硝酸呼吸能を有する微生物の培養方法
【課題】微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行う。
【解決手段】硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に電極を接触させ、電極に電位を与えて、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにした。
【解決手段】硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に電極を接触させ、電極に電位を与えて、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝酸呼吸能を有する微生物の培養方法に関する。さらに詳述すると、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物、例えば大腸菌等を培養するのに好適な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Escherichia coli）は、遺伝子組換え操作を行う際の宿主として利用される代表的な微生物であり、分子生物学の分野における最も基本的で且つ極めて重要なツールである。また、大腸菌は、遺伝子組換えにより所望の機能を容易に発現させることができる利便性も有しており、実際に有用な機能を発現させた大腸菌が種々作出されている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、ファルネシル二リン酸からイソプレノイドを合成する酵素の遺伝子又は遺伝子群と、２型のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子と、アセトアセチル−コエンザイムＡからイソペンテニル二リン酸までの合成を行うメバロン酸経路遺伝子群の３つの遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌が開示されており、さらに、この遺伝子組換え大腸菌をアセト酢酸塩を含む培地にて培養することにより、イソプレノイドを生産できることが開示されている。また、特許文献２では、セグロイソメ由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を加工し、タウロピンデヒドロゲナーゼ生成能を阻害することなくプラスミドに挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子を有する遺伝子組換え大腸菌が開示されており、さらに、この遺伝子組換え大腸菌を培養することで、タウリンとピルビン酸からタウロピンを合成する酵素であるタウロピンデヒドロゲナーゼを生産できることが開示されている。
【０００４】
ところで、大腸菌を培養する場合、例えば、遺伝子組換え大腸菌を培養してその過程でタンパク質等の物質を大量生産させてこれを回収する場合には、大腸菌を培養液に入れて好気条件下で培養を行うのが一般的である。つまり、大腸菌に最終電子受容体として遊離酸素（Ｏ２）を供給しながら培養を行うのが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０７３７６号
【特許文献２】特開２００７−８９５３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、大腸菌に遊離酸素を供給する場合には、培養液に空気を常時供給して培養液の遊離酸素濃度を常時一定レベル以上に維持するための空気供給装置（例えばポンプ等）等が必要となる。また、清浄度の高い空気を供給して培養液への雑菌の混入を防ぐための殺菌装置（例えば紫外線照射装置）等が必要となる場合もある。したがって、培養に必要となる装置が高価となったり、装置の運転コストや維持・管理コストが多大なものとなって、培養にかかる総コストが上昇してしまう問題があった。
【０００７】
そこで、本願発明者は、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、上記問題点を解決し得ると考えた。即ち、大腸菌は、遊離酸素だけでなく硝酸イオンも最終電子受容体として使用することができる。硝酸イオンは遊離酸素と比較して圧倒的に水に溶けやすく、しかも、ポンプ等を使用することなく、硝酸塩等を直接培養液に添加すれば供給が可能である。したがって、硝酸イオンを最終電子受容体として使用すれば、従来のように培養液に空気を常時供給するための空気供給装置等や清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要とすることなく、大腸菌を培養することができるものと考えられた。
【０００８】
ところが、このような利点があるにも関わらず、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことは全く行われていなかった。そこで、本願発明者等は、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用した培養について検討すべく、培養液に硝酸イオンを溶解させ、大腸菌に硝酸呼吸を行わせながら培養試験を実施した。その結果、ある一定の培養期間を経過すると大腸菌の生育が阻害されることがわかった。
【０００９】
この試験結果について本願発明者等が詳細に検討した結果、大腸菌の硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが大腸菌の生育に悪影響を及ぼしていることがわかった。即ち、亜硝酸イオンは、微生物全般に対して毒性を呈する物質として知られており、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが大腸菌に対して毒性を呈した結果として、大腸菌の生育に悪影響が及ぼされたものと考えられた。このことから、大腸菌に限らず、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物全般について、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行おうとすると、同様の問題が生じ得ることが考えられた。
【００１０】
しかしながら、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができれば、上記の通り、従来のように培養液に空気を常時供給して培養液の遊離酸素濃度を常時一定レベル以上に維持する制御を行うことなく、また、清浄度の高い空気を供給することなく、培養を行うことができ、培養にかかるコストを大幅に低減することができる。また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も多数存在している。したがって、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができれば、従来培養ができなかった微生物を培養することも可能となる。以上のことから、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことには種々の利点があり、産業上極めて有用である。
【００１１】
そこで、本発明は、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことのできる方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、物質生産能を有する微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、微生物による物質生産を効率よく行うことのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は鋭意研究を行った結果、培養液に電極を接触させて電位を与え、大腸菌の硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことで、大腸菌の生育を阻害することなく、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養できることを知見するに至った。そして、この知見から、大腸菌に限らず、硝酸呼吸能を有する微生物全般について、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことで、生育を阻害することなく培養を促進することができる可能性が導かれることを知見し、本願発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明の培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に電極を接触させ、電極に電位を与えて、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００１５】
電極に電位を与えることによって、微生物の硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンを酸化させると、硝酸呼吸による培養液中の亜硝酸イオンの蓄積が抑えられる。したがって、亜硝酸イオンの毒性による微生物の生育の阻害の影響を大幅に低減でき、対数増殖期を大幅に延長させて、最終菌体密度を大幅に向上させることができる。しかも、亜硝酸イオンの酸化により硝酸イオンが生成されることから、微生物の硝酸呼吸により消費された硝酸イオンを再生して再度微生物に供給することができる。したがって、培養液中に最終電子受容体として含有させた硝酸イオンを繰り返し使用することができる。
【００１６】
ここで、本発明の培養方法において、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）であることが好ましい。また、大腸菌は、遺伝子組換え大腸菌であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の培養方法において、培養対象微生物を大腸菌または遺伝子組換え大腸菌とした場合には、電極を炭素電極とし、電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行うことが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明の培養方法において、培養対象微生物を大腸菌または遺伝子組換え大腸菌とした場合には、電極を白金電極とし、電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行うことが好ましい。
【００１９】
また、上記課題を解決するため、本願発明者等が鋭意検討を行った結果、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌を本発明の培養方法により培養することで、その培養過程での１菌密度当たりのβ−ガラクトシダーゼ生産量（１菌密度当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性）が大幅に向上することを知見した。この結果から、物質生産能と硝酸呼吸能とを有する微生物全般について、本発明の培養方法により培養を行うことで、物質の生産効率を大幅に向上できる可能性が導かれることを知見し、本願発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明の物質生産方法は、物質生産能と硝酸呼吸能とを有する微生物を培養対象微生物とし、微生物により物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して本発明の培養方法を実施し、培養過程において微生物により生産される物質を回収するようにしている。
【００２１】
ここで、本発明の物質生産方法において、微生物は、物質生産能を有する遺伝子組換え大腸菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の培養方法によれば、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことが可能となる。したがって、培養液に空気を常時供給して遊離酸素濃度を一定レベル以上に維持するための空気供給装置等や、清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要としないので、培養にかかるコストを大幅に低減することができる。
【００２３】
また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も多数存在しているが、本発明の培養方法によれば、このような微生物についても、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができるので、従来培養ができなかった微生物の培養が可能となる。
【００２４】
しかも、本発明の培養方法によれば、硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに戻ることから、培養期間中に硝酸イオンを補充しなくてもその濃度を維持することができる。したがって、最終電子受容体である硝酸イオンを補充する手間を省くことができ、培養にかかる手間を大幅に削減することができる。
【００２５】
本発明の物質生産方法によれば、物質生産能を有する微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、微生物による物質生産を効率よく行うことが可能となる。したがって、培養液に空気を常時供給して遊離酸素濃度を一定レベル以上に維持するための空気供給装置等や、清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要としないので、微生物からの物質生産にかかるコストを大幅に低減することができる。
【００２６】
また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も存在しているが、本発明の物質生産方法によれば、このような微生物についても、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行い、物質生産の対象微生物とすることができるので、従来生産できなかった物質の生産が可能となる。
【００２７】
さらには、本発明の物質生産方法によれば、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことで、培養液に空気を供給せずに物質生産を行うことができるので、遊離酸素により分解・劣化が生じ得る物質を分解・劣化させずに生産することも可能になる。
【００２８】
しかも、本発明の物質生産方法によれば、硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに戻ることから、培養期間中に硝酸イオンを補充しなくてもその濃度を維持することができる。したがって、電子受容体である硝酸イオンを補充する手間を省くことができ、物質生産にかかる手間を大幅に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の培養方法の概念を示す図である。
【図２】第一の実施形態Ａにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図３】第一の実施形態Ｂにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図４】第一の実施形態Ｃにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図５】第一の実施形態Ｄにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図６】第二の実施形態にかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図７】硝酸イオンの存在下または硝酸イオンと亜硝酸イオンの存在下で大腸菌に硝酸呼吸をさせながら培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（比較例１）。
【図８】実験に使用した電気培養装置の構成を示す断面図である。
【図９】実験に使用した電気培養装置の小容器の構成を示す図である。
【図１０】炭素電極を用いた場合の亜硝酸イオンの酸化還元特性を示す図である。
【図１１】白金電極を用いた場合の亜硝酸イオンの酸化還元特性を示す図である。
【図１２】炭素電極を用いた場合の各種電位における亜硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１３】炭素電極を用いた場合の各種電極電位における硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１４】白金電極を用いた場合の各種電極電位における硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１５】各種電極電位で大腸菌の培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例１）。
【図１６】電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を行ったときの硝酸イオンと亜硝酸イオンの経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１７】通電無しで培養試験を行ったときの硝酸イオンと亜硝酸イオンの経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１８】遺伝子組換え大腸菌の培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例２）。
【図１９】遺伝子組換え大腸菌の培養試験を行った際のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図である（実施例２）。
【図２０】培養試験に用いられた遺伝子組換え大腸菌に導入されたｐＵＣ１８プラスミドの構成を示す図である（実施例２）。
【図２１】本発明の培養方法を実施するための電気培養装置の他の構成の一例を示す断面図である。
【図２２】第三の実施形態Ａにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２３】第三の実施形態Ｂにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２４】第三の実施形態Ｃにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２５】第三の実施形態Ｄにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２６】第三の実施形態Ｅにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２７】培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例４）。
【図２８】培養試験期間中における極間電圧の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２９】培養試験期間中における電流値の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図３０】培養試験期間中における水素発生量の比較図である（実施例４）。
【図３１】培養試験期間中における各種有機酸の蓄積量の比較図である（実施例４）。
【図３２】通電の有無及び大腸菌の有無による二酸化炭素及び水素の発生量を示す図である（実施例１）。
【図３３】大腸菌を利用した場合の水素製造機構の概念図である。
【図３４】培養試験を行った際の電流値の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図３５】培養試験を行った際の電圧値の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図３６】実施例３における培養試験結果（通電無し）を示す図である。
【図３７】実施例３における培養試験結果（通電有り）を示す図である。
【図３８】炭素源（栄養源）をグルコースとして培養試験を行った結果を示す図である（実施例５）。
【図３９】炭素源（栄養源）をグルコースとして培養試験を行った際のグルコールの経時変化を示す図である（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３１】
図１に、本発明の培養方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物２を培養するに際し、培養液４に硝酸イオンを含有させて微生物２に硝酸呼吸をさせ、培養液４に電極９を接触させ、電極９に電位を与えて、微生物２の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００３２】
図１において、容器５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られており、培養槽７には硝酸イオンを含む培養液４と微生物２が収容され、対極槽８には電解液４ａが収容されている。また、培養液４には電極（作用電極）９が浸され、電解液４ａには対電極１０が浸されている。
【００３３】
本発明の培養方法を適用しうる対象となる微生物は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物であれば特に限定されない。具体例を挙げると、例えばアルカリゲネス（Alcaligenes）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アクアスピリラム（Aquaspirillum）属、アゾスピリラム（Azospirillum）属、バチルス（Bacillus）属、ブラストバクター（Blastobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、ブランハメラ（Branhamella）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、サイトファーガ（Cytophaga）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、フレキシバクター（Flexibacter）属、ハロバクテリウム（Halobacterium）属、ヒポミクロビウム（Hyphomicrobium）属、キンゲラ（Kingella）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、リソバクター（Lysobacter）属、ネイセイリア（Neisseiria）属、パラコッカス（Paracoccus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ウォリネラ（Wolinella）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、チオバチルス（Thiobacillus）属、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）属、チオスフェラ（Thiosphera）属等の微生物を、本発明の培養方法における培養対象微生物とすることができる。
【００３４】
ここで、本発明の培養方法を適用しうる対象となる微生物としては、上記微生物の中でも、硝酸呼吸により培養液４に亜硝酸イオンが蓄積されやすい微生物が特に好適である。具体的には、大腸菌（Escherichia coli）、ブラディリゾビウム ジャポニカム（Bradyrhyzobium japonicum）、クレブシエラ プネウモニア（Klebsiella pneumonia）、エンテロバクター エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）、チオバチルス チオパラス（Thiobacillus thioparus）、リゾバクター アンチビオティカム（Lysobacter antibioticum）等が挙げられ、特に大腸菌（Escherichia coli）が好適である。
【００３５】
培養液４には、培養対象微生物の培養に必要な元素や栄養源を含むものを適宜用いればよい。例えば、培養対象微生物を大腸菌とする場合には、乳酸ナトリウム、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、カザミノ酸及び微量元素からなる溶液を培養液４として用いればよい。
【００３６】
電解液４ａには、例えば塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの電解質が添加された溶液を用いればよい。
【００３７】
イオン交換膜６は、培養液４に含まれる硝酸イオン及び微生物２の硝酸呼吸によって生じる亜硝酸イオンを対極槽８側に透過させることなく培養液４中に留まらせ、且つ培養液４に含まれるイオンまたは電解液４ａに含まれるイオンを透過させてイオン電流を生じさせ、作用電極９において生じる酸化反応を補完する還元反応を対電極１０で生じさせるものである。これにより、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが長期に亘って安定に硝酸イオンに酸化される。イオン交換膜６としては、硝酸イオンと亜硝酸イオンを透過させることのない陽イオン交換膜、２価または３価の陰イオン交換膜を用いることができ、特にプロトンを透過可能な陽イオン交換膜を用いることが好適である。この場合、培養液４と電解液４ａに含まれている陽イオン（プロトン）によってイオン電流を発生させやすい。但し、本願発明者等の実験によれば、少なくとも−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲では硝酸イオンが亜硝酸イオンに還元される反応は生じないことから、イオン交換膜６を設けずとも、対電極１０での硝酸イオンの還元反応は生じない。したがって、イオン交換膜６を設けることは本発明において必須ではない。
【００３８】
ここで、培養液４には、微生物２の呼吸に関与することなく、亜硝酸イオンよりも酸化されにくい酸化還元物質を添加するようにしてもよい。亜硝酸イオンよりも酸化され易い酸化還元物質を用いると亜硝酸イオンの酸化が阻害される虞がある。酸化還元物質を添加することで、培養液４の溶液電位を制御し易くなる。酸化還元物質としては、例えば、鉄イオン、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲン等を用いることができる。鉄イオンを酸化還元物質とする場合には、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液４中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができる。但し、本発明の培養方法においては、作用電極９において亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化できればよく、酸化還元物質の培養液４への添加は必須ではない。
【００３９】
培養液４の硝酸イオン含有量は、培養対象微生物２の硝酸呼吸能や菌体密度に応じてその最適な量が適宜変化するが、概ね１〜１００ｍＭ、好適には１０ｍＭ程度添加すればよい。
【００４０】
尚、培養液４に硝酸イオンを含有させる方法としては、例えば、硝酸ナトリウム等の硝酸塩を培養液４に添加して溶解させる方法が挙げられるが、この方法には限定されない。例えば、培養液４に亜硝酸塩を添加して亜硝酸イオンを溶解させ、電極に電位を与えて亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化することにより培養液４に硝酸イオンを含有させるようにしてもよい。
【００４１】
培養液４に硝酸イオンを含有させることで、硝酸呼吸能を有する微生物２の最終電子受容体物質を培養液４中に存在させることができる。ここで、硝酸呼吸能を有する微生物２が通性嫌気性微生物の場合には、培養液４に溶け込んでいる遊離酸素を消費しながら呼吸を行い、遊離酸素濃度が低下するにつれて徐々に硝酸イオンを利用した硝酸呼吸を行うようになるが、偏性嫌気性微生物の場合には、培養液４に遊離酸素が溶け込んでいると微生物２が失活する場合がある。したがって、培養対象微生物２が偏性嫌気性微生物の場合には、培養液４を窒素やアルゴン等の不活性ガスでパージして遊離酸素を追い出すことが好ましい。
