眼における細胞死についての蛍光マーカー
本発明は、眼における細胞死を同定するための、波長最適化標識で標識した細胞死マーカーの使用に関する。適切な細胞死マーカーは、アネキシン並びにそのフラグメント及びその誘導体である。本発明はまた、波長最適化標識で標識した細胞死マーカーを含有する医薬組成物及び波長最適化標識で標識した細胞死マーカーを使用して眼における細胞死を観測するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死、特に眼におけるアポトーシス、特に網膜神経細胞の単一細胞の死の直接視覚化における使用のためのマーカーに関する。
【０００２】
細胞プロセスを検出するための生細胞画像化は、培養細胞のインビトロアッセイにおいて使用される。しかし、これは、眼におけるインビボでの細胞レベルではこれまで適用されていなかった。神経細胞の喪失は、特定の神経変性障害、例えば緑内障、糖尿病性網膜症及びアルツハイマー病の最初期段階で起こるプロセスである。緑内障は世界中で不可逆的な失明の主要原因であり、４０歳以上の人々の２％が罹患する。この状態は、その沈黙性と進行性の故に著しい罹患率を有するが、しばしば診断と治療の遅れを生じさせる。アルツハイマー病は、今後２０年間にわたって罹患するアメリカ人が４００万人から１２００万人に増加すると予測される、最も一般的な単一形態の認知症である。緑内障並びに変性性脳疾患のような疾患の進行を評価するために、網膜神経細胞のアポトーシスを評価できることは有用である。
【０００３】
本技術の開発を導いた、細胞死を検出するためのマーカー、マーカーの投与及び画像化機器の最適化により、本発明者らは、眼における単一細胞のアポトーシスの視覚化が可能であることを立証することができた。本発明者らは、内因性網膜自己蛍光及び負の影響、例えばマーカーに対する炎症性応答を含む、重大な難点を克服した。
【０００４】
本発明によれば、眼における細胞死を同定するための、波長最適化標識に結合した細胞死マーカーの使用が提供される。開発された波長最適化標識は、シグナル対ノイズ比を改善することによって改善された画像品質を提供し、同時に他の標識に関連する毒性作用を低減する。
【０００５】
また、波長最適化標識で標識した又は波長最適化標識に結合した細胞死マーカーを被験者に投与し、最適化された画像化装置を使用して被験者の眼から励起波長の画像を作製することを含む、眼において細胞死を同定する又は観測する方法が提供される。これは、眼における個別細胞のレベルの細胞死のリアルタイムでの数量化を可能にする。
【０００６】
「細胞死」という用語は、例えば、その間に原形質膜の完全性の喪失が存在する、アポトーシス及び壊死による細胞の死を含む何らかのプロセスを指す。本発明は、死にかけている、例えばアポトーシスを受けつつある細胞を同定することを可能にする。
【０００７】
「細胞死マーカー」という用語は、生細胞を死にかけている又は死滅した細胞から識別することを可能にするマーカーを指す。例えば、細胞死マーカーは、生細胞に特異的に結合するが死細胞若しくは死にかけている細胞には結合しない、又は死細胞若しくは死にかけている細胞に特異的に結合するが生細胞には結合しない化合物又は分子であることができる。細胞死マーカーは、例えばアネキシンファミリーのタンパク質を含む。アネキシンは、陽イオンの存在下で細胞膜に可逆的に結合するタンパク質である。本発明において有用なアネキシンは、天然又は組換えであることができる。このタンパク質は、全タンパク質でも、又は機能性フラグメント、すなわち全タンパク質と同じ分子に特異的に結合するアネキシンのフラグメント若しくは部分であることができる。また、そのようなタンパク質の機能性誘導体が使用されることもできる。様々なアネキシンが使用可能であり、例えば米国特許出願公開第２００６／０１３４００１Ａ号に記載されているものが挙げられる。好ましいアネキシンは、当分野において周知のアネキシン５である。細胞死マーカーとして使用し得る他のアネキシンは、アネキシン１１、２及び６を含む。細胞死、特にアポトーシスの他のマーカーは当分野において公知であり、例えばヨウ化プロピジウム及びシナプトタグミンのＣ２Ａドメイン[Jung et al., Bioconjing Chem. 2004 Sep-Oct; 15(5):983-7]が含まれる。
【０００８】
「波長最適化標識」という用語は、励起に反応して光を放出する物質であり、光毒性作用を回避するための光暴露安全性基準を順守しながら、高いシグナル対ノイズ比、そしてそれによる改善された画像解像度と感受性の故に使用のために選択された蛍光物質を指す。最適化波長は、赤外波長及び近赤外波長を含む。そのような標識は当分野で周知であり、染料、例えばＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄ−７７６及びＤ−７８１が含まれる。また、そのような染料を他の分子、例えばタンパク質及び核酸に結合することによって形成される蛍光物質も包含される。最適化波長は、投与したとき炎症をほとんど又は全く生じさせないことが好ましい。好ましい波長最適化標識はＤ−７７６であり、他の染料が炎症を引き起こす可能性があるのに対し、Ｄ−７７６は眼においてほとんど又は全く炎症を生じさせないことが認められているためである。最適化染料はまた、好ましくは、組織学的に検出され得る蛍光のレベルとインビボで検出され得るレベルとの間の密接な相関を明らかにする。組織学的蛍光とインビボでの蛍光との間に実質的な相関、特に１：１の相関が存在することが特に好ましい。
【０００９】
標識細胞死マーカーは、波長最適化標識をマーカー化合物に結合するための標準的な手法を使用して調製されることができる。そのような標識は、周知の供給源から、例えばＤｙｏｍｉｃｓから入手し得る。標識をマーカーに結合するための適切な手法は当分野において公知であり、標識の製造者によって提供されることができる。
【００１０】
細胞死の画像を作製するために、標識マーカーを、例えば静脈内注射によって、被験者に投与する。画像化される被験者の領域である眼を医用画像化装置の検出視野の中に位置づける。次に標識マーカーからの励起波長を撮像し、細胞死の領域のマップが提供されるように画像を構築する。細胞死が一定期間にわたって観測されるように画像の作製が反復されることができる。リアルタイムで観測されることができる。網膜細胞、特に網膜神経細胞の細胞死を観測することは特に好ましい。網膜神経細胞は、網膜神経節細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞及び光受容細胞を含む。
【００１１】
標識細胞死マーカーは局所的又は全身的に投与され得る。マーカーを投与するための方法は当分野において周知であり、例えば静脈内注射を含む。標識細胞死マーカーは静脈内投与されてきたが、本発明者らは、驚くべきことに、それらが、眼における視覚化を可能にする、血液網膜障壁を越えることを発見した。これまでの研究では、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ｎｍ染料は、血液網膜障壁を越えるその能力が組織学的に明らかにされたにもかかわらず、静脈内投与後にインビボで検出できないことが示されていた。あるいは、より好ましくないが、標識細胞死マーカーは局所的又は経眼的に投与され得る。
【００１２】
また、波長最適化マーカーで標識した細胞死マーカーを含有する、静脈内送達に適するように構成された医薬組成物、特に診断用組成物が提供される。あるいは、より好ましくないが、組成物は、眼投与又は局所投与にも適し得る。
【００１３】
本発明では、単なる例示として、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、網膜自己蛍光によって影響されない発蛍光団を使用した場合のインビボ画像化と組織学的網膜神経節細胞アポトーシスとの間の相関を示し、これは、例えば、組織学の判断基準で認められるものに正確に対応するインビボでの単一細胞のアポトーシス計数の実施を可能にする。 図１ａは、３週目の緑内障の動物モデルにおける組織学的網膜アポトーシスとインビボ画像化の比較を示す。インビボ画像の上の対応する共焦点顕微鏡検査（組織学）のオーバーレイは、組織学画像ではインビボ画像（バックグラウンド画像上の白色のスポット）よりも多くの硝子体内アネキシン−４８８で標識されたアポトーシス細胞（オーバーレイの灰色のスポット）を示す。
【図１Ｂ】図１ｂは、硝子体内アネキシンＤｙ−７７６（赤色に標識されたスポット）を使用したスタウロスポリン処置ラット眼における、組織学、インビボ及びエクスビボ分析を用いた網膜の対応する領域の画像を示す。３つの方法すべての間で１:１の相関が明らかに認められる。
