神経変性の分別診断
【課題】神経変性の特異的検出および分別検査のための新たな方法を提供する。
【解決手段】本発明は、個体の１またはそれ以上の体液中の少なくとも３つの神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを用いる、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための新たな方法であって、神経変性のタイプおよび程度が対照試料と比較して該神経学的マーカーのすべてのレベルの量的変化により反映されるものである方法。
【解決手段】本発明は、個体の１またはそれ以上の体液中の少なくとも３つの神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを用いる、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための新たな方法であって、神経変性のタイプおよび程度が対照試料と比較して該神経学的マーカーのすべてのレベルの量的変化により反映されるものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性の診断の分野に関する。本発明は、体液中の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを使用する、神経変性の分別診断のための新たな方法に関する。また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５またはα−シヌクレイン（synuclein）を検出するための新たな方法ならびに神経変性の分別診断のための組み合わせアッセイにおけるこれらの方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性はいくつかの神経学的疾患の特徴となっている。神経変性は、軸索損傷、除々に広がるニューロンの死、神経伝達物質放出または受容体機能の異常、ミエリンの破壊、ＣＮＳ血流の変化、血液／脳関門機能不全および／または変化した酸素代謝、他のＣＮＳ代謝経路における困難性および／またはＣＮＳの機能不全を引き起こす可能性のある種々の他のしばしば不明な様相を包含しうる。今日では、異なる疾患は異なる神経機能不全の様相に関連している（概説としてはWilson et al., 1991参照）。例えば、アルツハイマー病は、大脳皮質中の神経細胞の死および消失が関与するすべての神経変性疾患のうち最も重要なものである。それは最も普通に起こる老人の痴呆であり、患者および家族の苦難ならびに当該疾病により完全に無能となった患者の長期のケアに必要なコストによる経済的損失を引き起こす。前頭側頭葉痴呆は初期の変性的痴呆の２番目にありふれたタイプであり、全痴呆患者の約３〜１０％を占める（Brun, 1993; Knopman, 1993）。臨床的特徴は優勢な前頭葉症候群の存在により特徴づけられ（Sjogren, 1997）、それは情緒障害および精神分裂病のような他の障害においても観察される（Abbruzzese et al, 1997）。レービー小体疾患は、進行性の痴呆または精神病とともに存在する疾病である。発症時には不存在であるかまたは穏やかであるが最終的には通常の堅固なものとなるなパーキンソン病の徴候は、一般的には重症である。レービー小体は脳幹、基底核、視床下部核および新皮質に多く見られる。パーキンソン病は人生の半ば以降に起こるレービー小体疾患の１つのタイプであり、非常にゆっくりと進行し、長い経過をたどる。それは、主に黒質線状体ドパミン作動性系に関連したニューロン系の疾患の一例と考えられる。一方、脳血管性疾患は、脳血管に関連したいくつかの病理学的プロセスの１つにより引き起こされる。それは発展途上国における心臓疾患および癌の後の３番目に主要な死亡原因であり、１０００００人につき７９４人の割合である。６５歳以上の人工のうち５％が卒中、すなわちこれらの病理学的プロセスの１つの結果として生じる急性の神経学的傷害にかかる。神経変性はある種の化合物（表１）、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントに曝露されることによっても起こる。小児白血病および脳腫瘍に対する長期の治療（または予防）により併発される病気は、行動の変化、学業不振、記憶力低下、知能減退、成長遅延、ホルモン混乱、および異常なＣＴスキャン（脳萎縮、脳室拡張、脳内石灰化）を包含する。白血病生存者における知恵遅れ（ＩＱ、記憶力、注意力、視覚空間認識能の欠乏）（Fletcher et al., 1988）または認識機能低下（Ochus et al., 1991）は、それぞれ、放射線照射後あるいは頭蓋照射を行わない化学療法の後に観察された。さらに、４歳未満の小児は、頭蓋放射および／または化学療法の神経毒性効果に対して特に感受性がある（Moore et al., 1986; Jannoun et al., 1983）。大部分の薬剤に関しては、高用量治療、組み合わせ化学療法、当該照射併用、および頸動脈内または鞘内注射が、標準的な経口または静脈内治療よりも神経学的合併症を引き起こす可能性が高い。神経系のいずれかの部分が損傷を受ける可能性がある。癌患者はより攻撃的に治療を受け、化学療法剤をより多く投与され、長く生き、新しい化学療法剤が開発され、現存している薬剤がより意図的または新規な方法で使用されるので、癌の化学療法による神経学的合併症はよりありふれたものとなり、重症で複雑なものとなるであろう。
【０００３】
患者が一般的な医学的ケアを必要とする大部分の神経学的症状は、容易に示される疾病のプロセスによる。疾患部位およびその原因に関する正しい診断を行うための神経学的分析方法を開発することが臨床研究者の任務である。正確な診断後にのみ、疾病の効果的な管理および治療が可能である。能の機能および構造の研究を可能にするポジトロン放出核種トモグラフィー（ＰＥＴ）、単一フォトン放出核種コンピューター計算トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）および核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲＳ）のごとき患者における神経変性のいくつかの診断方法が開発されている。しかしながら、大部分の神経学的疾患は、疾患の他の形態の排除に基づいて臨床的に診断され、いくつかの場合には異なる神経学的疾患を区別することさえ不可能である。例えば、レービー小体タイプの痴呆あるいはレービー小体痴呆（ＬＢＤ）は神経弛緩剤に対して感受性があり、アルツハイマー病と区別することが臨床的に非常に困難である（McKeith et al., 1996; Ballard et al., 1998）。大部分の患者（７５％以上）は神経病理学的にアルツハイマー病であると決定されるが、臨床的にアルツハイマー病であると決定された患者の１５ないし２５％はレービー小体痴呆を有する（Hooten et al., 1998）。レービー小体痴呆はアセチルコリンエステラーゼでの治療により感受性があるので、アルツハイマー病からのレービー小体痴呆の分別は治療最適化にとり必須である（Levy et al., 1994; Perry et al., 1994; Wilcock et al., 1994）。
【０００４】
前頭側頭葉痴呆は、その徴候が他の疾患においても観察されうるので、しばしば他のタイプの痴呆または他の精神病と誤診される。
【０００５】
血管性疾患とアルツハイマー病との間に明確な相違はなく、誤診の危険性が明らかである。血管性疾患の薬理学的治療は可能なので、早期の正しい診断が重要である。
【０００６】
ある種の化合物、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントのごとき誘発薬剤により引き起こされる脳の損傷に関する認識および治療は、大部分の神経学者に対して頻繁かつ重要な臨床的な問題を残す。臨床的診断が疑わしい場合、神経病理学的試験により最終的な診断を決定的に行うことができる。そのようなものとして、正確かつ分別的な神経変性に関する診断が死亡後にのみ可能となる。それゆえ、患者における神経学的疾患の早期検出ならびに異なる薬剤により誘導された神経学的変化のモニタリングのための方法は、誘発剤への曝露を継続できるかどうか、適当な用量および薬剤が個々の患者に使用され、正しい治療の開始のために使用されるかどうかを決定するための助けとなるであろう。
【０００７】
最近になって、細胞死、軸索成長／再誘導、炎症および／または血液脳関門機能不全に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）の症状を反映する多くの神経学的マーカーが利用できるようになった。
【０００８】
例えば、微小管関連蛋白タウ（tau）は対になった螺旋フィラメント（ＰＨＦ）および神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）の主要蛋白成分である（Brion et al., 1985; Delacourte and Defossez, 1986; Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986; Kondo et al., 1988）。タウ蛋白は異なるイソ形態として存在し、それらのうち４ないし６種は成人脳に見られるが、１のイソ形態だけは胎児脳において検出される。イソ形態の多様性は、ｍＲＮＡスプライシングによりヒト染色体１７上の単一遺伝子から生じる（Himmler, 1989; Goedert et al., 1989; Andreadis et al., 1992）。分子クローニングから推定されるタウ蛋白の最も著しい特徴は分子のカルボキシ末端部分に存在する３１または３２個のアミノ酸の並びであり、３回または４回繰り返されることがある。さらなる多様性はタウ分子のＮＨ２末端における２９ないし５８個のアミノ酸の挿入により生じる（Goedert et al., 1989）。インビボにおいて、タウは、そのリピート領域（２５５〜３８１）中に局在化する微小管結合ドメインに関連する相互作用によって微小管アッセンブリーおよびニューロンの軸索コンパートメントの安定性を促進する（Lewis et al., 1988）。正常な環境において、成人脳はタウ１分子あたり２〜３分子のリン酸根を含む（Selden and Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al., 1992）。ラットおよびヒトにおいて研究された正常タウにおける異なる部位でのリン酸化は発達状態に依存している（Lee et al., 1991; Bramblett et al., 1993; Goedert et al., 1993）。リン酸化の結果として生じる６０、６４および６８ｋＤａのタウ変種が、神経原性線維のもつれを示す脳の領域において検出されている（Delacourte et al., 1990; Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990; Greenberg and Davies, 1990）。これらの脳はタウ１分子あたり６〜８個のリン酸根を含む（Ksiezak-Reding et al., 1992）。ＰＨＦから単離されたタウ（ＰＨＦ−タウ）において、リン酸化は数個の位置において起こっている（Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992）。いままでのところ、脳抽出物中のホスホ−タウの検出は、抗体によって（Mab Alz50: Ghanbari et al., 1990; Mab Ab423: Harrington et al., 1991; Mab AT120: Vandermeeren et al., 1993; Mab AT180; Mab AT270: WO95/17429として公開された国際特許出願ならびにMab AT8: WO93/08302として公開された国際特許出願）あるいは分子量の変化によって（Flament et al., 1990）あるいは機能のアッセイ（Bramblett et al., 1992）による他の方法により行われており、その検出により、変化した細胞骨格特性に関連した痴呆対象と正常な老人対象とを、あるいは他のタイプの痴呆患者とが識別されている。リン酸化されていないタウのエピトープを認識する個々のモノクローナル抗体の組み合わせを用いて、脳脊髄液中のタウおよびＰＨＦ−タウの存在が検出されている（Van de Voorde et al., 1995）。
【０００９】
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）のガンマサブユニットはニューロン細胞質の主要構成成分である（Kato et al., 1981）。ＮＳＥは可溶性脳蛋白の３％を占める。成人において、それは虚血、感染または腫瘍起源の活性ニューロンのダメージを評価することにおいて有用であると考えられている（Garcia et al., 1994）。小児血清中のＮＳＥについては研究されていない。Neraら（1988）は、脳脊髄液中または血清中の高レベルのＮＳＥが昏睡状態の小児における効果の乏しさおよび死亡と関連性があることを示した。しかしながら、増加した血清ＮＳＥは必ずしもＣＮＳ起源ではない。末梢ニューロンを含むいくつかの組織、内分泌腺、リンパ球、赤血球、ならびに血小板はＮＳＥを含み（Kaiser, 1989）、このマーカー単独での使用に対する妨げとなりうる。
【００１０】
４０〜４３個のアミノ酸の長さのβ−アミロイドは、アミロイド前駆体蛋白またはＡＰＰと呼ばれる大きな前駆体蛋白の蛋白分解的開裂により生じる。アミロイドは正常細胞の代謝の間に生成される。アミロイドペプチドは高度な異種性を示す。β−アミロイドの２つの主要な形態が同定されており、β−アミロイド（１−４０）およびβ−アミロイド（１−４２）である。β−アミロイド（１−４２）はアルツハイマー病、ダウン症候群および正常な老人の脳の神経突起プラークの主要構成成分である。それは神経毒性であるかもしれず、他の損傷に対するニューロンの弱さを増すことが知られている。さらに、低濃度の可溶性アミロイドは、同時に生じる神経毒性に依存しないコリン作動性活性の低下を誘導しうる。アセチルコリンは認識プロセスにおいて重要な役割を果たしている（Auld et al., 1998）。十分に定義されたペプチドのエピトープを特異的に認識する高親和性モノクローナル抗体の開発により、未濃縮脳脊髄液中のβ−アミロイド（１−４２）ペプチドに関する簡単な試験が可能となった（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）。この試験は薬剤、放射線照射、またはＡＰＰプロセッシングを妨害する化学物質のモニタリングにおいて価値を有することも証明されている。
【００１１】
ニューロモジュリンまたはＢ−５０とも呼ばれる成長関連蛋白−４３（ＧＡＰ−４３）は神経組織特異的蛋白であり、主に軸索および前シナプス末端に局在化している。ＧＡＰ−４３は、ニューロン成長、神経突起形成、ならびに再生およびニューロン新芽形成において役割を果たしていると考えられている（Skene and Woillard, 1981; Basi, 1987; Benowitz et al., 1989; Mercken et al., 1992a）。シナプス蛋白はシナプス機能において異なった役割を有している。シナプシンのごとき蛋白は、融合に利用可能な小胞の量を決定することにおいて重要であるが、Ｒａｂ３およびラブフィリンは膜に対して小胞を標的化することにおいて重要である。ドッキングのプロセスはシナプトブレビン、ＳＮＡＰ２５、Ｓｅｃおよびシンタクシンの分子複合体によって決定されているが、ＣＳＰおよびシナプトタグミンは小胞内容物のＣａ２＋依存性放出において重要な役割を果たすと考えられている。アルファ−シヌクレイン（synuclein）は黒質および基底核のシナプスにおいて豊富であり、α−シヌクレインおよびγ−シヌクレインを包含する蛋白のファミリーに属している。
【００１２】
体液中に存在し、安定であり、中枢神経系におけるニューロンの代謝状態を反映するかかる細胞内マーカーは、臨床的徴候が存在する前でさえも、神経変性の早期認識において有用であるかもしれない。可能ならば他の診断方法と組み合わせて使用できるニューロン機能に関する生化学的指数は、神経変性の臨床的な診断の正確さおよび治療的モニタリングを改善することを大きく促進するであろう。
【００１３】
アルツハイマー病は豊富な老人斑、細胞内のもつれおよびシナプスの損失により特徴づけられる。タウおよびβ−アミロイド（１−４２）はこれらのもつれおよびプラークのそれぞれの必須成分であり、これらはＡＤの神経病理学的試験における２つの診断構成要素である。タウおよびβ−アミロイド（１−４２）は両方とも脳脊髄液（ＣＳＦ）中において検出され、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）がアルツハイマー病の神経学的マーカーとして使用可能であるということは現在十分に確認されているが、ＣＳＦにおけるいかなる変化がアルツハイマー病の病理生理学に関係しているのかはまだ知られていない。ＣＳＦ−タウは、同年齢の対象と比較するとアルツハイマー病患者において増加しており、脳におけるもつれの数に関連しているが、一方では、アルツハイマー病においてβ−アミロイド（１−４２）は減少している。老人性の、散在性のプラークを伴わない痴呆、例えば前頭葉痴呆においてβ−アミロイド（１−４２）が減少していることが見出されているので、おそらくβ−アミロイド（１−４２）はプラーク形成には関連していないであろう。脳組織に関する研究は、プラークともつれが痴呆の程度に関連していることを示唆しているが、Mini-Mental Stateにより決定したところＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）のレベルは一貫して痴呆の程度に関連しているわけではなく、同様に存在している他のタイプの痴呆と重複している。アルツハイマー病患者におけるベータ−アミロイド（１−４０）のレベルは正常対照と比較して変わりがないので（Motter et al., 1995）、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）に加えてβ−アミロイド（１−４０）を神経学的マーカーとして使用すること（Soji et al., 1998；非特許文献１）は、アルツハイマー病の診断アッセイを改善するものではない。
【００１４】
脳のＧＡＰ−４３に関する研究は、アルツハイマー病の前脳皮質においてそのレベルが低下するが、他の領域ではそのレベルが上昇することを示唆している（Coleman et al., 1992）。痴呆性疾患の患者の体液中のＧＡＰ−４３に関する研究はまだ行われていない。
【００１５】
ＡＤ患者の脳におけるもう１つの重要な構造上の変化はシナプスの損失である。実際に、もつれ、プラークおよびシナプス損失を測定する最近の研究は、主にシナプス損失が痴呆の程度に関連していることを示唆している（Terry et al., 1991）。シナプス損失の研究において、シナプトフィシンの免疫反応性の低下が観察された。他のシナプス蛋白：シナプトタグミン、Ｒａｂ３ａ、シナプトブレビンおよびシンタクシンについても同様の減少が報告されている（Blennow et al., 1996; Davidsson et al., 1996; Shimohama et al., 1997; Ferrer et al., 1998）。また、いくつかの形態のパーキンソン病に関して、シナプス蛋白が病理学的役割を果たしていることが強く示されている。２種のまれな形態の家族性パーキンソン病のα−シヌクレインにおいて２つの変異が検出され、α−シヌクレインはレービー小体中の主成分として特徴づけられた。インビボにおけるレービー小体の形成はシヌクレインの蓄積により生じる可能性があり、シヌクレイン蓄積は迅速な軸索輸送の減少またはシヌクレインの過剰発現に結果である可能性がある（Jensen et al., 1998）。シナプス蛋白は主に痴呆の程度と関連があるように思われる（Terry et al., 1991）ので、体液中のシナプス蛋白の検出および定量方法を提供することは有用であろう。ＣＳＦ中のシナプス蛋白の存在および定量はまだ十分に開発されていない。クロモグラニンはＣＳＦ中のシナプス損失のマーカーとしてすでに使用されているが、減少は「純粋」なまたはタイプＩのアルツハイマー病においてのみ示されている（Blennow et al., 1995）。その後まもなくシナプトタグミンＩがＣＳＦ中に存在することが示された（Davidsson et al., 1996）。この研究において、アルツハイマー患者の左側の海馬体および前頭皮質のBrodmann領域９においてシナプトタグミンが選択的に減少することが示された。ＣＳＦの貯留物に基づいて、この減少がＣＳＦにも存在する可能性が示唆されたが、定量されていない。Davidssonら（1996）はＣＳＦ中のＲａｂ３およびシナプトフォシンを検出することができなかった。
【００１６】
また、ある種の化合物、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントへの曝露により誘発される神経変性に関しては、正確な診断ツールが使用できない。周産期仮死は神経学的後遺症に関連している可能性がある。しかしながら、低酸素−虚血イベント後の早期の正確な評価は新生児ケアにおける最も困難な問題の１つとなっている。現在に至るまで、脳の血流の研究と組み合わされた臨床的な脳電図による評価、および神経放射線学的評価が最も容易に利用できる方法である。変化した脳の代謝活性がＣＳＦ中の成分の変化に反映されるということが除々に明らかになってきたので、ＣＳＦの神経学的マーカーの検出は低酸素−虚血イベントの評価におけるデータを補うものとなる可能性がある（Garcia-Alix et al., 1994）。化学療法、放射線照射または低酸素−虚血イベント後のＣＳＦの神経学的マーカーと行動の変化とのリンクについては全く調べられていない。
【非特許文献１】Soji M, Matsubara E, Kanai M, Watanabe M, Nakamura T, Tomidokoro Y, Shizuka M, Wakabayashi K, Igeta Y, Ikeda Y, Mizushima K, Amari M, Ishiguro K, Kawarabayashi T, Harigaya Y, Okamotot K, Hirai S (1998) J Neurol Sci 158: 134-140.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、個体における神経変性の特異的検出、定量、および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるアルツハイマー病の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるレービー小体疾患の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるパーキンソン病の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体における前頭側頭葉痴呆の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、パーキンソン病とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、レービー小体疾患とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のための方法、ならびに異なる形態のアルツハイマー病の分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、化学療法により、あるいは化合物または放射線照射に対する曝露により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、白血病または脳腫瘍の治療を受けた個体における、化学療法により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、周産期仮死により生じる神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白Ｒａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体における神経変性の、より特異的検出、定量および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病の、より特異的検出、定量および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白α−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるより特異的な検出、定量、および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病および／またはレービー小体疾患の、より特異的な検出または定量を可能にする、ならびに／あるいはレービー小体疾患とアルツハイマー病との分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、上記方法を行うための診断キットを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、特定の治療の有効性の治療モニタリングおよび／または決定のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を行い、体液中の特定の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを用いると、正確かつ迅速な神経変性の特異的検出および分別検査ができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、
（１）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程：
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法：
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；
（２）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも３種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー：
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
の組み合わせを認識するものであるか；あるいは
少なくとも２種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち１つが２つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ：
−タウ、β−アミロイド（１−４２）；または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
のいずれかを認識するものである、キット；
（３）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）を一緒にあるいは別個に含む支持体；
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）；
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー；
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、（２）に記載のキット；
（４）（１）に記載の方法を行うために特別に設計された（２）または（３）に記載のキット
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、体液中の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを使用する、神経変性の特異的検出および分別検査のための新たな方法が提供される。本発明により、正確かつ迅速な神経変性の特異的検出および分別検査を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、個体中の神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための方法に関する。これらの方法は、該個体の１つまたはそれ以上の体液試料中の少なくとも３つの神経学的マーカーのレベルを決定することを包含するものであり、該方法により、神経変性のタイプおよび程度が、対照試料と比較した場合の該神経学的マーカーすべてのレベルの量的変化により反映される。
【００２２】
本願の実施例からわかるように、少なくとも３つの神経学的マーカーの使用により、より特異的かつ高感度な神経変性的症状の検出が可能となった。少なくとも３つの神経学的マーカーの使用により、臨床診断を基礎としては分別できなかった多くの神経学的症状間の識別が可能となったことも明らかである。
【００２３】
本明細書の用語「神経変性」および「神経変性的症状」は同じ意味であり、本明細書において混用される。これらの用語は、神経の機能不全に関連した脳症状を包含する。神経変性に関連した種々の疾病はWilson et al. (1991)において引用されている。それらはアルツハイマー病、卒中（集中性脳傷害）、散在性脳傷害、血管性疾患、パーキンソン病、レービー小体疾患、クロイツフェルド・ヤコブ（Creutzfeld Jacob）病、前頭側頭葉痴呆、ギラン・バレ（Guilain Barre）症候群、多発性硬化症、正常圧水頭、筋委縮性側索硬化症、分裂病、鬱病、神経ラチリズム、転換および仮死を包含する。しかしながら、このリストは完全なものではない。神経機能不全に関連していることが知られている他の疾患も包含される。神経変性は、神経機能不全に関連しており、薬剤を包含する特定の原因により引き起こされるいずれかの種類の脳のダメージまたは脳のいずれかの症状も包含する。本発明の好ましい具体例において、特に検出、定量および／または分別診断される神経変性的症状は、アルツハイマー病、レービー小体疾患、パーキンソン病および前頭側頭葉痴呆からなる群より選択される。「レービー小体疾患」は、脳幹、基底前脳、視床下部核および／または新皮質におけるレービー小体を示すいずれかの疾患について用いる。レービー小体疾患はパーキンソン病、多発性全身性萎縮症およびレービー小体痴呆を包含する。
【００２４】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、特に検出、定量および／または分別診断される神経変性的症状は、低酸素−虚血イベント、化学療法、放射線療法により、あるいは化合物または放射線に対する曝露により誘導されるものである。より詳細には、神経変性は、白血病または脳腫瘍の治療の間に化学療法または放射線療法により誘導されうる。
【００２５】
しかしながら、この神経変性的症状のリストは不完全である。脳の機能不全が起こる他の症状も包含される。
【００２６】
本明細書の「神経変性の特異的検出」なる表現は、３つ未満の神経学的マーカーを診断に使用した場合に得られるよりも、特定の神経変性的症状に対する関連性を有する特定の疾患または特定の神経学的疾患の原因に関して、より高い感度および特異性が得られることを意味する。
本明細書の表現「神経変性の定量」は、特定の神経変性的症状による神経の機能不全の程度が測定されることを意味する。
本明細書の表現「神経変性の分別診断」は、神経学的障害の特定の疾患または特定の原因が特定の神経変性的症状に関連している種々の神経変性的症状を識別することをいう。
【００２７】
個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断は、下記工程を含むイムノアッセイを用いて、該個体の１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３つの異なる神経学的マーカーの検出により行われる：
該個体から１またはそれ以上の体液試料を得ること；および
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下において、体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該体液試料を接触させること；および
該体液試料に対する該抗体の免疫学的結合を検出すること；
対照試料と比較して、該神経学的マーカーすべてのレベルの量的変化に反映される神経変性のタイプおよび程度を該体液中の該神経学的マーカーのレベルに基づいて推断すること。
【００２８】
次いで、免疫学的結合の検出のための方法を行うことができ、該方法は、抗原および神経学的マーカーの１つを認識する抗体により形成された該抗原−抗体複合体を下記のものと混合することにより行われる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体は、抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であって、好ましくは固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたポリクローナル抗体であってもよい
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付する、あるいは特異的にカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかのマーカー
ｃ）抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応、を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）また可能ならば、標準化する目的で、神経学的マーカーの検出に使用する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００２９】
有利には、本発明に使用する抗体は適当な支持体上に固定化される。抗体は３つまでの（３つよりも多い神経学的マーカーを検出する場合には３つよりも多い）異なった支持体または同じ支持体上に存在していてもよい。抗体が同じ支持体上に（例えば、１のマイクロタイタープレートのウェル）に存在する場合、それらそれぞれの免疫学的結合を特異的マーカーにより検出してもよい。あるいはまた、抗体は同じ支持体の別々の位置に存在してもよい。その場合、これらの抗体のいずれかの免疫学的結合を検出する汎用マーカーを用いて検出を行ってもよい。有利には、ニ次抗体自身がマーカーとの直接または間接的カップリングのためのマーカーまたは基を担持しているものである。あるいはまた、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いて本発明の方法を実施してもよい。
【００３０】
用語「エピトープ」は、抗体結合部位により特異的に結合される抗原−抗体複合体の部分をいう。エピトープは当該分野で知られた方法により決定でき、あるいは当該分野で知られた種々のコンピューター推定モデルにより推定できる。
本明細書の表現「認識」、「〜と反応」、「免疫学的結合」または「抗原−抗体複合体」は、抗体および抗原の免疫学的特性を考慮したすべての条件下で抗原と抗体との間の結合が起こることと解釈すべきである。
用語「体液」は、血液、リンパ液、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）（これらに限らない）を包含する人体に存在するすべての液体をいう。
【００３１】
特別な具体例において、本発明は、体液試料が脳脊髄液試料および血液試料からなる群より選択されるものである上記方法に関する。血液試料は患者から採取される全血試料を包含する。より好ましくは、血液試料は血漿試料または血清試料を包含する。
【００３２】
本発明の方法において、２つの異なる体液中の同じマーカーを検出すること（少なくとも他のマーカーの検出と組み合わせて）、あるいは３つの異なる体液試料中の同じマーカーを検出することも可能である。例えば、脳脊髄液中において２つの神経学的マーカーが検出され、これらの神経学的マーカーの一方が血漿中においても検出される。実施例に示すように、２つの異なる体液中の同じマーカーの検出は、１の体液中においてのみこのマーカーを検出する場合と比較して、より特異的かつ高感度な検出ならびに神経変性のより良い分別診断を可能にする。
