短鎖核酸を単離する方法
本発明は、核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製するための方法及びキットであって、以下の方法工程によって特徴付けられる方法及びキット：（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び好ましくはイソプロパノールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、イソプロパノールは、≧２５％（ｖ／ｖ）かつ≦３５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。当該方法は、母親の血液から胎児ＤＮＡを精製するために特に好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸は普通、均一の基礎的パターン：部分的にはタンパク質分解酵素を用いて核酸を含有する出発材料を先ず粉砕することに従って、植物、動物又はヒトの材料から及び細胞培養又はウイルス培養から単離される。非常に多様な方法を用いたその後の工程において個々の構成成分を取除くことができる。さらに、核酸が遊離の形態で存在する、すなわち、それらが細胞の中に存在しない試料材料から核酸を単離してもよい。従って、遊離の核酸が人工的な試料混合物に生じることは可能であるが、たとえば、血液のような天然試料に生じることも可能である。そのような自由に循環する核酸は細胞外核酸とも呼ばれる。
【０００３】
前記核酸を精製するための従来技術の方法はほとんど、以下の２種類の取り出しの原理のいずれかに基づく。
【０００４】
古典的方法は、ほとんどの場合カオトロピック剤を含有するバッファー、及び有 機抽出剤、通常フェノール及び／又はクロロホルムを添加した後、抽出を行うことを含む一工程法に基づくものである。望ましくない付随する物質を有機相と一緒に廃棄する。水性相に保持された核酸は、相を分離することによって次いで取り出され、それによって単離してもよい。たとえば、フェノール及び／又はクロロホルムのような有毒かつ有害な物質の使用は別として、この手順の重要な短所は、核酸水溶液に混入物として残り、非常に時間のかかる精製工程で取り除かれなければならない水溶性物質である。
【０００５】
これらの短所を考慮して、従来技術では代替法がしたがって確立しており、その方法はたとえば、二酸化珪素のような固体支持体物質への核酸の選択的吸着に基づくものである。核酸を含有する出発材料を必要に応じて溶解し、規定した条件下において前記支持体物質に接触させて、核酸が前記支持体物質に結合するのを可能にするが、その際、適当な洗浄工程が実施される。その後、及び任意で、支持体に結合した核酸は好適なバッファーによって支持体物質から溶出される。
【０００６】
たとえば、米国特許第５，２３４，８０９号（ブーム（Boom））は、様々な使用の多様性に好適である核酸を単離する方法を開示している。それは、核酸を含有する出発材料をカオトロピック・バッファーとＤＮＡ結合固相と共にインキュベートすることによって前記出発材料から核酸を単離する方法を記載している。カオトロピック・バッファーは、必要ならば、出発材料の溶解と核酸の固相への結合の双方を達成する。前記方法は、相対的に小さな試料量から核酸を単離するために上手く適合する。ＷＯ９３／１１２２１は類似の原理に基づく方法も記載している。
【０００７】
固相をカオトロピック・バッファーと組み合わせることを含む従来技術では、核酸を精製する方法が多数開示されている。既知の方法のすべてにおいて長鎖核酸は、短鎖核酸（例えば、１０００ｂｐ、５００ｂｐ又はさらに３００ｂｐの長さ）と少なくとも同等に、しかし、ほとんどの場合、それより相当に良好に固相に結合するので、従来技術の方法は、短鎖核酸を効率的に精製する又は長鎖核酸を上回って短鎖核酸をさらに濃縮するためには好適ではない。
【０００８】
短鎖核酸を精製するための好適性の乏しさは、おそらく、前記短鎖核酸の支持体物質への結合が長鎖核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ）のそれよりも劣るという事実に起因しうる。従って、短鎖核酸の大部分は一般の精製方法のほとんどで失われ、短鎖核酸は精製した核酸の中に存在しないか、又は実際より少なく評価される。しかしながら、特定の応用ためには、短鎖核酸を単離すること又は長鎖核酸を上回ってそれを濃縮することが特に望まれる。
【０００９】
好ましくは短鎖核酸を濃縮する又は長鎖核酸から短鎖核酸を分離するために、従来技術では以前、種々の原理が使用されている。たとえば、ＤＥ１０２００６０４５３９１は、特別に設計された固相に試料を数回、適用することを含む、短鎖核酸から長鎖核酸を取り除く方法を記載している。別の方法としては、カオトロピック塩ではなくクエン酸塩を含有する特別な結合バッファーの使用により、このように短鎖核酸を特に結合させることに基づくものがある（ＷＯ２００７／０６５９３４）。
【００１０】
短鎖核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の精製／濃縮は、応用の種々の分野に決定的に重要である。短鎖核酸が中心的な役割を担う領域の１つは出生前診断である。妊娠女性の血液は、内因性の自由に循環するＤＮＡに加えて胎児の自由に循環するＤＮＡも含有する。妊娠女性の血液中で自由に循環する胎児のＤＮＡは母親の自由に循環するＤＮＡとはサイズが異なることが想定される。母親の自由に循環するＤＮＡの長さの平均は５００ｂｐを超えることが多い一方で、胎児の自由に循環するＤＮＡの大半は著しく小さく、長さの平均は５００ｂｐ未満である。好適な精製方法が利用可能であれば、胎児と母親の核酸の間のサイズのこの差異は、濃縮可能とし、かつ胎児のＤＮＡをさらに詳細に検討するために、活用されればよい。胎児起源の自由に循環するＤＮＡを出生前診断に利用することは、胎児にとって危険ではないのでリスクが減るという点で、羊水穿刺又は絨毛膜の採取のような従来の方法よりも有利である。しかしながら、血液中の胎児起源の自由に循環するＤＮＡの量は非常に少ない。妊娠の段階によって、血液１ｍＬは２０〜２６０の間のコピーの胎児ＤＮＡを含有する。従って自由に循環する胎児ＤＮＡの濃度は低いが、自由に循環する胎児細胞の濃度よりは高い。自由に循環する胎児ＤＮＡの濃度は、自由に循環する母親ＤＮＡに比べて極めて低いという問題もあり、結果として、母親の血液から自由に循環する総ＤＮＡを単離した場合、遺伝物質のほんのわずかが胎児起源であり、単離した遺伝物質の大半は母親由来である。多くの場合、母親ＤＮＡのこの高いバックグラウンドが胎児の遺伝区分の検出を妨害し、場合によっては、リアルタイムＰＣＲと同じくらい敏感な検出方法の感度でさえ、胎児ＤＮＡが検出されるのを可能にするには不十分である。
【００１１】
母親の血液から自由に循環するＤＮＡを単離するのに以前採用されていた方法は、胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡを同一程度に精製し、それによって母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの好ましくない比を保つが、胎児ＤＮＡは、総ＤＮＡのほんの一部を構成するにすぎない。今までのところ、母親のＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡが濃縮されたことはない。さらに、短鎖核酸は精製の間上手く捕捉されないことが多いので、胎児の核酸の精製は通常劣っている。しかしながら、たとえば、短鎖の胎児ＤＮＡの効率的な精製及び特定の濃縮が有利となるのは、これが感度を実質的に高めるので自由に循環する胎児ＤＮＡに基づく出生前診断の信頼性も実質的に高めるからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、短鎖核酸を効率的に単離／精製することが可能でもある核酸を単離及び／又は精製する方法を提供するという目的に基づくものである。本発明の別の目的は、前記胎児ＤＮＡが効率的に単離及び／又は濃縮されるのを可能にする、母親の血液から胎児ＤＮＡを単離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
核酸を含有する出発材料から核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程によって特徴付けられる方法によって、本出願において前記目的は達成される：
（ａ）カオトロピック化合物及びアルコール、好ましくはイソプロパノールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≧５％（ｖ／ｖ）かつ好ましくは≦４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは≦３５％（ｖ／ｖ）、及びより好ましくは≦３２%（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に取り外すこと。
【００１４】
本発明の方法によれば、核酸は、特定の反応条件下で支持体物質に固定化される。２つの成分が、支持体物質への短鎖核酸の有効な結合に不可欠であり、すなわち、カオトロピック化合物と分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールである。本発明によれば、支持体物質への結合の間、試料混合物中で≧５％（ｖ／ｖ）である正確なアルコール濃度を選択することが特に重要である。しかしながら、さらに高い、従って≧１５、特に≧１９％（ｖ／ｖ）及び≧２５％（ｖ／ｖ）であるアルコール濃度が好ましい。正しいアルコール濃度が選択された場合、短鎖核酸は、非常に良く或いは（より長鎖の核酸に対して）さらに好ましく、支持体物質に結合することが示されている。カオトロピック物質の濃度を増加させることによって、さらに低いアルコール濃度はある程度バランスを保つことができる。しかしながら、全体として、定義した範囲の上端におけるアルコール濃度は、より良い結果を達成することができる。アルコールの濃度は、結合した核酸のサイズ分画に関し選択性を生じさせる。より高いアルコール濃度では、特に、短鎖核酸はより効率的に結合する。
【００１５】
好ましくは、アルコール濃度はおよそ１９〜４０％（ｖ／ｖ）の範囲内である。なぜならば、この範囲内で、短鎖核酸、特にＤＮＡが結合され、特に良く単離され得るからである。結合条件の精密な調整によって、このことが、長鎖核酸を上回って短鎖核酸が濃縮されるのを可能にしてもよい。この有利な濃度効果は、特に、２５〜４０％（ｖ／ｖ）、２５〜３５％（ｖ／ｖ）、２５〜３２％（ｖ／ｖ）及び２８〜３２％（ｖ／ｖ）の間のアルコール濃度によって達成される。実施例も立証するように、これらの条件下で、長鎖核酸よりも短鎖核酸の方が良好に、従って好ましく支持体物質に結合する。核酸の結合はカオトロピック化合物の濃度によっても影響を受ける。好適なカオトロピック化合物及び濃度は以下に記載されている。相対的に高い濃度のカオトロピック化合物を選択することによってさらに相対的に低いアルコール濃度が採用されるのが可能になる。
【００１６】
任意に洗浄工程を実施してもよい。支持体物質に結合した核酸を前記支持体物質から次いで取り出す、たとえば、短鎖核酸の回収が望まれるのであれば、それ自体既知の方法で溶出する。次いで、本発明により単離／濃縮された核酸を既知の方法でさらに処理してもよく、たとえば、解析してもよい。しかしながら、計画されたその後のさらなる処理又は解析によって、支持体物質に結合した、すなわち溶出されていない核酸を使用することも同様に可能である。方法は試料から核酸を取り出すために利用されてもよい。
【００１７】
本発明の方法は、一工程法として実施することができる。一工程法の長所は、核酸（全体としての）の高い収率を通常達成することであり；精製の間に核酸のほんのわずかな比率が失われる。短鎖核酸が支持体物質に効果的に結合し、それによって本発明の方法の一工程変形により単離／濃縮されるので、このように実施される短鎖核酸の単離／濃縮は多数の応用に対して既に十分なものである。容易に且つ簡単に実施することができるので、一工程法は、また、ユーザーに特に便利である。本発明の方法は良好な収率で短鎖核酸を効果的に単離することができ、長鎖核酸を上回って短鎖核酸を濃縮することさえできるので、実施例で示される比較実験が証明するように、短鎖核酸を単離するための本発明の一工程法は、従来技術で開示される方法よりも明らかに優れている。
【００１８】
特定の使用については、できるだけ効率的に長鎖核酸を上回って短鎖核酸を濃縮することが有利であり；長鎖核酸のバックグラウンドなしで、又は長鎖核酸のバックグラウンドがほとんどないように短鎖核酸が回収されるべきである。この場合、出来るだけ少ない長鎖核酸を精製することが望ましい。特に効果的な方法でこれを達成するために、本発明の一実施形態によれば、短鎖核酸を取り出す／溶出するための実際の単離工程ａ）及び任意でｂ）の前に、長鎖核酸が効率的に希釈される工程（ｘ）が先行する。先行する長鎖核酸の希釈によって、特に純度の高い形態で短鎖核酸が回収されることが可能になる。
【００１９】
核酸を含有する出発材料から短鎖核酸を単離及び／又は精製するための対応する改善された方法は、本発明によれば、以下の方法工程を有する。
（ｘ）少なくとも１つのカオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって前記核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは≦３０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物（ブレークスルー）／上清を接触させることによって前記核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物（ブレイクスルー）／上清を結合させること、ただし、前記アルコールの濃度は、≧５％（ｖ／ｖ）、かつ好ましくは≦４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは≦３５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは≦３２%（ｖ／ｖ）である。
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【００２０】
本発明の方法のこの二工程変形によれば、短鎖核酸を単離／精製するための実際の単離工程ａ）及び任意でｂ）の前には、長鎖核酸を効率的に希釈する工程（ｘ）が先行する。結合工程（ｘ）は、カオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で支持体物質に核酸を結合させることを含む。結合条件及び特に結合の間の全試料におけるアルコールの濃度が、長鎖核酸の希釈に再び不可欠である。工程（ｘ）におけるアルコールの濃度は、≦３０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくはまさに≦２５％（ｖ／ｖ）である。驚くべきことに、２５％（ｖ／ｖ）前後のアルコール濃度はサイズ選択性を反転できることが示されている。カオトロピック化合物の濃度がそれに応じて選択されれば、長い及び／又はさらに長い鎖の核酸は２５％（ｖ／ｖ）未満、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）未満で支持体物質に好ましく結合する（以下を参照のこと）。これらの条件下で、短鎖核酸は支持体物質に結合しないか又はさらに乏しく結合するので、突破物（ブレイクスルー）／上清（利用される支持体物質による）にある。その後の工程ａ）及び任意にｂ）では、そのとき、短鎖核酸は単離されるので、短鎖核酸を特に含有する工程（ｘ）の突破物（ブレイクスルー）／上清から濃縮される。
【００２１】
一工程法（上記参照）の工程ａ）及びｂ）は、二工程法の工程ａ）及びｂ）に非常に類似し、及び／又はそれらは実質的に同一である。最終的に、二工程法では、核酸を含有する出発材料の代わりに、工程（ｘ）からの突破物（ブレイクスルー）／上清が用いられる。従って、一工程法と併せて記載されるのと同じ好ましい条件が二工程法の工程ａ）及びｂ）に適用される。先行する工程（ｘ）は最終的に、少なくともさらに低い量が突破物（ブレイクスルー）／上清に存在するように、長鎖核酸の希釈をさらに達成する。所望であれば、長鎖核酸は、二工程法では工程（ｘ）で結合した支持体物質から同様に溶出され、異なった目的にさらに使用されてもよい。
【００２２】
種々の材料、及び特に生体材料を、核酸を含有する出発材料として、利用してもよい。これらは、たとえば、ウイルス、ファージ及び細菌のような細胞、たとえば、またヒト、動物又は植物の細胞を含む。さらに、しかしながら、方法は、細胞を含有しない試料から、又はそのように調製された試料から遊離の核酸を単離／精製するのにも特に有用である。さらに具体的には、本発明の方法は、ヒト又は動物起源の試料物質、特に、たとえば、血液、血漿、血清、洗口液（マウスリンス；mouth rinse）、尿、脳脊髄液、唾液、糞便、穿刺液(punctates)、上皮塗抹標本、生検及びそのほかの組織又は骨髄試料のような臨床試料からＤＮＡ及び／又はＲＮＡのような核酸を単離するのに好適である。さらに具体的には、本発明の方法は、母親の血液試料、特に血漿から胎児ＤＮＡを単離するのに好適である。本発明の方法は、特に、体液、特に血漿及び／又は血清から自由に循環する核酸、たとえば、腫瘍ＤＮＡ及び腫瘍ＲＮＡを単離するのにも好適である。
【００２３】
特定の場合では、前処理することなく試料を本発明の方法で用いてもよい。しかしながら、多くの場合、試料は先ず好適な方法によって破砕される必要があり、前記試料に存在する生体材料が放出される必要がある。試料及び細胞を破砕するための方法は当業者には知られており、化学的な種類、酵素的な種類又は物理的な種類であってもよい。これらの方法を組み合わせることも可能である。
【００２４】