【図２Ａ】図２ａおよび２ｂは、ＳＳＰ（ａ）及び緑内障（ｂ）動物の組織学画像がアポトーシスを明らかにした、つまりマーカーが血液網膜障壁を越えていたことを証明した、にもかかわらず、静脈内アネキシン４８８（１２５μｇ）がインビボで視覚化できなかったことを実証するＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）網膜画像を示す。本発明者らは、この非最適化波長で遭遇される高レベルのバックグラウンド自己蛍光のためにインビボ画像化が不可能であると考えた。
【図２Ｂ】図２ａおよび２ｂは、ＳＳＰ（ａ）及び緑内障（ｂ）動物の組織学画像がアポトーシスを明らかにした、つまりマーカーが血液網膜障壁を越えていたことを証明した、にもかかわらず、静脈内アネキシン４８８（１２５μｇ）がインビボで視覚化できなかったことを実証するＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）網膜画像を示す。本発明者らは、この非最適化波長で遭遇される高レベルのバックグラウンド自己蛍光のためにインビボ画像化が不可能であると考えた。
【図２Ｃ】図２ｃは、最適化波長、例えば赤外波長で、静脈内アネキシンＤＹ−７７６（１２５μｇ）がＳＳＰ誘導性の単一網膜細胞アポトーシスをインビボで、及び組織学的に示すことができたことを明らかにする。
【図３】Ｄｙ−７７６単独（Ａ）、アネキシン−ＤＹ−７７６（Ｂ）及びアネキシンＩＲＤｙｅ８００（Ｃ）で処置した網膜の反射及びＤＡＲＣ画像を示し、インビボでの網膜血管蛇行がＩＲＤｙｅ８００を使用して見られ得るが、Ｄ−７７６（単回又は反復注射で）では認められないことを明らかにする。
【図４】硝子体基底部における炎症細胞の存在を示す、ＩＲＤｙｅ８００標識アネキシンで処置した眼の走査型電子顕微鏡写真である。多くの硝子体細胞だけでなくいくつかの炎症細胞も硝子体内で認められる。
【図５】トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性のＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）評価の結果を示す。アポトーシス網膜神経節細胞は、糖尿病性網膜（ａ）で認められるが、野生型年齢適合対照（ｂ）では見られない。
【図６】眼において波長最適化された細胞死マーカーの視覚化の技術の方法を示す。簡単に述べると、波長最適化染料の静脈内注射（又は経眼的又は局所的又は他の方法）を実施し、それに続いて、最適の時間後に、最適化波長のレ−ザー光で励起し、検出した後、最適化波長の補正フィルターを用いて網膜の視覚化を達成する。
【図７】スタウロスポリン（７．１４ｎｍｏｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌ）及びアネキシン４８８の硝子体内注射後の組織学的及びインビボでの同じラット眼の対応する領域の画像を示す。組織学と比較してインビボで撮像された陽性スポット（アネキシン４８８）の数との間には驚くほどの相違が存在し、はるかに多くが組織学的に認められる。
【図８】ＳＳＰ処置後の３つの眼に関して撮影された対応する画像のインビボで認められるＲＧＣアポトーシスの陽性スポットと比較した、組織学的検査での硝子体内投与したアネキシン４８８陽性スポットの平均計数を示すグラフである。組織学画像では有意に高い計数が存在する。
【図９】ＳＳＰ処置眼におけるアネキシン４８８（０．２ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ）の静脈内投与の結果を示す。眼は、組織学的検査でアネキシン４８８陽性スポットを示したが、インビボでは何も示さなかった。
【図１０】静脈内アネキシン４８８の投与の結果を示す。特に、硝子体内アネキシンと比較した場合、組織学的には同様の平均計数のアネキシン４８８陽性スポットが存在したが、インビボではごくわずかしか視覚化されなかった。
【図１１】基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。アポトーシスを示す白色スポットがインビボで認められるが、非常にかすかである。
【図１２】使用した赤外染料の３つの分子構造を示す。
【図１３】蛍光タグの評価の結果を示す。評価した蛍光タグ全部の中で、アネキシン５と最も良好に結合した染料はＤｙ−７７６であった。Ｄｙ−７７６は、アネキシンＤｙ−７７６によるインビボ画像化及び組織学的検査で完全な相関（１：１）を示した。
【図１４】ＩＲＤｙｅ８００で標識したアネキシンの投与の結果を示す。緑内障のモデルへのアネキシンＩＲＤｙｅ８００の投与は、インビボでの網膜細胞アポトーシス標識の上昇を示した。しかし、組織学的画像と比較してインビボでの標識のレベルはまだ２０％低かった。
【図１５】投与の５日後の、種々の赤外蛍光染料と結合したアネキシン５の同じ用量で処置したラット眼を示す反射画像である。アネキシン５ Ｄｙ−７７６で処置した眼だけがこの時点で網膜血管蛇行を示さなかった。
【図１６】インビボ像を見た盲検観察者によって等級づけられた網膜蛇行のレベルにおいて認められる相違を示すグラフである。ＤＹ−７７６及び対照と比較して硝子体内ＩＲＤｙｅ８００及びＤＹ−７８１を投与された眼では血管蛇行の有意の上昇が存在した。この事象は炎症を強く示唆した。
【図１７】アネキシン５ ＩＲＤｙｅ８００に関して眼の硝子体で認められたマクロファージの走査型電子顕微鏡画像であり、染料によって引き起こされた炎症の存在を確認する。
【図１８】基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシン１１ Ｄｙ７７６を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。白色のスポットは、アネキシン１１がインビボでアポトーシスを検出するために使用し得ることを明らかに示す。
【図１９】スタウロスポリン（ＳＳＰ）で処置し、その後アネキシン４８８とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の両方を投与されたラット眼の画像を含む。異なる段階のＳＳＰ誘導性ＲＧＣ死が、数時間にわたって追跡した眼の同じ領域の静止画像に示されている。ＳＳＰ処置の２．０時間後（ａ）、２．５時間後（ｂ）及び３．０時間後（ｃ）の初期（陽性アネキシン４８８染色のみ）及び後期（陽性アネキシン４８８及びＰＩ染色）アポトーシス及び壊死（ＰＩ染色のみ）段階の、アポトーシスを起こしている単一細胞を認めることができる。（ｄ）この手法を使用して、連続的な段階のアポトーシス細胞死を受けている、同じ細胞（ポイント１及び２として矢印で示し、同定している）の経時的な変化を追跡することが可能である。どちらの細胞も、アネキシン５標識のピークがＰＩのピークより前に起こることを示し、マーカーの波長最適化が眼における細胞死の視覚化を導き得るという特許請求の範囲を裏付ける。
【図２０】食塩水とＳＳＰで処置した眼のインビボでのＭＣ５４０標識の比較、及びアネキシンＤＹ−７７６標識との比較を示す。認められるように、アネキシンＤＹ−７７６は、インビボ画像において個別に明らかに見える単一細胞を標識することができる。ＲＧＣアポトーシスのレベルは、アネキシン−ＤＹ−７７６でのＳＳＰ投与後にはるかに高い。比較すると、ＭＣ５４０は膜全体を標識するので、広範な蛍光シグナルが検出され、単一細胞を同定することを不可能にするが、ＳＳＰ後のＭＣ５４０の画像は基線より明確に高いレベルの蛍光を有する。
【図２１】網膜層を示す略図である。網膜神経細胞は、光受容細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞である。
【図２２】虚血のマウスモデルの網膜の組織学的切片を示す。硝子体内Ａｎｘ−Ｆを投与した後、動物を犠死させた。矢印は網膜の種々の層においてＡｎｘ−Ｆに関して陽性染色された４つの細胞を示し、内核層（ＩＮＬ）、外核層（ＯＮＬ）及び光受容器層（ＰＬ）におけるアポトーシスの存在を確認する。
【実施例】
【００１５】
アネキシン５へのＤ７７６の結合