【００４２】
培養対象微生物２により硝酸呼吸が行われると、亜硝酸イオンが発生する。本発明では、亜硝酸イオンを作用電極９により酸化して硝酸イオンに戻し、最終電子受容体を供給し続けることができる。
【００４３】
作用電極９の電位は、培養液４中で亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化可能な電位とすればよい。具体的には、作用電極９を炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極とした場合には、電位を＋０．９Ｖ以上とすれば亜硝酸イオンの酸化が起こる。作用電極９を白金電極を用いた場合には、電位を＋０．８Ｖ以上とすれば亜硝酸イオンの酸化が起こる。したがって、使用する電極に応じて、亜硝酸イオンを酸化して硝酸イオンを生成することができる電位に適宜設定すればよい。
【００４４】
ここで、亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化する速度を高めて亜硝酸イオンの蓄積を防ぐ上では、作用電極９の電位を高めることが好ましいが、作用電極９の電位を高め過ぎると、微生物によっては生育が阻害される場合がある。そこで、例えば以下の手順により、作用電極９の好適電位を導き出すことができる。即ち、培養液４に作用電極９を接触させて、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される範囲の各種電位で培養試験を行う。また、比較試験として、培養液４に作用電極９を接触させずに（電位を印加せずに）培養試験を行う。作用電極９の電位をある一定値に到達するまで高める程、微生物の対数増殖期が延び続けるが、作用電極９の電位がある一定値を超えると、微生物の対数増殖期が徐々に短くなり、最終的には培養液４に作用電極９を接触させずに培養試験を行った場合と同程度あるいはそれよりも短くなる。対数増殖期の長さが最大となる電位を適正電位と呼び、適正電位よりも高い電位で且つ対数増殖期が電位を印加していない場合と同程度となる電位を限界電位と呼ぶ。上記培養試験結果から、適正電位と限界電位を導き出すことができる。そして、作用電極９の電位は、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される電位以上で尚且つ限界電位以下とすることが好ましく、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される電位以上で尚且つ適正電位以下とすることがより好ましく、適正電位とすることが最も好ましい。
【００４５】
作用電極９の電位を制御し始めるタイミングについては、電位を制御していない場合の対数増殖期中、好適には対数増殖期中期付近とすればよい。電位を与えるタイミングが早すぎると微生物の生育が阻害される虞がある。逆に電位を与えるタイミングが遅すぎると亜硝酸イオンが蓄積して微生物の生育が阻害される虞がある。但し、微生物によっては、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御しても生育が阻害されない場合もある。例えば、硫酸還元菌やメタン生成菌などの環境微生物、酵母、硝酸還元菌の中でもParacoccus pantotropha等については、培養初期から作用電極９の電位を制御しても生育が阻害されないことが本願発明者等の実験により確かめられている。このような微生物については、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御しても問題は無い。また、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御することで微生物の生育が阻害されたとしても、定常期に到達する段階で最終的に生育促進効果が得られるのであれば、培養初（培養開始時）から作用電極９の電位を制御するようにしても構わない。尚、大腸菌については、作用電極９の電位を制御するタイミングは、培養開始から３時間経過後、好適には培養開始から３〜２０時間の間、より好適には培養開始から３〜１７．５時間の間である。
【００４６】
以上、本発明の培養方法によれば、電位を印加しない場合よりも対数増殖期を大幅に延長させることができ、その結果として最終菌体密度が大幅に向上して、効率よく培養を行うことができる。したがって、微生物の硝酸呼吸を積極的に利用した培養を効率よく実施することが可能となる。
【００４７】
また、本発明の培養方法を実施すると、対電極１０から大量の水素ガスが発生する。この現象は、通常の培養方法では見られないし、微生物を培養液に投入せずに通電した場合にも見られない。このことから、上記現象は、微生物が電子（栄養）源とした有機物から得られた電子が、対電極１０を通して水素ガスとして回収された現象であると解される。したがって、本発明の培養方法の付随的効果として、微生物の生育を促進させつつ、同時にエネルギー源としての水素ガス回収できるという効果が奏される。
【００４８】
次に、本発明の物質生産方法について説明する。本発明の物質生産方法は、物質生産能と硝酸還元能を有する微生物を培養対象微生物とし、この微生物が物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して本発明の培養方法で培養し、培養過程において微生物により生産される物質を回収するようにしている。尚、本発明における「微生物により生産される物質」とは、微生物が直接生産する物質は勿論のこと、微生物の生産物が他の物質と化学反応した結果生じる物質、即ち微生物が間接的に生産する物質も含んでいる。
【００４９】
本発明の培養方法を用いて培養を行うと、最終菌体密度が増加するだけでなく、１菌密度当たりの物質生産能も向上することが確認されている。したがって、最終菌体密度の増加効果と相俟って、極めて効率よく物質生産を行うことができる。
【００５０】
例えば、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌を培養対象微生物２とし、培養液４にラクトースを添加して培養を行うことで、β−ガラクトシダーゼによりラクトースが分解されてグルコースとガラクトースが生成される。本発明によれば、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ活性を大幅に向上させて、β−ガラクトシダーゼの生産量を大幅に向上できるので、ラクトースを原料とするグルコースとガラクトースの生産が極めて効率よく実施できるようになる。
【００５１】
また、その他にも、本発明の物質生産方法により、例えばヘミセルロースからバイオ燃料になる脂肪酸エステル類、脂肪アルコール（Nature 463, 7280 (Jan 2010)）、エタノール、水素、生分解性プラスチックＰＨＡ、コハク酸、1,3-プロパンジオール、2,3-プロパンジオール、アスパラギン酸、アラニン、インターロイキン・インスリンなど医薬品、セルラーゼ・リパーゼ・キトサナーゼ・プロテアーゼなどのタンパク質などの生産を極めて効率よく実施し得る。
【００５２】
本発明の培養方法及び物質生産方法は、例えば、図２〜６、図２２〜２６に示す電気培養装置により実施される。以下、イオン交換膜６を設けた場合の実施形態として、第一の実施形態を図２〜図５に基づいて説明し、第二の実施形態を図６に基づいて説明する。また、イオン交換膜を設けない場合の実施形態として、第三の実施形態を図２２〜図２６に基づいて説明する。
【００５３】
＜第一の実施形態＞
第一の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と電解液をイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に作用電極と共に参照電極を接触させ、電解液に対電極を接触させ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００５４】
第一の実施形態にかかる培養方法は、例えば図２〜図５に示す電気培養装置１により実施される。即ち、図２〜図５に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６によって仕切られた二つの槽のうちの一方の槽を培養槽７とし、他方の槽を対電極槽８とし、培養槽７には硝酸イオンを含む培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が浸され、対電極槽８には電解液４ａが収容されると共に対電極１０が浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、定電位設定装置１２により作用電極の電位を３電極方式で制御するようにしている。
【００５５】
このように、３電極方式で作用電極９の電位を制御することで、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【００５６】
また、図２〜図５に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外（電気培養装置１の外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されるない。例えば、ガス回収手段１５を備えることなく、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７からガスが漏れ出すことがない。このようにしてガスを回収することで、硝酸還元能を有する微生物２により生産される物質がガス状物質である場合に、これを漏れなく回収することができる。
【００５７】
さらに、図２〜図５に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４を採取するようにしている。但し、培養液４の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段１６を備えることなく、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介して培養液４を採取するようにしてもよい。このようにして培養液４を回収することで、硝酸還元能を有する微生物２が生産する物質を培養液４から回収することができる。
【００５８】
また、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【００５９】
以下、図２に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ａとして説明し、図３に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｂとして説明し、図４に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｃとして説明し、図５に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｄとして説明する。
【００６０】
（第一の実施形態Ａ）
図２に示す電気培養装置１は、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対電極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備えると共にガス（対電極１０から発生するガス）を容器２０の外に排出するガス排出管２２を備えるものとしている。また、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させている。尚、図２に示す電気培養装置１では、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させているが、必ずしもこの構成には限定されず、配線をガス排出管２２を通さずに定電位設定装置１２と結線するようにしてもよい。
【００６１】
培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対電極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。
【００６２】
対電極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。ここで、小容器２１はその全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいが、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成したり、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成し、小容器２１からのガス（対電極槽８から発生するガス）が容器２０の内部に漏洩しないようにしてもよい。
【００６３】
このように、容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４に小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６は培養液４と接触する。換言すれば、培養液４はイオン交換膜６を介して電解液４ａと接触する。
【００６４】
ここで、第一の実施形態Ａでは、小容器２１を密閉構造とすることが好ましいが、小容器２１は必ずしも密閉構造とせずともよい。即ち、小容器２１の上部を開放して対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させて滞留させると、小容器２１を密閉構造とした場合と比較して微生物の生育が若干低下するものの、通電せずに培養した場合と比較して優れた生育促進効果を奏しうる。そして、この場合には、培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、微生物２が産生したガスに加え、対電極１０にて発生した水素ガスをも同時に回収できる利点がある。
【００６５】
尚、対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させて滞留させた場合の微生物の生育低下の要因としては、例えば対電極１０から微生物の生育に悪影響を及ぼすガスが発生しており、このガスが培養液４に溶け込むこと等が推定される。したがって、対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させる形態とした場合には、例えば培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けることで、小容器２１を密閉構造とした場合と同様の生育促進効果を奏し得るものと考えられる。
【００６６】
また、培養槽７（容器２０）は、密閉構造とすることが好ましい。この場合には、培養槽７を嫌気条件に制御し易い。即ち、培養槽７を密閉構造とすることで、遊離酸素の進入が起こらないので、通性嫌気性微生物を培養対象微生物とした場合には、培養槽７に残存する遊離酸素が消費されれば、呼吸形態を完全に硝酸呼吸に移行させることができる。また、偏性嫌気性微生物を培養対象微生物とした場合にも、培養を開始する前に培養槽７の遊離酸素を実質的に無くせば、培養槽７への遊離酸素の進入が起こらないので、培養期間中は嫌気条件を維持し続けて硝酸呼吸を行わせることができる。さらに、微生物がガスを産生する場合には、培養槽７を密閉構造とし、且つ上述のガス回収手段１５等を備えることが好ましい。この場合には、微生物が産生するガスを容器２０の外に漏れ出させることなく、ガスによる容器２０内の圧力上昇を防ぎながらその全量を回収し易いものとできる。但し、培養槽７を密閉構造とすることは必須条件ではない。即ち、微生物がガスを産生して培養液４の液面からガスが発生することによって、培養液４の液面への遊離酸素の接触が抑制されるような場合や、好気性微生物を培養対象とする場合等においては、培養槽７を密閉構造とせずとも構わない。
【００６７】
尚、本実施形態において使用できる作用電極９としては、上記の通り、亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化し得る材質の電極、例えばグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、対電極１０としては、作用電極９における酸化反応を補完する還元反応が生じ得る材質の電極、例えば炭素電極、白金電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
（第一の実施形態Ｂ）
図３に示す電気培養装置１は、上方が開放されている容器２３をイオン交換膜６で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽７としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞がれているものとしている。つまり、図３に示す電気培養装置１は、対電極槽８から発生するガスを培養槽７に漏れ出さないようにする構成以外は、図２と同一の構成としている。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００６９】
尚、図３に示す電気培養装置１において、対電極槽８は、開放したままでもよいが、培養槽７と同様に密閉構造とし、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外に排出するガス排出管を備えるようにしてもよい。この場合には、対電極槽８から発生する水素ガスを所望の位置から排出させることができるので、これを回収することが可能となる。
【００７０】
ここで、図３に示す電気培養装置１において、対電極槽８から発生するガスを培養槽７に漏れ出さないようにする構成とすることが好ましいが、対電極槽８のヘッドスペースと培養槽７のヘッドスペースを連通させて対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させるようにしても構わない。この場合にも、第一の実施形態Ａにおいて説明した通り、本発明の効果は十分に得られる。
【００７１】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００７２】
図３に示す電気培養装置１において、ガス不透過膜またはガス不透過部材２４としては、各種分野で一般に用いられているものを適宜用いることができる。例えば、ガス不透過部材としては、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過膜としては、例えばイオン交換膜６を用いることができるがこれに限定されるものではない。
【００７３】
尚、本実施形態において使用できる容器２３の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００７４】
（第一の実施形態Ｃ）
図４に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、一方の容器２５ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２５ｂを開放して対電極槽８としている。この場合、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２５自体のＵ字型構造によって隔てて配置される。そして、一方の容器２５ａが密閉構造とされていることから、対電極槽８から発生するガスが培養槽７に侵入するのを防ぎながら、培養槽７から発生するガスが培養槽７から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００７５】
ここで、第一の実施形態Ｃにおける電気培養装置１の他方の容器２５ｂの開放とは、例えば他方の容器２５ｂの端部を完全に開放した場合は勿論のこと、図４に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、対電極槽８から発生するガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。
【００７６】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００７７】
尚、本実施形態において使用できる容器２５の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００７８】
（第一の実施形態Ｄ）
図５に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂを開放して対電極槽８としている。この場合にも、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２６自体のＨ字型構造によって隔てて配置される。そして、Ｈ字型容器２６の一方の容器２６ａが密閉構造とされていることから、培養槽７は密閉構造となる。したがって、対電極槽８から発生するガスが培養槽７に侵入するのを防ぎながら、培養槽７から発生するガスが培養槽７から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００７９】
ここで、第一の実施形態Ｄにおける電気培養装置１の他方の容器２６ｂの開放とは、例えば他方の容器２６ｂの上部等を完全に開放した場合は勿論のこと、図５に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、対電極槽８から発生するガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。
【００８０】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００８１】
尚、本実施形態において使用できる容器２６の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００８２】
＜第二の実施形態＞
第二の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と対電極とをイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第一の実施形態における培養方法とは、電解液を用いることなく対電極を直接イオン交換膜に接触させている点のみが異なっている。
【００８３】
しかしながら、第一の実施形態のように電解液４ａを用いずとも、作用電極９と対電極１０との間でイオン交換膜６を介してイオン電流は流れるので、第二の実施形態にかかる培養方法によれば、第一の実施形態と同様に作用電極９の電位を制御して、同様の効果を得ることが可能である。
【００８４】
第二の実施形態にかかる培養方法は、例えば図６に示す電気培養装置により実施される。図６に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器５内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５の外側に対電極１０が配置され、容器５に培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が培養液４に浸され、容器４のイオン交換膜６は容器５に培養液４が収容されたときに少なくともその一部がイオン交換膜６と接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４の接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。図６に示す電気培養装置１では、容器５の培養液４の液面よりも下部に開口部５ａが設けられ、開口部５ａがイオン交換膜６で塞がれ、容器５の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。つまり、図６に示す電気培養装置１では、容器５全体が培養槽７として機能することとなる。
【００８５】
したがって、図６に示す電気培養装置１によれば、容器５からガスが漏洩することがない。また、対電極１０から発生するガスが容器５内に漏れ出すことがないので、容器５から発生したガスに対電極１０から発生したガスが混入してその濃度を低下させたり、対電極１０から発生したガスが培養液４に溶け込んで微生物２の生育に悪影響を及ぼすこともない。さらに、容器５を密閉構造としているので、第一の実施形態と同様、容器５内を嫌気条件に制御し易い利点もある。
【００８６】
尚、図６に示す電気培養装置１では、第一の実施形態と同様に、ガス回収手段１５、培養液採取手段１６を備えるようにしているが、上記の通り、ガス回収方法、培養液採取方法は、これらの手段を利用したものには限定されない。また、第一の実施形態と同様、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【００８７】
以下、図６に示す電気培養装置１の詳細について説明する。但し、以下に説明する以外の構成については、第一の実施形態と実質的に同一であり、説明は省略する。
【００８８】
容器５は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造としている。容器５の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。尚、図６では、密閉構造の容器５の培養液４の液面よりも下部に設けられた開口部５ａをイオン交換膜６により塞ぐようにしているが、容器５の形態や構造は特に限定されない。例えば容器５全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいし、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分はガラス等の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えば培養液４と培養液４中の成分の双方を透過させることがない膜材により構成してもよい。要は、容器５に収容される培養液４が容器５の少なくとも一部を構成するイオン交換膜６と接触しうる構造の容器とすればよい。
【００８９】
対電極１０は、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に接触させるようにしている。本実施形態において、対電極１０は板状の炭素電極としているが、対電極１０の形状と材質はこれに限定されるものではなく、要は、イオン交換膜６との接触が可能な形状であり、且つ作用電極９における酸化反応に対して電子の授受を補完する還元反応を進行させることが可能な材質、つまり、作用電極９において還元反応が生じる際に酸化反応を進行させることが可能な材質の電極とすればよい。また、本実施形態では、対電極１０の面積をイオン交換膜６の面積よりも大きなものとしてイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにし、イオン交換膜６と対電極１０とを接触させるようにしているが、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０を接触させれば、イオン交換膜６を介して培養液４から対電極１０にイオンが伝達するので、必ずしもイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにしてイオン交換膜６と対電極１０とを接触させずともよい。但し、イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うことで、対電極１０をイオン交換膜６の保護材としても機能させることができると共に、培養液４からのイオンの伝達面が増大する結果として、培養液４の電位制御性を高めることができる利点があり、好適である。イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆う方法としては、例えば、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０を接着することにより、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよいし、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０の表面の少なくとも一部に塗布形成されたイオン交換膜６を接着することにより、開口部５ａをイオン交換膜６で塞ぎつつ、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよい。イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤としては、例えばナフィオン分散液が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、対電極１０の表面にナフィオン分散液を塗布し、ナフィオン分散液が乾燥する前にイオン交換膜６を貼り付けるようにしてもよい。この場合には、イオン交換膜６の対電極１０の表面への接着性と接触性とを十分なものとすることができる。