この関係において、種々の生体材料について種々の因子が有利であることが判っている；原則として、以下の方法が良く適合する：好適なバッファーにおいて、たとえば、グアニジン塩酸塩（ＧＨＣＬ）、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）、グアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム及びその他のようなカオトロピック塩の使用し、たとえば、ＳＤＳ、ＬｉＤＳ又はサルコシルのようなイオン性及び非イオン性の界面活性剤を用いた溶解；たとえば、フレンチプレス、超音波、ガラスボール、ニッケルボール、アルミニウムによる製粉による、又は液体窒素における機械的引き裂き；たとえば、リゾチーム、プロテイナーゼ、プロテイナーゼＫ若しくはセルラーゼによる、又は溶解用の他の市販の酵素のよる酵素的溶解；バクテリオファージ又はウイルスの感染による細胞の溶解；凍結乾燥；浸透圧ショック；マイクロ波処理；温度処理；たとえば、ドライアイス又は液体窒素における加熱又は煮沸又は凍結、及び融解；アルカリ溶解。
【００２５】
議論したように、上記方法は、溶解に関する技術水準であり、良く知られているものであるから、詳細に議論される必要はない。
【００２６】
血液試料からたとえば、ＤＮＡのような自由に循環する核酸を精製する場合、たとえば、母親の試料から胎児ＤＮＡを精製する場合、先ず、細胞及び血液のそのほかの固形性分を取り除き（たとえば、遠心分離によって）、こうして得られた血漿をさらに処理する。前記血漿は細胞を通常含まず、自由に循環する核酸、たとえば、母親及び胎児のＤＮＡを含有する。後者はすでに自由に循環する形態であるから、核酸を放出させるために、血漿からの遊離の核酸の精製は、実際の細胞溶解を必要としない。これは、結果として細胞の内側には位置しない遊離の核酸を含有するそのほかの試料にも適用される。しかしながら、自由に循環する核酸は、タンパク質及び／又はそのほかの物質との複合体であってもよい。この理由のため、核酸を含有する出発材料、たとえば、血漿は先ず、核酸が複合形態から放出されることを確実にする放出バッファーで処理される。放出バッファーの機能及び組成は、細胞の破砕に利用される溶解バッファーのものと同様である；放出バッファーは試料において核酸の放出に好適な条件を生成し、その結果、後者は複合体として存在しない。放出バッファーの添加によって核酸はさらに精製し易くなる。本発明の方法は、従って、無細胞の出発材料に利用されてもよい。その組成によって、核酸を効果的に精製する又は濃縮するために、対応する放出バッファーは溶解バッファーとして機能してもよい。通常、たいていの溶解バッファーを放出バッファーとしても利用してもよい。
【００２７】
本発明によれば、放出バッファー又は溶解バッファーの組成はまた核酸が支持体物質に結合する条件に影響を及ぼすので、カオトロピック剤を含有する放出バッファー又は溶解バッファーの使用は、なおさら特に効果的である。従って、本発明によれば本発明の方法の有効性に不可欠である、試料における結合条件も、たとえば、好適な様式での結合バッファーとの組み合わせで放出バッファー又は溶解バッファーを選択することによって調整されてもよい。本発明に係る放出バッファー又は溶解バッファーは、たとえば、ＧＴＣ又はＧＨＣＬのようなカオトロピック化合物、及び、必要に応じて、たとえばＳＤＳ又はツイーンのような界面活性剤を含有する。これらの物質は、水溶液又は緩衝溶液、すなわち、「放出バッファー」又は「溶解バッファー」に存在してもよい。利用されるバッファーは、たとえば、トリス（tris）、ビシン(bicine)、トリシン(tricine)又はリン酸バッファーのような好適なバッファーであってもよい。或いは、溶解剤又は放出剤は別々に添加してもよい。溶解剤又は放出剤の好適な濃度及び量は、各系、細胞の種類などによって異なり、当業者によって決定されてもよい。具体的な適用、特に血液試料からの胎児ＤＮＡの精製のためには、２〜７Ｍの範囲の濃度のカオトロピック化合物、たとえば、ＧＴＣ、ＧＨＣＬ、又はＮａｌ又は過塩素酸ナトリウム、０．１Ｍ〜１Ｍのアルカリ剤、たとえば、ＮａＯＨ、及び０．１〜５０重量％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、たとえば、ツイーンが有用であることが判っている。
【００２８】
核酸の支持体物質への結合の間、試料混合物にカオトロピック化合物も存在する。カオトロピック化合物は、たとえば、溶解バッファー又は放出バッファーに由来してもよく、及び／又は、しかしながら、たとえば、結合バッファーの形態で別々に添加される。最終的には、核酸の支持体物質への結合の間、試料における結合条件が重要である。ここで、カオトロピック化合物は最終的に溶解度の限界まで存在してもよい。カオトロピック化合物の使用は核酸の効率的な結合に有利である。結合の間、試料におけるカオトロピック化合物の濃度は好ましくは１〜１０モル／Ｌ、特に好ましくは２〜６モル／Ｌの範囲である。好適な化合物の例は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジンチオシアネート、グアニジンイソチオシアネート及びグアニジン塩酸塩である。
【００２９】
結合の間、試料は、たとえば、非イオン性界面活性剤及び特にツイーンのような界面活性剤も有してもよい。前記界面活性剤は、放出／溶解バッファーと共に又は結合バッファーの一部として添加されてもよい。界面活性剤は、たとえば、血清及び血漿の成分の試料における種々の成分の効率的な可溶化を引き起こす。これは、核酸が結合する支持体物質がブロックするのを防いでもよい。これは、シリカ膜が利用される場合、特に有利である。
【００３０】
議論したように、核酸の支持体物質への結合の間、試料におけるアルコールの濃度は本発明の方法において重要である。たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール又はペンタノールのような短鎖の分枝鎖又は非分枝鎖で１〜５の炭素原子を有するアルカノール類を利用することが好ましい。相当するアルコールの混合物も利用してもよい。特に好ましいのは、イソプロパノール又はイソプロパノール様特性を有するアルコール若しくはアルコール混合物を利用することである。アルコールの濃度は、結合工程（長鎖核酸を希釈するための結合工程（ｘ）又は短鎖核酸を結合させるための結合工程（ａ））に応じて異なる。
【００３１】
長鎖核酸が予備工程（ｘ）で希釈されるのであれば、それによって試料からこれらの核酸を取り除くことを可能とするために、長鎖核酸の支持体物質への結合を促進するアルコール濃度が使用される。突破物（ブレイクスルー）又は上清は、前記希釈により、高い比率の所望の短鎖核酸を含有する。
【００３２】
長鎖核酸の結合を促進し、かつそれにより希釈を改善するために、核酸の支持体物質への結合の間のアルコールの濃度は、本発明によれば３０％（ｖ／ｖ）未満である。アルコールの濃度が≦２５％、特に好ましくは≦２０％（ｖ／ｖ）であれば、特に良好な結果が達成される。これらの条件下では長鎖核酸は特に良好に結合する。このことは、≧１モル／Ｌ、好ましくは≧２モル／Ｌ、特に≧２．４モル／Ｌのカオトロピック化合物の存在下で特に真実である。さらに、長鎖核酸を希釈するためのカオトロピック剤の濃度は、好ましくは≦４モル／Ｌ、さらに好ましくは≦３．５モル／Ｌ、一層さらに好ましくは≦３．２モル／Ｌ、最も好ましくは≦３．１モル／Ｌである。試料におけるカオトロピック化合物の好ましい濃度は、前記カオトロピック化合物の種類及び／又は強度にさらに依存する。長鎖核酸の結合を促進するために、たとえば、グアニジンチオシアネートのような特に強いカオトロピック化合物は低い濃度で利用されるべきである。より長鎖の核酸を結合させ、それによりそれらを希釈するために、１５〜２５％、好ましくはおよそ２０％のアルコール濃度と共に、グアニジン塩酸塩は、≧２．５モル／Ｌ且つ≦３．１モル／Ｌの濃度で好ましくは利用される。
【００３３】
二工程法の工程ａ）、及び一工程法の工程ａ）は、短鎖核酸の好ましい結合のために、好ましくはカオトロピック化合物の約同一濃度でさらに高いアルコール濃度を利用する。短鎖核酸の結合を改善するには、結合の間の試料におけるアルコール濃度は、好ましくは≧１９％（ｖ／ｖ）、特におよそ１９〜３６％の範囲内である。およそ２５％（ｖ／ｖ）を超える濃度では、特に前記核酸があらかじめ希釈されている場合、短鎖核酸は、長鎖核酸を上回って濃縮され得ることが分かった。このことは、カオトロピック化合物の濃度の調整に特に適用され；好適な濃度は上述の通りである。例えば母親の血漿のような試料は通常、長鎖核酸を優勢に含有するので、この結果は、血液試料から例えば胎児DNAのような細胞外核酸を精製するのに特に有利である。従って、本発明の方法は、短鎖核酸のさらに効果的な濃縮を達成することができる。特に好ましくは、短鎖核酸の好ましい結合のために、核酸が支持体物質に結合する間、試料混合物はおよそ３０％（ｖ／ｖ）のアルコールを含有する。これは、短鎖核酸の＞２倍、＞５倍、又はさらに１０倍を超える濃縮を達成する、短鎖核酸を濃縮するための効果的な方法を提供する。一般に、方法の濃縮ポテンシャルは、２００ｂｐの核酸断片と１０００ｂｐの核酸断片の収率を比較することによって判定されてもよい。その結果、本発明の方法は従来技術の方法より明らかに優れている。
【００３４】
一工程法又は二工程法の一実施形態によれば、工程（ａ）における試料混合物中のアルコールは、以下から成る群から選択される濃度である。
≧１９％（ｖ／ｖ）
≧２５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦５０％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦４０％（ｖ／ｖ）
≧１９〜≦３６％（ｖ／ｖ）
≧１９〜＜３５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦３５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦３２％（ｖ／ｖ）
≧２８〜≦３２％（ｖ／ｖ）。
【００３５】
工程（ｘ）において長鎖核酸を希釈することを含む二工程法では、工程ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度である。特に、アルコール濃度が工程（ａ）において増加されるので、方法工程（ｘ）から方法工程ａ）への移行においてカオトロピック化合物の濃度を下げないことによって顕著にさらに良好な結果が達成される。支持体物質への短鎖核酸の結合を促進するために、実際の単離工程ａ）において工程（ｘ）より高い濃度のカオトロピック化合物を採用することが好ましい。
【００３６】
一実施形態によれば、本発明の方法は以下の特徴の少なくとも１つ有する：
・工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が≧１モル／Ｌから溶解度の限界までであること、及び／又は、
・工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が≧２モル／Ｌ、≧２．４モル／Ｌ又は≧２．６モル／Ｌであること、及び／又は、
・工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度であること、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が、あらかじめ溶解バッファーで処理されること、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が細胞を含有せず、かつ細胞溶解が行われないこと、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が、あらかじめ放出バッファーで処理されること、及び／又は、
・フェノール抽出が行われないこと、及び／又は、
・単離された核酸がＤＮＡ分解酵素で処理されること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも３０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも５０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも６０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも２倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも５倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも１０倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ及び／又は≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ及び／又は≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮されること、及び／又は
・細胞外核酸が単離されること。
【００３７】
核酸が結合する支持体物質は、好ましくは、珪酸含有物質、シリカゲル、二酸化珪素、ガラス、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、ゲル状シリカ、セラミックス、又はポリマー支持体物質及びポリスチレンビーズの群に由来する核酸が結合する固相である。最終的に重要なのは、支持体物質が核酸を結合させることが可能であるという事実である。シリカ材を利用することが特に好ましい。シリカ膜とシリカ又はガラスの表面を有する磁性粒子との双方の使用がここでは有用であることが判っている。後者は本質的にビーズ様又は球状であってもよく、０．０２〜３０μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍ、特に好ましくは０．１〜１０μｍの範囲内の粒度を好ましくは有する。本発明の方法で有利に採用されてもよい磁性シリカ粒子は、たとえば、国際出願ＷＯ０１／７１７３２に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００３８】
核酸を含有する材料と共に支持体マトリクスをインキュベートした後、残っている試料流体から核酸を取り出す。これは、通常、磁性シリカ粒子を用いた場合、本発明により粒子に結合した核酸を磁場を用いて分離することによって達成される。たとえば、インキュベートが行われた容器の壁に磁性粒子をひきつけてもよい。次いで、磁性粒子に結合していない試料の成分を含有する液体を除去してもよい。工程（ｘ）では上清がさらに処理される（長鎖核酸は磁性粒子に結合する）；工程ａ）では、短鎖核酸は、磁性粒子に結合され、洗浄工程の後必要に応じて、工程ｂ）において粒子から任意に溶出される。処理は、インキュベートが行われた容器の種類に依存する。液体を除去するための好適な方法工程の例は、静かに注ぐこと（デカンティング；decanting）、ピペッティング、濾過すること又は吸引することによって液体を除くものである。
【００３９】
議論したように、たとえば、シリカ膜を利用することも可能である。遠心分離によって又は真空を適用することによって又は圧力によってここから液体を除去してもよい。精製される核酸は、本発明の方法の応用の多くで、特に母親の血液試料から胎児ＤＮＡを精製する場合、大きな体積に低濃度で存在する。従来技術におけるシリカ膜の使用は、膜を場合によりブロックする大きな試料体積の問題にぶつかることが多い。しかしながら、本発明の方法によれば、特定のバッファー物質／バッファー濃度が利用されるので、この問題は生じない。界面活性剤が利用されるのであれば、それはここでは特に有利である。
【００４０】
本方法によって単離されてもよい核酸の例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアの、後成的（エピジェネティック）に修飾された、一本鎖の、二本鎖の、環状の、プラスミドの、コスミドの、人工的な又は合成の核酸、及びｃＤＮＡ並びにそれらの断片である。本発明の方法は、長さ≦１０００ｂｐ、≦８００ｂｐ、≦５００ｂｐ、又は≦３００ｂｐの短鎖核酸（たとえば、非コーディングＲＮＡ、たとえば、ｍｉＲＮＡ、又は合成核酸を含む任意の形態でのＤＮＡ及びＲＮＡ）を濃縮するのに特に好適である。一実施形態によれば、長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ、≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ、≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮される。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを精製することが好ましい。長さ≧５０ヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡを特に効率的に精製することができる。短鎖ＲＮＡを得るには、精製した核酸を好ましくはＤＮＡ分解酵素で処理する。
【００４１】
特にカオトロピック剤の濃度との組み合わせでアルコール濃度を選択することによって単離される核酸のサイズが変化してもよく、制御されてもよい。本発明の方法の双方の変形（一工程法及び二工程法）は、短鎖核酸が効率的に単離されるのを可能にする。本明細書で記載されるように、結合条件を適宜調整することによって短鎖核酸を特異的に濃縮してもよい。下記の実施例によっても証拠付けられるように、方法は胎児の核酸を濃縮するのに特に好適である。
【００４２】
従って、本発明の方法は、母親の血液から、たとえば胎児ＤＮＡのような細胞外核酸を単離するために有利に採用されてもよい。従って、本発明は、血液試料、特に血漿又は血清から胎児の核酸を濃縮する方法も提供するが、該方法は、本発明の短鎖核酸を単離／精製する方法が実施されることを特徴とする。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４３】
しかしながら、応用のさらなる分野は、たとえば、法医学及び小さな核酸の精製が不可欠であるそのほかの分野に見つけることができる。さらに、本発明の方法は、たとえば、血液のような試料からの自由に循環する腫瘍の核酸を精製することについての診断において採用されてもよい。
【００４４】
本発明はまた、試料からの核酸を濃縮するが、血液試料からの胎児の核酸を濃縮しない方法も提供し、該方法は、本発明の短鎖核酸を単離／精製する方法が実施されることを特徴とする。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４５】
本発明の方法は、診断における使用に特に好適である。それは自動化することができるので、対応する精製ロボットでの使用に採用することもできる。
【００４６】
