粒子状医薬組成物
【課題】薬物運搬システムに好適な粒子状医薬組成物における薬物の封入安定性を向上させる。
【解決手段】疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に向けると共に親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた状態で放射状に配置されたブロックコポリマーユニット２と、薬物４と、薬物４の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質３とを含有し、当該荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置され、薬物３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に配置された、粒子状医薬組成物１とする。この医薬組成物１によれば、薬物４の粒子外への脱落が防止される。
【解決手段】疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に向けると共に親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた状態で放射状に配置されたブロックコポリマーユニット２と、薬物４と、薬物４の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質３とを含有し、当該荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置され、薬物３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に配置された、粒子状医薬組成物１とする。この医薬組成物１によれば、薬物４の粒子外への脱落が防止される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子状担体組成物に薬物が内包された、薬物運搬システム（ＤＤＳ）として利用し得る粒子状医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や核酸といった生体高分子を利用するバイオ医薬品は、低分子化合物を利用する従来型の医薬品に比べ、酵素で分解されたり免疫系によって排除されたりし易い。特許文献１〜３は、生体内におけるバイオ医薬品の安定性を高める観点から、脂質二重膜からなるリポソームに生体高分子を内包させたＤＤＳを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００１／０３４１１５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第１９９８／５８６３０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０９２３８９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１〜３に記載の従来型のＤＤＳでは、薬物としての生体高分子を脂質二重膜で保護することによって、生体内における薬物の安定性を向上できるものの、薬物が担体から放出されにくくなる。そして、こうした従来型のＤＤＳは、その粒子径の大きさや脂質二重膜を構成する脂質が有する電荷に起因して、肺、肝臓及び脾臓といった細網内皮系に捕捉され易いため、投薬対象物に到達する以前に血中から除去されてしまう場合がある。
【０００５】
疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットによって構成された高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、リポソームを使用した従来型のＤＤＳに比べてＤＤＳ粒子を大幅に小型化（例えば、平均粒径１００ｎｍ以下）できる。しかし、こうした高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、後述する比較例に示すように生体高分子をＤＤＳ粒子内に保持する作用が弱すぎることによって、やはり投薬対象物に薬物を適切に輸送し難くなる場合がある。また、こうしたＤＤＳでは、製造後のストック期間中に担体から薬物が脱離してしまう場合もある。
【０００６】
本発明者等は、帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止された高分子ミセルＤＤＳの開発を進めてきた（特願２００９−２００６８１）。かかるＤＤＳは、投薬対象物への薬物運搬の妨害に帰結し得る担体表面への生体分子の付着を防止できるものの、薬物をより長期的に保持させる観点からはさらに改善できる余地があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットと、薬物と、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質とを含有する粒子状医薬組成物であって、複数の前記ブロックコポリマーユニットが、前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置され、前記荷電脂質が、前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置され、前記薬物が、前記疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在することによって、当該薬物の粒子外への脱落が防止された、粒子状医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＤＤＳに適した医薬組成物における薬物の封入安定性を向上できる。かかる医薬組成物は、従来型のＤＤＳに比べてより確実に薬物を輸送できる。特に、到達に時間が掛かる投薬対象物への薬物送達に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）及び図１（ｂ）は、本発明の医薬組成物の代表的な構造を説明するための図である。
【図２】図２（ａ）及び図２（ｂ）は、凍結融解操作による粒子内の薬物分布の変化を説明するための図である。
【図３】図３は、医薬組成物の封入安定性評価の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、医薬組成物の血中滞留性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以降の説明では、本発明の把握を容易にするために、図１及び図２を参照する。しかし、図１及び図２は何れも模式図であり、本発明はいかなる意味においても、これらの図に限定されるものではない。図１及び図２では、荷電脂質がカチオン性脂質であり、薬物がアニオン性薬物である場合を示しているが、本発明はこの態様に限定されない。
【００１１】
図１（ａ）に、本発明の粒子状医薬組成物（以降、単に「医薬組成物」という場合がある）の代表的な構造を示す。医薬組成物１は、ブロックコポリマーユニット２と、荷電脂質３と、薬物４とを含有する。図１（ｂ）に、ブロックコポリマーユニット２を拡大して示す。ブロックコポリマーユニット２は、親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとを有し、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に向けると共に親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた状態で、医薬組成物１内に放射状に配置される。荷電脂質３は、薬物４の電荷とは反対の電荷を帯び、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置される。
【００１２】
本発明による医薬組成物１において、薬物は、図１（ａ）に示すように、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在している。なお、これは、医薬組成物１に内包される全ての薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に偏在した状態に限定する意図ではなく、一部の薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも外側に存在した状態を排除しない。本発明による医薬組成物１は、薬物４が当該位置に存在することによって、薬物４の脱落が防止された、換言すれば薬物４の封入安定性が向上した、状態にある。