【００９０】
ここで、対電極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対電極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。尚、対電極１０を多孔質体とし、ナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対電極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００９１】
また、培養槽７として機能する容器５は、第一の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器５の外側の対電極１０をガス不透過部材等で覆って密封構造とし、対電極１０から発生するガスを回収するためのガス回収手段を設けて、対電極１０から発生するガスを漏れ出させることなく回収するようにしてもよい。
【００９２】
＜第三の実施形態＞
第三の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と対電極と参照電極とを接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第三の実施形態にかかる培養方法においては、イオン交換膜と電解液を用いることなく、培養液に全ての電極を接触させている点において第一の実施形態及び第二の実施形態と異なる。
【００９３】
第三の実施形態のように、イオン交換膜６を設けない場合には、対電極１０から発生するガスが培養槽７のヘッドスペースに滞留し、また対電極１０から発生するガスが直接培養液４に溶け込んで微生物の生育が若干低下する虞があるものの、通電せずに培養した場合と比較して優れた生育促進効果を奏しうる。
【００９４】
また、本願発明者等の実験によると、イオン交換膜６を設けて且つ培養槽７のヘッドスペースに対電極１０にて発生したガスが移行する形態とした上記第一の実施形態Ａの電気培養装置で培養試験を行った場合よりも、イオン交換膜６を設けずに培養試験を行った場合の方が微生物の生育が促進されることが確認されている。このことから、イオン交換膜６を設けないことによって、作用電極９と対電極１０との間の電流値が増大し、微生物の生育が促進されやすくなるものと考えられる。
【００９５】
さらに、本願発明者等の実験によると、イオン交換膜６を設けて且つ培養槽７のヘッドスペースに対電極１０にて発生したガスが移行する形態とした上記第一の実施形態Ａの電気培養装置で培養試験を行った場合よりも、イオン交換膜６を設けずに培養試験を行った場合の方が対電極１０からの水素発生量が顕著に増加すること、及び微生物の代謝産物の分解が促進されることが確認されている。このことから、イオン交換膜６を設けないことによって、作用電極９と対電極１０との間の電流値が増大し、微生物が利用できる電子・炭素が増加するものと考えられる。
【００９６】
また、イオン交換膜６を設けない場合には、電気培養装置の構成の簡素化を図ることができると共に、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧低下によるエネルギーロスの低減を図ることができる。
【００９７】
さらに、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、微生物２の生育に必要な炭素源（栄養源）の汎用性を向上させることも可能である。したがって、例えば微生物２に資化され得る各種物質は勿論のこと、各種バイオマス、有機性廃棄物、有機性廃水等といったバイオマスや廃棄物系の有機物を微生物２の炭素源として使用し得るものとできる。
【００９８】
このように、イオン交換膜６を設けずに本発明を実施することで、種々の恩恵が得られる。
【００９９】
第三の実施形態にかかる培養方法は、例えば図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａにより実施される。即ち、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａは、培養槽７に硝酸イオンを含む培養液４が収容され、培養液４には作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、定電位設定装置１２により作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【０１００】
ここで、第三の実施形態のように、イオン交換膜６を設けない場合、電気培養中に対電極１０へのプロトンの移行が活発に起こる結果として、対電極１０を腐食させてその機能を失わせる虞がある。したがって、第三の実施形態においては、対電極１０として、作用電極９における酸化反応を補完する還元反応が生じ得る材質で尚かつ耐酸性の電極を用いることが好ましい。例示すると、白金電極等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えばガラス電極やステンレス電極等を用いてもよい。作用電極９については、第一の実施形態及び第二の実施形態と同様、例えばグラッシーカーボン等の炭素電極や白金電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
また、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａでは、培養槽７内の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外（電気培養装置１ａの外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されない。例えば、ガス回収手段１５を備えることなく、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７からガスが漏れ出すことがない。
【０１０２】
また、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａでは、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４を採取するようにしている。但し、培養液４の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段１６を備えることなく、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介して培養液４を採取するようにしてもよい。
【０１０３】
尚、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【０１０４】
以下、図２２に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ａとして説明し、図２３に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｂとして説明し、図２４に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｃとして説明し、図２５に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｄとして説明し、図２６に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｅとして説明する。
【０１０５】
（第三の実施形態Ａ）
図２２に示す電気培養装置１ａは、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、培養槽７に収容された培養液４に作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが定電位設定装置１２に結線されている。つまり、第三の実施形態Ａは、第一の実施形態Ａから小容器２１（イオン交換膜６）及びガス排出管２２を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ａと同様の構成を有している。したがって、図２２に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１０６】
また、ガス回収手段１５等により培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、対電極１０から大量に発生する水素を回収することができる。そして、微生物がガスを産生する場合には、このガスと対電極１０から発生する水素を同時に回収することができる。
【０１０７】
尚、培養槽７として機能する容器２０は、第一の実施形態及び第二の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１０８】
また、培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けて、対電極１０から発生するガスの培養液４への溶け込みを防ぐことで、より優れた生育促進効果が奏され得るものと考えられる。
【０１０９】
（第三の実施形態Ｂ）
図２３に示す電気培養装置１ａは、容器５内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５内に培養液４を収容し、容器５の培養液４の液面よりも下部に穴を設けておき、この穴を対電極１０で塞いで、容器５を密閉構造としている。そして、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが定電位設定装置１２に結線されている。つまり、第三の実施形態Ｂは、第二の実施形態からイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第二の実施形態と同様の構成を有している。したがって、図２３に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１０】
また、第三の実施形態Ａと同様、ガス回収手段１５等により培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、対電極１０から大量に発生する水素を回収することができる。そして、微生物がガスを産生する場合には、このガスと対電極１０から発生する水素を同時に回収することができる。
【０１１１】
尚、培養槽７として機能する容器５は、第三の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１１２】
また、第三の実施形態Ａと同様、培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けて、対電極１０から発生するガスの培養液４への溶け込みを防ぐことで、より優れた生育促進効果が奏され得るものと考えられる。
【０１１３】
（第三の実施形態Ｃ）
図２４に示す電気培養装置１ａは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂが開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、容器２５内に培養液４を収容し、容器２５ａ側を培養槽７とし、容器２５ｂ側を対電極槽としている。そして、作用電極９と参照電極１１を容器２５ａ側の培養液４に浸し、対電極を容器２５ｂ側の培養液４に浸し、容器２５ａ側の培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースは密閉構造とし、容器２５ｂ側の培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースは開放構造としている。つまり、第三の実施形態Ｃは、第一の実施形態Ｃからイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ｃと同様の形態を有している。したがって、図２４に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１４】
ここで、第三の実施形態Ｃにおける電気培養装置１ａの容器２５ｂ側のヘッドスペースの開放とは、例えば容器２５ｂの上部を完全に開口した場合は勿論のこと、図２４に示すように、容器２５ｂの上部を容器２５ａの上部と同様に密閉構造としつつ、容器２５ｂのヘッドスペースから容器２５ｂの外へガスを排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、他端側のヘッドスペースのガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。尚、この場合には、容器２５ｂのヘッドスペースから容器２５ａのヘッドスペースへのガスの移行が起こらないので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果も期待できる。
【０１１５】
尚、容器２５の一端は、第一の実施形態Ｃと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器２５は、容器２５ａと容器２５ｂを連結したものには限定されず、一体成形されたものを用いても構わない。
【０１１６】
（第三の実施形態Ｄ）
図２５に示す電気培養装置１ａは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂが開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂを開放して対電極槽８としている。つまり、第三の実施形態Ｄは、第一の実施形態Ｄからイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ｄと同様の形態を有している。したがって、図２５に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１７】
ここで、第三の実施形態Ｄにおける電気培養装置１ａの容器２６ｂの開放とは、例えば容器２６ｂを完全に開放した場合は勿論のこと、図２５に示すように、容器２６ａと同様に密閉構造としつつ、容器２６ｂのヘッドスペースから容器２６の外へガスを排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、容器２６ｂのヘッドスペースのガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。尚、この場合には、容器２６ｂのヘッドスペースから容器２６ａのヘッドスペースへのガスの移行は起こらないので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果も期待できる。
【０１１８】
尚、容器２６ａは、第一の実施形態Ｄと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また容器２６は、容器２６ａと容器２６ｂを連結したものには限定されず、一体成形されたものを用いても構わない。
【０１１９】
（第三の実施形態Ｅ）
図２６に示す電気培養装置１ａは、容器２３に培養液４を収容し、培養液４に作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを浸し、これらの電極を定電位設定装置１２に結線し、容器２３に収容された培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースを二層に区画し、一方の区画２３ｃに対電極１０から発生するガスを滞留させ、もう一方の区画２３ｄにこのガスが移行するのを抑制するようにしている。したがって、図２６に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１２０】
また、この場合、ヘッドスペース２３ｃからヘッドスペース２３ｄへのガスの移行は起こり難いので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果が期待できる。
【０１２１】
また、第三の実施形態Ｅの構成とした場合には、第三の実施形態Ｃや第三の実施形態Ｄよりも作用電極９と対電極１０を接近させやすいので、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧のさらなる低下や、電流値のさらなる増大が期待できる。
【０１２２】
尚、ヘッドスペース２３ｄは、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１２３】
また、ヘッドスペース２３ｃは、図２６に示すように密閉構造として、滞留するガスを排出するガス排出管２２を備えるようにしてもよいが、開放構造としても構わない。
【０１２４】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図２１に示すように、培養液４と電解質４ａをイオン交換膜６ではなく、イオンや微生物を一切透過させることのない不透過部材４０で隔て、あるいは培養槽７と対電極槽８を別の容器で形成し、塩橋４１（寒天等にＫＣｌ等の飽和電解質溶液を入れたもの）を介して培養液４と電解質４ａを接触（液絡）させるようにしてもよい。この場合にも、塩橋４１によってイオン電流の流れが許容されると共に、硝酸イオンと亜硝酸イオンの対電極槽８への透過を防ぐことができるので、上述の実施形態と同様の効果が得られる。
【０１２５】
また、好気条件下において硝酸呼吸を行う微生物も存在するので、このような微生物を培養する場合には、培養液を好気条件に制御しながら硝酸呼吸を利用して培養を行うようにしてもよい。このような微生物としては、例えば、参考文献１に挙げられているThiosphaera pantotropha LMD 92.63（後に分類変更されてParacoccus pantotropha LMD 92.63に名前が変更）、Pseudomonas denitrificans LMD84.60、Alcaligenes faecalis LMD89.147等が挙げられる（参考文献１：FEMS microbiology ecology 18 (1995) 113-120）。
【０１２６】
さらに、イオン交換膜６に代えて、透析膜を使用してもよい。透析膜を使用することで、透水性が確保されるので、イオン交換膜６を設けない場合と同様、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧の低下効果や、電流値の増大効果が奏される。しかも、透析膜は、対電極１０から発生するガスの障壁となり得るので、例えば第一の実施形態Ａで説明したように小容器２１の上方を開口した構成を採用したり、あるいは第一の実施形態Ｂ〜Ｄのような構成を採用したりすることで、対電極１０から発生するガスを上方に逃がして培養液４に直接溶け込むのを抑制する効果が期待できるので、生育のさらなる促進効果が期待できる。
【実施例】
【０１２７】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【０１２８】
尚、本実施例における電極電位は、全て銀・塩化銀電極電位を基準とするものである。
【０１２９】
（比較例１）
大腸菌を用いて、硝酸呼吸を利用した培養について検討した。
【０１３０】
１００ｍＬ容のガラスバイアル瓶に以下の組成を有する培養液を３０ｍＬ収容し、これに大腸菌（E.coli JM109）を初期菌体密度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加した。
[培養液の組成（Ｌ−１）]
・乳酸ナトリウム： ４．７２ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４： ４．２ｇ
・ＮＨ４Ｃｌ： ０．６ｇ
・ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ： ０．０８ｇ
・カザミノ酸： ５．０ｇ
・微量元素溶液： １ｍＬ
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
・ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ： ０．２ｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ： １．０ｇ
・ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ： ０．０３４ｇ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ： ０．０１５ｇ
・Ｎａ２ＳｅＯ４： ０．５ｇ
【０１３１】
培養液と大腸菌を入れたガラスバイアル瓶は６個用意し、これを同数づつ２グループに分けた。
【０１３２】
一方のグループの培養液には、硝酸塩（NaNO3）を添加して硝酸イオン濃度を１０ｍＭとした。他方のグループの培養液には、硝酸塩（NaNO3）と亜硝酸塩（NaNO2）を添加して硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度を共に１０ｍＭとした。
【０１３３】
ガラスバイアル瓶に窒素ガスを充填して蓋を閉め、培養環境を嫌気条件とした。また、培養液のｐＨは７．０ 、培養液温度は３０℃として菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。
【０１３４】
結果を図７に示す。図７中、◆は培養液の硝酸イオン濃度が１０ｍＭの場合の増殖曲線を示し、■は培養液の硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度が共に１０ｍＭの場合の増殖曲線を示している。図７に示される通り、いずれの条件においても、培養開始から２４時間が経過した後には、菌数の減少が見られた。この結果から、硝酸イオンが硝酸呼吸により還元されて亜硝酸イオンになると、大腸菌の生育が阻害されることが示唆された。また、培養液に亜硝酸イオンが含まれている場合には、亜硝酸イオンが含まれていない場合よりも生育速度が低下することが確認された。また、最終的に得られる菌体量も少なかった。
【０１３５】
以上の結果から、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を実施する場合には、硝酸呼吸によって生じる亜硝酸イオンの存在によって、大腸菌の生育が阻害されることが明らかとなった。
【０１３６】
（実施例１）
培養液に電極を接触させて、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら大腸菌を培養することについて検討した。
【０１３７】
（１）実験装置
図８に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽７としての容器２０は２５０ｍＬ容のガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）とした。培養液４は容器２０の八分目程度まで入れた。容器２０には蓋３０をした。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
【０１３８】
対電極槽８としての小容器２１は、イオン交換膜６を成型して袋状（以下、袋２１と呼ぶ）とした。実験で用いた小容器２１の形態を図９に示す。具体的には、イオン交換膜（ナフィオンＫ、デュポン製）をヒートシーラーで熱圧着により加工して上部が開口した袋状の容器２１とし、袋２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。そして、対電極１０と定電位設定装置１２を結線するための配線３１をガス排出管２２に通した。ガス排出管２２は両端が開口されており、一端を小容器２１の内部に、他端を容器２０の外側に配置するようにして、小容器２１内で発生するガスが容器２０の外側に排出されるようにした。袋状の小容器２１の上部の開口部は、シリコン接着剤３２で塞いだ。
【０１３９】
小容器２１と作用電極９とを培養液４に浸漬し、小容器２１のガス排出管２２と作用電極４の配線は蓋３０に設けたシリコーンゴム栓に通して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（RE-1B, ＢＡＳ株式会社）は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことにより培養液４と接触させた。培養液採取管１６は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことによりその一端を培養液４と接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。培養液採取管１６の他端は注射器と接続して培養液４を採取可能とした。培養中は攪拌子３４により培養液４を攪拌した。
【０１４０】
培養液４の組成は、以下の通りとした。
[培養液の組成（Ｌ−１）]
・乳酸ナトリウム： ４．７２ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４： ４．２ｇ
・ＮＨ４Ｃｌ： ０．６ｇ
・ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ： ０．０８ｇ
・カザミノ酸： ５．０ｇ
・微量元素溶液： １ｍＬ
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
・ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ： ０．２ｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ： １．０ｇ
・ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ： ０．０３４ｇ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ： ０．０１５ｇ
・Ｎａ２ＳｅＯ４： ０．５ｇ
【０１４１】
電解液４ａは、ＮａＣｌ溶液（０．５８ｇ／Ｌ）とした。
【０１４２】
（２）亜硝酸イオンの酸化還元特性
培養液４に亜硝酸イオンとしてNaNO2を０．８５ｇ／Ｌ添加し、作用電極９を炭素電極（BAS社製）とし、対電極１０を白金棒電極（自作）として上記電気培養装置を用いてサイクリックボルタンメトリーにより酸化還元特性を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示される結果から、亜硝酸イオンは、電気化学的に酸化されるが、還元されない性質を有することが明らかとなった。
【０１４３】
この結果について、作用電極９を白金電極（BAS株式会社製）に替えて再現性を確認した。結果を図１１に示す。炭素電極を用いた図１０の場合と同様、亜硝酸イオンは電気化学的に酸化されるが、還元されなかった。
【０１４４】
次に、培養液４に亜硝酸イオンとしてNaNO2を０．８５ｇ／Ｌ添加し、作用電極９と対電極１０を炭素電極とした場合の作用電極９の電極電位に対する亜硝酸イオン濃度の経時変化と硝酸イオン濃度の経時変化について検討した。亜硝酸イオン濃度の経時変化を図１２に示し、硝酸イオン濃度の経時変化を図１３に示す。尚、亜硝酸イオン濃度と硝酸イオン濃度の測定はイオンクロマトグラフィー（ICS-1500、DIONEX製）により行った。この実験結果から、作用電極９の電極電位を＋０．９Ｖ以上とすると、亜硝酸イオンが酸化され、これに伴い硝酸イオンが生成されることが明らかとなった。そして、電極電位を大きくするに伴い、亜硝酸イオン濃度をより速く低減でき、硝酸イオン濃度をより速く増加できることが明らかとなった。
