稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に配置させることを含むハイブリッド植物の稔性を向上させる方法
本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物、及び前記ハイブリッド植物の作成方法を提供することを目的とする。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。また、本発明の方法は、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、平成１５年６月１８日に提出された特願２００３−１７３９２７に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に導入したハイブリッド植物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の技術
イネ等の自殖性植物において品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるために穎花が開花する直前に穎花内の雄しべを全て取り除き、次いで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。しかしながら、このような手作業による交雑方法で商業的規模での大量の雑種種子を生産することは不可能である。
【０００４】
そこで、ハイブリッド品種の生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、配偶体型稔性回復遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの３系統を用いて、（ｉ）不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ｉｉ）一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。
【０００５】
ハイブリッド種子を商業的に生産するために、雄性不稔細胞質および核にコードされた稔性回復遺伝子が利用されている。稔性回復遺伝子は、その作用機構により、配偶体型および胞子体型に分類される。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１やトウモロコシのＳ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＷＡ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子やトウモロコシのＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子などが知られている。
【０００６】
配偶体型の稔性回復遺伝子を利用してハイブリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が１：１に分離するため、理論的花粉稔性は５０％となる。これは、一般品種の理論的花粉稔性１００％の半分であり、ハイブリッド品種の種子生産の安定性を低下させる要因として危惧されていた。実際に、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質とその稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を利用したハイブリッド品種は耐冷性が弱いことが一般に知られているが、その原因は理論的花粉稔性の低さ（５０％）であると考えられている。
【０００７】
一方、胞子体型でも、以下のような問題が存在する。イネのＷＡ細胞質に対する稔性回復は複数個の稔性回復遺伝子によって付与されると考えられているが、その数や染色体上での位置は詳細に同定されていない。このため、ＷＡ細胞質に対する回復系統としてハイブリッド育種で使用するためには、収量性や草型などの特性が優れていることに加え、ＷＡ細胞質に対して完全回復能を持つことが不稔系統との交雑次代での種子稔性調査により示されている必要がある。稔性回復能以外の特性がいくら優れていても、ＷＡ細胞質雄性不稔系統との交雑次代での種子稔性が完全でなければ、回復系統として利用することはできない。また、前述の通り、回復系統の数や座乗位置が詳細に同定されていないため、その他の特性を維持して回復能だけを改良することは困難である。
【０００８】
よって、高い稔性を有するハイブリッド品種を作成するための方法が希求される。
【特許文献１】特開２００２−３４５４８５号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０１４５０６ Ａ１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０２７２９０ Ａ１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０１９８０３ Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｉ．，ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｒｉｃｅ．Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓ．Ｓ．Ｂａｎｇａ ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｇａ，ｅｄｓ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ），ｐｐ．２２１−２５６．
【非特許文献２】Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｂ．Ｓ．（１９９８）．Ｍａｉｚｅ．Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓ．Ｓ．Ｂａｎｇａ ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｇａ，ｅｄｓ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．２８２−３１５．
【非特許文献３】Ｗｅｎ，Ｌ．＆Ｃｈａｓｅ、Ｃ．Ｄ．（１９９９）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３５，ｐ．５２１−５２６に
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）ｐ．１６４−１６５
【非特許文献５】Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２
【非特許文献６】Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）１０，ｐ．１６５−１７４
【非特許文献７】Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０），７７：ｐ．７３４７−７３５１
【非特許文献８】Ｌｅｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ １９９２，２７，ｐ．１６１−１６３
【非特許文献９】Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｗｉｓｅ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｎｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（１９９６）Ｔｈｅ ｒｆ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｓｔｏｒｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ Ｔ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｍａｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１３３４−１３３６
【非特許文献１０】Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｈｏｒｎｅｒ，Ｈ．Ｔ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｓｃｈｎａｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｉｚｅ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１３，１０６３−１０７８
【非特許文献１１】Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ １９９８，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（３）ｐ．３８１−３８５
【非特許文献１２】Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（３）ｐ．３８７−３９２
【非特許文献１３】Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，Ｎａｋａｋｉｄｏ，Ｆ．，ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，Ｔ．（１９８９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７７，５４７−５５２．
【非特許文献１４】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０．
【非特許文献１５】Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔａｋｅｍｏｒｉ，Ｎ．，Ｋａｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｎｉｔｔａ，Ｎ．（２００２）．Ｆｉｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｅｓｔｏｒｅｒ ｇｅｎｅ，Ｒｆ−１，ｔｈａｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ＢＴ−ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．Ｂｒｅｅｄ．Ｒｅｓ．４（Ｓｕｐｐｌ．２），２４３．
【非特許文献１６】Ｈａｒｕｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ２２７５ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ Ｆ２ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８，４７９−４９４．
【非特許文献１７】Ｋａｒｉｙａ，Ｋ．（１９８９）．Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｏｏｌｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ＩＩＩ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊａｐ．Ｊ．Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．５８，９６−１０２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供することを目的とする。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。
【００１０】
本発明において、完全連鎖関係にない遺伝子座とは、好ましくは異なる染色体上の遺伝子座である。
【００１１】
本発明において、稔性回復遺伝子は、好ましくは配偶体型稔性回復遺伝子、より好ましくはイネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子である。
【００１２】
本発明はまた、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、前記ハイブリッド植物の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、高い稔性を有するハイブリッド植物を得ることに成功し、本願発明を想到した。
【００１４】
ハイブリッド植物
よって、本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供する。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。
【００１５】
植物において配偶体である花粉の形成の際に減数分裂が生じ、各組の相同染色体が分離する。よって、配偶体型稔性回復遺伝子と雄性不稔細胞質を利用してハイブリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が１：１に分離するため、理論的花粉稔性は５０％となる。本発明のハイブリッド植物は、ａ）２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を有すること、そして、ｂ）それらを完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有すること、という特徴のため、減数分裂により花粉が形成される際に、いずれかの染色体に配偶体型回復遺伝子が存在する可能性が高くなる、という利点を有する。
【００１６】
具体的には、例えば、イネは１２組の相同染色体を有するが、遺伝子導入および交配の繰り返しにより、例えば、第６、第７、第１０染色体の３カ所に配偶体型回復遺伝子を配置させる。花粉が形成される場合に配偶体を有する相同染色体と有さない相同染色体は、他組の相同染色体の分離とは独立して分離される。よって、配偶体型稔性回復遺伝子を３カ所に有する花粉（第６、第７、第１０染色体）、２カ所に有する花粉（第６及び第７染色体、第６及び第１０染色体または第７及び第１０染色体）、１カ所に有する花粉（第６、第７、第１０染色体のいずれか）、０カ所に有する花粉が、１：３：３：１の割合で形成される。本研究者は、遺伝子工学的に導入された配偶体型稔性回復遺伝子が内因性の遺伝子と同様に機能すること、花粉が配偶体型稔性回復遺伝子を１つでも有すれば稔性が得られること、そして、配偶体型稔性回復遺伝子を複数持つ花粉も正常に発育することを明らかにした。よって、理論的には配偶体型稔性回復遺伝子を全く含まない１／８の割合の花粉以外、即ち、８７．５％の花粉は稔性を有することになる。後述の実施例４において、３座Ｒｆ−１ヘテロ個体の花粉稔性が概ね８７．５％であることが示され、上記理論が正しいことが実証された。
【００１７】
以上、本発明の技術的特徴の説明のために、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が異なる染色体上にある場合を例に挙げた。しかしながら、同一染色体上に複数、例えば２個の遺伝子座が存在しても、両者にある程度遺伝的距離があれば、異なる染色体上に座乗している場合と同様に独立に遺伝される。あるいは完全に独立して遺伝されなくても、完全に挙動を共にしない限り、「２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を配置することにより花粉稔性を向上させる」という本願発明の目的を達成しうる。よって、本明細書において「完全連鎖関係にない」とは、異なる染色体上に座乗している場合と同様に完全に独立に遺伝されるいわゆる「独立の関係の場合」のみならず、独立ではないが完全連鎖でもないような「密接ないし穏やかな連鎖関係にある場合」も含む。限定されるわけではないが、２個の遺伝子座が約１ｃＭ以上、より好ましくは約５ｃＭ以上の距離にある場合に、両者は完全には挙動を共にせず遺伝する、即ち、「完全連鎖関係にない」と言える。
【００１８】
さらに胞子体型稔性回復遺伝子については、ＢＴ細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１がＷＡ細胞質に対して部分的稔性回復能を示すことも十分考えられる。しかも、複数のＲｆ−１を配置することにより回復程度が向上する可能性もある。現在、それらの点を確認するための実験を遂行中である。
【００１９】
本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有するハイブリッド植物は、上述したように稔性回復遺伝子を１コピーしか有しない稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体（従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い花粉稔性を有する。さらに、耐冷性、即ち、低温条件下での種子稔性も向上する（実施例７）。「低温条件下」とは、例えば、移植後から登熟期まで、２０℃ないし２８℃の明条件下、１５℃ないし２３℃の暗条件下で栽培することを意味する。例えば、後述の実施例７では、移植後から登熟期まで、明条件（２４℃）１２時間、暗条件（１９℃）１２時間で栽培したところ、本願発明のハイブリッド植物（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１）は、稔性回復遺伝子を１コピーしか有しない稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体（ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１）（従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い種子稔性を維持した。
【００２０】
本発明のハイブリッド植物は、花粉、種子、成体のあらゆる状態を含む。
【００２１】
本発明において得られるハイブリッド植物の属、種は特に限定されず、例えば、イネ、トウモロコシが含まれる。最も好ましくはイネである。
【００２２】
本発明の「稔性回復遺伝子」は、配偶体型および胞子体型の双方を含む。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１やトウモロコシのＳ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＷＡ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ａｈｍｅｄ ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑ，１９９８）やトウモロコシのＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｄｈｉｌｌｏｎ，１９９８）などが知られている。
【００２３】
「配偶体型稔性回復遺伝子」は、ハイブリッド植物の種類に応じて公知の遺伝子を利用可能である。例えば、ハイブリッドイネの場合、イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子Ｒｆ−１が利用可能である。Ｒｆ−１遺伝子については、本発明者らが単離・同定し、特許出願を行っている。Ｒｆ−１遺伝子については、本明細書中で詳述する。ハイブリッドトウモロコシの場合、Ｓ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られており、例えば、Ｗｅｎ，Ｌ．＆Ｃｈａｓｅ、Ｃ．Ｄ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３５，ｐ．５２１−５２６に記載されている。
【００２４】
本発明のハイブリッド植物は稔性回復遺伝子を、２コピーまたはそれより多く含む。本発明は、完全連鎖関係にない遺伝子が完全に又は一部独立して遺伝する性質を利用する。よって、複数の稔性回復遺伝子は同一染色体上にある場合でも約１ｃＭ以上、より好ましくは約５ｃＭ以上の距離に存在することが望ましい。最も好ましくは、各々異なる染色体上に存在することが望ましい。よって、稔性回復遺伝子は特に限定されないが、最大でも染色体の組の数であることが好ましい。
【００２５】
本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する。各遺伝子がそれぞれ全て完全連鎖関係にない遺伝子座に存在することが望ましい。但し、３コピー以上の複数の遺伝子を有する場合、そのうちの一部が連鎖関係にある遺伝子座に存在する場合でも、その他の遺伝子が完全連鎖関係にない遺伝子座に存在している場合は、単一コピー（ヘテロ）の場合よりも高い稔性を得ることができ、本発明のハイブリッド植物に含まれる。例えば、４コピーの遺伝子を含むハイブリッド植物であって、そのうちの２つが同一の染色体上の連鎖関係にある遺伝子座に存在し、その他の２つが各々別個の染色体に存在する場合が含まれる。完全連鎖関係にない遺伝子の数が多いほど、稔性を有する花粉の確率は高くなる。理論的には、稔性回復遺伝子が１コピーしか存在しない場合には５０％であるのに対し、例えば、２コピー、３コピー、４コピー、５コピーと増えると、７５％、８７．５％、９３．７５％、９６．８７５％と稔性が高くなる。本発明の実施例４では最大４遺伝子座に稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を有するハイブリッドイネが作成され、理論上の花粉稔性９３．７５％に極めて近い値が観察された。このことから、稔性回復遺伝子を複数個、例えば４個持つ花粉も正常に発育するものことが示された。よって、限定されるわけではないが、本発明においてハイブリッド植物において、稔性回復遺伝子のコピー数は、好ましくは２ないし宿主植物の染色体の組の数、好ましくは２ないし４である。
【００２６】
なお、本発明のハイブリッド植物中の２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子のうちの１コピーは、稔性回復遺伝子を天然に保有する稔性回復系統の植物由来のものであってもよい。例えば、イネのＲｆ−１遺伝子座は第１０染色体上に存在することが知られている（Ｆｕｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）１６４−１６５）。このような内因性の稔性回復遺伝子は、本発明のハイブリッド植物の作成に利用可能である。
【００２７】
ハイブリッド植物の作成方法
本発明はまた、稔性を高めた本発明のハイブリッド植物の作成方法を提供する。本発明の方法は、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む。
【００２８】
限定されるわけではないが、本発明の好ましい方法は、
１）稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、
２）工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配する
ことを含む、作成方法である。
【００２９】
１）の工程における、植物への稔性回復遺伝子の導入方法は特に限定されず、植物の種類に応じた公知の方法を使用することが可能である。遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、植物に導入されうる稔性回復遺伝子（例えば、イネのＲｆ−１）を含む核酸を含む。
【００３０】
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。植物において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００３１】
さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい
プラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞である植物に導入される。
【００３２】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸断片を用いて植物に稔性を付与する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
【００３３】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（稔性回復遺伝子の核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。
【００３４】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって形質転換することができる。
【００３５】
特に植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２，１７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８））などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。
【００３６】
限定されるわけではないが、アグロバクテリウムを用いる植物（例えば、イネ）の回復系統の作成方法は、例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，ｐ．２７１−２８２（１９９４）、Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：ｐ．７３４７−７３５１（１９８０）等に記載されている。
【００３７】
先ず、所期の挿入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、前記Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）らにプラスミドマップが記載されている、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。本明細書後述する参考例では、ｐＳＢ１１を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成して使用した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
【００３８】
次いで、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えばＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４等、いずれも例えばＴＡＫＡＲＡ社より購入可能）を形質転換する。
【００３９】
さらに、形質転換された大腸菌を用いて、アグロバクテリウム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行う。限定されるわけではないが、アグロバクテリウムは例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＮＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ３等を使用することが可能である。いずれも前述のＫｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えばＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないがｐＲＫ２０７３を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（Ｌｅｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ １９９２，２７，ｐ．１６１−１６３）。
【００４０】
次いで、所期の交配が生じたアグロバクテリウムを用いて、例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、雄性不稔植物、例えばイネの形質転換を行う。形質転換に必要なイネ未熟種子は、例えば、雄性不稔イネにジャポニカ品種の花粉をかけることにより作成できる。
【００４１】
形質転換植物の稔性回復は、例えば出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査することによって調べることが可能である。立毛調査とは、圃場などで栽培されている状態で観察する方法である。あるいは、実験室で穂の稔実率を調べる稔実率調査を行ってもよい。
【００４２】
稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入から、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物の作成は、限定されるわけではないが、例えば以下のように行うことができる。
【００４３】
まず、上述の方法で稔性回復した形質転換体から定法に従いＤＮＡを抽出して、ゲノミックサザン解析を行う。その際に用いるプローブは、導入した遺伝子断片の一部から調製する。解析結果に基づき、１コピー導入個体を複数選抜する。次いで、各自殖次代から、当該導入遺伝子についてホモ型の個体を選抜する（以下、Ａ個体とＢ個体と呼称する）。選抜は、上述のゲノミックサザン解析により行うこともできるし、当該遺伝子が導入された座の周辺塩基配列情報に基づいて設計したＰＣＲマーカーによって行うこともできる。天然の回復系統×Ａの交配により得られた交雑Ｆ２のなかから、２座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜する。天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、例えば、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１に記載の方法により推定することが可能である。Ａ個体に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、上述の通り、ゲノミックサザン解析により推定することもできるし、ＰＣＲマーカーによって推定することもできる。
【００４４】
同様の方法により、（天然の回復系統×Ａ）×（天然の回復系統×Ｂ）の交雑Ｆ１のなかから、天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子をホモで持ち、かつ、Ａ個体およびＢ個体に由来する稔性回復遺伝子をヘテロで持つ個体を選抜する。選抜個体の自殖次代のなかから、Ａ個体およびＢ個体に由来する稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜することにより、３座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を作成することができる。
【００４５】
なお、各工程の前又は後に、外来の遺伝子が導入された染色体の位置を確認してすることが可能である。導入遺伝子の染色体の位置を確認は、限定されるわけではないが、例えば、以下のように行うことができる。
【００４６】
稔性回復遺伝子とともに、宿主植物には天然に存在しない配列が組み込まれる。例えば、後述の実施例ではイネのＲｆ−１遺伝子ともに、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）（図９中のＮｏｓ）が組み込まれている。なお、Ｔｎｏｓの配列は公開データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）に登録されているクローニングベクターｐＢＩ１２１（アクセッション番号ＡＦ４８５７８３）に含まれている。実施例３ではＮｏｓを用いて導入遺伝子の染色体上の導入部位を同定した。具体的には、公知のＮｏｓの塩基配列に基づいてのプライマー（例：図９のＮｏｓＦ２）を作成し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅産物の末端塩基配列を解析し、Ｇｅｎｂａｎｋのデータベースに対して相同性検索を行ったところ、イネの特定の染色体のゲノムクローンの相補鎖配列（例：図９のＡＰ００４００７）と一致することがわかった。導入遺伝子が特定の染色体に存在することをさらに確認するために、前記特定の染色体上に２個のプライマーを設計し（例：図９のＮｏ６Ｆ及びＮｏ６Ｒ）、ＰＣＲを行ってもよい。ＰＣＲにより、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを鋳型とした場合には増幅産物が得られないのに対し、導入遺伝子が存在しない植物ゲノムの場合には所期の長さの断片が増幅される。逆に、導入遺伝子の染色体部位の同定に使用した、Ｎｏｓの塩基配列に基づいて単一のプライマー（例：図９のＮｏｓＦ２）と、染色体上の配列に基づくプライマー対の一方のプライマー（例：図９のＮｏｓ６Ｒ）をプライマー対として使用した場合には、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを鋳型とした場合には所期の長さの断片が増幅されるの対し、導入遺伝子が存在しない植物ゲノムの場合には増幅産物が観察されない。
【００４７】
ゲノムの全体又は一部の塩基配列が確認されている植物において上記確認手法を利用することが可能である。例えば、イネやトウモロコシについては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータバンクにゲノムの塩基配列が開示されている。
【００４８】
２）さらに、工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統の植物とを交配する、ことにより本発明の植物を得ることができる。
【００４９】
交配後、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する植物を選択することができる。ハイブリッド植物に、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が存在することは、例えば、サザン分析におけるバンドの数及び／又は濃度等によって確認することが可能である。
【００５０】
さらに、本発明は工程１）で作成された２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を含む。このような稔性回復系統植物は、実際の育種現場において、所期の雄性不稔系統と交配させることによって、本発明のハイブリッド植物を取得するために使用することができる。
【００５１】
イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１
本発明者らは、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を単離・同定した（参考例）。後述する実施例では配偶体型稔性回復遺伝子として、Ｒｆ−１遺伝子を用いて、ハイブリッドイネを作成した。Ｒｆ−１遺伝子については別途、特許出願を行っている。以下、詳述する。
【００５２】
本発明者らの先願
（特開２００２−３４５４８５、ＷＯ ０２／１４５０６ Ａ１）
（特願２００１−２８５２４７、特願２００１−３０９１３５及び特願２００２−１８５７０９、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１）
（特願２００２−１９７５６０、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０３１５４）
本発明者らは、まず、Ｒｆ−１の存在部位を第１０染色体上の極めて狭い範囲に特定した。その結果に基づいて、Ｒｆ−１遺伝子座の近傍に存在するＰＣＲマーカーを開発し、これらのＰＣＲマーカーが、Ｒｆ−１遺伝子座と連鎖することを利用して、Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法が見出された。具体的には、Ｒｆ−１遺伝子座が、イネ第１０染色体上に存在するＰＣＲマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間に座乗することを利用して、近傍に存在する新規のＰＣＲマーカー座の遺伝子型を調査することにより、Ｒｆ−１遺伝子の有無の調査およびＲｆ−１遺伝子ホモ型個体の選抜を実施する。当該Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法につき、本発明者らは、特許出願を行い（特願２０００−２４７２０４）、特開２００２−３４５４８５として公開されている。また、前記日本特許出願に基づき国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０７０５２）を行い、ＷＯ ０２／１４５０６ Ａ１として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。
【００５３】
本発明者らはさらに、特願２０００−２４７２０４の改良方法として、Ｒｆ−１遺伝子を含むＲｆ−１遺伝子座の領域をさらに特定し、特願２００１−２８５２４７（２００１年９月１９日）、特願２００１−３０９１３５（２００１年１０月４日）及び特願２００２−１８５７０９（２００２年６月２６日）を出願した。そして、前記３つの日本特許出願に基づき、国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０９４２９）を行った。また、本発明者らはさらに研究を進め、Ｒｆ−１遺伝子を同定し、２００２年７月５日に特許出願を行った（特願２００２−１９７５６０）。また、前記日本特許出願に基づき、国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０３１５４）を行い、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。
【００５４】
特開２００２−３４５４８５において、Ｒｆ−１遺伝子座がＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間に座乗することが本発明者らにより明らかにされ、これを利用したＲＦＬＰ−ＰＣＲ用マーカーが記載されている。本発明者らは、さらにＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の間の領域について、Ｒｆ−１遺伝子座とＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉとが密接連鎖することを手がかりに、染色体歩行および遺伝学的解析を行うことにより、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖する領域を調べた。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むＲｆ−１遺伝子座領域を約７６ｋｂまで特定し、そして当該領域の全塩基配列を決定することに成功した。