【００１３】
医薬組成物１は、例えば、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも外側の領域に薬物が内包された状態にある医薬組成物前駆体に、凍結融解操作を施すことによって形成できる。なお、医薬組成物前駆体１’は、後述のように、公知の方法によって担体組成物に薬物を内包させることで容易に形成できる。図２（ａ）に、凍結融解操作前の医薬組成物前駆体１’における粒子内の薬物４分布を示し、図２（ｂ）に、凍結融解操作後の医薬組成物１における粒子内の薬物４分布を示す。図２（ａ）に示すように、医薬組成物前駆体１’においては、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも粒子外側に存在していた薬物４が、凍結融解操作を施すと、粒子内側に向かって移動し、図２（ｂ）に示すように、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在する医薬組成物１が得られることになる。このように、本発明の医薬組成物１は、医薬組成物前駆体１’において疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの外側に配置されている薬物４を、凍結融解を経ることで疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの内側に移動させることによって形成できる。こうした薬物移動が生じる理由は定かではないが、担体組成物を構成するブロックコポリマー２および荷電脂質３の配置が凍結融解操作によって乱され、これに付随して生じる隙間を介して粒子のより内部に薬物４が格納されるものと考えられる。凍結融解操作は、少なくとも１回行えばよいが、２回以上実施することが好ましい。凍結融解操作を繰り返すことで、薬物４の粒子内部への格納を促進できる。
【００１４】
凍結融解操作は、組成物を凍結する操作と、凍結した組成物を融解する操作とからなる。その条件は制限されるものではないが、例えば次のとおりである。凍結操作は、組成物を、−２００℃以上、好ましくは−１００℃以上、また、−１０℃以下、好ましくは−２０℃以下の温度で、１時間以上、好ましくは５時間以上、また、７２時間以下、好ましくは２４時間以下に亘って保持することにより行う。融解操作は、組成物を、４℃以上、好ましくは１０℃以上、また、４０℃以下、好ましくは３０℃以下の温度で、３０分以上、好ましくは１時間以上、また、２４時間以下、好ましくは５時間以下に亘って保持することにより行う。
【００１５】
薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在する状態は、例えば、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値が、当該医薬組成物１と同一の組成を有する一方で凍結融解操作を経ずに形成した薬物内包粒子のゼータ電位の絶対値よりも高いことに基づいて特定できる。これは、凍結融解操作を施すと薬物４が粒子のより内側に向かって移動して粒子の外表面から離れるため、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値における荷電脂質３の影響が増加することに起因する。
【００１６】
本明細書において、荷電脂質３とは、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性脂質、及び当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性脂質を意味する。このため、本明細書では、カチオン性基及びアニオン性基を有するいわゆる両性荷電脂質についても、上記の基準に基づいて取り扱うこととする。
【００１７】
荷電脂質３は、薬物４を静電結合によって医薬組成物１内に保持する。荷電脂質３は、少なくとも医薬組成物１のストック環境下において、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びていればよい。荷電脂質３及び薬物４は、血中に代表される生理環境下（例えば、ｐＨ７．４）においても反対の電荷を帯びていることが好ましい。
【００１８】
荷電脂質３は、次のメカニズムによって、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置される。本発明の医薬組成物１の素材になる担体組成物は、例えば、ブロックコポリマーユニット２と荷電脂質３を水溶液中で懸濁する工程を含んで形成できる。ブロックコポリマーユニット２の疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、疎水性であるために、水溶液中では拡散せず凝集して存在する。親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、水溶液中で拡散し自由に運動し得る。このため、ブロックコポリマーユニット２は、水溶液中で、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に、親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた放射状に配置される。そして、荷電脂質は、疎水性が強く、水や親水性ポリマー鎖セグメント２ａに比べて疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとの親和性が高いため、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられる。こうして、荷電脂質３は、担体組成物の外周面から離れて配置されることとなる。そして、後述する凍結融解操作を経ても、荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態は維持される。
【００１９】
本発明の医薬組成物１は、荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられて配置されているため、荷電脂質３とは反対の電荷を帯びた帯電性物質（例えば、血中のタンパク質）を誘引し得る電荷を医薬組成物１の外周面が帯びることが防止された状態にある。こうした状態は、例えば、医薬組成物１から測定されるゼータ電位の絶対値が所定値以下の範囲にあることによって特定できる。より具体的には、医薬組成物１については、ゼータ電位の絶対値が１５ｍＶ以下であることが望ましく、１２ｍＶ以下、更には６ｍＶ以下、特に３ｍＶ以下であることが好ましい。ゼータ電位は、ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、担体組成物及び医薬組成物１に含有される荷電脂質の総量が１ミリリットルの当該バッファー溶液あたり０．１ｍｇになるように添加して測定することとする。
【００２０】
荷電脂質３に対するブロックコポリマーユニットの割合は、重量比で表示して、１．０以上であることが望ましく、好ましくは１．５以上、より好ましくは２．０以上、また、５０以下であることが望ましく、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である。当該割合を高めるほど、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値を低くできる。他方、荷電脂質３の割合が高くなるほど、薬物をより積極的に粒子内に取り込むことができるため、上記のとおり当該割合は５０以下に制限することが望ましい。
【００２１】
脂質は、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質の何れであってもよく、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類及びステロール類を例示できる。より具体的には、カチオン性脂質として、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸が挙げられる。医薬組成物１は、２種以上の荷電脂質３を含有できる。