【０１４５】
次に、作用電極９の電極電位に対する硝酸イオン濃度の経時変化について、作用電極９と対電極１０を白金電極に替えて同様の実験を行った。結果を図１４に示す。電極電位を＋０．８Ｖとすることで亜硝酸イオンの酸化に伴う硝酸イオンの生成が見られた以外は、炭素電極を用いた場合と同様の結果が得られた。
【０１４６】
（３）培養試験方法
培養液４には、硝酸イオン源として、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）を０．８５ｇ／Ｌ添加した。また、大腸菌（E.coli JM109）を初期菌体密度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加した。
【０１４７】
培養槽７には窒素を充填して嫌気条件とし、温度（培養液温度）３０℃、培養液のｐＨを７．０とした。そして、培養開始から１７．５時間後、作用電極９（炭素電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８Ｖ、＋０．９Ｖ、＋１．０Ｖ、＋１．２Ｖに制御して培養試験を行った。また、比較試験として通電無し（作用電極への電位の印加を行わない）の場合の培養試験も実施した。培養期間中の菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。
【０１４８】
（４）培養試験結果
各種電極電位における菌数の経時変化を図１５に示す。＋０．８Ｖでは通電無しの場合との差が見られなかったが、＋０．９Ｖとすることで通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られ、＋１．０Ｖとすることでこの効果がより顕著に見られることが確認された。また、＋１．２Ｖとした場合にも、通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られたが、その効果は＋１．０Ｖの場合ほどではなかった。
【０１４９】
次に、最終菌体密度が最も向上した＋１．０Ｖの場合について、硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度の経時変化を測定した。結果を図１６に示す。また、比較のために、通電無しの場合について、硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度の経時変化を測定した結果を図１７に示す。図１７に示されるように、通電無しの場合には、硝酸イオンが大腸菌の硝酸呼吸により消費されるのに伴い、亜硝酸イオンが徐々に蓄積していることが確認された。一方、電極電位を＋１．０Ｖとした場合には、亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに再生されていることが確認された。尚、培養開始から３６時間目あたりで見られた亜硝酸イオンの蓄積は、大腸菌の菌数の増加に伴って硝酸呼吸による硝酸イオン消費速度が作用電極９による亜硝酸イオン酸化速度を超えたために生じたものと考えられる。
【０１５０】
以上の結果から、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うためには、電極電位を＋０．９Ｖ〜１．２Ｖに制御することが好ましいことが明らかとなった。また、上記（２）の実験結果から、炭素電極を用いた場合に亜硝酸イオンの酸化が生じる最小電位が＋０．９Ｖであったことから、電極の電位を亜硝酸イオンの酸化が生じる電位以上に制御すれば、本発明の効果が得られることが明らかとなった。このことから、白金電極を用いた場合には、電極の電位を＋０．８Ｖ以上に制御すれば、本発明の効果を得られるものと考えられた。
【０１５１】
また、上記（２）の実験結果から、電極電位を高めた方が亜硝酸イオンの酸化速度を高めることができることが確認されたが、培養試験においては、＋１．０Ｖで最も優れた効果が得られた。このことから、＋１．２Ｖでは、本発明の効果を得られる反面、電極電位自体によって微生物の生育が阻害されていることが示唆された。
【０１５２】
以上より、炭素電極を用いた場合、電極電位は＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとすればよいが、＋０．９Ｖ超〜＋１．２Ｖ未満とすることが好ましく、＋１．０Ｖ程度とすることがさらに好ましい。
【０１５３】
また、白金電極を用いた場合、電極電位は＋０．８Ｖ〜＋１．２Ｖとすればよいが、＋０．８Ｖ超〜＋１．２Ｖ未満とすることが好ましく、＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖ未満とすることがより好ましく、＋１．０Ｖ程度とすることがさらに好ましい。
【０１５４】
つまり、大腸菌を培養対象微生物とした場合には、電極電位が＋１．２Ｖを超えると限界電位（対数増殖期が電位を印加していない場合と同程度となる電位）を超える可能性があり、＋１．０Ｖ付近に適正電位（対数増殖期の長さが最大となる電位）があるものと考えられる。
【０１５５】
尚、電位制御開始タイミングを変更して上記培養試験を実施した。具体的には、培養開始から３時間経過後、６時間経過後、１０．５時間経過後に電位制御を開始して、上記培養試験と同様の試験を実施した結果、上記培養試験で得られた結果とほぼ同様の生育促進効果が得られることが確認された。したがって、培養開始から３時間経過後〜１７．５時間経過後に電位制御を開始すれば、本発明の効果が確実に奏されることが明らかとなった。
【０１５６】
（５）培養期間中に発生したガスの組成分析
作用電極９と炭素電極とし、イオン交換膜６（ナフィオンＮ１１７、デュポン製）により作製した袋状の小容器２１の上部の開口部をシリコン接着剤３２で塞ぐことなく開放しておき、また、ガス排出管２２を備えずに対電極１０から発生したガスが培養槽７のヘッドスペースに移行するようにして、上記と同様の培養試験を実施し、培養期間中に培養槽７から発生したガスと対電極槽８から発生したガスを容器２０の上部に設置したフッ化ビニル樹脂製サンプリングバッグ（アズワン製、商品名：テドラーバッグ、１Ｌ）に回収し、回収したガスの量と組成を分析した。作用電極９の電極電位は＋１．０Ｖとした。ガスの量は水上置換法により分析し、ガスの組成はガスクロマトグラフィー（ＶＡＲＩＡＮ、ＣＲ４９００）で分析した。また、比較試験として、通電を行わなかった場合と、大腸菌を入れずに通電を行った場合について、ガスの発生量と組成を分析した。
【０１５７】
結果を図３２に示す。通電の有無で比較したところ、二酸化炭素の発生量は乳酸代謝の差に相応した差に留まっていた。尚、二酸化炭素は、大腸菌の乳酸代謝によって生じる副産物であることから、大腸菌が存在している培養液４から発生して培養槽７のヘッドスペースを経て回収されたものである。一方で、水素の発生量は＋１．０Ｖの電位を印加しながら電気培養を行った場合では非通電時と比べ顕著な違いが見られ、非通電時の０．０２４ｍＬに対して約６８００倍の１６３．４ｍＬ±１．７ｍＬに達していた。通電の有無による大腸菌の生育促進効果に対して水素発生量が顕著に多いこと、培養期間中に対電極からの活発なガス発生が目視にて確認されたことから、この水素発生は対電極における電極反応に依存しているものと考えられた。次に、実験的に水の電気分解の寄与を評価するために、大腸菌非存在下、同一条件で通電試験を行ったところ、水素発生量は２．３ｍＬ±０．９５ｍＬと電気培養の場合と比べて顕著に低いものであり、流れた電流値も小さかった（図３４）。これに対し、大腸菌存在下で通電試験を行った場合には、流れた電流値が顕著に増加していた（図３４）。よって培養過程における対電極１０からの大量の水素発生には大腸菌が寄与しているものと考えられた。
【０１５８】
ここで、図３３に本発明における水素生成機構の概念図を示す。
【０１５９】
大腸菌非存在下、両電極で起こりうる反応と標準電極電位（Ｅ０ ｖｓ ＳＨＥ）は以下の通りである。
作用電極：O2 + 4H+ + 4e- = 2H2O、 E0= 1.229V ・・・・（ａ）
対電極 ：2H+ + 2e- = H2、E0= 0.000V ・・・・（ｂ）
【０１６０】
これに対し、大腸菌が存在する場合、培養槽にて乳酸分解と硝酸呼吸とが起こると共に、作用電極上での亜硝酸酸化反応が起こる。つまり、作用電極での反応が上記(ａ)から以下の（ｄ）に変化する。
硝酸呼吸：C3H6O3 + 2NO3- → C2H4O2 + CO2 + 2NO2- + 2H2O ・・・・（ｃ）
亜硝酸酸化反応：NO3- + 2H+ + 2e- = NO2- + H2O、E0= 0.835V ・・・・（ｄ）
【０１６１】
亜硝酸の酸化にて得られた２Ｈ＋は、陽イオン交換膜Ｎ１１７を透過して対極槽８に移行し、同じく亜硝酸の酸化により作用電極から対電極に流れ込んだ電子と対電極上で反応することにより、水素発生反応が起こる。
【０１６２】
ここで、対電極で起こる反応のE0は、大腸菌の有無によらず同一であるが、作用電極で起こる反応が大腸菌の硝酸呼吸によって変化するため、大腸菌存在下では非存在下と比べて水素発生に必要なΔＥが小さくなる。さらに反応（ｄ）に必要な亜硝酸は大腸菌の硝酸呼吸（ｃ）により、常に供給されるため、水素生産に必要な電子を安定して対電極に送ることが可能である。また、本実施例で使用した対電極を陽イオン交換膜が取り囲んだ形状の装置を用いたことも、効率的なプロトン移動を促して、活発な水素生産に寄与したものと考えられる。以上の条件が組み合わさった結果、水の電気分解より少ないエネルギー（理論上７６ｋＪ少ない）を投入し、大腸菌の生育促進のために電気培養をおこなうことにより、乳酸から大腸菌が引き抜いた電子を水素として回収可能となったと言える。
【０１６３】
ここで、亜硝酸の酸化により得られた電気量は、培養期間中に流れた電流値（図３４）から、２１４２Ｃと算出された。本実施例において乳酸の主要な代謝産物は酢酸であることから乳酸分解は４電子反応であり、電気培養（＋１．０Ｖ）を行った場合の乳酸分解量は約３０ｍＭであったことから、大腸菌の乳酸代謝から得られる電気量は２３１６Ｃと算出された。よって、大腸菌が乳酸から引き抜いた電子のうち、硝酸還元及び亜硝酸酸化反応を経由し、作用電極から対電極に送られた電子の割合(Coulombic efficiency)は９２．５％であると見積もられた。
【０１６４】
そして、作用電極にて回収された全ての電子が、回路内の抵抗による消費を無視し、仮に水素生成反応に用いられたとすると、上記（ｄ）の反応は、２電子反応であることから、理論上は１１．１ｍｍｏｌ（２４８．６ｍＬ）の水素が生産される計算になる。これに対し、実際の水素生産量は１６３．４ｍＬであったことから、流れた電流の６５．７％、即ち、大腸菌が乳酸から引き抜いた電子の６０．９％を水素として回収できることが明らかとなった。
【０１６５】
ここで、水素生産の側面から本実施例のエネルギー効率を計算したところ、投入電気エネルギーに対して得られた水素（燃焼熱量）としてのエネルギー回収効率は、（ＷＨ２／Ｗｉｎ）＝２０８４．９／５８９１．１８×１００＝３５．４％であった。
【０１６６】
尚、ＷＨ２は、水素の燃焼エネルギー（２８５．８３ｋＪ／ｍｏｌ）に実際の水素生産量１６３．４ｍＬのモル数（７．２９ｍｍｏｌ）を掛けて算出した。また、Ｗｉｎは、図３４に示す電流のグラフの積分値（２１４２Ａ・ｓｅｃ）に図３５に示す電圧（極間電位）のグラフの積分値（４１５８４８Ｖ・ｓｅｃ）を掛け、この値を培養期間（４２×６０×６０ｓｅｃ）で割って、算出した。
【０１６７】
以上の結果から、大腸菌が硝酸呼吸において硝酸に捨てた電子（乳酸から回収した電子）と生育促進のための電気エネルギーの一部を対電極において水素（化学エネルギー）として回収することが可能であることが明らかとなった。
【０１６８】
（実施例２）
遺伝子組換え大腸菌を用いて、通電無しの場合と電極電位を＋１．０Ｖとした場合について、実施例１の（１）の電気培養装置を用いて、実施例１と同様の方法で培養試験を実施した。
【０１６９】
遺伝子組換え大腸菌には、図２０に示すｐＵＣ１８プラスミドを大腸菌（E.coli JM109）に導入してβ−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた大腸菌であるE.coli JM109-pUC18を用いた。
【０１７０】
通電無しの場合と電極電位を＋１．０Ｖとした場合について、培養液４に乳酸を添加して培養試験を実施し、培養期間中の菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。培養液より一部試料をサンプリングし、細胞を溶解した試料を粗酵素溶液としてo-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG) の分解に伴う吸光度変化および菌体濁度の測定値から菌体あたりの活性を算出し、β−ガラクトシダーゼ活性とした。尚、この実験では、ｐＵＣ１８にコードされているβ−ガラクトシダーゼ生産能の発現誘導剤として、通電開始と同時にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、β−ガラクトシダーゼの大腸菌内での生産を始めさせた。
【０１７１】
菌数の経時変化を図１８に示し、β−ガラクトシダーゼ活性を図１９に示す。電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりも菌密度が約２．５倍に増加した。また、電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりもβ−ガラクトシダーゼ活性が４．５倍に増加した。このことから、電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりも培養槽全体におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を１１．５倍に向上できることが明らかとなった。
【０１７２】
この結果から、物質生産能を持たせた遺伝子組換え大腸菌全般、さらには物質生産能を有する微生物全般について、本発明の培養方法により硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことで、物質生産能を向上できることが明らかとなった。
【０１７３】
（実施例３）
袋状の小容器２１の密閉性と大腸菌の生育の関係について検討した。
【０１７４】
＜条件１＞
実施例１の（１）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極として、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７５】
＜条件２＞
実施例１の（５）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極として、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７６】
＜条件３＞
実施例１の（５）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極とし、サンプリングバッグをフッ化ビニル樹脂製からアルミニウム製（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に変更して、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７７】
培養試験期間中の培養液４のＯＤ６６０を測定し、菌体密度の経時変化を調査した結果を図３６と図３７に示す。図３６が通電無しの結果であり、図３７が通電有りの結果である。
【０１７８】
図３６に示される通り、通電無しの場合には条件１〜３での生育の違いは見られなかったが、図３７に示される通り、通電有りの場合には、条件１から３に向かうに従い、生育が低下する傾向が見られた。但し、図３６と図３７を比較すると、いずれの条件においても通電有りの方が最終菌体密度が高められており、いずれの条件においても通電による生育促進効果は確実に得られることが明らかとなった。つまり、袋上の小容器２１を密閉構造とすることなく、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させたとしても、本発明の効果は十分に奏されることが明らかとなった。
【０１７９】
但し、本発明の効果をより顕著なものとする上では、袋状の小容器２１を密閉構造として、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させないようにすることが好ましいことが明らかとなった。
【０１８０】
また、図３７に示されるように、条件２よりも条件３の方が生育が低下する傾向が見られたが、この現象は以下のように考察することができる。即ち、ガス回収に用いたサンプリングバッグが、条件２と条件３では異なり、条件３で使用したアルミニウム製サンプリングバッグの方が、条件２で使用したフッ化ビニル樹脂製サンプリングバッグよりも固く、膨らむためにより高い圧力を必要とすることであった。したがって、条件２よりも条件３の方が培養槽７のヘッドスペースに対電極１０から発生したガスが滞留し易くなる状況にあり、例えば培養槽４にガスが溶け込む等の影響によって、大腸菌の生育を低下させたものと考えられた。このことから、対電極１０にて発生するガスが培養槽７のヘッドスペースに移行するような形態とする場合には、培養槽７のヘッドスペースから速やかにガスを除くことが望ましいと考えられた。
【０１８１】
（実施例４）
１．実験条件
以下の４条件（Ａ）〜（Ｄ）により培養試験を実施した。
【０１８２】
＜条件（Ａ）：イオン交換膜有り、通電無し＞
実施例３の条件３にて使用した電気培養装置と同様の装置を用い、通電を行うことなく培養試験を実施した。
【０１８３】
＜条件（Ｂ）：イオン交換膜有り、通電有り＞
条件（Ａ）について、作用電極９の電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を実施した。作用電極９と対電極１０は共に炭素電極（ＢＡＳ社製）とした。
【０１８４】
＜条件（Ｃ）：イオン交換膜無し、通電有り、電極Ｃ／Ｃ＞
袋状の小容器２１とガス排出管２２を備えずに、対電極１０を直接培養液４に浸した以外は、条件（Ａ）と同様の電気培養装置を用い、作用電極９の電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を実施した。作用電極９と対電極１０は共に炭素電極（ＢＡＳ社製）とした。
【０１８５】
＜条件（Ｄ）：イオン交換膜無し、通電有り、電極Ｃ／Ｐｔ＞
条件（Ｃ）について、対電極１０を炭素電極から白金電極（ＢＡＳ社製）に代えて培養試験を実施した。
【０１８６】
また、サンプリングバッグに回収されたガスは、ガスの量を水上置換法を用いて分析し、ガスの組成をガスクロマトグラフィー（ＶＡＲＩＡＮ、ＣＲ４９００）で分析して、これらの分析結果を基に、水素ガス量を計算した。
【０１８７】
さらに、条件（Ａ）〜（Ｄ）において、大腸菌の代謝状況を確認するため、培養試験終了後の培養液４の乳酸濃度、酢酸濃度、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸濃度をイオンクロマトグラフィー（ICS-2000、DIONEX製）にて測定した。
【０１８８】
上記以外の培養条件は、実施例１と同様とした。
【０１８９】
２．実験結果
＜菌体密度＞
条件（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）について、菌体密度（ＯＤ６６０）の経時変化を図２７に示す。図２７に示される結果から、条件（Ａ）と比較して、条件（Ｂ）及び（Ｄ）の方が対数増殖期が長期化して定常期の菌数が増加しその傾向は、条件（Ｂ）よりも条件（Ｄ）の方が顕著であった。
【０１９０】
ここで、条件（Ｃ）については、対電極１０に用いた炭素電極が培養試験中に腐食して培養液４の色が黒色となり、菌数測定ができなかった。このことから、条件（Ｃ）においては、対電極１０が電極として十分に機能しなくなっているものと考えられた。
【０１９１】
＜極間電圧＞
条件（Ｂ）〜（Ｄ）について、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧の経時変化を図２８に示す。イオン交換膜６を設けていない条件（Ｃ）及び（Ｄ）において、イオン交換膜６を設けた条件（Ｂ）よりも、極間電圧が低下する傾向が見られた。このことから、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、極間電圧を低下させてエネルギーロスを低減する効果が奏されることが確認できた。
【０１９２】
＜電流値＞
条件（Ｂ）〜（Ｄ）について、作用電極９と対電極１０との間の電流値の経時変化を図２９に示す。条件（Ｂ）及び条件（Ｄ）において、培養対象微生物とした大腸菌の対数増殖期に対応する時期に電流値の大幅な増大が見られ、増殖の定常期に向かうにしたがって電流値が低下し、その後一定になる傾向が見られた。電流値の大きさは、イオン交換膜を設けていない条件（Ｄ）の方が大きかった。このことから、条件（Ｂ）及び（Ｄ）のいずれにおいても、微生物の増殖の過程で電子の授受が生じており、特にイオン交換膜を設けない場合において、電子の授受が活発に起こっていることが示唆された。尚、条件（Ｃ）においては、条件（Ｂ）及び（Ｄ）で見られた対数増殖期における電流値の増大が見られなかったことから、対電極１０として使用した炭素電極が電極として十分に機能しなくなっていたものと考えられた。
【０１９３】
＜水素量＞
条件（Ａ）〜（Ｄ）について、水素発生量を図３０に示す。尚、条件（Ｃ）については、上記の通り、対電極１０の炭素電極が腐食して電極として機能していなかったものと考えられることから、条件（Ｃ）の実験結果は除外して検討を行った。図３０に示される結果から、通電を行うことで、水素が大量に発生し、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことで、水素発生量が顕著に増加することが明らかとなった。
【０１９４】
＜乳酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸＞
条件（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）について、培養試験終了後の培養液４の乳酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸濃度を図３１に示す。図３１では、各有機酸毎に左から条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）の順でグラフを並べている。尚、炭素源として初期投入した培養液４の乳酸濃度は２０ｍＭである。図３１に示される結果から、イオン交換膜６を設けた場合には、プロピオン酸とギ酸を蓄積させずに培養できることが確認され、イオン交換膜６を設けずに培養を行った場合には、プロピオン酸とギ酸に加えて、酢酸とピルビン酸についても蓄積させずに培養できることが確認された。
【０１９５】
このことから、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことによって、有機酸を蓄積させることなく、有機物を最終生成物（ＣＯ２等）に分解させることができ、微生物に炭素源としての有機物を極めて効率よく利用させて培養を行うことができることが明らかとなった。つまり、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことで、微生物の代謝産物の分解が促進され、微生物が利用できる炭素や電子が増加し、その結果として微生物の生育促進効果、対電極１０における水素発生量の増加効果が奏されているものと考えられた。
【０１９６】
尚、イオン交換膜６を設けずに培養を行う場合、培養槽７のヘッドスペースに対電極１０において発生するガスが必ず移行することになり、また対電極１０において発生するガスが培養系４に直接溶け込むことから、これらの影響による生育低下が懸念されたが、本実験結果によれば、実施例３の条件１（袋状の小容器２１を密閉構造として、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させないようにした形態）とほぼ同等の生育促進効果が得られることが確認できた。しかも、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施する場合には、装置構成の簡素化を図ることができ、極間電圧の低下によるエネルギーロスの低減を図ることができ、対電極からの水素発生量も顕著に増加させることができ、しかも代謝産物の分解を促進して炭素（栄養）源としての有機物を極めて効率よく利用できることから、本発明の培養方法を実施する上で極めて有利な形態であることが明らかとなった。
【０１９７】
（実施例５）
実施例４の条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）について、大腸菌の炭素源（栄養源）を乳酸からグルコースに代えて、同様の培養試験を実施した。
【０１９８】
結果を図３８に示す。条件（Ｄ）について、条件（Ａ）及び（Ｂ）よりも優れた生育促進効果が奏されることが確認された。
【０１９９】
また、図３９に示されるように、条件（Ｄ）について、条件（Ａ）及び（Ｂ）よりも大腸菌によるグルコース消費が促進されていることが確認できた。
【０２００】
以上の結果から、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、炭素源を乳酸とした場合のみならず、グルコースとした場合についても、生育促進効果が奏されることが明らかとなった。
【０２０１】
尚、この結果は、例えばグルコースの代謝産物である酢酸の分解が、乳酸を炭素源とした実施例４の場合と同様に、イオン交換膜６を設けない場合に促進されることや、乳酸を炭素源とするよりもグルコースを炭素源とした方が分解に伴ってｐＨが低下し易くなるが、イオン交換膜６を設けないことで、対電極１０でのプロトンの還元反応が速やかに起こり、培養環境のｐＨの低下が抑制された状況になることによるものと推定される。
【符号の説明】
【０２０２】
２ 微生物
４ 培養液
９ 電極（作用電極）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝酸呼吸能を有する微生物の培養方法に関する。さらに詳述すると、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物、例えば大腸菌等を培養するのに好適な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Escherichia coli）は、遺伝子組換え操作を行う際の宿主として利用される代表的な微生物であり、分子生物学の分野における最も基本的で且つ極めて重要なツールである。また、大腸菌は、遺伝子組換えにより所望の機能を容易に発現させることができる利便性も有しており、実際に有用な機能を発現させた大腸菌が種々作出されている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、ファルネシル二リン酸からイソプレノイドを合成する酵素の遺伝子又は遺伝子群と、２型のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子と、アセトアセチル−コエンザイムＡからイソペンテニル二リン酸までの合成を行うメバロン酸経路遺伝子群の３つの遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌が開示されており、さらに、この遺伝子組換え大腸菌をアセト酢酸塩を含む培地にて培養することにより、イソプレノイドを生産できることが開示されている。また、特許文献２では、セグロイソメ由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を加工し、タウロピンデヒドロゲナーゼ生成能を阻害することなくプラスミドに挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子を有する遺伝子組換え大腸菌が開示されており、さらに、この遺伝子組換え大腸菌を培養することで、タウリンとピルビン酸からタウロピンを合成する酵素であるタウロピンデヒドロゲナーゼを生産できることが開示されている。