【００３３】
本発明の方法において検出される神経学的マーカーは、特定のタイプの神経細胞または細胞機能に関連したいずれの蛋白であってもよく、神経変性の条件下において１またはそれ以上の体液中のそのレベルが疾病のプロセスまたは神経学的疾患の原因を示すものである。特定の神経学的条件下において、１またはそれ以上の体液中のある神経学的マーカーは増加し、またある神経学的マーカーは減少する。特定の神経学的条件下における特定の体液中において変化したレベルを有する３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の神経学的マーカーの可能な組み合わせを、個体における該神経学的症状の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用可能な神経学的マーカーは：タウ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、シナプス蛋白（Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、α−シヌクレイン、シナプシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、シンタキシン、ラブフィリン、ｎ−ｓｅｃ、システインストリング蛋白および他の蛋白）、グリア細線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、１００、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ニューロフィラメント（ＮＦ）、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）および１４−３−３を包含する。しかしながら、これらに限らない。特定の疾病プロセスまたは神経学的疾患の原因を示す他の神経学的マーカーを使用することもできる。異なる神経学的疾病および脳損傷にかかっている患者体液中のこれらの神経学的マーカーのうちいくつかの挙動を表２に示す。
【００３４】
調製された、あるいは当該分野において存在するモノクローナル抗体であって、上記神経学的マーカーの１つを認識するモノクローナル抗体を神経学的マーカーの検出に使用することができる。タウを特異的に認識する抗体はAlz50 (Ghanbari et al., 1990), Ab423 (Harrington et al., 1991), AT8 (WO 93/08302として公開された国際出願), AT120 (Vandermeeren et al., 1993); AT180 および AT270 (WO 95/17429として公開された国際出願) および AT100 (WO 96/04309として公開された国際出願)を包含する。しかしながら、タウを特異的に認識する、当該分野で知られた他の抗体を用いることもできる。ＮＳＥを特異的に認識する抗体は１０Ｃ１および２Ｅ７ならびにInnogenetics (Gent, Belgium) から入手できる他のもの, Dako (Glostrup, Denmark; Cat No BBS/NC/VI-H14)から入手できるような市販されている抗体, Biogenex (San Ramon, CA, USA; Cat Nos MA055-5C and AM055-5M)、RDI (Flanders, NJ, USA; Cat No RDI-TRK4N6)、Diagnostic Systems (Basel, Switzerland; Cat No 07 34373)、Immunosource (Brussels, Belgium; Cat Nos CLA 73/5 and CR7041M)およびCortex Biochem (San Leandro, CA, USA; Cat No CR7047)から入手できるもの等を包含する。ＮＳＥを認識する抗体のリストは完全でなく、当該分野において利用または記載されている抗体であって、ＮＳＥを認識するものを用いることもできる。β−アミロイドを特異的に認識する抗体は2H3, 8E5 (Johnson-Wood et al., 1997), 10H3 (Majocha et al., 1992; Friedland et al., 1994), 2G3 (Citron et al., 1996), BA-27 and BC-05 (Suzuki et al., 1994), BNT77 (Asami-Odaka et al., 1995), 369.2B (Koenig et al., 1996), 22C11 (Lannfelt et al., 1995), 6E10 (Kim et al., 1990) および AMY-33 (Stern et al., 1990)を包含する。しかしながら、当該分野において知られた、β−アミロイドを特異的に認識する他の抗体を用いてもよい。ニューロモジュリンを特異的に認識する抗体は、NM2 (Oestreicher et al., 1994), NM4 (Six et al., 1992), NM1, NM3, NM6, NM7 および NM8 (Mercken et al., 1992a)を包含する。しかしながら、ニューロモジュリンを特異的に認識する、当該分野で知られた他の抗体を使用してもよい。Ｒａｂ３ａを特異的に認識する抗体は市販されている抗体を包含し、例えば、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号R35520)から入手可能である。ＳＮＡＰ２５を特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Serotec (Oxford, UK; Cat No SP12)、Sternberger Monoclonals Inc. (Distributed by Affinity Research Products Lim., Mamhead, Exeter, UK; Cat No SMI-81)、Chemicon (Temecula, CA, USA; Cat No MAB331) および Transduction Labs (Lexington, KY, USA; Cat No S35020)から入手できる。ＳＮＡＰ２５を認識する抗体のリストは完全でなく、市販されている、あるいはＳＮＡＰ２５２を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。α−シヌクレインを特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号S63320)から入手可能である。市販されている、あるいはα−シヌクレインを認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。神経学的マーカーとして使用できる他のシナプス蛋白の特異的検出のために、種々の抗体が市販されており、そして／あるいは当該分野において知られている。Ｓ１００を特異的に認識する抗体は市販されており、例えば、Biogenex (San Ramon, CA, USA; Cat Nos MA058-C および AM058-5M) および Innogenetics (Gent, Belgium; Cat No M-011)から得られるものである。Ｓ１００を認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいはＳ１００を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。１４−３−３を特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA; Cat No sc-1657) および Transduction Labs (Lexington, KY, USA; Cat No F46820)から得ることができる。１４−３−３を認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいは１４−３−３を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。ニューロフィラメントを特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Innogenetics (Gent, Belgium; Cat Nos M-011 および M-005) および Alexis (Laeufelfingen, Switzerland; Cat Nos BC-4000-A-L001 および BC-4010-A-L001)から得ることができる。ニューロフィラメントを認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいはニューロフィラメントを認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。
【００３５】
Fab、F(ab)’2、ssFv（１本鎖可変フラグメント）のごときこれらのモノクローナル抗体に由来するフラグメント、ならびに抗体の可変領域を保持している構築物のような他の抗体であって、元の結合特性を保持しているものを本発明の方法に使用することもできる。一般的には、かかるフラグメントは、例えばパパイン、ペプシンまたは他のプロテアーゼのような酵素での消化により得られる。モノクローナル抗体、またはそのフラグメントを種々の用途のために修飾できることが、当業者によく知られている。ミニ抗体およびジアボディー、トリアボディー、４価抗体およびペプタボディーのごとき多価抗体を本発明の方法に使用することもできる。これらのフラグメントおよび多価抗体の調製は国際特許出願ＷＯ９８／２９４４２に詳述されている。
【００３６】
本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体は、ＨまたはＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列から、あるいはＨまたはＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから組み換えＤＮＡ法によって作成されるマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであってもよい。あるいはまた、本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワークの少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００３７】
本発明の方法に使用される抗体を、酵素、蛍光または放射活性タイプの適当な標識で標識してもよい。
【００３８】
本発明の特別な具体例において、上記方法において検出される神経学的マーカーの少なくとも１つは、タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、ニューロン特異的エノラーゼおよび／またはシナプス蛋白からなる群より選択される。上記群から１つが選択される３、４、５、６、７、８つまたはそれ以上のマーカーの可能な組み合わせを、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。本発明の方法いおいて使用される１つよりも多い（すなわち、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上またはすべての神経学的マーカー）を上記群から選択することができる。
【００３９】
本発明のより特別な具体例において、上記方法において検出される１つ、より好ましくは２つ、最も好ましくは３つの神経学的マーカーを下記群から選択する：
タウ、β−アミロイド（１−４２）、およびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）。
【００４０】
より特別な具体例において、体液中、好ましくはＣＳＦ中においてタウを検出し、２種の異なる体積、好ましくはＣＳＦおよび血漿においてβ−アミロイド（１−４２）を検出する。
【００４１】
もう１つのより特別な具体例において、上記方法において検出される少なくとも１つの神経学的マーカーは、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５およびα−シヌクレインからなる群より選択されるシナプス蛋白である。上記シナプス蛋白の群からそのうち１つが選択されている３、４、５、６、７、８またはそれ以上のマーカーを、個体の神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。
【００４２】
したがって、本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、Ｒａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００４３】
Ｒａｂ３ａを特異的に認識する抗体を脳組織中のＲａｂ３ａの検出に利用することができるが、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの検出の証拠はない。Davidssonら（１９９６年）は彼らの方法を用いることによっては脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出することができなかった。脳脊髄液中のＲａｂ３ａの特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号R35520)から得ることができる。
【００４４】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００４５】
次いで、抗原およびＲａｂ３ａ認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、Ｒａｂ３ａまたはＲａｂ３ａ−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、Ｒａｂ３ａを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００４６】
本明細書の実施例に示すように、ポリクローナルＲａｂ３ａ血清をディテクター抗体として使用してもよい。
【００４７】
有利には、二次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００４８】
本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するための新たな検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、ＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００４９】
ＳＮＡＰ２５を特異的に認識する抗体を脳組織中のＳＮＡＰ２５の検出に利用することができるが、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５の検出の証拠はなく、これまで検出が示されていない。
【００５０】
脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５の特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Serotec (Oxford, UK;カタログ番号SP12)、Sternberger Monoclonals Inc. (Affinity Research Products Lim., Mamhead, Exter, UK;カタログ番号SMI-81)、Chemicon (Temecula, CA, USA;カタログ番号MAB331)またはTransduction Labs (Lexington, KY, USA, カタログ番号S35020)から得ることができる。
【００５１】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００５２】
次いで、抗原およびＳＮＡＰ２５認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、ＳＮＡＰ２５またはＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、ＳＮＡＰ２５を認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００５３】
本明細書の実施例に示すように、ポリクローナルＳＮＡＰ２５血清をディテクター抗体として使用してもよい。
【００５４】
有利には、ニ次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００５５】
本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するための新たな検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００５６】
α−シヌクレインを特異的に認識する抗体を脳組織中のα−シヌクレインの検出に利用することができるが、脳脊髄液中のα−シヌクレインの検出の証拠はない。脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在はこれまで報告されていないので、α−シヌクレインがＣＳＦ中に存在するかどうかは疑わしいものであった。本発明は、はじめてα−シヌクレインが脳脊髄液中に存在することを示すことができた。さらに、脳脊髄液中のα−シヌクレインの定量的検出のための正確な方法が開発された。また本発明者は、レービー小体疾患（これに限らない）を包含するある種の神経変性条件下においてα−シヌクレインが変化することも示した。
【００５７】
脳脊髄液中のα−シヌクレインの特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Transduction Labs (Lexington, KY, USΑ, カタログ番号R35520)から得ることができる。
【００５８】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。可能ならば、この固定化状態は抗ＩｇＧで被覆されたあるいは被覆されていないマイクロタイタープレートであってもよい。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００５９】
次いで、抗原およびα−シヌクレイン認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、α−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００６０】
有利には、二次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００６１】
好ましい具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出するためのこれらの方法を、１またはそれ以上の他の神経学的マーカーの検出方法と組み合わせて使用して、個体における神経変性を特異的に検出、定量および／または分別診断することができる。
【００６２】
さらに好ましい具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出するためのこれらの方法を、タウ、ホスホタウ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）からなる群より選択される１またはそれ以上の神経学的マーカーの検出方法と組み合わせて使用することができる。
【００６３】
より詳細には、神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用されるマーカーを下記の群から選択することができる：
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはＲａｂ３ａ；あるいは
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはＳＮＡＰ２５；あるいは
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはα−シヌクレイン。
【００６４】
上記群からの３、４、５、６または７つの可能なマーカーを、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。
【００６５】
もう１つの具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出する方法を組み合わせて使用して、神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断を行うことができる。したがって、本発明は、神経学的マーカーの２つまたは３つがＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５およびα−シヌクレインからなる群より選択される方法に関する。
【００６６】
非常に特別な具体例は、アルツハイマー病および／またはレービー小体疾患の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病とレービー小体疾患との分別診断のための上記方法に関し、該方法において、
脳脊髄液試料中の少なくともα−シヌクレインのレベルが決定され；および／または
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびα−シヌクレインのレベルが決定される。
【００６７】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において、
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａのレベルが決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびＳＮＡＰ２５のレベルが決定される。
【００６８】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病および／またはパーキンソン病の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病とパーキンソン病との分別診断のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００６９】
もう１つの非常に特別な具体例は、化学療法、化合物への曝露および／または放射線照射により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００７０】
もう１つの非常に特別な具体例は、脳腫瘍または白血病の治療を受けた個体において化学療法、化合物への曝露および／または放射線照射により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００７１】
もう１つの非常に特別な具体例は、周産期仮死により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、少なくとも３つの神経学的マーカーが検出される。
【００７２】
もう１つの非常に特別な具体例は、前頭側頭葉痴呆の特異的検出または定量、および／または前頭側頭葉痴呆と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが決定される。
【００７３】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のための、異なる形態のアルツハイマー病の分別診断のための、および／またはアルツハイマー病と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において少なくとも：
脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のタウおよびホスホタウのレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液中のタウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定される。
【００７４】
個体の体液中の少なくとも３つの神経学的マーカーのレベルを決定することによる、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための上記方法を単独で使用することができ、あるいは簡単にモニターされる神経学的終点（例えば、白血球カウント）と組み合わせて、あるいは血漿中の薬剤濃度の測定と組み合わせて使用することができる。
【００７５】
また本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための診断キットにも関し、該キットは該個体の１またはそれ以上の体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３つの抗体を含む。
【００７６】
より詳細には、本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のためのキットに関し、該キットは少なくともマイクロタイタープレートのごとき支持体を含み、該支持体は該個体の１またはそれ以上の体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する、一緒にされたあるいは別個のウェル中にある少なくとも３つの抗体を有している。
【００７７】
また本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のためのキットにも関し、該キットは下記のものを含む：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する、一緒にされたあるいは別個のウェル中にある少なくとも３つの抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体、
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）
＊該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００７８】
特別な具体例において、本発明は、上記方法の１つまたはそれ以上を行うためにそれぞれ設計された上記診断キットに関する。
【００７９】
より詳細には、本発明は、下記のものを特異的に認識する抗体を少なくとも含む上記診断キットに関する：
α−シヌクレイン；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびα−シヌクレイン；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａ；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＳＮＡＰ２５；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）；あるいは
タウおよびβ−アミロイド（１−４２）。
【００８０】
また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するためのキットにも関し、該キットはＲａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８１】
また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するためのキットにも関し、該キットはＲａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８２】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、Ｒａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はＲａｂ３ａ−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はＲａｂ３ａ−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたＲａｂ３ａまたはＲａｂ３ａ−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とＲａｂ３ａ−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、Ｒａｂ３ａの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８３】
また本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するためのキットにも関し、該キットはＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８４】
また本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するためのキットにも関し、該キットはＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８５】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、ＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたＳＮＡＰ２５またはＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、ＳＮＡＰ２５の検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８６】
また本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するためのキットにも関し、該キットはα−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８７】
また本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するためのキットにも関し、該キットはα−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８８】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたα−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体とα−シヌクレイン−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８９】
また本発明は、特定の治療の治療モニタリングおよび／または有効性の決定のための上記いずれかの方法またはキットの使用にも関する。開示したマーカーのいずれかに特異的な抗体を記載するすべての文献の内容を、参照により本明細書に一体化させる。
【００９０】
以下の実施例は本発明を説明するためにだけ役立つ。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
【００９３】
【表３】
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【００９６】
【表６】
【００９７】
【表７】
【００９８】
【表８】
【００９９】
【表９】
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
【表１１】
【０１０２】
【表１２】
【０１０３】
【表１３】
【０１０４】
【表１４】
【実施例１】
【０１０５】
実施例１：ＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の検出
１．１ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５のクローニング
製造者の増幅プロトコルに従ってQuick-ScreenTMヒトｃＤＮＡライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA, USA;カタログ番号K1003-1）からＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５コーディング配列を増幅するために特別なプライマーを使用した。簡単に説明すると、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒アニーリング、次いでＴａｑポリメラーゼ（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands;カタログ番号600131）を用いて７２℃で２分伸長からなるサイクルを３５サイクル行った。７２℃で７分間のポリメラーゼ伸長反応にてプログラムを終了した。Perkin-Elmer（Ueberlingen, Germany）ＤＮＡサーマルサイクラー（４８０型）にて反応を行った。Ｒａｂ３ａを増幅するためのプライマーの配列はヒトＲａｂ３ａ配列（Zahraoui et al., 1989）に基づくものであった：ＡＴＧプライマーとしてATG GCA TCG GCC ACA GAC TCG CGC TAT GGG (Tm=76℃)および逆プライマーとしてCGCG TCTAG AGG CTC TCA GCA GGC GCA GTC CTG GTG CGG (Tm=77℃)。ＳＮＡＰ２５を増幅するためのプライマーの配列はヒトＳＮＡＰ２５配列（Zhao et al., 1994）に基づくものであった：ＡＴＧプライマーとしてATG GCC GAA GAC GCA GAC ATG CGC AAT GAG (Tm=75℃)および逆プライマーとしてCGCG CTAG ACA CTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG TTG (Tm=59℃)。
ＰＣＲ生成物を再増幅して十分な量のＰＣＲ生成物を得て、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで仕上げを行い、ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩで平滑末端化され、ＸｂａＩで切断されたｐＩＧＲＨＩＳＡ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2075）中に連結した。これにより、Ｒａｂ３ａに関してｐＩＧＲＨＩＳＡＲａｂ３ａ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号3008）を、ＳＮＡＰ２５に関してｐＩＧＲＨ６ＳＮＡＰ２５ａ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2941）を得た。連結生成物をＤＨ１（λ）（Bachmann, 1987）中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーをインサートの存在について分析した。インサートを配列決定し、正しい配列（Zahraoui et al., 1989; Zhao et al., 1994）を含むプラスミドをさらに使用した。Ｒａｂ３ａに関しては、ＰＣＲによるいくつかの人工的要因が存在した。２つのクローンから正しい配列を組み立てた。
【０１０６】
１．２ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の発現および精製
ＰＬに基づく発現系ｐＩＧＲＨＩＳＡＲａｂ３ａおよびｐＩＧＲＨ６ＳＮＡＰ２５ａを用いてＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５をそれぞれイー・コリにおいて発現させた。温度感受性ｃＩリプレッサーを有するＭＣ１０６１ ｐＡＣＩ（Wertman et al., 1986）中に正しいプラスミドを形質転換した。約２５ｋＤａのクーマシー染色可能なバンドが１２．５％アクリルアミドゲル上に可視化され、合理的な発現レベルが示された。組み換え蛋白は、ＮｉＩＭＡＣカラムでの精製を迅速ならしめる６個の付加ヒスチジン残基を含む融合蛋白として得られた。３リットルの熱誘導イー・コリ（Houchi, 1988; Van Gelder et al., 1993）を用いて、１０ｍｇよりも多い組み換えＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５を精製し、少なくとも９５％の均質性であった。