本発明はまた、核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製するためのキットも提供するが、該キットは、本発明の方法を実施するためのバッファー及び／又は試薬及び任意に少なくとも１つの核酸が結合する支持体物質を有する。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４７】
対応するキットは、血液試料から胎児ＤＮＡを精製するために使用されてもよい。さらに、対応するキットは、試料から短鎖核酸を精製するが、血液試料から胎児ＤＮＡを濃縮しないために提供される。
【００４８】
本発明のキットは、特に診断の分野において、及び医療応用のために利用することができる。それらは自動化された方式で利用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１の結果を示す。
【図２】実施例１の結果を示す。
【図３】実施例２の結果を示す。
【図４】実施例３の結果を示す。
【図５】実施例４の結果を示す。
【図６】実施例４の結果を示す。
【図７】実施例５の結果を示す。
【図８】実施例５の結果を示す。
【図９】実施例５における反応条件を示す。
【図１０】実施例５の結果を示す。
【図１１】実施例６の結果を示す。
【図１２】実施例６の結果を示す。
【図１３】実施例６の結果を示す。
【実施例】
【００５０】
本発明は、今や下記の実施例に基づいて説明される。実験は、下記の実験プロトコールに基づいて実施された。
【００５１】
母親のＤＮＡを上回る胎児ＤＮＡの付随する濃縮を伴って母親の血液から自由に循環する前記胎児ＤＮＡを単離することに本発明の方法を適用する出発点は、文献に記載された、２つの核酸種の平均長が異なるという発見にある。胎児ＤＮＡの平均長が５００ｂｐより短い一方で、母親のＤＮＡの平均長は５００ｂｐよりも長い。
【００５２】
実施例１：胎児ＤＮＡ及び母親ＤＮＡの平均長を決定するアッセイ
その中で自由に循環するＤＮＡのサイズ分布を調査するために、男胎児を妊娠した女性の血液から生成した３つの異なる血漿プールを用いた。前記血漿プールは、プールＡ、Ｂ及びＣである。プールＡは、妊娠の第１期〜第３期における妊娠女性の血液試料からの血漿を含んでいた。プールＢ及びプールＣはそれぞれ、妊娠の第１期〜第２期における妊娠女性から採取した血液からの血漿を含み；依然として相対的に少量の自由に循環する胎児ＤＮＡが存在するが、臨床診断の時期という点では相対的に高い関連性を有する時期である。
【００５３】
使用した出発材料は、１０ｍＬの血漿、プールＡの場合、５ｍＬの血漿であった。手順は、１０ｍＬの体積に適合させたキアアンプ・ブラッドDNAミディプロトコル（QIAamp blood DNA Midi protocol）（キアゲン）に従った。３００μＬのＡＥバッファー（キアゲン、市販）を溶出のための各場合に使用した。溶出後、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿を行い、乾燥させたペレットを１５μＬのバッファーＥＢ（キアゲン、市販）に再懸濁した。アガロースゲル電気泳動の後、個々のサイズの分画をゲルから切り出し、ゲル抽出用のキアクイック・バキューム・プロトコル（QIAquick vacuum protocol）に従ってゲル抽出を行った。各ゲル分画について、溶出は１００μＬとし、その後のＰＣＲで各場合、２０μＬの溶出液をデュープリケートで用いた。適切なプライマー、先ず自由に循環する胎児ＤＮＡを検出するためのＳＲＹ遺伝子座を用いて増幅を行った。ＳＲＹは男性個体でのみ検出可能である。確実に男の胎児を持つ妊娠女性からの血液のみを用いたので、ＳＲＹのシグナルはすべて胎児起源のＤＮＡに起因した。母親の血液で自由に循環する総ＤＮＡを検出するためにｃ−ｍｙｃ遺伝子座の適切なプライマーを用いて増幅を行った。前記増幅は、ＡＢＩ７５００機器（アプライドシステムズ）にて行った。それからの結果は図１及び図２に示す。
【００５４】
図１は、使用したプールの関数としての胎児ＤＮＡのサイズ分布を示す。
図２は、使用したプールの関数としての総ＤＮＡのサイズ分布を示す。
【００５５】
この実験は、文献に記載されるように、胎児ＤＮＡが、短い断片としてのみ存在することを明らかにしている。大半は明らかに３００ｂｐ未満の分画内にあり、有意な部分が３００〜５００ｂｐの断片長さを示す。母親の血液において自由に循環する胎児ＤＮＡの非常に小さな部分のみが５００ｂｐより長い。他方、母親ＤＮＡのすべてが５００ｂｐより大きいわけではない。血中で自由に循環する母親ＤＮＡの約半分は同様に長さが５００ｂｐ以下であるが、別の半分は５００ｂｐより顕著に長い。従って、単離／濃縮された核酸のサイズ分画によって母親ＤＮＡを上回る胎児ＤＮＡの有意な相対的な濃縮を達成することができる。
【００５６】
実施例２
胎児ＤＮＡ（大半が３００ｂｐより短い、実施例１を参照）及び母親ＤＮＡ（主として５００ｂｐより長い）の異なったサイズ分布を模倣するために、２つの異なったＰＣＲアンプリコンをバックグラウンドとして血漿に加えた。２１９ｂｐの断片が胎児ＤＮＡを模倣し、長さ１０１８ｂｐの断片が母親ＤＮＡを模倣するはずである。第１の実験で相対的に高い量の前記ＰＣＲアンプリコンをこれに用い、すなわち、各場合で、血漿６００μＬに２×１０6コピーであった。手順は以下のプロトコールに従った。
【００５７】
５ｍＬの容器における６００μＬの血漿に、９０μＬのプロテアーゼ（キアゲン）とグアニジンを含有する６００μＬバッファーＡＬ（キアゲン、市販）とを加えた。ボルテックスによって混合した後、溶解のために混合物を５６℃で１５分間インキュベートした。溶解の後、長さ２１９ｂｐ又は１０１８ｂｐのＰＣＲアンプリコンを溶解物に加えた。試料全体で６．９％（ｗ／ｖ）のイソプロパノールの濃度を生じるように１００μＬのイソプロパノールで結合条件を調整した。
【００５８】
ボルテックスによる混合の後、室温で１０分間インキュベートした。結合のために、シリカの表面を有するマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）磁性粒子５０μＬを加え、混合物を振盪器上で５分間結合させた。結合後、磁石によって粒子を上清から分離し、上清を取り出した。上清はさらなる処理まで４℃で保存した。
【００５９】
マグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）粒子の処理
上清を取り出した後、プレート振盪器上で５分間、磁性粒子を７５０μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）と混合し、次いで粒子懸濁液を１．５ｍＬの反応容器に移した。この容器における磁性分離の後、上清を除去し、廃棄した。次いで、７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノール（各場合、振盪器上での５分間のインキュベート後）によって粒子を連続して洗浄した。アルコールで洗浄した後、５６℃の加熱ブロックにて１０分間、粒子を乾燥させた。粒子に結合した核酸は、ＲＮＡ分解酵素を含まない水(キアゲン）２００μＬを用いて溶出させたが、前記溶出は、再び５分間振盪することによって実施した。磁性分離後、新しい容器に溶出液を移した。
【００６０】
結合の上清の処理
結合の上清／突破物（ブレイクスルー）（磁性粒子に結合しない物質）を以下のように後処理した。結合後の上清を２ｍＬのバッファーＢ６（２．５ＭのＧｕＨＣｌ、５０％イソプロパノール）と混合し、３２．４％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール濃度を生じ、ボルテックスによって混合し、室温で１０分間インキュベートした。
【００６１】
インキュベートの後、最初の結合混合物（ＡＷ１（キアゲン、市販）、ＡＷ２（キアゲン、市販）、エタノールによる洗浄、ＲＮＡ分解酵素を含まない水での溶離）で記載されたのと同じ手順で５０μＬのＭａｇＡｔｒａｃｔ粒子を加えた。或いは、結合後の上清に１００％のイソプロパノール（バッファーＢ１１）２ｍＬを加え、こうして６１．９％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールの濃度を生じた。同等のアリコートを溶出液から取り出し、リアルタイムＰＣＲにより１１９ｂｐのアンプリコンを増幅したが、該アンプリコンは、２１９ｂｐ断片及び１０１８ｂｐ断片双方からと同一の断片を生じる。ＰＣＲの間にＳＹＢＲグリーンを用いてアンプリコンを検出した。
【００６２】
これは結果として図３に示す画像を生じた。
【００６３】
この実験は、選択された結合条件下では、２１９ｂｐ断片と１０１８ｂｐ断片双方の核酸のほんのわずか、各場合、たった約１０％しかマグアトラクト（ＭａｇＡｔｒａｃｔ）粒子に結合しないことを明らかにしている。しかしながら、バッファーＢ６又はＢ１１による結合条件の再調整は、驚くべきことに、断片のサイズによる収率の差異を生じた。バッファーＢ６を用いることにより８０％を超える短いＤＮＡ（胎児ＤＮＡを表す）を回収することが出来る一方で、長いＤＮＡ（母親ＤＮＡを表す）の結果は、約５０％の収率にすぎない。バッファーＢ１１を用いることは、対照的に、２つのＤＮＡ断片の長さの間で収率の実質的な差異は生じない。
【００６４】
この実験は、好適な条件下で２つの固相を用いた二工程結合方式により母親ＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡを濃縮することができ、胎児ＤＮＡの収率ではほんのわずかな損失が記録されることを明らかにしている。
【００６５】
実施例３
手順は実施例２に記載したとおりであったが、今回は、血中における実際の自由に循環するコピー数のより現実的な状況を模倣するために、たった２００，０００コピーの規定した断片を用いた。今回、結果的に２０．３％（ｖ／ｖ）（上記参照）のイソプロパノール濃度を生じる１００μＬのバッファーＢ１１（上記参照）＋１．２ｍＬのバッファーＢ６を用い、第１の条件下でマトリクスへの結合を行った。マトリクスへの結合の代替条件については、１００μＬのバッファーＢ１１と２．０ｍＬのバッファーＢ６を血漿溶解物に加えた。さらに、各場合、結合混合物にて、二つの前述のバッファー条件下でＤＮＡ断片をマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）マトリクス又はキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに結合させた。
【００６６】
これについての手順は以下のとおりであった。バッファーＢ１１とＢ６を上清に加え、混合し、室温にて１０分間インキュベートした。２つの試料の溶解物を合わせ、真空下で延長チューブ（キアゲン）を用いてキアアンプミニカラム(QIAamp Mini column)（キアゲン）に適用した。１０００μＬ（マグアトラクト（ＭａｇＡｔｒａｃｔ）粒子への結合用）又は７５０μＬ（キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムへの結合用）のＡＷ１（キアゲン、市販）、ＡＷ２（キアゲン、市販）及びエタノールによって連続して洗浄を行った。乾燥には、カラムを１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、５６℃の加熱ブロックに５分間入れた。実施例２に記載したように、マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子を処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水２００μＬによって、ここでも溶出を行った（１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心）。その後のリアルタイムＰＣＲはここで図４に示す画像を生成した。
【００６７】
驚くべきことに、この実験は、同一バッファー組成で、固相として磁性粒子を採用しようと、シリカ膜を採用しようとほとんど差異がないことを示している。１．２ｍＬのバッファーＢ６の添加が、得られたＤＮＡ試料で濃縮された相対的に長いＤＮＡ断片（およそ１０００ｂｐ）をもたらす一方で、驚くべきことに、逆に、２．０ｍＬのバッファーＢ６の添加によって短いＤＮＡ断片（およそ２００ｂｐ）が濃縮される。シリカ膜（キアアンプミニ（QIAamp Mini））を用いた場合、ＤＮＡの収率は、全体的にマグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）粒子を用いたよりも高いが、サイズ依存のＤＮＡ結合もあまり顕著ではない。その結果、二工程ＤＮＡ抽出（最初の結合のＤＮＡを含有する上清をさらに用いてシリカ膜に結合させる）における磁性粒子（第１のマトリクス）とシリカ膜（第２のマトリクス）との組合せは、二工程にて短いＤＮＡ断片を効果的に濃縮するのに顕著に適しているので、第２のマトリクスで母親ＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡを効果的に濃縮するのにも適している。
【００６８】
実施例４
手順は実施例３で示したものに類似するが、今回は、本物の血液試料を用い、二工程結合法を採用した。これには、第１の結合工程のための試料に１．２ｍＬのバッファーＢ６を添加することと、その後の、合計で２．０ｍＬのバッファーＢ６への追加のバッファーＢ６を用いた第１の結合工程の突破物（ブレイクスルー）又は上清を調整することが含まれた。出発材料は、確実に男の子を身ごもっている第１期と第２期の妊娠女性の血漿試料のプールであった。胎児ＤＮＡはその後のリアルタイムＰＣＲにてＳＲＹ遺伝子座を増幅することによって検出し、総ＤＮＡは１８Ｓ遺伝子座（実施例１も参照）を増幅することによって検出した。比較のために、従来技術に相当するキアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルス真空プロトコールに従って、一カラムプロトコールを実施した。結果を図５に示す。
【００６９】
この実験の結果は実施例３の結果と一致して、２１９ｂｐと１０１８ｂｐの断片による人工的な系が実際の状況（実施例４）の良好な模倣であることを明らかにしている。第１のマトリクスを介して胎児ＤＮＡが実際上失われない一方で、有意な量の母親ＤＮＡは既に前記第１のマトリクス（ここでは、マグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）磁性粒子）に結合している。従って、母親ＤＮＡはこの工程（ｘ）で効率的に希釈されるので、第２のカラムを介した精製の間、既に枯渇している。従来技術（ＭｉｎＥｌｕｔｅ一工程）と比べて、２マトリクス法は、胎児ＤＮＡの増加した絶対数を産出するだけでなく、第１のマトリクスを介した母親ＤＮＡの少なくとも部分的な枯渇のために、溶出液における母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの顕著に良好な比を生じ、母親の血液からの胎児の遺伝物質の検出力を明らかに進歩させている。図６は、母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの向上した比をもう一度説明する。従来技術に係る一工程精製が溶出液で約１５％の胎児ＤＮＡの比率を生じる（ＳＲＹ／１８ＳデュプレックスリアルタイムＰＣＲによって定量された）一方で、二工程精製による比率は、２倍を超えて、３０〜４０％である。
【００７０】
実施例５
手順は実施例４に記載されたとおりであるが、今回は、体積のさらに大きい血漿を用いた（反応混合物当たり３ｍＬ）。さらに、結合表面（マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子及びキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラム）の種々の組み合わせ及び種々の量のマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）を互いに比較した。さらに、膜二工程プロトコールにおける溶解をたった１５分間ではなく３０分間続けた。結果を図７に示す。この実験は、以前の実験結果を裏付けている。従来技術の一工程プロトコールと比べて、本発明に係る二工程プロトコールは、第２の結合工程でシリカ表面を持つ磁性粒子又はシリカ膜のいずれかを使用するかに関わりなく、母親ＤＮＡに対する改善された胎児ＤＮＡの比を常に生じる。３０分間の延長した溶解はここでは、胎児ＤＮＡに有利に、母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比をさらに改善すると思われ、それによって母親ＤＮＡを顕著に枯渇させるのを可能にする。比の前記改善を図８に示す。
【００７１】
従来技術に係る１−マトリクスプロトコールがたった約１５％の母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比を生じる一方で、２−マトリクスプロトコールによってこの比を５０％の胎児ＤＮＡまで増加させることができる。従って、母親の血漿から精製した循環するＤＮＡにおける胎児ＤＮＡの比率を従来技術に比べて顕著に増加させることができる。
【００７２】
図９に示す表は、（本発明の一工程法により）核酸が支持体物質に結合する、試料における種々の反応条件を示す。マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子を支持体物質として採用した。結果を図１０に示す。
【００７３】
実施例６
ヒトの血漿から自由に循環するＤＮＡを抽出するための本発明の方法の効率を比較するために、以下のプロトコールを互いに比較した。
１．従来技術で採用された自由に循環するＤＮＡの一工程法、すなわち、以下に特定される改変キアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルスプロトコール
２．自由に循環するＤＮＡを抽出／単離する本発明の一工程プロトコール（「一工程」）
【００７４】
この実験は、プロトコール当たり４回の抽出の反復において男性供血者のプールした血漿を採用し、調べた。特定のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。５ｍＬの血漿を用いた。ＤＮＡは５０μＬに溶出した。
【００７５】
１．改変キアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルス真空プロトコール−従来技術