【００５５】
具体的には、特開２００２−３４５４８５では、ＭＳコシヒカリにＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成した集団１０４２個体を用いて連鎖分析を行い、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出した。本発明者らは、上記集団をさらに４１０３個体追加し、合計５１４５個体として解析を行った。その結果、新たに、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出し、それぞれの組換え個体の合計を２個体および８個体とした。これら１０個体をＲｆ−１座極近傍組換え個体として、高精度分離分析に供試することとした（参考例１）。
【００５６】
Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体が２個体に対し、Ｃ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体が８個体という上記の組換え個体出現頻度は、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座とを比較すると、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座のほうが遺伝学的にＲｆ−１座に近いことを意味する。遺伝的距離（組換え価ｃＭが単位）と物理的距離（塩基対数ｂｐが単位）とは必ずしも比例しないが、通常は遺伝的距離が短ければ物理的距離も短いと期待できる。
【００５７】
そこで、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座を起点に染色体歩行を行うことにより、Ｒｆ−１座を単離することとした（参考例２）。染色体歩行には、インディカ品種ＩＲ２４およびジャポニカ品種あそみのりのゲノムＤＮＡを用いてλ ＤＡＳＨ ＩＩベクターにより作成したゲノミックライブラリーを供試した。ＩＲ２４はＲｆ−１保有品種、あそみのりはＲｆ−１非保有品種である。染色体歩行を進めた結果、ＩＲ２４のゲノミッククローンにより約７６ｋｂの染色体領域をカバーするコンティグ（複数のクローンを重複部分で重ね合わせて染色上での順に整列化したもの）を作成することができ、その全塩基配列（７６３６３ｂｐ）を決定した。
【００５８】
次いで、得られた塩基配列情報等を利用することにより、新たに１２個のマーカーを開発し、既述のＲｆ−１座極近傍組換え個体１０個体を用いて、高精度分離分析を行った（参考例３）。その結果、上記の約７６ｋｂの染色体領域に含まれる６５ｋｂの配列がＲｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列を包含することが示された。この領域は、８個のゲノミッククローンから構成されるコンティグによりカバーされている。各クローンの長さは、約１２〜２２ｋｂであり少なくとも４．７ｋｂの重複部を持つ。一方、イネの遺伝子の長さについては、短いものから長いものまであることが知られているが、大部分の遺伝子は数ｋｂ以内であると考えられる。そのため、これら８個のゲノミッククローンのうち、少なくともひとつは完全長のＲｆ−１遺伝子を包含すると予測される。
【００５９】
本発明者らはさらに、上記７６ｋｂの染色体領域のうち、Ｒｆ−１遺伝子領域をさらに絞り込むと共に、稔性回復能の存在を直接的に証明するために、相補性試験を行った。
【００６０】
具体的には、雄性不稔系統であるＭＳコシヒカリの未熟種子に、上記７６ｋｂ領域内の１０個の部分断片（各１０〜２１ｋｂ）を、別々に遺伝子工学的に導入した（図５）。使用された１０個の部分断片のうち、８個は先に染色体歩行で得られた８個のゲノミッククローン（図１、参考例３に記載のＸＳＥ１、ＸＳＥ７、ＸＳＦ４、ＸＳＦ２０、ＸＳＧ２２、ＸＳＧ１６、ＸＳＧ８及びＸＳＨ１８）に由来するものである。これらに加えて、さらに２個のクローンＸＳＦ１８およびＸＳＸ１に由来する断片についても相補性試験を行った。ＸＳＦ１８はＸＳＦ２０と５’末端及び３’末端（各々、配列番号１の塩基２０３２８及び４１９２１）が同一だが、途中の塩基３３９４７−３８５９１を欠いている。これは、最初にクローンＸＳＦ１８が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、ＸＳＦ２０と命名したことに因る。また、ＸＳＸ１は、クローンＸＳＧ８とＸＳＨ１８の重複部分がやや小さいため（約７ｋｂ）、制限酵素処理およびライゲーションにより両クローンから、重複部分を十分に含むようなクローンを新たに作成したものである。
【００６１】
Ｒｆ−１は優性遺伝子であるので、導入した断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含している場合には、形質転換植物当代において稔性が回復する。相補性試験において、各断片について形質転換植物の種子稔性調査を行い、λファージクローンＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（参考例４）。他の断片については、形質転換植物はすべて不稔であった。これらの結果から、上記１５．６ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含していることが示された。さらに、Ｒｆ−１遺伝子を遺伝子工学的に導入する方法が提供され、その有効性が実証された。
【００６２】
本発明者らは、λファージクローンＸＳＧ１６のどの部分がＲｆ−１遺伝子を含むかをさらに特定するために、前述の１５．６ｋｂ断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）よりも短い断片について相補性試験による種子稔性調査を行った。その結果、ＸＳＧ１６に由来する１１．４ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２３５７−５３７４３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（参考例４（２））。さらに、より短い６．８ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４８８８３を含む）を導入した形質転換体においても、種子稔性が回復した（参考例４（３））。これらの結果から、上記６．８ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を包含していることが示された。
【００６３】
本発明者らは、さらに研究をすすめ、稔性回復機能を有する核酸を特定し、それによってコードされるアミノ酸配列も明らかにした。具体的には、参考例５−６に記載したように、先ず、配列番号１の４３７３３−４４０３８及び４８３０６−５０２２６に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて作成した。これらの２種の断片をプローブ（プローブＰ及びＱ）として、コシヒカリにＲｆ−１を導入した系統より作成したｃＤＮＡをライブラリーをスクリーニングした。その結果、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致し、Ｒｆ−１遺伝子を含むクローンとして単離され、塩基配列が解析された（配列番号４３−４８）。
【００６４】
配列番号４３−４８のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードする。具体的には、各々配列番号４３の塩基２１５−２５８７、配列番号４４の塩基２１３−２５８５、配列番号４５の塩基２１８−２５９０、配列番号４６の塩基２０８−２５８０、配列番号４７の塩基１４９−２５２１及び配列番号４８の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【００６５】
配列番号４９のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。
【００６６】
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較し、Ｒｆ−１遺伝子のエキソンとイントロンの構造を明らかにした（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。Ｒｆ−１遺伝子のコード領域内には、イントロンは介在しない。
【００６７】
本発明者らは、参考例４（３）の相補性実験で種子稔性を回復した６．８ｋｂ断片について、さらに相補性実験を行った。具体的には、参考例７において、前記６．８ｋｂ断片中のＲｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４６３１８）を用いて、相補性実験を行ったところ、種子稔性が回復した。
【００６８】
さらに、参考例８において稔性回復機能を有する核酸を含むクローンを新たに６個取得した。具体的には、先ず、配列番号１の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する２種類のプライマーを用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をプローブＲとして、前記プローブＰとともにプラークハイブリダイゼーションを行なった。プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークから、新たに６個のクローンを得た（＃７−＃１２）。その結果を配列番号５４−５９に示す。
【００６９】
配列番号５４−５９のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号５４の塩基２２９−２６０１、配列番号５５の塩基１７５−２５４７、配列番号５６の塩基２２７−２５９９、配列番号５７の塩基２２０−２５９２、配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び配列番号５９の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【００７０】
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（特願２００１−２８５２４７の配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号５７−５９）。
【００７１】
稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号１の塩基配列を有する核酸、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。さらに、参考例４に記載したように、配列番号１の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていると確認された。Ｒｆ−１遺伝子を含む領域はさらに、好ましくは、配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３、より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８と特定された。
【００７２】
Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域が特定された。
【００７３】
ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び
ｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２。
【００７４】
上記塩基配列は、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応し、そして、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。
【００７５】
以下、本明細書中、文脈により「配列番号１の塩基配列」という用語は、配列番号１全体、あるいは、その一部であって稔性回復機能に関与する部分、特に、塩基３８５３８−５４１２３を示す。より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８を示す。そして、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを示す。
【００７６】
後述する参考例では、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸として、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ米のＩＲ２４のゲノムライブラリーより核酸が単離され、配列番号１の塩基配列が決定された。しかしながら、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸の由来は、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種由来のものであれば特に限定されない。Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種は、特に限定されず、例えば、ＩＲ２４、ＩＲ８、ＩＲ３６、ＩＲ６４、Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ、ＢｏｒｏＩＩが含まれる。Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型品種としては、例えば、限定されるわけではないが、あそみのり、コシヒカリ、きらら３９７、アキヒカリ、あきたこまち、ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、ミネアサヒ、あいちのかおり、ハツシモ、アケボノ、フジヒカリ、峰の雪もち、ココノエモチ、ふくひびき、どんとこい、五百万石、ハナエチゼン、トドロキワセ、はえぬき、どまんなか、ヤマヒカリ等が知られている。「インディカ型品種」も「ジャポニカ型品種」も当業者に周知であり、当業者はどのようなイネ品種が本発明の対象となり得るか容易に判断できる。
【００７７】
本発明に利用可能な核酸は、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる
Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸は、好ましくは配列番号１の塩基配列を有する。１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号１と完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号１と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００７８】
Ｒｆ−１遺伝子は、好ましくは配列番号４９に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。
、稔性回復機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。Ｒｆ−１遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００７９】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００８０】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００８１】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。Ｒｆ−１遺伝子は、稔性回復機能を有する限り、配列番号１の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。「稔性回復機能を有する」とは、当該ＤＮＡ断片が導入された場合に、イネ個体又は種子に稔性を付与することを意味する。稔性回復は、Ｒｆ−１遺伝子よりタンパク質が発現されることに因ってもよく、あるいはＲｆ−１遺伝子の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）自体が稔性の付与に何らかの機能をしていてもよい。
【００８２】
限定されるわけではないが、Ｒｆ−１遺伝子の相同体、変異体が稔性回復機能を有するか否かは、例えば、以下のように調べることが可能である。ＭＳコシヒカリ（不稔系統）にコシヒカリの花粉をかけることにより得た未熟種子を供試して、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２）の方法に従い、被検定核酸断片を導入する。得られた形質転換体を通常の条件で栽培すると、被検定核酸断片が稔性回復機能を有する場合にのみ、種子が稔る。
【００８３】
Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型のあそみのりの対応する領域に由来する核酸は、配列番号２に示した塩基配列を有する。配列番号２と配列番号１の対応する部分は、全体として約９８％の同一性を有する。よって、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号１と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。「配列番号１」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
【００８４】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００８５】
本発明の好ましい核酸はまた、配列番号１の塩基配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸、並びに、配列番号１の塩基配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸を含む。
【００８６】
本明細書において使用されるように、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示されている。例えば、ニトロセルロースフィルターに関し、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０℃ないし６０℃での、１×ＳＳＣないし６ＸＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダイゼーション溶液が約５０％ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダイゼーション温度は約１５℃ないし２０℃低めとなる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、非常にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジェントな条件よりも、より高い温度及び／又はより低い塩濃度でのハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を含む、例えば、約６０℃ないし６５℃での０．１×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および／又は約６５℃ないし６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００８７】
「配列番号１」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
【００８８】
同様に、本発明の核酸には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号１の塩基配列とは異なるが稔性回復機能を有する核酸を含む。稔性回復機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。
【００８９】
本明細書の記載に基づいてＲｆ−１遺伝子がより特定され、当業者がＲｆ−１遺伝子以外の部分またはＲｆ−１遺伝子内のイントロン部分などの核酸を除いて使用することが可能である。また、既定のアミノ酸（特に配列番号４９に記載のアミノ酸配列）を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００９０】
本発明者らは、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型のＩＲ２４（塩基配列２７）と、有しないジャポニカ型のあそみのり（塩基配列２８）およびＧｅｎＢａｎｋに登録されている日本晴ＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）とを比較した。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ型のＲｆ−１領域は少なくとも、以下の１塩基多型（ＳＮＰ）を有することを見出した。
【００９１】
１）配列番号１の塩基１２３９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号１の塩基６２２７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号１の塩基２０６８０に相当する塩基がＧである；
４）配列番号１の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；
５）配列番号１の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである；
６）配列番号１の塩基５６３６８に相当する塩基がＴである；
７）配列番号１の塩基５７６２９に相当する塩基がＣである；及び
８）配列番号１の塩基６６２６７に相当する塩基がＧである。
【００９２】
よって、本発明のＲｆ−１領域を含む核酸は、好ましくは上記条件１）−８）の１つないし全てを満たす。
【００９３】
なお、後述の参考例３において、Ｒｆ−１遺伝子極近傍組換え個体（ＲＳ１−ＲＳ２、ＲＣ１−ＲＣ８）についてそのＲｆ−１領域の染色体構成を調べた。その結果、配列番号１の塩基１２３９ないし６６２６７の塩基配列、即ち、最大限に見積もってもＰ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）（図３）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることが明らかにされた。ただし、Ｒｆ−１遺伝子の一部の遺伝子型がインディカ型であることが、Ｒｆ−１遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディカ型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。極端な場合、ジャポニカ・インディカ間でコーディング領域は完全に同一で、プロモーター領域だけに差違があり、そして、プロモーター領域及びコーディング領域の一部のみが上記Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に含まれることもあり得る。よって、上記共有インディカ型領域（配列番号１の塩基１２３９ないし６６２６７）がＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、
１）遺伝子の大きさは通常数ｋｂであり１０ｋｂを超えることは稀である；
２）ＩＲ２４のゲノム塩基配列（配列番号１）は、上記共有インディカ型領域を完全に包含する；
３）配列番号１の５’末端は、上記共有インディカ型領域の５’末端から１２３８ｂｐ上流に位置し、別の遺伝子（Ｓ１２５６４）の一部である；および
４）配列番号１の３’末端は、上記共有インディカ型領域の３’末端から１００９６ｂｐ下流に位置する
により、少なくとも配列番号１はＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。
【００９４】
さらに、本発明者らは相補性試験を行うことにより、配列番号１の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていることを確認した。よって、本発明の一態様において、配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３の塩基配列と、少なくとも７０％同一の塩基配列は、以下の条件１）及び２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号１の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；及び
２）配列番号１の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである。
【００９５】
本発明者らはさらに、Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。
【００９６】
ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６、及び
ｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２。
【００９７】
上記塩基配列は、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。本発明の好ましい核酸はさらに、
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
を含む。
【００９８】
上記の配列番号１の塩基４５４６１は、１）配列番号４３の塩基１７６９；２）配列番号４４の塩基１７６７；３）配列番号４５の塩基１７７２；４）配列番号４６の塩基１７６２；５）配列番号４７の塩基１７０３；６）配列番号４８の塩基１７７９；７）配列番号５４の塩基１７８３；８）配列番号５５の塩基１７２９；９）配列番号５６の塩基１７８１；１０）配列番号５７の塩基１７７４；１１）配列番号５８の塩基１７２８；及び１２）配列番号５９の塩基１６４４に相当する。よって、特に好ましくは、本発明の方法に使用する核酸は、好ましくは、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号４３の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号４４の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号４５の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号４６の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号４７の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号４８の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号５４の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号５５の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号５６の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号５７の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号５８の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号５９の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
【００９９】
本明細書中の参考例４及び７に記載の相補性試験では実際に、図５に記載の１０個のクローン由来の断片を用い、アグロバクテリウムを用いる方法によりＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）を形質転換した。その結果、配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８の塩基配列を含む核酸によって、稔性回復系統が育成されることが証明された。
【０１００】
本発明の実施例では、Ｒｆ−１遺伝子として、ＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片を使用し、花粉稔性が得られることを確認した。当該断片を含むより長い断片、並びに上述したようにＲｆ−１遺伝子を含むことが同定されているより短い断片も同様に利用可能であることは当業者に容易に理解される。好ましくは、より短い断片を利用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
［図１］図１は、ＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４を起点とする染色体歩行の結果を示す。
［図２］図２は、ＢＡＣクローンＡＣ０６８９２３とラムダクローンコンティグとの位置関係を示す。
［図３］図３は、Ｒｆ−１座極近傍組換え型花粉（いずれも稔性あり）のＲｆ−１座極近傍の染色体構成を、その花粉から生じた１０個体（ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＣ１−８）のマーカー座の遺伝子型に基づき、明らかにした結果を示したものである。白抜き部分はジャポニカ型領域を、黒部分はインディカ型領域を示す。
［図４］図４は、第１０染色体上のマーカー座とＲｆ−１座との連鎖分析の結果に基づき、Ｒｆ−１座の連鎖地図上での位置を示したものである。地図距離は、１０４２Ｆ１個体の分離データから算出した。
［図５］図５は、相補性試験によるＲｆ−１領域の同定のために使用した、１０個のゲノムクローン由来の断片を示す。染色体歩行により得られたλクローン（細い線）を用いて、太い直線で示した染色体領域について相補性試験を行った。ＸＳＦ１８は、欠失を含むクローンであることが分かったので、その欠失部分は点線で示した。
［図６］図６は、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ（参考例４）及びＸＳＦ１８由来の１６．２ｋｂ断片（塩基番号１の塩基２１０６５−３３９４６及び３８５９２−４１９２１を含む）を用いた相補性試験の結果を示す。ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂでは稔性が回復し、稲穂がたれている。
［図７］図７は、Ｒｆ−１遺伝子構造の模式図を示す。白棒部分および黒線部分は、それぞれエキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
［図８］図８は、相補性試験を行ったＩＲ２４ゲノム断片、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに用いたプローブ及び単離したｃＤＮＡから推定したＲｆ−１遺伝子の位置関係の模式図を示す。Ｒｆ−１遺伝子の白棒部分および黒線部分は、それぞれ、エキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
［図９］図９は、導入Ｒｆ−１部位を確認するために使用したプライマーの位置を示す模式図である。Ｎｏｓ：ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、ＨＰＴ：ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ＢＲ：ライトボーダー、ＢＬ：レフトボーダー。
［図１０］図１０は、本発明及び従来技術のハイブリッド植物の作成方法の例を示す模式図である。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０３】
参考例
以下の参考例は、イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子Ｒｆ−１の単離・同定、稔性回復活性の確認を記載したものである。
【０１０４】
参考例１ Ｒｆ−１座極近傍組換え個体の獲得
（材料および方法）
ＭＳコシヒカリ（世代：ＢＣ１０Ｆ１）にＭＳ−ＦＲコシヒカリ（世代：ＢＣ９Ｆ１、Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成したＢＣ１０Ｆ１集団４１０３個体を用い、各個体からＤＮＡを抽出し、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）に記載の方法でＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型を調査した。Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換えにより生じた個体とみなし、Ｃ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換えにより生じた個体とみなした。
【０１０５】
（結果および考察）
４１０３個体を調査した結果、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出した。一方、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）において交配により得られた１０４２個体を調査した結果、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出している。
【０１０６】
合計すると、５１４５個体から、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を２個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を８個体獲得できたことになる。これら１０個体を以下の参考例における高精度分離分析に供試することにした。
【０１０７】
参考例２ 染色体歩行
（１）１回目染色体歩行
（材料および方法）
ジャポニカ品種あそみのり（Ｒｆ−１非保有品種）のゲノムＤＮＡを用いて、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）に記載したようにＬａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩベクターによりゲノミックライブラリーを作成し、染色体歩行に供試した。
【０１０８】
ＲＦＬＰプローブＳ１２５６４の部分塩基配列（アクセッション番号Ｄ４７２８４）に対して次のプライマー対：
を設計し、あそみのり全ＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡは、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＡ、図１）とした。
【０１０９】
ライブラリーのスクリーニングは、プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にブロットした後、常法により行った。単一プラークを分離した後、Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプレートライセート法によりファージＤＮＡを精製した。
【０１１０】
（結果および考察）
スクリーニングにより４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＡ１およびＷＳＡ３）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＡ１およびＷＳＡ３に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した（ＤＮＡシーケンサー３７７、ＡＢＩ社）。
【０１１１】
（２）２回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーに加え、インディカ品種ＩＲ２４（Ｒｆ−１保有品種）のゲノムＤＮＡから同様に作成したＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１１２】
（１）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
を設計し、ＷＳＡ３のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた５２４ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＥ、図１）とした。
【０１１３】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１１４】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＷＳＥ８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＥ８に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１１５】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより７個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＥ１およびＸＳＥ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＥ１およびＸＳＥ７に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１１６】
（３）３回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１１７】
（２）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
を設計し、ＷＳＥ８のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた１１５９ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＦ、図１）とした。