組換えにより細菌で発現させたアネキシン５（等張緩衝液１ｍｌ中５ｍｇ）が、「標識化緩衝液」に対し、緩衝液を２回交換して（各々２５０ｍｌ）３時間かけて透析される。標識化緩衝液は、炭酸水素ナトリウム２１ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに溶解することによって作製される。アジ化ナトリウム１ｇ（０．２％）を添加する。水酸化ナトリウムの濃厚水溶液でｐＨを９．０に調整する。使用の前に、濃縮保存溶液１容に対し水９容（ｖ／ｖ）を添加して緩衝液を希釈する。アネキシン５タンパク質は、今や標識化反応の準備ができている。染料対タンパク質比は、各々の標識化反応について一定に保持される。それ故、アネキシン５ １ｍｇを標識するためにＤ７７６−ＮＨＳ−エステル０．５ｍｇを使用する。これは、染料とアネキシン５タンパク質の間で約５００のモル比を与える。ＮＨＳ−エステルをボルテックスすることによってジメチルホルムアミドに溶解し、染料を標識化緩衝液中のアネキシン５タンパク質に添加して反応を開始させる。標識化反応におけるアネキシン５の最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであるべきである。標識化は、振とう機に入れたエッペンドルフ管において２時間にわたって進行させることが可能である。
【００１６】
反応期間の終了時に、着色した標識化溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５の５ｍｌ又は１０ｍｌカラムにピペットで慎重に分注し、ゲルに浸透させる。次に１００ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４をカラムに緩やかに滴下してコンジュゲートを溶出する。標識タンパク質が比較的鋭いバンドとして先に溶出し、一方遊離染料は遅れて緩やかにスミアリングする。ひとたび結合アネキシン５がカラムの底部に達すれば、それをエッペンドルフチューブに収集し、直ちに使用できる。
【００１７】
画像化法
画像化は、当分野で公知の手法、例えば以下のような記述されている手法を用いて実施し得る。
【００１８】
すべてのインビボ画像化は、７９０ｎｍの改変ｃＳＬＯ（共焦点走査型レーザー検眼鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｒｅｔｉｎａ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ ２，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｏｓｓｅｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）手法１で実施した１、２、３。標準レンズ（１５°×１５°〜３０°×３０°）と広視野レンズ（５５°−すべての度数値はヒト眼に合わせて較正した）を使用した。種々の焦点設定で反射率と対応する蛍光画像をラット網膜で撮影した。シグナル対ノイズ比を改善し、画像コントラストを強調するために、一連の単回画像（１００まで）からの平均画像を眼運動の補正後に算定した。
【００１９】
蛍光の最適化
本発明者らは、網膜における内因性蛍光シグナルの存在は、特定の蛍光標識で標識された細胞死マーカーが適切に撮像できないことを意味することを発見した。本発明者らは以前に、網膜神経節細胞のアポトーシスを撮像するために蛍光標識アネキシン（アネキシン４８８）を使用した。全身的に投与した場合、本発明者らは、驚くべきことに、固有の網膜自己蛍光が、有用な結果が得られない程度までシグナルに干渉することを発見した。
【００２０】
網膜自己蛍光からの干渉を回避するため、本発明者らは、近赤外及び赤外発蛍光団を含む他の発蛍光団、例えばＬｉｃｏｒ ８００ ＣＷ、Ｄ−７７６及びＤ−７８１を検討した。これらの標識を使用して、本発明者らは、組織学的局在化に正確に対応する、生体眼における単一細胞のアポトーシスを確認することができた。これは図１、２及び３に示されている。
【００２１】
３つの染料を評価したとき、本発明者らは、Ｌｉｃｏｒ ８００ ＣＷ及びＤ−７８１の両方が血管蛇行と硝子体炎症を引き起こすことを発見した。Ｄ−７７６は炎症又は血管変化を引き起こさなかった。これは図３及び４に示されている。
【００２２】
トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性の変化
トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性のＤＡＲＣ評価を、本明細書で述べた手法を用いて実施した。図５に見られるように、糖尿病動物（ａ）は、年齢適合野生型対照（ｂ）よりも有意に多い網膜神経節細胞アポトーシスを示す。
【００２３】
蛍光標識アネキシン５（Ａｎｘ−Ｆ）の波長最適化
標識細胞におけるインビボ対組織学の相違
ａ）硝子体内投与
本発明者らは以前に、網膜神経節細胞のアポトーシスを画像化するために、硝子体内経路で眼に投与した蛍光標識アネキシン（アネキシン４８８）を使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒａ ４８８標識アネキシン５又は別の蛍光マーカーで標識したアネキシン５。それらは以下のように評価された。
・アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５３２ ５３２／５５３の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ５５５／５６８の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＤｙ−７７６ ７７１／７９３の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＤｙ−７８１ ７８３／８００の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＬｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ ８００ ７７４／７８９の最大励起／蛍光波長。
【００２４】
本発明者らはまた、アネキシン分子当たりに結合される染料分子の数が重要であることを発見した。本発明者らは、アネキシン分子につき低い数の染料分子（１２未満、好ましくは５未満）を目指すことが、アポトーシス細胞に対するその結合親和性を保持しながらコンジュゲートの自然蛍光を高めると主張する。
【００２５】
本発明者らはまた、染料分子がどのようにしてアネキシン分子に結合するかが重要であることを発見した。本発明者らは、アネキシン分子をそのＮ末端において染料で標識すると改善されたシグナル対ノイズ比を生じること、及び静脈内投与した場合に主要器官、例えば肝臓及び腎臓への取込みがより少ないことを発見した。さらに、アネキシン分子内のリシン残基ではなくシステイン残基を標識すると、より少ないノイズを生じた。
【００２６】
図１１の画像は、基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。アポトーシスを示す白色スポットがインビボで認められるが、非常にかすかである。赤外染料と比較して（下記参照）、アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２は、ＤＡＲＣによるインビボ画像化に関して明らかに最適以下であった。
【００２７】
驚くべきことに、評価した蛍光タグ全部の中で、アネキシン５と最も良好に結合した染料はＤｙ−７７６であった。Ｄｙ−７７６は、以下に見られるように、アネキシンＤｙ−７７６によるインビボ画像化と組織学的検査に関して完全な相関（１：１）を示した。
【００２８】
点間の分離距離を使用して、組織学とインビボ検査を比較する統計解析では、平均分離は、ランダム・ノイズ・モデル（３０．９８６ピクセル）と比較して、前記画像において１９．７５６ピクセルであり、これが偶然に起こる確率は０．００１３０５パーセントである。同様の結果が、マッチする個々の点に関して得られた。ｐ＝０．００１５９７パーセント、すなわち、組織学とインビボ画像の間で点のマッチングが偶然に起こり得た可能性は極めて低い。これは、その他の赤外アネキシン染料、例えばインビボで少なくとも２０％少ないスポットを示したＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ）に匹敵する。
【００２９】
アネキシンＤｙ−７８１の使用は同様の結果を与えたが、アネキシンＩＲＤｙｅ８００に関しては、染料を投与した５日後の画像化は網膜血管蛇行を明らかにし、炎症を示唆した。
【００３０】
図１３、１４及び１５の画像は、投与の５日後の、種々の赤外蛍光染料と結合したアネキシン５の同じ用量で処置したラット眼を示す。アネキシン５ Ｄｙ−７７６で処置した眼だけが網膜血管異常を示さなかった。
【００３１】
図１６のグラフは、インビボ像を見た盲検観察者によって等級づけられた網膜蛇行のレベルにおいて認められる相違を示す。ＤＹ−７７６及び対照と比較して硝子体内ＩＲＤｙｅ８００及びＤＹ−７８１を投与された眼では血管蛇行の有意の上昇が存在した。この事象は炎症を強く示唆し、次に組織学的検査と組み合わせて検討された。