５ｍＬのＥＤＴＡ入り血漿から自由に循環する核酸を単離した。プロトコールは以下のように実施された。
【００７６】
放出条件
７５０μＬのキアゲンプロテアーゼ（プロテアーゼ溶媒に溶解）をピペットで５０ｍＬの容器に入れた。その後、５ｍＬの血漿と５ｍＬのグアニジン含有バッファーＡＬ（５．６μｇのキャリアＲＮＡと共に）を加えた。容器を閉じ、均質な溶液を得るためにボルテックスでよく撹拌した。次いで前記均質な溶液を５６℃の水槽で３０分間インキュベートした。
【００７７】
マーカー断片の添加
母親の核酸と混合された胎児の核酸の状況を模倣するために、次いで２０μＬのマーカー断片混合物を均質な混合物に加えた。この目的で、各場合、２００，０００コピーの２１９ｂｐ断片（胎児ＤＮＡに相当する）と１０１８ｂｐ断片（母親ＤＮＡに相当する）を加えた。
【００７８】
結合
溶解物に６ｍＬのエタノールを加えた。混合物をボルテックスで撹拌し、氷上で５分間インキュベートした。キアバック（ＱＩＡｖａｃ）２４真空装置に連結された延長チューブとともに、溶解物をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムにロードした。前記真空を適用することによって溶解物をカラムに通した。延長チューブを慎重に外した。
【００７９】
洗浄工程
６００μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）をカラムに適用し、真空を適用した。７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノールとを用いて洗浄工程を繰り返した。
【００８０】
カラムを２ｍＬの回収チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。次いでカラムを新しい回収チューブに移し、５６℃の加熱ブロックにて１０分間乾燥させた。
【００８１】
溶出
乾燥させたカラムを１．５ｍＬの容器に入れ、５０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）を各カラムに適用し、３分間インキュベートして、１分間１４，０００ｒｐｍで遠心した。
【００８２】
この方法で得られた核酸は溶出液に存在する。
【００８３】
２．本発明の一工程法による自由に循環する核酸の単離
放出
７５０μＬのキアゲンプロテアーゼ（プロテアーゼ溶媒に溶解）をピペットで５０ｍＬの容器に入れた。５ｍＬの血漿と５ｍＬのグアニジンを含有する溶解／放出バッファーＡＬ（キアゲン、市販、キャリアＲＮＡなし）を加えた。
【００８４】
容器を閉じ、均質な溶液を得るためにボルテックスでよく撹拌した。次いで前記均質な溶液を５６℃の水槽で３０分間インキュベートした。
【００８５】
マーカー断片の添加
ここでもまた、再び、２０μＬのマーカー断片混合物を加えた（母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比を模倣するために各場合、２００，０００コピーの２００ｂｐ断片及び１０００ｂｐ断片）。
【００８６】
結合
次いで結合バッファーを加えることによって以下の結合条件を調整した：約２５〜３５％のイソプロパノール及び２Ｍを超えるカオトロピック化合物。混合物における反応条件は支持体物質への短鎖核酸の結合効率に不可欠なので、バッファーではなく試料全体における反応条件が重要である。
【００８７】
試料をボルテックスで撹拌し、氷上で５分間インキュベートした。
【００８８】
キアバック（ＱＩＡｖａｃ）２４真空装置に連結された延長チューブとともに、結合バッファーと混合した溶解物をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムにロードした。前記真空を適用することによって溶解物をカラムに通した。次いで延長チューブを慎重に外した。
【００８９】
洗浄工程
６００μＬの洗浄バッファー、たとえば、ＡＷ１（キアゲン、市販）をカラムに適用し、真空によって除いた。７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノールによるさらなる洗浄工程が続いてもよい。
【００９０】
洗浄したカラムを２ｍＬの回収チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。次いでカラムを新しい回収チューブに置き、５６℃の加熱ブロックにて１０分間乾燥させた。
【００９１】
溶出
カラムを１．５ｍＬの容器に入れ、５０μＬの溶出バッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）をカラムに適用し、３分間インキュベートを行い、その後１分間１４，０００ｒｐｍでの遠心工程を行った。短鎖核酸は主として溶出液に存在する。
【００９２】
結果
使用されるタックマン（Ｔａｑｍａｎ）試料と共に（ＤＮＡ抽出当たり４回のＰＣＲ反復）、定量デュプレックスリアルタイムＰＣＲによって個々のプロトコールによるＤＮＡの収率を測定した。先ず、Ｙ染色体標的（ＤＹＳ１４）と１８ＳｒＤＮＡ特異的標的によってＤＮＡを判定した。双方の方法によって最終的に試料中のＤＮＡ濃度を決定した。１８ＳｒＤＮＡは両方の染色体に存在するので、Ｙ染色体標的の２倍量で存在する。ＤＮＡの収率は、血漿のｍＬ当たりの半数体ゲノムのコピーとして示した。
【００９３】
小さいＤＮＡ断片の濃度は、デュプレックスリアルタイムＰＣＲにおける濃縮された２００ｂｐ断片と１０００ｂｐ断片にて独立して決定された。
【００９４】
結果を図１１に示す。
【００９５】
図１１は、試料（各抽出方法について４つの試料が測定された）当たりのＤＮＡ収率を示す。従って、個々の方法によって得られる総ＤＮＡ含量が示されている。概観が示すように、本発明の一工程法は、従来技術において知られる一工程法（ミンエリュート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ））よりも明らかに高い収率を達成する。ＤＮＡ収率は何倍も高く、これは、特に発現／存在が低い核酸を測定するのに特に有利である。
【００９６】
図１２は、与えられた２００ｂｐ（胎児の核酸を模倣する）と１０００ｂｐ（長鎖の母親の断片を模倣する）のＤＮＡ断片の収率を示す。上記で議論したように、２００ｂｐ断片と１０００ｂｐ断片は、１：１の比、すなわち、それぞれ２００，０００コピーずつ与えられた。図１２に示したグラフは、精製した核酸について長鎖核酸に対する短鎖核酸の比が依然として１：１であるかどうか、或いは短鎖核酸が濃縮されたかどうかを示す。図１２が明らかにするように、従来技術の一工程法（ミンエリュート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ））はおよそ１：１の長鎖核酸と短鎖核酸の比を有する。従って、短鎖核酸は濃縮されていない。図１２の下の表もまた、試料からどれだけの個々の断片（２００ｂｐと１０００ｂｐ）が得られたかを示す。従って、たとえば、６２．５％の２００ｂｐ断片と３６％の１０００ｂｐ断片が精製されたという情報は、当初与えた２００，０００コピーの２００ｂｐ断片の６２．５％と２００，０００コピーの１０００ｂｐ断片の３６％が精製され、よって単離されたことを示す。示されるように、本発明の一工程法によって短鎖核酸は長鎖核酸を上回って明らかに濃縮されている。比は、もはや（与えられた）１：１ではないが、実質的により多くの短鎖核酸が精製され、よって溶出液に濃縮された。従って、本発明の方法は、従来技術より明らかに優れている。
【００９７】
精製された１０００ｂｐ断片に対する２００ｂｐ断片の比はさらに図１３に示される。従来技術において知られる一工程法がおよそ１の値を達成する一方で、本発明の一工程法における比は、優先的に濃縮／単離される短鎖核酸の方向に明らかにシフトしている。長鎖核酸が最初に予備工程で希釈される本発明の二工程法は５〜１０倍の濃縮をさらに達成する。
【００９８】
本発明の一工程法は、結果が示すように、従来技術において知られる一工程法より明らかに優れている。本発明の一工程法は、調製の間に小さな核酸を濃縮するが、それは、短鎖核酸の好ましい結合をもたらす結合の間の独特の反応条件に起因する。
【００９９】
実施例７
５ｍＬの血漿又は血清からの核酸、特に循環するＲＮＡの単離を以下に記載する。
【０１００】
１３５０μｇの凍結乾燥したキャリアＲＮＡを含有する容器に１３５０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販、グアニジン含有）を加え、それによって１μｇ／ｍＬの溶液を作る。前記１μｇ／μＬの溶液を次いで、バッファーＡＬ（キアゲン、市販、グアニジン含有）と混合する。試料の数によって混合比を調整する。単一試料の処理については、８．５ｍＬのバッファーＡＬを５．６μＬのバッファーＡＶＥと混合する。さらに多い試料については、それに応じて比を合わせなければならない。混合のために容器を１０回前後に動かす。
【０１０１】
６ｍＬのプロテアーゼ溶液（キアゲン、市販）を凍結乾燥したキアゲンプロテアーゼ（７．５Ａ．Ｕ．市販）に加え、慎重に混合する。
【０１０２】
５００μＬのキアゲンプロテアーゼを５０ｍＬの容器（チューブ）にピペットで入れ、５ｍＬの血漿を加える。その後、キャリアＲＮＡ（上記参照）と混合した８．５ｍＬのバッファーＡＬを加え、物質をボルテックスで混合する。
【０１０３】
混合した試料を５６℃で３０分間インキュベートする。
【０１０４】
７．５ｍＬの結合バッファーを溶解物に加える（約０．５〜１．５モル／Ｌ、好ましくは約１モル／Ｌのグアニジンと約６０〜９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは７０％を超えるイソプロパノールを含有する）。混合物をボルテックスで３０秒間撹拌し、氷上で５分間インキュベートする。開放キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに置かれた延長チューブと共に、キアバック２４プラス（ＱＩＡｖａｃ２４Ｐｌｕｓ）上のバックコネクター（ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒ）にキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを挿入する。
【０１０５】
溶解物を延長チューブに導入し、真空を適用する。溶解物をカラムに通すとすぐに真空ポンプのスイッチを切り、圧を平衡化する。延長チューブを捨てる。
【０１０６】
真空支持体からカラムを外し、２ｍＬの回収容器に移す。カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【０１０７】
ＲＮＡの調製については、１０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉ(DNAse I)のストック溶液を７０μＬのバッファーＲＤＤ（キアゲン、市販）にピペットで入れる。チューブを動かして混合を行う。ＲＤＤバッファーには、ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット（キアゲン、カタログ番号７９２５４）が提供される。
【０１０８】
カラムを再び、キアバック２４プラス(ＱＩＡｖａｃ２４Ｐｌｕｓ)真空支持体上に置く。キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニシリカゲル膜にＤＮＡ分解酵素Ｉの混合物を直接ピペットで入れ、適度な温度（２０〜３０℃）で１５分間インキュベートする。
【０１０９】
その後、６００μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）をピペットでキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに入れる。次いでカラムを介して混合物を引くために真空を適用する。この後、７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）を加え、真空を適用することによってそれをカラムに通す。
【０１１０】
その後、７５０μＬのエタノール（９６〜１００％）をカラムに適用し、真空によってカラムに通す。次いで真空支持体からキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを外し、バックコネクター（ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒ）を捨てる。カラムを２ｍＬの清浄な回収容器に入れて２０，０００×ｇにて１４，０００ｒｐｍで３分間遠心する。
【０１１１】
カラムを新しい２ｍＬの回収容器に入れ、フタを開けたまま５６℃で１０分間乾燥させる。次いでキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを清浄な１．５ｍＬの微量遠心用容器に入れ、回収容器を捨てる。２０〜６０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニ膜の中央にピペットで落とす。この後、フタを閉じて３分間インキュベートする。
【０１１２】
この後、ＲＮＡを溶出するために、２０，０００×ｇでの１４，０００ｒｐｍの１分間の遠心工程が続く。次いでＲＮＡ分解酵素阻害剤を加える。
【０１１３】
相当するプロトコールを用いて、目覚しく短鎖ＲＮＡを精製することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸は普通、均一の基礎的パターン：部分的にはタンパク質分解酵素を用いて核酸を含有する出発材料を先ず粉砕することに従って、植物、動物又はヒトの材料から及び細胞培養又はウイルス培養から単離される。非常に多様な方法を用いたその後の工程において個々の構成成分を取除くことができる。さらに、核酸が遊離の形態で存在する、すなわち、それらが細胞の中に存在しない試料材料から核酸を単離してもよい。従って、遊離の核酸が人工的な試料混合物に生じることは可能であるが、たとえば、血液のような天然試料に生じることも可能である。そのような自由に循環する核酸は細胞外核酸とも呼ばれる。
【０００３】
前記核酸を精製するための従来技術の方法はほとんど、以下の２種類の取り出しの原理のいずれかに基づく。
【０００４】
古典的方法は、ほとんどの場合カオトロピック剤を含有するバッファー、及び有 機抽出剤、通常フェノール及び／又はクロロホルムを添加した後、抽出を行うことを含む一工程法に基づくものである。望ましくない付随する物質を有機相と一緒に廃棄する。水性相に保持された核酸は、相を分離することによって次いで取り出され、それによって単離してもよい。たとえば、フェノール及び／又はクロロホルムのような有毒かつ有害な物質の使用は別として、この手順の重要な短所は、核酸水溶液に混入物として残り、非常に時間のかかる精製工程で取り除かれなければならない水溶性物質である。
【０００５】
これらの短所を考慮して、従来技術では代替法がしたがって確立しており、その方法はたとえば、二酸化珪素のような固体支持体物質への核酸の選択的吸着に基づくものである。核酸を含有する出発材料を必要に応じて溶解し、規定した条件下において前記支持体物質に接触させて、核酸が前記支持体物質に結合するのを可能にするが、その際、適当な洗浄工程が実施される。その後、及び任意で、支持体に結合した核酸は好適なバッファーによって支持体物質から溶出される。
【０００６】
たとえば、米国特許第５，２３４，８０９号（ブーム（Boom））は、様々な使用の多様性に好適である核酸を単離する方法を開示している。それは、核酸を含有する出発材料をカオトロピック・バッファーとＤＮＡ結合固相と共にインキュベートすることによって前記出発材料から核酸を単離する方法を記載している。カオトロピック・バッファーは、必要ならば、出発材料の溶解と核酸の固相への結合の双方を達成する。前記方法は、相対的に小さな試料量から核酸を単離するために上手く適合する。ＷＯ９３／１１２２１は類似の原理に基づく方法も記載している。
【０００７】
固相をカオトロピック・バッファーと組み合わせることを含む従来技術では、核酸を精製する方法が多数開示されている。既知の方法のすべてにおいて長鎖核酸は、短鎖核酸（例えば、１０００ｂｐ、５００ｂｐ又はさらに３００ｂｐの長さ）と少なくとも同等に、しかし、ほとんどの場合、それより相当に良好に固相に結合するので、従来技術の方法は、短鎖核酸を効率的に精製する又は長鎖核酸を上回って短鎖核酸をさらに濃縮するためには好適ではない。
【０００８】
短鎖核酸を精製するための好適性の乏しさは、おそらく、前記短鎖核酸の支持体物質への結合が長鎖核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ）のそれよりも劣るという事実に起因しうる。従って、短鎖核酸の大部分は一般の精製方法のほとんどで失われ、短鎖核酸は精製した核酸の中に存在しないか、又は実際より少なく評価される。しかしながら、特定の応用ためには、短鎖核酸を単離すること又は長鎖核酸を上回ってそれを濃縮することが特に望まれる。
【０００９】
好ましくは短鎖核酸を濃縮する又は長鎖核酸から短鎖核酸を分離するために、従来技術では以前、種々の原理が使用されている。たとえば、ＤＥ１０２００６０４５３９１は、特別に設計された固相に試料を数回、適用することを含む、短鎖核酸から長鎖核酸を取り除く方法を記載している。別の方法としては、カオトロピック塩ではなくクエン酸塩を含有する特別な結合バッファーの使用により、このように短鎖核酸を特に結合させることに基づくものがある（ＷＯ２００７／０６５９３４）。
【００１０】