【０１１８】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１１９】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより８個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＦ５およびＷＳＦ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＦ５およびＷＳＦ７に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１２０】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１３個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１２１】
（４）４回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１２２】
（３）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対してプライマー対：
を設計し、ＷＳＦ７のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた４５６ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＧ、図１）とした。
【０１２３】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１２４】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより６個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＧ２およびＷＳＧ６）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＧ２およびＷＳＧ６に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１２５】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちの３クローン（ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１２６】
（５）５回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１２７】
本発明者らは、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の公開ホームページを閲覧し、ＲＦＬＰマーカーＳ１２５６４を包含するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）が公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されていることを見出した。このＢＡＣクローンは、ジャポニカ品種日本晴のゲノムＤＮＡを含むものであり、塩基配列を比較したところ、（１）−（４）で作成したあそみのりおよびＩＲ２４のコンティグ領域を完全に包含することが示された（図２）。
【０１２８】
そこで、このＢＡＣクローンの一部を増幅する次のプライマー対：
を設計し、ＩＲ２４全ＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約６００ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＨ、図１）とした。
【０１２９】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１３０】
（結果および考察）
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＸＳＨ１８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＨ１８に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１３１】
参考例３ 高精度分離分析
（１）ＰＣＲマーカーＰ４４９７ ＭｂｏＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の１２３９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の１２６３１番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１３２】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基８５３−８７６に相当）
（配列番号２の塩基１２２４７−１２２７０に相当）
および
Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基１５８３−１５６０に相当）
（配列番号２の塩基１２９７５−１２９５２に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約７３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３３】
（２）ＰＣＲマーカーＰ９４９３ ＢｓｌＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の６２２７番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の１７６２７番目の塩基はＣであることを見出した。
【０１３４】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基６１２９−６１５２に相当）
（配列番号２の塩基１７５２９−１７５５２に相当）
および
Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基６２５４−６２３１に相当）
（配列番号２の塩基１７６５４−１７６３１に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い１２６ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｌＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列（ＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓｌＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列をもち、ＢｓｌＩ処理により切断されるため、ＢｓｌＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３５】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法（Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ １９９８，Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ １９９８）を適用した。具体的には、前記Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｒプライマーの使用により、配列番号１の６２３６および配列番号２の１７６３６のａがｇに置換される。これにより、あそみのりＤＮＡ由来の断片は、配列番号２の１７６２６−１７６３６の部分の配列がＣＣｔｔｔｃｃｔｔＧＧとなり、ＢｓｌＩ処理により切断される。
【０１３６】
（３）ＰＣＲマーカーＰ２３９４５ ＭｂｏＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の２０６８０番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の３２０７９番目の塩基はＡであることを見出した。
【０１３７】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ２３９４５ ＭｂｏＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基２０５１９−２０５４４に相当）
（配列番号２の塩基３１９１８−３１９４３に相当）
および
Ｐ２３９４５ ＭｂｏＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基２０７７８−２０７５５に相当）
（配列番号２の塩基３２１７７−３２１５４に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２６０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３８】
（４）ＰＣＲマーカーＰ４１０３０ ＴａｑＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の４５４６１番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の４９１６４番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１３９】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４１０３０ ＴａｑＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基４５３６９−４５３９２に相当）
（配列番号２の塩基４９０７２−４９０９５に相当）
および
Ｐ４１０３０ ＴａｑＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基４５６４８−４５６２５に相当）
（配列番号２の塩基４９３５１−４９３２８に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２８０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＴａｑＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）をもたず、ＴａｑＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列をもち、ＴａｑＩ処理により切断されるため、ＴａｑＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４０】
（５）ＰＣＲマーカーＰ４５１７７ ＢｓｔＵＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の４９６０９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の５３３１１番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１４１】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４５１７７ ＢｓｔＵＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基４９３５５−４９３７８に相当）
（配列番号２の塩基５３０５７−５３０８０に相当）
および
Ｐ４５１７７ ＢｓｔＵＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５０１６６−５０１４３に相当）
（配列番号２の塩基５３８６８−５３８４５に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い８１２ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｔＵＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列（ＣＧＣＧ）を２個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により３個の断片に切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列を３個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により４個の断片に切断されるため、ＢｓｔＵＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４２】
（６）ＰＣＲマーカーＢ６０３０４ ＭｓｐＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の５６３６８番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１４３】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基５６１４９−５６１７２に相当）
および
Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５６４７９−５６４５５に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約３３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｓｐＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列（ＣＣＧＧ）をもたず、ＭｓｐＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列をもち、ＭｓｐＩ処理により切断されるため、ＭｓｐＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４４】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。具体的には、Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｒプライマーの使用により、配列番号１の５６４６３のｇがｔに置換される。これにより、配列番号１の５６４６０−５６４６３のＭｓｐＩの認識配列ＣＣＧＧがｃｃｇｔとなり、ＭｓｐＩによって切断されなくなる。よって、ＩＲ２４由来の断片はＭｓｐＩの認識配列を一つも有さず、一方、日本晴由来のＤＮＡは、配列番号１の５６３６７−５６３７０に対応する領域に１箇所ＭｓｐＩの認識配列を有することとなる。
【０１４５】
（７）ＰＣＲマーカーＢ５９０６６ ＢｓａＪＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の５７６２９番目の塩基がＣであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣＣであることを見出した。
【０１４６】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５９０６６ ＢｓａＪＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基５７５６３−５７５８６に相当）
および
Ｂ５９０６６ ＢｓａＪＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５７９８３−５７９６０に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約４２０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓａＪＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列（ＣＣＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓａＪＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列をもち、ＢｓａＪＩ処理により切断されるため、ＢｓａＪＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４７】
（８）ＰＣＲマーカーＢ５６６９１ ＸｂａＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の６６２６７番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１４８】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５６６９１ ＸｂａＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基６６１２９−６６１５２に相当）
および
Ｂ５６６９１ ＸｂａＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基６６７９９−６６７７６に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６７０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＸｂａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）をもたず、ＸｂａＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるため、ＸｂａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４９】
（９）ＰＣＲマーカーＢ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の６９３３１番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１５０】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉ Ｆ：
（配列番号１の塩基６８９６５−６８９８８に相当）
および
Ｂ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉ Ｒ：
（配列番号１の塩基６９５８２−６９５５９に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６２０ｂｐの断片を増幅する。
増幅産物をＢｓｔＺ１７Ｉ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列（ＧＴＡＴＡＣ）をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列をもたず、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理により切断されないため、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５１】
（１０）ＰＣＲマーカーＢ４０９３６ ＭｓｅＩの開発
以下の（１０）−（１２）のＰＣＲマーカーの開発はいずれも、配列番号１の３’末端７６３６３よりもさらに下流（３’末端）側に相当する塩基配列についての研究に関する。
【０１５２】
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座の遺伝子型はＲｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５３】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ４０９３６ ＭｓｅＩ Ｆ：
および
Ｂ４０９３６ ＭｓｅＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｓｅＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列（ＴＴＡＡ）をもち、ＭｓｅＩ処理により切断されるのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列をもたず、ＭｓｅＩ処理により切断されないため、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５４】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
【０１５５】
（１１）ＰＣＲマーカーＢ１９８３９ ＭｗｏＩの開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５６】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ１９８３９ ＭｗｏＩ Ｆ：
および
Ｂ１９８３９ ＭｗｏＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｗｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列（ＧＣＮＮＮＮＮＮＮＧＣ）をもたず、ＭｗｏＩ処理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列をもち、ＭｗｏＩ処理により切断されるため、ＭｗｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５７】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
【０１５８】
（１２）ＰＣＲマーカーＢ２３８７ ＢｆａＩの開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５９】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ２３８７ ＢｆａＩ Ｆ：
および
Ｂ２３８７ ＢｆａＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＢｆａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列（ＣＴＡＧ）をもたず、ＢｆａＩ列理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列をもち、ＢｆａＩ処理により切断されるため、ＢｆａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（１３）分離分析
参考例１で得られた、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体２個体（ＲＳ１およびＲＳ２）およびＲｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体８個体（ＲＣ１からＲＣ８）について、上記（１）ないし（１２）で開発した１２個のＤＮＡマーカー座の遺伝子型を調査した。結果を、各個体のＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型とともに表１に示した。
【０１６０】
【表１】
表１は、いずれの個体もＰ９４９３ ＢｓｌＩないし５９０６６ ＢｓａＪＩの間については、インディカ型品種由来のＲｆ−１染色体領域を有することを示す。この結果から、図３で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、Ｒｆ−１遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディカ型領域、すなわち、最大限に見積もってもＰ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。
【０１６１】
参考例４ ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（１）
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６（図１および５）をＮｏｔＩで部分消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１５．７ｋｂの断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１６２】
一方、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン体制遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー部位を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
【０１６３】
上記プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【０１６４】
上記により準備した、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振盪培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーからプラスミドを単離した。その制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、組換えプラスミドにより形質転換された所望の大腸菌を選抜した。
【０１６５】
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１６６】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１６７】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、４８個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。
【０１６８】
（結果および考察）
形質転換植物４７個体のうち、少なくとも３７個体は、明らかに稔性を回復していた（図６）。このことから、導入した１５．７ｋｂ断片のなかのイネ（ＩＲ２４）に由来する部分である１５５８６塩基（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３）が、完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していると考えられた。
【０１６９】
（２）ＸＳＧ１６内部の１１．４ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＡｌｗＮＩおよびＢｓｉＷＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１１．４ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１７０】
プラスミドベクターｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６）をＳｍａＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【０１７１】
上記により準備したふたつの断片を供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１４個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１７２】
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ４Ｕ（高倉ら、特願２００１−２６９９８２（ＷＯ０２／０１９８０３ Ａ１））およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１７３】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１７４】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、１２０個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植約１か月後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、各個体から標準的な穂を１穂サンプリングし、種子稔性（総もみ数に対する稔実もみの割合）を調査した。
【０１７５】
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、５９個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち１９個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した１１．４ｋｂ断片（配列番号１の４２３５７番目の塩基から５３７４３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
【０１７６】
（３）ＸＳＧ１６内部の６．８ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＨｐａＩおよびＡｌｗＮＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された６．８ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。プラスミドベクターｐＳＢ１１の調整を含め、以後の過程は上記（２）に記載の方法に準拠した。
【０１７７】
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、６７個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち２６個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した６．８ｋｂ断片（配列番号１の４２１３２番目の塩基から４８８８３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
【０１７８】
図１及び図５に示したあそみのり由来の他の断片、即ち、ＸＳＥ１，ＸＳＥ７、ＸＳＦ４、ＸＳＦ４、ＸＳＦ１８、ＸＳＦ２０、ＸＳＧ２２、ＸＳＧ８、ＸＳＨ１８及びＸＳＸ１についても同様に相補性実験を行ったが、いずれも稔性回復機能を有しなかった。
【０１７９】
参考例５ ｃＤＮＡライブラリーの作成
先ず、戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１を導入した系統ＩＬ２１６（遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１）を作成した。前記ＩＬ２１６を慣行法で温室栽培し、葉耳間長が−５〜５ｃｍの生育段階で幼穂をサンプリングした。ＳＤＳ−フェノール法（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ．ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ａ．（１９８２）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｆｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｓｐｉｎａｃｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９，６３０４−６３０８）で全ＲＮＡを抽出した後、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
【０１８０】
次いで、精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを供試して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したライブラリー（１ｍｌ）のタイターは１６００００００ｐｆｕ／ｍｌと算出され、十分な大きさであると判断された。
【０１８１】
参考例６ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）スクリーニング用プライマーの作成
以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号５０及び５１は各々、配列番号１の塩基４３７３３−４３７５６及び４４０３８−４４０１５に相当する。
【０１８２】
電気泳動後、約３００ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＰ」と呼称する）。
【０１８３】
また、以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号５２及び５３は各々、配列番号１の塩基４８３０６−４８３２９及び５０２２６−５０２０３に相当する。電気泳動後、約１９００ｂｐの増幅産物を上述の方法によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＱ」と呼称する）。
【０１８４】
（２）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
参考例５で作成したｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を７０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンをプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＱとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。
【０１８５】
ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液にプローブを添加し、６５℃で１６時間行った。洗浄は、１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った。洗浄後のメンブレンをＦＵＪＩＸ ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍｓ）で解析した。
【０１８６】
その結果、プローブＰおよびプローブＱのどちらでも陽性を示すプラークが８個見出された。そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。８個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致した。それら６クローンの全塩基配列を決定し、結果を、配列表の配列番号４３−７４に示した。
【０１８７】
配列番号４３−７４のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号４３の塩基２１５−２５８７、配列番号４４の塩基２１３−２５８５、配列番号４５の塩基２１８−２５９０、配列番号４６の塩基２０８−２５８０、配列番号４７の塩基１４９−２５２１及び配列番号４８の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【０１８８】
配列番号４９のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。遺伝子産物がミトコンドリアに移行してからの稔性回復機構は、両者で異なるものと推測される。
【０１８９】
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。
【０１９０】
参考例７ 相補性試験
参考例４（３）において、稔性回復能を持つことが証明されたＩＲ２４由来の６．８ｋｂゲノム断片を含むプラスミド中の、Ｒｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を用いて、相補性実験を行った。
【０１９１】
先ず、上記参考例４（３）のプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４６３１８に相当する）を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）とともに供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
【０１９２】
回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。つぎに、選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
【０１９３】
一方、ＴｎｏｓＪＨ００７２（ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行った。ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットとを包含する３．０ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
【０１９４】
Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片及びＴｎｏｓＪＨ００７２由来の断片を、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１９５】
さらに、上述のとおり選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＳｇｆＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＰａｃＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＳＢ２００Ｐａｃ（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）とともに供試して、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１９６】