【００３２】
図１７は、アネキシン５ ＩＲＤｙｅ８００に関して眼の硝子体で認められたマクロファージの走査型電子顕微鏡画像であり、染料によって引き起こされた炎症の存在を確認する。
【００３３】
他のアネキシンのマーカーとしての使用
本発明者らは、他のアネキシンマーカー、例えば、すべてが暴露ホスファチジルセリンに対して親和性を有する、アネキシン１１、アネキシン２及びアネキシン６も、アポトーシスを起こしている網膜細胞に結合することを示した。
【００３４】
図１８の画像は、基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシン１１ Ｄｙ７７６を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。白色のスポットは、アネキシン１１がインビボでアポトーシスを検出するために使用し得ることを明らかに示す。
【００３５】
細胞死の他の（すなわちアネキシンではない）マーカーの使用
ヨウ化プロピジウム
本発明者らは、次に細胞死の他のマーカーを評価した。最初に、分断された膜を有する細胞を標識し、それらのＤＮＡ及びＲＮＡを蛍光染色することによって壊死細胞を同定するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）。ＰＩは、それぞれ５３２ｎｍと６４９ｎｍの最大励起及び蛍光波長を有する。図１９の画像は、網膜においてインビボで壊死細胞を標識するＰＩとインビボでアポトーシス細胞を標識するアネキシン４８８の比較を示す。
【００３６】
（ａ〜ｃ）スタウロスポリン（ＳＳＰ）処置の２．０時間後（ａ）、２．５時間後（ｂ）及び３．０時間後（ｃ）の初期（緑色、陽性アネキシン４８８染色のみ）及び後期（黄色、陽性アネキシン４８８及びＰＩ染色）アポトーシス及び壊死（赤色、ＰＩ染色のみ）段階の単一細胞を示す、ＳＳＰ誘導性ＲＧＣ死の微速度撮影動画からとった静止画像。（ｄ）この手法を使用して、連続的な段階のアポトーシス細胞死を受けている、同じ細胞（ポイント１及び２として矢印で示し、同定している）の経時的な変化を追跡することが可能である。どちらの細胞も、アネキシン５標識のピークがＰＩのピークより前に起こることを示し、マーカーの波長最適化が眼における細胞死の視覚化を導き得るという特許請求を裏付ける。
【００３７】
本発明者らはまた、複数の細胞死マーカー、例えばアネキシンＶとヨウ化プロピジウムの同時視覚化が、各々別々のマーカーが波長最適化されている限り、可能であることを発見した。
【００３８】
メロシアニン５４０（ＭＣ５４０）
メロシアニン５４０は、細胞の外膜に結合し、アポトーシスの初期に起こる膜の解体の程度に比例して蛍光を発するという事実によってアポトーシス細胞を同定する染料である。ＭＣ４５０は、それぞれ４８８ｎｍと５７５ｎｍの最大励起及び蛍光波長を有する。図２０の画像は、食塩水とＳＳＰで処置した眼のインビボでのＭＣ５４０標識の比較、及びアネキシン７７６標識との比較を示す。
【００３９】
認められるように、アネキシン７７６は、前記に示すインビボ画像において個別に明らかに見える単一細胞を標識することができる。ＲＧＣアポトーシスのレベルはＳＳＰ投与後にはるかに高い。比較すると、ＭＣ５４０は膜全体を標識するので、広範な蛍光シグナルが検出され、単一細胞を同定することを不可能にするが、ＳＳＰ後のＭＣ５４０の画像は基線より明確に高いレベルの蛍光を有する。
【００４０】
網膜全体にわたるアポトーシス細胞の標識化
本発明者らは以前に、Ａｎｘ−ＦがＲＧＣアポトーシスを同定するために使用し得ることを示した。最近、同じ手法を使用して、アポトーシスを起こしている双極細胞を視覚化することが可能であることを示した。本発明者らはここで、図２１に見られるように、硝子体内投与した場合のＡｎｘ−Ｆが他の網膜細胞も染色できることを示す。
【００４１】
図２２の組織学的切片は、実験的に虚血を誘発させたマウス眼から撮影している。硝子体内Ａｎｘ−Ｆを投与した後、動物を犠死させた。矢印は網膜の種々の層においてＡｎｘ−Ｆに関して陽性染色された４つの細胞を示し、内核層（ＩＮＬ）、外核層（ＯＮＬ）及び光受容器層（ＰＬ）におけるアポトーシスの存在を確認する。
【００４２】
参考文献
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死、特に眼におけるアポトーシス、特に網膜神経細胞の単一細胞の死の直接視覚化における使用のためのマーカーに関する。
【０００２】
細胞プロセスを検出するための生細胞画像化は、培養細胞のインビトロアッセイにおいて使用される。しかし、これは、眼におけるインビボでの細胞レベルではこれまで適用されていなかった。神経細胞の喪失は、特定の神経変性障害、例えば緑内障、糖尿病性網膜症及びアルツハイマー病の最初期段階で起こるプロセスである。緑内障は世界中で不可逆的な失明の主要原因であり、４０歳以上の人々の２％が罹患する。この状態は、その沈黙性と進行性の故に著しい罹患率を有するが、しばしば診断と治療の遅れを生じさせる。アルツハイマー病は、今後２０年間にわたって罹患するアメリカ人が４００万人から１２００万人に増加すると予測される、最も一般的な単一形態の認知症である。緑内障並びに変性性脳疾患のような疾患の進行を評価するために、網膜神経細胞のアポトーシスを評価できることは有用である。
【０００３】
本技術の開発を導いた、細胞死を検出するためのマーカー、マーカーの投与及び画像化機器の最適化により、本発明者らは、眼における単一細胞のアポトーシスの視覚化が可能であることを立証することができた。本発明者らは、内因性網膜自己蛍光及び負の影響、例えばマーカーに対する炎症性応答を含む、重大な難点を克服した。
【０００４】
本発明によれば、眼における細胞死を同定するための、波長最適化標識に結合した細胞死マーカーの使用が提供される。開発された波長最適化標識は、シグナル対ノイズ比を改善することによって改善された画像品質を提供し、同時に他の標識に関連する毒性作用を低減する。
【０００５】
また、波長最適化標識で標識した又は波長最適化標識に結合した細胞死マーカーを被験者に投与し、最適化された画像化装置を使用して被験者の眼から励起波長の画像を作製することを含む、眼において細胞死を同定する又は観測する方法が提供される。これは、眼における個別細胞のレベルの細胞死のリアルタイムでの数量化を可能にする。
【０００６】
「細胞死」という用語は、例えば、その間に原形質膜の完全性の喪失が存在する、アポトーシス及び壊死による細胞の死を含む何らかのプロセスを指す。本発明は、死にかけている、例えばアポトーシスを受けつつある細胞を同定することを可能にする。
【０００７】
「細胞死マーカー」という用語は、生細胞を死にかけている又は死滅した細胞から識別することを可能にするマーカーを指す。例えば、細胞死マーカーは、生細胞に特異的に結合するが死細胞若しくは死にかけている細胞には結合しない、又は死細胞若しくは死にかけている細胞に特異的に結合するが生細胞には結合しない化合物又は分子であることができる。細胞死マーカーは、例えばアネキシンファミリーのタンパク質を含む。アネキシンは、陽イオンの存在下で細胞膜に可逆的に結合するタンパク質である。本発明において有用なアネキシンは、天然又は組換えであることができる。このタンパク質は、全タンパク質でも、又は機能性フラグメント、すなわち全タンパク質と同じ分子に特異的に結合するアネキシンのフラグメント若しくは部分であることができる。また、そのようなタンパク質の機能性誘導体が使用されることもできる。様々なアネキシンが使用可能であり、例えば米国特許出願公開第２００６／０１３４００１Ａ号に記載されているものが挙げられる。好ましいアネキシンは、当分野において周知のアネキシン５である。細胞死マーカーとして使用し得る他のアネキシンは、アネキシン１１、２及び６を含む。細胞死、特にアポトーシスの他のマーカーは当分野において公知であり、例えばヨウ化プロピジウム及びシナプトタグミンのＣ２Ａドメイン[Jung et al., Bioconjing Chem. 2004 Sep-Oct; 15(5):983-7]が含まれる。
【０００８】