【０００４】
ところで、大腸菌を培養する場合、例えば、遺伝子組換え大腸菌を培養してその過程でタンパク質等の物質を大量生産させてこれを回収する場合には、大腸菌を培養液に入れて好気条件下で培養を行うのが一般的である。つまり、大腸菌に最終電子受容体として遊離酸素（Ｏ２）を供給しながら培養を行うのが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０７３７６号
【特許文献２】特開２００７−８９５３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、大腸菌に遊離酸素を供給する場合には、培養液に空気を常時供給して培養液の遊離酸素濃度を常時一定レベル以上に維持するための空気供給装置（例えばポンプ等）等が必要となる。また、清浄度の高い空気を供給して培養液への雑菌の混入を防ぐための殺菌装置（例えば紫外線照射装置）等が必要となる場合もある。したがって、培養に必要となる装置が高価となったり、装置の運転コストや維持・管理コストが多大なものとなって、培養にかかる総コストが上昇してしまう問題があった。
【０００７】
そこで、本願発明者は、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、上記問題点を解決し得ると考えた。即ち、大腸菌は、遊離酸素だけでなく硝酸イオンも最終電子受容体として使用することができる。硝酸イオンは遊離酸素と比較して圧倒的に水に溶けやすく、しかも、ポンプ等を使用することなく、硝酸塩等を直接培養液に添加すれば供給が可能である。したがって、硝酸イオンを最終電子受容体として使用すれば、従来のように培養液に空気を常時供給するための空気供給装置等や清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要とすることなく、大腸菌を培養することができるものと考えられた。
【０００８】
ところが、このような利点があるにも関わらず、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことは全く行われていなかった。そこで、本願発明者等は、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用した培養について検討すべく、培養液に硝酸イオンを溶解させ、大腸菌に硝酸呼吸を行わせながら培養試験を実施した。その結果、ある一定の培養期間を経過すると大腸菌の生育が阻害されることがわかった。
【０００９】
この試験結果について本願発明者等が詳細に検討した結果、大腸菌の硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが大腸菌の生育に悪影響を及ぼしていることがわかった。即ち、亜硝酸イオンは、微生物全般に対して毒性を呈する物質として知られており、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが大腸菌に対して毒性を呈した結果として、大腸菌の生育に悪影響が及ぼされたものと考えられた。このことから、大腸菌に限らず、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物全般について、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行おうとすると、同様の問題が生じ得ることが考えられた。
【００１０】
しかしながら、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができれば、上記の通り、従来のように培養液に空気を常時供給して培養液の遊離酸素濃度を常時一定レベル以上に維持する制御を行うことなく、また、清浄度の高い空気を供給することなく、培養を行うことができ、培養にかかるコストを大幅に低減することができる。また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も多数存在している。したがって、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができれば、従来培養ができなかった微生物を培養することも可能となる。以上のことから、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことには種々の利点があり、産業上極めて有用である。
【００１１】
そこで、本発明は、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことのできる方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、物質生産能を有する微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、微生物による物質生産を効率よく行うことのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は鋭意研究を行った結果、培養液に電極を接触させて電位を与え、大腸菌の硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことで、大腸菌の生育を阻害することなく、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養できることを知見するに至った。そして、この知見から、大腸菌に限らず、硝酸呼吸能を有する微生物全般について、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことで、生育を阻害することなく培養を促進することができる可能性が導かれることを知見し、本願発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明の培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に電極を接触させ、電極に電位を与えて、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００１５】
電極に電位を与えることによって、微生物の硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンを酸化させると、硝酸呼吸による培養液中の亜硝酸イオンの蓄積が抑えられる。したがって、亜硝酸イオンの毒性による微生物の生育の阻害の影響を大幅に低減でき、対数増殖期を大幅に延長させて、最終菌体密度を大幅に向上させることができる。しかも、亜硝酸イオンの酸化により硝酸イオンが生成されることから、微生物の硝酸呼吸により消費された硝酸イオンを再生して再度微生物に供給することができる。したがって、培養液中に最終電子受容体として含有させた硝酸イオンを繰り返し使用することができる。
【００１６】
ここで、本発明の培養方法において、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）であることが好ましい。また、大腸菌は、遺伝子組換え大腸菌であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の培養方法において、培養対象微生物を大腸菌または遺伝子組換え大腸菌とした場合には、電極を炭素電極とし、電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行うことが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明の培養方法において、培養対象微生物を大腸菌または遺伝子組換え大腸菌とした場合には、電極を白金電極とし、電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行うことが好ましい。
【００１９】
また、上記課題を解決するため、本願発明者等が鋭意検討を行った結果、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌を本発明の培養方法により培養することで、その培養過程での１菌密度当たりのβ−ガラクトシダーゼ生産量（１菌密度当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性）が大幅に向上することを知見した。この結果から、物質生産能と硝酸呼吸能とを有する微生物全般について、本発明の培養方法により培養を行うことで、物質の生産効率を大幅に向上できる可能性が導かれることを知見し、本願発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明の物質生産方法は、物質生産能と硝酸呼吸能とを有する微生物を培養対象微生物とし、微生物により物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して本発明の培養方法を実施し、培養過程において微生物により生産される物質を回収するようにしている。
【００２１】
ここで、本発明の物質生産方法において、微生物は、物質生産能を有する遺伝子組換え大腸菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の培養方法によれば、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことが可能となる。したがって、培養液に空気を常時供給して遊離酸素濃度を一定レベル以上に維持するための空気供給装置等や、清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要としないので、培養にかかるコストを大幅に低減することができる。
【００２３】
また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も多数存在しているが、本発明の培養方法によれば、このような微生物についても、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことができるので、従来培養ができなかった微生物の培養が可能となる。
【００２４】
しかも、本発明の培養方法によれば、硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに戻ることから、培養期間中に硝酸イオンを補充しなくてもその濃度を維持することができる。したがって、最終電子受容体である硝酸イオンを補充する手間を省くことができ、培養にかかる手間を大幅に削減することができる。
【００２５】
本発明の物質生産方法によれば、物質生産能を有する微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用することで、微生物による物質生産を効率よく行うことが可能となる。したがって、培養液に空気を常時供給して遊離酸素濃度を一定レベル以上に維持するための空気供給装置等や、清浄度の高い空気を供給するための殺菌装置等を必要としないので、微生物からの物質生産にかかるコストを大幅に低減することができる。
【００２６】
また、硝酸呼吸能を有する微生物の中には、遊離酸素を最終電子受容体として使用することができない微生物も存在しているが、本発明の物質生産方法によれば、このような微生物についても、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行い、物質生産の対象微生物とすることができるので、従来生産できなかった物質の生産が可能となる。
【００２７】
さらには、本発明の物質生産方法によれば、微生物の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことで、培養液に空気を供給せずに物質生産を行うことができるので、遊離酸素により分解・劣化が生じ得る物質を分解・劣化させずに生産することも可能になる。
【００２８】
しかも、本発明の物質生産方法によれば、硝酸呼吸により生成された亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに戻ることから、培養期間中に硝酸イオンを補充しなくてもその濃度を維持することができる。したがって、電子受容体である硝酸イオンを補充する手間を省くことができ、物質生産にかかる手間を大幅に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の培養方法の概念を示す図である。
【図２】第一の実施形態Ａにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図３】第一の実施形態Ｂにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図４】第一の実施形態Ｃにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図５】第一の実施形態Ｄにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図６】第二の実施形態にかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図７】硝酸イオンの存在下または硝酸イオンと亜硝酸イオンの存在下で大腸菌に硝酸呼吸をさせながら培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（比較例１）。
【図８】実験に使用した電気培養装置の構成を示す断面図である。
【図９】実験に使用した電気培養装置の小容器の構成を示す図である。
【図１０】炭素電極を用いた場合の亜硝酸イオンの酸化還元特性を示す図である。
【図１１】白金電極を用いた場合の亜硝酸イオンの酸化還元特性を示す図である。
【図１２】炭素電極を用いた場合の各種電位における亜硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１３】炭素電極を用いた場合の各種電極電位における硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１４】白金電極を用いた場合の各種電極電位における硝酸イオン濃度の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１５】各種電極電位で大腸菌の培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例１）。
【図１６】電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を行ったときの硝酸イオンと亜硝酸イオンの経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１７】通電無しで培養試験を行ったときの硝酸イオンと亜硝酸イオンの経時変化を示す図である（実施例１）。
【図１８】遺伝子組換え大腸菌の培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例２）。
【図１９】遺伝子組換え大腸菌の培養試験を行った際のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す図である（実施例２）。
【図２０】培養試験に用いられた遺伝子組換え大腸菌に導入されたｐＵＣ１８プラスミドの構成を示す図である（実施例２）。
【図２１】本発明の培養方法を実施するための電気培養装置の他の構成の一例を示す断面図である。
【図２２】第三の実施形態Ａにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２３】第三の実施形態Ｂにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２４】第三の実施形態Ｃにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２５】第三の実施形態Ｄにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２６】第三の実施形態Ｅにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図２７】培養試験を行った際の増殖曲線を示す図である（実施例４）。
【図２８】培養試験期間中における極間電圧の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図２９】培養試験期間中における電流値の経時変化を示す図である（実施例４）。
【図３０】培養試験期間中における水素発生量の比較図である（実施例４）。
【図３１】培養試験期間中における各種有機酸の蓄積量の比較図である（実施例４）。
【図３２】通電の有無及び大腸菌の有無による二酸化炭素及び水素の発生量を示す図である（実施例１）。
【図３３】大腸菌を利用した場合の水素製造機構の概念図である。
【図３４】培養試験を行った際の電流値の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図３５】培養試験を行った際の電圧値の経時変化を示す図である（実施例１）。
【図３６】実施例３における培養試験結果（通電無し）を示す図である。
【図３７】実施例３における培養試験結果（通電有り）を示す図である。
【図３８】炭素源（栄養源）をグルコースとして培養試験を行った結果を示す図である（実施例５）。
【図３９】炭素源（栄養源）をグルコースとして培養試験を行った際のグルコールの経時変化を示す図である（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００３１】
図１に、本発明の培養方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物２を培養するに際し、培養液４に硝酸イオンを含有させて微生物２に硝酸呼吸をさせ、培養液４に電極９を接触させ、電極９に電位を与えて、微生物２の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００３２】
図１において、容器５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８に仕切られており、培養槽７には硝酸イオンを含む培養液４と微生物２が収容され、対極槽８には電解液４ａが収容されている。また、培養液４には電極（作用電極）９が浸され、電解液４ａには対電極１０が浸されている。
【００３３】
本発明の培養方法を適用しうる対象となる微生物は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物であれば特に限定されない。具体例を挙げると、例えばアルカリゲネス（Alcaligenes）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アクアスピリラム（Aquaspirillum）属、アゾスピリラム（Azospirillum）属、バチルス（Bacillus）属、ブラストバクター（Blastobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、ブランハメラ（Branhamella）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、サイトファーガ（Cytophaga）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、フレキシバクター（Flexibacter）属、ハロバクテリウム（Halobacterium）属、ヒポミクロビウム（Hyphomicrobium）属、キンゲラ（Kingella）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、リソバクター（Lysobacter）属、ネイセイリア（Neisseiria）属、パラコッカス（Paracoccus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ウォリネラ（Wolinella）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、チオバチルス（Thiobacillus）属、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）属、チオスフェラ（Thiosphera）属等の微生物を、本発明の培養方法における培養対象微生物とすることができる。
【００３４】
ここで、本発明の培養方法を適用しうる対象となる微生物としては、上記微生物の中でも、硝酸呼吸により培養液４に亜硝酸イオンが蓄積されやすい微生物が特に好適である。具体的には、大腸菌（Escherichia coli）、ブラディリゾビウム ジャポニカム（Bradyrhyzobium japonicum）、クレブシエラ プネウモニア（Klebsiella pneumonia）、エンテロバクター エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）、チオバチルス チオパラス（Thiobacillus thioparus）、リゾバクター アンチビオティカム（Lysobacter antibioticum）等が挙げられ、特に大腸菌（Escherichia coli）が好適である。
【００３５】
培養液４には、培養対象微生物の培養に必要な元素や栄養源を含むものを適宜用いればよい。例えば、培養対象微生物を大腸菌とする場合には、乳酸ナトリウム、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、カザミノ酸及び微量元素からなる溶液を培養液４として用いればよい。
【００３６】
電解液４ａには、例えば塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの電解質が添加された溶液を用いればよい。
【００３７】
イオン交換膜６は、培養液４に含まれる硝酸イオン及び微生物２の硝酸呼吸によって生じる亜硝酸イオンを対極槽８側に透過させることなく培養液４中に留まらせ、且つ培養液４に含まれるイオンまたは電解液４ａに含まれるイオンを透過させてイオン電流を生じさせ、作用電極９において生じる酸化反応を補完する還元反応を対電極１０で生じさせるものである。これにより、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンが長期に亘って安定に硝酸イオンに酸化される。イオン交換膜６としては、硝酸イオンと亜硝酸イオンを透過させることのない陽イオン交換膜、２価または３価の陰イオン交換膜を用いることができ、特にプロトンを透過可能な陽イオン交換膜を用いることが好適である。この場合、培養液４と電解液４ａに含まれている陽イオン（プロトン）によってイオン電流を発生させやすい。但し、本願発明者等の実験によれば、少なくとも−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲では硝酸イオンが亜硝酸イオンに還元される反応は生じないことから、イオン交換膜６を設けずとも、対電極１０での硝酸イオンの還元反応は生じない。したがって、イオン交換膜６を設けることは本発明において必須ではない。
【００３８】
ここで、培養液４には、微生物２の呼吸に関与することなく、亜硝酸イオンよりも酸化されにくい酸化還元物質を添加するようにしてもよい。亜硝酸イオンよりも酸化され易い酸化還元物質を用いると亜硝酸イオンの酸化が阻害される虞がある。酸化還元物質を添加することで、培養液４の溶液電位を制御し易くなる。酸化還元物質としては、例えば、鉄イオン、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲン等を用いることができる。鉄イオンを酸化還元物質とする場合には、鉄イオンを培養液４中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させて培養液４中に添加することが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができる。但し、本発明の培養方法においては、作用電極９において亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化できればよく、酸化還元物質の培養液４への添加は必須ではない。
【００３９】
培養液４の硝酸イオン含有量は、培養対象微生物２の硝酸呼吸能や菌体密度に応じてその最適な量が適宜変化するが、概ね１〜１００ｍＭ、好適には１０ｍＭ程度添加すればよい。
【００４０】
尚、培養液４に硝酸イオンを含有させる方法としては、例えば、硝酸ナトリウム等の硝酸塩を培養液４に添加して溶解させる方法が挙げられるが、この方法には限定されない。例えば、培養液４に亜硝酸塩を添加して亜硝酸イオンを溶解させ、電極に電位を与えて亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化することにより培養液４に硝酸イオンを含有させるようにしてもよい。
【００４１】
培養液４に硝酸イオンを含有させることで、硝酸呼吸能を有する微生物２の最終電子受容体物質を培養液４中に存在させることができる。ここで、硝酸呼吸能を有する微生物２が通性嫌気性微生物の場合には、培養液４に溶け込んでいる遊離酸素を消費しながら呼吸を行い、遊離酸素濃度が低下するにつれて徐々に硝酸イオンを利用した硝酸呼吸を行うようになるが、偏性嫌気性微生物の場合には、培養液４に遊離酸素が溶け込んでいると微生物２が失活する場合がある。したがって、培養対象微生物２が偏性嫌気性微生物の場合には、培養液４を窒素やアルゴン等の不活性ガスでパージして遊離酸素を追い出すことが好ましい。
【００４２】
培養対象微生物２により硝酸呼吸が行われると、亜硝酸イオンが発生する。本発明では、亜硝酸イオンを作用電極９により酸化して硝酸イオンに戻し、最終電子受容体を供給し続けることができる。
【００４３】
作用電極９の電位は、培養液４中で亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化可能な電位とすればよい。具体的には、作用電極９を炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極とした場合には、電位を＋０．９Ｖ以上とすれば亜硝酸イオンの酸化が起こる。作用電極９を白金電極を用いた場合には、電位を＋０．８Ｖ以上とすれば亜硝酸イオンの酸化が起こる。したがって、使用する電極に応じて、亜硝酸イオンを酸化して硝酸イオンを生成することができる電位に適宜設定すればよい。
【００４４】
ここで、亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化する速度を高めて亜硝酸イオンの蓄積を防ぐ上では、作用電極９の電位を高めることが好ましいが、作用電極９の電位を高め過ぎると、微生物によっては生育が阻害される場合がある。そこで、例えば以下の手順により、作用電極９の好適電位を導き出すことができる。即ち、培養液４に作用電極９を接触させて、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される範囲の各種電位で培養試験を行う。また、比較試験として、培養液４に作用電極９を接触させずに（電位を印加せずに）培養試験を行う。作用電極９の電位をある一定値に到達するまで高める程、微生物の対数増殖期が延び続けるが、作用電極９の電位がある一定値を超えると、微生物の対数増殖期が徐々に短くなり、最終的には培養液４に作用電極９を接触させずに培養試験を行った場合と同程度あるいはそれよりも短くなる。対数増殖期の長さが最大となる電位を適正電位と呼び、適正電位よりも高い電位で且つ対数増殖期が電位を印加していない場合と同程度となる電位を限界電位と呼ぶ。上記培養試験結果から、適正電位と限界電位を導き出すことができる。そして、作用電極９の電位は、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される電位以上で尚且つ限界電位以下とすることが好ましく、亜硝酸イオンが硝酸イオンに酸化される電位以上で尚且つ適正電位以下とすることがより好ましく、適正電位とすることが最も好ましい。
【００４５】