以上の工程により、Ｒｆ−１のプロモーター領域とＲｆ−１の予想翻訳領域を含む断片にｎｏｓターミネーターが接続されたキメラ遺伝子が、中間ベクター内に挿入された大腸菌が得られた。この大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従いｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇを行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１９７】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１９８】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、３２個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。その結果、３２個体のうち２８個体は、稔性を回復していることがわかった。
【０１９９】
以上の結果から、予想翻訳領域を発現させることによりＲｆ−１遺伝子の機能を付与できることが、実験的に証明された。
【０２００】
参考例８ ｃＤＮＡ単離
参考例６では、プローブＰおよびプローブＱによりＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、どちらのプローブでも陽性を示すプラークを単離・解析することにより、６個のｃＤＮＡを単離した。本参考例では、プローブＰおよび下記のプローブＲにより同様のスクリーニングを行うことにより、さらに６個のｃＤＮＡを単離した。詳細は、以下のとおりである。
まず、２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号６０および６１は各々、配列番号１の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する。
【０２０１】
電気泳動後、約４３０ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（プローブＲ、図８）。
【０２０２】
ＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を２０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンを参考例６のプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＲとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。その結果、プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークが１２個見出された。
【０２０３】
そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。１２個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致したため、それら６クローンの全塩基配列を決定した（＃７−＃１２）。その結果を配列番号５４−８５に示す。
【０２０４】
配列番号５４−８５のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号５４の塩基２２９−２６０１、配列番号５５の塩基１７５−２５４７、配列番号５６の塩基２２７−２５９９、配列番号５７の塩基２２０−２５９２、配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び配列番号５９の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【０２０５】
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号５７−５９）。
【０２０６】
実施例１ 単一コピー導入形質転換体の選抜
（材料および方法）
本発明者らは、参考例４（１）において、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片をＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）に導入することにより、形質転換当代（Ｔ０世代）で種子稔性が回復することを見出した。
【０２０７】
稔性が回復した形質転換植物（Ｔ０世代）のなかから１２個体を選び、緑葉からＳＤＳ−フェノール法（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）により全ＤＮＡを抽出した。全ＤＮＡをＳａｃＩで消化し、アガロース電気泳動にかけた後、製造者の手引書に従いＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写し、サザン解析に供試した。
【０２０８】
サザン解析のためのプローブは、以下のようにして作成した。まず、２種類のプライマー、
（配列番号１の塩基４９２４４−４９２６７に相当）
および
（配列番号１の塩基５０２２６−５０２０３に相当）
を用いて、上述のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。電気泳動後、約９８０ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした。
【０２０９】
ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液にプローブを添加し、６５℃で１６時間行った。洗浄は、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液により６５℃・１５分で２回行った後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液により６５℃・１５分で２回行った。洗浄後のメンブレンをＦＵＪＩＸ ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍｓ）で解析した。その他の実験手法は、実験手引書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１、上述）を参考にして行った。
【０２１０】
ＳａｃＩ消化の結果から、単一コピーであることが示された個体の一部については、ＥｃｏＲＶ消化後、上述と同様にサザン解析を行った。
【０２１１】
（結果および考察）
１２個体についてのＳａｃＩ消化サザン解析の結果、内生のｒｆ−１遺伝子に対応する約１２ｋｂのバンドに加え、種々のサイズのバンドが観察された。各個体のバンドの数は、その個体の導入コピー数を反映していると考えられるので、約１２ｋｂのバンド以外のバンドが１本だけ観察された７個体を、単一コピー導入個体候補とした。
【０２１２】
それら単一コピー導入個体候補のなかから６個体を選抜し、ＥｃｏＲＶ消化サザン解析を行った。その結果、いずれの個体についても、内生のＲｆ−１遺伝子に対応する約１５ｋｂのバンドに加え、１本のバンドが観察された。以上の結果から、これら６個体は単一コピー導入個体であることが示された。
【０２１３】
実施例２ 導入遺伝子ホモ型個体の選抜
（材料および方法）
実施例１で単一コピー導入個体であることが示された６個体のなかの４個体（１６Ｔ０−６、１６Ｔ０−２６、１６Ｔ０−３４、１６Ｔ０−３５）の自殖次代を６個体ずつ栽培し、実施例１に記載した方法で全ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＶ消化サザン解析を行った。
【０２１４】
（結果および考察）
内生のｒｆ−１遺伝子に対応する約１５ｋｂのバンドと導入遺伝子に対応するバンドの強度を、各系統内で比較することにより、各系統から導入遺伝子ホモ型個体を１個体ずつ選抜した（１６Ｔ１−６、１６Ｔ１−２６、１６Ｔ１−３４、１６Ｔ１−３５）。これら４個体の花粉稔性をヨウ素ヨウ化カリウム染色で調査したところ、いずれも１００％に近いことがわかり、サザン解析の結果から推定した導入遺伝子座の遺伝子型が正しいことが示された。
【０２１５】
実施例３ 導入遺伝子の染色体部位の同定
（１）１６Ｔ０−６における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−６のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて製造者の手引書に従って導入部位の増幅を行った。１回目のＰＣＲには、特異的プライマーとして
Ｎｏｓ Ｆ１：
を用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で１分間の熱変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。
【０２１６】
２回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲ反応溶液の２００倍希釈液１μｌをテンプレートにし、特異的プライマーとして
Ｎｏｓ Ｆ２：
を用いた。ＰＣＲ条件は、１回目と同様とした。２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅された断片を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収し、塩基配列を解析した。
【０２１７】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約５００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を行った。その結果、日本晴の第６染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＰ００４００７）の相補鎖配列と一致することがわかった。
【０２１８】
そこで、ＡＰ００４００７の相補鎖配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ６ Ｆ：
および
Ｎｏ６ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−６（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２１０ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−６からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２１９】
さらに、ＮｏｓＦ２とＮｏ６Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−６の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−６からは期待された大きさ（２３４ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２０】
以上の結果から、１６Ｔ０−６における導入遺伝子挿入部位は、第６染色体のＡＰ００４００７に対応する部位であることが示された。
【０２２１】
（２）１６Ｔ０−２６における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−２６のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。ただし、ＰＣＲのバッファーには、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）添付のＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉ）を用いた。
【０２２２】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、日本晴の第１０染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＣ０２６７５８）の配列と一致することがわかった。
【０２２３】
そこで、ＡＣ０２６７５８の配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ２６ Ｆ：
および
Ｎｏ２６ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−２６（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２４６ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−２６からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２４】
さらに、Ｎｏｓ Ｆ２とＮｏ２６ Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−２６の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−２６からは期待された大きさ（３５２ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２５】
以上の結果から、１６Ｔ０−２６における導入遺伝子挿入部位は、第１０染色体のＡＣ０２６７５８に対応する部位であることが示された。
【０２２６】
（３）１６Ｔ０−３４における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−３４のＤＮＡをＢａｍＨＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、２００２年９月９日時点では、当該配列を持つクローンは見出されなかった。
【０２２７】
（４）１６Ｔ０−３５における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−３５のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。
【０２２８】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約５００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、日本晴の第７染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＰ００４００９）の配列と一致することがわかった。
【０２２９】
そこで、ＡＰ００４００９の配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ３５ Ｆ：
および
Ｎｏ３５ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−３５（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２３５ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−３５からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２３０】
さらに、Ｎｏｓ Ｆ２とＮｏ３５ Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−３５の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−３５からは期待された大きさ（１７７ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２３１】
以上の結果から、１６Ｔ０−３５における導入遺伝子挿入部位は、第７染色体のＡＰ００４００９に対応する部位であることが示された。
【０２３２】
実施例４ Ｒｆ−１集積系統のヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性調査
（材料および方法）
下記の植物材料を供試した。
【０２３３】
１）ＭＳコシヒカリ
２）コシヒカリ
３）ＦＲコシヒカリ（連続戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１遺伝子を導入した系統）
４）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリ
５）１６Ｔ１−６、１６Ｔ１−２６、１６Ｔ１−３４、１６Ｔ１−３５の自殖次代（１６Ｔ２−６、１６Ｔ２−２６、１６Ｔ２−３４、１６Ｔ２−３５）
６）ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
７）ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
８）３座Ｒｆ−１ヘテロ個体
９）４座Ｒｆ−１ヘテロ個体
８）及び９）の３座Ｒｆ−１ヘテロ個体および４座Ｒｆ−１ヘテロ個体は、以下のように作出した。３座Ｒｆ−１ヘテロ個体を作出するために、（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物３９個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座遺伝子型、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座遺伝子型（第６染色体）、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座遺伝子型（第７染色体）を、下記のとおりＤＮＡマーカーにより推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３４ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、１７７ｂｐの断片が増幅された場合に、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの３個体が、Ｒｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。
【０２３４】
また、４座Ｒｆ−１ヘテロ個体を作出するために、（１６Ｔ１−３４×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物６２個体について、Ｒｆ−１座遺伝子型、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座遺伝子型、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座遺伝子型、および、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座遺伝子型を推定した。１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２および
Ｎｏ３４ Ｒ：
を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２４５ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの５個体が、Ｒｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座、および、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。
【０２３５】
１）ないし９）の各品種・系統の２個体から、出穂後の未開花穎花を１個体あたり４穎花サンプリングした。各穎花から葯を取り出し、ヨウ素ヨウ化カリウム液中で軽く粉砕した後に顕微鏡観察した。ヨウ素デンプン反応により濃青色を呈する花粉を稔実花粉、それ以外の花粉を不稔花粉とみなした。各穎花について、２００花粉以上を調査した。
【０２３６】
（結果および考察）
穎花ごとの花粉稔性を算出し、各品種・系統について８穎花の花粉稔性の平均値および標準偏差を求めた結果を表２に示す。
【０２３７】
【表２】
１）ＭＳコシヒカリ、２）コシヒカリ、３）ＦＲコシヒカリ、および、４）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの理論的花粉稔性は、それぞれ、０％、１００％、１００％、および、５０％であるが、それらの理論値に近い花粉稔性が実際に観察された。
【０２３８】
５）の１６Ｔ２−６、１６Ｔ２−２６、１６Ｔ２−３４、および、１６Ｔ２−３５は、ＦＲコシヒカリと同程度の花粉稔性を示し、また、６）のＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、および、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３５はＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリと同程度の花粉稔性を示した。これらのことから、遺伝子工学的に導入した各Ｒｆ−１遺伝子が、内生Ｒｆ−１遺伝子と同様に機能していることが示唆された。
【０２３９】
７）のＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６およびＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５の花粉稔性は、それぞれ、７４％および７６％であった。ＦＲコシヒカリが持つ内生Ｒｆ−１遺伝子は第１０染色体に座乗するのに対し、１６Ｔ１−６および１６Ｔ１−３５が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子は、実施例３に記載したとおり、それぞれ、第６および第７染色体に座乗する。このため、上記Ｆ１では、内生Ｒｆ−１および導入Ｒｆ−１をともに持つ花粉、内生Ｒｆ−１のみを持つ花粉、導入Ｒｆ−１のみを持つ花粉、ならびに、いずれのＲｆ−１も持たない花粉が、１：１：１：１の比で分離すると考えられる。これらＦ１の花粉稔性が概ね７５％であったことから、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は、稔性を持つと推察された。
【０２４０】
ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３４の花粉稔性は７０％であり、内生Ｒｆ−１および導入Ｒｆ−１が独立である場合の期待値７５％に近かった。１６Ｔ１−３４が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子の位置は同定されていないが、本結果から、少なくとも第１０染色体の内生Ｒｆ−１座と強い連鎖関係にない座位であることが示された。
【０２４１】
ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６の花粉稔性は９２％であった。１６Ｔ１−２６が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子は、実施例３に記載したとおり、第１０染色体のＡＣ０２６７５８の内部に位置し、ＡＣ０２６７５８はＲＦＬＰマーカー座Ｃ７９７に対応する。一方、ＦＲコシヒカリが持つ内生Ｒｆ−１遺伝子は、第１０染色体のＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４と密接連鎖している（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＲＦＬＰ連鎖地図（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）によると、Ｃ７９７とＳ１２５６４との間の地図距離は約２０ｃＭである。両マーカー間の組換え価が約２０％である場合、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６の理論的花粉稔性は約９０％と計算される。観察された花粉稔性は、この理論値に近いものであった。
【０２４２】
８）の３座Ｒｆ−１ヘテロ個体は、Ｒｆ−１を第６、第７および第１０染色体に持つため、各Ｒｆ−１は独立に遺伝する。したがって、これらの個体では、Ｒｆ−１を３個、２個、１個および０個持つ花粉が、１：３：３：１の比で分離すると期待される。これらの個体の花粉稔性が概ね８７．５％であったことから、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は稔性を持つことが示され、Ｒｆ−１を３個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。
【０２４３】
また、９）の４座Ｒｆ−１ヘテロ個体については、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座が同定されていないため、各Ｒｆ−１が独立に遺伝するか否かは不明である。しかし、各Ｒｆ−１が独立に遺伝し、かつ、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は稔性を持つ、と仮定したときの理論上の花粉稔性９３．７５％に極めて近い値が観察された。このことから、Ｒｆ−１を４個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。
【０２４４】
実施例５ Ｒｆ−１集積系統の花粉発芽試験
（材料および方法）
下記の植物材料を供試した。
【０２４５】
１）コシヒカリ
２）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリ
３）ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
各品種・系統の２個体から、開花中の穎花を１個体あたり４穎花選び、葯をピンセットでつまみ取り、花粉発芽培地上に直接置床した。花粉発芽培地には、既報（Ｋａｒｉｙａ，１９８９）に従い、１％ Ａｇａｒ、２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、２０ｐｐｍ Ｈ３ＢＯ３からなる寒天培地を用いた。２０分以上経過した後、顕微鏡観察し、花粉管の伸長が認められた花粉を稔性花粉とみなした。各穎花について、２００花粉以上を調査した。
【０２４６】
（結果および考察）
穎花ごとの発芽率を算出し、各品種・系統について８穎花の発芽率の平均値および標準偏差を求めた結果を表３に示す。
【０２４７】
【表３】
コシヒカリおよびＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの発芽率は、それぞれ、９３％および３９％であった。ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６およびＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５の発芽率は、それぞれ、５８％および６６％であり、コシヒカリの発芽率ほど高くはないものの、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの発芽率よりは有意に高かった。
【０２４８】
ヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性調査の結果と考えあわせると、複数座でＲｆ−１ヘテロの系統は、通常のハイブリッド（単一座でＲｆ−１ヘテロ）と比較して、デンプンを蓄積する花粉の割合、即ち、正常に発育する花粉の割合が増加し、その結果、実際に発芽する花粉の割合も増加するものと考えられる。
【０２４９】
実施例６ ２座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統及び３座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統の作成
２座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６の交雑Ｆ２の２４個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座および１６Ｔ１−６の導入遺伝子座（第６染色体）における遺伝子型を推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏ６ ＦおよびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２１０ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの１個体が、Ｒｆ−１座および１６Ｔ１−６の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。
３座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。実施例４に記載した通り、（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物３９個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座（第６染色体）、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座（第７染色体）を、下記のとおりＤＮＡマーカーにより推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３４ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、１７７ｂｐの断片が増幅された場合に、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの１個体が、Ｒｆ−１座でＲｆ−１ホモ、かつ、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の両座においてヘテロであると推定された。
【０２５０】
そこで、その個体の自殖次代２４個体からＤＮＡを調整し、各個体の１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座における遺伝子型を推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、上述の通り、Ｎｏ６ ＦおよびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２１０ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏ３５ ＦおよびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３５ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの２個体が、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。これらの個体は、Ｒｆ−１座でＲｆ−１ホモであるので、合計３座でＲｆ−１ホモである。
【０２５１】
実施例７ 耐冷性検定
（材料および方法）
コシヒカリ、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１、及び、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５（実施例４に記載）のＦ１を供試した。慣行法により移植期まで育成させた後、各品種・系統につき４個体を、１／５０００アールのワグネルポットに移植した（１個体、１ポット）。移植後は、明条件（２４℃）１２時間、暗条件（１９℃）１２時間に設定した人工気象器内で栽培した。登熟後に各個体から１０穂をサンプリングし、各穂について種子稔性（全穎果中の稔実穎果の割合）を求め、１０穂の種子稔性の平均をその個体の種子稔性とした。
【０２５２】
（結果および考察）
４個体の平均種子稔性は、コシヒカリで約９５％であったのに対し、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１では約５７％であった。コシヒカリと比較してＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１の種子稔性が低かったことから、今回用いた低温条件により、耐冷性の品種・系統間比較が可能であると考えられた。また、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１の４個体の平均種子稔性は約７６％であり、コシヒカリほど高くはないものの、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１よりは高かった。母比率の差の検定を行ったところ、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１（５８０８穎果のなかの３２７６穎果が稔実）とＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１（５９００穎果のなかの４５８７穎果が稔実）との間の種子稔性の差は、１％水準で有意であることが示された。本結果は、複数座でＲｆ−１遺伝子をヘテロで保有するハイブリッドは、従来のハイブリッドと比較して、低温条件においても高い種子稔性を維持することを意味する。以上のことから、複数座でＲｆ−１遺伝子をホモで保有する稔性回復系統を用いることにより、ハイブリッド品種の耐冷性を向上させることができると考えられる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、平成１５年６月１８日に提出された特願２００３−１７３９２７に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に導入したハイブリッド植物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の技術
イネ等の自殖性植物において品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるために穎花が開花する直前に穎花内の雄しべを全て取り除き、次いで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。しかしながら、このような手作業による交雑方法で商業的規模での大量の雑種種子を生産することは不可能である。
【０００４】
そこで、ハイブリッド品種の生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、配偶体型稔性回復遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの３系統を用いて、（ｉ）不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ｉｉ）一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。
【０００５】
ハイブリッド種子を商業的に生産するために、雄性不稔細胞質および核にコードされた稔性回復遺伝子が利用されている。稔性回復遺伝子は、その作用機構により、配偶体型および胞子体型に分類される。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１やトウモロコシのＳ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＷＡ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子やトウモロコシのＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子などが知られている。
【０００６】
配偶体型の稔性回復遺伝子を利用してハイブリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が１：１に分離するため、理論的花粉稔性は５０％となる。これは、一般品種の理論的花粉稔性１００％の半分であり、ハイブリッド品種の種子生産の安定性を低下させる要因として危惧されていた。実際に、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質とその稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を利用したハイブリッド品種は耐冷性が弱いことが一般に知られているが、その原因は理論的花粉稔性の低さ（５０％）であると考えられている。
【０００７】
一方、胞子体型でも、以下のような問題が存在する。イネのＷＡ細胞質に対する稔性回復は複数個の稔性回復遺伝子によって付与されると考えられているが、その数や染色体上での位置は詳細に同定されていない。このため、ＷＡ細胞質に対する回復系統としてハイブリッド育種で使用するためには、収量性や草型などの特性が優れていることに加え、ＷＡ細胞質に対して完全回復能を持つことが不稔系統との交雑次代での種子稔性調査により示されている必要がある。稔性回復能以外の特性がいくら優れていても、ＷＡ細胞質雄性不稔系統との交雑次代での種子稔性が完全でなければ、回復系統として利用することはできない。また、前述の通り、回復系統の数や座乗位置が詳細に同定されていないため、その他の特性を維持して回復能だけを改良することは困難である。
【０００８】
よって、高い稔性を有するハイブリッド品種を作成するための方法が希求される。
【特許文献１】特開２００２−３４５４８５号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０１４５０６ Ａ１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０２７２９０ Ａ１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０１９８０３ Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｉ．，ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｒｉｃｅ．Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓ．Ｓ．Ｂａｎｇａ ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｇａ，ｅｄｓ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ），ｐｐ．２２１−２５６．
【非特許文献２】Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｂ．Ｓ．（１９９８）．Ｍａｉｚｅ．Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓ．Ｓ．Ｂａｎｇａ ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｇａ，ｅｄｓ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．２８２−３１５．