「波長最適化標識」という用語は、励起に反応して光を放出する物質であり、光毒性作用を回避するための光暴露安全性基準を順守しながら、高いシグナル対ノイズ比、そしてそれによる改善された画像解像度と感受性の故に使用のために選択された蛍光物質を指す。最適化波長は、赤外波長及び近赤外波長を含む。そのような標識は当分野で周知であり、染料、例えばＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄ−７７６及びＤ−７８１が含まれる。また、そのような染料を他の分子、例えばタンパク質及び核酸に結合することによって形成される蛍光物質も包含される。最適化波長は、投与したとき炎症をほとんど又は全く生じさせないことが好ましい。好ましい波長最適化標識はＤ−７７６であり、他の染料が炎症を引き起こす可能性があるのに対し、Ｄ−７７６は眼においてほとんど又は全く炎症を生じさせないことが認められているためである。最適化染料はまた、好ましくは、組織学的に検出され得る蛍光のレベルとインビボで検出され得るレベルとの間の密接な相関を明らかにする。組織学的蛍光とインビボでの蛍光との間に実質的な相関、特に１：１の相関が存在することが特に好ましい。
【０００９】
標識細胞死マーカーは、波長最適化標識をマーカー化合物に結合するための標準的な手法を使用して調製されることができる。そのような標識は、周知の供給源から、例えばＤｙｏｍｉｃｓから入手し得る。標識をマーカーに結合するための適切な手法は当分野において公知であり、標識の製造者によって提供されることができる。
【００１０】
細胞死の画像を作製するために、標識マーカーを、例えば静脈内注射によって、被験者に投与する。画像化される被験者の領域である眼を医用画像化装置の検出視野の中に位置づける。次に標識マーカーからの励起波長を撮像し、細胞死の領域のマップが提供されるように画像を構築する。細胞死が一定期間にわたって観測されるように画像の作製が反復されることができる。リアルタイムで観測されることができる。網膜細胞、特に網膜神経細胞の細胞死を観測することは特に好ましい。網膜神経細胞は、網膜神経節細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞及び光受容細胞を含む。
【００１１】
標識細胞死マーカーは局所的又は全身的に投与され得る。マーカーを投与するための方法は当分野において周知であり、例えば静脈内注射を含む。標識細胞死マーカーは静脈内投与されてきたが、本発明者らは、驚くべきことに、それらが、眼における視覚化を可能にする、血液網膜障壁を越えることを発見した。これまでの研究では、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ｎｍ染料は、血液網膜障壁を越えるその能力が組織学的に明らかにされたにもかかわらず、静脈内投与後にインビボで検出できないことが示されていた。あるいは、より好ましくないが、標識細胞死マーカーは局所的又は経眼的に投与され得る。
【００１２】
また、波長最適化マーカーで標識した細胞死マーカーを含有する、静脈内送達に適するように構成された医薬組成物、特に診断用組成物が提供される。あるいは、より好ましくないが、組成物は、眼投与又は局所投与にも適し得る。
【００１３】
本発明では、単なる例示として、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、網膜自己蛍光によって影響されない発蛍光団を使用した場合のインビボ画像化と組織学的網膜神経節細胞アポトーシスとの間の相関を示し、これは、例えば、組織学の判断基準で認められるものに正確に対応するインビボでの単一細胞のアポトーシス計数の実施を可能にする。 図１ａは、３週目の緑内障の動物モデルにおける組織学的網膜アポトーシスとインビボ画像化の比較を示す。インビボ画像の上の対応する共焦点顕微鏡検査（組織学）のオーバーレイは、組織学画像ではインビボ画像（バックグラウンド画像上の白色のスポット）よりも多くの硝子体内アネキシン−４８８で標識されたアポトーシス細胞（オーバーレイの灰色のスポット）を示す。
【図１Ｂ】図１ｂは、硝子体内アネキシンＤｙ−７７６（赤色に標識されたスポット）を使用したスタウロスポリン処置ラット眼における、組織学、インビボ及びエクスビボ分析を用いた網膜の対応する領域の画像を示す。３つの方法すべての間で１:１の相関が明らかに認められる。
【図２Ａ】図２ａおよび２ｂは、ＳＳＰ（ａ）及び緑内障（ｂ）動物の組織学画像がアポトーシスを明らかにした、つまりマーカーが血液網膜障壁を越えていたことを証明した、にもかかわらず、静脈内アネキシン４８８（１２５μｇ）がインビボで視覚化できなかったことを実証するＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）網膜画像を示す。本発明者らは、この非最適化波長で遭遇される高レベルのバックグラウンド自己蛍光のためにインビボ画像化が不可能であると考えた。
【図２Ｂ】図２ａおよび２ｂは、ＳＳＰ（ａ）及び緑内障（ｂ）動物の組織学画像がアポトーシスを明らかにした、つまりマーカーが血液網膜障壁を越えていたことを証明した、にもかかわらず、静脈内アネキシン４８８（１２５μｇ）がインビボで視覚化できなかったことを実証するＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）網膜画像を示す。本発明者らは、この非最適化波長で遭遇される高レベルのバックグラウンド自己蛍光のためにインビボ画像化が不可能であると考えた。
【図２Ｃ】図２ｃは、最適化波長、例えば赤外波長で、静脈内アネキシンＤＹ−７７６（１２５μｇ）がＳＳＰ誘導性の単一網膜細胞アポトーシスをインビボで、及び組織学的に示すことができたことを明らかにする。
【図３】Ｄｙ−７７６単独（Ａ）、アネキシン−ＤＹ−７７６（Ｂ）及びアネキシンＩＲＤｙｅ８００（Ｃ）で処置した網膜の反射及びＤＡＲＣ画像を示し、インビボでの網膜血管蛇行がＩＲＤｙｅ８００を使用して見られ得るが、Ｄ−７７６（単回又は反復注射で）では認められないことを明らかにする。
【図４】硝子体基底部における炎症細胞の存在を示す、ＩＲＤｙｅ８００標識アネキシンで処置した眼の走査型電子顕微鏡写真である。多くの硝子体細胞だけでなくいくつかの炎症細胞も硝子体内で認められる。
【図５】トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性のＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）評価の結果を示す。アポトーシス網膜神経節細胞は、糖尿病性網膜（ａ）で認められるが、野生型年齢適合対照（ｂ）では見られない。
【図６】眼において波長最適化された細胞死マーカーの視覚化の技術の方法を示す。簡単に述べると、波長最適化染料の静脈内注射（又は経眼的又は局所的又は他の方法）を実施し、それに続いて、最適の時間後に、最適化波長のレ−ザー光で励起し、検出した後、最適化波長の補正フィルターを用いて網膜の視覚化を達成する。
【図７】スタウロスポリン（７．１４ｎｍｏｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌ）及びアネキシン４８８の硝子体内注射後の組織学的及びインビボでの同じラット眼の対応する領域の画像を示す。組織学と比較してインビボで撮像された陽性スポット（アネキシン４８８）の数との間には驚くほどの相違が存在し、はるかに多くが組織学的に認められる。
【図８】ＳＳＰ処置後の３つの眼に関して撮影された対応する画像のインビボで認められるＲＧＣアポトーシスの陽性スポットと比較した、組織学的検査での硝子体内投与したアネキシン４８８陽性スポットの平均計数を示すグラフである。組織学画像では有意に高い計数が存在する。
【図９】ＳＳＰ処置眼におけるアネキシン４８８（０．２ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ）の静脈内投与の結果を示す。眼は、組織学的検査でアネキシン４８８陽性スポットを示したが、インビボでは何も示さなかった。
【図１０】静脈内アネキシン４８８の投与の結果を示す。特に、硝子体内アネキシンと比較した場合、組織学的には同様の平均計数のアネキシン４８８陽性スポットが存在したが、インビボではごくわずかしか視覚化されなかった。
【図１１】基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。アポトーシスを示す白色スポットがインビボで認められるが、非常にかすかである。
【図１２】使用した赤外染料の３つの分子構造を示す。
【図１３】蛍光タグの評価の結果を示す。評価した蛍光タグ全部の中で、アネキシン５と最も良好に結合した染料はＤｙ−７７６であった。Ｄｙ−７７６は、アネキシンＤｙ−７７６によるインビボ画像化及び組織学的検査で完全な相関（１：１）を示した。
【図１４】ＩＲＤｙｅ８００で標識したアネキシンの投与の結果を示す。緑内障のモデルへのアネキシンＩＲＤｙｅ８００の投与は、インビボでの網膜細胞アポトーシス標識の上昇を示した。しかし、組織学的画像と比較してインビボでの標識のレベルはまだ２０％低かった。