短鎖核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の精製／濃縮は、応用の種々の分野に決定的に重要である。短鎖核酸が中心的な役割を担う領域の１つは出生前診断である。妊娠女性の血液は、内因性の自由に循環するＤＮＡに加えて胎児の自由に循環するＤＮＡも含有する。妊娠女性の血液中で自由に循環する胎児のＤＮＡは母親の自由に循環するＤＮＡとはサイズが異なることが想定される。母親の自由に循環するＤＮＡの長さの平均は５００ｂｐを超えることが多い一方で、胎児の自由に循環するＤＮＡの大半は著しく小さく、長さの平均は５００ｂｐ未満である。好適な精製方法が利用可能であれば、胎児と母親の核酸の間のサイズのこの差異は、濃縮可能とし、かつ胎児のＤＮＡをさらに詳細に検討するために、活用されればよい。胎児起源の自由に循環するＤＮＡを出生前診断に利用することは、胎児にとって危険ではないのでリスクが減るという点で、羊水穿刺又は絨毛膜の採取のような従来の方法よりも有利である。しかしながら、血液中の胎児起源の自由に循環するＤＮＡの量は非常に少ない。妊娠の段階によって、血液１ｍＬは２０〜２６０の間のコピーの胎児ＤＮＡを含有する。従って自由に循環する胎児ＤＮＡの濃度は低いが、自由に循環する胎児細胞の濃度よりは高い。自由に循環する胎児ＤＮＡの濃度は、自由に循環する母親ＤＮＡに比べて極めて低いという問題もあり、結果として、母親の血液から自由に循環する総ＤＮＡを単離した場合、遺伝物質のほんのわずかが胎児起源であり、単離した遺伝物質の大半は母親由来である。多くの場合、母親ＤＮＡのこの高いバックグラウンドが胎児の遺伝区分の検出を妨害し、場合によっては、リアルタイムＰＣＲと同じくらい敏感な検出方法の感度でさえ、胎児ＤＮＡが検出されるのを可能にするには不十分である。
【００１１】
母親の血液から自由に循環するＤＮＡを単離するのに以前採用されていた方法は、胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡを同一程度に精製し、それによって母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの好ましくない比を保つが、胎児ＤＮＡは、総ＤＮＡのほんの一部を構成するにすぎない。今までのところ、母親のＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡが濃縮されたことはない。さらに、短鎖核酸は精製の間上手く捕捉されないことが多いので、胎児の核酸の精製は通常劣っている。しかしながら、たとえば、短鎖の胎児ＤＮＡの効率的な精製及び特定の濃縮が有利となるのは、これが感度を実質的に高めるので自由に循環する胎児ＤＮＡに基づく出生前診断の信頼性も実質的に高めるからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、短鎖核酸を効率的に単離／精製することが可能でもある核酸を単離及び／又は精製する方法を提供するという目的に基づくものである。本発明の別の目的は、前記胎児ＤＮＡが効率的に単離及び／又は濃縮されるのを可能にする、母親の血液から胎児ＤＮＡを単離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
核酸を含有する出発材料から核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程によって特徴付けられる方法によって、本出願において前記目的は達成される：
（ａ）カオトロピック化合物及びアルコール、好ましくはイソプロパノールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≧５％（ｖ／ｖ）かつ好ましくは≦４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは≦３５％（ｖ／ｖ）、及びより好ましくは≦３２%（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に取り外すこと。
【００１４】
本発明の方法によれば、核酸は、特定の反応条件下で支持体物質に固定化される。２つの成分が、支持体物質への短鎖核酸の有効な結合に不可欠であり、すなわち、カオトロピック化合物と分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールである。本発明によれば、支持体物質への結合の間、試料混合物中で≧５％（ｖ／ｖ）である正確なアルコール濃度を選択することが特に重要である。しかしながら、さらに高い、従って≧１５、特に≧１９％（ｖ／ｖ）及び≧２５％（ｖ／ｖ）であるアルコール濃度が好ましい。正しいアルコール濃度が選択された場合、短鎖核酸は、非常に良く或いは（より長鎖の核酸に対して）さらに好ましく、支持体物質に結合することが示されている。カオトロピック物質の濃度を増加させることによって、さらに低いアルコール濃度はある程度バランスを保つことができる。しかしながら、全体として、定義した範囲の上端におけるアルコール濃度は、より良い結果を達成することができる。アルコールの濃度は、結合した核酸のサイズ分画に関し選択性を生じさせる。より高いアルコール濃度では、特に、短鎖核酸はより効率的に結合する。
【００１５】
好ましくは、アルコール濃度はおよそ１９〜４０％（ｖ／ｖ）の範囲内である。なぜならば、この範囲内で、短鎖核酸、特にＤＮＡが結合され、特に良く単離され得るからである。結合条件の精密な調整によって、このことが、長鎖核酸を上回って短鎖核酸が濃縮されるのを可能にしてもよい。この有利な濃度効果は、特に、２５〜４０％（ｖ／ｖ）、２５〜３５％（ｖ／ｖ）、２５〜３２％（ｖ／ｖ）及び２８〜３２％（ｖ／ｖ）の間のアルコール濃度によって達成される。実施例も立証するように、これらの条件下で、長鎖核酸よりも短鎖核酸の方が良好に、従って好ましく支持体物質に結合する。核酸の結合はカオトロピック化合物の濃度によっても影響を受ける。好適なカオトロピック化合物及び濃度は以下に記載されている。相対的に高い濃度のカオトロピック化合物を選択することによってさらに相対的に低いアルコール濃度が採用されるのが可能になる。
【００１６】
任意に洗浄工程を実施してもよい。支持体物質に結合した核酸を前記支持体物質から次いで取り出す、たとえば、短鎖核酸の回収が望まれるのであれば、それ自体既知の方法で溶出する。次いで、本発明により単離／濃縮された核酸を既知の方法でさらに処理してもよく、たとえば、解析してもよい。しかしながら、計画されたその後のさらなる処理又は解析によって、支持体物質に結合した、すなわち溶出されていない核酸を使用することも同様に可能である。方法は試料から核酸を取り出すために利用されてもよい。
【００１７】
本発明の方法は、一工程法として実施することができる。一工程法の長所は、核酸（全体としての）の高い収率を通常達成することであり；精製の間に核酸のほんのわずかな比率が失われる。短鎖核酸が支持体物質に効果的に結合し、それによって本発明の方法の一工程変形により単離／濃縮されるので、このように実施される短鎖核酸の単離／濃縮は多数の応用に対して既に十分なものである。容易に且つ簡単に実施することができるので、一工程法は、また、ユーザーに特に便利である。本発明の方法は良好な収率で短鎖核酸を効果的に単離することができ、長鎖核酸を上回って短鎖核酸を濃縮することさえできるので、実施例で示される比較実験が証明するように、短鎖核酸を単離するための本発明の一工程法は、従来技術で開示される方法よりも明らかに優れている。
【００１８】
特定の使用については、できるだけ効率的に長鎖核酸を上回って短鎖核酸を濃縮することが有利であり；長鎖核酸のバックグラウンドなしで、又は長鎖核酸のバックグラウンドがほとんどないように短鎖核酸が回収されるべきである。この場合、出来るだけ少ない長鎖核酸を精製することが望ましい。特に効果的な方法でこれを達成するために、本発明の一実施形態によれば、短鎖核酸を取り出す／溶出するための実際の単離工程ａ）及び任意でｂ）の前に、長鎖核酸が効率的に希釈される工程（ｘ）が先行する。先行する長鎖核酸の希釈によって、特に純度の高い形態で短鎖核酸が回収されることが可能になる。
【００１９】
核酸を含有する出発材料から短鎖核酸を単離及び／又は精製するための対応する改善された方法は、本発明によれば、以下の方法工程を有する。
（ｘ）少なくとも１つのカオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって前記核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは≦３０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物（ブレークスルー）／上清を接触させることによって前記核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物（ブレイクスルー）／上清を結合させること、ただし、前記アルコールの濃度は、≧５％（ｖ／ｖ）、かつ好ましくは≦４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは≦３５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは≦３２%（ｖ／ｖ）である。
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【００２０】
本発明の方法のこの二工程変形によれば、短鎖核酸を単離／精製するための実際の単離工程ａ）及び任意でｂ）の前には、長鎖核酸を効率的に希釈する工程（ｘ）が先行する。結合工程（ｘ）は、カオトロピック化合物と少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールとの存在下で支持体物質に核酸を結合させることを含む。結合条件及び特に結合の間の全試料におけるアルコールの濃度が、長鎖核酸の希釈に再び不可欠である。工程（ｘ）におけるアルコールの濃度は、≦３０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくはまさに≦２５％（ｖ／ｖ）である。驚くべきことに、２５％（ｖ／ｖ）前後のアルコール濃度はサイズ選択性を反転できることが示されている。カオトロピック化合物の濃度がそれに応じて選択されれば、長い及び／又はさらに長い鎖の核酸は２５％（ｖ／ｖ）未満、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）未満で支持体物質に好ましく結合する（以下を参照のこと）。これらの条件下で、短鎖核酸は支持体物質に結合しないか又はさらに乏しく結合するので、突破物（ブレイクスルー）／上清（利用される支持体物質による）にある。その後の工程ａ）及び任意にｂ）では、そのとき、短鎖核酸は単離されるので、短鎖核酸を特に含有する工程（ｘ）の突破物（ブレイクスルー）／上清から濃縮される。
【００２１】
一工程法（上記参照）の工程ａ）及びｂ）は、二工程法の工程ａ）及びｂ）に非常に類似し、及び／又はそれらは実質的に同一である。最終的に、二工程法では、核酸を含有する出発材料の代わりに、工程（ｘ）からの突破物（ブレイクスルー）／上清が用いられる。従って、一工程法と併せて記載されるのと同じ好ましい条件が二工程法の工程ａ）及びｂ）に適用される。先行する工程（ｘ）は最終的に、少なくともさらに低い量が突破物（ブレイクスルー）／上清に存在するように、長鎖核酸の希釈をさらに達成する。所望であれば、長鎖核酸は、二工程法では工程（ｘ）で結合した支持体物質から同様に溶出され、異なった目的にさらに使用されてもよい。
【００２２】
種々の材料、及び特に生体材料を、核酸を含有する出発材料として、利用してもよい。これらは、たとえば、ウイルス、ファージ及び細菌のような細胞、たとえば、またヒト、動物又は植物の細胞を含む。さらに、しかしながら、方法は、細胞を含有しない試料から、又はそのように調製された試料から遊離の核酸を単離／精製するのにも特に有用である。さらに具体的には、本発明の方法は、ヒト又は動物起源の試料物質、特に、たとえば、血液、血漿、血清、洗口液（マウスリンス；mouth rinse）、尿、脳脊髄液、唾液、糞便、穿刺液(punctates)、上皮塗抹標本、生検及びそのほかの組織又は骨髄試料のような臨床試料からＤＮＡ及び／又はＲＮＡのような核酸を単離するのに好適である。さらに具体的には、本発明の方法は、母親の血液試料、特に血漿から胎児ＤＮＡを単離するのに好適である。本発明の方法は、特に、体液、特に血漿及び／又は血清から自由に循環する核酸、たとえば、腫瘍ＤＮＡ及び腫瘍ＲＮＡを単離するのにも好適である。
【００２３】
特定の場合では、前処理することなく試料を本発明の方法で用いてもよい。しかしながら、多くの場合、試料は先ず好適な方法によって破砕される必要があり、前記試料に存在する生体材料が放出される必要がある。試料及び細胞を破砕するための方法は当業者には知られており、化学的な種類、酵素的な種類又は物理的な種類であってもよい。これらの方法を組み合わせることも可能である。
【００２４】
この関係において、種々の生体材料について種々の因子が有利であることが判っている；原則として、以下の方法が良く適合する：好適なバッファーにおいて、たとえば、グアニジン塩酸塩（ＧＨＣＬ）、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）、グアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム及びその他のようなカオトロピック塩の使用し、たとえば、ＳＤＳ、ＬｉＤＳ又はサルコシルのようなイオン性及び非イオン性の界面活性剤を用いた溶解；たとえば、フレンチプレス、超音波、ガラスボール、ニッケルボール、アルミニウムによる製粉による、又は液体窒素における機械的引き裂き；たとえば、リゾチーム、プロテイナーゼ、プロテイナーゼＫ若しくはセルラーゼによる、又は溶解用の他の市販の酵素のよる酵素的溶解；バクテリオファージ又はウイルスの感染による細胞の溶解；凍結乾燥；浸透圧ショック；マイクロ波処理；温度処理；たとえば、ドライアイス又は液体窒素における加熱又は煮沸又は凍結、及び融解；アルカリ溶解。
【００２５】
議論したように、上記方法は、溶解に関する技術水準であり、良く知られているものであるから、詳細に議論される必要はない。
【００２６】
血液試料からたとえば、ＤＮＡのような自由に循環する核酸を精製する場合、たとえば、母親の試料から胎児ＤＮＡを精製する場合、先ず、細胞及び血液のそのほかの固形性分を取り除き（たとえば、遠心分離によって）、こうして得られた血漿をさらに処理する。前記血漿は細胞を通常含まず、自由に循環する核酸、たとえば、母親及び胎児のＤＮＡを含有する。後者はすでに自由に循環する形態であるから、核酸を放出させるために、血漿からの遊離の核酸の精製は、実際の細胞溶解を必要としない。これは、結果として細胞の内側には位置しない遊離の核酸を含有するそのほかの試料にも適用される。しかしながら、自由に循環する核酸は、タンパク質及び／又はそのほかの物質との複合体であってもよい。この理由のため、核酸を含有する出発材料、たとえば、血漿は先ず、核酸が複合形態から放出されることを確実にする放出バッファーで処理される。放出バッファーの機能及び組成は、細胞の破砕に利用される溶解バッファーのものと同様である；放出バッファーは試料において核酸の放出に好適な条件を生成し、その結果、後者は複合体として存在しない。放出バッファーの添加によって核酸はさらに精製し易くなる。本発明の方法は、従って、無細胞の出発材料に利用されてもよい。その組成によって、核酸を効果的に精製する又は濃縮するために、対応する放出バッファーは溶解バッファーとして機能してもよい。通常、たいていの溶解バッファーを放出バッファーとしても利用してもよい。
【００２７】
本発明によれば、放出バッファー又は溶解バッファーの組成はまた核酸が支持体物質に結合する条件に影響を及ぼすので、カオトロピック剤を含有する放出バッファー又は溶解バッファーの使用は、なおさら特に効果的である。従って、本発明によれば本発明の方法の有効性に不可欠である、試料における結合条件も、たとえば、好適な様式での結合バッファーとの組み合わせで放出バッファー又は溶解バッファーを選択することによって調整されてもよい。本発明に係る放出バッファー又は溶解バッファーは、たとえば、ＧＴＣ又はＧＨＣＬのようなカオトロピック化合物、及び、必要に応じて、たとえばＳＤＳ又はツイーンのような界面活性剤を含有する。これらの物質は、水溶液又は緩衝溶液、すなわち、「放出バッファー」又は「溶解バッファー」に存在してもよい。利用されるバッファーは、たとえば、トリス（tris）、ビシン(bicine)、トリシン(tricine)又はリン酸バッファーのような好適なバッファーであってもよい。或いは、溶解剤又は放出剤は別々に添加してもよい。溶解剤又は放出剤の好適な濃度及び量は、各系、細胞の種類などによって異なり、当業者によって決定されてもよい。具体的な適用、特に血液試料からの胎児ＤＮＡの精製のためには、２〜７Ｍの範囲の濃度のカオトロピック化合物、たとえば、ＧＴＣ、ＧＨＣＬ、又はＮａｌ又は過塩素酸ナトリウム、０．１Ｍ〜１Ｍのアルカリ剤、たとえば、ＮａＯＨ、及び０．１〜５０重量％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、たとえば、ツイーンが有用であることが判っている。
【００２８】
核酸の支持体物質への結合の間、試料混合物にカオトロピック化合物も存在する。カオトロピック化合物は、たとえば、溶解バッファー又は放出バッファーに由来してもよく、及び／又は、しかしながら、たとえば、結合バッファーの形態で別々に添加される。最終的には、核酸の支持体物質への結合の間、試料における結合条件が重要である。ここで、カオトロピック化合物は最終的に溶解度の限界まで存在してもよい。カオトロピック化合物の使用は核酸の効率的な結合に有利である。結合の間、試料におけるカオトロピック化合物の濃度は好ましくは１〜１０モル／Ｌ、特に好ましくは２〜６モル／Ｌの範囲である。好適な化合物の例は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジンチオシアネート、グアニジンイソチオシアネート及びグアニジン塩酸塩である。
【００２９】
結合の間、試料は、たとえば、非イオン性界面活性剤及び特にツイーンのような界面活性剤も有してもよい。前記界面活性剤は、放出／溶解バッファーと共に又は結合バッファーの一部として添加されてもよい。界面活性剤は、たとえば、血清及び血漿の成分の試料における種々の成分の効率的な可溶化を引き起こす。これは、核酸が結合する支持体物質がブロックするのを防いでもよい。これは、シリカ膜が利用される場合、特に有利である。
【００３０】
議論したように、核酸の支持体物質への結合の間、試料におけるアルコールの濃度は本発明の方法において重要である。たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール又はペンタノールのような短鎖の分枝鎖又は非分枝鎖で１〜５の炭素原子を有するアルカノール類を利用することが好ましい。相当するアルコールの混合物も利用してもよい。特に好ましいのは、イソプロパノール又はイソプロパノール様特性を有するアルコール若しくはアルコール混合物を利用することである。アルコールの濃度は、結合工程（長鎖核酸を希釈するための結合工程（ｘ）又は短鎖核酸を結合させるための結合工程（ａ））に応じて異なる。