【０１０７】
１．３ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に特異的な抗体の取得および特徴付け
Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に対する抗体をウサギにおいて生成させた。５０μｇの精製蛋白を２匹のウサギに腹腔内注射した（１００μｇ／ウサギ１匹）。４週間ごとに注射を行い、ＥＬＩＳＡで力価を測定した。抗体は脳抽出物により特徴づけられた。Ｒａｂ３ａ免疫反応性に関する結果を図１に示す。アルツハイマー病患者および対照患者からの組織試料を、５倍体積の１％ ＳＤＳ、１％ バナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４中で迅速にホモジナイズし、次いで、水浴にて５分間煮沸することにより調製した。ホモジネートを５分間遠心分離（１２０００ｇ、室温）して不溶性物質を除去した。少量の上清を用いてＢＣＡ法（Pierce, Rockford, Illinois, USA）により蛋白濃度を測定した。上清を水で希釈して蛋白濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、同体積の２ｘ試料緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、３％ ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００６％ブロモフェノールブルーおよび２％ β−メルカプトエタノール）を添加した。１０〜１２．５％ゲルのLaemmli系によりゲル電気泳動を行った。半乾燥ブロッティング法により蛋白をニトロセルロース（Schleicher and Schull, Dassel, Germany;カタログ番号401196）に移行させた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％ ＢＳＡでニトロセルロースフィルターをブロックした。１％ ＢＳＡ中適当濃度（±１μｇ／ｍｌ）の一次抗体およびニ次抗体を添加した。
【０１０８】
１．４ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に特異的な抗体の免疫アフィニティー精製
０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６中で精製組み換え抗原を透析した。透析前後においてＯＤ２８０値を測定して蛋白量を評価した。Mini-Leak-Medium（KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada;カタログ番号10127、ロット番号60232-5）を用い、製造者の指示に従って免疫精製を行った。抗体の一部をビオチン化させた（Amersham, Place Little Chalfont ]Buckinghamshire, UK;カタログ番号RPN 2202）。銀染色およびウエスタンブロットにより精製および標識化をモニターした（データ示さず）。
【０１０９】
１．５ ＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の安定性および存在の評価
特異的モノクローナル抗体（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; R35520およびS35020）を捕捉抗体として用い、免疫精製されたポリクローナルウサギ抗血清をディテクター抗体として用いて、ＣＳＦ中に添加したシナプス蛋白Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の安定性を、３７℃で一晩インキュベーションした後に評価した。濃度５００ｐｇ／ｍｌにおいて、ＳＮＡＰ２５およびＲａｂ３ａに対する組み換え体の免疫反応性は試験したＣＳＦ中で一晩置いても変化しなかった（図２）。
５０ｍｌのＣＳＦからのアルブミンおよびＩｇＧの抽出ならびにカラムでの分画により、両蛋白がＣＳＦ中に存在するという直接的証拠を得た。フラクションを乾燥させ、試料緩衝液に溶解し、１２％アクリルアミドゲルで泳動し、ブロッテイングした。Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５モノクローナル抗体を用いてＰＶＤＦ膜をプローブした。予想分子量およびｐＩの免疫反応性バンドが検出された。
【０１１０】
１．６ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の検出およびＣＳＦレベルの定量的測定のためのＥＬＩＳＡの開発
モノクローナルＲａｂ３ａまたはＳＮＡＰ２５抗体を捕捉抗体とし、免疫アフィニティー精製されたビオチン化ポリクローナル抗体をディテクター抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144）で被覆した。ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ（臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384）をブロッキング緩衝液として使用した。ブロッキング緩衝液で１／１０００に希釈したマウス抗Ｒａｂ３ａ（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 R35520, IgG2a, クローン 9, ロット番号 606-259-1550 ロット 2）または抗ＳＮＡＰ２５（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S35020, IgG1, クローン 20）を添加した。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加した（濃度範囲４００００〜２．５６ｐｇ／ｍｌ）。同時に、アフィニティー精製されたウサギ抗Ｒａｂ３ａまたは抗ＳＮＡＰ２５抗血清を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加した。次いで、１／２０００に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン（Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084）によりビオチン化ウサギ抗体を検出した。カップリングしたペルオキシダーゼを、ＴＭＢ Ｈ２Ｏ２基質溶液により検出した。３０分後に２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。このＥＬＩＳＡに基づいて１０ｐｇ／ｍｌ程度のＲａｂ３ａを検出することができた。ＳＮＡＰ２５のアッセイは同じ原理に基づくものであった。
【実施例２】
【０１１１】
実施例２：脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在および検出
２．１ α−シヌクレインに対する特異性に関する市販抗体の評価
異なるシヌクレインのイソ形態（isoform）に対する市販モノクローナル抗体（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320, IgG1）の特異性を評価した。公表された配列のデータ（α-synuclein: accession number L08850; β-synuclein: accession number S69965; γ-synuclein: accession number AF010126）に基づくプライマーを用いて、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン、γ−シヌクレインのオープンリーディングフレーム（ＡＴＧから停止コドンまで）をヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（HL5018; Clontech, Palo Alto, CA, USA）から増幅した。報告されたように、いくつかの重要なアミノ酸変化がγ−シヌクレインのオリジナル配列に存在した：このクローンにはＫ１２ＥおよびＫ６８Ｅがあり、このクローンのアミノ酸１０９の多型性はＥ１０９Ｖであった。アミノ末端に６個のさらなるヒスチジンを付加するＰＬベースの発現系（ICCG 3307; Innogenetics, Gent, Belgium）中にインサートをサブクローンした。Ｈｉｓタグを付したシヌクレイン融合蛋白をイー・コリにおいて発現させた。次いで、イー・コリ蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。このモノクローナル抗体はα−シヌクレインに対して特異性を示し、シヌクレイン蛋白のカルボキシ末端半分をマッピングしている（図３）。
【０１１２】
２．２ 脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在についての評価
数人の患者からのＣＳＦをプールした。Rotophorを用いて２００ｍｌのプールしたＣＳＦを等電点により分離した。次いで、得られたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。２つの免疫反応性バンドが１９ｋＤａの範囲に検出され、ｐＩは４ないし６の範囲であった（図４）。いくつかの負に荷電したアミノ酸（最後の２０個のアミノ酸中に６つのＥ）はｐＩをより塩基性のほうへシフトさせるので、低い方のバンドはＣ末端切断形態である可能性があった。この免疫反応性に基づいて、α−シヌクレインの濃度範囲をｐｇ／ｍｌの範囲で評価した。
【０１１３】
２．３ α−シヌクレイン特異的抗体の取得および特徴づけ
３リットルの誘導イー・コリ培養からα−シヌクレインを精製したところ、１０ｍｇよりも多いα−シヌクレインが精製された（クーマシーおよび銀染色ゲルから評価すると純度は９０％より高い）。いくつかの免疫スキーム（表３）に従って蛋白をマウスに注射した。４回注射後、コーティングＥＬＩＳＡにおいてα−シヌクレインに対する力価を評価した。６匹のマウスは１０００００以上の力価を有していた（バックグラウンドの２倍のＯＤが得られる血清の希釈率として力価を定義）。
最後の注射から３日後、動物３１２（ｍ３）から脾臓細胞を取り、Koehler and Milstein (1975)により記載された方法に大まかに準じて細胞融合に使用した。最初のスクリーニングラウンドでは、直接コーティングアッセイにおいて特異的抗体の存在についてハイブリドーマを試験した。次いで、α−、β−、γ−シヌクレインおよびα−シヌクレイン由来の欠失変異体を含有するイー・コリ溶解物のドットブロットによりそれらを再試験して、シヌクレイン蛋白上の異なるエピトープを認識する抗体を生成するハイブリドーマを選択した。
【０１１４】
２．４ α−シヌクレイン特異的抗体の特徴づけ
ドットブロットにおいてα−シヌクレインに特異的であった２つのハイブリドーマ３Ｂ５（ＩｇＧ２ａ）および９Ｂ６（ＩｇＧ１）を単離した。その正確なエピトープを決定するために、カルボキシ末端部分（位置６４から１４０まで）を、１０個の重複するペプチドとして合成した（図５）。それらのペプチドはアミノ酸１４個の長さで、７個のアミノ酸が重複していた。ビオチン化ペプチドを、１μｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジン被覆プレート上に捕捉した。これらのペプチド上でα−シヌクレイン特異的抗体をインキュベーションし、次いで、抗マウス酵素結合抗体を用いて検出した。トリメチルベンジジンを基質として用いて酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼを定量した。３Ｂ５および９Ｂ６は両方とも、配列LEDMPVDPDNEAYE（位置１１３〜１２６）を含むペプチドを認識し、このモノクローナル抗体に対する直鎖状エピトープが示唆された（図６）。同じセットの実験において、α−シヌクレインを認識することがすでに示されている市販抗体（Clone 42, IgG1, Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320）もまた、直鎖状エピトープ（配列AGSIAAATGFVKKD）（図６）にマップできた。
【０１１５】
２．５ α−シヌクレイン特異的抗体の精製およびビオチン化
第２および第３ラウンドのサブクローニング後、１０〜２０ｍｇの抗体を精製するために抗体の生成を１〜２リットルまでスケールアップする。Mini-Leak-Medium（KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada; カタログ番号 10127, ロット番号 60232-5）を用いて、製造者により提供される説明に従って抗体を免疫精製する。
十分に確立された方法（Bonhard et al., 1984）に従って、Ｄ−ビオチニル−エタ−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Boehringer-Mannheim, Brussels, Belgium; カタログ番号 1008960）を用いてビオチン化を行う。
【０１１６】
２．６ 脳脊髄液中のα−シヌクレイン検出および定量的測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡの開発
α−シヌクレイン抗体を捕捉抗体とし、ビオチン化モノクローナル抗体の１つをディテクター抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを開発する。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144）で被覆する。ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ（臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384）＋１％マウス血清をブロッキング緩衝液として使用する。ブロッキング緩衝液で１／１０００に希釈した抗α−シヌクレイン（Transduction Labs, Lexington, KY, USA）を添加する。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加する（濃度範囲１０００〜２ｐｇ／ｍｌ）。同時に、１％マウス抗体の存在下においてビオチン化抗α−シヌクレインモノクローナル抗体を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加する。次いで、１／２０００に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン（Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084）によりビオチン化ウサギ抗体を検出する。カップリングしたペルオキシダーゼを、ＴＭＢ Ｈ２Ｏ２基質溶液により検出する。３０分後に２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定する。
【実施例３】
【０１１７】
実施例３：脳脊髄液中の他の神経学的マーカーの検出
３．１ タウおよびホスホタウ
ＡＴ１２０を捕捉抗体とし、ビオチン化ＨＴ７−ＢＴ２をディテクター抗体として用いて、タウ抗原試験（INNOTEST hTau antigen, Innogenetics, Gent, Belgium）により全タウを測定した。モノクローナル抗体ＡＴ１２０は、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応し（Vandermeeren et al., 1993）、モノクローナル抗体ＨＴ７もまた、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応するが、モノクローナル抗体ＢＴ２は優先的に正常タウを認識する（Goedert et al., 1994）。すでに記載されたようにして（Mercken et al., 1992b）調製された、アフィニティー精製されたタウ蛋白を標準物質として使用した。
ＨＴ７を捕捉抗体とし、ビオチン化ＡＴ２７０をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ（INNOTEST phospho-tau(181), Innogenetics, Gent, Belgium）を用いてホスホタウを測定した。ＡＴ２７０はホスホタウを特異的に認識する（国際公開 WO 95/17429）。
【０１１８】
３．２ β−アミロイド（１−４２）
Innotest β-amyloid(1-42)（Innogenetics, Gent, Belgium）を用いてβ−アミロイド（１−４２）濃度を測定した。アッセイはサンドイッチ型ＥＬＩＳＡであり、該アッセイにおいて第１のモノクローナル抗体２１Ｆ１２（アミロイドのカルボキシ末端に特異的）を捕捉抗体として使用し、ビオチン化抗体３Ｄ６（アミノ末端に特異的）をディテクター抗体として使用する。２１Ｆ１２／３Ｄ６の組み合わせはアミロイド（１−４２）ペプチドの特異的検出を可能にする。いくぶんかの交差反応性がアミロイド（１−４２）に関して観察されるが、短いペプチドに関しては観察されない（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）。簡単に説明すると、２１Ｆ１２抗体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁し、４℃で一晩かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを被覆した。１回洗浄工程を行った後、２５℃で２時間、ＰＢＳ−０．１％カゼインでプレートをブロックした。７５μｌのビオチン化３Ｄ６および２５μｌのＣＳＦまたは標準物質を同時インキュベーション（２５℃で１時間）することにより試験を行った。数回洗浄工程を行った後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（RDI, Flanders, New York, NY, USA）を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを２５℃で３０分継続した。次いで、１００μｌの０．４２ｍＭ ３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジンをペルオキシダーゼ基質として添加した。３０分後に５０μｌの０．９Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１１９】
３．３ β−アミロイド（１−４０）
Quality Controlled Biochemicals (QCB, Hopkinton, MA, USA)から得た、Ｃ末端に特異的な、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、３Ｄ６（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）をディテクター抗体として用いて、β−アミロイド（１−４０）濃度を測定した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中で２５℃で２時間かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのアフィニティー精製されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 111-005-144）で被覆した。その後、４℃で一晩、プレートをＰＢＳ−０．１％カゼインでブロックした。ウサギポリクローナル抗体（QCB, Hopkinton, MA, USA; カタログ番号 44-348-20）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２５℃で１時間置いた。数回洗浄工程を行った後、１００μｌのＣＳＦまたは標準物質を２５℃で２時間インキュベーションした。１００μｌのビオチン化３Ｄ６抗体を添加（抱合体希釈物中０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加）して２５℃で１時間置くことにより結合アミロイド量を調べた。プレートをさらに５回洗浄した。１００μｌのＳＶ−ＡＰ（Gibco, Rockville, MD, USA; カタログ番号 JK-4410）を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを２５℃で１時間継続した。最後の洗浄工程（５回）の後、基質緩衝液に溶解した１００μｌのＴＭＢをペルオキシダーゼ基質として添加した。３０分後に５０μｌの０．９Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１２０】
３．４ ニューロモジュリン
２種のエピトープ特異的モノクローナル抗体（ＮＭ２、ＮＭ４；Oestreicher et al., 1994）を用いてニューロモジュリンについても測定した。捕捉抗体としてＮＭ２を選択し、ディテクター抗体としてビオチン化ＮＭ４を選択した。組み換えニューロモジュリンを標準物質として使用した。
【０１２１】
３．５ ニューロン特異的エノラーゼ
ＮＳＥの測定は、抗ＮＳＥモノクローナル抗体２Ｅ７を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗ＮＳＥモノクローナル抗体１０Ｃ１をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡの測定は、抗ＮＳＥモノクローナル抗体２Ｅ７を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗ＮＳＥモノクローナル抗体１０Ｃ１をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡに基づくものであった。ヒト脳から精製したＮＳＥを標準物質として使用した（Vanmechelen et al., 1997）。
ＢＣＡ蛋白試薬（Pierce, Rockford, Illinois, USA）を用いて蛋白濃度を決定した。
【実施例４】
【０１２２】
実施例４：アルツハイマー病の特異的検出および年齢を合わせた対照に対するアルツハイマー病の分別のための神経学的マーカーとしてのＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
４．１ 患者および対照患者
アルツハイマー病（ＡＤ）群は３２人の患者からなり、男性１５人、女性１７人で、平均年齢±ＳＤは７５．０±６．６歳であった。血管性痴呆（ＶＡＤ）群は２０人の患者からなり、男性１０人、女性１０人で、平均年齢±ＳＤは８１．０±７．０歳であった。対照群は１８個体を含み、男性７人、女性１１人で、平均年齢±ＳＤは６７．５±５．５歳であった。ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ判断基準（McKhann et al., 1984）に従って排除を行うことにより可能性のあるＡＤの診断を行った。痴呆の進展、および／または大規模な梗塞および／または多発性裂口のＣＴ所見、および／または重症の血管性疾患の臨床的所見、例えば、合併症を伴う動脈高血圧または糖尿病に関連した一時的な虚血発作および／または卒中エピソードを有する患者においてＶＡＤを診断した。対照群は精神病または神経学的疾患、悪性疾患、または全身性疾患（例えば、リューマチ性関節炎、感染性疾患）の病歴、症状または徴候のない個体からなっていた。６０歳以上の個体において、Multi-Mental state examination （Folstein et al., 1975）を用いて認識状態を試験した。２８点以下のスコアを有する患者は参加させなかった。University of Goeteberg（Goeteberg, Swedec）のEthic Committeeにより当該研究は承認された。患者（または彼らに最も近い親類）および対照群の個体は研究に参加するためのインフォームドコンセントを受けた。
【０１２３】
４．２ 脳に特異的な脳脊髄液の単離
手順はDavidsson et al., 1996に詳述されている。簡単に説明すると、５〜１０ｍｌのＣＳＦをBlue Sepharoseカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に供してアルブミンを選択的に除去した。次いで、アルブミン不含フラクションを、Sepharose 4B（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に共有結合したスタフィロコッカス蛋白Ｇのカラムに供してＩｇＧを吸着させた。ｍＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８カラム（内径２．１ｘ１００ｍｍ、ゲル体積０．３５ｍｌ、粒子サイズ３ｍｍ）を装備したＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia LKB technology）を用いるｍＲ−ＨＰＬＣにより未吸着蛋白を分離した。２回のトリフルオロ酢酸のグラジエントにより蛋白を溶離した。全部で４０個のフラクションをSavant Speed Vac Concentratorで乾燥させた。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解し、超音波処理し、１５分煮沸して、１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。
【０１２４】
４．３ アルツハイマー病の特異的検出のための組み合わせアッセイの評価
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いることにより、ＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を３２人のＡＤ患者、２０人のＶＡＤ患者および１１人の対照のＣＳＦ試料中で測定した。すべてのマーカーの平均レベルを表４にまとめる。個体のタウおよびＲａｂ３ａ値を図７に示す。
ＡＤ患者に関する最高感度および対照患者に関する最高特異性により決定されたカットオフ値に基づいて、確度比を決定した（表５）。Ｒａｂ３ａレベルとＳＮＡＰ２５レベルとが相関関係を有しているので、Ｒａｂ３ａまたはＳＮＡＰ２５のいずれかをタウおよびβ−アミロイドと組み合わせるだけでよい（図８）。かくして、Ｒａｂ３ａとＳＮＡＰ２５の組み合わせに関する確度比を調べなかった。個々のマーカー１つだけあるいは２つだけの組み合わせに関する確度比と比較した場合の、３つの神経学的マーカーの組み合わせ、タウ−β−アミロイド（１−４２）−Ｒａｂ３ａならびにタウ−β−アミロイド（１−４２）−ＳＮＡＰ２５の増加した確度比は、これらの３つのマーカーの組み合わせによりアルツハイマー病のより特異的かつ感度の良い検出が可能になることを示す。
依存的変数、因子としての性別、共分散としての年齢および最小精神的スコア（MMSE; Folstein et al., 1975）のようなすべてのマーカーを有する、十分に階乗的な変数の多数分析（ＡＮＯＶＡ）は、異なる群において、これらのパラメーターが共分散しないことを示した。さらに、タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａ／ＳＮＡＰ２５の間の有為な相関関係は、各群においても、全群を一緒にしても検出できなかった。
Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に対するさらなる抗体を単離する。ＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）のレベルを、許容される試料のサイズにより統計学的に有意な比較が可能な十分に定義された臨床診断群において研究する。
【実施例５】
【０１２５】
実施例５：白血病の治療を受けた小児において化学療法により誘導された神経のダメージを診断するための、ＣＳＦ−タウ、ＣＳＦ−ニューロモジュリンおよびＣＳＦ−ニューロン特異的エノラーゼを用いる組み合わせアッセイ
５．１ 患者および対照患者
１９９６年８月から１９９８年９月までの間、the Pediatric Hemato-oncology Department of the Catholic University of Leuven, Belgiumにおいて癌の治療を受けた８３人の小児から４４８のＣＳＦ試料を得た。すべての患者は診断時点において完全に臨床的評価を受けていた。親のインフォームドコンセントが得られた。
悪性疾患の分類および治療のために、計画された腰椎せん刺（ＬＰ）のコースに試料を供した。血液学的悪性疾患を有する患者の異なる群を本研究に参加させた（表６）。第１群は、United Kingdom Children Cancers group (UKCCSG 9602) NHL protocolに従って治療された９人のＢ細胞非ホジキンリンパ腫患者（Ｂ−ＮＨＬ）からなっていた（表７ａ）。この群において、４人の患者がＢ細胞リンパ腫を有し、３人の患者がBurkittリンパ腫を、２人の患者が未分化ラージ細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を有していた。これらの患者のうち８人は長期にわたり研究された。第２および最後の群は、European Organization for Research and Treatment of Cancer' (EORTC) protocol 58881に従って治療された非Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病／非ホジキンリンパ腫（ＮＢ ＡＬＬ／ＮＨＬ）の４２人の患者からなっていた（表７ｂ）。この第２群において、１８人の小児はＣＤ１０（＋）ブラストまたは通常のＮＢ ＡＬＬを有し、２人の患者はダウン症候群（ＤＳ）を有し、１人の患者はBrachmann-de Lange症候群を有し、３人の患者は通常のＢ細胞ブラストを有し、１人の患者はＴ細胞ブラストを有し、２人の患者はプロＢ細胞ブラストを有し、９人の患者はプレＢ細胞ブラストを有し、８人の患者はＴ細胞ブラストを有していた。３８人の小児が白血病を有し、５人の患者が非ホジキンリンパ腫段階ＩＩ（１人）、段階ＩＩＩ（３人）または段階（ＩＶ）（１人）であり、それらのうち１人の患者は、ＣＳＦ中の悪性細胞に関する研究プロトコル、眼底検査およびコントラストカプテーション（contrast captation）により定義された明らかなＣＮＳの疾病（ＣＮＳ＋）を有していた。５人の患者は、治療プロトコルにおいて定義された判断基準によれば非常に危険性の高い（ＶＨＲ）患者であった（２人の患者はＴ細胞ブラスト、３人の患者はコルチコイド耐性）。この群中の患者のうち２７人は長期にわたり追跡できた。第３の患者群は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の６人の小児からなってお、そのうち１人の患者はＣＮＳの疾病を有し、２人の患者はダウン症候群であった。Ｍ０表現型を有する３人の患者、およびＭ１、Ｍ２またはＭ７表現型が１人ずついた。これらすべての患者はEORTC 58921プロトコルにより治療され、長期にわたり追跡された。他の患者は異種の小児群（ｎ＝１８）からなり、治療前後の感染の診断および段階分けのために臨床的理由により腰椎せん刺を行った。この群は５人の髄芽細胞腫の小児（３人が段階分け中、１人が治療中、１人がフォローアップ中）、３人のホジキン病の小児（段階分け中）、３人の横紋筋肉腫（２人が段階分け中、１人が治療中）、２人の脊髄形成異常（ＭＤＳ）の小児（段階分け中）、２人のランゲルハンス細胞組織球炎（ＬＣＨ／ＨＬＨ、段階分け中）、１人の若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の小児（治療中）、絨毛癌（フォローアップ中）の小児、または胚細胞腫（段階分け中）の小児であった。健康な新生児の大きな群は利用できなかった。なぜなら、これらの患者から脳脊髄液を採取することは倫理に反するからである。対照として、髄膜炎を有する疑いがあるが陰性である小児（ｎ＝４）、局所的網膜芽細胞腫（ｎ＝１）の小児および家族性ヘモファゴサイティックリンパ組織炎球増多症（ｎ＝１）の小児を参加させた。親のインフォームドコンセンサスが得られた。
【０１２６】
５．２ 研究計画
見込のある、かつ長期の単一中心研究計画を用いた。研究に入る前に患者は治療を受けなかった。今回の調査研究において、５８人の小児から得たＣＳＦ試料を治療前に利用した（診断的腰椎せん刺またはＬＰ１）（さらなる詳細は表７参照）。大部分の患者に関してすべての時点において残りの試料が利用できなかった。失われた値は小児の疾病の状態によるのではなく、サンプリングまたは試料の保存の間の人為的要因によるものであった。
診断ワークアップのためのベースラインまたは化学療法のＩＴ投与直前のいずれかにおいて、ルーチンな分析のために腰椎せん刺を行った。別々のポリプロピレンチューブに５ｍｌのＣＳＦを集めた。１の試料を即座に１５００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞および他の不溶性物質を除去した。引き続いて行う分析のために上清を−７０℃で保存した。凍結／融解サイクルの数を最小限とした。ルーチンなＣＳＦ測定は、細胞学的項目、蛋白濃度、グルコース等を包含した。
診断群にかかわらずすべての神経学的マーカーのデータに関する正規化が拒否されたので、非パラメトリック統計を分析に使用した。Kruskal-Wallis検定を用いて、エフェクト変数（タウ、ニューロモジュリン、蛋白等）に関する群の差異を調べた。Wilcoxonサインドランクス検定、マッチド−ペアー（Wilcoxon signed ranks test, matched-pairs）を用いて、最初の診断ＬＰとその後のＬＰとの間の相違をチェックした。Prismソフトウェアｖ２．０１（Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA）、Systatバージョン７（SPSS, Chicago, IL, USA）を用いて分析を行った。
【０１２７】
５．３ 化学療法により誘導された神経ダメージの診断のための組み合わせアッセイの評価
治療前の神経学的マーカーのレベル
まず、感染性疾患（しかしながら、ウイルスおよび細菌培養陰性）（ｎ＝４）の小児から得たＣＳＦ試料に関してタウの正常な上限を調べた。１人の患者は非常に局部的な網膜芽細胞腫を有し、１人の小児は家族性ＨＬＨに関してスクリーニングされた者であった。対照小児における平均タウ値は１０６．２ｐｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ＝３４．３〜１７８．０）であった。任意のカットオフ正常値は３１２ｐｇ／ｍｌ（平均＋３ＳＤ）であり、それは成人において観察される値の範囲内である。正常成人対照の８０％が３５２ｐｇ／ｍｌ未満のタウ値を有するが、４２５ｐｇ／ｍｌ（ｐ２５−ｐ７５：２７４−７１３，ｎ＝１５０）がアルツハイマー病患者のメジアンタウレベルである（Hulstaert et al.,1999）。まず、患者数に関係なく試料を分析し、その後、１の患者から得たすべての試料を１のイムノプレート上でさらに分析した。１０４個の試料のセットに関する第１のアプローチと第２のアプローチとの間の相関係数は０．９０１（９５％ ＣＩ：０．８５６−０．９３３）であった。