【図１５】投与の５日後の、種々の赤外蛍光染料と結合したアネキシン５の同じ用量で処置したラット眼を示す反射画像である。アネキシン５ Ｄｙ−７７６で処置した眼だけがこの時点で網膜血管蛇行を示さなかった。
【図１６】インビボ像を見た盲検観察者によって等級づけられた網膜蛇行のレベルにおいて認められる相違を示すグラフである。ＤＹ−７７６及び対照と比較して硝子体内ＩＲＤｙｅ８００及びＤＹ−７８１を投与された眼では血管蛇行の有意の上昇が存在した。この事象は炎症を強く示唆した。
【図１７】アネキシン５ ＩＲＤｙｅ８００に関して眼の硝子体で認められたマクロファージの走査型電子顕微鏡画像であり、染料によって引き起こされた炎症の存在を確認する。
【図１８】基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシン１１ Ｄｙ７７６を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。白色のスポットは、アネキシン１１がインビボでアポトーシスを検出するために使用し得ることを明らかに示す。
【図１９】スタウロスポリン（ＳＳＰ）で処置し、その後アネキシン４８８とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の両方を投与されたラット眼の画像を含む。異なる段階のＳＳＰ誘導性ＲＧＣ死が、数時間にわたって追跡した眼の同じ領域の静止画像に示されている。ＳＳＰ処置の２．０時間後（ａ）、２．５時間後（ｂ）及び３．０時間後（ｃ）の初期（陽性アネキシン４８８染色のみ）及び後期（陽性アネキシン４８８及びＰＩ染色）アポトーシス及び壊死（ＰＩ染色のみ）段階の、アポトーシスを起こしている単一細胞を認めることができる。（ｄ）この手法を使用して、連続的な段階のアポトーシス細胞死を受けている、同じ細胞（ポイント１及び２として矢印で示し、同定している）の経時的な変化を追跡することが可能である。どちらの細胞も、アネキシン５標識のピークがＰＩのピークより前に起こることを示し、マーカーの波長最適化が眼における細胞死の視覚化を導き得るという特許請求の範囲を裏付ける。
【図２０】食塩水とＳＳＰで処置した眼のインビボでのＭＣ５４０標識の比較、及びアネキシンＤＹ−７７６標識との比較を示す。認められるように、アネキシンＤＹ−７７６は、インビボ画像において個別に明らかに見える単一細胞を標識することができる。ＲＧＣアポトーシスのレベルは、アネキシン−ＤＹ−７７６でのＳＳＰ投与後にはるかに高い。比較すると、ＭＣ５４０は膜全体を標識するので、広範な蛍光シグナルが検出され、単一細胞を同定することを不可能にするが、ＳＳＰ後のＭＣ５４０の画像は基線より明確に高いレベルの蛍光を有する。
【図２１】網膜層を示す略図である。網膜神経細胞は、光受容細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞である。
【図２２】虚血のマウスモデルの網膜の組織学的切片を示す。硝子体内Ａｎｘ−Ｆを投与した後、動物を犠死させた。矢印は網膜の種々の層においてＡｎｘ−Ｆに関して陽性染色された４つの細胞を示し、内核層（ＩＮＬ）、外核層（ＯＮＬ）及び光受容器層（ＰＬ）におけるアポトーシスの存在を確認する。
【実施例】
【００１５】
アネキシン５へのＤ７７６の結合
組換えにより細菌で発現させたアネキシン５（等張緩衝液１ｍｌ中５ｍｇ）が、「標識化緩衝液」に対し、緩衝液を２回交換して（各々２５０ｍｌ）３時間かけて透析される。標識化緩衝液は、炭酸水素ナトリウム２１ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに溶解することによって作製される。アジ化ナトリウム１ｇ（０．２％）を添加する。水酸化ナトリウムの濃厚水溶液でｐＨを９．０に調整する。使用の前に、濃縮保存溶液１容に対し水９容（ｖ／ｖ）を添加して緩衝液を希釈する。アネキシン５タンパク質は、今や標識化反応の準備ができている。染料対タンパク質比は、各々の標識化反応について一定に保持される。それ故、アネキシン５ １ｍｇを標識するためにＤ７７６−ＮＨＳ−エステル０．５ｍｇを使用する。これは、染料とアネキシン５タンパク質の間で約５００のモル比を与える。ＮＨＳ−エステルをボルテックスすることによってジメチルホルムアミドに溶解し、染料を標識化緩衝液中のアネキシン５タンパク質に添加して反応を開始させる。標識化反応におけるアネキシン５の最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであるべきである。標識化は、振とう機に入れたエッペンドルフ管において２時間にわたって進行させることが可能である。
【００１６】
反応期間の終了時に、着色した標識化溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５の５ｍｌ又は１０ｍｌカラムにピペットで慎重に分注し、ゲルに浸透させる。次に１００ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４をカラムに緩やかに滴下してコンジュゲートを溶出する。標識タンパク質が比較的鋭いバンドとして先に溶出し、一方遊離染料は遅れて緩やかにスミアリングする。ひとたび結合アネキシン５がカラムの底部に達すれば、それをエッペンドルフチューブに収集し、直ちに使用できる。
【００１７】
画像化法
画像化は、当分野で公知の手法、例えば以下のような記述されている手法を用いて実施し得る。
【００１８】
すべてのインビボ画像化は、７９０ｎｍの改変ｃＳＬＯ（共焦点走査型レーザー検眼鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｒｅｔｉｎａ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ ２，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｏｓｓｅｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＡＲＣ（アポトーシスを起こしている網膜細胞の検出）手法１で実施した１、２、３。標準レンズ（１５°×１５°〜３０°×３０°）と広視野レンズ（５５°−すべての度数値はヒト眼に合わせて較正した）を使用した。種々の焦点設定で反射率と対応する蛍光画像をラット網膜で撮影した。シグナル対ノイズ比を改善し、画像コントラストを強調するために、一連の単回画像（１００まで）からの平均画像を眼運動の補正後に算定した。
【００１９】
蛍光の最適化
本発明者らは、網膜における内因性蛍光シグナルの存在は、特定の蛍光標識で標識された細胞死マーカーが適切に撮像できないことを意味することを発見した。本発明者らは以前に、網膜神経節細胞のアポトーシスを撮像するために蛍光標識アネキシン（アネキシン４８８）を使用した。全身的に投与した場合、本発明者らは、驚くべきことに、固有の網膜自己蛍光が、有用な結果が得られない程度までシグナルに干渉することを発見した。
【００２０】
網膜自己蛍光からの干渉を回避するため、本発明者らは、近赤外及び赤外発蛍光団を含む他の発蛍光団、例えばＬｉｃｏｒ ８００ ＣＷ、Ｄ−７７６及びＤ−７８１を検討した。これらの標識を使用して、本発明者らは、組織学的局在化に正確に対応する、生体眼における単一細胞のアポトーシスを確認することができた。これは図１、２及び３に示されている。
【００２１】
３つの染料を評価したとき、本発明者らは、Ｌｉｃｏｒ ８００ ＣＷ及びＤ−７８１の両方が血管蛇行と硝子体炎症を引き起こすことを発見した。Ｄ−７７６は炎症又は血管変化を引き起こさなかった。これは図３及び４に示されている。
【００２２】
トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性の変化
トランスジェニックモデルにおける糖尿病性神経変性のＤＡＲＣ評価を、本明細書で述べた手法を用いて実施した。図５に見られるように、糖尿病動物（ａ）は、年齢適合野生型対照（ｂ）よりも有意に多い網膜神経節細胞アポトーシスを示す。
【００２３】
蛍光標識アネキシン５（Ａｎｘ−Ｆ）の波長最適化
標識細胞におけるインビボ対組織学の相違
ａ）硝子体内投与
本発明者らは以前に、網膜神経節細胞のアポトーシスを画像化するために、硝子体内経路で眼に投与した蛍光標識アネキシン（アネキシン４８８）を使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒａ ４８８標識アネキシン５又は別の蛍光マーカーで標識したアネキシン５。それらは以下のように評価された。
・アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５３２ ５３２／５５３の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ５５５／５６８の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＤｙ−７７６ ７７１／７９３の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＤｙ−７８１ ７８３／８００の最大励起／蛍光波長
・アネキシンＬｉｃｏｒ ＩＲＤｙｅ ８００ ７７４／７８９の最大励起／蛍光波長。
【００２４】
本発明者らはまた、アネキシン分子当たりに結合される染料分子の数が重要であることを発見した。本発明者らは、アネキシン分子につき低い数の染料分子（１２未満、好ましくは５未満）を目指すことが、アポトーシス細胞に対するその結合親和性を保持しながらコンジュゲートの自然蛍光を高めると主張する。
【００２５】
本発明者らはまた、染料分子がどのようにしてアネキシン分子に結合するかが重要であることを発見した。本発明者らは、アネキシン分子をそのＮ末端において染料で標識すると改善されたシグナル対ノイズ比を生じること、及び静脈内投与した場合に主要器官、例えば肝臓及び腎臓への取込みがより少ないことを発見した。さらに、アネキシン分子内のリシン残基ではなくシステイン残基を標識すると、より少ないノイズを生じた。
【００２６】
図１１の画像は、基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。アポトーシスを示す白色スポットがインビボで認められるが、非常にかすかである。赤外染料と比較して（下記参照）、アネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５及びアネキシンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２は、ＤＡＲＣによるインビボ画像化に関して明らかに最適以下であった。
【００２７】
驚くべきことに、評価した蛍光タグ全部の中で、アネキシン５と最も良好に結合した染料はＤｙ−７７６であった。Ｄｙ−７７６は、以下に見られるように、アネキシンＤｙ−７７６によるインビボ画像化と組織学的検査に関して完全な相関（１：１）を示した。
【００２８】
点間の分離距離を使用して、組織学とインビボ検査を比較する統計解析では、平均分離は、ランダム・ノイズ・モデル（３０．９８６ピクセル）と比較して、前記画像において１９．７５６ピクセルであり、これが偶然に起こる確率は０．００１３０５パーセントである。同様の結果が、マッチする個々の点に関して得られた。ｐ＝０．００１５９７パーセント、すなわち、組織学とインビボ画像の間で点のマッチングが偶然に起こり得た可能性は極めて低い。これは、その他の赤外アネキシン染料、例えばインビボで少なくとも２０％少ないスポットを示したＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉｃｏｒ）に匹敵する。
【００２９】
アネキシンＤｙ−７８１の使用は同様の結果を与えたが、アネキシンＩＲＤｙｅ８００に関しては、染料を投与した５日後の画像化は網膜血管蛇行を明らかにし、炎症を示唆した。
【００３０】
図１３、１４及び１５の画像は、投与の５日後の、種々の赤外蛍光染料と結合したアネキシン５の同じ用量で処置したラット眼を示す。アネキシン５ Ｄｙ−７７６で処置した眼だけが網膜血管異常を示さなかった。
【００３１】
図１６のグラフは、インビボ像を見た盲検観察者によって等級づけられた網膜蛇行のレベルにおいて認められる相違を示す。ＤＹ−７７６及び対照と比較して硝子体内ＩＲＤｙｅ８００及びＤＹ−７８１を投与された眼では血管蛇行の有意の上昇が存在した。この事象は炎症を強く示唆し、次に組織学的検査と組み合わせて検討された。
【００３２】
図１７は、アネキシン５ ＩＲＤｙｅ８００に関して眼の硝子体で認められたマクロファージの走査型電子顕微鏡画像であり、染料によって引き起こされた炎症の存在を確認する。
【００３３】
他のアネキシンのマーカーとしての使用
本発明者らは、他のアネキシンマーカー、例えば、すべてが暴露ホスファチジルセリンに対して親和性を有する、アネキシン１１、アネキシン２及びアネキシン６も、アポトーシスを起こしている網膜細胞に結合することを示した。
【００３４】
図１８の画像は、基線時及びスタウロスポリン（ＳＳＰ）投与の２時間後の同じ眼のアネキシン１１ Ｄｙ７７６を使用したインビボＤＡＲＣ画像を示す。白色のスポットは、アネキシン１１がインビボでアポトーシスを検出するために使用し得ることを明らかに示す。
【００３５】
細胞死の他の（すなわちアネキシンではない）マーカーの使用
ヨウ化プロピジウム
本発明者らは、次に細胞死の他のマーカーを評価した。最初に、分断された膜を有する細胞を標識し、それらのＤＮＡ及びＲＮＡを蛍光染色することによって壊死細胞を同定するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）。ＰＩは、それぞれ５３２ｎｍと６４９ｎｍの最大励起及び蛍光波長を有する。図１９の画像は、網膜においてインビボで壊死細胞を標識するＰＩとインビボでアポトーシス細胞を標識するアネキシン４８８の比較を示す。
【００３６】
（ａ〜ｃ）スタウロスポリン（ＳＳＰ）処置の２．０時間後（ａ）、２．５時間後（ｂ）及び３．０時間後（ｃ）の初期（緑色、陽性アネキシン４８８染色のみ）及び後期（黄色、陽性アネキシン４８８及びＰＩ染色）アポトーシス及び壊死（赤色、ＰＩ染色のみ）段階の単一細胞を示す、ＳＳＰ誘導性ＲＧＣ死の微速度撮影動画からとった静止画像。（ｄ）この手法を使用して、連続的な段階のアポトーシス細胞死を受けている、同じ細胞（ポイント１及び２として矢印で示し、同定している）の経時的な変化を追跡することが可能である。どちらの細胞も、アネキシン５標識のピークがＰＩのピークより前に起こることを示し、マーカーの波長最適化が眼における細胞死の視覚化を導き得るという特許請求を裏付ける。
【００３７】
本発明者らはまた、複数の細胞死マーカー、例えばアネキシンＶとヨウ化プロピジウムの同時視覚化が、各々別々のマーカーが波長最適化されている限り、可能であることを発見した。
【００３８】
メロシアニン５４０（ＭＣ５４０）
メロシアニン５４０は、細胞の外膜に結合し、アポトーシスの初期に起こる膜の解体の程度に比例して蛍光を発するという事実によってアポトーシス細胞を同定する染料である。ＭＣ４５０は、それぞれ４８８ｎｍと５７５ｎｍの最大励起及び蛍光波長を有する。図２０の画像は、食塩水とＳＳＰで処置した眼のインビボでのＭＣ５４０標識の比較、及びアネキシン７７６標識との比較を示す。
【００３９】
認められるように、アネキシン７７６は、前記に示すインビボ画像において個別に明らかに見える単一細胞を標識することができる。ＲＧＣアポトーシスのレベルはＳＳＰ投与後にはるかに高い。比較すると、ＭＣ５４０は膜全体を標識するので、広範な蛍光シグナルが検出され、単一細胞を同定することを不可能にするが、ＳＳＰ後のＭＣ５４０の画像は基線より明確に高いレベルの蛍光を有する。
【００４０】
網膜全体にわたるアポトーシス細胞の標識化
本発明者らは以前に、Ａｎｘ−ＦがＲＧＣアポトーシスを同定するために使用し得ることを示した。最近、同じ手法を使用して、アポトーシスを起こしている双極細胞を視覚化することが可能であることを示した。本発明者らはここで、図２１に見られるように、硝子体内投与した場合のＡｎｘ−Ｆが他の網膜細胞も染色できることを示す。
【００４１】
図２２の組織学的切片は、実験的に虚血を誘発させたマウス眼から撮影している。硝子体内Ａｎｘ−Ｆを投与した後、動物を犠死させた。矢印は網膜の種々の層においてＡｎｘ−Ｆに関して陽性染色された４つの細胞を示し、内核層（ＩＮＬ）、外核層（ＯＮＬ）及び光受容器層（ＰＬ）におけるアポトーシスの存在を確認する。
【００４２】
参考文献
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼における細胞死を同定するための、波長最適化標識で標識した細胞死マーカーの使用。
【請求項２】