【００２２】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、ポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンからなる水溶性ポリマー由来のセグメントであることが好ましい。親水性ポリマー鎖セグメント２ａの分子量は、２，５００Ｄａ以上であることが望ましく、好ましくは５，０００Ｄａ以上、より好ましくは８，０００Ｄａ以上であり、また、２００，０００Ｄａ以下であることが望ましく、好ましくは２０，０００Ｄａ以下、より好ましくは１５，０００Ｄａ以下である。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、ポリアミノ酸鎖由来のセグメントであることが好ましい。かかるポリアミノ酸鎖は、医薬組成物１中で、その一部又は全部がαヘリックスを形成し得る。このため、荷電脂質３は、ポリアミノ酸鎖のαヘリックス部分に引き寄せられた状態で、換言すればαヘリックス部分の周辺に分散した状態で、配置され得る。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの反復単位数は、１０個以上であることが望ましく、好ましくは２０個以上であり、また、２００個以下であることが望ましく、好ましくは１００個以下、より好ましくは６０個以下である。医薬組成物１のゼータ電位の絶対値を低くする、換言すれば医薬組成物１の表面電荷を小さくする（中性に近づける）観点からは、ブロックコポリマーユニット２において、親水性ポリマー鎖セグメント２ａのサイズ（分子量）を、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂのサイズ（反復単位数）に比べて大きくすることが好ましい。親水性ポリマー鎖セグメント２ａ及び疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、分岐構造を有していても構わない。例えば、一方のセグメントに対し２本以上のセグメントが結合した状態にあってもよい。
【００２３】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａ及び疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、帯電性物質を誘引し得る電荷を医薬組成物１の粒子外周面が帯びることを防止できる程度であれば、アミノ基及びカルボキシル基に代表される荷電性の置換基をさらに含有していても構わない。
【００２４】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、主鎖の末端同士を共有結合を介して結合させたものを用いることができる。より具体的には、ブロックコポリマーユニット２として、次の一般式（Ｉ）及び一般式（II）で表示される化合物を例示できる。医薬組成物１は、２種類以上のブロックコポリマーユニット２によって形成されていてもよい。
【化１】
【化２】
【００２５】
一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、Ｒ1及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子又はＲ8（Ｒ9）ＣＨ（ＣＨ2）q−で表される基を表し（ただし、Ｒ8及びＲ9は、ｉ）それぞれ独立して、水素原子、Ｃ1-6アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ1-3オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、トリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基である、ii）一緒になって、Ｃ1-3アルキル基で置換されていている若しくは未置換のエチレンジオキシ基又はプロピレンジオキシ基を形成する、又はiii）それらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を形成する）、ｑは０〜１０の整数であり、Ｒ2は水素原子、飽和若しくは不飽和のＣ1〜Ｃ29脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基であり、Ｒ4は水酸基、飽和若しくは不飽和のＣ1〜Ｃ30脂肪族オキシ基又はアリール−低級アルキルオキシ基であり、Ｒ5は−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ6は水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ2)4−フェニル基、未置換の又はアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ4〜Ｃ16アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基であり、Ｒ7はメチレン基であり、ｎは５５〜４，６００の範囲にある整数であり、ｘは１０〜２００の範囲にある整数であり、ｍは０〜２００の範囲にある整数であり（ただし、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ7ＣＨＮＨ）のユニットとの結合順は任意であり、ｍが２以上である場合、Ｒ6は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ6が水素原子である場合はＲ6全体の７５％以下である）、ｙは１又は２であり、Ｌ1は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ2−、及び−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ1〜Ｃ6アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ2は−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、及び−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ただし、ＺはＣ1〜Ｃ6アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
【００２６】
一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、ｎは、好ましくは１１０以上、より好ましくは１８０以上、また、好ましくは４６０以下、より好ましくは３４０以下の整数であり、ｘは、好ましくは２０以上、また、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数であり、ｍは、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数である。
【００２７】
ブロックコポリマーユニット２は、例えば、親水性ポリマー鎖を有するポリマー及びポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、又は必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。一般式（Ｉ）のブロックコポリマーユニット２については、例えば、Ｒ1を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることによっても形成できる。
【００２８】
担体組成物は、例えば、次のようにして形成できる。まず、ブロックコポリマーユニットと荷電脂質、及び必要であれば中性の脂質を、有機溶媒を含有する形成溶液に溶解又は分散させ、十分に溶解又は分散した後に当該有機溶媒を蒸散除去する。有機溶媒としては、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォオキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノールを例示できる。形成溶液は、２種以上の有機溶媒を含有でき、少量の水を更に含有してもよい。得られた固形物又はペーストに、水又は適当な塩若しくは安定化剤などの添加物を含んだ水溶液を加え、攪拌することによりブロックコポリマーユニットと脂質を懸濁させる。これを超音波照射、高圧乳化機又はエクストルーダーなどの手段を用いて分散・微小化することによって、担体組成物を形成できる。
【００２９】
薬物４は、荷電脂質３との静電結合によって医薬組成物１内に保持される。このように、荷電脂質３と薬物４との結合状態は可逆的であり、化学的構造変化を伴わない。薬物４は、担体組成物の形成過程において形成溶液中に添加することによっても、薬物４の溶液に担体組成物を添加することによっても、担体組成物に内包させることができる。
【００３０】
薬物４としては、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性化合物、及び当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性化合物が挙げられる。化合物は、高分子化合物が好ましい。