診断時のタウレベルを患者の各サブグループに関して分析した（図９）。診断時のタウレベルは６６から１５００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。タウ、ニューロモジュリン、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、血清ＬＤＨおよびＣＳＦ白血球カウントに関するデータ（図１０）は、ダウン症候群を有するまたは有しない患者群において、あるいは診断群間において、明らかな相違を示さない。さらに、タウレベルとＷＢＣまたはＬＤＨレベルとの間にも相関関係が見出されなかった。タウ濃度と小児の年齢との間にも有意な相関関係が見出されなかった。２人のＭＤＳ患者、明らかなＣＮＳ侵襲（ＣＮＳ＋）であるがＡＭＬでない小児は、診断時においてタウレベルが著しく上昇していた。また、後方窩における髄芽細胞腫のために頭蓋内圧が上昇して入院した３人の患者から、段階分けのためにＣＳＦを取ったところ、非常に高いＣＳＦ−タウ濃度であった（８２３、１３９７、１５００）。しかしながら、非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬを有する２１人中７人の小児、非常に高い危険性を有する非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬ患者４人のうち１人、ＡＭＬの患者４人のうち２人、およびＢ細胞ＮＨＬの患者８人のうち２人が３１２ｐｇ／ｍｌ以上のタウレベルを有していたが、古典的な診断手順を用いるとＣＮＳ侵襲は検出されなかった。
非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬを有する２７人の患者あるいはＢ細胞 ＮＨＬを有する９人の患者に関しては（データ示さず）、白血球カウント（ｐ＝０．９３５，ｎ＝４０）または血清ＬＤＨ（ｐ＝０．８５５，ｎ＝３９）によって反映されるように、診断時のタウレベルは腫瘍負荷と相関関係がなかった。ＬＰ１において、タウとニューロモジュリンとの間の非常に有意な相関関係が存在し［ｒ＝０．７９３；９５％ ＣＩ：０．６５８−０．９２８，ｎ＝５０］、両方の蛋白の分泌がある程度相互関係があることが示された。タウとβ−アミロイド（１−４２）との間には相関関係が見られなかった（ｐ＝０．１０３２，ｎ＝５２）。
【０１２８】
Ｂ−ＮＨＬ患者の治療期間中における神経学的マーカーのレベル
化学療法により誘導されたＣＳＦ中のタウの増加に関する最も明確な相違がＢ細胞ＮＨＬ患者において検出された。ベースライン試料および９日目のＬＰ（＝ＬＰ２）におけるフォローアップ試料の両方が利用可能であった３人の患者に関する結果を図１１ａに示す。９日目、すなわちＩＶ ＭＴＸおよびビンクリスチンとともにＭＴＸおよびヒドロコルチゾンをＩＴ投与した後には、すでに最大タウ増加が測定可能であった。タウのさらなる増加はその後測定されなかった。ニューロモジュリン（図１１ｂ）およびニューロン特異的エノラーゼ（図１１ｃ）に関する同様の知見によっても、化学療法により誘導された神経代謝活性に対する効果が確認された。さらに、タウとニューロモジュリンとの間（r=0.722, 95% CI: 0.553-0.834, n=49）あるいはニューロモジュリンとニューロン特異的エノラーゼとの間（r=0.622, 95% CI: 0.247-0.835, n=20）に明確な相関関係があった。
【０１２９】
非Ｂ細胞ＡＬＬ／ＮＨＬ患者の治療期間中における神経学的マーカーのレベル
全治療期間にわたるデータ（前後試料）が、EORTCプロトコル58881により治療を受けた１３人の非Ｂ細胞ＡＬＬ患者に関して利用可能であった。個々の患者について、異なるフェーズまたは治療に関するメジアンタウ値を図１２ａに示す。治療前（ＬＰ１）と比較して（ｐ＝０．０４８）、あるいはメンテナンス期間と比較して（ｐ＝０．０４０）、誘導期間中にタウレベルが有意に増加した。１人の患者は治療開始前からすでにタウレベルが上昇しており（８９３ｐｇ／ｍｌ）、おそらく神経学的機能不全がすでに開始していたことを反映するものであろう。また、治療前と誘導期間との間のニューロモジュリンレベルの増加傾向もあった（図１２ｂ）。治療開始時に高いタウレベルが存在した患者もまた、化学療法開始時において高いニューロモジュリンレベルを示した。ＬＰ１およびＬＰ２に関するＮＳＥのデータが利用可能であった２人の患者において［LP1 (4.0 ng/ml, 3.4 ng/ml); LP2 (11.7 ng/ml, 9.6 ng/ml)］、ＮＳＥの明確な増加が観察された。
非Ｂ細胞ＡＬＬ患者からのすべてのデータの分析により、誘導期間において最高タウ濃度が見られることが明らかとなった。誘導期間中、分析した試料の４１％（２８／６８）が５００ｐｇ／ｍｌよりも高かった。その後、インターバル期間においてこのパーセンテージは１８．９％（１４／７４）まで低下し、再誘導期間中に１６．７％（３／１８）となり、最後に、メンテナンス期間中に９．７％（７／７２）となった（図１３ａ）。治療開始前にすでに上昇したタウ（＞５００ｐｇ／ｍｌ）を有していた３人の患者におけるタウ値は化学療法後に正常化した。β−アミロイド（１−４２）、非Ｂ ＡＬＬ患者におけるニューロモジュリンおよびＮＳＥレベルに関するデータを図１３ｂ、図１３ｃおよび図１３ｄにそれぞれ示す。ここでもやはりタウとニューロモジュリン（r=0.658, 95% CI = 0.580-0.725,n=251）またはＮＳＥ（r=0.589, 95% CI = 0.363-0.749, n=47）との間に明確な相関関係があった。
非常に高い危険性を有する５人の非Ｂ ＡＬＬ小児を、本研究において長期にわたり試験した。最初の治療フェーズはEORTC 58881と同様であった。同様の化学療法により誘導されたタウレベルの変化が５人中４人の患者において観察され、タウとニューロモジュリンとの間の高く有意な相関関係も観察された（n=55; r=0.880, 95% CI: 0.802-0.929）。
１人のダウン症候群−非Ｂ ＡＬＬ患者は診断時に７０ｐｇ／ｍｌのタウ濃度を有していた。すべての非Ｂ ＡＬＬ患者における平均タウ増加は、長期研究の８日目で２５０％（95% CI = 130% 370%, n=13）、２１日目で２００％（95% CI = 150%-260%, n=8）であったが、ダウン症候群患者のタウ増加パーセンテージは８日目および２１日目においてそれぞれ８２０％および１２００％であった。
高い白血球負荷（６１００００ＷＢＣ／ｍｍ３）のため、１人の特別な患者を、１日目にＩＴ ＭＴＸを使用せずにプレドニソロンで８日間治療した。治療８日後にタウレベルは低いまま、すなわち１５５ｐｇ／ｍｌであった。その後、この患者は他の非Ｂ ＡＬＬ患者と同様にEORTCプロトコル（次の週からＭＴＸをＩＴ注射することを含む）に入った。タウレベルは急激に増加し、１２、１５、１８、２２および４４日目にはそれぞれ７４４、９４８、１１２０、８６１および１０２３ｐｇ／ｍｌとなった。別のセンターで治療を受け、ＭＴＸでの治療後に明らかな神経毒性に苦しんでおり、しかも両側麻痺であった小児から１のＣＳＦ試料が利用可能であった。この小児のタウおよびミューロモジュリンのレベルは使用した最高標準値（タウについて１５００ｐｇ／ｍｌ、ニューロモジュリンについて８０００ｐｇ／ｍｌ）を超え、大規模な神経変性を反映していた。
【０１３０】
ＡＭＬの治療期間中における神経学的マーカーのレベル
図１４ａは、ＡＭＬを有する個々の患者におけるタウの消長を示す。患者１１、１２および２３は治療期間中有意なタウの増加を示さなかった（表７ｃ）。１日目および８日目にＬＰを取った患者１２は激しい疾病を有しており、骨髄移植後間もなく死亡した。ダウン症候群の２人の患者のうち１人から、長期にわたるデータが利用可能であり、この患者は３００ｐｇ／ｍｌをわずかに上回るタウレベルを有しており、患者１１および２３のＣＳＦ中のタウレベルの消長とは対照的であった。診断時にＣＮＳ侵襲の証拠があった患者６９はＣＳＦ中のタウおよびニューロモジュリンの劇的な増加を示した（図１４ｂ）。この小児はまだ治療中であり、現在完全に軽快している。
【０１３１】
結論
我々は、長期の研究において、体液中のタウ、ニューロモジュリンおよびＮＳＥレベルの有意な増加を見出し、それは化学療法に関連した神経のダメージを反映している可能性が最も高く、主にＩＶ コルチコステロイドおよび化学療法剤と組み合わせてＩＴ ＭＴＸを投与した場合に誘導されたが、インターバル治療期間中の高用量のＩＶおよびＩＴ ＭＴＸ投与期間中には誘導されなかった。
【実施例６】
【０１３２】
実施例６：周産期仮死により生じた脳損傷の診断のための組み合わせアッセイ
周産期仮死は神経損傷に関連している可能性がある。電脳図および神経放射線学的データに加えて、ＣＳＦ神経学的マーカーは低酸素−虚血イベントを評価する際の臨床データを補完しうるものである（Garcia-Alix, 1994）。変化した脳の代謝活性はＣＳＦ中の成分の変化を反映するものであるという証拠が増えつつある。ＣＳＦマーカーの周産期レベルおよび仮死による変化の分布を評価する。
【実施例７】
【０１３３】
実施例７：アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー患者との分別のための、神経学的マーカーとしてＣＳＦ−ニューロモジュリン、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
７．１ 患者および対照患者
１０９の個体からＣＳＦを得た。個体を４群に分けた：（ｉ）痴呆に関する神経学的対照と定義される群（ｎ＝７０）。この群は、多発性硬化症、Guillan-Barre症候群、多発性ニューロパシーおよびてんかんの患者を含んでいた。他の群は、（ｉｉ）記憶障害の老人患者（ｎ＝７）、（ｉｉｉ）アルツハイマー病（ＡＤ）患者（ｎ＝２７）、および（ｉｖ）血管性痴呆（ＶＡＤ）の患者（ｎ＝５）からなっていた。International Classification of Diseases, version 9 (Manual of the international statistical classification of diseases, injuries, and causes of death: based on recommendations of the Ninth Revision Conference; 1975, and adopted by the Twenty-Ninth World Health Assembly. Geneva: World Health Organization, 1977)により決定された判断基準に従ってすべての患者を診断した。ＡＤ群において、２人の患者は１の家族からの者であり、プレセニリン変異により疾病の早期発症がわかっている。これらの患者のうち１人は徴候前であった。
神経学的試験の一環としてＣＳＦをルーチンに採取した。ＣＳＦの残りについてすべての試験を行った。ポリプロピレンチューブ中に正しく保存され、１回だけ凍結されたＣＳＦ試料においてのみβ−アミロイド（１−４２）を測定した。
【０１３４】
７．２ アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
これらの患者のＣＳＦ中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン（ＧＡＰ−４３）を調べた。各群の平均ＣＳＦレベルを表８に示す。β−アミロイド（１−４２）、タウおよびニューロモジュリンの個人レベルを図１５ａ、１５ｂおよび１５ｃにそれぞれ示す。
ＡＤ患者においてＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）が有意に変化していた。また、ＡＤにおいてＣＳＦ−ニューロモジュリンが有意に増加していた。対照的に、老人性記憶障害患者においてはＣＳＦ−ニューロモジュリンにおける有意な影響は観察されなかったが、対照患者と比較してＣＳＦ−タウレベルが有意に増加していた。７人の記憶障害患者のうち３人が対照群により決定された最大レベル（２８０ｐｇ／ｍｌ）よりも高いＣＳＦ−タウレベルを有していた。正しくない保存のため、ＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）レベルは３人の記憶障害の患者においてしか調べることができなかった。３人の患者のうち２人において、３００ｐｇ／ｍｌ未満のレベルがみられた。これらの患者のうち１人は上昇したＣＳＦ−タウレベルも有していた。他の患者は２７８ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−タウレベルを有しており、すなわち、対照群により決定された最大レベルよりもわずかに低かった。徴候前の家族性ＡＤ患者において、３２７ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−タウレベルにまで増加しており、β−アミロイド（１−４２）レベルは３００ｐｇ／ｍｌ未満であった。少ない記憶障害個体の試料についてのこの分析は、タウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンの組み合わせ使用はアルツハイマー病の存在に関するより良いインジケーターであることを示す。統計学的に有意であるように、１群あたりより多数の試料を分析中である（１の診断群あたり少なくとも５０の試料）。
【実施例８】
【０１３５】
実施例８：アルツハイマー病の特異的検出、対照患者とアルツハイマー患者との分別、パーキンソン病の特異的検出、対照患者とパーキンソン病患者との分別のための、およびアルツハイマー患者とパーキンソン病患者の分別のために、神経学的マーカーとしてＣＳＦ−ニューロモジュリン、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
８．１ 患者および対照患者
６０人のアルツハーマー病患者、２３人のパーキンソン病患者および年齢の合った３２人の対照患者からＣＳＦを得た。これらの患者のＣＳＦ中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン（ＧＡＰ−４３）を調べた。各群の平均ＣＳＦレベルを表９に示す。
【０１３６】
８．２ アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー病患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
対照と比較すると、ＡＤ患者においてタウが有意に増加していたが、β−アミロイド（１−４２）レベルが減少していた。ＮＭレベルは両群間で有意には異ならなかった。しかしながら、ＮＭとタウのレベルは有意に相関関係があった（図１６）。図１６は、ＡＤ患者に関する値が対照患者に関する値とは異なる可能性を示す。後退判別分析（backward discriminant analysis）（Marrisonら,１９７６年）を用いて、タウ、β−アミロイド（１−４２）、ニューロモジュリンまたはタウ／ニューロモジュリンのいすれの変数が最も良くアルツハイマー病患者を対照患者から識別するものであるかを調べた。変数タウ／ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）を選択し、アルツハイマー患者５８人中５５人（感度９４．８％、ＣＩ ８５．６％〜９８．９％）および対照患者３１人中３０人（特異性９６．８％、ＣＩ ８３．３％〜９９．９％）を正しく分類した（図１７）。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【０１３７】
８．３ パーキンソン病の特異的検出および対照患者とパーキンソン病患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
後退判別分析（Morrison, 1976）を用いて、いずれの変数がパーキンソン病患者と対照患者とを最適に識別するものであるかを調べた。変数タウ／ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）を選択した。パーキンソン病患者２３人中１４人が正しく分類され（感度６０．９％、ＣＩ ３８．６％〜８０．３％）、対照患者３１人中２７人が正しく分類された（特異性８７．１％、ＣＩ ７０．２％〜９６．４％）（図１７）。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるパーキンソン病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【０１３８】
８．４ アルツハイマー病患者とパーキンソン病患者とを分別するための組み合わせアッセイの評価
β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンを選択して、アルツハイマー病患者をパーキンソン病患者から分別し、アルツハイマー病患者について感度９４．８％（ＣＩ ８５．６〜９８．９％）、パーキンソン病患者について特異性７８．３％（ＣＩ ５６．３％〜９２．５％）であった。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病とパーキンソン病の分別の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【実施例９】
【０１３９】
実施例９：レービー小体痴呆とアルツハイマー病との間の分別を行うための神経学的マーカーとしてのＣＳＦ−α−シヌクレインの使用
９．１ 患者および対照患者
３０〜４０人のアルツハイマー患者、１０〜２０人のレービー小体痴呆患者および１０〜２０人の年齢の合った対照からＣＳＦを得る。
【０１４０】
９．２ アルツハイマー病とレービー小体痴呆との分別診断のためのアッセイ
患者群および対照群からのＣＳＦ中のα−シヌクレイン濃度を定量する。レービー小体痴呆群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値とアルツハイマー病群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値との有意な相違により、両方のタイプの痴呆を分別することが可能である。α−シヌクレインの定量と少なくとも２種の他の神経学的マーカー（タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のごとき）の定量を組み合わせることにより、アルツハイマー病とレービー小体痴呆との分別がさらに改善される。
【実施例１０】
【０１４１】
実施例１０：前頭側頭葉痴呆の特異的検出および前頭側頭葉痴呆と他の痴呆との分別のためにＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−ホスホタウを神経学的マーカーとして使用する組み合わせアッセイ
１０．１ 患者および対照患者
３０〜４０人の前頭側頭葉痴呆患者および１０〜２０人の年齢の合った対照からＣＳＦを得る。
【０１４２】
１０．２ 前頭側頭葉痴呆患者と対照患者との分別診断のための組み合わせアッセイ
前頭側頭葉痴呆患者および対照患者のＣＳＦ中のβ−アミロイド（１−４２）、タウおよびホスホ−タウのレベルを定量する。対照患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値と比較した場合、前頭側頭葉痴呆患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値が有意に増加している。前頭側頭葉痴呆患者は、対照患者と比較すると、β−アミロイド（１−４２）のレベル低下を示す。
【実施例１１】
【０１４３】
実施例１１：アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出および他の形態のアルツハイマー病と血管の問題との分別のためにＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよび血漿−ベータ−アミロイド（１−４２）を神経学的マーカーとして使用する組み合わせアッセイ
１１．１ 患者および対照患者
アルツハイマー病の血管性疾患の患者３０〜４０人、他の形態のアルツハイマー病患者３０〜４０人および年齢の合った対照１０〜２０人からＣＳＦおよび血漿を得る。
【０１４４】
１１．２ 血管性疾患と他の形態のアルツハイマー病との分別診断のための組み合わせアッセイ
血管性疾患の患者、他の形態のアルツハイマー病の患者、ならびに対照患者のＣＳＦ中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルならびに血漿中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量する。血漿−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）の定量的に異なったレベルは、血管性疾患の患者と他の形態のアルツハイマー病の患者との分別を可能にする。
【０１４５】
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【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明は、例えば、神経変性疾患の診断試薬の製造分野、神経変性の研究用試薬の製造分野などにおいて利よ可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】実施例１．３に記載のウエスタンブロットであり、アルツハイマー病および対照の脳の側頭皮質におけるＲａｂ３ａ免疫反応性を示す。１は１２．８μｌの対照患者Ｎｏ．３；２は６．４μｌの対照患者Ｎｏ．３；３は３．２μｌの対照患者Ｎｏ．３；４は１．６μｇの対照患者Ｎｏ．３；５は１．０μｌの対照患者Ｎｏ．３；６は１０μｌの対照患者Ｎｏ．３；７は１０μｌの患者Ｎｏ．１；８は１０μｌのＡＤ Ｎｏ．２；９は１０μｌの対照患者Ｎｏ．１；１０は１０μｌの対照患者Ｎｏ．２；１１は１０μｌのＡＤ患者Ｎｏ．３；１２は１０μｌの対照患者Ｎｏ．４。
【図２ａ】脳脊髄液におけるシナプス蛋白Ｒａｂ３ａ（ａ）およびＳＮＡＰ２５（ｂ）の安定性。実施例１．５に記載のようにシナプス蛋白に対して特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりシナプス蛋白の分解を定量した。精製シナプス蛋白をＣＳＦのプールに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした（リジェンド：ＣＳＦ中のＲａｂ３ａ）。対照として、シナプス蛋白を同じＣＳＦのプールに添加し、直接定量した（リジェンド：Ｒａｂ３ａ；ＳＮＡＰ２５）。１％ ＢＳＡ中での安定性もアッセイした（結果示さず）。
【図２ｂ】脳脊髄液におけるシナプス蛋白ＳＮＡＰ２５（ｂ）の安定性。実施例１．５に記載のようにシナプス蛋白に対して特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりシナプス蛋白の分解を定量した。精製シナプス蛋白をＣＳＦのプールに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした（リジェンド：ＣＳＦ中のＳＮＡＰ２５）。対照として、シナプス蛋白を同じＣＳＦのプールに添加し、直接定量した（リジェンド：ＳＮＡＰ２５）。１％ ＢＳＡ中での安定性もアッセイした（結果示さず）。
【図３】Transduction Labs(Lexington, KY, USA;カタログ番号S63320)から得た抗体のα−シヌクレインに対する特異性を示す。Ａ：クーマシー染色ゲル；Ｂ：抗Ｈｉｓモノクローナル抗体で発色させてすべての生成物の発現が明らかとなったウエスタンブロット；Ｃ：Transduction Labs(Lexington, KY, USA;カタログ番号S63320)から得たモノクローナル抗体で発色したウエスタンブロット。レーン１：α−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン２：β−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン３：γ−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン４：ニューロン特異的エノラーゼを発現するイー・コリを用いた対照レーンレーン５：分子量標準；レーン６：プラスミドを有しないイー・コリ株。
【図４】２００μｌのＣＳＦ中のα−シヌクレインの検出。実施例２．２に記載したように分子量ならびにRotophorにより等電点によってプールしたＣＳＦを分離した。Ｍ：分子量マーカー；Ｒ１：ｐＩ３；Ｒ２：ｐＩ４；Ｒ３：ｐＩ４．５；Ｒ４：ｐＩ４．５；Ｒ５：ｐＩ５；Ｒ６：ｐＩ５；Ｒ７：ｐＩ５．５；Ｒ８：ｐＩ６；Ｒ９：ｐＩ６；Ｒ１０：ｐＩ６．５；Ｒ１１：ｐＩ６．５；Ｒ１２：ｐＩ７；Ｒ１３：ｐＩ７；Ｒ１４：ｐＩ７．５。
【図５】α−シヌクレインならびにα−シヌクレインのカルボキシ末端に対するモノクローナル抗体３Ｂ５および９Ｂ６のマッピングに使用した重複ペプチドのアミノ酸配列。ペプチドの合成に使用したカルボキシ末端部分を太字で示す。モノクローナル抗体ならびに市販抗体（クローン42,IgG1,Transduction Labs, Lexington, KY, USA）により認識されるペプチドを示す。
【図６】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体クローン４２との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図６−１】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体３Ｂ５との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図６−２】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体９Ｂ６との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図７】実施例１．６および３．１に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した、３２人のＡＤ患者、２０人の血管性痴呆（ＭＩＤ）患者、および１１人の対照のＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびタウのレベル。
【図８−１】実施例４．１に記載されたＡＤ患者のＣＳＦにおけるＲａｂ３ａとＳＮＡＰ２５との間、Ｒａｂ３ａとβ−アミロイド（１−４２）との間の関係。実施例１．６および３に記載しサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【図８−２】実施例４．１に記載されたＡＤ患者のＣＳＦにおけるＲａｂ３ａとタウとの間の関係。実施例１．６および３に記載しサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【図９】治療前の診断におけるタウ値。１はＡＭＬ（３）；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋（１）；３はダウンＡＭＬ（２）；４は脊髄形成異常（２）；５はその他［髄芽細胞腫（２）、横紋筋肉腫（２）、頭蓋内胚細胞腫（１）］；６はＢ−ＮＨＬ（８）；７はホジキン病（３）；８はダウンＮＢ ＡＬＬ（１）；９はＮＢ ＡＬＬ（２１）；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群（１）１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋（１）；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ（４）；１３は対照（６）（カッコ内は患者数）。
【図１０ａ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｂ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｃ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（β−アミロイド（１−４２））濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｄ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（ＮＳＥ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｅ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（血清ＬＤＨ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｆ】１日目のＣＳＦ白血球数を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。測定方法は実施例３に記載されている。
【図１１ａ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１１ｂ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１１ｃ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロン特異的エノラーゼ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１２ａ】化学療法の異なるフェーズにおける１３人の非Ｂ ＡＬＬ患者のＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１２ｂ】化学療法の異なるフェーズにおける１３人の非Ｂ ＡＬＬ患者のＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ａ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｂ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（β−アミロイド（１−４２））のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｃ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｄ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロン特異的エノラーゼ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１４ａ】ＡＭＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてのタウのレベル。Ｘ軸上の数は表７ｃに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１４ｂ】ＡＭＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてのニューロモジュリンのレベル。Ｘ軸上の数は表７ｃに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１５ａ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるタウの個体レベル。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１５ｂ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるβ−アミロイド（１−４２）の個体レベル。実施例３に記載のごとくβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１５ｃ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるニューロモジュリン（または成長関連蛋白４３）の個体レベル。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１６】６０人のアルツハイマー病（ＡＤ）患者および３２人の年齢を合わせた対照におけるタウおよびニューロモジュリンの個体レベルの相関関係。実施例３に記載のごとくタウおよびニューロモジュリンのレベルを測定した。
【図１７】アルツハイマー病（ＡＤ）患者、パーキンソン病（ＰＡＲＫ）患者および対照患者（ＣＯＮＴ）におけるタウ／ｎｍおよびβ−アミロイド（１−４２）の個体レベルの相関関係。実施例３に記載のごとくタウ、ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性の診断の分野に関する。本発明は、体液中の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを使用する、神経変性の分別診断のための新たな方法に関する。また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５またはα−シヌクレイン（synuclein）を検出するための新たな方法ならびに神経変性の分別診断のための組み合わせアッセイにおけるこれらの方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性はいくつかの神経学的疾患の特徴となっている。神経変性は、軸索損傷、除々に広がるニューロンの死、神経伝達物質放出または受容体機能の異常、ミエリンの破壊、ＣＮＳ血流の変化、血液／脳関門機能不全および／または変化した酸素代謝、他のＣＮＳ代謝経路における困難性および／またはＣＮＳの機能不全を引き起こす可能性のある種々の他のしばしば不明な様相を包含しうる。今日では、異なる疾患は異なる神経機能不全の様相に関連している（概説としてはWilson et al., 1991参照）。例えば、アルツハイマー病は、大脳皮質中の神経細胞の死および消失が関与するすべての神経変性疾患のうち最も重要なものである。それは最も普通に起こる老人の痴呆であり、患者および家族の苦難ならびに当該疾病により完全に無能となった患者の長期のケアに必要なコストによる経済的損失を引き起こす。前頭側頭葉痴呆は初期の変性的痴呆の２番目にありふれたタイプであり、全痴呆患者の約３〜１０％を占める（Brun, 1993; Knopman, 1993）。臨床的特徴は優勢な前頭葉症候群の存在により特徴づけられ（Sjogren, 1997）、それは情緒障害および精神分裂病のような他の障害においても観察される（Abbruzzese et al, 1997）。レービー小体疾患は、進行性の痴呆または精神病とともに存在する疾病である。発症時には不存在であるかまたは穏やかであるが最終的には通常の堅固なものとなるなパーキンソン病の徴候は、一般的には重症である。レービー小体は脳幹、基底核、視床下部核および新皮質に多く見られる。パーキンソン病は人生の半ば以降に起こるレービー小体疾患の１つのタイプであり、非常にゆっくりと進行し、長い経過をたどる。それは、主に黒質線状体ドパミン作動性系に関連したニューロン系の疾患の一例と考えられる。一方、脳血管性疾患は、脳血管に関連したいくつかの病理学的プロセスの１つにより引き起こされる。それは発展途上国における心臓疾患および癌の後の３番目に主要な死亡原因であり、１０００００人につき７９４人の割合である。６５歳以上の人工のうち５％が卒中、すなわちこれらの病理学的プロセスの１つの結果として生じる急性の神経学的傷害にかかる。神経変性はある種の化合物（表１）、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントに曝露されることによっても起こる。小児白血病および脳腫瘍に対する長期の治療（または予防）により併発される病気は、行動の変化、学業不振、記憶力低下、知能減退、成長遅延、ホルモン混乱、および異常なＣＴスキャン（脳萎縮、脳室拡張、脳内石灰化）を包含する。白血病生存者における知恵遅れ（ＩＱ、記憶力、注意力、視覚空間認識能の欠乏）（Fletcher et al., 1988）または認識機能低下（Ochus et al., 1991）は、それぞれ、放射線照射後あるいは頭蓋照射を行わない化学療法の後に観察された。さらに、４歳未満の小児は、頭蓋放射および／または化学療法の神経毒性効果に対して特に感受性がある（Moore et al., 1986; Jannoun et al., 1983）。大部分の薬剤に関しては、高用量治療、組み合わせ化学療法、当該照射併用、および頸動脈内または鞘内注射が、標準的な経口または静脈内治療よりも神経学的合併症を引き起こす可能性が高い。神経系のいずれかの部分が損傷を受ける可能性がある。癌患者はより攻撃的に治療を受け、化学療法剤をより多く投与され、長く生き、新しい化学療法剤が開発され、現存している薬剤がより意図的または新規な方法で使用されるので、癌の化学療法による神経学的合併症はよりありふれたものとなり、重症で複雑なものとなるであろう。
【０００３】