【非特許文献３】Ｗｅｎ，Ｌ．＆Ｃｈａｓｅ、Ｃ．Ｄ．（１９９９）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３５，ｐ．５２１−５２６に
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）ｐ．１６４−１６５
【非特許文献５】Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２
【非特許文献６】Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９６）１０，ｐ．１６５−１７４
【非特許文献７】Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０），７７：ｐ．７３４７−７３５１
【非特許文献８】Ｌｅｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ １９９２，２７，ｐ．１６１−１６３
【非特許文献９】Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｗｉｓｅ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｎｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（１９９６）Ｔｈｅ ｒｆ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｓｔｏｒｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ Ｔ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｍａｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１３３４−１３３６
【非特許文献１０】Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｈｏｒｎｅｒ，Ｈ．Ｔ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｓｃｈｎａｂｌｅ，Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｉｚｅ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１３，１０６３−１０７８
【非特許文献１１】Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ １９９８，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（３）ｐ．３８１−３８５
【非特許文献１２】Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（３）ｐ．３８７−３９２
【非特許文献１３】Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，Ｎａｋａｋｉｄｏ，Ｆ．，ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，Ｔ．（１９８９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７７，５４７−５５２．
【非特許文献１４】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０．
【非特許文献１５】Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔａｋｅｍｏｒｉ，Ｎ．，Ｋａｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｎｉｔｔａ，Ｎ．（２００２）．Ｆｉｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｅｓｔｏｒｅｒ ｇｅｎｅ，Ｒｆ−１，ｔｈａｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ＢＴ−ｔｙｐｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．Ｂｒｅｅｄ．Ｒｅｓ．４（Ｓｕｐｐｌ．２），２４３．
【非特許文献１６】Ｈａｒｕｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ２２７５ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ Ｆ２ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８，４７９−４９４．
【非特許文献１７】Ｋａｒｉｙａ，Ｋ．（１９８９）．Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｏｏｌｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ＩＩＩ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊａｐ．Ｊ．Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．５８，９６−１０２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供することを目的とする。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。
【００１０】
本発明において、完全連鎖関係にない遺伝子座とは、好ましくは異なる染色体上の遺伝子座である。
【００１１】
本発明において、稔性回復遺伝子は、好ましくは配偶体型稔性回復遺伝子、より好ましくはイネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子である。
【００１２】
本発明はまた、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、前記ハイブリッド植物の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、高い稔性を有するハイブリッド植物を得ることに成功し、本願発明を想到した。
【００１４】
ハイブリッド植物
よって、本発明は、高い稔性を有するハイブリッド植物を提供する。本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有することを特徴とする。
【００１５】
植物において配偶体である花粉の形成の際に減数分裂が生じ、各組の相同染色体が分離する。よって、配偶体型稔性回復遺伝子と雄性不稔細胞質を利用してハイブリッド品種を育成すると、ハイブリッド品種の葯では稔性回復遺伝子を持つ花粉と持たない花粉が１：１に分離するため、理論的花粉稔性は５０％となる。本発明のハイブリッド植物は、ａ）２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を有すること、そして、ｂ）それらを完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有すること、という特徴のため、減数分裂により花粉が形成される際に、いずれかの染色体に配偶体型回復遺伝子が存在する可能性が高くなる、という利点を有する。
【００１６】
具体的には、例えば、イネは１２組の相同染色体を有するが、遺伝子導入および交配の繰り返しにより、例えば、第６、第７、第１０染色体の３カ所に配偶体型回復遺伝子を配置させる。花粉が形成される場合に配偶体を有する相同染色体と有さない相同染色体は、他組の相同染色体の分離とは独立して分離される。よって、配偶体型稔性回復遺伝子を３カ所に有する花粉（第６、第７、第１０染色体）、２カ所に有する花粉（第６及び第７染色体、第６及び第１０染色体または第７及び第１０染色体）、１カ所に有する花粉（第６、第７、第１０染色体のいずれか）、０カ所に有する花粉が、１：３：３：１の割合で形成される。本研究者は、遺伝子工学的に導入された配偶体型稔性回復遺伝子が内因性の遺伝子と同様に機能すること、花粉が配偶体型稔性回復遺伝子を１つでも有すれば稔性が得られること、そして、配偶体型稔性回復遺伝子を複数持つ花粉も正常に発育することを明らかにした。よって、理論的には配偶体型稔性回復遺伝子を全く含まない１／８の割合の花粉以外、即ち、８７．５％の花粉は稔性を有することになる。後述の実施例４において、３座Ｒｆ−１ヘテロ個体の花粉稔性が概ね８７．５％であることが示され、上記理論が正しいことが実証された。
【００１７】
以上、本発明の技術的特徴の説明のために、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が異なる染色体上にある場合を例に挙げた。しかしながら、同一染色体上に複数、例えば２個の遺伝子座が存在しても、両者にある程度遺伝的距離があれば、異なる染色体上に座乗している場合と同様に独立に遺伝される。あるいは完全に独立して遺伝されなくても、完全に挙動を共にしない限り、「２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を配置することにより花粉稔性を向上させる」という本願発明の目的を達成しうる。よって、本明細書において「完全連鎖関係にない」とは、異なる染色体上に座乗している場合と同様に完全に独立に遺伝されるいわゆる「独立の関係の場合」のみならず、独立ではないが完全連鎖でもないような「密接ないし穏やかな連鎖関係にある場合」も含む。限定されるわけではないが、２個の遺伝子座が約１ｃＭ以上、より好ましくは約５ｃＭ以上の距離にある場合に、両者は完全には挙動を共にせず遺伝する、即ち、「完全連鎖関係にない」と言える。
【００１８】
さらに胞子体型稔性回復遺伝子については、ＢＴ細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１がＷＡ細胞質に対して部分的稔性回復能を示すことも十分考えられる。しかも、複数のＲｆ−１を配置することにより回復程度が向上する可能性もある。現在、それらの点を確認するための実験を遂行中である。
【００１９】
本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有するハイブリッド植物は、上述したように稔性回復遺伝子を１コピーしか有しない稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体（従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い花粉稔性を有する。さらに、耐冷性、即ち、低温条件下での種子稔性も向上する（実施例７）。「低温条件下」とは、例えば、移植後から登熟期まで、２０℃ないし２８℃の明条件下、１５℃ないし２３℃の暗条件下で栽培することを意味する。例えば、後述の実施例７では、移植後から登熟期まで、明条件（２４℃）１２時間、暗条件（１９℃）１２時間で栽培したところ、本願発明のハイブリッド植物（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１）は、稔性回復遺伝子を１コピーしか有しない稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体（ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１）（従来技術のハイブリッド植物）と比較して、高い種子稔性を維持した。
【００２０】
本発明のハイブリッド植物は、花粉、種子、成体のあらゆる状態を含む。
【００２１】
本発明において得られるハイブリッド植物の属、種は特に限定されず、例えば、イネ、トウモロコシが含まれる。最も好ましくはイネである。
【００２２】
本発明の「稔性回復遺伝子」は、配偶体型および胞子体型の双方を含む。配偶体型では、花粉の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１やトウモロコシのＳ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られている。一方、胞子体型では、花粉を生じる植物体の遺伝子型により花粉稔性が回復されるか否かが決定され、イネのＷＡ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ａｈｍｅｄ ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑ，１９９８）やトウモロコシのＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｄｈｉｌｌｏｎ，１９９８）などが知られている。
【００２３】
「配偶体型稔性回復遺伝子」は、ハイブリッド植物の種類に応じて公知の遺伝子を利用可能である。例えば、ハイブリッドイネの場合、イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子Ｒｆ−１が利用可能である。Ｒｆ−１遺伝子については、本発明者らが単離・同定し、特許出願を行っている。Ｒｆ−１遺伝子については、本明細書中で詳述する。ハイブリッドトウモロコシの場合、Ｓ型雄性不稔細胞質に対する回復遺伝子が知られており、例えば、Ｗｅｎ，Ｌ．＆Ｃｈａｓｅ、Ｃ．Ｄ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３５，ｐ．５２１−５２６に記載されている。
【００２４】
本発明のハイブリッド植物は稔性回復遺伝子を、２コピーまたはそれより多く含む。本発明は、完全連鎖関係にない遺伝子が完全に又は一部独立して遺伝する性質を利用する。よって、複数の稔性回復遺伝子は同一染色体上にある場合でも約１ｃＭ以上、より好ましくは約５ｃＭ以上の距離に存在することが望ましい。最も好ましくは、各々異なる染色体上に存在することが望ましい。よって、稔性回復遺伝子は特に限定されないが、最大でも染色体の組の数であることが好ましい。
【００２５】
本発明のハイブリッド植物は、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する。各遺伝子がそれぞれ全て完全連鎖関係にない遺伝子座に存在することが望ましい。但し、３コピー以上の複数の遺伝子を有する場合、そのうちの一部が連鎖関係にある遺伝子座に存在する場合でも、その他の遺伝子が完全連鎖関係にない遺伝子座に存在している場合は、単一コピー（ヘテロ）の場合よりも高い稔性を得ることができ、本発明のハイブリッド植物に含まれる。例えば、４コピーの遺伝子を含むハイブリッド植物であって、そのうちの２つが同一の染色体上の連鎖関係にある遺伝子座に存在し、その他の２つが各々別個の染色体に存在する場合が含まれる。完全連鎖関係にない遺伝子の数が多いほど、稔性を有する花粉の確率は高くなる。理論的には、稔性回復遺伝子が１コピーしか存在しない場合には５０％であるのに対し、例えば、２コピー、３コピー、４コピー、５コピーと増えると、７５％、８７．５％、９３．７５％、９６．８７５％と稔性が高くなる。本発明の実施例４では最大４遺伝子座に稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を有するハイブリッドイネが作成され、理論上の花粉稔性９３．７５％に極めて近い値が観察された。このことから、稔性回復遺伝子を複数個、例えば４個持つ花粉も正常に発育するものことが示された。よって、限定されるわけではないが、本発明においてハイブリッド植物において、稔性回復遺伝子のコピー数は、好ましくは２ないし宿主植物の染色体の組の数、好ましくは２ないし４である。
【００２６】
なお、本発明のハイブリッド植物中の２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子のうちの１コピーは、稔性回復遺伝子を天然に保有する稔性回復系統の植物由来のものであってもよい。例えば、イネのＲｆ−１遺伝子座は第１０染色体上に存在することが知られている（Ｆｕｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊｐｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２（ｓｕｐｌ．１）１６４−１６５）。このような内因性の稔性回復遺伝子は、本発明のハイブリッド植物の作成に利用可能である。
【００２７】
ハイブリッド植物の作成方法
本発明はまた、稔性を高めた本発明のハイブリッド植物の作成方法を提供する。本発明の方法は、稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む。
【００２８】
限定されるわけではないが、本発明の好ましい方法は、
１）稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、
２）工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配する
ことを含む、作成方法である。
【００２９】
１）の工程における、植物への稔性回復遺伝子の導入方法は特に限定されず、植物の種類に応じた公知の方法を使用することが可能である。遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、植物に導入されうる稔性回復遺伝子（例えば、イネのＲｆ−１）を含む核酸を含む。
【００３０】
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。植物において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００３１】
さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい
プラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞である植物に導入される。
【００３２】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸断片を用いて植物に稔性を付与する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
【００３３】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（稔性回復遺伝子の核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。
【００３４】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって形質転換することができる。
【００３５】
特に植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２，１７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８））などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。
【００３６】
限定されるわけではないが、アグロバクテリウムを用いる植物（例えば、イネ）の回復系統の作成方法は、例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，ｐ．２７１−２８２（１９９４）、Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：ｐ．７３４７−７３５１（１９８０）等に記載されている。
【００３７】
先ず、所期の挿入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、前記Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）らにプラスミドマップが記載されている、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。本明細書後述する参考例では、ｐＳＢ１１を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成して使用した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
【００３８】
次いで、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えばＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４等、いずれも例えばＴＡＫＡＲＡ社より購入可能）を形質転換する。
【００３９】
さらに、形質転換された大腸菌を用いて、アグロバクテリウム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行う。限定されるわけではないが、アグロバクテリウムは例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＮＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ３等を使用することが可能である。いずれも前述のＫｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，ｐ．１６５−１７４（１９９６）にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えばＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないがｐＲＫ２０７３を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（Ｌｅｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ １９９２，２７，ｐ．１６１−１６３）。
【００４０】
次いで、所期の交配が生じたアグロバクテリウムを用いて、例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、雄性不稔植物、例えばイネの形質転換を行う。形質転換に必要なイネ未熟種子は、例えば、雄性不稔イネにジャポニカ品種の花粉をかけることにより作成できる。
【００４１】
形質転換植物の稔性回復は、例えば出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査することによって調べることが可能である。立毛調査とは、圃場などで栽培されている状態で観察する方法である。あるいは、実験室で穂の稔実率を調べる稔実率調査を行ってもよい。
【００４２】
稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入から、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物の作成は、限定されるわけではないが、例えば以下のように行うことができる。
【００４３】
まず、上述の方法で稔性回復した形質転換体から定法に従いＤＮＡを抽出して、ゲノミックサザン解析を行う。その際に用いるプローブは、導入した遺伝子断片の一部から調製する。解析結果に基づき、１コピー導入個体を複数選抜する。次いで、各自殖次代から、当該導入遺伝子についてホモ型の個体を選抜する（以下、Ａ個体とＢ個体と呼称する）。選抜は、上述のゲノミックサザン解析により行うこともできるし、当該遺伝子が導入された座の周辺塩基配列情報に基づいて設計したＰＣＲマーカーによって行うこともできる。天然の回復系統×Ａの交配により得られた交雑Ｆ２のなかから、２座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜する。天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、例えば、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１に記載の方法により推定することが可能である。Ａ個体に由来する稔性回復遺伝子の遺伝子型は、上述の通り、ゲノミックサザン解析により推定することもできるし、ＰＣＲマーカーによって推定することもできる。
【００４４】
同様の方法により、（天然の回復系統×Ａ）×（天然の回復系統×Ｂ）の交雑Ｆ１のなかから、天然の回復系統に由来する稔性回復遺伝子をホモで持ち、かつ、Ａ個体およびＢ個体に由来する稔性回復遺伝子をヘテロで持つ個体を選抜する。選抜個体の自殖次代のなかから、Ａ個体およびＢ個体に由来する稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を選抜することにより、３座で稔性回復遺伝子をホモで持つ個体を作成することができる。
【００４５】
なお、各工程の前又は後に、外来の遺伝子が導入された染色体の位置を確認してすることが可能である。導入遺伝子の染色体の位置を確認は、限定されるわけではないが、例えば、以下のように行うことができる。
【００４６】
稔性回復遺伝子とともに、宿主植物には天然に存在しない配列が組み込まれる。例えば、後述の実施例ではイネのＲｆ−１遺伝子ともに、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）（図９中のＮｏｓ）が組み込まれている。なお、Ｔｎｏｓの配列は公開データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）に登録されているクローニングベクターｐＢＩ１２１（アクセッション番号ＡＦ４８５７８３）に含まれている。実施例３ではＮｏｓを用いて導入遺伝子の染色体上の導入部位を同定した。具体的には、公知のＮｏｓの塩基配列に基づいてのプライマー（例：図９のＮｏｓＦ２）を作成し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅産物の末端塩基配列を解析し、Ｇｅｎｂａｎｋのデータベースに対して相同性検索を行ったところ、イネの特定の染色体のゲノムクローンの相補鎖配列（例：図９のＡＰ００４００７）と一致することがわかった。導入遺伝子が特定の染色体に存在することをさらに確認するために、前記特定の染色体上に２個のプライマーを設計し（例：図９のＮｏ６Ｆ及びＮｏ６Ｒ）、ＰＣＲを行ってもよい。ＰＣＲにより、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを鋳型とした場合には増幅産物が得られないのに対し、導入遺伝子が存在しない植物ゲノムの場合には所期の長さの断片が増幅される。逆に、導入遺伝子の染色体部位の同定に使用した、Ｎｏｓの塩基配列に基づいて単一のプライマー（例：図９のＮｏｓＦ２）と、染色体上の配列に基づくプライマー対の一方のプライマー（例：図９のＮｏｓ６Ｒ）をプライマー対として使用した場合には、導入遺伝子が存在するハイブリッド植物のゲノムを鋳型とした場合には所期の長さの断片が増幅されるの対し、導入遺伝子が存在しない植物ゲノムの場合には増幅産物が観察されない。
【００４７】
ゲノムの全体又は一部の塩基配列が確認されている植物において上記確認手法を利用することが可能である。例えば、イネやトウモロコシについては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータバンクにゲノムの塩基配列が開示されている。
【００４８】
２）さらに、工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統の植物とを交配する、ことにより本発明の植物を得ることができる。
【００４９】
交配後、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に有する植物を選択することができる。ハイブリッド植物に、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子が存在することは、例えば、サザン分析におけるバンドの数及び／又は濃度等によって確認することが可能である。
【００５０】
さらに、本発明は工程１）で作成された２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を含む。このような稔性回復系統植物は、実際の育種現場において、所期の雄性不稔系統と交配させることによって、本発明のハイブリッド植物を取得するために使用することができる。
【００５１】
イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１
本発明者らは、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子Ｒｆ−１を単離・同定した（参考例）。後述する実施例では配偶体型稔性回復遺伝子として、Ｒｆ−１遺伝子を用いて、ハイブリッドイネを作成した。Ｒｆ−１遺伝子については別途、特許出願を行っている。以下、詳述する。
【００５２】
本発明者らの先願
（特開２００２−３４５４８５、ＷＯ ０２／１４５０６ Ａ１）
（特願２００１−２８５２４７、特願２００１−３０９１３５及び特願２００２−１８５７０９、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１）
（特願２００２−１９７５６０、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０３１５４）
本発明者らは、まず、Ｒｆ−１の存在部位を第１０染色体上の極めて狭い範囲に特定した。その結果に基づいて、Ｒｆ−１遺伝子座の近傍に存在するＰＣＲマーカーを開発し、これらのＰＣＲマーカーが、Ｒｆ−１遺伝子座と連鎖することを利用して、Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法が見出された。具体的には、Ｒｆ−１遺伝子座が、イネ第１０染色体上に存在するＰＣＲマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間に座乗することを利用して、近傍に存在する新規のＰＣＲマーカー座の遺伝子型を調査することにより、Ｒｆ−１遺伝子の有無の調査およびＲｆ−１遺伝子ホモ型個体の選抜を実施する。当該Ｒｆ−１遺伝子を検出する方法につき、本発明者らは、特許出願を行い（特願２０００−２４７２０４）、特開２００２−３４５４８５として公開されている。また、前記日本特許出願に基づき国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０７０５２）を行い、ＷＯ ０２／１４５０６ Ａ１として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。
【００５３】
本発明者らはさらに、特願２０００−２４７２０４の改良方法として、Ｒｆ−１遺伝子を含むＲｆ−１遺伝子座の領域をさらに特定し、特願２００１−２８５２４７（２００１年９月１９日）、特願２００１−３０９１３５（２００１年１０月４日）及び特願２００２−１８５７０９（２００２年６月２６日）を出願した。そして、前記３つの日本特許出願に基づき、国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０９４２９）を行った。また、本発明者らはさらに研究を進め、Ｒｆ−１遺伝子を同定し、２００２年７月５日に特許出願を行った（特願２００２−１９７５６０）。また、前記日本特許出願に基づき、国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０３１５４）を行い、ＷＯ ０３／０２７２９０ Ａ１として国際公開されている。これらの出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。
【００５４】
特開２００２−３４５４８５において、Ｒｆ−１遺伝子座がＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間に座乗することが本発明者らにより明らかにされ、これを利用したＲＦＬＰ−ＰＣＲ用マーカーが記載されている。本発明者らは、さらにＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９ＩとＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の間の領域について、Ｒｆ−１遺伝子座とＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉとが密接連鎖することを手がかりに、染色体歩行および遺伝学的解析を行うことにより、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖する領域を調べた。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むＲｆ−１遺伝子座領域を約７６ｋｂまで特定し、そして当該領域の全塩基配列を決定することに成功した。
【００５５】
具体的には、特開２００２−３４５４８５では、ＭＳコシヒカリにＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成した集団１０４２個体を用いて連鎖分析を行い、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出した。本発明者らは、上記集団をさらに４１０３個体追加し、合計５１４５個体として解析を行った。その結果、新たに、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出し、それぞれの組換え個体の合計を２個体および８個体とした。これら１０個体をＲｆ−１座極近傍組換え個体として、高精度分離分析に供試することとした（参考例１）。
【００５６】
Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体が２個体に対し、Ｃ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体が８個体という上記の組換え個体出現頻度は、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座とを比較すると、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座のほうが遺伝学的にＲｆ−１座に近いことを意味する。遺伝的距離（組換え価ｃＭが単位）と物理的距離（塩基対数ｂｐが単位）とは必ずしも比例しないが、通常は遺伝的距離が短ければ物理的距離も短いと期待できる。
【００５７】
そこで、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座を起点に染色体歩行を行うことにより、Ｒｆ−１座を単離することとした（参考例２）。染色体歩行には、インディカ品種ＩＲ２４およびジャポニカ品種あそみのりのゲノムＤＮＡを用いてλ ＤＡＳＨ ＩＩベクターにより作成したゲノミックライブラリーを供試した。ＩＲ２４はＲｆ−１保有品種、あそみのりはＲｆ−１非保有品種である。染色体歩行を進めた結果、ＩＲ２４のゲノミッククローンにより約７６ｋｂの染色体領域をカバーするコンティグ（複数のクローンを重複部分で重ね合わせて染色上での順に整列化したもの）を作成することができ、その全塩基配列（７６３６３ｂｐ）を決定した。
【００５８】
次いで、得られた塩基配列情報等を利用することにより、新たに１２個のマーカーを開発し、既述のＲｆ−１座極近傍組換え個体１０個体を用いて、高精度分離分析を行った（参考例３）。その結果、上記の約７６ｋｂの染色体領域に含まれる６５ｋｂの配列がＲｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列を包含することが示された。この領域は、８個のゲノミッククローンから構成されるコンティグによりカバーされている。各クローンの長さは、約１２〜２２ｋｂであり少なくとも４．７ｋｂの重複部を持つ。一方、イネの遺伝子の長さについては、短いものから長いものまであることが知られているが、大部分の遺伝子は数ｋｂ以内であると考えられる。そのため、これら８個のゲノミッククローンのうち、少なくともひとつは完全長のＲｆ−１遺伝子を包含すると予測される。
【００５９】
本発明者らはさらに、上記７６ｋｂの染色体領域のうち、Ｒｆ−１遺伝子領域をさらに絞り込むと共に、稔性回復能の存在を直接的に証明するために、相補性試験を行った。
【００６０】
具体的には、雄性不稔系統であるＭＳコシヒカリの未熟種子に、上記７６ｋｂ領域内の１０個の部分断片（各１０〜２１ｋｂ）を、別々に遺伝子工学的に導入した（図５）。使用された１０個の部分断片のうち、８個は先に染色体歩行で得られた８個のゲノミッククローン（図１、参考例３に記載のＸＳＥ１、ＸＳＥ７、ＸＳＦ４、ＸＳＦ２０、ＸＳＧ２２、ＸＳＧ１６、ＸＳＧ８及びＸＳＨ１８）に由来するものである。これらに加えて、さらに２個のクローンＸＳＦ１８およびＸＳＸ１に由来する断片についても相補性試験を行った。ＸＳＦ１８はＸＳＦ２０と５’末端及び３’末端（各々、配列番号１の塩基２０３２８及び４１９２１）が同一だが、途中の塩基３３９４７−３８５９１を欠いている。これは、最初にクローンＸＳＦ１８が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、ＸＳＦ２０と命名したことに因る。また、ＸＳＸ１は、クローンＸＳＧ８とＸＳＨ１８の重複部分がやや小さいため（約７ｋｂ）、制限酵素処理およびライゲーションにより両クローンから、重複部分を十分に含むようなクローンを新たに作成したものである。
【００６１】
Ｒｆ−１は優性遺伝子であるので、導入した断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含している場合には、形質転換植物当代において稔性が回復する。相補性試験において、各断片について形質転換植物の種子稔性調査を行い、λファージクローンＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（参考例４）。他の断片については、形質転換植物はすべて不稔であった。これらの結果から、上記１５．６ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を完全に包含していることが示された。さらに、Ｒｆ−１遺伝子を遺伝子工学的に導入する方法が提供され、その有効性が実証された。
【００６２】