【００３１】
薬物４に適用できる高分子化合物としては、ペプチド及びタンパク質を例示できる。こうしたペプチド及びタンパク質としては、アルブミン、オブアルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、ペプシノーゲン、α−ラクトアルブミン、カタラーゼ、カーボニックアンヒドラーゼ、インシュリン、ＴＧＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン、ｔ−ＰＡ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２といったインターロイキン類、エリスロポエチン、成長ホルモン（ＧＨ）、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ゴセレリン、リュープロレリンといったＬＨ−ＲＨ誘導体、ブセレリン、ナファレリンといったＧｎＲＨ誘導体、ゴナトトロピン、ＩＧＦ−１、グルカゴン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リゾチーム、セラチオペプチダーゼ、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、コラーゲン、ヒストン、プロタミン、抗体又はこれと類似の活性を有する誘導体、及び免疫治療に用いられる抗原ペプチドを例示できる。
【００３２】
薬物４として適用できる、ペプチド及びタンパク質以外の高分子化合物としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーといったカチオン性高分子、並びにデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランといった糖鎖、オリゴ若しくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴ若しくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴ若しくはポリ一本鎖ＤＮＡ及びオリゴ若しくはポリ一本鎖ＲＮＡといった核酸、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸コポリマー、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドンコポリマー、アニオン性デンドリマー、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸を例示できる。
【００３３】
核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても構わない。核酸の長さは、好ましくは４塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、更に好ましくは１８塩基以上、また、好ましくは２０，０００塩基以下、より好ましくは１０，０００塩基以下、更に好ましくは３０塩基以下である。核酸は、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー及びリボザイムであってよい。
【００３４】
薬物４としては、特にｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、標的とする遺伝子及びポリヌクレオチドに特異的に作用するように、公知の方法で設計すればよい。このｓｉＲＮＡには、ヌクレオチド１８〜３０個の長さを有する一本鎖又は二本鎖のＲＮＡであって、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用又は機能を有するすべてのヌクレオチドが包含される。遺伝子としては、非小細胞肺癌に関係するＰＫＣα、悪性黒色腫に関係するＢＣＬ−２、クローン病に関係するＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係するＨＣＶ、関節リュウマチ及び乾癬に関係するＴＮＦα、喘息に関係するアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌に関係するｃ−ｒａｆキナーゼ、膵臓癌に関係するＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係するｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係するＰＫＡ Ｒｉａ、エイズに関係するＨＩＶ、固形癌に関係するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、腎臓癌に関係するリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係するＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係するＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係するＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係するＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係するＰＴＰ−１Ｂ、乳癌に関係するＥＧＦＲ、癌に関係するＶＥＧＦ受容体、ｃ−ｍｙｂ、ｍｄｒ１、オータキシン（autotaxin）及びＧＬＵＴ−１を例示できる。
【００３５】
薬物４が血中等において医薬組成物１から早期に脱離してしまうことを抑制すると共に、薬物４が医薬組成物１内に過剰な期間保持され続けることを防止する観点からは、医薬組成物１における荷電脂質３と薬物４との電荷比を、所定範囲に制御することが好ましい。当該電荷比は、例えば、薬物４として核酸を使用する場合、［医薬組成物に含有される荷電脂質中のカチオン性基のモル濃度］／［核酸中のリン酸基のモル濃度］によって規定され、また例えば、タンパク質に代表される両性の荷電性基を有する薬物４を使用する場合、［医薬組成物に含有される荷電脂質中の荷電性基のモル濃度］／（［荷電脂質の電荷と反対の電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］−［荷電脂質の電荷と同じ電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］）によって規定される。当該電荷比は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１以上、更に好ましくは２以上、また、好ましくは５０以下、より好ましくは２０以下、更に好ましくは１０以下である。
【００３６】
担体組成物及び医薬組成物１の平均粒径は、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは３０ｎｍ以上、また、好ましくは３００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明する。
【００３８】
Ｉ．粒子状医薬組成物の調製：
次に記載する手順に従って粒子状医薬組成物を調製し、後述の各種測定に供した。
【００３９】
重量平均分子量（Ｍｗ）１００００のα−メトキシ−ω−アミノ−ポリエチレングリコール（以降、「ＰＥＧ」と表示する場合がある）（日油株式会社）５ｇをジメチルスルホキシド５０ｍｌに溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（以降、「ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）５．５ｇ（ポリエチレングリコールに対し４２等量）を加え、４０℃で２４時間反応を行った。この反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。減圧濾過によりポリマーを回収し、更に乾燥させることで、８．６ｇの固形物を得た。これをＤＭＦ８６ｍｌに溶解し、無水酢酸４３２μｌを加え、４０℃で２４時間反応を行った。反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。ポリマーは減圧濾過により回収し、更に乾燥させることで、８．１ｇのポリエチレングリコール−ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）−Ａｃブロックコポリマー（以降、「ＰＥＧ−ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）を得た。ＰＥＧ−ＰＢＬＧの構造式を下記に示す。1Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＧブロックの重合度は４０であった。