作用電極９の電位を制御し始めるタイミングについては、電位を制御していない場合の対数増殖期中、好適には対数増殖期中期付近とすればよい。電位を与えるタイミングが早すぎると微生物の生育が阻害される虞がある。逆に電位を与えるタイミングが遅すぎると亜硝酸イオンが蓄積して微生物の生育が阻害される虞がある。但し、微生物によっては、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御しても生育が阻害されない場合もある。例えば、硫酸還元菌やメタン生成菌などの環境微生物、酵母、硝酸還元菌の中でもParacoccus pantotropha等については、培養初期から作用電極９の電位を制御しても生育が阻害されないことが本願発明者等の実験により確かめられている。このような微生物については、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御しても問題は無い。また、培養初期（培養開始時）から作用電極９の電位を制御することで微生物の生育が阻害されたとしても、定常期に到達する段階で最終的に生育促進効果が得られるのであれば、培養初（培養開始時）から作用電極９の電位を制御するようにしても構わない。尚、大腸菌については、作用電極９の電位を制御するタイミングは、培養開始から３時間経過後、好適には培養開始から３〜２０時間の間、より好適には培養開始から３〜１７．５時間の間である。
【００４６】
以上、本発明の培養方法によれば、電位を印加しない場合よりも対数増殖期を大幅に延長させることができ、その結果として最終菌体密度が大幅に向上して、効率よく培養を行うことができる。したがって、微生物の硝酸呼吸を積極的に利用した培養を効率よく実施することが可能となる。
【００４７】
また、本発明の培養方法を実施すると、対電極１０から大量の水素ガスが発生する。この現象は、通常の培養方法では見られないし、微生物を培養液に投入せずに通電した場合にも見られない。このことから、上記現象は、微生物が電子（栄養）源とした有機物から得られた電子が、対電極１０を通して水素ガスとして回収された現象であると解される。したがって、本発明の培養方法の付随的効果として、微生物の生育を促進させつつ、同時にエネルギー源としての水素ガス回収できるという効果が奏される。
【００４８】
次に、本発明の物質生産方法について説明する。本発明の物質生産方法は、物質生産能と硝酸還元能を有する微生物を培養対象微生物とし、この微生物が物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して本発明の培養方法で培養し、培養過程において微生物により生産される物質を回収するようにしている。尚、本発明における「微生物により生産される物質」とは、微生物が直接生産する物質は勿論のこと、微生物の生産物が他の物質と化学反応した結果生じる物質、即ち微生物が間接的に生産する物質も含んでいる。
【００４９】
本発明の培養方法を用いて培養を行うと、最終菌体密度が増加するだけでなく、１菌密度当たりの物質生産能も向上することが確認されている。したがって、最終菌体密度の増加効果と相俟って、極めて効率よく物質生産を行うことができる。
【００５０】
例えば、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌を培養対象微生物２とし、培養液４にラクトースを添加して培養を行うことで、β−ガラクトシダーゼによりラクトースが分解されてグルコースとガラクトースが生成される。本発明によれば、β−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた遺伝子組換え大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ活性を大幅に向上させて、β−ガラクトシダーゼの生産量を大幅に向上できるので、ラクトースを原料とするグルコースとガラクトースの生産が極めて効率よく実施できるようになる。
【００５１】
また、その他にも、本発明の物質生産方法により、例えばヘミセルロースからバイオ燃料になる脂肪酸エステル類、脂肪アルコール（Nature 463, 7280 (Jan 2010)）、エタノール、水素、生分解性プラスチックＰＨＡ、コハク酸、1,3-プロパンジオール、2,3-プロパンジオール、アスパラギン酸、アラニン、インターロイキン・インスリンなど医薬品、セルラーゼ・リパーゼ・キトサナーゼ・プロテアーゼなどのタンパク質などの生産を極めて効率よく実施し得る。
【００５２】
本発明の培養方法及び物質生産方法は、例えば、図２〜６、図２２〜２６に示す電気培養装置により実施される。以下、イオン交換膜６を設けた場合の実施形態として、第一の実施形態を図２〜図５に基づいて説明し、第二の実施形態を図６に基づいて説明する。また、イオン交換膜を設けない場合の実施形態として、第三の実施形態を図２２〜図２６に基づいて説明する。
【００５３】
＜第一の実施形態＞
第一の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と電解液をイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に作用電極と共に参照電極を接触させ、電解液に対電極を接触させ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
【００５４】
第一の実施形態にかかる培養方法は、例えば図２〜図５に示す電気培養装置１により実施される。即ち、図２〜図５に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６によって仕切られた二つの槽のうちの一方の槽を培養槽７とし、他方の槽を対電極槽８とし、培養槽７には硝酸イオンを含む培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が浸され、対電極槽８には電解液４ａが収容されると共に対電極１０が浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、定電位設定装置１２により作用電極の電位を３電極方式で制御するようにしている。
【００５５】
このように、３電極方式で作用電極９の電位を制御することで、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【００５６】
また、図２〜図５に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外（電気培養装置１の外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されるない。例えば、ガス回収手段１５を備えることなく、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７からガスが漏れ出すことがない。このようにしてガスを回収することで、硝酸還元能を有する微生物２により生産される物質がガス状物質である場合に、これを漏れなく回収することができる。
【００５７】
さらに、図２〜図５に示す電気培養装置１では、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４を採取するようにしている。但し、培養液４の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段１６を備えることなく、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介して培養液４を採取するようにしてもよい。このようにして培養液４を回収することで、硝酸還元能を有する微生物２が生産する物質を培養液４から回収することができる。
【００５８】
また、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【００５９】
以下、図２に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ａとして説明し、図３に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｂとして説明し、図４に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｃとして説明し、図５に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Ｄとして説明する。
【００６０】
（第一の実施形態Ａ）
図２に示す電気培養装置１は、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対電極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備えると共にガス（対電極１０から発生するガス）を容器２０の外に排出するガス排出管２２を備えるものとしている。また、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させている。尚、図２に示す電気培養装置１では、対電極１０と定電位設定装置１２を結線する配線は、ガス排出管２２の中を通過させているが、必ずしもこの構成には限定されず、配線をガス排出管２２を通さずに定電位設定装置１２と結線するようにしてもよい。
【００６１】
培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対電極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。
【００６２】
対電極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。ここで、小容器２１はその全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいが、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成したり、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成し、小容器２１からのガス（対電極槽８から発生するガス）が容器２０の内部に漏洩しないようにしてもよい。
【００６３】
このように、容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４に小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６は培養液４と接触する。換言すれば、培養液４はイオン交換膜６を介して電解液４ａと接触する。
【００６４】
ここで、第一の実施形態Ａでは、小容器２１を密閉構造とすることが好ましいが、小容器２１は必ずしも密閉構造とせずともよい。即ち、小容器２１の上部を開放して対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させて滞留させると、小容器２１を密閉構造とした場合と比較して微生物の生育が若干低下するものの、通電せずに培養した場合と比較して優れた生育促進効果を奏しうる。そして、この場合には、培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、微生物２が産生したガスに加え、対電極１０にて発生した水素ガスをも同時に回収できる利点がある。
【００６５】
尚、対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させて滞留させた場合の微生物の生育低下の要因としては、例えば対電極１０から微生物の生育に悪影響を及ぼすガスが発生しており、このガスが培養液４に溶け込むこと等が推定される。したがって、対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させる形態とした場合には、例えば培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けることで、小容器２１を密閉構造とした場合と同様の生育促進効果を奏し得るものと考えられる。
【００６６】
また、培養槽７（容器２０）は、密閉構造とすることが好ましい。この場合には、培養槽７を嫌気条件に制御し易い。即ち、培養槽７を密閉構造とすることで、遊離酸素の進入が起こらないので、通性嫌気性微生物を培養対象微生物とした場合には、培養槽７に残存する遊離酸素が消費されれば、呼吸形態を完全に硝酸呼吸に移行させることができる。また、偏性嫌気性微生物を培養対象微生物とした場合にも、培養を開始する前に培養槽７の遊離酸素を実質的に無くせば、培養槽７への遊離酸素の進入が起こらないので、培養期間中は嫌気条件を維持し続けて硝酸呼吸を行わせることができる。さらに、微生物がガスを産生する場合には、培養槽７を密閉構造とし、且つ上述のガス回収手段１５等を備えることが好ましい。この場合には、微生物が産生するガスを容器２０の外に漏れ出させることなく、ガスによる容器２０内の圧力上昇を防ぎながらその全量を回収し易いものとできる。但し、培養槽７を密閉構造とすることは必須条件ではない。即ち、微生物がガスを産生して培養液４の液面からガスが発生することによって、培養液４の液面への遊離酸素の接触が抑制されるような場合や、好気性微生物を培養対象とする場合等においては、培養槽７を密閉構造とせずとも構わない。
【００６７】
尚、本実施形態において使用できる作用電極９としては、上記の通り、亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化し得る材質の電極、例えばグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、対電極１０としては、作用電極９における酸化反応を補完する還元反応が生じ得る材質の電極、例えば炭素電極、白金電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
（第一の実施形態Ｂ）
図３に示す電気培養装置１は、上方が開放されている容器２３をイオン交換膜６で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽７としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞がれているものとしている。つまり、図３に示す電気培養装置１は、対電極槽８から発生するガスを培養槽７に漏れ出さないようにする構成以外は、図２と同一の構成としている。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００６９】
尚、図３に示す電気培養装置１において、対電極槽８は、開放したままでもよいが、培養槽７と同様に密閉構造とし、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外に排出するガス排出管を備えるようにしてもよい。この場合には、対電極槽８から発生する水素ガスを所望の位置から排出させることができるので、これを回収することが可能となる。
【００７０】
ここで、図３に示す電気培養装置１において、対電極槽８から発生するガスを培養槽７に漏れ出さないようにする構成とすることが好ましいが、対電極槽８のヘッドスペースと培養槽７のヘッドスペースを連通させて対電極１０から発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させるようにしても構わない。この場合にも、第一の実施形態Ａにおいて説明した通り、本発明の効果は十分に得られる。
【００７１】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００７２】
図３に示す電気培養装置１において、ガス不透過膜またはガス不透過部材２４としては、各種分野で一般に用いられているものを適宜用いることができる。例えば、ガス不透過部材としては、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過膜としては、例えばイオン交換膜６を用いることができるがこれに限定されるものではない。
【００７３】
尚、本実施形態において使用できる容器２３の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００７４】
（第一の実施形態Ｃ）
図４に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、一方の容器２５ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２５ｂを開放して対電極槽８としている。この場合、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２５自体のＵ字型構造によって隔てて配置される。そして、一方の容器２５ａが密閉構造とされていることから、対電極槽８から発生するガスが培養槽７に侵入するのを防ぎながら、培養槽７から発生するガスが培養槽７から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００７５】
ここで、第一の実施形態Ｃにおける電気培養装置１の他方の容器２５ｂの開放とは、例えば他方の容器２５ｂの端部を完全に開放した場合は勿論のこと、図４に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、対電極槽８から発生するガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。
【００７６】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００７７】
尚、本実施形態において使用できる容器２５の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００７８】
（第一の実施形態Ｄ）
図５に示す電気培養装置１は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂがイオン交換膜６を介して開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂを開放して対電極槽８としている。この場合にも、培養液４と電解液４ａがイオン交換膜６を介して接触すると共に、培養槽７の培養液４の液面よりも上部の空間と対電極槽８の電解液４ａの液面よりも上部の空間とが容器２６自体のＨ字型構造によって隔てて配置される。そして、Ｈ字型容器２６の一方の容器２６ａが密閉構造とされていることから、培養槽７は密閉構造となる。したがって、対電極槽８から発生するガスが培養槽７に侵入するのを防ぎながら、培養槽７から発生するガスが培養槽７から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図２に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００７９】
ここで、第一の実施形態Ｄにおける電気培養装置１の他方の容器２６ｂの開放とは、例えば他方の容器２６ｂの上部等を完全に開放した場合は勿論のこと、図５に示すように、一方の容器２５ａと同様に密閉構造としつつ、対電極槽８において発生するガスを対電極槽８の外の排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、対電極槽８から発生するガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。
【００８０】
また、培養槽７は、第一の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【００８１】
尚、本実施形態において使用できる容器２６の材質は、第一の実施形態Ａと同様である。本実施形態において使用できる作用電極９と対電極１０についても、第一の実施形態Ａと同様である。
【００８２】
＜第二の実施形態＞
第二の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と対電極とをイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第一の実施形態における培養方法とは、電解液を用いることなく対電極を直接イオン交換膜に接触させている点のみが異なっている。
【００８３】
しかしながら、第一の実施形態のように電解液４ａを用いずとも、作用電極９と対電極１０との間でイオン交換膜６を介してイオン電流は流れるので、第二の実施形態にかかる培養方法によれば、第一の実施形態と同様に作用電極９の電位を制御して、同様の効果を得ることが可能である。
【００８４】
第二の実施形態にかかる培養方法は、例えば図６に示す電気培養装置により実施される。図６に示す電気培養装置１は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器５内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５の外側に対電極１０が配置され、容器５に培養液４が収容されると共に作用電極９と参照電極１１が培養液４に浸され、容器４のイオン交換膜６は容器５に培養液４が収容されたときに少なくともその一部がイオン交換膜６と接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４の接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。図６に示す電気培養装置１では、容器５の培養液４の液面よりも下部に開口部５ａが設けられ、開口部５ａがイオン交換膜６で塞がれ、容器５の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対電極１０が接触して配置されているものとしている。つまり、図６に示す電気培養装置１では、容器５全体が培養槽７として機能することとなる。
【００８５】
したがって、図６に示す電気培養装置１によれば、容器５からガスが漏洩することがない。また、対電極１０から発生するガスが容器５内に漏れ出すことがないので、容器５から発生したガスに対電極１０から発生したガスが混入してその濃度を低下させたり、対電極１０から発生したガスが培養液４に溶け込んで微生物２の生育に悪影響を及ぼすこともない。さらに、容器５を密閉構造としているので、第一の実施形態と同様、容器５内を嫌気条件に制御し易い利点もある。
【００８６】
尚、図６に示す電気培養装置１では、第一の実施形態と同様に、ガス回収手段１５、培養液採取手段１６を備えるようにしているが、上記の通り、ガス回収方法、培養液採取方法は、これらの手段を利用したものには限定されない。また、第一の実施形態と同様、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【００８７】
以下、図６に示す電気培養装置１の詳細について説明する。但し、以下に説明する以外の構成については、第一の実施形態と実質的に同一であり、説明は省略する。
【００８８】
容器５は、イオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造としている。容器５の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。尚、図６では、密閉構造の容器５の培養液４の液面よりも下部に設けられた開口部５ａをイオン交換膜６により塞ぐようにしているが、容器５の形態や構造は特に限定されない。例えば容器５全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としてもよいし、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分はガラス等の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えば培養液４と培養液４中の成分の双方を透過させることがない膜材により構成してもよい。要は、容器５に収容される培養液４が容器５の少なくとも一部を構成するイオン交換膜６と接触しうる構造の容器とすればよい。
【００８９】
対電極１０は、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に接触させるようにしている。本実施形態において、対電極１０は板状の炭素電極としているが、対電極１０の形状と材質はこれに限定されるものではなく、要は、イオン交換膜６との接触が可能な形状であり、且つ作用電極９における酸化反応に対して電子の授受を補完する還元反応を進行させることが可能な材質、つまり、作用電極９において還元反応が生じる際に酸化反応を進行させることが可能な材質の電極とすればよい。また、本実施形態では、対電極１０の面積をイオン交換膜６の面積よりも大きなものとしてイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにし、イオン交換膜６と対電極１０とを接触させるようにしているが、イオン交換膜６の培養液４との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極１０を接触させれば、イオン交換膜６を介して培養液４から対電極１０にイオンが伝達するので、必ずしもイオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うようにしてイオン交換膜６と対電極１０とを接触させずともよい。但し、イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆うことで、対電極１０をイオン交換膜６の保護材としても機能させることができると共に、培養液４からのイオンの伝達面が増大する結果として、培養液４の電位制御性を高めることができる利点があり、好適である。イオン交換膜６全体を対電極１０で完全に覆う方法としては、例えば、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０を接着することにより、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよいし、容器５の開口部５ａの周囲に接着剤を塗布して対電極１０の表面の少なくとも一部に塗布形成されたイオン交換膜６を接着することにより、開口部５ａをイオン交換膜６で塞ぎつつ、開口部５ａを塞ぐイオン交換膜６全体と対電極１０とを接触させるようにしてもよい。イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤としては、例えばナフィオン分散液が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、対電極１０の表面にナフィオン分散液を塗布し、ナフィオン分散液が乾燥する前にイオン交換膜６を貼り付けるようにしてもよい。この場合には、イオン交換膜６の対電極１０の表面への接着性と接触性とを十分なものとすることができる。
【００９０】
ここで、対電極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対電極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。尚、対電極１０を多孔質体とし、ナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対電極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００９１】
また、培養槽７として機能する容器５は、第一の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器５の外側の対電極１０をガス不透過部材等で覆って密封構造とし、対電極１０から発生するガスを回収するためのガス回収手段を設けて、対電極１０から発生するガスを漏れ出させることなく回収するようにしてもよい。
【００９２】
＜第三の実施形態＞
第三の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と対電極と参照電極とを接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を３電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第三の実施形態にかかる培養方法においては、イオン交換膜と電解液を用いることなく、培養液に全ての電極を接触させている点において第一の実施形態及び第二の実施形態と異なる。