患者が一般的な医学的ケアを必要とする大部分の神経学的症状は、容易に示される疾病のプロセスによる。疾患部位およびその原因に関する正しい診断を行うための神経学的分析方法を開発することが臨床研究者の任務である。正確な診断後にのみ、疾病の効果的な管理および治療が可能である。能の機能および構造の研究を可能にするポジトロン放出核種トモグラフィー（ＰＥＴ）、単一フォトン放出核種コンピューター計算トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）および核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲＳ）のごとき患者における神経変性のいくつかの診断方法が開発されている。しかしながら、大部分の神経学的疾患は、疾患の他の形態の排除に基づいて臨床的に診断され、いくつかの場合には異なる神経学的疾患を区別することさえ不可能である。例えば、レービー小体タイプの痴呆あるいはレービー小体痴呆（ＬＢＤ）は神経弛緩剤に対して感受性があり、アルツハイマー病と区別することが臨床的に非常に困難である（McKeith et al., 1996; Ballard et al., 1998）。大部分の患者（７５％以上）は神経病理学的にアルツハイマー病であると決定されるが、臨床的にアルツハイマー病であると決定された患者の１５ないし２５％はレービー小体痴呆を有する（Hooten et al., 1998）。レービー小体痴呆はアセチルコリンエステラーゼでの治療により感受性があるので、アルツハイマー病からのレービー小体痴呆の分別は治療最適化にとり必須である（Levy et al., 1994; Perry et al., 1994; Wilcock et al., 1994）。
【０００４】
前頭側頭葉痴呆は、その徴候が他の疾患においても観察されうるので、しばしば他のタイプの痴呆または他の精神病と誤診される。
【０００５】
血管性疾患とアルツハイマー病との間に明確な相違はなく、誤診の危険性が明らかである。血管性疾患の薬理学的治療は可能なので、早期の正しい診断が重要である。
【０００６】
ある種の化合物、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントのごとき誘発薬剤により引き起こされる脳の損傷に関する認識および治療は、大部分の神経学者に対して頻繁かつ重要な臨床的な問題を残す。臨床的診断が疑わしい場合、神経病理学的試験により最終的な診断を決定的に行うことができる。そのようなものとして、正確かつ分別的な神経変性に関する診断が死亡後にのみ可能となる。それゆえ、患者における神経学的疾患の早期検出ならびに異なる薬剤により誘導された神経学的変化のモニタリングのための方法は、誘発剤への曝露を継続できるかどうか、適当な用量および薬剤が個々の患者に使用され、正しい治療の開始のために使用されるかどうかを決定するための助けとなるであろう。
【０００７】
最近になって、細胞死、軸索成長／再誘導、炎症および／または血液脳関門機能不全に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）の症状を反映する多くの神経学的マーカーが利用できるようになった。
【０００８】
例えば、微小管関連蛋白タウ（tau）は対になった螺旋フィラメント（ＰＨＦ）および神経原線維のもつれ（ＮＦＴ）の主要蛋白成分である（Brion et al., 1985; Delacourte and Defossez, 1986; Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986; Kondo et al., 1988）。タウ蛋白は異なるイソ形態として存在し、それらのうち４ないし６種は成人脳に見られるが、１のイソ形態だけは胎児脳において検出される。イソ形態の多様性は、ｍＲＮＡスプライシングによりヒト染色体１７上の単一遺伝子から生じる（Himmler, 1989; Goedert et al., 1989; Andreadis et al., 1992）。分子クローニングから推定されるタウ蛋白の最も著しい特徴は分子のカルボキシ末端部分に存在する３１または３２個のアミノ酸の並びであり、３回または４回繰り返されることがある。さらなる多様性はタウ分子のＮＨ２末端における２９ないし５８個のアミノ酸の挿入により生じる（Goedert et al., 1989）。インビボにおいて、タウは、そのリピート領域（２５５〜３８１）中に局在化する微小管結合ドメインに関連する相互作用によって微小管アッセンブリーおよびニューロンの軸索コンパートメントの安定性を促進する（Lewis et al., 1988）。正常な環境において、成人脳はタウ１分子あたり２〜３分子のリン酸根を含む（Selden and Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al., 1992）。ラットおよびヒトにおいて研究された正常タウにおける異なる部位でのリン酸化は発達状態に依存している（Lee et al., 1991; Bramblett et al., 1993; Goedert et al., 1993）。リン酸化の結果として生じる６０、６４および６８ｋＤａのタウ変種が、神経原性線維のもつれを示す脳の領域において検出されている（Delacourte et al., 1990; Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990; Greenberg and Davies, 1990）。これらの脳はタウ１分子あたり６〜８個のリン酸根を含む（Ksiezak-Reding et al., 1992）。ＰＨＦから単離されたタウ（ＰＨＦ−タウ）において、リン酸化は数個の位置において起こっている（Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992）。いままでのところ、脳抽出物中のホスホ−タウの検出は、抗体によって（Mab Alz50: Ghanbari et al., 1990; Mab Ab423: Harrington et al., 1991; Mab AT120: Vandermeeren et al., 1993; Mab AT180; Mab AT270: WO95/17429として公開された国際特許出願ならびにMab AT8: WO93/08302として公開された国際特許出願）あるいは分子量の変化によって（Flament et al., 1990）あるいは機能のアッセイ（Bramblett et al., 1992）による他の方法により行われており、その検出により、変化した細胞骨格特性に関連した痴呆対象と正常な老人対象とを、あるいは他のタイプの痴呆患者とが識別されている。リン酸化されていないタウのエピトープを認識する個々のモノクローナル抗体の組み合わせを用いて、脳脊髄液中のタウおよびＰＨＦ−タウの存在が検出されている（Van de Voorde et al., 1995）。
【０００９】
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）のガンマサブユニットはニューロン細胞質の主要構成成分である（Kato et al., 1981）。ＮＳＥは可溶性脳蛋白の３％を占める。成人において、それは虚血、感染または腫瘍起源の活性ニューロンのダメージを評価することにおいて有用であると考えられている（Garcia et al., 1994）。小児血清中のＮＳＥについては研究されていない。Neraら（1988）は、脳脊髄液中または血清中の高レベルのＮＳＥが昏睡状態の小児における効果の乏しさおよび死亡と関連性があることを示した。しかしながら、増加した血清ＮＳＥは必ずしもＣＮＳ起源ではない。末梢ニューロンを含むいくつかの組織、内分泌腺、リンパ球、赤血球、ならびに血小板はＮＳＥを含み（Kaiser, 1989）、このマーカー単独での使用に対する妨げとなりうる。
【００１０】
４０〜４３個のアミノ酸の長さのβ−アミロイドは、アミロイド前駆体蛋白またはＡＰＰと呼ばれる大きな前駆体蛋白の蛋白分解的開裂により生じる。アミロイドは正常細胞の代謝の間に生成される。アミロイドペプチドは高度な異種性を示す。β−アミロイドの２つの主要な形態が同定されており、β−アミロイド（１−４０）およびβ−アミロイド（１−４２）である。β−アミロイド（１−４２）はアルツハイマー病、ダウン症候群および正常な老人の脳の神経突起プラークの主要構成成分である。それは神経毒性であるかもしれず、他の損傷に対するニューロンの弱さを増すことが知られている。さらに、低濃度の可溶性アミロイドは、同時に生じる神経毒性に依存しないコリン作動性活性の低下を誘導しうる。アセチルコリンは認識プロセスにおいて重要な役割を果たしている（Auld et al., 1998）。十分に定義されたペプチドのエピトープを特異的に認識する高親和性モノクローナル抗体の開発により、未濃縮脳脊髄液中のβ−アミロイド（１−４２）ペプチドに関する簡単な試験が可能となった（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）。この試験は薬剤、放射線照射、またはＡＰＰプロセッシングを妨害する化学物質のモニタリングにおいて価値を有することも証明されている。
【００１１】
ニューロモジュリンまたはＢ−５０とも呼ばれる成長関連蛋白−４３（ＧＡＰ−４３）は神経組織特異的蛋白であり、主に軸索および前シナプス末端に局在化している。ＧＡＰ−４３は、ニューロン成長、神経突起形成、ならびに再生およびニューロン新芽形成において役割を果たしていると考えられている（Skene and Woillard, 1981; Basi, 1987; Benowitz et al., 1989; Mercken et al., 1992a）。シナプス蛋白はシナプス機能において異なった役割を有している。シナプシンのごとき蛋白は、融合に利用可能な小胞の量を決定することにおいて重要であるが、Ｒａｂ３およびラブフィリンは膜に対して小胞を標的化することにおいて重要である。ドッキングのプロセスはシナプトブレビン、ＳＮＡＰ２５、Ｓｅｃおよびシンタクシンの分子複合体によって決定されているが、ＣＳＰおよびシナプトタグミンは小胞内容物のＣａ２＋依存性放出において重要な役割を果たすと考えられている。アルファ−シヌクレイン（synuclein）は黒質および基底核のシナプスにおいて豊富であり、α−シヌクレインおよびγ−シヌクレインを包含する蛋白のファミリーに属している。
【００１２】
体液中に存在し、安定であり、中枢神経系におけるニューロンの代謝状態を反映するかかる細胞内マーカーは、臨床的徴候が存在する前でさえも、神経変性の早期認識において有用であるかもしれない。可能ならば他の診断方法と組み合わせて使用できるニューロン機能に関する生化学的指数は、神経変性の臨床的な診断の正確さおよび治療的モニタリングを改善することを大きく促進するであろう。
【００１３】
アルツハイマー病は豊富な老人斑、細胞内のもつれおよびシナプスの損失により特徴づけられる。タウおよびβ−アミロイド（１−４２）はこれらのもつれおよびプラークのそれぞれの必須成分であり、これらはＡＤの神経病理学的試験における２つの診断構成要素である。タウおよびβ−アミロイド（１−４２）は両方とも脳脊髄液（ＣＳＦ）中において検出され、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）がアルツハイマー病の神経学的マーカーとして使用可能であるということは現在十分に確認されているが、ＣＳＦにおけるいかなる変化がアルツハイマー病の病理生理学に関係しているのかはまだ知られていない。ＣＳＦ−タウは、同年齢の対象と比較するとアルツハイマー病患者において増加しており、脳におけるもつれの数に関連しているが、一方では、アルツハイマー病においてβ−アミロイド（１−４２）は減少している。老人性の、散在性のプラークを伴わない痴呆、例えば前頭葉痴呆においてβ−アミロイド（１−４２）が減少していることが見出されているので、おそらくβ−アミロイド（１−４２）はプラーク形成には関連していないであろう。脳組織に関する研究は、プラークともつれが痴呆の程度に関連していることを示唆しているが、Mini-Mental Stateにより決定したところＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）のレベルは一貫して痴呆の程度に関連しているわけではなく、同様に存在している他のタイプの痴呆と重複している。アルツハイマー病患者におけるベータ−アミロイド（１−４０）のレベルは正常対照と比較して変わりがないので（Motter et al., 1995）、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）に加えてβ−アミロイド（１−４０）を神経学的マーカーとして使用すること（Soji et al., 1998；非特許文献１）は、アルツハイマー病の診断アッセイを改善するものではない。
【００１４】
脳のＧＡＰ−４３に関する研究は、アルツハイマー病の前脳皮質においてそのレベルが低下するが、他の領域ではそのレベルが上昇することを示唆している（Coleman et al., 1992）。痴呆性疾患の患者の体液中のＧＡＰ−４３に関する研究はまだ行われていない。
【００１５】
ＡＤ患者の脳におけるもう１つの重要な構造上の変化はシナプスの損失である。実際に、もつれ、プラークおよびシナプス損失を測定する最近の研究は、主にシナプス損失が痴呆の程度に関連していることを示唆している（Terry et al., 1991）。シナプス損失の研究において、シナプトフィシンの免疫反応性の低下が観察された。他のシナプス蛋白：シナプトタグミン、Ｒａｂ３ａ、シナプトブレビンおよびシンタクシンについても同様の減少が報告されている（Blennow et al., 1996; Davidsson et al., 1996; Shimohama et al., 1997; Ferrer et al., 1998）。また、いくつかの形態のパーキンソン病に関して、シナプス蛋白が病理学的役割を果たしていることが強く示されている。２種のまれな形態の家族性パーキンソン病のα−シヌクレインにおいて２つの変異が検出され、α−シヌクレインはレービー小体中の主成分として特徴づけられた。インビボにおけるレービー小体の形成はシヌクレインの蓄積により生じる可能性があり、シヌクレイン蓄積は迅速な軸索輸送の減少またはシヌクレインの過剰発現に結果である可能性がある（Jensen et al., 1998）。シナプス蛋白は主に痴呆の程度と関連があるように思われる（Terry et al., 1991）ので、体液中のシナプス蛋白の検出および定量方法を提供することは有用であろう。ＣＳＦ中のシナプス蛋白の存在および定量はまだ十分に開発されていない。クロモグラニンはＣＳＦ中のシナプス損失のマーカーとしてすでに使用されているが、減少は「純粋」なまたはタイプＩのアルツハイマー病においてのみ示されている（Blennow et al., 1995）。その後まもなくシナプトタグミンＩがＣＳＦ中に存在することが示された（Davidsson et al., 1996）。この研究において、アルツハイマー患者の左側の海馬体および前頭皮質のBrodmann領域９においてシナプトタグミンが選択的に減少することが示された。ＣＳＦの貯留物に基づいて、この減少がＣＳＦにも存在する可能性が示唆されたが、定量されていない。Davidssonら（1996）はＣＳＦ中のＲａｂ３およびシナプトフォシンを検出することができなかった。
【００１６】
また、ある種の化合物、放射線照射、化学療法または低酸素−虚血イベントへの曝露により誘発される神経変性に関しては、正確な診断ツールが使用できない。周産期仮死は神経学的後遺症に関連している可能性がある。しかしながら、低酸素−虚血イベント後の早期の正確な評価は新生児ケアにおける最も困難な問題の１つとなっている。現在に至るまで、脳の血流の研究と組み合わされた臨床的な脳電図による評価、および神経放射線学的評価が最も容易に利用できる方法である。変化した脳の代謝活性がＣＳＦ中の成分の変化に反映されるということが除々に明らかになってきたので、ＣＳＦの神経学的マーカーの検出は低酸素−虚血イベントの評価におけるデータを補うものとなる可能性がある（Garcia-Alix et al., 1994）。化学療法、放射線照射または低酸素−虚血イベント後のＣＳＦの神経学的マーカーと行動の変化とのリンクについては全く調べられていない。
【非特許文献１】Soji M, Matsubara E, Kanai M, Watanabe M, Nakamura T, Tomidokoro Y, Shizuka M, Wakabayashi K, Igeta Y, Ikeda Y, Mizushima K, Amari M, Ishiguro K, Kawarabayashi T, Harigaya Y, Okamotot K, Hirai S (1998) J Neurol Sci 158: 134-140.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、個体における神経変性の特異的検出、定量、および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるアルツハイマー病の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるレービー小体疾患の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるパーキンソン病の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体における前頭側頭葉痴呆の、より特異的な検出、定量および／または分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、パーキンソン病とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、レービー小体疾患とアルツハイマー病との分別方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のための方法、ならびに異なる形態のアルツハイマー病の分別診断のための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、化学療法により、あるいは化合物または放射線照射に対する曝露により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、白血病または脳腫瘍の治療を受けた個体における、化学療法により誘発された神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、周産期仮死により生じる神経変性の診断方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白Ｒａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体における神経変性の、より特異的検出、定量および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病の、より特異的検出、定量および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、脳脊髄液中のシナプス蛋白α−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、個体におけるより特異的な検出、定量、および／または分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、アルツハイマー病および／またはレービー小体疾患の、より特異的な検出または定量を可能にする、ならびに／あるいはレービー小体疾患とアルツハイマー病との分別診断を可能にする、脳脊髄液中のα−シヌクレインの新たな検出方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、上記方法を行うための診断キットを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、特定の治療の有効性の治療モニタリングおよび／または決定のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を行い、体液中の特定の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを用いると、正確かつ迅速な神経変性の特異的検出および分別検査ができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、
（１）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程：
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法：
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；
（２）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも３種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー：
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
の組み合わせを認識するものであるか；あるいは
少なくとも２種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち１つが２つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ：
−タウ、β−アミロイド（１−４２）；または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
のいずれかを認識するものである、キット；
（３）個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）を一緒にあるいは別個に含む支持体；
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）；
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー；
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、（２）に記載のキット；
（４）（１）に記載の方法を行うために特別に設計された（２）または（３）に記載のキット
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、体液中の異なる神経学的マーカーを検出する組み合わせアッセイを使用する、神経変性の特異的検出および分別検査のための新たな方法が提供される。本発明により、正確かつ迅速な神経変性の特異的検出および分別検査を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、個体中の神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための方法に関する。これらの方法は、該個体の１つまたはそれ以上の体液試料中の少なくとも３つの神経学的マーカーのレベルを決定することを包含するものであり、該方法により、神経変性のタイプおよび程度が、対照試料と比較した場合の該神経学的マーカーすべてのレベルの量的変化により反映される。
【００２２】
本願の実施例からわかるように、少なくとも３つの神経学的マーカーの使用により、より特異的かつ高感度な神経変性的症状の検出が可能となった。少なくとも３つの神経学的マーカーの使用により、臨床診断を基礎としては分別できなかった多くの神経学的症状間の識別が可能となったことも明らかである。
【００２３】
本明細書の用語「神経変性」および「神経変性的症状」は同じ意味であり、本明細書において混用される。これらの用語は、神経の機能不全に関連した脳症状を包含する。神経変性に関連した種々の疾病はWilson et al. (1991)において引用されている。それらはアルツハイマー病、卒中（集中性脳傷害）、散在性脳傷害、血管性疾患、パーキンソン病、レービー小体疾患、クロイツフェルド・ヤコブ（Creutzfeld Jacob）病、前頭側頭葉痴呆、ギラン・バレ（Guilain Barre）症候群、多発性硬化症、正常圧水頭、筋委縮性側索硬化症、分裂病、鬱病、神経ラチリズム、転換および仮死を包含する。しかしながら、このリストは完全なものではない。神経機能不全に関連していることが知られている他の疾患も包含される。神経変性は、神経機能不全に関連しており、薬剤を包含する特定の原因により引き起こされるいずれかの種類の脳のダメージまたは脳のいずれかの症状も包含する。本発明の好ましい具体例において、特に検出、定量および／または分別診断される神経変性的症状は、アルツハイマー病、レービー小体疾患、パーキンソン病および前頭側頭葉痴呆からなる群より選択される。「レービー小体疾患」は、脳幹、基底前脳、視床下部核および／または新皮質におけるレービー小体を示すいずれかの疾患について用いる。レービー小体疾患はパーキンソン病、多発性全身性萎縮症およびレービー小体痴呆を包含する。
【００２４】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、特に検出、定量および／または分別診断される神経変性的症状は、低酸素−虚血イベント、化学療法、放射線療法により、あるいは化合物または放射線に対する曝露により誘導されるものである。より詳細には、神経変性は、白血病または脳腫瘍の治療の間に化学療法または放射線療法により誘導されうる。
【００２５】
しかしながら、この神経変性的症状のリストは不完全である。脳の機能不全が起こる他の症状も包含される。
【００２６】
本明細書の「神経変性の特異的検出」なる表現は、３つ未満の神経学的マーカーを診断に使用した場合に得られるよりも、特定の神経変性的症状に対する関連性を有する特定の疾患または特定の神経学的疾患の原因に関して、より高い感度および特異性が得られることを意味する。
本明細書の表現「神経変性の定量」は、特定の神経変性的症状による神経の機能不全の程度が測定されることを意味する。
本明細書の表現「神経変性の分別診断」は、神経学的障害の特定の疾患または特定の原因が特定の神経変性的症状に関連している種々の神経変性的症状を識別することをいう。
【００２７】
個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断は、下記工程を含むイムノアッセイを用いて、該個体の１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３つの異なる神経学的マーカーの検出により行われる：
該個体から１またはそれ以上の体液試料を得ること；および
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下において、体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該体液試料を接触させること；および
該体液試料に対する該抗体の免疫学的結合を検出すること；
対照試料と比較して、該神経学的マーカーすべてのレベルの量的変化に反映される神経変性のタイプおよび程度を該体液中の該神経学的マーカーのレベルに基づいて推断すること。
【００２８】
次いで、免疫学的結合の検出のための方法を行うことができ、該方法は、抗原および神経学的マーカーの１つを認識する抗体により形成された該抗原−抗体複合体を下記のものと混合することにより行われる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体は、抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊抗原−抗体複合体の特異的エピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であって、好ましくは固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたポリクローナル抗体であってもよい
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付する、あるいは特異的にカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかのマーカー
ｃ）抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応、を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）また可能ならば、標準化する目的で、神経学的マーカーの検出に使用する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００２９】
有利には、本発明に使用する抗体は適当な支持体上に固定化される。抗体は３つまでの（３つよりも多い神経学的マーカーを検出する場合には３つよりも多い）異なった支持体または同じ支持体上に存在していてもよい。抗体が同じ支持体上に（例えば、１のマイクロタイタープレートのウェル）に存在する場合、それらそれぞれの免疫学的結合を特異的マーカーにより検出してもよい。あるいはまた、抗体は同じ支持体の別々の位置に存在してもよい。その場合、これらの抗体のいずれかの免疫学的結合を検出する汎用マーカーを用いて検出を行ってもよい。有利には、ニ次抗体自身がマーカーとの直接または間接的カップリングのためのマーカーまたは基を担持しているものである。あるいはまた、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いて本発明の方法を実施してもよい。
【００３０】
用語「エピトープ」は、抗体結合部位により特異的に結合される抗原−抗体複合体の部分をいう。エピトープは当該分野で知られた方法により決定でき、あるいは当該分野で知られた種々のコンピューター推定モデルにより推定できる。
本明細書の表現「認識」、「〜と反応」、「免疫学的結合」または「抗原−抗体複合体」は、抗体および抗原の免疫学的特性を考慮したすべての条件下で抗原と抗体との間の結合が起こることと解釈すべきである。
用語「体液」は、血液、リンパ液、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）（これらに限らない）を包含する人体に存在するすべての液体をいう。
【００３１】
特別な具体例において、本発明は、体液試料が脳脊髄液試料および血液試料からなる群より選択されるものである上記方法に関する。血液試料は患者から採取される全血試料を包含する。より好ましくは、血液試料は血漿試料または血清試料を包含する。
【００３２】
本発明の方法において、２つの異なる体液中の同じマーカーを検出すること（少なくとも他のマーカーの検出と組み合わせて）、あるいは３つの異なる体液試料中の同じマーカーを検出することも可能である。例えば、脳脊髄液中において２つの神経学的マーカーが検出され、これらの神経学的マーカーの一方が血漿中においても検出される。実施例に示すように、２つの異なる体液中の同じマーカーの検出は、１の体液中においてのみこのマーカーを検出する場合と比較して、より特異的かつ高感度な検出ならびに神経変性のより良い分別診断を可能にする。
【００３３】
本発明の方法において検出される神経学的マーカーは、特定のタイプの神経細胞または細胞機能に関連したいずれの蛋白であってもよく、神経変性の条件下において１またはそれ以上の体液中のそのレベルが疾病のプロセスまたは神経学的疾患の原因を示すものである。特定の神経学的条件下において、１またはそれ以上の体液中のある神経学的マーカーは増加し、またある神経学的マーカーは減少する。特定の神経学的条件下における特定の体液中において変化したレベルを有する３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の神経学的マーカーの可能な組み合わせを、個体における該神経学的症状の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用可能な神経学的マーカーは：タウ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、シナプス蛋白（Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、α−シヌクレイン、シナプシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、シンタキシン、ラブフィリン、ｎ−ｓｅｃ、システインストリング蛋白および他の蛋白）、グリア細線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、１００、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ニューロフィラメント（ＮＦ）、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）および１４−３−３を包含する。しかしながら、これらに限らない。特定の疾病プロセスまたは神経学的疾患の原因を示す他の神経学的マーカーを使用することもできる。異なる神経学的疾病および脳損傷にかかっている患者体液中のこれらの神経学的マーカーのうちいくつかの挙動を表２に示す。
【００３４】
調製された、あるいは当該分野において存在するモノクローナル抗体であって、上記神経学的マーカーの１つを認識するモノクローナル抗体を神経学的マーカーの検出に使用することができる。タウを特異的に認識する抗体はAlz50 (Ghanbari et al., 1990), Ab423 (Harrington et al., 1991), AT8 (WO 93/08302として公開された国際出願), AT120 (Vandermeeren et al., 1993); AT180 および AT270 (WO 95/17429として公開された国際出願) および AT100 (WO 96/04309として公開された国際出願)を包含する。しかしながら、タウを特異的に認識する、当該分野で知られた他の抗体を用いることもできる。ＮＳＥを特異的に認識する抗体は１０Ｃ１および２Ｅ７ならびにInnogenetics (Gent, Belgium) から入手できる他のもの, Dako (Glostrup, Denmark; Cat No BBS/NC/VI-H14)から入手できるような市販されている抗体, Biogenex (San Ramon, CA, USA; Cat Nos MA055-5C and AM055-5M)、RDI (Flanders, NJ, USA; Cat No RDI-TRK4N6)、Diagnostic Systems (Basel, Switzerland; Cat No 07 34373)、Immunosource (Brussels, Belgium; Cat Nos CLA 73/5 and CR7041M)およびCortex Biochem (San Leandro, CA, USA; Cat No CR7047)から入手できるもの等を包含する。ＮＳＥを認識する抗体のリストは完全でなく、当該分野において利用または記載されている抗体であって、ＮＳＥを認識するものを用いることもできる。β−アミロイドを特異的に認識する抗体は2H3, 8E5 (Johnson-Wood et al., 1997), 10H3 (Majocha et al., 1992; Friedland et al., 1994), 2G3 (Citron et al., 1996), BA-27 and BC-05 (Suzuki et al., 1994), BNT77 (Asami-Odaka et al., 1995), 369.2B (Koenig et al., 1996), 22C11 (Lannfelt et al., 1995), 6E10 (Kim et al., 1990) および AMY-33 (Stern et al., 1990)を包含する。しかしながら、当該分野において知られた、β−アミロイドを特異的に認識する他の抗体を用いてもよい。ニューロモジュリンを特異的に認識する抗体は、NM2 (Oestreicher et al., 1994), NM4 (Six et al., 1992), NM1, NM3, NM6, NM7 および NM8 (Mercken et al., 1992a)を包含する。しかしながら、ニューロモジュリンを特異的に認識する、当該分野で知られた他の抗体を使用してもよい。Ｒａｂ３ａを特異的に認識する抗体は市販されている抗体を包含し、例えば、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号R35520)から入手可能である。ＳＮＡＰ２５を特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Serotec (Oxford, UK; Cat No SP12)、Sternberger Monoclonals Inc. (Distributed by Affinity Research Products Lim., Mamhead, Exeter, UK; Cat No SMI-81)、Chemicon (Temecula, CA, USA; Cat No MAB331) および Transduction Labs (Lexington, KY, USA; Cat No S35020)から入手できる。ＳＮＡＰ２５を認識する抗体のリストは完全でなく、市販されている、あるいはＳＮＡＰ２５２を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。α−シヌクレインを特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号S63320)から入手可能である。市販されている、あるいはα−シヌクレインを認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。神経学的マーカーとして使用できる他のシナプス蛋白の特異的検出のために、種々の抗体が市販されており、そして／あるいは当該分野において知られている。Ｓ１００を特異的に認識する抗体は市販されており、例えば、Biogenex (San Ramon, CA, USA; Cat Nos MA058-C および AM058-5M) および Innogenetics (Gent, Belgium; Cat No M-011)から得られるものである。Ｓ１００を認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいはＳ１００を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。１４−３−３を特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA; Cat No sc-1657) および Transduction Labs (Lexington, KY, USA; Cat No F46820)から得ることができる。１４−３−３を認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいは１４−３−３を認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。ニューロフィラメントを特異的に認識する抗体は市販抗体を包含し、例えば、Innogenetics (Gent, Belgium; Cat Nos M-011 および M-005) および Alexis (Laeufelfingen, Switzerland; Cat Nos BC-4000-A-L001 および BC-4010-A-L001)から得ることができる。ニューロフィラメントを認識する抗体のこのリストは完全でなく、市販されている、あるいはニューロフィラメントを認識すると当該分野において記載されている他の抗体を用いてもよい。