【００４０】
【化３】
【００４１】
以上の手順により得られたブロックコポリマーユニットであるＰＥＧ−ＰＢＬＧ（１０−４０）と、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰと、中性脂質であるＤＯＰＥとを、クロロホルム中で、２．５／１／１の重量比となるように混合し、減圧下で乾固させた。この混合物に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、４℃で終夜攪拌した後、超音波を照射して粒子化を行い、更に０．２２μｍのフィルターを通すことで、脂質ミセル（粒子状担体組成物）の溶液を得た。
【００４２】
ｓｉＲＮＡを１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させ、４０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。このｓｉＲＮＡ溶液を、脂質ミセル（粒子状担体組成物）の溶液、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及び５０％スクロース溶液と混合することにより、薬物として各試験例に記載のｓｉＲＮＡを内包する脂質ミセル（粒子状医薬組成物）の溶液を得た。この際、粒子状医薬組成物溶液中のｓｉＲＮＡ濃度は１０μＭに、スクロース濃度は１０％となるように調製を行った。また、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）の正電荷（カチオン性基）の濃度とｓｉＲＮＡの負電荷（リン酸基）の濃度との比である電荷比（＋／−）が８となるように、混合量比を調整した。
【００４３】
なお、ｓｉＲＮＡとしては、次に説明するものを用いた。これらｓｉＲＮＡは、株式会社日本イージーティーを通じて入手できる。
・ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
・ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）：ヒトＰｌｋ１（Polo-like kinase 1）遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＣＡＵＵＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖として５’−ＵＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＧＵＵＡＡＵＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号４）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。Ｐｌｋ１遺伝子は、細胞分裂のＭ期において重要なキナーゼである。ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）は、細胞内に導入された場合にアポトーシスを誘導する。
・Ｆ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）において、配列番号２のアンチセンス鎖の５’末端にＣｙ３標識を付したアンチセンス鎖（５’−Ｃｙ３−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’）を用いて形成したｓｉＲＮＡである。
【００４４】
得られたｓｉＲＮＡ内包脂質ミセル（粒子状医薬組成物）の溶液を未処理のまま、或いは凍結融解処理を１回、２回、又は３回行い、以下の各種測定に供した。なお、各凍結融解処理は、−８０℃で１２時間放置して凍結させた後、室温で１時間放置して融解させることにより行った。
【００４５】
以降、未処理の粒子状医薬組成物を「参考例１の医薬組成物」、凍結融解を１回行った粒子状医薬組成物を「実施例１の医薬組成物」、凍結融解を２回行った粒子状医薬組成物を「実施例２の医薬組成物」、凍結融解を３回行った粒子状医薬組成物を「実施例３の医薬組成物」、と表示する場合がある。また、これらを総称して単に「試料」と表示する場合がある。
【００４６】
なお、参考例１及び実施例１〜３の各医薬組成物は、何れも、荷電脂質（ＤＯＴＡＰ）が、薬物（ｓｉＲＮＡ）を静電結合によって粒子内に保持する一方、疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置されることによって、荷電脂質とは反対の電荷を帯びた帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止された状態にある。また、参考例１及び実施例１〜３の各医薬組成物は、ポリアミノ酸鎖由来の疎水性ポリマー鎖セグメント（ＰＢＬＧ）がαヘリックスを形成し、荷電脂質（ＤＯＴＡＰ）はこのαヘリックスの周辺に分散していると考えられる。更に、実施例１〜３の各医薬組成物は、何れも、薬物が疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在する状態にある。
【００４７】
II．粒子状医薬組成物の各種測定：
II−１．光散乱測定：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１（未処理）、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００４８】
各試料を１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで１０倍に希釈し、ｓｉＲＮＡ濃度を１μＭとして用いた。光散乱分析装置（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments）により、各試料中のミセルの粒子径、散乱強度及びゼータ電位を測定した。
【００４９】
粒子径及びゼータ電位の測定結果を表１に示す。参考例１（未処理）の医薬組成物と比べ、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物では、ミセルの粒子径及び散乱強度については大きな変化は見られず安定であったが、ゼータ電位が増加するという現象がみられた。理由としては、（ｉ）ミセル中から脂質が解離してしまったこと、及び、（ii）ｓｉＲＮＡがミセルの内部に移行し、ミセル表面の正電荷が相対的に増加したこと、が考えられる。しかし、上記（ｉ）の場合には粒子径や散乱強度にも大きな変化が生じるはずであるのに対し、実際には上述のように粒子径や散乱強度に大きな変化は生じていない。よって、上記（ii）のように、ｓｉＲＮＡがミセルの内部へ移行したためであると考えられる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
II−２．内包率の測定：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１（未処理）、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００５２】
II−２−１．検量線の作成：
４０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで希釈し、１／３の希釈系列を５０μＬずつ作製した（４０μＭから０．６８ｎＭまでの１１段階）。得られた希釈系列の各ｓｉＲＮＡ溶液５０μＬについて、以下の手順で蛍光強度を測定し、検量線を作成した。すなわち、各ｓｉＲＮＡ溶液５０μＬに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー７５０μＬ及び１％TRITONX-100水溶液２００μＬを加えてよく混合した。得られた混合液のうち１００μＬを９６ウェルプレート（黒色）のウェルに移した。各ウェルにPicoGreen（登録商標）溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで２００倍希釈したもの）１００μＬを加えて混合し、遮光下、室温で５分間放置した後に、プレートリーダーで蛍光強度を測定し、検量線を作成した。得られた検量線は、ｓｉＲＮＡ濃度が１．４８μＭから２ｎＭまでの範囲がリニアであったため、この範囲で試料の測定を行った。
【００５３】