【００９３】
第三の実施形態のように、イオン交換膜６を設けない場合には、対電極１０から発生するガスが培養槽７のヘッドスペースに滞留し、また対電極１０から発生するガスが直接培養液４に溶け込んで微生物の生育が若干低下する虞があるものの、通電せずに培養した場合と比較して優れた生育促進効果を奏しうる。
【００９４】
また、本願発明者等の実験によると、イオン交換膜６を設けて且つ培養槽７のヘッドスペースに対電極１０にて発生したガスが移行する形態とした上記第一の実施形態Ａの電気培養装置で培養試験を行った場合よりも、イオン交換膜６を設けずに培養試験を行った場合の方が微生物の生育が促進されることが確認されている。このことから、イオン交換膜６を設けないことによって、作用電極９と対電極１０との間の電流値が増大し、微生物の生育が促進されやすくなるものと考えられる。
【００９５】
さらに、本願発明者等の実験によると、イオン交換膜６を設けて且つ培養槽７のヘッドスペースに対電極１０にて発生したガスが移行する形態とした上記第一の実施形態Ａの電気培養装置で培養試験を行った場合よりも、イオン交換膜６を設けずに培養試験を行った場合の方が対電極１０からの水素発生量が顕著に増加すること、及び微生物の代謝産物の分解が促進されることが確認されている。このことから、イオン交換膜６を設けないことによって、作用電極９と対電極１０との間の電流値が増大し、微生物が利用できる電子・炭素が増加するものと考えられる。
【００９６】
また、イオン交換膜６を設けない場合には、電気培養装置の構成の簡素化を図ることができると共に、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧低下によるエネルギーロスの低減を図ることができる。
【００９７】
さらに、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、微生物２の生育に必要な炭素源（栄養源）の汎用性を向上させることも可能である。したがって、例えば微生物２に資化され得る各種物質は勿論のこと、各種バイオマス、有機性廃棄物、有機性廃水等といったバイオマスや廃棄物系の有機物を微生物２の炭素源として使用し得るものとできる。
【００９８】
このように、イオン交換膜６を設けずに本発明を実施することで、種々の恩恵が得られる。
【００９９】
第三の実施形態にかかる培養方法は、例えば図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａにより実施される。即ち、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａは、培養槽７に硝酸イオンを含む培養液４が収容され、培養液４には作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、定電位設定装置１２により作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。但し、作用電極９と対電極１０の極間電圧のみで作用電極９の電位を制御できる場合には、３電極方式とせずともよい。
【０１００】
ここで、第三の実施形態のように、イオン交換膜６を設けない場合、電気培養中に対電極１０へのプロトンの移行が活発に起こる結果として、対電極１０を腐食させてその機能を失わせる虞がある。したがって、第三の実施形態においては、対電極１０として、作用電極９における酸化反応を補完する還元反応が生じ得る材質で尚かつ耐酸性の電極を用いることが好ましい。例示すると、白金電極等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えばガラス電極やステンレス電極等を用いてもよい。作用電極９については、第一の実施形態及び第二の実施形態と同様、例えばグラッシーカーボン等の炭素電極や白金電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
また、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａでは、培養槽７内の培養液４の液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガスを培養槽７の外（電気培養装置１ａの外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されない。例えば、ガス回収手段１５を備えることなく、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７からガスが漏れ出すことがない。
【０１０２】
また、図２２〜図２６に示す電気培養装置１ａでは、培養槽７内の培養液４の液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４を培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４を採取するようにしている。但し、培養液４の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段１６を備えることなく、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液４に浸けて、管を介して培養液４を採取するようにしてもよい。
【０１０３】
尚、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液４に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物２をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス（窒素ガス等）を供給することもできる。但し、培養液４に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【０１０４】
以下、図２２に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ａとして説明し、図２３に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｂとして説明し、図２４に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｃとして説明し、図２５に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｄとして説明し、図２６に示す電気培養装置を用いた場合について第三の実施形態Ｅとして説明する。
【０１０５】
（第三の実施形態Ａ）
図２２に示す電気培養装置１ａは、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、培養槽７に収容された培養液４に作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが浸され、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが定電位設定装置１２に結線されている。つまり、第三の実施形態Ａは、第一の実施形態Ａから小容器２１（イオン交換膜６）及びガス排出管２２を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ａと同様の構成を有している。したがって、図２２に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１０６】
また、ガス回収手段１５等により培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、対電極１０から大量に発生する水素を回収することができる。そして、微生物がガスを産生する場合には、このガスと対電極１０から発生する水素を同時に回収することができる。
【０１０７】
尚、培養槽７として機能する容器２０は、第一の実施形態及び第二の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１０８】
また、培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けて、対電極１０から発生するガスの培養液４への溶け込みを防ぐことで、より優れた生育促進効果が奏され得るものと考えられる。
【０１０９】
（第三の実施形態Ｂ）
図２３に示す電気培養装置１ａは、容器５内に作用電極９と参照電極１１が配置され、容器５内に培養液４を収容し、容器５の培養液４の液面よりも下部に穴を設けておき、この穴を対電極１０で塞いで、容器５を密閉構造としている。そして、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とが定電位設定装置１２に結線されている。つまり、第三の実施形態Ｂは、第二の実施形態からイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第二の実施形態と同様の構成を有している。したがって、図２３に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１０】
また、第三の実施形態Ａと同様、ガス回収手段１５等により培養槽７のヘッドスペースからガスを回収することで、対電極１０から大量に発生する水素を回収することができる。そして、微生物がガスを産生する場合には、このガスと対電極１０から発生する水素を同時に回収することができる。
【０１１１】
尚、培養槽７として機能する容器５は、第三の実施形態Ａと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１１２】
また、第三の実施形態Ａと同様、培養槽７のヘッドスペースから吸引等により速やかにガスを回収・除去し続けて、対電極１０から発生するガスの培養液４への溶け込みを防ぐことで、より優れた生育促進効果が奏され得るものと考えられる。
【０１１３】
（第三の実施形態Ｃ）
図２４に示す電気培養装置１ａは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２５ａと２５ｂが開口部で連結されてＵ字型の容器２５が形成され、容器２５内に培養液４を収容し、容器２５ａ側を培養槽７とし、容器２５ｂ側を対電極槽としている。そして、作用電極９と参照電極１１を容器２５ａ側の培養液４に浸し、対電極を容器２５ｂ側の培養液４に浸し、容器２５ａ側の培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースは密閉構造とし、容器２５ｂ側の培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースは開放構造としている。つまり、第三の実施形態Ｃは、第一の実施形態Ｃからイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ｃと同様の形態を有している。したがって、図２４に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１４】
ここで、第三の実施形態Ｃにおける電気培養装置１ａの容器２５ｂ側のヘッドスペースの開放とは、例えば容器２５ｂの上部を完全に開口した場合は勿論のこと、図２４に示すように、容器２５ｂの上部を容器２５ａの上部と同様に密閉構造としつつ、容器２５ｂのヘッドスペースから容器２５ｂの外へガスを排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、他端側のヘッドスペースのガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。尚、この場合には、容器２５ｂのヘッドスペースから容器２５ａのヘッドスペースへのガスの移行が起こらないので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果も期待できる。
【０１１５】
尚、容器２５の一端は、第一の実施形態Ｃと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器２５は、容器２５ａと容器２５ｂを連結したものには限定されず、一体成形されたものを用いても構わない。
【０１１６】
（第三の実施形態Ｄ）
図２５に示す電気培養装置１ａは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器２６ａと２６ｂが開口部で連結されてＨ字型の容器２６が形成され、一方の容器２６ａを密閉構造として培養槽７とし、他方の容器２６ｂを開放して対電極槽８としている。つまり、第三の実施形態Ｄは、第一の実施形態Ｄからイオン交換膜６を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Ｄと同様の形態を有している。したがって、図２５に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１１７】
ここで、第三の実施形態Ｄにおける電気培養装置１ａの容器２６ｂの開放とは、例えば容器２６ｂを完全に開放した場合は勿論のこと、図２５に示すように、容器２６ａと同様に密閉構造としつつ、容器２６ｂのヘッドスペースから容器２６の外へガスを排出するガス排出管２２を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管２２を備える場合には、容器２６ｂのヘッドスペースのガス（水素ガスを含むガス）を所望の位置から排出させて、これを容易に回収することが可能となる。尚、この場合には、容器２６ｂのヘッドスペースから容器２６ａのヘッドスペースへのガスの移行は起こらないので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果も期待できる。
【０１１８】
尚、容器２６ａは、第一の実施形態Ｄと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また容器２６は、容器２６ａと容器２６ｂを連結したものには限定されず、一体成形されたものを用いても構わない。
【０１１９】
（第三の実施形態Ｅ）
図２６に示す電気培養装置１ａは、容器２３に培養液４を収容し、培養液４に作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを浸し、これらの電極を定電位設定装置１２に結線し、容器２３に収容された培養液４の液面よりも上部のヘッドスペースを二層に区画し、一方の区画２３ｃに対電極１０から発生するガスを滞留させ、もう一方の区画２３ｄにこのガスが移行するのを抑制するようにしている。したがって、図２６に示す電気培養装置１ａにより微生物を培養することで、イオン交換膜６を設けない場合の上記効果が奏される。
【０１２０】
また、この場合、ヘッドスペース２３ｃからヘッドスペース２３ｄへのガスの移行は起こり難いので、このことに起因する微生物の生育低下を抑制することができるという効果が期待できる。
【０１２１】
また、第三の実施形態Ｅの構成とした場合には、第三の実施形態Ｃや第三の実施形態Ｄよりも作用電極９と対電極１０を接近させやすいので、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧のさらなる低下や、電流値のさらなる増大が期待できる。
【０１２２】
尚、ヘッドスペース２３ｄは、密閉構造とすること、及びガス回収手段１５等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【０１２３】
また、ヘッドスペース２３ｃは、図２６に示すように密閉構造として、滞留するガスを排出するガス排出管２２を備えるようにしてもよいが、開放構造としても構わない。
【０１２４】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図２１に示すように、培養液４と電解質４ａをイオン交換膜６ではなく、イオンや微生物を一切透過させることのない不透過部材４０で隔て、あるいは培養槽７と対電極槽８を別の容器で形成し、塩橋４１（寒天等にＫＣｌ等の飽和電解質溶液を入れたもの）を介して培養液４と電解質４ａを接触（液絡）させるようにしてもよい。この場合にも、塩橋４１によってイオン電流の流れが許容されると共に、硝酸イオンと亜硝酸イオンの対電極槽８への透過を防ぐことができるので、上述の実施形態と同様の効果が得られる。
【０１２５】
また、好気条件下において硝酸呼吸を行う微生物も存在するので、このような微生物を培養する場合には、培養液を好気条件に制御しながら硝酸呼吸を利用して培養を行うようにしてもよい。このような微生物としては、例えば、参考文献１に挙げられているThiosphaera pantotropha LMD 92.63（後に分類変更されてParacoccus pantotropha LMD 92.63に名前が変更）、Pseudomonas denitrificans LMD84.60、Alcaligenes faecalis LMD89.147等が挙げられる（参考文献１：FEMS microbiology ecology 18 (1995) 113-120）。
【０１２６】
さらに、イオン交換膜６に代えて、透析膜を使用してもよい。透析膜を使用することで、透水性が確保されるので、イオン交換膜６を設けない場合と同様、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧の低下効果や、電流値の増大効果が奏される。しかも、透析膜は、対電極１０から発生するガスの障壁となり得るので、例えば第一の実施形態Ａで説明したように小容器２１の上方を開口した構成を採用したり、あるいは第一の実施形態Ｂ〜Ｄのような構成を採用したりすることで、対電極１０から発生するガスを上方に逃がして培養液４に直接溶け込むのを抑制する効果が期待できるので、生育のさらなる促進効果が期待できる。
【実施例】
【０１２７】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【０１２８】
尚、本実施例における電極電位は、全て銀・塩化銀電極電位を基準とするものである。
【０１２９】
（比較例１）
大腸菌を用いて、硝酸呼吸を利用した培養について検討した。
【０１３０】
１００ｍＬ容のガラスバイアル瓶に以下の組成を有する培養液を３０ｍＬ収容し、これに大腸菌（E.coli JM109）を初期菌体密度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加した。
[培養液の組成（Ｌ−１）]
・乳酸ナトリウム： ４．７２ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４： ４．２ｇ
・ＮＨ４Ｃｌ： ０．６ｇ
・ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ： ０．０８ｇ
・カザミノ酸： ５．０ｇ
・微量元素溶液： １ｍＬ
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
・ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ： ０．２ｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ： １．０ｇ
・ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ： ０．０３４ｇ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ： ０．０１５ｇ
・Ｎａ２ＳｅＯ４： ０．５ｇ
【０１３１】
培養液と大腸菌を入れたガラスバイアル瓶は６個用意し、これを同数づつ２グループに分けた。
【０１３２】
一方のグループの培養液には、硝酸塩（NaNO3）を添加して硝酸イオン濃度を１０ｍＭとした。他方のグループの培養液には、硝酸塩（NaNO3）と亜硝酸塩（NaNO2）を添加して硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度を共に１０ｍＭとした。
【０１３３】
ガラスバイアル瓶に窒素ガスを充填して蓋を閉め、培養環境を嫌気条件とした。また、培養液のｐＨは７．０ 、培養液温度は３０℃として菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。
【０１３４】
結果を図７に示す。図７中、◆は培養液の硝酸イオン濃度が１０ｍＭの場合の増殖曲線を示し、■は培養液の硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度が共に１０ｍＭの場合の増殖曲線を示している。図７に示される通り、いずれの条件においても、培養開始から２４時間が経過した後には、菌数の減少が見られた。この結果から、硝酸イオンが硝酸呼吸により還元されて亜硝酸イオンになると、大腸菌の生育が阻害されることが示唆された。また、培養液に亜硝酸イオンが含まれている場合には、亜硝酸イオンが含まれていない場合よりも生育速度が低下することが確認された。また、最終的に得られる菌体量も少なかった。
【０１３５】
以上の結果から、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を実施する場合には、硝酸呼吸によって生じる亜硝酸イオンの存在によって、大腸菌の生育が阻害されることが明らかとなった。
【０１３６】
（実施例１）
培養液に電極を接触させて、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら大腸菌を培養することについて検討した。
【０１３７】
（１）実験装置
図８に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽７としての容器２０は２５０ｍＬ容のガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）とした。培養液４は容器２０の八分目程度まで入れた。容器２０には蓋３０をした。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
【０１３８】
対電極槽８としての小容器２１は、イオン交換膜６を成型して袋状（以下、袋２１と呼ぶ）とした。実験で用いた小容器２１の形態を図９に示す。具体的には、イオン交換膜（ナフィオンＫ、デュポン製）をヒートシーラーで熱圧着により加工して上部が開口した袋状の容器２１とし、袋２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。そして、対電極１０と定電位設定装置１２を結線するための配線３１をガス排出管２２に通した。ガス排出管２２は両端が開口されており、一端を小容器２１の内部に、他端を容器２０の外側に配置するようにして、小容器２１内で発生するガスが容器２０の外側に排出されるようにした。袋状の小容器２１の上部の開口部は、シリコン接着剤３２で塞いだ。
【０１３９】
小容器２１と作用電極９とを培養液４に浸漬し、小容器２１のガス排出管２２と作用電極４の配線は蓋３０に設けたシリコーンゴム栓に通して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（RE-1B, ＢＡＳ株式会社）は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことにより培養液４と接触させた。培養液採取管１６は容器２０の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことによりその一端を培養液４と接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。培養液採取管１６の他端は注射器と接続して培養液４を採取可能とした。培養中は攪拌子３４により培養液４を攪拌した。
【０１４０】
培養液４の組成は、以下の通りとした。
[培養液の組成（Ｌ−１）]
・乳酸ナトリウム： ４．７２ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４： ４．２ｇ
・ＮＨ４Ｃｌ： ０．６ｇ
・ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ： ０．０８ｇ
・カザミノ酸： ５．０ｇ
・微量元素溶液： １ｍＬ
[微量元素溶液の組成（Ｌ−１）]
・ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ： ０．２ｇ
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ： １．０ｇ
・ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ： ０．０３４ｇ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ： ０．０１５ｇ
・Ｎａ２ＳｅＯ４： ０．５ｇ
【０１４１】
電解液４ａは、ＮａＣｌ溶液（０．５８ｇ／Ｌ）とした。
【０１４２】
（２）亜硝酸イオンの酸化還元特性
培養液４に亜硝酸イオンとしてNaNO2を０．８５ｇ／Ｌ添加し、作用電極９を炭素電極（BAS社製）とし、対電極１０を白金棒電極（自作）として上記電気培養装置を用いてサイクリックボルタンメトリーにより酸化還元特性を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示される結果から、亜硝酸イオンは、電気化学的に酸化されるが、還元されない性質を有することが明らかとなった。
【０１４３】
この結果について、作用電極９を白金電極（BAS株式会社製）に替えて再現性を確認した。結果を図１１に示す。炭素電極を用いた図１０の場合と同様、亜硝酸イオンは電気化学的に酸化されるが、還元されなかった。
【０１４４】
次に、培養液４に亜硝酸イオンとしてNaNO2を０．８５ｇ／Ｌ添加し、作用電極９と対電極１０を炭素電極とした場合の作用電極９の電極電位に対する亜硝酸イオン濃度の経時変化と硝酸イオン濃度の経時変化について検討した。亜硝酸イオン濃度の経時変化を図１２に示し、硝酸イオン濃度の経時変化を図１３に示す。尚、亜硝酸イオン濃度と硝酸イオン濃度の測定はイオンクロマトグラフィー（ICS-1500、DIONEX製）により行った。この実験結果から、作用電極９の電極電位を＋０．９Ｖ以上とすると、亜硝酸イオンが酸化され、これに伴い硝酸イオンが生成されることが明らかとなった。そして、電極電位を大きくするに伴い、亜硝酸イオン濃度をより速く低減でき、硝酸イオン濃度をより速く増加できることが明らかとなった。
【０１４５】
次に、作用電極９の電極電位に対する硝酸イオン濃度の経時変化について、作用電極９と対電極１０を白金電極に替えて同様の実験を行った。結果を図１４に示す。電極電位を＋０．８Ｖとすることで亜硝酸イオンの酸化に伴う硝酸イオンの生成が見られた以外は、炭素電極を用いた場合と同様の結果が得られた。
【０１４６】
（３）培養試験方法
培養液４には、硝酸イオン源として、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）を０．８５ｇ／Ｌ添加した。また、大腸菌（E.coli JM109）を初期菌体密度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加した。
【０１４７】
培養槽７には窒素を充填して嫌気条件とし、温度（培養液温度）３０℃、培養液のｐＨを７．０とした。そして、培養開始から１７．５時間後、作用電極９（炭素電極）の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８Ｖ、＋０．９Ｖ、＋１．０Ｖ、＋１．２Ｖに制御して培養試験を行った。また、比較試験として通電無し（作用電極への電位の印加を行わない）の場合の培養試験も実施した。培養期間中の菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。
【０１４８】
（４）培養試験結果
各種電極電位における菌数の経時変化を図１５に示す。＋０．８Ｖでは通電無しの場合との差が見られなかったが、＋０．９Ｖとすることで通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られ、＋１．０Ｖとすることでこの効果がより顕著に見られることが確認された。また、＋１．２Ｖとした場合にも、通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られたが、その効果は＋１．０Ｖの場合ほどではなかった。