本発明者らは、λファージクローンＸＳＧ１６のどの部分がＲｆ−１遺伝子を含むかをさらに特定するために、前述の１５．６ｋｂ断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）よりも短い断片について相補性試験による種子稔性調査を行った。その結果、ＸＳＧ１６に由来する１１．４ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２３５７−５３７４３を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（参考例４（２））。さらに、より短い６．８ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４８８８３を含む）を導入した形質転換体においても、種子稔性が回復した（参考例４（３））。これらの結果から、上記６．８ｋｂ断片がＲｆ−１遺伝子を包含していることが示された。
【００６３】
本発明者らは、さらに研究をすすめ、稔性回復機能を有する核酸を特定し、それによってコードされるアミノ酸配列も明らかにした。具体的には、参考例５−６に記載したように、先ず、配列番号１の４３７３３−４４０３８及び４８３０６−５０２２６に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて作成した。これらの２種の断片をプローブ（プローブＰ及びＱ）として、コシヒカリにＲｆ−１を導入した系統より作成したｃＤＮＡをライブラリーをスクリーニングした。その結果、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致し、Ｒｆ−１遺伝子を含むクローンとして単離され、塩基配列が解析された（配列番号４３−４８）。
【００６４】
配列番号４３−４８のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードする。具体的には、各々配列番号４３の塩基２１５−２５８７、配列番号４４の塩基２１３−２５８５、配列番号４５の塩基２１８−２５９０、配列番号４６の塩基２０８−２５８０、配列番号４７の塩基１４９−２５２１及び配列番号４８の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【００６５】
配列番号４９のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。
【００６６】
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較し、Ｒｆ−１遺伝子のエキソンとイントロンの構造を明らかにした（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。Ｒｆ−１遺伝子のコード領域内には、イントロンは介在しない。
【００６７】
本発明者らは、参考例４（３）の相補性実験で種子稔性を回復した６．８ｋｂ断片について、さらに相補性実験を行った。具体的には、参考例７において、前記６．８ｋｂ断片中のＲｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４６３１８）を用いて、相補性実験を行ったところ、種子稔性が回復した。
【００６８】
さらに、参考例８において稔性回復機能を有する核酸を含むクローンを新たに６個取得した。具体的には、先ず、配列番号１の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する２種類のプライマーを用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をプローブＲとして、前記プローブＰとともにプラークハイブリダイゼーションを行なった。プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークから、新たに６個のクローンを得た（＃７−＃１２）。その結果を配列番号５４−５９に示す。
【００６９】
配列番号５４−５９のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号５４の塩基２２９−２６０１、配列番号５５の塩基１７５−２５４７、配列番号５６の塩基２２７−２５９９、配列番号５７の塩基２２０−２５９２、配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び配列番号５９の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【００７０】
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（特願２００１−２８５２４７の配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号５７−５９）。
【００７１】
稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号１の塩基配列を有する核酸、又は配列番号１の塩基配列と少なくとも７０％同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。さらに、参考例４に記載したように、配列番号１の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていると確認された。Ｒｆ−１遺伝子を含む領域はさらに、好ましくは、配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３、より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８と特定された。
【００７２】
Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域が特定された。
【００７３】
ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び
ｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２。
【００７４】
上記塩基配列は、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応し、そして、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。
【００７５】
以下、本明細書中、文脈により「配列番号１の塩基配列」という用語は、配列番号１全体、あるいは、その一部であって稔性回復機能に関与する部分、特に、塩基３８５３８−５４１２３を示す。より好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、さらに好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８を示す。そして、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを示す。
【００７６】
後述する参考例では、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸として、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ米のＩＲ２４のゲノムライブラリーより核酸が単離され、配列番号１の塩基配列が決定された。しかしながら、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を含む核酸の由来は、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種由来のものであれば特に限定されない。Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型品種は、特に限定されず、例えば、ＩＲ２４、ＩＲ８、ＩＲ３６、ＩＲ６４、Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ、ＢｏｒｏＩＩが含まれる。Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型品種としては、例えば、限定されるわけではないが、あそみのり、コシヒカリ、きらら３９７、アキヒカリ、あきたこまち、ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、ミネアサヒ、あいちのかおり、ハツシモ、アケボノ、フジヒカリ、峰の雪もち、ココノエモチ、ふくひびき、どんとこい、五百万石、ハナエチゼン、トドロキワセ、はえぬき、どまんなか、ヤマヒカリ等が知られている。「インディカ型品種」も「ジャポニカ型品種」も当業者に周知であり、当業者はどのようなイネ品種が本発明の対象となり得るか容易に判断できる。
【００７７】
本発明に利用可能な核酸は、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる
Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸は、好ましくは配列番号１の塩基配列を有する。１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号１と完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号１と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００７８】
Ｒｆ−１遺伝子は、好ましくは配列番号４９に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。
、稔性回復機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。Ｒｆ−１遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００７９】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００８０】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００８１】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。Ｒｆ−１遺伝子は、稔性回復機能を有する限り、配列番号１の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。「稔性回復機能を有する」とは、当該ＤＮＡ断片が導入された場合に、イネ個体又は種子に稔性を付与することを意味する。稔性回復は、Ｒｆ−１遺伝子よりタンパク質が発現されることに因ってもよく、あるいはＲｆ−１遺伝子の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）自体が稔性の付与に何らかの機能をしていてもよい。
【００８２】
限定されるわけではないが、Ｒｆ−１遺伝子の相同体、変異体が稔性回復機能を有するか否かは、例えば、以下のように調べることが可能である。ＭＳコシヒカリ（不稔系統）にコシヒカリの花粉をかけることにより得た未熟種子を供試して、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９４），６（２），ｐ．２７２−２８２）の方法に従い、被検定核酸断片を導入する。得られた形質転換体を通常の条件で栽培すると、被検定核酸断片が稔性回復機能を有する場合にのみ、種子が稔る。
【００８３】
Ｒｆ−１遺伝子を有しないジャポニカ型のあそみのりの対応する領域に由来する核酸は、配列番号２に示した塩基配列を有する。配列番号２と配列番号１の対応する部分は、全体として約９８％の同一性を有する。よって、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座を含む核酸は、配列番号１と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。「配列番号１」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
【００８４】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００８５】
本発明の好ましい核酸はまた、配列番号１の塩基配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸、並びに、配列番号１の塩基配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸を含む。
【００８６】
本明細書において使用されるように、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示されている。例えば、ニトロセルロースフィルターに関し、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０℃ないし６０℃での、１×ＳＳＣないし６ＸＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダイゼーション溶液が約５０％ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダイゼーション温度は約１５℃ないし２０℃低めとなる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、非常にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジェントな条件よりも、より高い温度及び／又はより低い塩濃度でのハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を含む、例えば、約６０℃ないし６５℃での０．１×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、および／又は約６５℃ないし６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００８７】
「配列番号１」は、特に好ましくは、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９、あるいは、これに対応する、ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６又はｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２のいずれかを意図する。
【００８８】
同様に、本発明の核酸には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号１の塩基配列とは異なるが稔性回復機能を有する核酸を含む。稔性回復機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。
【００８９】
本明細書の記載に基づいてＲｆ−１遺伝子がより特定され、当業者がＲｆ−１遺伝子以外の部分またはＲｆ−１遺伝子内のイントロン部分などの核酸を除いて使用することが可能である。また、既定のアミノ酸（特に配列番号４９に記載のアミノ酸配列）を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００９０】
本発明者らは、Ｒｆ−１遺伝子を有するインディカ型のＩＲ２４（塩基配列２７）と、有しないジャポニカ型のあそみのり（塩基配列２８）およびＧｅｎＢａｎｋに登録されている日本晴ＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）とを比較した。その結果、Ｒｆ−１遺伝子を含むインディカ型のＲｆ−１領域は少なくとも、以下の１塩基多型（ＳＮＰ）を有することを見出した。
【００９１】
１）配列番号１の塩基１２３９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号１の塩基６２２７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号１の塩基２０６８０に相当する塩基がＧである；
４）配列番号１の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；
５）配列番号１の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである；
６）配列番号１の塩基５６３６８に相当する塩基がＴである；
７）配列番号１の塩基５７６２９に相当する塩基がＣである；及び
８）配列番号１の塩基６６２６７に相当する塩基がＧである。
【００９２】
よって、本発明のＲｆ−１領域を含む核酸は、好ましくは上記条件１）−８）の１つないし全てを満たす。
【００９３】
なお、後述の参考例３において、Ｒｆ−１遺伝子極近傍組換え個体（ＲＳ１−ＲＳ２、ＲＣ１−ＲＣ８）についてそのＲｆ−１領域の染色体構成を調べた。その結果、配列番号１の塩基１２３９ないし６６２６７の塩基配列、即ち、最大限に見積もってもＰ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）（図３）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることが明らかにされた。ただし、Ｒｆ−１遺伝子の一部の遺伝子型がインディカ型であることが、Ｒｆ−１遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディカ型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。極端な場合、ジャポニカ・インディカ間でコーディング領域は完全に同一で、プロモーター領域だけに差違があり、そして、プロモーター領域及びコーディング領域の一部のみが上記Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に含まれることもあり得る。よって、上記共有インディカ型領域（配列番号１の塩基１２３９ないし６６２６７）がＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、
１）遺伝子の大きさは通常数ｋｂであり１０ｋｂを超えることは稀である；
２）ＩＲ２４のゲノム塩基配列（配列番号１）は、上記共有インディカ型領域を完全に包含する；
３）配列番号１の５’末端は、上記共有インディカ型領域の５’末端から１２３８ｂｐ上流に位置し、別の遺伝子（Ｓ１２５６４）の一部である；および
４）配列番号１の３’末端は、上記共有インディカ型領域の３’末端から１００９６ｂｐ下流に位置する
により、少なくとも配列番号１はＲｆ−１遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。
【００９４】
さらに、本発明者らは相補性試験を行うことにより、配列番号１の塩基配列のうち、特に塩基３８５３８−５４１２３にＲｆ−１遺伝子が完全に含まれていることを確認した。よって、本発明の一態様において、配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３の塩基配列と、少なくとも７０％同一の塩基配列は、以下の条件１）及び２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号１の塩基４５４６１に相当する塩基がＡである；及び
２）配列番号１の塩基４９６０９に相当する塩基がＡである。
【００９５】
本発明者らはさらに、Ｒｆ−１遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。
【００９６】
ａ）配列番号４３の塩基２１５−２５８７、
ｂ）配列番号４４の塩基２１３−２５８５、
ｃ）配列番号４５の塩基２１８−２５９０、
ｄ）配列番号４６の塩基２０８−２５８０、
ｅ）配列番号４７の塩基１４９−２５２１、
ｆ）配列番号４８の塩基２２５−２５９７、
ｈ）配列番号５４の塩基２２９−２６０１、
ｉ）配列番号５５の塩基１７５−２５４７、
ｊ）配列番号５６の塩基２２７−２５９９、
ｋ）配列番号５７の塩基２２０−２５９２、
ｌ）配列番号５８の塩基１７４−２５４６、及び
ｍ）配列番号５９の塩基９０−２４６２。
【００９７】
上記塩基配列は、ｇ）配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。本発明の好ましい核酸はさらに、
ｎ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と少なくとも７０％同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；
ｏ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び
ｐ）上記ａ）−ｍ）のいずれかの核酸に１ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。
を含む。
【００９８】
上記の配列番号１の塩基４５４６１は、１）配列番号４３の塩基１７６９；２）配列番号４４の塩基１７６７；３）配列番号４５の塩基１７７２；４）配列番号４６の塩基１７６２；５）配列番号４７の塩基１７０３；６）配列番号４８の塩基１７７９；７）配列番号５４の塩基１７８３；８）配列番号５５の塩基１７２９；９）配列番号５６の塩基１７８１；１０）配列番号５７の塩基１７７４；１１）配列番号５８の塩基１７２８；及び１２）配列番号５９の塩基１６４４に相当する。よって、特に好ましくは、本発明の方法に使用する核酸は、好ましくは、以下の条件１）−１２）の少なくとも一つを満たす：
１）配列番号４３の塩基１７６９に相当する塩基がＡである；
２）配列番号４４の塩基１７６７に相当する塩基がＡである；
３）配列番号４５の塩基１７７２に相当する塩基がＡである；
４）配列番号４６の塩基１７６２に相当する塩基がＡである；
５）配列番号４７の塩基１７０３に相当する塩基がＡである；
６）配列番号４８の塩基１７７９に相当する塩基がＡである；
７）配列番号５４の塩基１７８３に相当する塩基がＡである；
８）配列番号５５の塩基１７２９に相当する塩基がＡである；
９）配列番号５６の塩基１７８１に相当する塩基がＡである；
１０）配列番号５７の塩基１７７４に相当する塩基がＡである；
１１）配列番号５８の塩基１７２８に相当する塩基がＡである；又は
１２）配列番号５９の塩基１６４４に相当する塩基がＡである。
【００９９】
本明細書中の参考例４及び７に記載の相補性試験では実際に、図５に記載の１０個のクローン由来の断片を用い、アグロバクテリウムを用いる方法によりＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）を形質転換した。その結果、配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３、好ましくは、塩基４２３５７−５３７４３、より好ましくは、塩基４２１３２−４８８８３、さらにより好ましくは塩基４２１３２−４６３１８の塩基配列を含む核酸によって、稔性回復系統が育成されることが証明された。
【０１００】
本発明の実施例では、Ｒｆ−１遺伝子として、ＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片を使用し、花粉稔性が得られることを確認した。当該断片を含むより長い断片、並びに上述したようにＲｆ−１遺伝子を含むことが同定されているより短い断片も同様に利用可能であることは当業者に容易に理解される。好ましくは、より短い断片を利用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
［図１］図１は、ＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４を起点とする染色体歩行の結果を示す。
［図２］図２は、ＢＡＣクローンＡＣ０６８９２３とラムダクローンコンティグとの位置関係を示す。
［図３］図３は、Ｒｆ−１座極近傍組換え型花粉（いずれも稔性あり）のＲｆ−１座極近傍の染色体構成を、その花粉から生じた１０個体（ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＣ１−８）のマーカー座の遺伝子型に基づき、明らかにした結果を示したものである。白抜き部分はジャポニカ型領域を、黒部分はインディカ型領域を示す。
［図４］図４は、第１０染色体上のマーカー座とＲｆ−１座との連鎖分析の結果に基づき、Ｒｆ−１座の連鎖地図上での位置を示したものである。地図距離は、１０４２Ｆ１個体の分離データから算出した。
［図５］図５は、相補性試験によるＲｆ−１領域の同定のために使用した、１０個のゲノムクローン由来の断片を示す。染色体歩行により得られたλクローン（細い線）を用いて、太い直線で示した染色体領域について相補性試験を行った。ＸＳＦ１８は、欠失を含むクローンであることが分かったので、その欠失部分は点線で示した。
［図６］図６は、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ（参考例４）及びＸＳＦ１８由来の１６．２ｋｂ断片（塩基番号１の塩基２１０６５−３３９４６及び３８５９２−４１９２１を含む）を用いた相補性試験の結果を示す。ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂでは稔性が回復し、稲穂がたれている。
［図７］図７は、Ｒｆ−１遺伝子構造の模式図を示す。白棒部分および黒線部分は、それぞれエキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
［図８］図８は、相補性試験を行ったＩＲ２４ゲノム断片、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに用いたプローブ及び単離したｃＤＮＡから推定したＲｆ−１遺伝子の位置関係の模式図を示す。Ｒｆ−１遺伝子の白棒部分および黒線部分は、それぞれ、エキソンおよびイントロンを示す。エキソン部分については、塩基対数を示してある。
［図９］図９は、導入Ｒｆ−１部位を確認するために使用したプライマーの位置を示す模式図である。Ｎｏｓ：ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、ＨＰＴ：ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ＢＲ：ライトボーダー、ＢＬ：レフトボーダー。
［図１０］図１０は、本発明及び従来技術のハイブリッド植物の作成方法の例を示す模式図である。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０３】
参考例
以下の参考例は、イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子Ｒｆ−１の単離・同定、稔性回復活性の確認を記載したものである。
【０１０４】
参考例１ Ｒｆ−１座極近傍組換え個体の獲得
（材料および方法）
ＭＳコシヒカリ（世代：ＢＣ１０Ｆ１）にＭＳ−ＦＲコシヒカリ（世代：ＢＣ９Ｆ１、Ｒｆ−１座ヘテロ）の花粉をかけて作成したＢＣ１０Ｆ１集団４１０３個体を用い、各個体からＤＮＡを抽出し、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）に記載の方法でＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型を調査した。Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換えにより生じた個体とみなし、Ｃ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換えにより生じた個体とみなした。
【０１０５】
（結果および考察）
４１０３個体を調査した結果、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を６個体見出した。一方、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）において交配により得られた１０４２個体を調査した結果、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を１個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を２個体見出している。
【０１０６】
合計すると、５１４５個体から、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体を２個体、Ｒｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体を８個体獲得できたことになる。これら１０個体を以下の参考例における高精度分離分析に供試することにした。
【０１０７】
参考例２ 染色体歩行
（１）１回目染色体歩行
（材料および方法）
ジャポニカ品種あそみのり（Ｒｆ−１非保有品種）のゲノムＤＮＡを用いて、特開２００２−３４５４８５（又はＷＯ０２／１４５０６）に記載したようにＬａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩベクターによりゲノミックライブラリーを作成し、染色体歩行に供試した。
【０１０８】
ＲＦＬＰプローブＳ１２５６４の部分塩基配列（アクセッション番号Ｄ４７２８４）に対して次のプライマー対：
を設計し、あそみのり全ＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡは、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＡ、図１）とした。
【０１０９】
ライブラリーのスクリーニングは、プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にブロットした後、常法により行った。単一プラークを分離した後、Ｌａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプレートライセート法によりファージＤＮＡを精製した。
【０１１０】
（結果および考察）
スクリーニングにより４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＡ１およびＷＳＡ３）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＡ１およびＷＳＡ３に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した（ＤＮＡシーケンサー３７７、ＡＢＩ社）。
【０１１１】
（２）２回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーに加え、インディカ品種ＩＲ２４（Ｒｆ−１保有品種）のゲノムＤＮＡから同様に作成したＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１１２】
（１）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
を設計し、ＷＳＡ３のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた５２４ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＥ、図１）とした。
【０１１３】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１１４】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＷＳＥ８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＥ８に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１１５】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより７個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＥ１およびＸＳＥ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＥ１およびＸＳＥ７に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１１６】
（３）３回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１１７】
（２）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対：
を設計し、ＷＳＥ８のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた１１５９ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＦ、図１）とした。
【０１１８】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１１９】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより８個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＦ５およびＷＳＦ７）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＦ５およびＷＳＦ７に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１２０】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１３個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＦ４およびＸＳＦ２０に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１２１】
（４）４回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のあそみのりゲノミックライブラリーおよびＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１２２】
（３）で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対してプライマー対：
を設計し、ＷＳＦ７のＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた４５６ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＧ、図１）とした。
【０１２３】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１２４】
（結果および考察）
あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより６個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（ＷＳＧ２およびＷＳＧ６）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＷＳＧ２およびＷＳＧ６に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。
【０１２５】
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１４個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちの３クローン（ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＧ８、ＸＳＧ１６およびＸＳＧ２２に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１２６】
（５）５回目染色体歩行
（材料および方法）
既述のＩＲ２４ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。
【０１２７】
本発明者らは、ＴＩＧＲ（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の公開ホームページを閲覧し、ＲＦＬＰマーカーＳ１２５６４を包含するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）が公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されていることを見出した。このＢＡＣクローンは、ジャポニカ品種日本晴のゲノムＤＮＡを含むものであり、塩基配列を比較したところ、（１）−（４）で作成したあそみのりおよびＩＲ２４のコンティグ領域を完全に包含することが示された（図２）。
【０１２８】
そこで、このＢＡＣクローンの一部を増幅する次のプライマー対：
を設計し、ＩＲ２４全ＤＮＡをテンプレートに用いて、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約６００ｂｐの増幅産物を、既述の方法で精製・ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブＨ、図１）とした。
【０１２９】
ライブラリーのスクリーニングおよびファージＤＮＡの精製は、既述の方法で行った。
【０１３０】
（結果および考察）
ＩＲ２４ゲノミックライブラリースクリーニングにより１５個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（ＸＳＨ１８）は図１に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、ＸＳＨ１８に対応するＩＲ２４ゲノム塩基配列を決定した。
【０１３１】
参考例３ 高精度分離分析
（１）ＰＣＲマーカーＰ４４９７ ＭｂｏＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の１２３９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の１２６３１番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１３２】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基８５３−８７６に相当）