前記細胞死マーカーがアネキシン又はそのフラグメント若しくはその誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細胞死マーカーがアネキシン５、１１、２又は６である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記波長最適化標識がＤ−７７６である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記マーカーが網膜細胞死を同定するためである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記マーカーが網膜神経細胞死を同定するためである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記マーカーが単一細胞の死を同定するためである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
眼における細胞死を観測するための方法であって、
（ａ）波長最適化標識で標識した細胞死マーカーを被験者に投与するステップと、
（ｂ）画像化装置を使用して被験者の眼から励起波長の画像を作製するステップとを含み、前記画像が眼における細胞死の表示である方法。
【請求項９】
前記細胞死マーカーがアネキシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞死マーカーがアネキシン５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記波長最適化標識がＤ−７７６である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーが網膜細胞死を同定するためである、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーが網膜神経細胞死を同定するためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーが単一細胞の死を同定するためである、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識マーカーが全身的、局所的又は経眼的に投与される、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
画像を作製する前記ステップを反復する、請求項８から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
画像を作製する前記ステップを、リアルタイム画像化を可能にするように反復する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が前記眼の変性疾患を診断するためである、請求項８から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が緑内障又は糖尿病性網膜症である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が脳の神経変性疾患である、請求項８から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患がアルツハイマー病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
最適化波長標識で標識した細胞死マーカーを含有する医薬組成物であって、静脈内、経眼又は局所投与に適する医薬組成物。
【請求項１】
眼における細胞死を同定するための、波長最適化標識で標識した細胞死マーカーの使用。
【請求項２】
前記細胞死マーカーがアネキシン又はそのフラグメント若しくはその誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細胞死マーカーがアネキシン５、１１、２又は６である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記波長最適化標識がＤ−７７６である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記マーカーが網膜細胞死を同定するためである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記マーカーが網膜神経細胞死を同定するためである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記マーカーが単一細胞の死を同定するためである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
眼における細胞死を観測するための方法であって、
（ａ）波長最適化標識で標識した細胞死マーカーを被験者に投与するステップと、
（ｂ）画像化装置を使用して被験者の眼から励起波長の画像を作製するステップとを含み、前記画像が眼における細胞死の表示である方法。
【請求項９】
前記細胞死マーカーがアネキシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞死マーカーがアネキシン５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記波長最適化標識がＤ−７７６である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーが網膜細胞死を同定するためである、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーが網膜神経細胞死を同定するためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーが単一細胞の死を同定するためである、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識マーカーが全身的、局所的又は経眼的に投与される、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
画像を作製する前記ステップを反復する、請求項８から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
画像を作製する前記ステップを、リアルタイム画像化を可能にするように反復する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が前記眼の変性疾患を診断するためである、請求項８から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が緑内障又は糖尿病性網膜症である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が脳の神経変性疾患である、請求項８から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患がアルツハイマー病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
最適化波長標識で標識した細胞死マーカーを含有する医薬組成物であって、静脈内、経眼又は局所投与に適する医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１１−５０６４１８（Ｐ２０１１−５０６４１８Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７５１９（Ｐ２０１０−５３７５１９）
【出願日】平成２０年１２月１５日（２００８．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００４１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７７５０
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０５３６７４６４）ユーシーエル ビジネス ピーエルシー (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１５日（２００８．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００４１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７７５０
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０５３６７４６４）ユーシーエル ビジネス ピーエルシー (20)
【Ｆターム（参考）】
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