II−２−２．試料の測定：
各試料を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）によりｓｉＲＮＡ濃度が１μＭとなるように希釈して（規格化して）用いた。この溶液５００μＬを超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、１時間）処理してミセルを沈殿させ、上清５０μＬを静かに採取した。得られた上清について、上記「II−２−１．検量線の作成」に記載の手法で蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度を上記の検量線と照合することで、各試料由来の上清中に存在するｓｉＲＮＡ濃度である規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度を算出した。次式より、各試料中のミセルのｓｉＲＮＡ内包率を求めた。
ｓｉＲＮＡ内包率（％）＝（１−ｘ）×１００
ｘ：規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度（μＭ）
【００５４】
II−２−３．結果：
得られたｓｉＲＮＡ内包率の結果を表２に示す。参考例１、実施例１〜３の何れの医薬組成物を用いた場合でも、超遠心後の上清中に存在するｓｉＲＮＡは殆どなく、ほぼ全てのｓｉＲＮＡがミセルに内包されていた。
【００５５】
【表２】
【００５６】
II−３．封入安定性の評価：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１及び実施例３の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００５７】
各試料に対して、アニオン性高分子であるデキストラン硫酸を添加し、デキストラン硫酸との置換によりミセルから放出されたｓｉＲＮＡの比率（ｓｉＲＮＡ放出率）を測定することにより、各試料の封入安定性を評価した。より具体的には、次のように評価を行った。各試料に対してデキストラン硫酸を過剰量（ｓｉＲＮＡに対し電荷比で８０倍）加えた後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）によりｓｉＲＮＡ濃度が１μＭとなるように希釈（規格化）した。この溶液５００μＬを超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、１時間）処理してミセルを沈殿させ、上清５０μＬを採取した。この上清について、上記「II−２−１．検量線の作成」に記載の手法で蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度を上記「II−２．内包率の測定」の検量線と照合することで、各試料由来の上清中に存在する規格化されたｓｉＲＮＡ濃度を算出し、これを各試料のミセルから放出されたｓｉＲＮＡ量とした。次式に従って、ｓｉＲＮＡ放出率（ミセルに内包されたｓｉＲＮＡに対する、デキストラン硫酸との置換によりミセルから放出されたｓｉＲＮＡの比率）を求めた。
ｓｉＲＮＡ放出率（％）＝｛（ｙ−ｘ）／１｝｛ｙ−ｘ｝×１００
ｘ：規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度（μＭ）ｙ：ミセルから放出されたｓｉＲＮＡ量（μＭ）
【００５８】
結果を図３に示す。実施例３の医薬組成物では、参考例１の医薬組成物に比べ、ｓｉＲＮＡ放出率は約半分に減少した。
【００５９】
II−４．血中滞留性評価：
ｓｉＲＮＡとしてＦ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１及び実施例３の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００６０】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー）の尾静脈に各試料を投与し、その１時間後に下大静脈から血液２００μｌを採取した。各サンプルの投与量は、マウス体重に対するＦ−ｓｉＲＮＡの比率が１ｍｇ／ｋｇとなるように調整した。採取した血液を４℃、２０００×ｇで１０分遠心し、上清から８０μｌの血漿を得た。この血漿の蛍光強度を、プレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）し、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡを定量して、血中残存性の指標とした。
【００６１】
結果を図４に示す。実施例３の医薬組成物と参考例１の医薬組成物とを比較すると、実施例３の医薬組成物の方が、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡ量が多く、血中滞留性が高かった。
【符号の説明】
【００６２】
１ 医薬組成物
１’ 医薬組成物前駆体
２ ブロックコポリマーユニット
２ａ 親水性ポリマー鎖セグメント
２ｂ 疎水性ポリマー鎖セグメント
３ 荷電脂質
４ 薬物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子状担体組成物に薬物が内包された、薬物運搬システム（ＤＤＳ）として利用し得る粒子状医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や核酸といった生体高分子を利用するバイオ医薬品は、低分子化合物を利用する従来型の医薬品に比べ、酵素で分解されたり免疫系によって排除されたりし易い。特許文献１〜３は、生体内におけるバイオ医薬品の安定性を高める観点から、脂質二重膜からなるリポソームに生体高分子を内包させたＤＤＳを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００１／０３４１１５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第１９９８／５８６３０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０９２３８９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１〜３に記載の従来型のＤＤＳでは、薬物としての生体高分子を脂質二重膜で保護することによって、生体内における薬物の安定性を向上できるものの、薬物が担体から放出されにくくなる。そして、こうした従来型のＤＤＳは、その粒子径の大きさや脂質二重膜を構成する脂質が有する電荷に起因して、肺、肝臓及び脾臓といった細網内皮系に捕捉され易いため、投薬対象物に到達する以前に血中から除去されてしまう場合がある。
【０００５】
疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットによって構成された高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、リポソームを使用した従来型のＤＤＳに比べてＤＤＳ粒子を大幅に小型化（例えば、平均粒径１００ｎｍ以下）できる。しかし、こうした高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、後述する比較例に示すように生体高分子をＤＤＳ粒子内に保持する作用が弱すぎることによって、やはり投薬対象物に薬物を適切に輸送し難くなる場合がある。また、こうしたＤＤＳでは、製造後のストック期間中に担体から薬物が脱離してしまう場合もある。
【０００６】
本発明者等は、帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止された高分子ミセルＤＤＳの開発を進めてきた（特願２００９−２００６８１）。かかるＤＤＳは、投薬対象物への薬物運搬の妨害に帰結し得る担体表面への生体分子の付着を防止できるものの、薬物をより長期的に保持させる観点からはさらに改善できる余地があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットと、薬物と、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質とを含有する粒子状医薬組成物であって、複数の前記ブロックコポリマーユニットが、前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置され、前記荷電脂質が、前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置され、前記薬物が、前記疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在することによって、当該薬物の粒子外への脱落が防止された、粒子状医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＤＤＳに適した医薬組成物における薬物の封入安定性を向上できる。かかる医薬組成物は、従来型のＤＤＳに比べてより確実に薬物を輸送できる。特に、到達に時間が掛かる投薬対象物への薬物送達に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）及び図１（ｂ）は、本発明の医薬組成物の代表的な構造を説明するための図である。