（配列番号２の塩基１２２４７−１２２７０に相当）
および
Ｐ４４９７ ＭｂｏＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基１５８３−１５６０に相当）
（配列番号２の塩基１２９７５−１２９５２に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約７３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３３】
（２）ＰＣＲマーカーＰ９４９３ ＢｓｌＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の６２２７番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の１７６２７番目の塩基はＣであることを見出した。
【０１３４】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基６１２９−６１５２に相当）
（配列番号２の塩基１７５２９−１７５５２に相当）
および
Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基６２５４−６２３１に相当）
（配列番号２の塩基１７６５４−１７６３１に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い１２６ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｌＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列（ＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓｌＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｌＩの認識配列をもち、ＢｓｌＩ処理により切断されるため、ＢｓｌＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３５】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法（Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ １９９８，Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ １９９８）を適用した。具体的には、前記Ｐ９４９３ ＢｓｌＩ Ｒプライマーの使用により、配列番号１の６２３６および配列番号２の１７６３６のａがｇに置換される。これにより、あそみのりＤＮＡ由来の断片は、配列番号２の１７６２６−１７６３６の部分の配列がＣＣｔｔｔｃｃｔｔＧＧとなり、ＢｓｌＩ処理により切断される。
【０１３６】
（３）ＰＣＲマーカーＰ２３９４５ ＭｂｏＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の２０６８０番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の３２０７９番目の塩基はＡであることを見出した。
【０１３７】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ２３９４５ ＭｂｏＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基２０５１９−２０５４４に相当）
（配列番号２の塩基３１９１８−３１９４３に相当）
および
Ｐ２３９４５ ＭｂｏＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基２０７７８−２０７５５に相当）
（配列番号２の塩基３２１７７−３２１５４に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２６０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｂｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列（ＧＡＴＣ）をもち、ＭｂｏＩ処理により切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＭｂｏＩの認識配列をもたず、ＭｂｏＩ処理により切断されないため、ＭｂｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１３８】
（４）ＰＣＲマーカーＰ４１０３０ ＴａｑＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の４５４６１番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の４９１６４番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１３９】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４１０３０ ＴａｑＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基４５３６９−４５３９２に相当）
（配列番号２の塩基４９０７２−４９０９５に相当）
および
Ｐ４１０３０ ＴａｑＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基４５６４８−４５６２５に相当）
（配列番号２の塩基４９３５１−４９３２８に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い２８０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＴａｑＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）をもたず、ＴａｑＩ処理により切断されないのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＴａｑＩの認識配列をもち、ＴａｑＩ処理により切断されるため、ＴａｑＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４０】
（５）ＰＣＲマーカーＰ４５１７７ ＢｓｔＵＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）とあそみのりコンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号２）とを比較した結果、配列番号１の４９６０９番目の塩基がＡであるのに対し、当該位置に対応する配列番号２の５３３１１番目の塩基はＧであることを見出した。
【０１４１】
この差異の検出には、先ず次のプライマー対：
Ｐ４５１７７ ＢｓｔＵＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基４９３５５−４９３７８に相当）
（配列番号２の塩基５３０５７−５３０８０に相当）
および
Ｐ４５１７７ ＢｓｔＵＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５０１６６−５０１４３に相当）
（配列番号２の塩基５３８６８−５３８４５に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い８１２ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓｔＵＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列（ＣＧＣＧ）を２個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により３個の断片に切断されるのに対し、あそみのりＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＵＩの認識配列を３個所もち、ＢｓｔＵＩ処理により４個の断片に切断されるため、ＢｓｔＵＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４２】
（６）ＰＣＲマーカーＢ６０３０４ ＭｓｐＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の５６３６８番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１４３】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基５６１４９−５６１７２に相当）
および
Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５６４７９−５６４５５に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約３３０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＭｓｐＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列（ＣＣＧＧ）をもたず、ＭｓｐＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｐＩの認識配列をもち、ＭｓｐＩ処理により切断されるため、ＭｓｐＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４４】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。具体的には、Ｂ６０３０４ ＭｓｐＩ Ｒプライマーの使用により、配列番号１の５６４６３のｇがｔに置換される。これにより、配列番号１の５６４６０−５６４６３のＭｓｐＩの認識配列ＣＣＧＧがｃｃｇｔとなり、ＭｓｐＩによって切断されなくなる。よって、ＩＲ２４由来の断片はＭｓｐＩの認識配列を一つも有さず、一方、日本晴由来のＤＮＡは、配列番号１の５６３６７−５６３７０に対応する領域に１箇所ＭｓｐＩの認識配列を有することとなる。
【０１４５】
（７）ＰＣＲマーカーＢ５９０６６ ＢｓａＪＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の５７６２９番目の塩基がＣであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣＣであることを見出した。
【０１４６】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５９０６６ ＢｓａＪＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基５７５６３−５７５８６に相当）
および
Ｂ５９０６６ ＢｓａＪＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基５７９８３−５７９６０に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約４２０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＢｓａＪＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列（ＣＣＮＮＧＧ）をもたず、ＢｓａＪＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓａＪＩの認識配列をもち、ＢｓａＪＩ処理により切断されるため、ＢｓａＪＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４７】
（８）ＰＣＲマーカーＢ５６６９１ ＸｂａＩの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の６６２６７番目の塩基がＧであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１４８】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５６６９１ ＸｂａＩ Ｆ：
（配列番号１の塩基６６１２９−６６１５２に相当）
および
Ｂ５６６９１ ＸｂａＩ Ｒ：
（配列番号１の塩基６６７９９−６６７７６に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６７０ｂｐの断片を増幅する。増幅産物をＸｂａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）をもたず、ＸｂａＩ処理により切断されないのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＸｂａＩの認識配列をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるため、ＸｂａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１４９】
（９）ＰＣＲマーカーＢ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉの開発
参考例２で明らかにしたＩＲ２４コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号１）と既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列とを比較した結果、配列番号１の６９３３１番目の塩基がＴであるのに対し、当該位置に対応するＡＣ０６８９２３の塩基はＣであることを見出した。
【０１５０】
この差異の検出は、先ず次のプライマー対：
Ｂ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉ Ｆ：
（配列番号１の塩基６８９６５−６８９８８に相当）
および
Ｂ５３６２７ ＢｓｔＺ１７Ｉ Ｒ：
（配列番号１の塩基６９５８２−６９５５９に相当）
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い約６２０ｂｐの断片を増幅する。
増幅産物をＢｓｔＺ１７Ｉ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＩＲ２４ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列（ＧＴＡＴＡＣ）をもち、ＸｂａＩ処理により切断されるのに対し、日本晴ＤＮＡからの増幅産物はＢｓｔＺ１７Ｉの認識配列をもたず、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理により切断されないため、ＢｓｔＺ１７Ｉ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５１】
（１０）ＰＣＲマーカーＢ４０９３６ ＭｓｅＩの開発
以下の（１０）−（１２）のＰＣＲマーカーの開発はいずれも、配列番号１の３’末端７６３６３よりもさらに下流（３’末端）側に相当する塩基配列についての研究に関する。
【０１５２】
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１座の遺伝子型はＲｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５３】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ４０９３６ ＭｓｅＩ Ｆ：
および
Ｂ４０９３６ ＭｓｅＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｓｅＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列（ＴＴＡＡ）をもち、ＭｓｅＩ処理により切断されるのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｓｅＩの認識配列をもたず、ＭｓｅＩ処理により切断されないため、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５４】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
【０１５５】
（１１）ＰＣＲマーカーＢ１９８３９ ＭｗｏＩの開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１２００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５６】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ１９８３９ ＭｗｏＩ Ｆ：
および
Ｂ１９８３９ ＭｗｏＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＭｗｏＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列（ＧＣＮＮＮＮＮＮＮＧＣ）をもたず、ＭｗｏＩ処理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＭｗｏＩの認識配列をもち、ＭｗｏＩ処理により切断されるため、ＭｗｏＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
【０１５７】
なお、本マーカーの開発には、ｄＣＡＰＳ法を適用した。
【０１５８】
（１２）ＰＣＲマーカーＢ２３８７ ＢｆａＩの開発
既述のＢＡＣクローン（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）の塩基配列に対して、次のプライマー対：
および
を設計した。このプライマー対を用いて、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）およびコシヒカリの全ＤＮＡをテンプレートに、定法に従いＰＣＲを行った。得られた約１３００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲルでの電気泳動後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＡＢＩ社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。
【０１５９】
そのひとつは、次のプライマー対：
Ｂ２３８７ ＢｆａＩ Ｆ：
および
Ｂ２３８７ ＢｆａＩ Ｒ：
を用いて当該部位周辺のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をＢｆａＩ処理後、アガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、ＭＳ−ＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１ Ｒｆ−１）ＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列（ＣＴＡＧ）をもたず、ＢｆａＩ列理により切断されないのに対し、コシヒカリＤＮＡからの増幅産物はＢｆａＩの認識配列をもち、ＢｆａＩ処理により切断されるため、ＢｆａＩ処理後のＤＮＡ鎖長が異なり、アガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。
（１３）分離分析
参考例１で得られた、Ｒｆ−１座とＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座との間での組換え個体２個体（ＲＳ１およびＲＳ２）およびＲｆ−１座とＣ１３６１ ＭｗｏＩ座との間での組換え個体８個体（ＲＣ１からＲＣ８）について、上記（１）ないし（１２）で開発した１２個のＤＮＡマーカー座の遺伝子型を調査した。結果を、各個体のＳ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型とともに表１に示した。
【０１６０】
【表１】
表１は、いずれの個体もＰ９４９３ ＢｓｌＩないし５９０６６ ＢｓａＪＩの間については、インディカ型品種由来のＲｆ−１染色体領域を有することを示す。この結果から、図３で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、Ｒｆ−１遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディカ型領域、すなわち、最大限に見積もってもＰ４４９７ ＭｂｏＩ座からＢ５６６９１ ＸｂａＩ座までの領域（約６５ｋｂ）に、Ｒｆ−１遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。
【０１６１】
参考例４ ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片に関する相補性試験
（１）
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６（図１および５）をＮｏｔＩで部分消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１５．７ｋｂの断片（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３を含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１６２】
一方、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン体制遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー部位を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
【０１６３】
上記プラスミドベクターｐＳＢ２００をＮｏｔＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【０１６４】
上記により準備した、ＸＳＧ１６由来の１５．７ｋｂ断片とベクター断片の二つの断片を供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振盪培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーからプラスミドを単離した。その制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、組換えプラスミドにより形質転換された所望の大腸菌を選抜した。
【０１６５】
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１６６】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１６７】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、４８個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。
【０１６８】
（結果および考察）
形質転換植物４７個体のうち、少なくとも３７個体は、明らかに稔性を回復していた（図６）。このことから、導入した１５．７ｋｂ断片のなかのイネ（ＩＲ２４）に由来する部分である１５５８６塩基（配列番号１の塩基３８５３８−５４１２３）が、完全長のＲｆ−１遺伝子を包含していると考えられた。
【０１６９】
（２）ＸＳＧ１６内部の１１．４ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＡｌｗＮＩおよびＢｓｉＷＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１１．４ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１７０】
プラスミドベクターｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６）をＳｍａＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【０１７１】
上記により準備したふたつの断片を供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１４個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１７２】
上記により選抜した大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ４Ｕ（高倉ら、特願２００１−２６９９８２（ＷＯ０２／０１９８０３ Ａ１））およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇ）を行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１７３】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１７４】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、１２０個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植約１か月後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、各個体から標準的な穂を１穂サンプリングし、種子稔性（総もみ数に対する稔実もみの割合）を調査した。
【０１７５】
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、５９個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち１９個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した１１．４ｋｂ断片（配列番号１の４２３５７番目の塩基から５３７４３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
【０１７６】
（３）ＸＳＧ１６内部の６．８ｋｂ断片に関する相補性試験
（材料および方法）
λファージクローンＸＳＧ１６をＨｐａＩおよびＡｌｗＮＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された６．８ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。プラスミドベクターｐＳＢ１１の調整を含め、以後の過程は上記（２）に記載の方法に準拠した。
【０１７７】
（結果および考察）
形質転換植物１２０個体のうち、６７個体が１０％以上の種子稔性を示し、そのうち２６個体は７０％以上の種子稔性を示した。このことから、導入した６．８ｋｂ断片（配列番号１の４２１３２番目の塩基から４８８８３番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須のＲｆ−１遺伝子領域を包含していると考えられた。
【０１７８】
図１及び図５に示したあそみのり由来の他の断片、即ち、ＸＳＥ１，ＸＳＥ７、ＸＳＦ４、ＸＳＦ４、ＸＳＦ１８、ＸＳＦ２０、ＸＳＧ２２、ＸＳＧ８、ＸＳＨ１８及びＸＳＸ１についても同様に相補性実験を行ったが、いずれも稔性回復機能を有しなかった。
【０１７９】
参考例５ ｃＤＮＡライブラリーの作成
先ず、戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１を導入した系統ＩＬ２１６（遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１）を作成した。前記ＩＬ２１６を慣行法で温室栽培し、葉耳間長が−５〜５ｃｍの生育段階で幼穂をサンプリングした。ＳＤＳ−フェノール法（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ．ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ａ．（１９８２）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｆｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｓｐｉｎａｃｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．，７９，６３０４−６３０８）で全ＲＮＡを抽出した後、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
【０１８０】
次いで、精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを供試して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したライブラリー（１ｍｌ）のタイターは１６００００００ｐｆｕ／ｍｌと算出され、十分な大きさであると判断された。
【０１８１】
参考例６ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）スクリーニング用プライマーの作成
以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号５０及び５１は各々、配列番号１の塩基４３７３３−４３７５６及び４４０３８−４４０１５に相当する。
【０１８２】
電気泳動後、約３００ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＰ」と呼称する）。
【０１８３】
また、以下の２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号５２及び５３は各々、配列番号１の塩基４８３０６−４８３２９及び５０２２６−５０２０３に相当する。電気泳動後、約１９００ｂｐの増幅産物を上述の方法によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で３２Ｐ−ラベルした（以下、「プローブＱ」と呼称する）。
【０１８４】
（２）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
参考例５で作成したｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を７０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンをプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＱとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。
【０１８５】
ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液にプローブを添加し、６５℃で１６時間行った。洗浄は、１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液により６５℃、１５分で２回行った。洗浄後のメンブレンをＦＵＪＩＸ ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍｓ）で解析した。
【０１８６】
その結果、プローブＰおよびプローブＱのどちらでも陽性を示すプラークが８個見出された。そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。８個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致した。それら６クローンの全塩基配列を決定し、結果を、配列表の配列番号４３−７４に示した。
【０１８７】
配列番号４３−７４のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号４３の塩基２１５−２５８７、配列番号４４の塩基２１３−２５８５、配列番号４５の塩基２１８−２５９０、配列番号４６の塩基２０８−２５８０、配列番号４７の塩基１４９−２５２１及び配列番号４８の塩基２２５−２５９７が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【０１８８】
配列番号４９のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（Ｒｆ２）の推定アミノ酸配列（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と比較したところ、Ｎ末端の７アミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が一致した。これら７アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらのことから、今回単離したｃＤＮＡはＲｆ−１遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネＲｆ−１とトウモロコシＲｆ２とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。遺伝子産物がミトコンドリアに移行してからの稔性回復機構は、両者で異なるものと推測される。
【０１８９】
また、今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図７）。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリＡ付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。
【０１９０】
参考例７ 相補性試験
参考例４（３）において、稔性回復能を持つことが証明されたＩＲ２４由来の６．８ｋｂゲノム断片を含むプラスミド中の、Ｒｆ−１遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を用いて、相補性実験を行った。
【０１９１】
先ず、上記参考例４（３）のプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片（配列番号１の塩基４２１３２−４６３１８に相当する）を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）とともに供試して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
【０１９２】
回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。つぎに、選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
【０１９３】
一方、ＴｎｏｓＪＨ００７２（ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行った。ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットとを包含する３．０ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。
【０１９４】
Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片及びＴｎｏｓＪＨ００７２由来の断片を、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。アンピシリンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１９５】
さらに、上述のとおり選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、ＳｇｆＩで処理後、アガロースゲルによる電気泳動を行い、Ｒｆ−１のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する４．２ｋｂ断片を分離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから回収した。この４．２ｋｂ断片を、ＰａｃＩ処理後ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ）処理したｐＳＢ２００Ｐａｃ（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）とともに供試して、前述の方法でライゲーション反応およびポレーションを行った。スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、加温（３７℃、１６時間）後、生じたコロニーのなかの１６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【０１９６】
以上の工程により、Ｒｆ−１のプロモーター領域とＲｆ−１の予想翻訳領域を含む断片にｎｏｓターミネーターが接続されたキメラ遺伝子が、中間ベクター内に挿入された大腸菌が得られた。この大腸菌を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢ４４０４／ｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ，１９８０）とともに供試して、Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８０）の方法に従いｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ ｍａｔｉｎｇを行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１９７】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）の方法に準拠し、ＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要なＭＳコシヒカリの未熟種子は、ＭＳコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。
【０１９８】