【００３１】
長鎖核酸が予備工程（ｘ）で希釈されるのであれば、それによって試料からこれらの核酸を取り除くことを可能とするために、長鎖核酸の支持体物質への結合を促進するアルコール濃度が使用される。突破物（ブレイクスルー）又は上清は、前記希釈により、高い比率の所望の短鎖核酸を含有する。
【００３２】
長鎖核酸の結合を促進し、かつそれにより希釈を改善するために、核酸の支持体物質への結合の間のアルコールの濃度は、本発明によれば３０％（ｖ／ｖ）未満である。アルコールの濃度が≦２５％、特に好ましくは≦２０％（ｖ／ｖ）であれば、特に良好な結果が達成される。これらの条件下では長鎖核酸は特に良好に結合する。このことは、≧１モル／Ｌ、好ましくは≧２モル／Ｌ、特に≧２．４モル／Ｌのカオトロピック化合物の存在下で特に真実である。さらに、長鎖核酸を希釈するためのカオトロピック剤の濃度は、好ましくは≦４モル／Ｌ、さらに好ましくは≦３．５モル／Ｌ、一層さらに好ましくは≦３．２モル／Ｌ、最も好ましくは≦３．１モル／Ｌである。試料におけるカオトロピック化合物の好ましい濃度は、前記カオトロピック化合物の種類及び／又は強度にさらに依存する。長鎖核酸の結合を促進するために、たとえば、グアニジンチオシアネートのような特に強いカオトロピック化合物は低い濃度で利用されるべきである。より長鎖の核酸を結合させ、それによりそれらを希釈するために、１５〜２５％、好ましくはおよそ２０％のアルコール濃度と共に、グアニジン塩酸塩は、≧２．５モル／Ｌ且つ≦３．１モル／Ｌの濃度で好ましくは利用される。
【００３３】
二工程法の工程ａ）、及び一工程法の工程ａ）は、短鎖核酸の好ましい結合のために、好ましくはカオトロピック化合物の約同一濃度でさらに高いアルコール濃度を利用する。短鎖核酸の結合を改善するには、結合の間の試料におけるアルコール濃度は、好ましくは≧１９％（ｖ／ｖ）、特におよそ１９〜３６％の範囲内である。およそ２５％（ｖ／ｖ）を超える濃度では、特に前記核酸があらかじめ希釈されている場合、短鎖核酸は、長鎖核酸を上回って濃縮され得ることが分かった。このことは、カオトロピック化合物の濃度の調整に特に適用され；好適な濃度は上述の通りである。例えば母親の血漿のような試料は通常、長鎖核酸を優勢に含有するので、この結果は、血液試料から例えば胎児DNAのような細胞外核酸を精製するのに特に有利である。従って、本発明の方法は、短鎖核酸のさらに効果的な濃縮を達成することができる。特に好ましくは、短鎖核酸の好ましい結合のために、核酸が支持体物質に結合する間、試料混合物はおよそ３０％（ｖ／ｖ）のアルコールを含有する。これは、短鎖核酸の＞２倍、＞５倍、又はさらに１０倍を超える濃縮を達成する、短鎖核酸を濃縮するための効果的な方法を提供する。一般に、方法の濃縮ポテンシャルは、２００ｂｐの核酸断片と１０００ｂｐの核酸断片の収率を比較することによって判定されてもよい。その結果、本発明の方法は従来技術の方法より明らかに優れている。
【００３４】
一工程法又は二工程法の一実施形態によれば、工程（ａ）における試料混合物中のアルコールは、以下から成る群から選択される濃度である。
≧１９％（ｖ／ｖ）
≧２５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦５０％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦４０％（ｖ／ｖ）
≧１９〜≦３６％（ｖ／ｖ）
≧１９〜＜３５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦３５％（ｖ／ｖ）
≧２５〜≦３２％（ｖ／ｖ）
≧２８〜≦３２％（ｖ／ｖ）。
【００３５】
工程（ｘ）において長鎖核酸を希釈することを含む二工程法では、工程ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度である。特に、アルコール濃度が工程（ａ）において増加されるので、方法工程（ｘ）から方法工程ａ）への移行においてカオトロピック化合物の濃度を下げないことによって顕著にさらに良好な結果が達成される。支持体物質への短鎖核酸の結合を促進するために、実際の単離工程ａ）において工程（ｘ）より高い濃度のカオトロピック化合物を採用することが好ましい。
【００３６】
一実施形態によれば、本発明の方法は以下の特徴の少なくとも１つ有する：
・工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が≧１モル／Ｌから溶解度の限界までであること、及び／又は、
・工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が≧２モル／Ｌ、≧２．４モル／Ｌ又は≧２．６モル／Ｌであること、及び／又は、
・工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度であること、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が、あらかじめ溶解バッファーで処理されること、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が細胞を含有せず、かつ細胞溶解が行われないこと、及び／又は、
・核酸を含有する出発材料が、あらかじめ放出バッファーで処理されること、及び／又は、
・フェノール抽出が行われないこと、及び／又は、
・単離された核酸がＤＮＡ分解酵素で処理されること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも３０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも５０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・本方法によって少なくとも６０％の短鎖核酸を単離することができること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも２倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも５倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・短鎖核酸の少なくとも１０倍の濃縮が達成されること、及び／又は、
・長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ及び／又は≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ及び／又は≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮されること、及び／又は
・細胞外核酸が単離されること。
【００３７】
核酸が結合する支持体物質は、好ましくは、珪酸含有物質、シリカゲル、二酸化珪素、ガラス、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、ゲル状シリカ、セラミックス、又はポリマー支持体物質及びポリスチレンビーズの群に由来する核酸が結合する固相である。最終的に重要なのは、支持体物質が核酸を結合させることが可能であるという事実である。シリカ材を利用することが特に好ましい。シリカ膜とシリカ又はガラスの表面を有する磁性粒子との双方の使用がここでは有用であることが判っている。後者は本質的にビーズ様又は球状であってもよく、０．０２〜３０μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍ、特に好ましくは０．１〜１０μｍの範囲内の粒度を好ましくは有する。本発明の方法で有利に採用されてもよい磁性シリカ粒子は、たとえば、国際出願ＷＯ０１／７１７３２に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００３８】
核酸を含有する材料と共に支持体マトリクスをインキュベートした後、残っている試料流体から核酸を取り出す。これは、通常、磁性シリカ粒子を用いた場合、本発明により粒子に結合した核酸を磁場を用いて分離することによって達成される。たとえば、インキュベートが行われた容器の壁に磁性粒子をひきつけてもよい。次いで、磁性粒子に結合していない試料の成分を含有する液体を除去してもよい。工程（ｘ）では上清がさらに処理される（長鎖核酸は磁性粒子に結合する）；工程ａ）では、短鎖核酸は、磁性粒子に結合され、洗浄工程の後必要に応じて、工程ｂ）において粒子から任意に溶出される。処理は、インキュベートが行われた容器の種類に依存する。液体を除去するための好適な方法工程の例は、静かに注ぐこと（デカンティング；decanting）、ピペッティング、濾過すること又は吸引することによって液体を除くものである。
【００３９】
議論したように、たとえば、シリカ膜を利用することも可能である。遠心分離によって又は真空を適用することによって又は圧力によってここから液体を除去してもよい。精製される核酸は、本発明の方法の応用の多くで、特に母親の血液試料から胎児ＤＮＡを精製する場合、大きな体積に低濃度で存在する。従来技術におけるシリカ膜の使用は、膜を場合によりブロックする大きな試料体積の問題にぶつかることが多い。しかしながら、本発明の方法によれば、特定のバッファー物質／バッファー濃度が利用されるので、この問題は生じない。界面活性剤が利用されるのであれば、それはここでは特に有利である。
【００４０】
本方法によって単離されてもよい核酸の例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアの、後成的（エピジェネティック）に修飾された、一本鎖の、二本鎖の、環状の、プラスミドの、コスミドの、人工的な又は合成の核酸、及びｃＤＮＡ並びにそれらの断片である。本発明の方法は、長さ≦１０００ｂｐ、≦８００ｂｐ、≦５００ｂｐ、又は≦３００ｂｐの短鎖核酸（たとえば、非コーディングＲＮＡ、たとえば、ｍｉＲＮＡ、又は合成核酸を含む任意の形態でのＤＮＡ及びＲＮＡ）を濃縮するのに特に好適である。一実施形態によれば、長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ、≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ、≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮される。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを精製することが好ましい。長さ≧５０ヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡを特に効率的に精製することができる。短鎖ＲＮＡを得るには、精製した核酸を好ましくはＤＮＡ分解酵素で処理する。
【００４１】
特にカオトロピック剤の濃度との組み合わせでアルコール濃度を選択することによって単離される核酸のサイズが変化してもよく、制御されてもよい。本発明の方法の双方の変形（一工程法及び二工程法）は、短鎖核酸が効率的に単離されるのを可能にする。本明細書で記載されるように、結合条件を適宜調整することによって短鎖核酸を特異的に濃縮してもよい。下記の実施例によっても証拠付けられるように、方法は胎児の核酸を濃縮するのに特に好適である。
【００４２】
従って、本発明の方法は、母親の血液から、たとえば胎児ＤＮＡのような細胞外核酸を単離するために有利に採用されてもよい。従って、本発明は、血液試料、特に血漿又は血清から胎児の核酸を濃縮する方法も提供するが、該方法は、本発明の短鎖核酸を単離／精製する方法が実施されることを特徴とする。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４３】
しかしながら、応用のさらなる分野は、たとえば、法医学及び小さな核酸の精製が不可欠であるそのほかの分野に見つけることができる。さらに、本発明の方法は、たとえば、血液のような試料からの自由に循環する腫瘍の核酸を精製することについての診断において採用されてもよい。
【００４４】
本発明はまた、試料からの核酸を濃縮するが、血液試料からの胎児の核酸を濃縮しない方法も提供し、該方法は、本発明の短鎖核酸を単離／精製する方法が実施されることを特徴とする。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４５】
本発明の方法は、診断における使用に特に好適である。それは自動化することができるので、対応する精製ロボットでの使用に採用することもできる。
【００４６】
本発明はまた、核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製するためのキットも提供するが、該キットは、本発明の方法を実施するためのバッファー及び／又は試薬及び任意に少なくとも１つの核酸が結合する支持体物質を有する。該方法の詳細は上記で特定されている。
【００４７】
対応するキットは、血液試料から胎児ＤＮＡを精製するために使用されてもよい。さらに、対応するキットは、試料から短鎖核酸を精製するが、血液試料から胎児ＤＮＡを濃縮しないために提供される。
【００４８】
本発明のキットは、特に診断の分野において、及び医療応用のために利用することができる。それらは自動化された方式で利用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１の結果を示す。
【図２】実施例１の結果を示す。
【図３】実施例２の結果を示す。
【図４】実施例３の結果を示す。
【図５】実施例４の結果を示す。
【図６】実施例４の結果を示す。
【図７】実施例５の結果を示す。
【図８】実施例５の結果を示す。
【図９】実施例５における反応条件を示す。
【図１０】実施例５の結果を示す。
【図１１】実施例６の結果を示す。
【図１２】実施例６の結果を示す。
【図１３】実施例６の結果を示す。
【実施例】
【００５０】
本発明は、今や下記の実施例に基づいて説明される。実験は、下記の実験プロトコールに基づいて実施された。
【００５１】
母親のＤＮＡを上回る胎児ＤＮＡの付随する濃縮を伴って母親の血液から自由に循環する前記胎児ＤＮＡを単離することに本発明の方法を適用する出発点は、文献に記載された、２つの核酸種の平均長が異なるという発見にある。胎児ＤＮＡの平均長が５００ｂｐより短い一方で、母親のＤＮＡの平均長は５００ｂｐよりも長い。
【００５２】
実施例１：胎児ＤＮＡ及び母親ＤＮＡの平均長を決定するアッセイ
その中で自由に循環するＤＮＡのサイズ分布を調査するために、男胎児を妊娠した女性の血液から生成した３つの異なる血漿プールを用いた。前記血漿プールは、プールＡ、Ｂ及びＣである。プールＡは、妊娠の第１期〜第３期における妊娠女性の血液試料からの血漿を含んでいた。プールＢ及びプールＣはそれぞれ、妊娠の第１期〜第２期における妊娠女性から採取した血液からの血漿を含み；依然として相対的に少量の自由に循環する胎児ＤＮＡが存在するが、臨床診断の時期という点では相対的に高い関連性を有する時期である。
【００５３】
使用した出発材料は、１０ｍＬの血漿、プールＡの場合、５ｍＬの血漿であった。手順は、１０ｍＬの体積に適合させたキアアンプ・ブラッドDNAミディプロトコル（QIAamp blood DNA Midi protocol）（キアゲン）に従った。３００μＬのＡＥバッファー（キアゲン、市販）を溶出のための各場合に使用した。溶出後、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿を行い、乾燥させたペレットを１５μＬのバッファーＥＢ（キアゲン、市販）に再懸濁した。アガロースゲル電気泳動の後、個々のサイズの分画をゲルから切り出し、ゲル抽出用のキアクイック・バキューム・プロトコル（QIAquick vacuum protocol）に従ってゲル抽出を行った。各ゲル分画について、溶出は１００μＬとし、その後のＰＣＲで各場合、２０μＬの溶出液をデュープリケートで用いた。適切なプライマー、先ず自由に循環する胎児ＤＮＡを検出するためのＳＲＹ遺伝子座を用いて増幅を行った。ＳＲＹは男性個体でのみ検出可能である。確実に男の胎児を持つ妊娠女性からの血液のみを用いたので、ＳＲＹのシグナルはすべて胎児起源のＤＮＡに起因した。母親の血液で自由に循環する総ＤＮＡを検出するためにｃ−ｍｙｃ遺伝子座の適切なプライマーを用いて増幅を行った。前記増幅は、ＡＢＩ７５００機器（アプライドシステムズ）にて行った。それからの結果は図１及び図２に示す。
【００５４】
図１は、使用したプールの関数としての胎児ＤＮＡのサイズ分布を示す。
図２は、使用したプールの関数としての総ＤＮＡのサイズ分布を示す。
【００５５】
この実験は、文献に記載されるように、胎児ＤＮＡが、短い断片としてのみ存在することを明らかにしている。大半は明らかに３００ｂｐ未満の分画内にあり、有意な部分が３００〜５００ｂｐの断片長さを示す。母親の血液において自由に循環する胎児ＤＮＡの非常に小さな部分のみが５００ｂｐより長い。他方、母親ＤＮＡのすべてが５００ｂｐより大きいわけではない。血中で自由に循環する母親ＤＮＡの約半分は同様に長さが５００ｂｐ以下であるが、別の半分は５００ｂｐより顕著に長い。従って、単離／濃縮された核酸のサイズ分画によって母親ＤＮＡを上回る胎児ＤＮＡの有意な相対的な濃縮を達成することができる。
【００５６】
実施例２
胎児ＤＮＡ（大半が３００ｂｐより短い、実施例１を参照）及び母親ＤＮＡ（主として５００ｂｐより長い）の異なったサイズ分布を模倣するために、２つの異なったＰＣＲアンプリコンをバックグラウンドとして血漿に加えた。２１９ｂｐの断片が胎児ＤＮＡを模倣し、長さ１０１８ｂｐの断片が母親ＤＮＡを模倣するはずである。第１の実験で相対的に高い量の前記ＰＣＲアンプリコンをこれに用い、すなわち、各場合で、血漿６００μＬに２×１０6コピーであった。手順は以下のプロトコールに従った。
【００５７】
５ｍＬの容器における６００μＬの血漿に、９０μＬのプロテアーゼ（キアゲン）とグアニジンを含有する６００μＬバッファーＡＬ（キアゲン、市販）とを加えた。ボルテックスによって混合した後、溶解のために混合物を５６℃で１５分間インキュベートした。溶解の後、長さ２１９ｂｐ又は１０１８ｂｐのＰＣＲアンプリコンを溶解物に加えた。試料全体で６．９％（ｗ／ｖ）のイソプロパノールの濃度を生じるように１００μＬのイソプロパノールで結合条件を調整した。
【００５８】