【図２】図２（ａ）及び図２（ｂ）は、凍結融解操作による粒子内の薬物分布の変化を説明するための図である。
【図３】図３は、医薬組成物の封入安定性評価の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、医薬組成物の血中滞留性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以降の説明では、本発明の把握を容易にするために、図１及び図２を参照する。しかし、図１及び図２は何れも模式図であり、本発明はいかなる意味においても、これらの図に限定されるものではない。図１及び図２では、荷電脂質がカチオン性脂質であり、薬物がアニオン性薬物である場合を示しているが、本発明はこの態様に限定されない。
【００１１】
図１（ａ）に、本発明の粒子状医薬組成物（以降、単に「医薬組成物」という場合がある）の代表的な構造を示す。医薬組成物１は、ブロックコポリマーユニット２と、荷電脂質３と、薬物４とを含有する。図１（ｂ）に、ブロックコポリマーユニット２を拡大して示す。ブロックコポリマーユニット２は、親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとを有し、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に向けると共に親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた状態で、医薬組成物１内に放射状に配置される。荷電脂質３は、薬物４の電荷とは反対の電荷を帯び、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置される。
【００１２】
本発明による医薬組成物１において、薬物は、図１（ａ）に示すように、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在している。なお、これは、医薬組成物１に内包される全ての薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に偏在した状態に限定する意図ではなく、一部の薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも外側に存在した状態を排除しない。本発明による医薬組成物１は、薬物４が当該位置に存在することによって、薬物４の脱落が防止された、換言すれば薬物４の封入安定性が向上した、状態にある。
【００１３】
医薬組成物１は、例えば、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも外側の領域に薬物が内包された状態にある医薬組成物前駆体に、凍結融解操作を施すことによって形成できる。なお、医薬組成物前駆体１’は、後述のように、公知の方法によって担体組成物に薬物を内包させることで容易に形成できる。図２（ａ）に、凍結融解操作前の医薬組成物前駆体１’における粒子内の薬物４分布を示し、図２（ｂ）に、凍結融解操作後の医薬組成物１における粒子内の薬物４分布を示す。図２（ａ）に示すように、医薬組成物前駆体１’においては、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも粒子外側に存在していた薬物４が、凍結融解操作を施すと、粒子内側に向かって移動し、図２（ｂ）に示すように、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在する医薬組成物１が得られることになる。このように、本発明の医薬組成物１は、医薬組成物前駆体１’において疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの外側に配置されている薬物４を、凍結融解を経ることで疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの内側に移動させることによって形成できる。こうした薬物移動が生じる理由は定かではないが、担体組成物を構成するブロックコポリマー２および荷電脂質３の配置が凍結融解操作によって乱され、これに付随して生じる隙間を介して粒子のより内部に薬物４が格納されるものと考えられる。凍結融解操作は、少なくとも１回行えばよいが、２回以上実施することが好ましい。凍結融解操作を繰り返すことで、薬物４の粒子内部への格納を促進できる。
【００１４】
凍結融解操作は、組成物を凍結する操作と、凍結した組成物を融解する操作とからなる。その条件は制限されるものではないが、例えば次のとおりである。凍結操作は、組成物を、−２００℃以上、好ましくは−１００℃以上、また、−１０℃以下、好ましくは−２０℃以下の温度で、１時間以上、好ましくは５時間以上、また、７２時間以下、好ましくは２４時間以下に亘って保持することにより行う。融解操作は、組成物を、４℃以上、好ましくは１０℃以上、また、４０℃以下、好ましくは３０℃以下の温度で、３０分以上、好ましくは１時間以上、また、２４時間以下、好ましくは５時間以下に亘って保持することにより行う。
【００１５】
薬物４が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂよりも内側に存在する状態は、例えば、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値が、当該医薬組成物１と同一の組成を有する一方で凍結融解操作を経ずに形成した薬物内包粒子のゼータ電位の絶対値よりも高いことに基づいて特定できる。これは、凍結融解操作を施すと薬物４が粒子のより内側に向かって移動して粒子の外表面から離れるため、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値における荷電脂質３の影響が増加することに起因する。
【００１６】
本明細書において、荷電脂質３とは、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性脂質、及び当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性脂質を意味する。このため、本明細書では、カチオン性基及びアニオン性基を有するいわゆる両性荷電脂質についても、上記の基準に基づいて取り扱うこととする。
【００１７】
荷電脂質３は、薬物４を静電結合によって医薬組成物１内に保持する。荷電脂質３は、少なくとも医薬組成物１のストック環境下において、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びていればよい。荷電脂質３及び薬物４は、血中に代表される生理環境下（例えば、ｐＨ７．４）においても反対の電荷を帯びていることが好ましい。
【００１８】
荷電脂質３は、次のメカニズムによって、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置される。本発明の医薬組成物１の素材になる担体組成物は、例えば、ブロックコポリマーユニット２と荷電脂質３を水溶液中で懸濁する工程を含んで形成できる。ブロックコポリマーユニット２の疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、疎水性であるために、水溶液中では拡散せず凝集して存在する。親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、水溶液中で拡散し自由に運動し得る。このため、ブロックコポリマーユニット２は、水溶液中で、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に、親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた放射状に配置される。そして、荷電脂質は、疎水性が強く、水や親水性ポリマー鎖セグメント２ａに比べて疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとの親和性が高いため、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられる。こうして、荷電脂質３は、担体組成物の外周面から離れて配置されることとなる。そして、後述する凍結融解操作を経ても、荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態は維持される。