形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、３２個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（４個体／ポット）、移植３〜４週間後に短日条件の温室に移した。出穂約１か月後に、種子稔性を立毛調査した。その結果、３２個体のうち２８個体は、稔性を回復していることがわかった。
【０１９９】
以上の結果から、予想翻訳領域を発現させることによりＲｆ−１遺伝子の機能を付与できることが、実験的に証明された。
【０２００】
参考例８ ｃＤＮＡ単離
参考例６では、プローブＰおよびプローブＱによりＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、どちらのプローブでも陽性を示すプラークを単離・解析することにより、６個のｃＤＮＡを単離した。本参考例では、プローブＰおよび下記のプローブＲにより同様のスクリーニングを行うことにより、さらに６個のｃＤＮＡを単離した。詳細は、以下のとおりである。
まず、２種類のプライマー、
センスプライマー
アンチセンスプライマー
を用いて、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。配列番号６０および６１は各々、配列番号１の塩基４５５２２−４５５４５及び４５９５５−４５９３２に相当する。
【０２０１】
電気泳動後、約４３０ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした（プローブＲ、図８）。
【０２０２】
ＩＲ２４幼穂由来ｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を２０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。一方のメンブレンを参考例６のプローブＰとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＲとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。その結果、プローブＰおよびプローブＲのどちらでも陽性を示すプラークが１２個見出された。
【０２０３】
そこで、それらプラークを単離し、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手引書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。１２個のクローンのうち、６個のクローンの末端塩基配列がＸＳＧ１６の配列と一致したため、それら６クローンの全塩基配列を決定した（＃７−＃１２）。その結果を配列番号５４−８５に示す。
【０２０４】
配列番号５４−８５のいずれの配列も、配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号５４の塩基２２９−２６０１、配列番号５５の塩基１７５−２５４７、配列番号５６の塩基２２７−２５９９、配列番号５７の塩基２２０−２５９２、配列番号５８の塩基１７４−２５４６及び配列番号５９の塩基９０−２４６２が、いずれも配列番号４９のアミノ酸配列１−７９１をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号１の塩基４３９０７−４６２７９に対応する。
【０２０５】
今回単離したｃＤＮＡの配列をＩＲ２４のゲノム配列（配列番号１）と比較することにより、エキソンとイントロンの構造が明らかになった（図８）。今回単離したｃＤＮＡのなかには、予想翻訳領域とは関係のないエキソンを含まず、単一エキソンからなるものも３個存在した（＃１０−＃１２、配列番号５７−５９）。
【０２０６】
実施例１ 単一コピー導入形質転換体の選抜
（材料および方法）
本発明者らは、参考例４（１）において、ＩＲ２４のゲノミッククローンＸＳＧ１６に由来する１５．６ｋｂ断片をＭＳコシヒカリ（ＢＴ細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）に導入することにより、形質転換当代（Ｔ０世代）で種子稔性が回復することを見出した。
【０２０７】
稔性が回復した形質転換植物（Ｔ０世代）のなかから１２個体を選び、緑葉からＳＤＳ−フェノール法（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）により全ＤＮＡを抽出した。全ＤＮＡをＳａｃＩで消化し、アガロース電気泳動にかけた後、製造者の手引書に従いＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写し、サザン解析に供試した。
【０２０８】
サザン解析のためのプローブは、以下のようにして作成した。まず、２種類のプライマー、
（配列番号１の塩基４９２４４−４９２６７に相当）
および
（配列番号１の塩基５０２２６−５０２０３に相当）
を用いて、上述のゲノミッククローンＸＳＧ１６をテンプレートにＰＣＲを行った。電気泳動後、約９８０ｂｐの増幅産物をＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３２Ｐ−ラベルした。
【０２０９】
ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液にプローブを添加し、６５℃で１６時間行った。洗浄は、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液により６５℃・１５分で２回行った後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液により６５℃・１５分で２回行った。洗浄後のメンブレンをＦＵＪＩＸ ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍｓ）で解析した。その他の実験手法は、実験手引書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１、上述）を参考にして行った。
【０２１０】
ＳａｃＩ消化の結果から、単一コピーであることが示された個体の一部については、ＥｃｏＲＶ消化後、上述と同様にサザン解析を行った。
【０２１１】
（結果および考察）
１２個体についてのＳａｃＩ消化サザン解析の結果、内生のｒｆ−１遺伝子に対応する約１２ｋｂのバンドに加え、種々のサイズのバンドが観察された。各個体のバンドの数は、その個体の導入コピー数を反映していると考えられるので、約１２ｋｂのバンド以外のバンドが１本だけ観察された７個体を、単一コピー導入個体候補とした。
【０２１２】
それら単一コピー導入個体候補のなかから６個体を選抜し、ＥｃｏＲＶ消化サザン解析を行った。その結果、いずれの個体についても、内生のＲｆ−１遺伝子に対応する約１５ｋｂのバンドに加え、１本のバンドが観察された。以上の結果から、これら６個体は単一コピー導入個体であることが示された。
【０２１３】
実施例２ 導入遺伝子ホモ型個体の選抜
（材料および方法）
実施例１で単一コピー導入個体であることが示された６個体のなかの４個体（１６Ｔ０−６、１６Ｔ０−２６、１６Ｔ０−３４、１６Ｔ０−３５）の自殖次代を６個体ずつ栽培し、実施例１に記載した方法で全ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＶ消化サザン解析を行った。
【０２１４】
（結果および考察）
内生のｒｆ−１遺伝子に対応する約１５ｋｂのバンドと導入遺伝子に対応するバンドの強度を、各系統内で比較することにより、各系統から導入遺伝子ホモ型個体を１個体ずつ選抜した（１６Ｔ１−６、１６Ｔ１−２６、１６Ｔ１−３４、１６Ｔ１−３５）。これら４個体の花粉稔性をヨウ素ヨウ化カリウム染色で調査したところ、いずれも１００％に近いことがわかり、サザン解析の結果から推定した導入遺伝子座の遺伝子型が正しいことが示された。
【０２１５】
実施例３ 導入遺伝子の染色体部位の同定
（１）１６Ｔ０−６における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−６のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて製造者の手引書に従って導入部位の増幅を行った。１回目のＰＣＲには、特異的プライマーとして
Ｎｏｓ Ｆ１：
を用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で１分間の熱変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。
【０２１６】
２回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲ反応溶液の２００倍希釈液１μｌをテンプレートにし、特異的プライマーとして
Ｎｏｓ Ｆ２：
を用いた。ＰＣＲ条件は、１回目と同様とした。２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅された断片を、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収し、塩基配列を解析した。
【０２１７】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約５００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を行った。その結果、日本晴の第６染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＰ００４００７）の相補鎖配列と一致することがわかった。
【０２１８】
そこで、ＡＰ００４００７の相補鎖配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ６ Ｆ：
および
Ｎｏ６ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−６（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２１０ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−６からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２１９】
さらに、ＮｏｓＦ２とＮｏ６Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−６の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−６からは期待された大きさ（２３４ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２０】
以上の結果から、１６Ｔ０−６における導入遺伝子挿入部位は、第６染色体のＡＰ００４００７に対応する部位であることが示された。
【０２２１】
（２）１６Ｔ０−２６における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−２６のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。ただし、ＰＣＲのバッファーには、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）添付のＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉ）を用いた。
【０２２２】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、日本晴の第１０染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＣ０２６７５８）の配列と一致することがわかった。
【０２２３】
そこで、ＡＣ０２６７５８の配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ２６ Ｆ：
および
Ｎｏ２６ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−２６（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２４６ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−２６からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２４】
さらに、Ｎｏｓ Ｆ２とＮｏ２６ Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−２６の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−２６からは期待された大きさ（３５２ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２２５】
以上の結果から、１６Ｔ０−２６における導入遺伝子挿入部位は、第１０染色体のＡＣ０２６７５８に対応する部位であることが示された。
【０２２６】
（３）１６Ｔ０−３４における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−３４のＤＮＡをＢａｍＨＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、２００２年９月９日時点では、当該配列を持つクローンは見出されなかった。
【０２２７】
（４）１６Ｔ０−３５における導入部位の同定
（材料および方法）
実施例１で用いた１６Ｔ０−３５のＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化した後、上記（１）に記載した方法で導入部位を増幅し、塩基配列を解析した。
【０２２８】
（結果および考察）
２回目のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、約５００ｂｐの断片を回収した。回収した断片の末端塩基配列を明らかにし、Ｇｅｎｂａｎｋ公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）を行った。その結果、日本晴の第７染色体のゲノムクローン（アクセッション番号ＡＰ００４００９）の配列と一致することがわかった。
【０２２９】
そこで、ＡＰ００４００９の配列に対して図９に示す位置に、
Ｎｏ３５ Ｆ：
および
Ｎｏ３５ Ｒ：
の２個のプライマーを設計した。これらプライマーを用いて、コシヒカリおよび実施例２に記載した１６Ｔ１−３５（導入遺伝子ホモ型個体）の全ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけたところ、コシヒカリＤＮＡからは期待された大きさ（２３５ｂｐ）の断片が増幅されたことが示された。一方、１６Ｔ１−３５からは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２３０】
さらに、Ｎｏｓ Ｆ２とＮｏ３５ Ｒとのプライマー組み合わせで、コシヒカリおよび１６Ｔ１−３５の全ＤＮＡをテンプレートとして、上記条件でＰＣＲを行った。その結果、１６Ｔ１−３５からは期待された大きさ（１７７ｂｐ）の断片が増幅された。一方、コシヒカリからは、期待通り当該産物は増幅されなかった。
【０２３１】
以上の結果から、１６Ｔ０−３５における導入遺伝子挿入部位は、第７染色体のＡＰ００４００９に対応する部位であることが示された。
【０２３２】
実施例４ Ｒｆ−１集積系統のヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性調査
（材料および方法）
下記の植物材料を供試した。
【０２３３】
１）ＭＳコシヒカリ
２）コシヒカリ
３）ＦＲコシヒカリ（連続戻し交雑によりコシヒカリにＲｆ−１遺伝子を導入した系統）
４）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリ
５）１６Ｔ１−６、１６Ｔ１−２６、１６Ｔ１−３４、１６Ｔ１−３５の自殖次代（１６Ｔ２−６、１６Ｔ２−２６、１６Ｔ２−３４、１６Ｔ２−３５）
６）ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
７）ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
８）３座Ｒｆ−１ヘテロ個体
９）４座Ｒｆ−１ヘテロ個体
８）及び９）の３座Ｒｆ−１ヘテロ個体および４座Ｒｆ−１ヘテロ個体は、以下のように作出した。３座Ｒｆ−１ヘテロ個体を作出するために、（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物３９個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座遺伝子型、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座遺伝子型（第６染色体）、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座遺伝子型（第７染色体）を、下記のとおりＤＮＡマーカーにより推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３４ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、１７７ｂｐの断片が増幅された場合に、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの３個体が、Ｒｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。
【０２３４】
また、４座Ｒｆ−１ヘテロ個体を作出するために、（１６Ｔ１−３４×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物６２個体について、Ｒｆ−１座遺伝子型、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座遺伝子型、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座遺伝子型、および、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座遺伝子型を推定した。１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２および
Ｎｏ３４ Ｒ：
を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２４５ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの５個体が、Ｒｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座、および、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座すべてについてヘテロであると推定された。
【０２３５】
１）ないし９）の各品種・系統の２個体から、出穂後の未開花穎花を１個体あたり４穎花サンプリングした。各穎花から葯を取り出し、ヨウ素ヨウ化カリウム液中で軽く粉砕した後に顕微鏡観察した。ヨウ素デンプン反応により濃青色を呈する花粉を稔実花粉、それ以外の花粉を不稔花粉とみなした。各穎花について、２００花粉以上を調査した。
【０２３６】
（結果および考察）
穎花ごとの花粉稔性を算出し、各品種・系統について８穎花の花粉稔性の平均値および標準偏差を求めた結果を表２に示す。
【０２３７】
【表２】
１）ＭＳコシヒカリ、２）コシヒカリ、３）ＦＲコシヒカリ、および、４）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの理論的花粉稔性は、それぞれ、０％、１００％、１００％、および、５０％であるが、それらの理論値に近い花粉稔性が実際に観察された。
【０２３８】
５）の１６Ｔ２−６、１６Ｔ２−２６、１６Ｔ２−３４、および、１６Ｔ２−３５は、ＦＲコシヒカリと同程度の花粉稔性を示し、また、６）のＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−２６、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３４、および、ＭＳコシヒカリ×１６Ｔ１−３５はＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリと同程度の花粉稔性を示した。これらのことから、遺伝子工学的に導入した各Ｒｆ−１遺伝子が、内生Ｒｆ−１遺伝子と同様に機能していることが示唆された。
【０２３９】
７）のＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６およびＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５の花粉稔性は、それぞれ、７４％および７６％であった。ＦＲコシヒカリが持つ内生Ｒｆ−１遺伝子は第１０染色体に座乗するのに対し、１６Ｔ１−６および１６Ｔ１−３５が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子は、実施例３に記載したとおり、それぞれ、第６および第７染色体に座乗する。このため、上記Ｆ１では、内生Ｒｆ−１および導入Ｒｆ−１をともに持つ花粉、内生Ｒｆ−１のみを持つ花粉、導入Ｒｆ−１のみを持つ花粉、ならびに、いずれのＲｆ−１も持たない花粉が、１：１：１：１の比で分離すると考えられる。これらＦ１の花粉稔性が概ね７５％であったことから、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は、稔性を持つと推察された。
【０２４０】
ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３４の花粉稔性は７０％であり、内生Ｒｆ−１および導入Ｒｆ−１が独立である場合の期待値７５％に近かった。１６Ｔ１−３４が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子の位置は同定されていないが、本結果から、少なくとも第１０染色体の内生Ｒｆ−１座と強い連鎖関係にない座位であることが示された。
【０２４１】
ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６の花粉稔性は９２％であった。１６Ｔ１−２６が持つ導入Ｒｆ−１遺伝子は、実施例３に記載したとおり、第１０染色体のＡＣ０２６７５８の内部に位置し、ＡＣ０２６７５８はＲＦＬＰマーカー座Ｃ７９７に対応する。一方、ＦＲコシヒカリが持つ内生Ｒｆ−１遺伝子は、第１０染色体のＲＦＬＰマーカー座Ｓ１２５６４と密接連鎖している（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＲＦＬＰ連鎖地図（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）によると、Ｃ７９７とＳ１２５６４との間の地図距離は約２０ｃＭである。両マーカー間の組換え価が約２０％である場合、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−２６の理論的花粉稔性は約９０％と計算される。観察された花粉稔性は、この理論値に近いものであった。
【０２４２】
８）の３座Ｒｆ−１ヘテロ個体は、Ｒｆ−１を第６、第７および第１０染色体に持つため、各Ｒｆ−１は独立に遺伝する。したがって、これらの個体では、Ｒｆ−１を３個、２個、１個および０個持つ花粉が、１：３：３：１の比で分離すると期待される。これらの個体の花粉稔性が概ね８７．５％であったことから、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は稔性を持つことが示され、Ｒｆ−１を３個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。
【０２４３】
また、９）の４座Ｒｆ−１ヘテロ個体については、１６Ｔ１−３４の導入遺伝子座が同定されていないため、各Ｒｆ−１が独立に遺伝するか否かは不明である。しかし、各Ｒｆ−１が独立に遺伝し、かつ、Ｒｆ−１を１個以上持つ花粉は稔性を持つ、と仮定したときの理論上の花粉稔性９３．７５％に極めて近い値が観察された。このことから、Ｒｆ−１を４個持つ花粉も正常に発育するものと推察された。
【０２４４】
実施例５ Ｒｆ−１集積系統の花粉発芽試験
（材料および方法）
下記の植物材料を供試した。
【０２４５】
１）コシヒカリ
２）ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリ
３）ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５
各品種・系統の２個体から、開花中の穎花を１個体あたり４穎花選び、葯をピンセットでつまみ取り、花粉発芽培地上に直接置床した。花粉発芽培地には、既報（Ｋａｒｉｙａ，１９８９）に従い、１％ Ａｇａｒ、２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、２０ｐｐｍ Ｈ３ＢＯ３からなる寒天培地を用いた。２０分以上経過した後、顕微鏡観察し、花粉管の伸長が認められた花粉を稔性花粉とみなした。各穎花について、２００花粉以上を調査した。
【０２４６】
（結果および考察）
穎花ごとの発芽率を算出し、各品種・系統について８穎花の発芽率の平均値および標準偏差を求めた結果を表３に示す。
【０２４７】
【表３】
コシヒカリおよびＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの発芽率は、それぞれ、９３％および３９％であった。ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６およびＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５の発芽率は、それぞれ、５８％および６６％であり、コシヒカリの発芽率ほど高くはないものの、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリの発芽率よりは有意に高かった。
【０２４８】
ヨウ素ヨウ化カリウム染色による花粉稔性調査の結果と考えあわせると、複数座でＲｆ−１ヘテロの系統は、通常のハイブリッド（単一座でＲｆ−１ヘテロ）と比較して、デンプンを蓄積する花粉の割合、即ち、正常に発育する花粉の割合が増加し、その結果、実際に発芽する花粉の割合も増加するものと考えられる。
【０２４９】
実施例６ ２座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統及び３座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統の作成
２座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６の交雑Ｆ２の２４個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座および１６Ｔ１−６の導入遺伝子座（第６染色体）における遺伝子型を推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏ６ ＦおよびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２１０ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの１個体が、Ｒｆ−１座および１６Ｔ１−６の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。
３座Ｒｆ−１ホモ稔性回復系統は、以下のようにして作成した。実施例４に記載した通り、（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−６）×（ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５）の交配で得られた植物３９個体からＤＮＡを調整し、各個体のＲｆ−１座、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座（第６染色体）、および、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座（第７染色体）を、下記のとおりＤＮＡマーカーにより推定した。Ｒｆ−１座については、Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２に従い、Ｓ１２５６４ Ｔｓｐ５０９Ｉ座およびＣ１３６１ ＭｗｏＩ座の遺伝子型から推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３４ｂｐの断片が増幅された場合に、同座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。同様に、実施例３に記載したＮｏｓ Ｆ２およびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、１７７ｂｐの断片が増幅された場合に、１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の遺伝子型がヘテロであるとみなした。マーカー検定の結果、本交配で得られた集団のなかの１個体が、Ｒｆ−１座でＲｆ−１ホモ、かつ、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の両座においてヘテロであると推定された。
【０２５０】
そこで、その個体の自殖次代２４個体からＤＮＡを調整し、各個体の１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座における遺伝子型を推定した。１６Ｔ１−６の導入遺伝子座については、上述の通り、Ｎｏ６ ＦおよびＮｏ６ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２１０ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座については、実施例３に記載したＮｏ３５ ＦおよびＮｏ３５ Ｒを用いたＰＣＲを行い、２３５ｂｐの断片が増幅されない場合に、同座の遺伝子型が導入遺伝子ホモであるとみなした。マーカー検定の結果、調査したなかなかの２個体が、１６Ｔ１−６の導入遺伝子座および１６Ｔ１−３５の導入遺伝子座の両座において、稔性回復遺伝子ホモであると推定された。これらの個体は、Ｒｆ−１座でＲｆ−１ホモであるので、合計３座でＲｆ−１ホモである。
【０２５１】
実施例７ 耐冷性検定
（材料および方法）
コシヒカリ、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１、及び、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５（実施例４に記載）のＦ１を供試した。慣行法により移植期まで育成させた後、各品種・系統につき４個体を、１／５０００アールのワグネルポットに移植した（１個体、１ポット）。移植後は、明条件（２４℃）１２時間、暗条件（１９℃）１２時間に設定した人工気象器内で栽培した。登熟後に各個体から１０穂をサンプリングし、各穂について種子稔性（全穎果中の稔実穎果の割合）を求め、１０穂の種子稔性の平均をその個体の種子稔性とした。
【０２５２】
（結果および考察）
４個体の平均種子稔性は、コシヒカリで約９５％であったのに対し、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１では約５７％であった。コシヒカリと比較してＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１の種子稔性が低かったことから、今回用いた低温条件により、耐冷性の品種・系統間比較が可能であると考えられた。また、ＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１の４個体の平均種子稔性は約７６％であり、コシヒカリほど高くはないものの、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１よりは高かった。母比率の差の検定を行ったところ、ＭＳコシヒカリ×ＦＲコシヒカリのＦ１（５８０８穎果のなかの３２７６穎果が稔実）とＦＲコシヒカリ×１６Ｔ１−３５のＦ１（５９００穎果のなかの４５８７穎果が稔実）との間の種子稔性の差は、１％水準で有意であることが示された。本結果は、複数座でＲｆ−１遺伝子をヘテロで保有するハイブリッドは、従来のハイブリッドと比較して、低温条件においても高い種子稔性を維持することを意味する。以上のことから、複数座でＲｆ−１遺伝子をホモで保有する稔性回復系統を用いることにより、ハイブリッド品種の耐冷性を向上させることができると考えられる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２カ所又はそれより多くの遺伝子座に有するハイブリッド植物。
【請求項２】
２コピーないし４コピー稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２カ所ないし４カ所の遺伝子座に有する、請求項１に記載のハイブリッド植物。
【請求項３】
複数の稔性回復遺伝子が異なる染色体上に座乗する、請求項１又は２に記載のハイブリッド植物。
【請求項４】
稔性回復遺伝子が配偶体型稔性回復遺伝子である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のハイブリッド植物。
【請求項５】
ハイブリッド植物がイネであり、稔性回復遺伝子がイネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のハイブリッド植物。
【請求項６】
イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子が、配列番号４９のアミノ酸配列、又は配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸である、請求項５に記載のハイブリッド植物。
【請求項７】
稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、請求項１ないし６に記載のハイブリッド植物の作成方法。
【請求項８】
１）稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、
２）工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配する
ことを含む、請求項７に記載の作成方法。
【請求項９】
２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物。
【請求項１０】
稔性回復遺伝子を１コピーのみ有する稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体よりも、低温条件下で高い種子稔性を有する、請求項１ないし６に記載のハイブリッド植物。
【請求項１】
２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２カ所又はそれより多くの遺伝子座に有するハイブリッド植物。
【請求項２】
２コピーないし４コピー稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２カ所ないし４カ所の遺伝子座に有する、請求項１に記載のハイブリッド植物。
【請求項３】
複数の稔性回復遺伝子が異なる染色体上に座乗する、請求項１又は２に記載のハイブリッド植物。
【請求項４】
稔性回復遺伝子が配偶体型稔性回復遺伝子である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のハイブリッド植物。
【請求項５】
ハイブリッド植物がイネであり、稔性回復遺伝子がイネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のハイブリッド植物。
【請求項６】
イネのＢＴ型雄性不稔性回復遺伝子が、配列番号４９のアミノ酸配列、又は配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸である、請求項５に記載のハイブリッド植物。
【請求項７】
稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入し、２コピーまたはそれより多くの稔性回復遺伝子を、完全連鎖関係にない２箇所又はそれより多くの遺伝子座に配置させることを含む、請求項１ないし６に記載のハイブリッド植物の作成方法。
【請求項８】
１）稔性回復遺伝子を遺伝子工学的に導入することによって、２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物を作成し、
２）工程１）で作成した稔性回復系統の植物と不稔系統と植物と交配する
ことを含む、請求項７に記載の作成方法。
【請求項９】
２座またはそれより多くの座で稔性回復遺伝子をホモで保有する稔性回復系統の植物。
【請求項１０】
稔性回復遺伝子を１コピーのみ有する稔性回復遺伝子１座ヘテロ個体よりも、低温条件下で高い種子稔性を有する、請求項１ないし６に記載のハイブリッド植物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５３７
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０７１９８（Ｐ２００５−５０７１９８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００８０２５
【国際出願日】平成１６年６月９日（２００４．６．９）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５０１００８８２０）シンジェンタ リミテッド (33)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００８０２５
【国際出願日】平成１６年６月９日（２００４．６．９）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５０１００８８２０）シンジェンタ リミテッド (33)
【Ｆターム（参考）】
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