ボルテックスによる混合の後、室温で１０分間インキュベートした。結合のために、シリカの表面を有するマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）磁性粒子５０μＬを加え、混合物を振盪器上で５分間結合させた。結合後、磁石によって粒子を上清から分離し、上清を取り出した。上清はさらなる処理まで４℃で保存した。
【００５９】
マグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）粒子の処理
上清を取り出した後、プレート振盪器上で５分間、磁性粒子を７５０μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）と混合し、次いで粒子懸濁液を１．５ｍＬの反応容器に移した。この容器における磁性分離の後、上清を除去し、廃棄した。次いで、７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノール（各場合、振盪器上での５分間のインキュベート後）によって粒子を連続して洗浄した。アルコールで洗浄した後、５６℃の加熱ブロックにて１０分間、粒子を乾燥させた。粒子に結合した核酸は、ＲＮＡ分解酵素を含まない水(キアゲン）２００μＬを用いて溶出させたが、前記溶出は、再び５分間振盪することによって実施した。磁性分離後、新しい容器に溶出液を移した。
【００６０】
結合の上清の処理
結合の上清／突破物（ブレイクスルー）（磁性粒子に結合しない物質）を以下のように後処理した。結合後の上清を２ｍＬのバッファーＢ６（２．５ＭのＧｕＨＣｌ、５０％イソプロパノール）と混合し、３２．４％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール濃度を生じ、ボルテックスによって混合し、室温で１０分間インキュベートした。
【００６１】
インキュベートの後、最初の結合混合物（ＡＷ１（キアゲン、市販）、ＡＷ２（キアゲン、市販）、エタノールによる洗浄、ＲＮＡ分解酵素を含まない水での溶離）で記載されたのと同じ手順で５０μＬのＭａｇＡｔｒａｃｔ粒子を加えた。或いは、結合後の上清に１００％のイソプロパノール（バッファーＢ１１）２ｍＬを加え、こうして６１．９％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールの濃度を生じた。同等のアリコートを溶出液から取り出し、リアルタイムＰＣＲにより１１９ｂｐのアンプリコンを増幅したが、該アンプリコンは、２１９ｂｐ断片及び１０１８ｂｐ断片双方からと同一の断片を生じる。ＰＣＲの間にＳＹＢＲグリーンを用いてアンプリコンを検出した。
【００６２】
これは結果として図３に示す画像を生じた。
【００６３】
この実験は、選択された結合条件下では、２１９ｂｐ断片と１０１８ｂｐ断片双方の核酸のほんのわずか、各場合、たった約１０％しかマグアトラクト（ＭａｇＡｔｒａｃｔ）粒子に結合しないことを明らかにしている。しかしながら、バッファーＢ６又はＢ１１による結合条件の再調整は、驚くべきことに、断片のサイズによる収率の差異を生じた。バッファーＢ６を用いることにより８０％を超える短いＤＮＡ（胎児ＤＮＡを表す）を回収することが出来る一方で、長いＤＮＡ（母親ＤＮＡを表す）の結果は、約５０％の収率にすぎない。バッファーＢ１１を用いることは、対照的に、２つのＤＮＡ断片の長さの間で収率の実質的な差異は生じない。
【００６４】
この実験は、好適な条件下で２つの固相を用いた二工程結合方式により母親ＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡを濃縮することができ、胎児ＤＮＡの収率ではほんのわずかな損失が記録されることを明らかにしている。
【００６５】
実施例３
手順は実施例２に記載したとおりであったが、今回は、血中における実際の自由に循環するコピー数のより現実的な状況を模倣するために、たった２００，０００コピーの規定した断片を用いた。今回、結果的に２０．３％（ｖ／ｖ）（上記参照）のイソプロパノール濃度を生じる１００μＬのバッファーＢ１１（上記参照）＋１．２ｍＬのバッファーＢ６を用い、第１の条件下でマトリクスへの結合を行った。マトリクスへの結合の代替条件については、１００μＬのバッファーＢ１１と２．０ｍＬのバッファーＢ６を血漿溶解物に加えた。さらに、各場合、結合混合物にて、二つの前述のバッファー条件下でＤＮＡ断片をマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）マトリクス又はキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに結合させた。
【００６６】
これについての手順は以下のとおりであった。バッファーＢ１１とＢ６を上清に加え、混合し、室温にて１０分間インキュベートした。２つの試料の溶解物を合わせ、真空下で延長チューブ（キアゲン）を用いてキアアンプミニカラム(QIAamp Mini column)（キアゲン）に適用した。１０００μＬ（マグアトラクト（ＭａｇＡｔｒａｃｔ）粒子への結合用）又は７５０μＬ（キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムへの結合用）のＡＷ１（キアゲン、市販）、ＡＷ２（キアゲン、市販）及びエタノールによって連続して洗浄を行った。乾燥には、カラムを１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、５６℃の加熱ブロックに５分間入れた。実施例２に記載したように、マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子を処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水２００μＬによって、ここでも溶出を行った（１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心）。その後のリアルタイムＰＣＲはここで図４に示す画像を生成した。
【００６７】
驚くべきことに、この実験は、同一バッファー組成で、固相として磁性粒子を採用しようと、シリカ膜を採用しようとほとんど差異がないことを示している。１．２ｍＬのバッファーＢ６の添加が、得られたＤＮＡ試料で濃縮された相対的に長いＤＮＡ断片（およそ１０００ｂｐ）をもたらす一方で、驚くべきことに、逆に、２．０ｍＬのバッファーＢ６の添加によって短いＤＮＡ断片（およそ２００ｂｐ）が濃縮される。シリカ膜（キアアンプミニ（QIAamp Mini））を用いた場合、ＤＮＡの収率は、全体的にマグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）粒子を用いたよりも高いが、サイズ依存のＤＮＡ結合もあまり顕著ではない。その結果、二工程ＤＮＡ抽出（最初の結合のＤＮＡを含有する上清をさらに用いてシリカ膜に結合させる）における磁性粒子（第１のマトリクス）とシリカ膜（第２のマトリクス）との組合せは、二工程にて短いＤＮＡ断片を効果的に濃縮するのに顕著に適しているので、第２のマトリクスで母親ＤＮＡを上回って胎児ＤＮＡを効果的に濃縮するのにも適している。
【００６８】
実施例４
手順は実施例３で示したものに類似するが、今回は、本物の血液試料を用い、二工程結合法を採用した。これには、第１の結合工程のための試料に１．２ｍＬのバッファーＢ６を添加することと、その後の、合計で２．０ｍＬのバッファーＢ６への追加のバッファーＢ６を用いた第１の結合工程の突破物（ブレイクスルー）又は上清を調整することが含まれた。出発材料は、確実に男の子を身ごもっている第１期と第２期の妊娠女性の血漿試料のプールであった。胎児ＤＮＡはその後のリアルタイムＰＣＲにてＳＲＹ遺伝子座を増幅することによって検出し、総ＤＮＡは１８Ｓ遺伝子座（実施例１も参照）を増幅することによって検出した。比較のために、従来技術に相当するキアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルス真空プロトコールに従って、一カラムプロトコールを実施した。結果を図５に示す。
【００６９】
この実験の結果は実施例３の結果と一致して、２１９ｂｐと１０１８ｂｐの断片による人工的な系が実際の状況（実施例４）の良好な模倣であることを明らかにしている。第１のマトリクスを介して胎児ＤＮＡが実際上失われない一方で、有意な量の母親ＤＮＡは既に前記第１のマトリクス（ここでは、マグアトラクト（Ｍａｇａｔｔｒａｃｔ）磁性粒子）に結合している。従って、母親ＤＮＡはこの工程（ｘ）で効率的に希釈されるので、第２のカラムを介した精製の間、既に枯渇している。従来技術（ＭｉｎＥｌｕｔｅ一工程）と比べて、２マトリクス法は、胎児ＤＮＡの増加した絶対数を産出するだけでなく、第１のマトリクスを介した母親ＤＮＡの少なくとも部分的な枯渇のために、溶出液における母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの顕著に良好な比を生じ、母親の血液からの胎児の遺伝物質の検出力を明らかに進歩させている。図６は、母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの向上した比をもう一度説明する。従来技術に係る一工程精製が溶出液で約１５％の胎児ＤＮＡの比率を生じる（ＳＲＹ／１８ＳデュプレックスリアルタイムＰＣＲによって定量された）一方で、二工程精製による比率は、２倍を超えて、３０〜４０％である。
【００７０】
実施例５
手順は実施例４に記載されたとおりであるが、今回は、体積のさらに大きい血漿を用いた（反応混合物当たり３ｍＬ）。さらに、結合表面（マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子及びキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラム）の種々の組み合わせ及び種々の量のマグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）を互いに比較した。さらに、膜二工程プロトコールにおける溶解をたった１５分間ではなく３０分間続けた。結果を図７に示す。この実験は、以前の実験結果を裏付けている。従来技術の一工程プロトコールと比べて、本発明に係る二工程プロトコールは、第２の結合工程でシリカ表面を持つ磁性粒子又はシリカ膜のいずれかを使用するかに関わりなく、母親ＤＮＡに対する改善された胎児ＤＮＡの比を常に生じる。３０分間の延長した溶解はここでは、胎児ＤＮＡに有利に、母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比をさらに改善すると思われ、それによって母親ＤＮＡを顕著に枯渇させるのを可能にする。比の前記改善を図８に示す。
【００７１】
従来技術に係る１−マトリクスプロトコールがたった約１５％の母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比を生じる一方で、２−マトリクスプロトコールによってこの比を５０％の胎児ＤＮＡまで増加させることができる。従って、母親の血漿から精製した循環するＤＮＡにおける胎児ＤＮＡの比率を従来技術に比べて顕著に増加させることができる。
【００７２】
図９に示す表は、（本発明の一工程法により）核酸が支持体物質に結合する、試料における種々の反応条件を示す。マグアトラクト（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ）粒子を支持体物質として採用した。結果を図１０に示す。
【００７３】
実施例６
ヒトの血漿から自由に循環するＤＮＡを抽出するための本発明の方法の効率を比較するために、以下のプロトコールを互いに比較した。
１．従来技術で採用された自由に循環するＤＮＡの一工程法、すなわち、以下に特定される改変キアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルスプロトコール
２．自由に循環するＤＮＡを抽出／単離する本発明の一工程プロトコール（「一工程」）
【００７４】
この実験は、プロトコール当たり４回の抽出の反復において男性供血者のプールした血漿を採用し、調べた。特定のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。５ｍＬの血漿を用いた。ＤＮＡは５０μＬに溶出した。
【００７５】
１．改変キアアンプミンエリュート（ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ）ウイルス真空プロトコール−従来技術
５ｍＬのＥＤＴＡ入り血漿から自由に循環する核酸を単離した。プロトコールは以下のように実施された。
【００７６】
放出条件
７５０μＬのキアゲンプロテアーゼ（プロテアーゼ溶媒に溶解）をピペットで５０ｍＬの容器に入れた。その後、５ｍＬの血漿と５ｍＬのグアニジン含有バッファーＡＬ（５．６μｇのキャリアＲＮＡと共に）を加えた。容器を閉じ、均質な溶液を得るためにボルテックスでよく撹拌した。次いで前記均質な溶液を５６℃の水槽で３０分間インキュベートした。
【００７７】
マーカー断片の添加
母親の核酸と混合された胎児の核酸の状況を模倣するために、次いで２０μＬのマーカー断片混合物を均質な混合物に加えた。この目的で、各場合、２００，０００コピーの２１９ｂｐ断片（胎児ＤＮＡに相当する）と１０１８ｂｐ断片（母親ＤＮＡに相当する）を加えた。
【００７８】
結合
溶解物に６ｍＬのエタノールを加えた。混合物をボルテックスで撹拌し、氷上で５分間インキュベートした。キアバック（ＱＩＡｖａｃ）２４真空装置に連結された延長チューブとともに、溶解物をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムにロードした。前記真空を適用することによって溶解物をカラムに通した。延長チューブを慎重に外した。
【００７９】
洗浄工程
６００μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）をカラムに適用し、真空を適用した。７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノールとを用いて洗浄工程を繰り返した。
【００８０】
カラムを２ｍＬの回収チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。次いでカラムを新しい回収チューブに移し、５６℃の加熱ブロックにて１０分間乾燥させた。
【００８１】
溶出
乾燥させたカラムを１．５ｍＬの容器に入れ、５０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）を各カラムに適用し、３分間インキュベートして、１分間１４，０００ｒｐｍで遠心した。
【００８２】
この方法で得られた核酸は溶出液に存在する。
【００８３】
２．本発明の一工程法による自由に循環する核酸の単離
放出
７５０μＬのキアゲンプロテアーゼ（プロテアーゼ溶媒に溶解）をピペットで５０ｍＬの容器に入れた。５ｍＬの血漿と５ｍＬのグアニジンを含有する溶解／放出バッファーＡＬ（キアゲン、市販、キャリアＲＮＡなし）を加えた。
【００８４】
容器を閉じ、均質な溶液を得るためにボルテックスでよく撹拌した。次いで前記均質な溶液を５６℃の水槽で３０分間インキュベートした。
【００８５】
マーカー断片の添加
ここでもまた、再び、２０μＬのマーカー断片混合物を加えた（母親ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの比を模倣するために各場合、２００，０００コピーの２００ｂｐ断片及び１０００ｂｐ断片）。
【００８６】
結合
次いで結合バッファーを加えることによって以下の結合条件を調整した：約２５〜３５％のイソプロパノール及び２Ｍを超えるカオトロピック化合物。混合物における反応条件は支持体物質への短鎖核酸の結合効率に不可欠なので、バッファーではなく試料全体における反応条件が重要である。
【００８７】
試料をボルテックスで撹拌し、氷上で５分間インキュベートした。
【００８８】
キアバック（ＱＩＡｖａｃ）２４真空装置に連結された延長チューブとともに、結合バッファーと混合した溶解物をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムにロードした。前記真空を適用することによって溶解物をカラムに通した。次いで延長チューブを慎重に外した。
【００８９】
洗浄工程
６００μＬの洗浄バッファー、たとえば、ＡＷ１（キアゲン、市販）をカラムに適用し、真空によって除いた。７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）と７５０μＬのエタノールによるさらなる洗浄工程が続いてもよい。
【００９０】
洗浄したカラムを２ｍＬの回収チューブに入れ、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。次いでカラムを新しい回収チューブに置き、５６℃の加熱ブロックにて１０分間乾燥させた。
【００９１】
溶出
カラムを１．５ｍＬの容器に入れ、５０μＬの溶出バッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）をカラムに適用し、３分間インキュベートを行い、その後１分間１４，０００ｒｐｍでの遠心工程を行った。短鎖核酸は主として溶出液に存在する。
【００９２】
結果
使用されるタックマン（Ｔａｑｍａｎ）試料と共に（ＤＮＡ抽出当たり４回のＰＣＲ反復）、定量デュプレックスリアルタイムＰＣＲによって個々のプロトコールによるＤＮＡの収率を測定した。先ず、Ｙ染色体標的（ＤＹＳ１４）と１８ＳｒＤＮＡ特異的標的によってＤＮＡを判定した。双方の方法によって最終的に試料中のＤＮＡ濃度を決定した。１８ＳｒＤＮＡは両方の染色体に存在するので、Ｙ染色体標的の２倍量で存在する。ＤＮＡの収率は、血漿のｍＬ当たりの半数体ゲノムのコピーとして示した。
【００９３】
小さいＤＮＡ断片の濃度は、デュプレックスリアルタイムＰＣＲにおける濃縮された２００ｂｐ断片と１０００ｂｐ断片にて独立して決定された。
【００９４】
結果を図１１に示す。
【００９５】
図１１は、試料（各抽出方法について４つの試料が測定された）当たりのＤＮＡ収率を示す。従って、個々の方法によって得られる総ＤＮＡ含量が示されている。概観が示すように、本発明の一工程法は、従来技術において知られる一工程法（ミンエリュート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ））よりも明らかに高い収率を達成する。ＤＮＡ収率は何倍も高く、これは、特に発現／存在が低い核酸を測定するのに特に有利である。