【００３５】
Fab、F(ab)’2、ssFv（１本鎖可変フラグメント）のごときこれらのモノクローナル抗体に由来するフラグメント、ならびに抗体の可変領域を保持している構築物のような他の抗体であって、元の結合特性を保持しているものを本発明の方法に使用することもできる。一般的には、かかるフラグメントは、例えばパパイン、ペプシンまたは他のプロテアーゼのような酵素での消化により得られる。モノクローナル抗体、またはそのフラグメントを種々の用途のために修飾できることが、当業者によく知られている。ミニ抗体およびジアボディー、トリアボディー、４価抗体およびペプタボディーのごとき多価抗体を本発明の方法に使用することもできる。これらのフラグメントおよび多価抗体の調製は国際特許出願ＷＯ９８／２９４４２に詳述されている。
【００３６】
本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体は、ＨまたはＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列から、あるいはＨまたはＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから組み換えＤＮＡ法によって作成されるマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであってもよい。あるいはまた、本発明の方法に使用されるモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワークの少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
【００３７】
本発明の方法に使用される抗体を、酵素、蛍光または放射活性タイプの適当な標識で標識してもよい。
【００３８】
本発明の特別な具体例において、上記方法において検出される神経学的マーカーの少なくとも１つは、タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、ニューロン特異的エノラーゼおよび／またはシナプス蛋白からなる群より選択される。上記群から１つが選択される３、４、５、６、７、８つまたはそれ以上のマーカーの可能な組み合わせを、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。本発明の方法いおいて使用される１つよりも多い（すなわち、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上またはすべての神経学的マーカー）を上記群から選択することができる。
【００３９】
本発明のより特別な具体例において、上記方法において検出される１つ、より好ましくは２つ、最も好ましくは３つの神経学的マーカーを下記群から選択する：
タウ、β−アミロイド（１−４２）、およびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）。
【００４０】
より特別な具体例において、体液中、好ましくはＣＳＦ中においてタウを検出し、２種の異なる体積、好ましくはＣＳＦおよび血漿においてβ−アミロイド（１−４２）を検出する。
【００４１】
もう１つのより特別な具体例において、上記方法において検出される少なくとも１つの神経学的マーカーは、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５およびα−シヌクレインからなる群より選択されるシナプス蛋白である。上記シナプス蛋白の群からそのうち１つが選択されている３、４、５、６、７、８またはそれ以上のマーカーを、個体の神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。
【００４２】
したがって、本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、Ｒａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００４３】
Ｒａｂ３ａを特異的に認識する抗体を脳組織中のＲａｂ３ａの検出に利用することができるが、脳脊髄液中のＲａｂ３ａの検出の証拠はない。Davidssonら（１９９６年）は彼らの方法を用いることによっては脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出することができなかった。脳脊髄液中のＲａｂ３ａの特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Transduction Labs (Lexington, KY, USA; カタログ番号R35520)から得ることができる。
【００４４】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００４５】
次いで、抗原およびＲａｂ３ａ認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、Ｒａｂ３ａまたはＲａｂ３ａ−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、Ｒａｂ３ａを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００４６】
本明細書の実施例に示すように、ポリクローナルＲａｂ３ａ血清をディテクター抗体として使用してもよい。
【００４７】
有利には、二次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００４８】
本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するための新たな検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、ＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００４９】
ＳＮＡＰ２５を特異的に認識する抗体を脳組織中のＳＮＡＰ２５の検出に利用することができるが、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５の検出の証拠はなく、これまで検出が示されていない。
【００５０】
脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５の特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Serotec (Oxford, UK;カタログ番号SP12)、Sternberger Monoclonals Inc. (Affinity Research Products Lim., Mamhead, Exter, UK;カタログ番号SMI-81)、Chemicon (Temecula, CA, USA;カタログ番号MAB331)またはTransduction Labs (Lexington, KY, USA, カタログ番号S35020)から得ることができる。
【００５１】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００５２】
次いで、抗原およびＳＮＡＰ２５認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、ＳＮＡＰ２５またはＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、ＳＮＡＰ２５を認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００５３】
本明細書の実施例に示すように、ポリクローナルＳＮＡＰ２５血清をディテクター抗体として使用してもよい。
【００５４】
有利には、ニ次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００５５】
本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するための新たな検出方法にも関し、該方法は少なくとも下記工程を含む：
個体から脳脊髄液試料を得ること；次いで、
抗原−抗体複合体の生成に適した条件下で、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）に該脳脊髄液試料を接触させること；次いで、
該脳脊髄液試料への該抗体の免疫学的結合を検出すること。
【００５６】
α−シヌクレインを特異的に認識する抗体を脳組織中のα−シヌクレインの検出に利用することができるが、脳脊髄液中のα−シヌクレインの検出の証拠はない。脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在はこれまで報告されていないので、α−シヌクレインがＣＳＦ中に存在するかどうかは疑わしいものであった。本発明は、はじめてα−シヌクレインが脳脊髄液中に存在することを示すことができた。さらに、脳脊髄液中のα−シヌクレインの定量的検出のための正確な方法が開発された。また本発明者は、レービー小体疾患（これに限らない）を包含するある種の神経変性条件下においてα−シヌクレインが変化することも示した。
【００５７】
脳脊髄液中のα−シヌクレインの特異的検出を可能にするいずれの抗体をこの新しい方法に使用してもよい。本発明の方法において使用する好ましいモノクローナル抗体を、Transduction Labs (Lexington, KY, USΑ, カタログ番号R35520)から得ることができる。
【００５８】
有利には、本発明で使用するモノクローナル抗体は適当な支持体上に固定化された状態である。可能ならば、この固定化状態は抗ＩｇＧで被覆されたあるいは被覆されていないマイクロタイタープレートであってもよい。別法として、当業者に知られた他のいずれかのイムノアッセイフォーマットを用いることにより本発明方法を実施してもよい。
【００５９】
次いで、抗原およびα−シヌクレイン認識抗体により形成された該抗原−抗体複合体を、下記のものと一緒にすることにより免疫学的結合の検出方法を実行することができる：
ａ）二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体（またはディテクター抗体）は、抗原−抗体複合体のエピトープを認識するが、単独の一次抗体を認識しないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、α−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
ｂ）該二次抗体に特異的にタグを付しあるいはカップリングするマーカーであって、当業者に知られたいずれかの使用可能なマーカー
ｃ）抗体と脳脊髄液との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液；および
ｄ）さらに可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインを認識する抗体と反応する精製蛋白または合成ペプチド。
【００６０】
有利には、二次抗体自体がマーカーを担持しているか、あるいはマーカーに直接または間接的にカップリングする基を担持している。
【００６１】
好ましい具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出するためのこれらの方法を、１またはそれ以上の他の神経学的マーカーの検出方法と組み合わせて使用して、個体における神経変性を特異的に検出、定量および／または分別診断することができる。
【００６２】
さらに好ましい具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出するためのこれらの方法を、タウ、ホスホタウ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）からなる群より選択される１またはそれ以上の神経学的マーカーの検出方法と組み合わせて使用することができる。
【００６３】
より詳細には、神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用されるマーカーを下記の群から選択することができる：
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはＲａｂ３ａ；あるいは
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはＳＮＡＰ２５；あるいは
タウ、ホスホタウ、ＮＳＥ、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、ニューロモジュリンまたはα−シヌクレイン。
【００６４】
上記群からの３、４、５、６または７つの可能なマーカーを、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断に使用することができる。
【００６５】
もう１つの具体例において、Ｒａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５および／またはα−シヌクレインを検出する方法を組み合わせて使用して、神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断を行うことができる。したがって、本発明は、神経学的マーカーの２つまたは３つがＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５およびα−シヌクレインからなる群より選択される方法に関する。
【００６６】
非常に特別な具体例は、アルツハイマー病および／またはレービー小体疾患の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病とレービー小体疾患との分別診断のための上記方法に関し、該方法において、
脳脊髄液試料中の少なくともα−シヌクレインのレベルが決定され；および／または
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびα−シヌクレインのレベルが決定される。
【００６７】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において、
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａのレベルが決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびＳＮＡＰ２５のレベルが決定される。
【００６８】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病および／またはパーキンソン病の特異的検出または定量のための、および／またはアルツハイマー病とパーキンソン病との分別診断のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００６９】
もう１つの非常に特別な具体例は、化学療法、化合物への曝露および／または放射線照射により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００７０】
もう１つの非常に特別な具体例は、脳腫瘍または白血病の治療を受けた個体において化学療法、化合物への曝露および／または放射線照射により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリンのレベルが決定される。
【００７１】
もう１つの非常に特別な具体例は、周産期仮死により誘導された神経変性の特異的検出または定量のための方法に関し、該方法において、少なくとも３つの神経学的マーカーが検出される。
【００７２】
もう１つの非常に特別な具体例は、前頭側頭葉痴呆の特異的検出または定量、および／または前頭側頭葉痴呆と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において、脳脊髄液試料中のタウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが決定される。
【００７３】
もう１つの非常に特別な具体例は、アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のための、異なる形態のアルツハイマー病の分別診断のための、および／またはアルツハイマー病と他の痴呆との分別診断のための方法に関し、該方法において少なくとも：
脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液試料中のタウおよびホスホタウのレベルが定量的に決定され、血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定され；あるいは
脳脊髄液中のタウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルが定量的に決定される。
【００７４】
個体の体液中の少なくとも３つの神経学的マーカーのレベルを決定することによる、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための上記方法を単独で使用することができ、あるいは簡単にモニターされる神経学的終点（例えば、白血球カウント）と組み合わせて、あるいは血漿中の薬剤濃度の測定と組み合わせて使用することができる。
【００７５】
また本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のための診断キットにも関し、該キットは該個体の１またはそれ以上の体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３つの抗体を含む。
【００７６】
より詳細には、本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のためのキットに関し、該キットは少なくともマイクロタイタープレートのごとき支持体を含み、該支持体は該個体の１またはそれ以上の体液試料中の異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する、一緒にされたあるいは別個のウェル中にある少なくとも３つの抗体を有している。
【００７７】
また本発明は、個体における神経変性の特異的検出、定量および／または分別診断のためのキットにも関し、該キットは下記のものを含む：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する、一緒にされたあるいは別個のウェル中にある少なくとも３つの抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体、
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）
＊該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体は神経学的マーカー−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化された神経学的マーカーまたは神経学的マーカー−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００７８】
特別な具体例において、本発明は、上記方法の１つまたはそれ以上を行うためにそれぞれ設計された上記診断キットに関する。
【００７９】
より詳細には、本発明は、下記のものを特異的に認識する抗体を少なくとも含む上記診断キットに関する：
α−シヌクレイン；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびα−シヌクレイン；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａ；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＳＮＡＰ２５；あるいは
タウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ニューロン特異的エノラーゼおよびニューロモジュリン；あるいは
タウ、ホスホタウおよびβ−アミロイド（１−４２）；あるいは
タウおよびβ−アミロイド（１−４２）。
【００８０】
また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するためのキットにも関し、該キットはＲａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８１】
また本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するためのキットにも関し、該キットはＲａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８２】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のＲａｂ３ａを検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、Ｒａｂ３ａを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はＲａｂ３ａ−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はＲａｂ３ａ−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたＲａｂ３ａまたはＲａｂ３ａ−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とＲａｂ３ａ−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、Ｒａｂ３ａの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８３】
また本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するためのキットにも関し、該キットはＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８４】
また本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するためのキットにも関し、該キットはＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８５】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のＳＮＡＰ２５を検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、ＳＮＡＰ２５を認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたＳＮＡＰ２５またはＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、ニ次抗体とＳＮＡＰ２５−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、ＳＮＡＰ２５の検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８６】
また本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するためのキットにも関し、該キットはα−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む。
【００８７】
また本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するためのキットにも関し、該キットはα−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体を少なくとも含む。
【００８８】
より詳細には、本発明は、脳脊髄液中のα−シヌクレインを検出するあめのキットに関し、該キットは下記のものを含む：
少なくとも、α−シヌクレインを認識するモノクローナル抗体（一次抗体または捕捉抗体）を含むマイクロタイタープレートのごとき支持体
二次抗体（またはディテクター抗体）
＊該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないモノクローナル抗体であってもよく、あるいは
＊該二次抗体はα−シヌクレイン−一次抗体複合体のエピトープと免疫学的複合体を形成できるが、単独の一次抗体とは免疫学的複合体を形成できないポリクローナル抗体であってもよく、該ポリクローナル抗体は、好ましくは、固定化されたα−シヌクレインまたはα−シヌクレイン−一次抗体複合体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたものである
可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付するあるいはカップリングするためのマーカー、
可能ならば、一次抗体と体液試料との間、二次抗体とα−シヌクレイン−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液、
可能ならば、標準化を目的として、α−シヌクレインの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド。
【００８９】
また本発明は、特定の治療の治療モニタリングおよび／または有効性の決定のための上記いずれかの方法またはキットの使用にも関する。開示したマーカーのいずれかに特異的な抗体を記載するすべての文献の内容を、参照により本明細書に一体化させる。
【００９０】
以下の実施例は本発明を説明するためにだけ役立つ。
【００９１】
【表１】
【００９２】
【表２】
【００９３】
【表３】
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【００９６】
【表６】
【００９７】
【表７】
【００９８】
【表８】
【００９９】
【表９】
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
【表１１】
【０１０２】
【表１２】
【０１０３】
【表１３】
【０１０４】
【表１４】
【実施例１】
【０１０５】
実施例１：ＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の検出
１．１ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５のクローニング
製造者の増幅プロトコルに従ってQuick-ScreenTMヒトｃＤＮＡライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA, USA;カタログ番号K1003-1）からＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５コーディング配列を増幅するために特別なプライマーを使用した。簡単に説明すると、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒アニーリング、次いでＴａｑポリメラーゼ（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands;カタログ番号600131）を用いて７２℃で２分伸長からなるサイクルを３５サイクル行った。７２℃で７分間のポリメラーゼ伸長反応にてプログラムを終了した。Perkin-Elmer（Ueberlingen, Germany）ＤＮＡサーマルサイクラー（４８０型）にて反応を行った。Ｒａｂ３ａを増幅するためのプライマーの配列はヒトＲａｂ３ａ配列（Zahraoui et al., 1989）に基づくものであった：ＡＴＧプライマーとしてATG GCA TCG GCC ACA GAC TCG CGC TAT GGG (Tm=76℃)および逆プライマーとしてCGCG TCTAG AGG CTC TCA GCA GGC GCA GTC CTG GTG CGG (Tm=77℃)。ＳＮＡＰ２５を増幅するためのプライマーの配列はヒトＳＮＡＰ２５配列（Zhao et al., 1994）に基づくものであった：ＡＴＧプライマーとしてATG GCC GAA GAC GCA GAC ATG CGC AAT GAG (Tm=75℃)および逆プライマーとしてCGCG CTAG ACA CTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG TTG (Tm=59℃)。
ＰＣＲ生成物を再増幅して十分な量のＰＣＲ生成物を得て、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで仕上げを行い、ＸｂａＩで切断し、ＮｃｏＩで平滑末端化され、ＸｂａＩで切断されたｐＩＧＲＨＩＳＡ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2075）中に連結した。これにより、Ｒａｂ３ａに関してｐＩＧＲＨＩＳＡＲａｂ３ａ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号3008）を、ＳＮＡＰ２５に関してｐＩＧＲＨ６ＳＮＡＰ２５ａ（Innogenetics, Gent, Belgium;カタログ番号2941）を得た。連結生成物をＤＨ１（λ）（Bachmann, 1987）中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーをインサートの存在について分析した。インサートを配列決定し、正しい配列（Zahraoui et al., 1989; Zhao et al., 1994）を含むプラスミドをさらに使用した。Ｒａｂ３ａに関しては、ＰＣＲによるいくつかの人工的要因が存在した。２つのクローンから正しい配列を組み立てた。
【０１０６】
１．２ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の発現および精製
ＰＬに基づく発現系ｐＩＧＲＨＩＳＡＲａｂ３ａおよびｐＩＧＲＨ６ＳＮＡＰ２５ａを用いてＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５をそれぞれイー・コリにおいて発現させた。温度感受性ｃＩリプレッサーを有するＭＣ１０６１ ｐＡＣＩ（Wertman et al., 1986）中に正しいプラスミドを形質転換した。約２５ｋＤａのクーマシー染色可能なバンドが１２．５％アクリルアミドゲル上に可視化され、合理的な発現レベルが示された。組み換え蛋白は、ＮｉＩＭＡＣカラムでの精製を迅速ならしめる６個の付加ヒスチジン残基を含む融合蛋白として得られた。３リットルの熱誘導イー・コリ（Houchi, 1988; Van Gelder et al., 1993）を用いて、１０ｍｇよりも多い組み換えＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５を精製し、少なくとも９５％の均質性であった。
【０１０７】
１．３ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に特異的な抗体の取得および特徴付け
Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に対する抗体をウサギにおいて生成させた。５０μｇの精製蛋白を２匹のウサギに腹腔内注射した（１００μｇ／ウサギ１匹）。４週間ごとに注射を行い、ＥＬＩＳＡで力価を測定した。抗体は脳抽出物により特徴づけられた。Ｒａｂ３ａ免疫反応性に関する結果を図１に示す。アルツハイマー病患者および対照患者からの組織試料を、５倍体積の１％ ＳＤＳ、１％ バナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４中で迅速にホモジナイズし、次いで、水浴にて５分間煮沸することにより調製した。ホモジネートを５分間遠心分離（１２０００ｇ、室温）して不溶性物質を除去した。少量の上清を用いてＢＣＡ法（Pierce, Rockford, Illinois, USA）により蛋白濃度を測定した。上清を水で希釈して蛋白濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、同体積の２ｘ試料緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、３％ ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００６％ブロモフェノールブルーおよび２％ β−メルカプトエタノール）を添加した。１０〜１２．５％ゲルのLaemmli系によりゲル電気泳動を行った。半乾燥ブロッティング法により蛋白をニトロセルロース（Schleicher and Schull, Dassel, Germany;カタログ番号401196）に移行させた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％ ＢＳＡでニトロセルロースフィルターをブロックした。１％ ＢＳＡ中適当濃度（±１μｇ／ｍｌ）の一次抗体およびニ次抗体を添加した。