【０１４９】
次に、最終菌体密度が最も向上した＋１．０Ｖの場合について、硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度の経時変化を測定した。結果を図１６に示す。また、比較のために、通電無しの場合について、硝酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度の経時変化を測定した結果を図１７に示す。図１７に示されるように、通電無しの場合には、硝酸イオンが大腸菌の硝酸呼吸により消費されるのに伴い、亜硝酸イオンが徐々に蓄積していることが確認された。一方、電極電位を＋１．０Ｖとした場合には、亜硝酸イオンが酸化されて硝酸イオンに再生されていることが確認された。尚、培養開始から３６時間目あたりで見られた亜硝酸イオンの蓄積は、大腸菌の菌数の増加に伴って硝酸呼吸による硝酸イオン消費速度が作用電極９による亜硝酸イオン酸化速度を超えたために生じたものと考えられる。
【０１５０】
以上の結果から、大腸菌の硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うためには、電極電位を＋０．９Ｖ〜１．２Ｖに制御することが好ましいことが明らかとなった。また、上記（２）の実験結果から、炭素電極を用いた場合に亜硝酸イオンの酸化が生じる最小電位が＋０．９Ｖであったことから、電極の電位を亜硝酸イオンの酸化が生じる電位以上に制御すれば、本発明の効果が得られることが明らかとなった。このことから、白金電極を用いた場合には、電極の電位を＋０．８Ｖ以上に制御すれば、本発明の効果を得られるものと考えられた。
【０１５１】
また、上記（２）の実験結果から、電極電位を高めた方が亜硝酸イオンの酸化速度を高めることができることが確認されたが、培養試験においては、＋１．０Ｖで最も優れた効果が得られた。このことから、＋１．２Ｖでは、本発明の効果を得られる反面、電極電位自体によって微生物の生育が阻害されていることが示唆された。
【０１５２】
以上より、炭素電極を用いた場合、電極電位は＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖとすればよいが、＋０．９Ｖ超〜＋１．２Ｖ未満とすることが好ましく、＋１．０Ｖ程度とすることがさらに好ましい。
【０１５３】
また、白金電極を用いた場合、電極電位は＋０．８Ｖ〜＋１．２Ｖとすればよいが、＋０．８Ｖ超〜＋１．２Ｖ未満とすることが好ましく、＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖ未満とすることがより好ましく、＋１．０Ｖ程度とすることがさらに好ましい。
【０１５４】
つまり、大腸菌を培養対象微生物とした場合には、電極電位が＋１．２Ｖを超えると限界電位（対数増殖期が電位を印加していない場合と同程度となる電位）を超える可能性があり、＋１．０Ｖ付近に適正電位（対数増殖期の長さが最大となる電位）があるものと考えられる。
【０１５５】
尚、電位制御開始タイミングを変更して上記培養試験を実施した。具体的には、培養開始から３時間経過後、６時間経過後、１０．５時間経過後に電位制御を開始して、上記培養試験と同様の試験を実施した結果、上記培養試験で得られた結果とほぼ同様の生育促進効果が得られることが確認された。したがって、培養開始から３時間経過後〜１７．５時間経過後に電位制御を開始すれば、本発明の効果が確実に奏されることが明らかとなった。
【０１５６】
（５）培養期間中に発生したガスの組成分析
作用電極９と炭素電極とし、イオン交換膜６（ナフィオンＮ１１７、デュポン製）により作製した袋状の小容器２１の上部の開口部をシリコン接着剤３２で塞ぐことなく開放しておき、また、ガス排出管２２を備えずに対電極１０から発生したガスが培養槽７のヘッドスペースに移行するようにして、上記と同様の培養試験を実施し、培養期間中に培養槽７から発生したガスと対電極槽８から発生したガスを容器２０の上部に設置したフッ化ビニル樹脂製サンプリングバッグ（アズワン製、商品名：テドラーバッグ、１Ｌ）に回収し、回収したガスの量と組成を分析した。作用電極９の電極電位は＋１．０Ｖとした。ガスの量は水上置換法により分析し、ガスの組成はガスクロマトグラフィー（ＶＡＲＩＡＮ、ＣＲ４９００）で分析した。また、比較試験として、通電を行わなかった場合と、大腸菌を入れずに通電を行った場合について、ガスの発生量と組成を分析した。
【０１５７】
結果を図３２に示す。通電の有無で比較したところ、二酸化炭素の発生量は乳酸代謝の差に相応した差に留まっていた。尚、二酸化炭素は、大腸菌の乳酸代謝によって生じる副産物であることから、大腸菌が存在している培養液４から発生して培養槽７のヘッドスペースを経て回収されたものである。一方で、水素の発生量は＋１．０Ｖの電位を印加しながら電気培養を行った場合では非通電時と比べ顕著な違いが見られ、非通電時の０．０２４ｍＬに対して約６８００倍の１６３．４ｍＬ±１．７ｍＬに達していた。通電の有無による大腸菌の生育促進効果に対して水素発生量が顕著に多いこと、培養期間中に対電極からの活発なガス発生が目視にて確認されたことから、この水素発生は対電極における電極反応に依存しているものと考えられた。次に、実験的に水の電気分解の寄与を評価するために、大腸菌非存在下、同一条件で通電試験を行ったところ、水素発生量は２．３ｍＬ±０．９５ｍＬと電気培養の場合と比べて顕著に低いものであり、流れた電流値も小さかった（図３４）。これに対し、大腸菌存在下で通電試験を行った場合には、流れた電流値が顕著に増加していた（図３４）。よって培養過程における対電極１０からの大量の水素発生には大腸菌が寄与しているものと考えられた。
【０１５８】
ここで、図３３に本発明における水素生成機構の概念図を示す。
【０１５９】
大腸菌非存在下、両電極で起こりうる反応と標準電極電位（Ｅ０ ｖｓ ＳＨＥ）は以下の通りである。
作用電極：O2 + 4H+ + 4e- = 2H2O、 E0= 1.229V ・・・・（ａ）
対電極 ：2H+ + 2e- = H2、E0= 0.000V ・・・・（ｂ）
【０１６０】
これに対し、大腸菌が存在する場合、培養槽にて乳酸分解と硝酸呼吸とが起こると共に、作用電極上での亜硝酸酸化反応が起こる。つまり、作用電極での反応が上記(ａ)から以下の（ｄ）に変化する。
硝酸呼吸：C3H6O3 + 2NO3- → C2H4O2 + CO2 + 2NO2- + 2H2O ・・・・（ｃ）
亜硝酸酸化反応：NO3- + 2H+ + 2e- = NO2- + H2O、E0= 0.835V ・・・・（ｄ）
【０１６１】
亜硝酸の酸化にて得られた２Ｈ＋は、陽イオン交換膜Ｎ１１７を透過して対極槽８に移行し、同じく亜硝酸の酸化により作用電極から対電極に流れ込んだ電子と対電極上で反応することにより、水素発生反応が起こる。
【０１６２】
ここで、対電極で起こる反応のE0は、大腸菌の有無によらず同一であるが、作用電極で起こる反応が大腸菌の硝酸呼吸によって変化するため、大腸菌存在下では非存在下と比べて水素発生に必要なΔＥが小さくなる。さらに反応（ｄ）に必要な亜硝酸は大腸菌の硝酸呼吸（ｃ）により、常に供給されるため、水素生産に必要な電子を安定して対電極に送ることが可能である。また、本実施例で使用した対電極を陽イオン交換膜が取り囲んだ形状の装置を用いたことも、効率的なプロトン移動を促して、活発な水素生産に寄与したものと考えられる。以上の条件が組み合わさった結果、水の電気分解より少ないエネルギー（理論上７６ｋＪ少ない）を投入し、大腸菌の生育促進のために電気培養をおこなうことにより、乳酸から大腸菌が引き抜いた電子を水素として回収可能となったと言える。
【０１６３】
ここで、亜硝酸の酸化により得られた電気量は、培養期間中に流れた電流値（図３４）から、２１４２Ｃと算出された。本実施例において乳酸の主要な代謝産物は酢酸であることから乳酸分解は４電子反応であり、電気培養（＋１．０Ｖ）を行った場合の乳酸分解量は約３０ｍＭであったことから、大腸菌の乳酸代謝から得られる電気量は２３１６Ｃと算出された。よって、大腸菌が乳酸から引き抜いた電子のうち、硝酸還元及び亜硝酸酸化反応を経由し、作用電極から対電極に送られた電子の割合(Coulombic efficiency)は９２．５％であると見積もられた。
【０１６４】
そして、作用電極にて回収された全ての電子が、回路内の抵抗による消費を無視し、仮に水素生成反応に用いられたとすると、上記（ｄ）の反応は、２電子反応であることから、理論上は１１．１ｍｍｏｌ（２４８．６ｍＬ）の水素が生産される計算になる。これに対し、実際の水素生産量は１６３．４ｍＬであったことから、流れた電流の６５．７％、即ち、大腸菌が乳酸から引き抜いた電子の６０．９％を水素として回収できることが明らかとなった。
【０１６５】
ここで、水素生産の側面から本実施例のエネルギー効率を計算したところ、投入電気エネルギーに対して得られた水素（燃焼熱量）としてのエネルギー回収効率は、（ＷＨ２／Ｗｉｎ）＝２０８４．９／５８９１．１８×１００＝３５．４％であった。
【０１６６】
尚、ＷＨ２は、水素の燃焼エネルギー（２８５．８３ｋＪ／ｍｏｌ）に実際の水素生産量１６３．４ｍＬのモル数（７．２９ｍｍｏｌ）を掛けて算出した。また、Ｗｉｎは、図３４に示す電流のグラフの積分値（２１４２Ａ・ｓｅｃ）に図３５に示す電圧（極間電位）のグラフの積分値（４１５８４８Ｖ・ｓｅｃ）を掛け、この値を培養期間（４２×６０×６０ｓｅｃ）で割って、算出した。
【０１６７】
以上の結果から、大腸菌が硝酸呼吸において硝酸に捨てた電子（乳酸から回収した電子）と生育促進のための電気エネルギーの一部を対電極において水素（化学エネルギー）として回収することが可能であることが明らかとなった。
【０１６８】
（実施例２）
遺伝子組換え大腸菌を用いて、通電無しの場合と電極電位を＋１．０Ｖとした場合について、実施例１の（１）の電気培養装置を用いて、実施例１と同様の方法で培養試験を実施した。
【０１６９】
遺伝子組換え大腸菌には、図２０に示すｐＵＣ１８プラスミドを大腸菌（E.coli JM109）に導入してβ−ガラクトシダーゼ生産能を発現させた大腸菌であるE.coli JM109-pUC18を用いた。
【０１７０】
通電無しの場合と電極電位を＋１．０Ｖとした場合について、培養液４に乳酸を添加して培養試験を実施し、培養期間中の菌数の経時変化を吸光度（ＯＤ６６０）により測定した。培養液より一部試料をサンプリングし、細胞を溶解した試料を粗酵素溶液としてo-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG) の分解に伴う吸光度変化および菌体濁度の測定値から菌体あたりの活性を算出し、β−ガラクトシダーゼ活性とした。尚、この実験では、ｐＵＣ１８にコードされているβ−ガラクトシダーゼ生産能の発現誘導剤として、通電開始と同時にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、β−ガラクトシダーゼの大腸菌内での生産を始めさせた。
【０１７１】
菌数の経時変化を図１８に示し、β−ガラクトシダーゼ活性を図１９に示す。電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりも菌密度が約２．５倍に増加した。また、電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりもβ−ガラクトシダーゼ活性が４．５倍に増加した。このことから、電極電位を＋１．０Ｖとすることで、通電無しの場合よりも培養槽全体におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を１１．５倍に向上できることが明らかとなった。
【０１７２】
この結果から、物質生産能を持たせた遺伝子組換え大腸菌全般、さらには物質生産能を有する微生物全般について、本発明の培養方法により硝酸呼吸能を積極的に利用して培養を行うことで、物質生産能を向上できることが明らかとなった。
【０１７３】
（実施例３）
袋状の小容器２１の密閉性と大腸菌の生育の関係について検討した。
【０１７４】
＜条件１＞
実施例１の（１）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極として、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７５】
＜条件２＞
実施例１の（５）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極として、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７６】
＜条件３＞
実施例１の（５）の電気培養装置を用い、作用電極９と対電極１０を共に炭素電極とし、サンプリングバッグをフッ化ビニル樹脂製からアルミニウム製（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に変更して、実施例１と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り（＋１．０Ｖ）と通電無しで実施した。
【０１７７】
培養試験期間中の培養液４のＯＤ６６０を測定し、菌体密度の経時変化を調査した結果を図３６と図３７に示す。図３６が通電無しの結果であり、図３７が通電有りの結果である。
【０１７８】
図３６に示される通り、通電無しの場合には条件１〜３での生育の違いは見られなかったが、図３７に示される通り、通電有りの場合には、条件１から３に向かうに従い、生育が低下する傾向が見られた。但し、図３６と図３７を比較すると、いずれの条件においても通電有りの方が最終菌体密度が高められており、いずれの条件においても通電による生育促進効果は確実に得られることが明らかとなった。つまり、袋上の小容器２１を密閉構造とすることなく、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させたとしても、本発明の効果は十分に奏されることが明らかとなった。
【０１７９】
但し、本発明の効果をより顕著なものとする上では、袋状の小容器２１を密閉構造として、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させないようにすることが好ましいことが明らかとなった。
【０１８０】
また、図３７に示されるように、条件２よりも条件３の方が生育が低下する傾向が見られたが、この現象は以下のように考察することができる。即ち、ガス回収に用いたサンプリングバッグが、条件２と条件３では異なり、条件３で使用したアルミニウム製サンプリングバッグの方が、条件２で使用したフッ化ビニル樹脂製サンプリングバッグよりも固く、膨らむためにより高い圧力を必要とすることであった。したがって、条件２よりも条件３の方が培養槽７のヘッドスペースに対電極１０から発生したガスが滞留し易くなる状況にあり、例えば培養槽４にガスが溶け込む等の影響によって、大腸菌の生育を低下させたものと考えられた。このことから、対電極１０にて発生するガスが培養槽７のヘッドスペースに移行するような形態とする場合には、培養槽７のヘッドスペースから速やかにガスを除くことが望ましいと考えられた。
【０１８１】
（実施例４）
１．実験条件
以下の４条件（Ａ）〜（Ｄ）により培養試験を実施した。
【０１８２】
＜条件（Ａ）：イオン交換膜有り、通電無し＞
実施例３の条件３にて使用した電気培養装置と同様の装置を用い、通電を行うことなく培養試験を実施した。
【０１８３】
＜条件（Ｂ）：イオン交換膜有り、通電有り＞
条件（Ａ）について、作用電極９の電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を実施した。作用電極９と対電極１０は共に炭素電極（ＢＡＳ社製）とした。
【０１８４】
＜条件（Ｃ）：イオン交換膜無し、通電有り、電極Ｃ／Ｃ＞
袋状の小容器２１とガス排出管２２を備えずに、対電極１０を直接培養液４に浸した以外は、条件（Ａ）と同様の電気培養装置を用い、作用電極９の電極電位を＋１．０Ｖとして培養試験を実施した。作用電極９と対電極１０は共に炭素電極（ＢＡＳ社製）とした。
【０１８５】
＜条件（Ｄ）：イオン交換膜無し、通電有り、電極Ｃ／Ｐｔ＞
条件（Ｃ）について、対電極１０を炭素電極から白金電極（ＢＡＳ社製）に代えて培養試験を実施した。
【０１８６】
また、サンプリングバッグに回収されたガスは、ガスの量を水上置換法を用いて分析し、ガスの組成をガスクロマトグラフィー（ＶＡＲＩＡＮ、ＣＲ４９００）で分析して、これらの分析結果を基に、水素ガス量を計算した。
【０１８７】
さらに、条件（Ａ）〜（Ｄ）において、大腸菌の代謝状況を確認するため、培養試験終了後の培養液４の乳酸濃度、酢酸濃度、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸濃度をイオンクロマトグラフィー（ICS-2000、DIONEX製）にて測定した。
【０１８８】
上記以外の培養条件は、実施例１と同様とした。
【０１８９】
２．実験結果
＜菌体密度＞
条件（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）について、菌体密度（ＯＤ６６０）の経時変化を図２７に示す。図２７に示される結果から、条件（Ａ）と比較して、条件（Ｂ）及び（Ｄ）の方が対数増殖期が長期化して定常期の菌数が増加しその傾向は、条件（Ｂ）よりも条件（Ｄ）の方が顕著であった。
【０１９０】
ここで、条件（Ｃ）については、対電極１０に用いた炭素電極が培養試験中に腐食して培養液４の色が黒色となり、菌数測定ができなかった。このことから、条件（Ｃ）においては、対電極１０が電極として十分に機能しなくなっているものと考えられた。
【０１９１】
＜極間電圧＞
条件（Ｂ）〜（Ｄ）について、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧の経時変化を図２８に示す。イオン交換膜６を設けていない条件（Ｃ）及び（Ｄ）において、イオン交換膜６を設けた条件（Ｂ）よりも、極間電圧が低下する傾向が見られた。このことから、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、極間電圧を低下させてエネルギーロスを低減する効果が奏されることが確認できた。
【０１９２】
＜電流値＞
条件（Ｂ）〜（Ｄ）について、作用電極９と対電極１０との間の電流値の経時変化を図２９に示す。条件（Ｂ）及び条件（Ｄ）において、培養対象微生物とした大腸菌の対数増殖期に対応する時期に電流値の大幅な増大が見られ、増殖の定常期に向かうにしたがって電流値が低下し、その後一定になる傾向が見られた。電流値の大きさは、イオン交換膜を設けていない条件（Ｄ）の方が大きかった。このことから、条件（Ｂ）及び（Ｄ）のいずれにおいても、微生物の増殖の過程で電子の授受が生じており、特にイオン交換膜を設けない場合において、電子の授受が活発に起こっていることが示唆された。尚、条件（Ｃ）においては、条件（Ｂ）及び（Ｄ）で見られた対数増殖期における電流値の増大が見られなかったことから、対電極１０として使用した炭素電極が電極として十分に機能しなくなっていたものと考えられた。
【０１９３】
＜水素量＞
条件（Ａ）〜（Ｄ）について、水素発生量を図３０に示す。尚、条件（Ｃ）については、上記の通り、対電極１０の炭素電極が腐食して電極として機能していなかったものと考えられることから、条件（Ｃ）の実験結果は除外して検討を行った。図３０に示される結果から、通電を行うことで、水素が大量に発生し、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことで、水素発生量が顕著に増加することが明らかとなった。
【０１９４】
＜乳酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸＞
条件（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）について、培養試験終了後の培養液４の乳酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸濃度を図３１に示す。図３１では、各有機酸毎に左から条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）の順でグラフを並べている。尚、炭素源として初期投入した培養液４の乳酸濃度は２０ｍＭである。図３１に示される結果から、イオン交換膜６を設けた場合には、プロピオン酸とギ酸を蓄積させずに培養できることが確認され、イオン交換膜６を設けずに培養を行った場合には、プロピオン酸とギ酸に加えて、酢酸とピルビン酸についても蓄積させずに培養できることが確認された。
【０１９５】
このことから、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことによって、有機酸を蓄積させることなく、有機物を最終生成物（ＣＯ２等）に分解させることができ、微生物に炭素源としての有機物を極めて効率よく利用させて培養を行うことができることが明らかとなった。つまり、イオン交換膜６を設けずに培養を行うことで、微生物の代謝産物の分解が促進され、微生物が利用できる炭素や電子が増加し、その結果として微生物の生育促進効果、対電極１０における水素発生量の増加効果が奏されているものと考えられた。
【０１９６】
尚、イオン交換膜６を設けずに培養を行う場合、培養槽７のヘッドスペースに対電極１０において発生するガスが必ず移行することになり、また対電極１０において発生するガスが培養系４に直接溶け込むことから、これらの影響による生育低下が懸念されたが、本実験結果によれば、実施例３の条件１（袋状の小容器２１を密閉構造として、対電極１０にて発生するガスを培養槽７のヘッドスペースに移行させないようにした形態）とほぼ同等の生育促進効果が得られることが確認できた。しかも、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施する場合には、装置構成の簡素化を図ることができ、極間電圧の低下によるエネルギーロスの低減を図ることができ、対電極からの水素発生量も顕著に増加させることができ、しかも代謝産物の分解を促進して炭素（栄養）源としての有機物を極めて効率よく利用できることから、本発明の培養方法を実施する上で極めて有利な形態であることが明らかとなった。
【０１９７】
（実施例５）
実施例４の条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）について、大腸菌の炭素源（栄養源）を乳酸からグルコースに代えて、同様の培養試験を実施した。
【０１９８】
結果を図３８に示す。条件（Ｄ）について、条件（Ａ）及び（Ｂ）よりも優れた生育促進効果が奏されることが確認された。
【０１９９】
また、図３９に示されるように、条件（Ｄ）について、条件（Ａ）及び（Ｂ）よりも大腸菌によるグルコース消費が促進されていることが確認できた。
【０２００】
以上の結果から、イオン交換膜６を設けずに本発明の培養方法を実施することで、炭素源を乳酸とした場合のみならず、グルコースとした場合についても、生育促進効果が奏されることが明らかとなった。
【０２０１】
尚、この結果は、例えばグルコースの代謝産物である酢酸の分解が、乳酸を炭素源とした実施例４の場合と同様に、イオン交換膜６を設けない場合に促進されることや、乳酸を炭素源とするよりもグルコースを炭素源とした方が分解に伴ってｐＨが低下し易くなるが、イオン交換膜６を設けないことで、対電極１０でのプロトンの還元反応が速やかに起こり、培養環境のｐＨの低下が抑制された状況になることによるものと推定される。
【符号の説明】
【０２０２】
２ 微生物
４ 培養液
９ 電極（作用電極）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、
前記培養液に硝酸イオンを含有させて前記微生物に硝酸呼吸をさせ、
前記培養液に電極を接触させ、
前記電極に電位を与えて、前記微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことを特徴とする電気培養方法。
【請求項２】
前記微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記大腸菌は、遺伝子組換え大腸菌である請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記電極を炭素電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行う請求項２または３に記載の培養方法。
【請求項５】
前記電極を白金電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８〜＋１．２Ｖに制御して培養を行う請求項２または３に記載の培養方法。
【請求項６】
硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能と共に物質生産能を有する微生物を培養対象微生物とし、前記微生物により物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して請求項１〜５のいずれか一つに記載の培養方法を実施し、培養過程において前記微生物により生産される前記物質を回収することを特徴とする物質生産方法。
【請求項７】
前記微生物は、物質生産能を有する遺伝子組換え大腸菌である請求項６に記載の物質生産方法。
【請求項１】
硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、
前記培養液に硝酸イオンを含有させて前記微生物に硝酸呼吸をさせ、
前記培養液に電極を接触させ、
前記電極に電位を与えて、前記微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことを特徴とする電気培養方法。
【請求項２】
前記微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記大腸菌は、遺伝子組換え大腸菌である請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記電極を炭素電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．９Ｖ〜＋１．２Ｖに制御して培養を行う請求項２または３に記載の培養方法。
【請求項５】
前記電極を白金電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８〜＋１．２Ｖに制御して培養を行う請求項２または３に記載の培養方法。
【請求項６】
硝酸イオン（ＮＯ３−）を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を生成する硝酸呼吸能と共に物質生産能を有する微生物を培養対象微生物とし、前記微生物により物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して請求項１〜５のいずれか一つに記載の培養方法を実施し、培養過程において前記微生物により生産される前記物質を回収することを特徴とする物質生産方法。
【請求項７】
前記微生物は、物質生産能を有する遺伝子組換え大腸菌である請求項６に記載の物質生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３５】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３５】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【公開番号】特開２０１１−１８２７８６（Ｐ２０１１−１８２７８６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５８９８（Ｐ２０１１−２５８９８）
【出願日】平成２３年２月９日（２０１１．２．９）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月９日（２０１１．２．９）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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