【００９６】
図１２は、与えられた２００ｂｐ（胎児の核酸を模倣する）と１０００ｂｐ（長鎖の母親の断片を模倣する）のＤＮＡ断片の収率を示す。上記で議論したように、２００ｂｐ断片と１０００ｂｐ断片は、１：１の比、すなわち、それぞれ２００，０００コピーずつ与えられた。図１２に示したグラフは、精製した核酸について長鎖核酸に対する短鎖核酸の比が依然として１：１であるかどうか、或いは短鎖核酸が濃縮されたかどうかを示す。図１２が明らかにするように、従来技術の一工程法（ミンエリュート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ））はおよそ１：１の長鎖核酸と短鎖核酸の比を有する。従って、短鎖核酸は濃縮されていない。図１２の下の表もまた、試料からどれだけの個々の断片（２００ｂｐと１０００ｂｐ）が得られたかを示す。従って、たとえば、６２．５％の２００ｂｐ断片と３６％の１０００ｂｐ断片が精製されたという情報は、当初与えた２００，０００コピーの２００ｂｐ断片の６２．５％と２００，０００コピーの１０００ｂｐ断片の３６％が精製され、よって単離されたことを示す。示されるように、本発明の一工程法によって短鎖核酸は長鎖核酸を上回って明らかに濃縮されている。比は、もはや（与えられた）１：１ではないが、実質的により多くの短鎖核酸が精製され、よって溶出液に濃縮された。従って、本発明の方法は、従来技術より明らかに優れている。
【００９７】
精製された１０００ｂｐ断片に対する２００ｂｐ断片の比はさらに図１３に示される。従来技術において知られる一工程法がおよそ１の値を達成する一方で、本発明の一工程法における比は、優先的に濃縮／単離される短鎖核酸の方向に明らかにシフトしている。長鎖核酸が最初に予備工程で希釈される本発明の二工程法は５〜１０倍の濃縮をさらに達成する。
【００９８】
本発明の一工程法は、結果が示すように、従来技術において知られる一工程法より明らかに優れている。本発明の一工程法は、調製の間に小さな核酸を濃縮するが、それは、短鎖核酸の好ましい結合をもたらす結合の間の独特の反応条件に起因する。
【００９９】
実施例７
５ｍＬの血漿又は血清からの核酸、特に循環するＲＮＡの単離を以下に記載する。
【０１００】
１３５０μｇの凍結乾燥したキャリアＲＮＡを含有する容器に１３５０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販、グアニジン含有）を加え、それによって１μｇ／ｍＬの溶液を作る。前記１μｇ／μＬの溶液を次いで、バッファーＡＬ（キアゲン、市販、グアニジン含有）と混合する。試料の数によって混合比を調整する。単一試料の処理については、８．５ｍＬのバッファーＡＬを５．６μＬのバッファーＡＶＥと混合する。さらに多い試料については、それに応じて比を合わせなければならない。混合のために容器を１０回前後に動かす。
【０１０１】
６ｍＬのプロテアーゼ溶液（キアゲン、市販）を凍結乾燥したキアゲンプロテアーゼ（７．５Ａ．Ｕ．市販）に加え、慎重に混合する。
【０１０２】
５００μＬのキアゲンプロテアーゼを５０ｍＬの容器（チューブ）にピペットで入れ、５ｍＬの血漿を加える。その後、キャリアＲＮＡ（上記参照）と混合した８．５ｍＬのバッファーＡＬを加え、物質をボルテックスで混合する。
【０１０３】
混合した試料を５６℃で３０分間インキュベートする。
【０１０４】
７．５ｍＬの結合バッファーを溶解物に加える（約０．５〜１．５モル／Ｌ、好ましくは約１モル／Ｌのグアニジンと約６０〜９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは７０％を超えるイソプロパノールを含有する）。混合物をボルテックスで３０秒間撹拌し、氷上で５分間インキュベートする。開放キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに置かれた延長チューブと共に、キアバック２４プラス（ＱＩＡｖａｃ２４Ｐｌｕｓ）上のバックコネクター（ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒ）にキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを挿入する。
【０１０５】
溶解物を延長チューブに導入し、真空を適用する。溶解物をカラムに通すとすぐに真空ポンプのスイッチを切り、圧を平衡化する。延長チューブを捨てる。
【０１０６】
真空支持体からカラムを外し、２ｍＬの回収容器に移す。カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【０１０７】
ＲＮＡの調製については、１０μＬのＤＮＡ分解酵素Ｉ(DNAse I)のストック溶液を７０μＬのバッファーＲＤＤ（キアゲン、市販）にピペットで入れる。チューブを動かして混合を行う。ＲＤＤバッファーには、ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット（キアゲン、カタログ番号７９２５４）が提供される。
【０１０８】
カラムを再び、キアバック２４プラス(ＱＩＡｖａｃ２４Ｐｌｕｓ)真空支持体上に置く。キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニシリカゲル膜にＤＮＡ分解酵素Ｉの混合物を直接ピペットで入れ、適度な温度（２０〜３０℃）で１５分間インキュベートする。
【０１０９】
その後、６００μＬのバッファーＡＷ１（キアゲン、市販）をピペットでキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムに入れる。次いでカラムを介して混合物を引くために真空を適用する。この後、７５０μＬのバッファーＡＷ２（キアゲン、市販）を加え、真空を適用することによってそれをカラムに通す。
【０１１０】
その後、７５０μＬのエタノール（９６〜１００％）をカラムに適用し、真空によってカラムに通す。次いで真空支持体からキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを外し、バックコネクター（ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒ）を捨てる。カラムを２ｍＬの清浄な回収容器に入れて２０，０００×ｇにて１４，０００ｒｐｍで３分間遠心する。
【０１１１】
カラムを新しい２ｍＬの回収容器に入れ、フタを開けたまま５６℃で１０分間乾燥させる。次いでキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニカラムを清浄な１．５ｍＬの微量遠心用容器に入れ、回収容器を捨てる。２０〜６０μＬのバッファーＡＶＥ（キアゲン、市販）をキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ミニ膜の中央にピペットで落とす。この後、フタを閉じて３分間インキュベートする。
【０１１２】
この後、ＲＮＡを溶出するために、２０，０００×ｇでの１４，０００ｒｐｍの１分間の遠心工程が続く。次いでＲＮＡ分解酵素阻害剤を加える。
【０１１３】
相当するプロトコールを用いて、目覚しく短鎖ＲＮＡを精製することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程によって特徴付けられる方法：
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≧２５％（ｖ／ｖ）かつ≦３５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【請求項２】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程を有する方法：
（ｘ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≦２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物／上清を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に突破物／上清を結合させること、但し、前記アルコールは、２５〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【請求項３】
工程（ｘ）において、前記アルコールが≦２０％（ｖ／ｖ）の濃度で混合物に存在することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｘ）における支持体物質への核酸の結合の間のアルコール濃度が、工程（ａ）における支持体物質への核酸の結合の間のアルコール濃度よりも低いことを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の以下の特徴によって特徴付けられる、請求項１〜４の一以上に記載の方法：
ａ．工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が、≧２モル／Ｌ、≧２．４モル／Ｌ、又は≧２．６モル／Ｌであること；及び／又は
ｂ．工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が、≦４モル／Ｌ、≦３．５モル／Ｌ、≦３．２モル／Ｌ、又は≦３．１モル／Ｌであること；及び／又は
ｃ．工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度であること；及び／又は
ｄ．当該方法によって、出発材料に存在する短鎖核酸の少なくとも３０％、５０％、及び好ましくは少なくとも６０％を単離することができること；及び／又は
ｅ．長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ及び／又は≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ及び／又は≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮されること。
【請求項６】
工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度が≧２．５モル／Ｌかつ≦３．１モル／Ｌであり、かつカオトロピック化合物が好ましくはグアニジン塩酸塩であることを特徴とする、請求項１〜５の一以上に記載の方法。
【請求項７】
核酸が細胞外核酸であることを特徴とする、請求項１〜６の一以上に記載の方法。
【請求項８】
単離／精製される核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜７の一以上に記載の方法。
【請求項９】
核酸が結合する支持体物質が、珪酸含有物質、シリカゲル、ガラス、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、ゲル状シリカ、磁性粒子、特に磁性シリカ又はガラス粒子、セラミックス、又はポリマー支持体物質を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８の一以上に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の特徴によって特徴付けられる、核酸が結合する支持体マトリクスに細胞外の及び／又は短鎖の核酸を結合させる方法。
【請求項１１】
血液試料から、特に血漿又は血清から胎児の核酸を濃縮する方法であって、請求項１〜９の一以上に記載の方法が実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製するためのキットであって、請求項１〜９の一以上に記載の方法を実施するためのバッファー及び／又は試薬を有するキット。
【請求項１３】
血液試料から胎児ＤＮＡを精製するための請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
診断に用いるための、請求項１〜９の一以上に記載の方法、又は請求項１２若しくは１３に記載のキット。
【請求項１】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程によって特徴付けられる方法：
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≧２５％（ｖ／ｖ）かつ≦３５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【請求項２】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製する方法であって、以下の方法工程を有する方法：
（ｘ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に出発材料を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に核酸を結合させること、但し、前記アルコールは、≦２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ａ）少なくとも１つのカオトロピック化合物及び少なくとも１つの分枝鎖及び／又は非分枝鎖のアルコールの存在下で、核酸が結合する支持体物質に工程（ｘ）からの突破物／上清を接触させることによって、核酸が結合する支持体物質に突破物／上清を結合させること、但し、前記アルコールは、２５〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する；
（ｂ）核酸が結合する支持体物質から結合した核酸を任意に溶出すること。
【請求項３】
工程（ｘ）において、前記アルコールが≦２０％（ｖ／ｖ）の濃度で混合物に存在することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｘ）における支持体物質への核酸の結合の間のアルコール濃度が、工程（ａ）における支持体物質への核酸の結合の間のアルコール濃度よりも低いことを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の以下の特徴によって特徴付けられる、請求項１〜４の一以上に記載の方法：
ａ．工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が、≧２モル／Ｌ、≧２．４モル／Ｌ、又は≧２．６モル／Ｌであること；及び／又は
ｂ．工程（ｘ）及び／又は工程（ａ）における混合物中のカオトロピック化合物の濃度が、≦４モル／Ｌ、≦３．５モル／Ｌ、≦３．２モル／Ｌ、又は≦３．１モル／Ｌであること；及び／又は
ｃ．工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度≧工程（ｘ）におけるカオトロピック化合物の濃度であること；及び／又は
ｄ．当該方法によって、出発材料に存在する短鎖核酸の少なくとも３０％、５０％、及び好ましくは少なくとも６０％を単離することができること；及び／又は
ｅ．長さ≦５００ｂｐ、≦４００ｂｐ及び／又は≦３００ｂｐ及び／又は≧５０ｂｐ及び／又は≧１００ｂｐの核酸の群から選択される特定の長さの短鎖核酸が単離及び／又は濃縮されること。
【請求項６】
工程（ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度が≧２．５モル／Ｌかつ≦３．１モル／Ｌであり、かつカオトロピック化合物が好ましくはグアニジン塩酸塩であることを特徴とする、請求項１〜５の一以上に記載の方法。
【請求項７】
核酸が細胞外核酸であることを特徴とする、請求項１〜６の一以上に記載の方法。
【請求項８】
単離／精製される核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜７の一以上に記載の方法。
【請求項９】
核酸が結合する支持体物質が、珪酸含有物質、シリカゲル、ガラス、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、ゲル状シリカ、磁性粒子、特に磁性シリカ又はガラス粒子、セラミックス、又はポリマー支持体物質を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８の一以上に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の特徴によって特徴付けられる、核酸が結合する支持体マトリクスに細胞外の及び／又は短鎖の核酸を結合させる方法。
【請求項１１】
血液試料から、特に血漿又は血清から胎児の核酸を濃縮する方法であって、請求項１〜９の一以上に記載の方法が実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
核酸を含有する出発材料から、核酸、特に短鎖核酸を単離及び／又は精製するためのキットであって、請求項１〜９の一以上に記載の方法を実施するためのバッファー及び／又は試薬を有するキット。
【請求項１３】
血液試料から胎児ＤＮＡを精製するための請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
診断に用いるための、請求項１〜９の一以上に記載の方法、又は請求項１２若しくは１３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１１−５２２５２９（Ｐ２０１１−５２２５２９Ａ）
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１０８６１（Ｐ２０１１−５１０８６１）
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３３６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６７７５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３３６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６７７５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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