【０１０８】
１．４ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に特異的な抗体の免疫アフィニティー精製
０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６中で精製組み換え抗原を透析した。透析前後においてＯＤ２８０値を測定して蛋白量を評価した。Mini-Leak-Medium（KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada;カタログ番号10127、ロット番号60232-5）を用い、製造者の指示に従って免疫精製を行った。抗体の一部をビオチン化させた（Amersham, Place Little Chalfont ]Buckinghamshire, UK;カタログ番号RPN 2202）。銀染色およびウエスタンブロットにより精製および標識化をモニターした（データ示さず）。
【０１０９】
１．５ ＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の安定性および存在の評価
特異的モノクローナル抗体（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; R35520およびS35020）を捕捉抗体として用い、免疫精製されたポリクローナルウサギ抗血清をディテクター抗体として用いて、ＣＳＦ中に添加したシナプス蛋白Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の安定性を、３７℃で一晩インキュベーションした後に評価した。濃度５００ｐｇ／ｍｌにおいて、ＳＮＡＰ２５およびＲａｂ３ａに対する組み換え体の免疫反応性は試験したＣＳＦ中で一晩置いても変化しなかった（図２）。
５０ｍｌのＣＳＦからのアルブミンおよびＩｇＧの抽出ならびにカラムでの分画により、両蛋白がＣＳＦ中に存在するという直接的証拠を得た。フラクションを乾燥させ、試料緩衝液に溶解し、１２％アクリルアミドゲルで泳動し、ブロッテイングした。Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５モノクローナル抗体を用いてＰＶＤＦ膜をプローブした。予想分子量およびｐＩの免疫反応性バンドが検出された。
【０１１０】
１．６ Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５の検出およびＣＳＦレベルの定量的測定のためのＥＬＩＳＡの開発
モノクローナルＲａｂ３ａまたはＳＮＡＰ２５抗体を捕捉抗体とし、免疫アフィニティー精製されたビオチン化ポリクローナル抗体をディテクター抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144）で被覆した。ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ（臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384）をブロッキング緩衝液として使用した。ブロッキング緩衝液で１／１０００に希釈したマウス抗Ｒａｂ３ａ（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 R35520, IgG2a, クローン 9, ロット番号 606-259-1550 ロット 2）または抗ＳＮＡＰ２５（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S35020, IgG1, クローン 20）を添加した。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加した（濃度範囲４００００〜２．５６ｐｇ／ｍｌ）。同時に、アフィニティー精製されたウサギ抗Ｒａｂ３ａまたは抗ＳＮＡＰ２５抗血清を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加した。次いで、１／２０００に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン（Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084）によりビオチン化ウサギ抗体を検出した。カップリングしたペルオキシダーゼを、ＴＭＢ Ｈ２Ｏ２基質溶液により検出した。３０分後に２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。このＥＬＩＳＡに基づいて１０ｐｇ／ｍｌ程度のＲａｂ３ａを検出することができた。ＳＮＡＰ２５のアッセイは同じ原理に基づくものであった。
【実施例２】
【０１１１】
実施例２：脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在および検出
２．１ α−シヌクレインに対する特異性に関する市販抗体の評価
異なるシヌクレインのイソ形態（isoform）に対する市販モノクローナル抗体（Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320, IgG1）の特異性を評価した。公表された配列のデータ（α-synuclein: accession number L08850; β-synuclein: accession number S69965; γ-synuclein: accession number AF010126）に基づくプライマーを用いて、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン、γ−シヌクレインのオープンリーディングフレーム（ＡＴＧから停止コドンまで）をヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（HL5018; Clontech, Palo Alto, CA, USA）から増幅した。報告されたように、いくつかの重要なアミノ酸変化がγ−シヌクレインのオリジナル配列に存在した：このクローンにはＫ１２ＥおよびＫ６８Ｅがあり、このクローンのアミノ酸１０９の多型性はＥ１０９Ｖであった。アミノ末端に６個のさらなるヒスチジンを付加するＰＬベースの発現系（ICCG 3307; Innogenetics, Gent, Belgium）中にインサートをサブクローンした。Ｈｉｓタグを付したシヌクレイン融合蛋白をイー・コリにおいて発現させた。次いで、イー・コリ蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。このモノクローナル抗体はα−シヌクレインに対して特異性を示し、シヌクレイン蛋白のカルボキシ末端半分をマッピングしている（図３）。
【０１１２】
２．２ 脳脊髄液中のα−シヌクレインの存在についての評価
数人の患者からのＣＳＦをプールした。Rotophorを用いて２００ｍｌのプールしたＣＳＦを等電点により分離した。次いで、得られたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、Transduction Labs (Lexington, KY, USA)から市販されているモノクローナル抗体を用いてイムノブロッテイングした。２つの免疫反応性バンドが１９ｋＤａの範囲に検出され、ｐＩは４ないし６の範囲であった（図４）。いくつかの負に荷電したアミノ酸（最後の２０個のアミノ酸中に６つのＥ）はｐＩをより塩基性のほうへシフトさせるので、低い方のバンドはＣ末端切断形態である可能性があった。この免疫反応性に基づいて、α−シヌクレインの濃度範囲をｐｇ／ｍｌの範囲で評価した。
【０１１３】
２．３ α−シヌクレイン特異的抗体の取得および特徴づけ
３リットルの誘導イー・コリ培養からα−シヌクレインを精製したところ、１０ｍｇよりも多いα−シヌクレインが精製された（クーマシーおよび銀染色ゲルから評価すると純度は９０％より高い）。いくつかの免疫スキーム（表３）に従って蛋白をマウスに注射した。４回注射後、コーティングＥＬＩＳＡにおいてα−シヌクレインに対する力価を評価した。６匹のマウスは１０００００以上の力価を有していた（バックグラウンドの２倍のＯＤが得られる血清の希釈率として力価を定義）。
最後の注射から３日後、動物３１２（ｍ３）から脾臓細胞を取り、Koehler and Milstein (1975)により記載された方法に大まかに準じて細胞融合に使用した。最初のスクリーニングラウンドでは、直接コーティングアッセイにおいて特異的抗体の存在についてハイブリドーマを試験した。次いで、α−、β−、γ−シヌクレインおよびα−シヌクレイン由来の欠失変異体を含有するイー・コリ溶解物のドットブロットによりそれらを再試験して、シヌクレイン蛋白上の異なるエピトープを認識する抗体を生成するハイブリドーマを選択した。
【０１１４】
２．４ α−シヌクレイン特異的抗体の特徴づけ
ドットブロットにおいてα−シヌクレインに特異的であった２つのハイブリドーマ３Ｂ５（ＩｇＧ２ａ）および９Ｂ６（ＩｇＧ１）を単離した。その正確なエピトープを決定するために、カルボキシ末端部分（位置６４から１４０まで）を、１０個の重複するペプチドとして合成した（図５）。それらのペプチドはアミノ酸１４個の長さで、７個のアミノ酸が重複していた。ビオチン化ペプチドを、１μｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジン被覆プレート上に捕捉した。これらのペプチド上でα−シヌクレイン特異的抗体をインキュベーションし、次いで、抗マウス酵素結合抗体を用いて検出した。トリメチルベンジジンを基質として用いて酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼを定量した。３Ｂ５および９Ｂ６は両方とも、配列LEDMPVDPDNEAYE（位置１１３〜１２６）を含むペプチドを認識し、このモノクローナル抗体に対する直鎖状エピトープが示唆された（図６）。同じセットの実験において、α−シヌクレインを認識することがすでに示されている市販抗体（Clone 42, IgG1, Transduction Labs, Lexington, KY, USA; カタログ番号 S63320）もまた、直鎖状エピトープ（配列AGSIAAATGFVKKD）（図６）にマップできた。
【０１１５】
２．５ α−シヌクレイン特異的抗体の精製およびビオチン化
第２および第３ラウンドのサブクローニング後、１０〜２０ｍｇの抗体を精製するために抗体の生成を１〜２リットルまでスケールアップする。Mini-Leak-Medium（KEM-EN-TEC Biozyme, Vancouver, BC, Canada; カタログ番号 10127, ロット番号 60232-5）を用いて、製造者により提供される説明に従って抗体を免疫精製する。
十分に確立された方法（Bonhard et al., 1984）に従って、Ｄ−ビオチニル−エタ−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Boehringer-Mannheim, Brussels, Belgium; カタログ番号 1008960）を用いてビオチン化を行う。
【０１１６】
２．６ 脳脊髄液中のα−シヌクレイン検出および定量的測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡの開発
α−シヌクレイン抗体を捕捉抗体とし、ビオチン化モノクローナル抗体の１つをディテクター抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを開発する。MaxisporpマイクロタイタープレートをAffini Pureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号115-035-144）で被覆する。ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ（臨床用グレード 98% 脂肪酸不含; ICN, Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, USA; カタログ番号 105033, ロット番号 6p384）＋１％マウス血清をブロッキング緩衝液として使用する。ブロッキング緩衝液で１／１０００に希釈した抗α−シヌクレイン（Transduction Labs, Lexington, KY, USA）を添加する。インキュベーション後、組み換え抗原を異なる濃度で添加する（濃度範囲１０００〜２ｐｇ／ｍｌ）。同時に、１％マウス抗体の存在下においてビオチン化抗α−シヌクレインモノクローナル抗体を最適バックグラウンドシグナル比となるように選択した濃度で添加する。次いで、１／２０００に希釈したセイヨウワサビ標識ストレプトアビジン（Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 016-030-084）によりビオチン化ウサギ抗体を検出する。カップリングしたペルオキシダーゼを、ＴＭＢ Ｈ２Ｏ２基質溶液により検出する。３０分後に２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定する。
【実施例３】
【０１１７】
実施例３：脳脊髄液中の他の神経学的マーカーの検出
３．１ タウおよびホスホタウ
ＡＴ１２０を捕捉抗体とし、ビオチン化ＨＴ７−ＢＴ２をディテクター抗体として用いて、タウ抗原試験（INNOTEST hTau antigen, Innogenetics, Gent, Belgium）により全タウを測定した。モノクローナル抗体ＡＴ１２０は、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応し（Vandermeeren et al., 1993）、モノクローナル抗体ＨＴ７もまた、正常ヒトタウ蛋白および過剰にリン酸化されたヒトタウ蛋白の両方と等しく十分に反応するが、モノクローナル抗体ＢＴ２は優先的に正常タウを認識する（Goedert et al., 1994）。すでに記載されたようにして（Mercken et al., 1992b）調製された、アフィニティー精製されたタウ蛋白を標準物質として使用した。
ＨＴ７を捕捉抗体とし、ビオチン化ＡＴ２７０をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ（INNOTEST phospho-tau(181), Innogenetics, Gent, Belgium）を用いてホスホタウを測定した。ＡＴ２７０はホスホタウを特異的に認識する（国際公開 WO 95/17429）。
【０１１８】
３．２ β−アミロイド（１−４２）
Innotest β-amyloid(1-42)（Innogenetics, Gent, Belgium）を用いてβ−アミロイド（１−４２）濃度を測定した。アッセイはサンドイッチ型ＥＬＩＳＡであり、該アッセイにおいて第１のモノクローナル抗体２１Ｆ１２（アミロイドのカルボキシ末端に特異的）を捕捉抗体として使用し、ビオチン化抗体３Ｄ６（アミノ末端に特異的）をディテクター抗体として使用する。２１Ｆ１２／３Ｄ６の組み合わせはアミロイド（１−４２）ペプチドの特異的検出を可能にする。いくぶんかの交差反応性がアミロイド（１−４２）に関して観察されるが、短いペプチドに関しては観察されない（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）。簡単に説明すると、２１Ｆ１２抗体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁し、４℃で一晩かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを被覆した。１回洗浄工程を行った後、２５℃で２時間、ＰＢＳ−０．１％カゼインでプレートをブロックした。７５μｌのビオチン化３Ｄ６および２５μｌのＣＳＦまたは標準物質を同時インキュベーション（２５℃で１時間）することにより試験を行った。数回洗浄工程を行った後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（RDI, Flanders, New York, NY, USA）を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを２５℃で３０分継続した。次いで、１００μｌの０．４２ｍＭ ３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジンをペルオキシダーゼ基質として添加した。３０分後に５０μｌの０．９Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１１９】
３．３ β−アミロイド（１−４０）
Quality Controlled Biochemicals (QCB, Hopkinton, MA, USA)から得た、Ｃ末端に特異的な、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、３Ｄ６（Citron et al., 1997; Johnson-Wood et al., 1997）をディテクター抗体として用いて、β−アミロイド（１−４０）濃度を測定した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中で２５℃で２時間かけてNunc Maxisorbsマイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのアフィニティー精製されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA; カタログ番号 111-005-144）で被覆した。その後、４℃で一晩、プレートをＰＢＳ−０．１％カゼインでブロックした。ウサギポリクローナル抗体（QCB, Hopkinton, MA, USA; カタログ番号 44-348-20）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２５℃で１時間置いた。数回洗浄工程を行った後、１００μｌのＣＳＦまたは標準物質を２５℃で２時間インキュベーションした。１００μｌのビオチン化３Ｄ６抗体を添加（抱合体希釈物中０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加）して２５℃で１時間置くことにより結合アミロイド量を調べた。プレートをさらに５回洗浄した。１００μｌのＳＶ−ＡＰ（Gibco, Rockville, MD, USA; カタログ番号 JK-4410）を添加することにより結合抗体量を調べた。インキュベーションを２５℃で１時間継続した。最後の洗浄工程（５回）の後、基質緩衝液に溶解した１００μｌのＴＭＢをペルオキシダーゼ基質として添加した。３０分後に５０μｌの０．９Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。
【０１２０】
３．４ ニューロモジュリン
２種のエピトープ特異的モノクローナル抗体（ＮＭ２、ＮＭ４；Oestreicher et al., 1994）を用いてニューロモジュリンについても測定した。捕捉抗体としてＮＭ２を選択し、ディテクター抗体としてビオチン化ＮＭ４を選択した。組み換えニューロモジュリンを標準物質として使用した。
【０１２１】
３．５ ニューロン特異的エノラーゼ
ＮＳＥの測定は、抗ＮＳＥモノクローナル抗体２Ｅ７を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗ＮＳＥモノクローナル抗体１０Ｃ１をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡの測定は、抗ＮＳＥモノクローナル抗体２Ｅ７を捕捉抗体として用い、ペルオキシダーゼ標識抗ＮＳＥモノクローナル抗体１０Ｃ１をディテクター抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡに基づくものであった。ヒト脳から精製したＮＳＥを標準物質として使用した（Vanmechelen et al., 1997）。
ＢＣＡ蛋白試薬（Pierce, Rockford, Illinois, USA）を用いて蛋白濃度を決定した。
【実施例４】
【０１２２】
実施例４：アルツハイマー病の特異的検出および年齢を合わせた対照に対するアルツハイマー病の分別のための神経学的マーカーとしてのＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
４．１ 患者および対照患者
アルツハイマー病（ＡＤ）群は３２人の患者からなり、男性１５人、女性１７人で、平均年齢±ＳＤは７５．０±６．６歳であった。血管性痴呆（ＶＡＤ）群は２０人の患者からなり、男性１０人、女性１０人で、平均年齢±ＳＤは８１．０±７．０歳であった。対照群は１８個体を含み、男性７人、女性１１人で、平均年齢±ＳＤは６７．５±５．５歳であった。ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ判断基準（McKhann et al., 1984）に従って排除を行うことにより可能性のあるＡＤの診断を行った。痴呆の進展、および／または大規模な梗塞および／または多発性裂口のＣＴ所見、および／または重症の血管性疾患の臨床的所見、例えば、合併症を伴う動脈高血圧または糖尿病に関連した一時的な虚血発作および／または卒中エピソードを有する患者においてＶＡＤを診断した。対照群は精神病または神経学的疾患、悪性疾患、または全身性疾患（例えば、リューマチ性関節炎、感染性疾患）の病歴、症状または徴候のない個体からなっていた。６０歳以上の個体において、Multi-Mental state examination （Folstein et al., 1975）を用いて認識状態を試験した。２８点以下のスコアを有する患者は参加させなかった。University of Goeteberg（Goeteberg, Swedec）のEthic Committeeにより当該研究は承認された。患者（または彼らに最も近い親類）および対照群の個体は研究に参加するためのインフォームドコンセントを受けた。
【０１２３】
４．２ 脳に特異的な脳脊髄液の単離
手順はDavidsson et al., 1996に詳述されている。簡単に説明すると、５〜１０ｍｌのＣＳＦをBlue Sepharoseカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に供してアルブミンを選択的に除去した。次いで、アルブミン不含フラクションを、Sepharose 4B（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に共有結合したスタフィロコッカス蛋白Ｇのカラムに供してＩｇＧを吸着させた。ｍＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８カラム（内径２．１ｘ１００ｍｍ、ゲル体積０．３５ｍｌ、粒子サイズ３ｍｍ）を装備したＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia LKB technology）を用いるｍＲ−ＨＰＬＣにより未吸着蛋白を分離した。２回のトリフルオロ酢酸のグラジエントにより蛋白を溶離した。全部で４０個のフラクションをSavant Speed Vac Concentratorで乾燥させた。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解し、超音波処理し、１５分煮沸して、１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。
【０１２４】
４．３ アルツハイマー病の特異的検出のための組み合わせアッセイの評価
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いることにより、ＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を３２人のＡＤ患者、２０人のＶＡＤ患者および１１人の対照のＣＳＦ試料中で測定した。すべてのマーカーの平均レベルを表４にまとめる。個体のタウおよびＲａｂ３ａ値を図７に示す。
ＡＤ患者に関する最高感度および対照患者に関する最高特異性により決定されたカットオフ値に基づいて、確度比を決定した（表５）。Ｒａｂ３ａレベルとＳＮＡＰ２５レベルとが相関関係を有しているので、Ｒａｂ３ａまたはＳＮＡＰ２５のいずれかをタウおよびβ−アミロイドと組み合わせるだけでよい（図８）。かくして、Ｒａｂ３ａとＳＮＡＰ２５の組み合わせに関する確度比を調べなかった。個々のマーカー１つだけあるいは２つだけの組み合わせに関する確度比と比較した場合の、３つの神経学的マーカーの組み合わせ、タウ−β−アミロイド（１−４２）−Ｒａｂ３ａならびにタウ−β−アミロイド（１−４２）−ＳＮＡＰ２５の増加した確度比は、これらの３つのマーカーの組み合わせによりアルツハイマー病のより特異的かつ感度の良い検出が可能になることを示す。
依存的変数、因子としての性別、共分散としての年齢および最小精神的スコア（MMSE; Folstein et al., 1975）のようなすべてのマーカーを有する、十分に階乗的な変数の多数分析（ＡＮＯＶＡ）は、異なる群において、これらのパラメーターが共分散しないことを示した。さらに、タウ、β−アミロイド（１−４２）およびＲａｂ３ａ／ＳＮＡＰ２５の間の有為な相関関係は、各群においても、全群を一緒にしても検出できなかった。
Ｒａｂ３ａおよびＳＮＡＰ２５に対するさらなる抗体を単離する。ＣＳＦ−Ｒａｂ３ａ、ＣＳＦ−ＳＮＡＰ２５、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）のレベルを、許容される試料のサイズにより統計学的に有意な比較が可能な十分に定義された臨床診断群において研究する。
【実施例５】
【０１２５】
実施例５：白血病の治療を受けた小児において化学療法により誘導された神経のダメージを診断するための、ＣＳＦ−タウ、ＣＳＦ−ニューロモジュリンおよびＣＳＦ−ニューロン特異的エノラーゼを用いる組み合わせアッセイ
５．１ 患者および対照患者
１９９６年８月から１９９８年９月までの間、the Pediatric Hemato-oncology Department of the Catholic University of Leuven, Belgiumにおいて癌の治療を受けた８３人の小児から４４８のＣＳＦ試料を得た。すべての患者は診断時点において完全に臨床的評価を受けていた。親のインフォームドコンセントが得られた。
悪性疾患の分類および治療のために、計画された腰椎せん刺（ＬＰ）のコースに試料を供した。血液学的悪性疾患を有する患者の異なる群を本研究に参加させた（表６）。第１群は、United Kingdom Children Cancers group (UKCCSG 9602) NHL protocolに従って治療された９人のＢ細胞非ホジキンリンパ腫患者（Ｂ−ＮＨＬ）からなっていた（表７ａ）。この群において、４人の患者がＢ細胞リンパ腫を有し、３人の患者がBurkittリンパ腫を、２人の患者が未分化ラージ細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を有していた。これらの患者のうち８人は長期にわたり研究された。第２および最後の群は、European Organization for Research and Treatment of Cancer' (EORTC) protocol 58881に従って治療された非Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病／非ホジキンリンパ腫（ＮＢ ＡＬＬ／ＮＨＬ）の４２人の患者からなっていた（表７ｂ）。この第２群において、１８人の小児はＣＤ１０（＋）ブラストまたは通常のＮＢ ＡＬＬを有し、２人の患者はダウン症候群（ＤＳ）を有し、１人の患者はBrachmann-de Lange症候群を有し、３人の患者は通常のＢ細胞ブラストを有し、１人の患者はＴ細胞ブラストを有し、２人の患者はプロＢ細胞ブラストを有し、９人の患者はプレＢ細胞ブラストを有し、８人の患者はＴ細胞ブラストを有していた。３８人の小児が白血病を有し、５人の患者が非ホジキンリンパ腫段階ＩＩ（１人）、段階ＩＩＩ（３人）または段階（ＩＶ）（１人）であり、それらのうち１人の患者は、ＣＳＦ中の悪性細胞に関する研究プロトコル、眼底検査およびコントラストカプテーション（contrast captation）により定義された明らかなＣＮＳの疾病（ＣＮＳ＋）を有していた。５人の患者は、治療プロトコルにおいて定義された判断基準によれば非常に危険性の高い（ＶＨＲ）患者であった（２人の患者はＴ細胞ブラスト、３人の患者はコルチコイド耐性）。この群中の患者のうち２７人は長期にわたり追跡できた。第３の患者群は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の６人の小児からなってお、そのうち１人の患者はＣＮＳの疾病を有し、２人の患者はダウン症候群であった。Ｍ０表現型を有する３人の患者、およびＭ１、Ｍ２またはＭ７表現型が１人ずついた。これらすべての患者はEORTC 58921プロトコルにより治療され、長期にわたり追跡された。他の患者は異種の小児群（ｎ＝１８）からなり、治療前後の感染の診断および段階分けのために臨床的理由により腰椎せん刺を行った。この群は５人の髄芽細胞腫の小児（３人が段階分け中、１人が治療中、１人がフォローアップ中）、３人のホジキン病の小児（段階分け中）、３人の横紋筋肉腫（２人が段階分け中、１人が治療中）、２人の脊髄形成異常（ＭＤＳ）の小児（段階分け中）、２人のランゲルハンス細胞組織球炎（ＬＣＨ／ＨＬＨ、段階分け中）、１人の若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の小児（治療中）、絨毛癌（フォローアップ中）の小児、または胚細胞腫（段階分け中）の小児であった。健康な新生児の大きな群は利用できなかった。なぜなら、これらの患者から脳脊髄液を採取することは倫理に反するからである。対照として、髄膜炎を有する疑いがあるが陰性である小児（ｎ＝４）、局所的網膜芽細胞腫（ｎ＝１）の小児および家族性ヘモファゴサイティックリンパ組織炎球増多症（ｎ＝１）の小児を参加させた。親のインフォームドコンセンサスが得られた。
【０１２６】
５．２ 研究計画
見込のある、かつ長期の単一中心研究計画を用いた。研究に入る前に患者は治療を受けなかった。今回の調査研究において、５８人の小児から得たＣＳＦ試料を治療前に利用した（診断的腰椎せん刺またはＬＰ１）（さらなる詳細は表７参照）。大部分の患者に関してすべての時点において残りの試料が利用できなかった。失われた値は小児の疾病の状態によるのではなく、サンプリングまたは試料の保存の間の人為的要因によるものであった。
診断ワークアップのためのベースラインまたは化学療法のＩＴ投与直前のいずれかにおいて、ルーチンな分析のために腰椎せん刺を行った。別々のポリプロピレンチューブに５ｍｌのＣＳＦを集めた。１の試料を即座に１５００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞および他の不溶性物質を除去した。引き続いて行う分析のために上清を−７０℃で保存した。凍結／融解サイクルの数を最小限とした。ルーチンなＣＳＦ測定は、細胞学的項目、蛋白濃度、グルコース等を包含した。
診断群にかかわらずすべての神経学的マーカーのデータに関する正規化が拒否されたので、非パラメトリック統計を分析に使用した。Kruskal-Wallis検定を用いて、エフェクト変数（タウ、ニューロモジュリン、蛋白等）に関する群の差異を調べた。Wilcoxonサインドランクス検定、マッチド−ペアー（Wilcoxon signed ranks test, matched-pairs）を用いて、最初の診断ＬＰとその後のＬＰとの間の相違をチェックした。Prismソフトウェアｖ２．０１（Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA）、Systatバージョン７（SPSS, Chicago, IL, USA）を用いて分析を行った。
【０１２７】
５．３ 化学療法により誘導された神経ダメージの診断のための組み合わせアッセイの評価
治療前の神経学的マーカーのレベル
まず、感染性疾患（しかしながら、ウイルスおよび細菌培養陰性）（ｎ＝４）の小児から得たＣＳＦ試料に関してタウの正常な上限を調べた。１人の患者は非常に局部的な網膜芽細胞腫を有し、１人の小児は家族性ＨＬＨに関してスクリーニングされた者であった。対照小児における平均タウ値は１０６．２ｐｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ＝３４．３〜１７８．０）であった。任意のカットオフ正常値は３１２ｐｇ／ｍｌ（平均＋３ＳＤ）であり、それは成人において観察される値の範囲内である。正常成人対照の８０％が３５２ｐｇ／ｍｌ未満のタウ値を有するが、４２５ｐｇ／ｍｌ（ｐ２５−ｐ７５：２７４−７１３，ｎ＝１５０）がアルツハイマー病患者のメジアンタウレベルである（Hulstaert et al.,1999）。まず、患者数に関係なく試料を分析し、その後、１の患者から得たすべての試料を１のイムノプレート上でさらに分析した。１０４個の試料のセットに関する第１のアプローチと第２のアプローチとの間の相関係数は０．９０１（９５％ ＣＩ：０．８５６−０．９３３）であった。
診断時のタウレベルを患者の各サブグループに関して分析した（図９）。診断時のタウレベルは６６から１５００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。タウ、ニューロモジュリン、β−アミロイド（１−４２）、β−アミロイド（１−４０）、血清ＬＤＨおよびＣＳＦ白血球カウントに関するデータ（図１０）は、ダウン症候群を有するまたは有しない患者群において、あるいは診断群間において、明らかな相違を示さない。さらに、タウレベルとＷＢＣまたはＬＤＨレベルとの間にも相関関係が見出されなかった。タウ濃度と小児の年齢との間にも有意な相関関係が見出されなかった。２人のＭＤＳ患者、明らかなＣＮＳ侵襲（ＣＮＳ＋）であるがＡＭＬでない小児は、診断時においてタウレベルが著しく上昇していた。また、後方窩における髄芽細胞腫のために頭蓋内圧が上昇して入院した３人の患者から、段階分けのためにＣＳＦを取ったところ、非常に高いＣＳＦ−タウ濃度であった（８２３、１３９７、１５００）。しかしながら、非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬを有する２１人中７人の小児、非常に高い危険性を有する非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬ患者４人のうち１人、ＡＭＬの患者４人のうち２人、およびＢ細胞ＮＨＬの患者８人のうち２人が３１２ｐｇ／ｍｌ以上のタウレベルを有していたが、古典的な診断手順を用いるとＣＮＳ侵襲は検出されなかった。
非Ｂ ＡＬＬ／ＮＨＬを有する２７人の患者あるいはＢ細胞 ＮＨＬを有する９人の患者に関しては（データ示さず）、白血球カウント（ｐ＝０．９３５，ｎ＝４０）または血清ＬＤＨ（ｐ＝０．８５５，ｎ＝３９）によって反映されるように、診断時のタウレベルは腫瘍負荷と相関関係がなかった。ＬＰ１において、タウとニューロモジュリンとの間の非常に有意な相関関係が存在し［ｒ＝０．７９３；９５％ ＣＩ：０．６５８−０．９２８，ｎ＝５０］、両方の蛋白の分泌がある程度相互関係があることが示された。タウとβ−アミロイド（１−４２）との間には相関関係が見られなかった（ｐ＝０．１０３２，ｎ＝５２）。
【０１２８】
Ｂ−ＮＨＬ患者の治療期間中における神経学的マーカーのレベル
化学療法により誘導されたＣＳＦ中のタウの増加に関する最も明確な相違がＢ細胞ＮＨＬ患者において検出された。ベースライン試料および９日目のＬＰ（＝ＬＰ２）におけるフォローアップ試料の両方が利用可能であった３人の患者に関する結果を図１１ａに示す。９日目、すなわちＩＶ ＭＴＸおよびビンクリスチンとともにＭＴＸおよびヒドロコルチゾンをＩＴ投与した後には、すでに最大タウ増加が測定可能であった。タウのさらなる増加はその後測定されなかった。ニューロモジュリン（図１１ｂ）およびニューロン特異的エノラーゼ（図１１ｃ）に関する同様の知見によっても、化学療法により誘導された神経代謝活性に対する効果が確認された。さらに、タウとニューロモジュリンとの間（r=0.722, 95% CI: 0.553-0.834, n=49）あるいはニューロモジュリンとニューロン特異的エノラーゼとの間（r=0.622, 95% CI: 0.247-0.835, n=20）に明確な相関関係があった。
【０１２９】
非Ｂ細胞ＡＬＬ／ＮＨＬ患者の治療期間中における神経学的マーカーのレベル
全治療期間にわたるデータ（前後試料）が、EORTCプロトコル58881により治療を受けた１３人の非Ｂ細胞ＡＬＬ患者に関して利用可能であった。個々の患者について、異なるフェーズまたは治療に関するメジアンタウ値を図１２ａに示す。治療前（ＬＰ１）と比較して（ｐ＝０．０４８）、あるいはメンテナンス期間と比較して（ｐ＝０．０４０）、誘導期間中にタウレベルが有意に増加した。１人の患者は治療開始前からすでにタウレベルが上昇しており（８９３ｐｇ／ｍｌ）、おそらく神経学的機能不全がすでに開始していたことを反映するものであろう。また、治療前と誘導期間との間のニューロモジュリンレベルの増加傾向もあった（図１２ｂ）。治療開始時に高いタウレベルが存在した患者もまた、化学療法開始時において高いニューロモジュリンレベルを示した。ＬＰ１およびＬＰ２に関するＮＳＥのデータが利用可能であった２人の患者において［LP1 (4.0 ng/ml, 3.4 ng/ml); LP2 (11.7 ng/ml, 9.6 ng/ml)］、ＮＳＥの明確な増加が観察された。
非Ｂ細胞ＡＬＬ患者からのすべてのデータの分析により、誘導期間において最高タウ濃度が見られることが明らかとなった。誘導期間中、分析した試料の４１％（２８／６８）が５００ｐｇ／ｍｌよりも高かった。その後、インターバル期間においてこのパーセンテージは１８．９％（１４／７４）まで低下し、再誘導期間中に１６．７％（３／１８）となり、最後に、メンテナンス期間中に９．７％（７／７２）となった（図１３ａ）。治療開始前にすでに上昇したタウ（＞５００ｐｇ／ｍｌ）を有していた３人の患者におけるタウ値は化学療法後に正常化した。β−アミロイド（１−４２）、非Ｂ ＡＬＬ患者におけるニューロモジュリンおよびＮＳＥレベルに関するデータを図１３ｂ、図１３ｃおよび図１３ｄにそれぞれ示す。ここでもやはりタウとニューロモジュリン（r=0.658, 95% CI = 0.580-0.725,n=251）またはＮＳＥ（r=0.589, 95% CI = 0.363-0.749, n=47）との間に明確な相関関係があった。
非常に高い危険性を有する５人の非Ｂ ＡＬＬ小児を、本研究において長期にわたり試験した。最初の治療フェーズはEORTC 58881と同様であった。同様の化学療法により誘導されたタウレベルの変化が５人中４人の患者において観察され、タウとニューロモジュリンとの間の高く有意な相関関係も観察された（n=55; r=0.880, 95% CI: 0.802-0.929）。
１人のダウン症候群−非Ｂ ＡＬＬ患者は診断時に７０ｐｇ／ｍｌのタウ濃度を有していた。すべての非Ｂ ＡＬＬ患者における平均タウ増加は、長期研究の８日目で２５０％（95% CI = 130% 370%, n=13）、２１日目で２００％（95% CI = 150%-260%, n=8）であったが、ダウン症候群患者のタウ増加パーセンテージは８日目および２１日目においてそれぞれ８２０％および１２００％であった。
高い白血球負荷（６１００００ＷＢＣ／ｍｍ３）のため、１人の特別な患者を、１日目にＩＴ ＭＴＸを使用せずにプレドニソロンで８日間治療した。治療８日後にタウレベルは低いまま、すなわち１５５ｐｇ／ｍｌであった。その後、この患者は他の非Ｂ ＡＬＬ患者と同様にEORTCプロトコル（次の週からＭＴＸをＩＴ注射することを含む）に入った。タウレベルは急激に増加し、１２、１５、１８、２２および４４日目にはそれぞれ７４４、９４８、１１２０、８６１および１０２３ｐｇ／ｍｌとなった。別のセンターで治療を受け、ＭＴＸでの治療後に明らかな神経毒性に苦しんでおり、しかも両側麻痺であった小児から１のＣＳＦ試料が利用可能であった。この小児のタウおよびミューロモジュリンのレベルは使用した最高標準値（タウについて１５００ｐｇ／ｍｌ、ニューロモジュリンについて８０００ｐｇ／ｍｌ）を超え、大規模な神経変性を反映していた。
【０１３０】
ＡＭＬの治療期間中における神経学的マーカーのレベル
図１４ａは、ＡＭＬを有する個々の患者におけるタウの消長を示す。患者１１、１２および２３は治療期間中有意なタウの増加を示さなかった（表７ｃ）。１日目および８日目にＬＰを取った患者１２は激しい疾病を有しており、骨髄移植後間もなく死亡した。ダウン症候群の２人の患者のうち１人から、長期にわたるデータが利用可能であり、この患者は３００ｐｇ／ｍｌをわずかに上回るタウレベルを有しており、患者１１および２３のＣＳＦ中のタウレベルの消長とは対照的であった。診断時にＣＮＳ侵襲の証拠があった患者６９はＣＳＦ中のタウおよびニューロモジュリンの劇的な増加を示した（図１４ｂ）。この小児はまだ治療中であり、現在完全に軽快している。
【０１３１】
結論
我々は、長期の研究において、体液中のタウ、ニューロモジュリンおよびＮＳＥレベルの有意な増加を見出し、それは化学療法に関連した神経のダメージを反映している可能性が最も高く、主にＩＶ コルチコステロイドおよび化学療法剤と組み合わせてＩＴ ＭＴＸを投与した場合に誘導されたが、インターバル治療期間中の高用量のＩＶおよびＩＴ ＭＴＸ投与期間中には誘導されなかった。
【実施例６】
【０１３２】
実施例６：周産期仮死により生じた脳損傷の診断のための組み合わせアッセイ
周産期仮死は神経損傷に関連している可能性がある。電脳図および神経放射線学的データに加えて、ＣＳＦ神経学的マーカーは低酸素−虚血イベントを評価する際の臨床データを補完しうるものである（Garcia-Alix, 1994）。変化した脳の代謝活性はＣＳＦ中の成分の変化を反映するものであるという証拠が増えつつある。ＣＳＦマーカーの周産期レベルおよび仮死による変化の分布を評価する。
【実施例７】
【０１３３】
実施例７：アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー患者との分別のための、神経学的マーカーとしてＣＳＦ−ニューロモジュリン、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
７．１ 患者および対照患者
１０９の個体からＣＳＦを得た。個体を４群に分けた：（ｉ）痴呆に関する神経学的対照と定義される群（ｎ＝７０）。この群は、多発性硬化症、Guillan-Barre症候群、多発性ニューロパシーおよびてんかんの患者を含んでいた。他の群は、（ｉｉ）記憶障害の老人患者（ｎ＝７）、（ｉｉｉ）アルツハイマー病（ＡＤ）患者（ｎ＝２７）、および（ｉｖ）血管性痴呆（ＶＡＤ）の患者（ｎ＝５）からなっていた。International Classification of Diseases, version 9 (Manual of the international statistical classification of diseases, injuries, and causes of death: based on recommendations of the Ninth Revision Conference; 1975, and adopted by the Twenty-Ninth World Health Assembly. Geneva: World Health Organization, 1977)により決定された判断基準に従ってすべての患者を診断した。ＡＤ群において、２人の患者は１の家族からの者であり、プレセニリン変異により疾病の早期発症がわかっている。これらの患者のうち１人は徴候前であった。
神経学的試験の一環としてＣＳＦをルーチンに採取した。ＣＳＦの残りについてすべての試験を行った。ポリプロピレンチューブ中に正しく保存され、１回だけ凍結されたＣＳＦ試料においてのみβ−アミロイド（１−４２）を測定した。
【０１３４】
７．２ アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
これらの患者のＣＳＦ中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン（ＧＡＰ−４３）を調べた。各群の平均ＣＳＦレベルを表８に示す。β−アミロイド（１−４２）、タウおよびニューロモジュリンの個人レベルを図１５ａ、１５ｂおよび１５ｃにそれぞれ示す。
ＡＤ患者においてＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）が有意に変化していた。また、ＡＤにおいてＣＳＦ−ニューロモジュリンが有意に増加していた。対照的に、老人性記憶障害患者においてはＣＳＦ−ニューロモジュリンにおける有意な影響は観察されなかったが、対照患者と比較してＣＳＦ−タウレベルが有意に増加していた。７人の記憶障害患者のうち３人が対照群により決定された最大レベル（２８０ｐｇ／ｍｌ）よりも高いＣＳＦ−タウレベルを有していた。正しくない保存のため、ＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）レベルは３人の記憶障害の患者においてしか調べることができなかった。３人の患者のうち２人において、３００ｐｇ／ｍｌ未満のレベルがみられた。これらの患者のうち１人は上昇したＣＳＦ−タウレベルも有していた。他の患者は２７８ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−タウレベルを有しており、すなわち、対照群により決定された最大レベルよりもわずかに低かった。徴候前の家族性ＡＤ患者において、３２７ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−タウレベルにまで増加しており、β−アミロイド（１−４２）レベルは３００ｐｇ／ｍｌ未満であった。少ない記憶障害個体の試料についてのこの分析は、タウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンの組み合わせ使用はアルツハイマー病の存在に関するより良いインジケーターであることを示す。統計学的に有意であるように、１群あたりより多数の試料を分析中である（１の診断群あたり少なくとも５０の試料）。
【実施例８】
【０１３５】
実施例８：アルツハイマー病の特異的検出、対照患者とアルツハイマー患者との分別、パーキンソン病の特異的検出、対照患者とパーキンソン病患者との分別のための、およびアルツハイマー患者とパーキンソン病患者の分別のために、神経学的マーカーとしてＣＳＦ−ニューロモジュリン、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）を用いる組み合わせアッセイ
８．１ 患者および対照患者
６０人のアルツハーマー病患者、２３人のパーキンソン病患者および年齢の合った３２人の対照患者からＣＳＦを得た。これらの患者のＣＳＦ中のタウ、β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリン（ＧＡＰ−４３）を調べた。各群の平均ＣＳＦレベルを表９に示す。
【０１３６】
８．２ アルツハイマー病の特異的検出および対照患者とアルツハイマー病患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
対照と比較すると、ＡＤ患者においてタウが有意に増加していたが、β−アミロイド（１−４２）レベルが減少していた。ＮＭレベルは両群間で有意には異ならなかった。しかしながら、ＮＭとタウのレベルは有意に相関関係があった（図１６）。図１６は、ＡＤ患者に関する値が対照患者に関する値とは異なる可能性を示す。後退判別分析（backward discriminant analysis）（Marrisonら,１９７６年）を用いて、タウ、β−アミロイド（１−４２）、ニューロモジュリンまたはタウ／ニューロモジュリンのいすれの変数が最も良くアルツハイマー病患者を対照患者から識別するものであるかを調べた。変数タウ／ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）を選択し、アルツハイマー患者５８人中５５人（感度９４．８％、ＣＩ ８５．６％〜９８．９％）および対照患者３１人中３０人（特異性９６．８％、ＣＩ ８３．３％〜９９．９％）を正しく分類した（図１７）。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【０１３７】
８．３ パーキンソン病の特異的検出および対照患者とパーキンソン病患者との分別のための組み合わせアッセイの評価
後退判別分析（Morrison, 1976）を用いて、いずれの変数がパーキンソン病患者と対照患者とを最適に識別するものであるかを調べた。変数タウ／ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）を選択した。パーキンソン病患者２３人中１４人が正しく分類され（感度６０．９％、ＣＩ ３８．６％〜８０．３％）、対照患者３１人中２７人が正しく分類された（特異性８７．１％、ＣＩ ７０．２％〜９６．４％）（図１７）。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるパーキンソン病の診断の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【０１３８】
８．４ アルツハイマー病患者とパーキンソン病患者とを分別するための組み合わせアッセイの評価
β−アミロイド（１−４２）およびニューロモジュリンを選択して、アルツハイマー病患者をパーキンソン病患者から分別し、アルツハイマー病患者について感度９４．８％（ＣＩ ８５．６〜９８．９％）、パーキンソン病患者について特異性７８．３％（ＣＩ ５６．３％〜９２．５％）であった。より多くの試料をさらに分析すれば、これら３つのマーカーを用いることによるアルツハイマー病とパーキンソン病の分別の統計学的に有意な改善が可能になるであろう。
【実施例９】
【０１３９】
実施例９：レービー小体痴呆とアルツハイマー病との間の分別を行うための神経学的マーカーとしてのＣＳＦ−α−シヌクレインの使用
９．１ 患者および対照患者
３０〜４０人のアルツハイマー患者、１０〜２０人のレービー小体痴呆患者および１０〜２０人の年齢の合った対照からＣＳＦを得る。
【０１４０】
９．２ アルツハイマー病とレービー小体痴呆との分別診断のためのアッセイ
患者群および対照群からのＣＳＦ中のα−シヌクレイン濃度を定量する。レービー小体痴呆群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値とアルツハイマー病群のα−シヌクレインレベルに関する値の平均値との有意な相違により、両方のタイプの痴呆を分別することが可能である。α−シヌクレインの定量と少なくとも２種の他の神経学的マーカー（タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のごとき）の定量を組み合わせることにより、アルツハイマー病とレービー小体痴呆との分別がさらに改善される。
【実施例１０】
【０１４１】
実施例１０：前頭側頭葉痴呆の特異的検出および前頭側頭葉痴呆と他の痴呆との分別のためにＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−ホスホタウを神経学的マーカーとして使用する組み合わせアッセイ
１０．１ 患者および対照患者
３０〜４０人の前頭側頭葉痴呆患者および１０〜２０人の年齢の合った対照からＣＳＦを得る。
【０１４２】
１０．２ 前頭側頭葉痴呆患者と対照患者との分別診断のための組み合わせアッセイ
前頭側頭葉痴呆患者および対照患者のＣＳＦ中のβ−アミロイド（１−４２）、タウおよびホスホ−タウのレベルを定量する。対照患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値と比較した場合、前頭側頭葉痴呆患者のタウおよびホスホ−タウのレベルの平均値が有意に増加している。前頭側頭葉痴呆患者は、対照患者と比較すると、β−アミロイド（１−４２）のレベル低下を示す。
【実施例１１】
【０１４３】
実施例１１：アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出および他の形態のアルツハイマー病と血管の問題との分別のためにＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよび血漿−ベータ−アミロイド（１−４２）を神経学的マーカーとして使用する組み合わせアッセイ
１１．１ 患者および対照患者
アルツハイマー病の血管性疾患の患者３０〜４０人、他の形態のアルツハイマー病患者３０〜４０人および年齢の合った対照１０〜２０人からＣＳＦおよび血漿を得る。
【０１４４】
１１．２ 血管性疾患と他の形態のアルツハイマー病との分別診断のための組み合わせアッセイ
血管性疾患の患者、他の形態のアルツハイマー病の患者、ならびに対照患者のＣＳＦ中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルならびに血漿中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量する。血漿−β−アミロイド（１−４２）、ＣＳＦ−タウおよびＣＳＦ−β−アミロイド（１−４２）の定量的に異なったレベルは、血管性疾患の患者と他の形態のアルツハイマー病の患者との分別を可能にする。
【０１４５】
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【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明は、例えば、神経変性疾患の診断試薬の製造分野、神経変性の研究用試薬の製造分野などにおいて利よ可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】実施例１．３に記載のウエスタンブロットであり、アルツハイマー病および対照の脳の側頭皮質におけるＲａｂ３ａ免疫反応性を示す。１は１２．８μｌの対照患者Ｎｏ．３；２は６．４μｌの対照患者Ｎｏ．３；３は３．２μｌの対照患者Ｎｏ．３；４は１．６μｇの対照患者Ｎｏ．３；５は１．０μｌの対照患者Ｎｏ．３；６は１０μｌの対照患者Ｎｏ．３；７は１０μｌの患者Ｎｏ．１；８は１０μｌのＡＤ Ｎｏ．２；９は１０μｌの対照患者Ｎｏ．１；１０は１０μｌの対照患者Ｎｏ．２；１１は１０μｌのＡＤ患者Ｎｏ．３；１２は１０μｌの対照患者Ｎｏ．４。
【図２ａ】脳脊髄液におけるシナプス蛋白Ｒａｂ３ａ（ａ）およびＳＮＡＰ２５（ｂ）の安定性。実施例１．５に記載のようにシナプス蛋白に対して特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりシナプス蛋白の分解を定量した。精製シナプス蛋白をＣＳＦのプールに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした（リジェンド：ＣＳＦ中のＲａｂ３ａ）。対照として、シナプス蛋白を同じＣＳＦのプールに添加し、直接定量した（リジェンド：Ｒａｂ３ａ；ＳＮＡＰ２５）。１％ ＢＳＡ中での安定性もアッセイした（結果示さず）。
【図２ｂ】脳脊髄液におけるシナプス蛋白ＳＮＡＰ２５（ｂ）の安定性。実施例１．５に記載のようにシナプス蛋白に対して特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりシナプス蛋白の分解を定量した。精製シナプス蛋白をＣＳＦのプールに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした（リジェンド：ＣＳＦ中のＳＮＡＰ２５）。対照として、シナプス蛋白を同じＣＳＦのプールに添加し、直接定量した（リジェンド：ＳＮＡＰ２５）。１％ ＢＳＡ中での安定性もアッセイした（結果示さず）。
【図３】Transduction Labs(Lexington, KY, USA;カタログ番号S63320)から得た抗体のα−シヌクレインに対する特異性を示す。Ａ：クーマシー染色ゲル；Ｂ：抗Ｈｉｓモノクローナル抗体で発色させてすべての生成物の発現が明らかとなったウエスタンブロット；Ｃ：Transduction Labs(Lexington, KY, USA;カタログ番号S63320)から得たモノクローナル抗体で発色したウエスタンブロット。レーン１：α−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン２：β−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン３：γ−シヌクレインを発現するイー・コリ；レーン４：ニューロン特異的エノラーゼを発現するイー・コリを用いた対照レーンレーン５：分子量標準；レーン６：プラスミドを有しないイー・コリ株。
【図４】２００μｌのＣＳＦ中のα−シヌクレインの検出。実施例２．２に記載したように分子量ならびにRotophorにより等電点によってプールしたＣＳＦを分離した。Ｍ：分子量マーカー；Ｒ１：ｐＩ３；Ｒ２：ｐＩ４；Ｒ３：ｐＩ４．５；Ｒ４：ｐＩ４．５；Ｒ５：ｐＩ５；Ｒ６：ｐＩ５；Ｒ７：ｐＩ５．５；Ｒ８：ｐＩ６；Ｒ９：ｐＩ６；Ｒ１０：ｐＩ６．５；Ｒ１１：ｐＩ６．５；Ｒ１２：ｐＩ７；Ｒ１３：ｐＩ７；Ｒ１４：ｐＩ７．５。
【図５】α−シヌクレインならびにα−シヌクレインのカルボキシ末端に対するモノクローナル抗体３Ｂ５および９Ｂ６のマッピングに使用した重複ペプチドのアミノ酸配列。ペプチドの合成に使用したカルボキシ末端部分を太字で示す。モノクローナル抗体ならびに市販抗体（クローン42,IgG1,Transduction Labs, Lexington, KY, USA）により認識されるペプチドを示す。
【図６】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体クローン４２との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図６−１】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体３Ｂ５との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図６−２】異なるα−シヌクレインのカルボキシ末端ペプチドとモノクローナル抗体９Ｂ６との反応後に得られた光学密度（ＯＤ）。実施例２．４に記載したイムノアッセイにおいて光学密度を測定した。Ｘ軸上の数（１〜１２）は図５に示すペプチドの番号に対応する。
【図７】実施例１．６および３．１に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した、３２人のＡＤ患者、２０人の血管性痴呆（ＭＩＤ）患者、および１１人の対照のＣＳＦ中のＲａｂ３ａおよびタウのレベル。
【図８−１】実施例４．１に記載されたＡＤ患者のＣＳＦにおけるＲａｂ３ａとＳＮＡＰ２５との間、Ｒａｂ３ａとβ−アミロイド（１−４２）との間の関係。実施例１．６および３に記載しサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【図８−２】実施例４．１に記載されたＡＤ患者のＣＳＦにおけるＲａｂ３ａとタウとの間の関係。実施例１．６および３に記載しサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＲａｂ３ａ、ＳＮＡＰ２５、タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【図９】治療前の診断におけるタウ値。１はＡＭＬ（３）；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋（１）；３はダウンＡＭＬ（２）；４は脊髄形成異常（２）；５はその他［髄芽細胞腫（２）、横紋筋肉腫（２）、頭蓋内胚細胞腫（１）］；６はＢ−ＮＨＬ（８）；７はホジキン病（３）；８はダウンＮＢ ＡＬＬ（１）；９はＮＢ ＡＬＬ（２１）；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群（１）１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋（１）；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ（４）；１３は対照（６）（カッコ内は患者数）。
【図１０ａ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｂ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｃ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（β−アミロイド（１−４２））濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｄ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（ＮＳＥ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｅ】１日目のＣＳＦ神経学的マーカー（血清ＬＤＨ）濃度を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１０ｆ】１日目のＣＳＦ白血球数を示す。１はＡＭＬ；２はＡＭＬ−ＣＮＳ＋；３はダウンＡＭＬ／ＭＤＳ；４は脊髄形成異常；５は慢性骨髄性白血病；６はＢ−ＮＨＬ；７はホジキン病；８はダウンＮＢ ＡＬＬ；９はＮＢ ＡＬＬ；１０はＮＢ ＡＬＬ−Brachman症候群；１１はＮＢ ＡＬＬ−ＣＮＳ＋；１２はＮＢ ＡＬＬ−ＶＨＲ；１３はＬＣＨ、横紋筋肉腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、絨毛癌；１４は対照、網膜芽細胞腫（健常者）、ヘモファゴサイトース（hemofagocytose）（gezond HLH）。測定方法は実施例３に記載されている。
【図１１ａ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１１ｂ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１１ｃ】Ｂ細胞ＮＨＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロン特異的エノラーゼ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ａに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１２ａ】化学療法の異なるフェーズにおける１３人の非Ｂ ＡＬＬ患者のＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１２ｂ】化学療法の異なるフェーズにおける１３人の非Ｂ ＡＬＬ患者のＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ａ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（タウ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｂ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（β−アミロイド（１−４２））のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｃ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロモジュリン）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１３ｄ】非Ｂ細胞ＡＬＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）の回数の関数としてＣＳＦ神経学的マーカー（ニューロン特異的エノラーゼ）のレベルを示す。Ｘ軸上の数は表７ｂに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１４ａ】ＡＭＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてのタウのレベル。Ｘ軸上の数は表７ｃに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１４ｂ】ＡＭＬ患者の化学療法期間中の腰椎せん刺（ＬＰ）回数の関数としてのニューロモジュリンのレベル。Ｘ軸上の数は表７ｃに示すＬＰ回数に対応する。マーカーの検出方法は実施例３に記載されている。
【図１５ａ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるタウの個体レベル。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１５ｂ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるβ−アミロイド（１−４２）の個体レベル。実施例３に記載のごとくβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１５ｃ】実施例７に記載されたように、神経学的対照（Guilain-Barre症候群、多発性硬化症等）（１ＣＯＮＴ）、記憶障害の人（２ＭＥＭ）、症候前家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（３ＰＦＡＤ）、家族性アルツハイマー患者（ＰＳ１変異）（４ＦＡＤ）、アルツハイマー患者（５ＡＤ）および血管性痴呆患者（６ＶＡＤ）に分類される個体におけるニューロモジュリン（または成長関連蛋白４３）の個体レベル。データをｐｇ／ｍｌで表す。
【図１６】６０人のアルツハイマー病（ＡＤ）患者および３２人の年齢を合わせた対照におけるタウおよびニューロモジュリンの個体レベルの相関関係。実施例３に記載のごとくタウおよびニューロモジュリンのレベルを測定した。
【図１７】アルツハイマー病（ＡＤ）患者、パーキンソン病（ＰＡＲＫ）患者および対照患者（ＣＯＮＴ）におけるタウ／ｎｍおよびβ−アミロイド（１−４２）の個体レベルの相関関係。実施例３に記載のごとくタウ、ニューロモジュリンおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程：
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法：
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する。
【請求項２】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも３種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー：
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
の組み合わせを認識するものであるか；あるいは
少なくとも２種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち１つが２つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ：
−タウ、β−アミロイド（１−４２）；または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
のいずれかを認識するものである、キット。
【請求項３】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）を一緒にあるいは別個に含む支持体；
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）；
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー；
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、請求項２記載のキット。
【請求項４】
請求項１記載の方法を行うために特別に設計された請求項２または３に記載のキット。
【請求項１】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のための方法であって、下記工程：
神経学的マーカーを特異的に認識する抗体を用いることにより、個体から得た１またはそれ以上の体液試料中の少なくとも３種の神経学的マーカーのレベルを決定する
を特徴とし、さらに以下のことを特徴とする方法：
アルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のために、
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウおよびホスホ−タウのレベルを定量的に測定し、該個体から得た血漿試料中のβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する；あるいは
該個体から得た脳脊髄液試料中のタウ、ホスホ−タウおよびβ−アミロイド（１−４２）のレベルを定量的に測定する。
【請求項２】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、
少なくとも３種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、かつ、各抗体が下記の神経学的マーカー：
タウ、ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
の組み合わせを認識するものであるか；あるいは
少なくとも２種の抗体を含み、各抗体が異なる神経学的マーカーを認識するものであり、該抗体のうち１つが２つの異なる体液中の神経学的マーカーを認識するものであり、各抗体が下記の神経学的マーカーの組み合わせ：
−タウ、β−アミロイド（１−４２）；または
−ホスホ−タウ、β−アミロイド（１−４２）
のいずれかを認識するものである、キット。
【請求項３】
個体におけるアルツハイマー病における血管の問題の特異的検出または定量のため、異なる形態のアルツハイマー病の分別検査のため、ならびに／あるいはアルツハイマー病と他の痴呆との分別検査のためのキットであって、下記のもの：
異なる神経学的マーカーをそれぞれ認識する少なくとも３種の抗体（一次抗体または捕捉抗体）を一緒にあるいは別個に含む支持体；
神経学的マーカー−一次抗体複合体の１つをそれぞれ認識する二次抗体（ディテクター抗体）；
−可能ならば、該二次抗体に特異的にタグを付すかあるいはカップリングするマーカー；
−可能ならば、一次抗体と体液試料間、二次抗体と神経学的マーカー−一次抗体複合体との間、および／または結合二次抗体とマーカーとの間の免疫学的反応を行うための適当な緩衝液
−可能ならば、標準化を目的として、神経学的マーカーの検出に使用されるキットの抗体により特異的に認識される精製蛋白または合成ペプチド
を含む、請求項２記載のキット。
【請求項４】
請求項１記載の方法を行うために特別に設計された請求項２または３に記載のキット。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１０ｅ】
【図１０ｆ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６】
【図１７】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１０ｅ】
【図１０ｆ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００６−９１０２５（Ｐ２００６−９１０２５Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２６５０３（Ｐ２００５−３２６５０３）
【出願日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【分割の表示】特願２０００−５５８３９７（Ｐ２０００−５５８３９７）の分割
【原出願日】平成１１年６月２９日（１９９９．６．２９）
【出願人】（３９９０４４１６０）イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【分割の表示】特願２０００−５５８３９７（Ｐ２０００−５５８３９７）の分割
【原出願日】平成１１年６月２９日（１９９９．６．２９）
【出願人】（３９９０４４１６０）イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ Ｎ．Ｖ．
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