【００１９】
本発明の医薬組成物１は、荷電脂質３が疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられて配置されているため、荷電脂質３とは反対の電荷を帯びた帯電性物質（例えば、血中のタンパク質）を誘引し得る電荷を医薬組成物１の外周面が帯びることが防止された状態にある。こうした状態は、例えば、医薬組成物１から測定されるゼータ電位の絶対値が所定値以下の範囲にあることによって特定できる。より具体的には、医薬組成物１については、ゼータ電位の絶対値が１５ｍＶ以下であることが望ましく、１２ｍＶ以下、更には６ｍＶ以下、特に３ｍＶ以下であることが好ましい。ゼータ電位は、ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、担体組成物及び医薬組成物１に含有される荷電脂質の総量が１ミリリットルの当該バッファー溶液あたり０．１ｍｇになるように添加して測定することとする。
【００２０】
荷電脂質３に対するブロックコポリマーユニットの割合は、重量比で表示して、１．０以上であることが望ましく、好ましくは１．５以上、より好ましくは２．０以上、また、５０以下であることが望ましく、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である。当該割合を高めるほど、医薬組成物１のゼータ電位の絶対値を低くできる。他方、荷電脂質３の割合が高くなるほど、薬物をより積極的に粒子内に取り込むことができるため、上記のとおり当該割合は５０以下に制限することが望ましい。
【００２１】
脂質は、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質の何れであってもよく、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類及びステロール類を例示できる。より具体的には、カチオン性脂質として、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸が挙げられる。医薬組成物１は、２種以上の荷電脂質３を含有できる。
【００２２】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、ポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンからなる水溶性ポリマー由来のセグメントであることが好ましい。親水性ポリマー鎖セグメント２ａの分子量は、２，５００Ｄａ以上であることが望ましく、好ましくは５，０００Ｄａ以上、より好ましくは８，０００Ｄａ以上であり、また、２００，０００Ｄａ以下であることが望ましく、好ましくは２０，０００Ｄａ以下、より好ましくは１５，０００Ｄａ以下である。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、ポリアミノ酸鎖由来のセグメントであることが好ましい。かかるポリアミノ酸鎖は、医薬組成物１中で、その一部又は全部がαヘリックスを形成し得る。このため、荷電脂質３は、ポリアミノ酸鎖のαヘリックス部分に引き寄せられた状態で、換言すればαヘリックス部分の周辺に分散した状態で、配置され得る。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの反復単位数は、１０個以上であることが望ましく、好ましくは２０個以上であり、また、２００個以下であることが望ましく、好ましくは１００個以下、より好ましくは６０個以下である。医薬組成物１のゼータ電位の絶対値を低くする、換言すれば医薬組成物１の表面電荷を小さくする（中性に近づける）観点からは、ブロックコポリマーユニット２において、親水性ポリマー鎖セグメント２ａのサイズ（分子量）を、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂのサイズ（反復単位数）に比べて大きくすることが好ましい。親水性ポリマー鎖セグメント２ａ及び疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、分岐構造を有していても構わない。例えば、一方のセグメントに対し２本以上のセグメントが結合した状態にあってもよい。
【００２３】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａ及び疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、帯電性物質を誘引し得る電荷を医薬組成物１の粒子外周面が帯びることを防止できる程度であれば、アミノ基及びカルボキシル基に代表される荷電性の置換基をさらに含有していても構わない。
【００２４】
親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、主鎖の末端同士を共有結合を介して結合させたものを用いることができる。より具体的には、ブロックコポリマーユニット２として、次の一般式（Ｉ）及び一般式（II）で表示される化合物を例示できる。医薬組成物１は、２種類以上のブロックコポリマーユニット２によって形成されていてもよい。
【化１】
【化２】
【００２５】
一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、Ｒ1及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子又はＲ8（Ｒ9）ＣＨ（ＣＨ2）q−で表される基を表し（ただし、Ｒ8及びＲ9は、ｉ）それぞれ独立して、水素原子、Ｃ1-6アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ1-3オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、トリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基である、ii）一緒になって、Ｃ1-3アルキル基で置換されていている若しくは未置換のエチレンジオキシ基又はプロピレンジオキシ基を形成する、又はiii）それらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を形成する）、ｑは０〜１０の整数であり、Ｒ2は水素原子、飽和若しくは不飽和のＣ1〜Ｃ29脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基であり、Ｒ4は水酸基、飽和若しくは不飽和のＣ1〜Ｃ30脂肪族オキシ基又はアリール−低級アルキルオキシ基であり、Ｒ5は−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ6は水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ2)4−フェニル基、未置換の又はアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ4〜Ｃ16アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基であり、Ｒ7はメチレン基であり、ｎは５５〜４，６００の範囲にある整数であり、ｘは１０〜２００の範囲にある整数であり、ｍは０〜２００の範囲にある整数であり（ただし、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ7ＣＨＮＨ）のユニットとの結合順は任意であり、ｍが２以上である場合、Ｒ6は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ6が水素原子である場合はＲ6全体の７５％以下である）、ｙは１又は２であり、Ｌ1は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ2−、及び−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ1〜Ｃ6アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ2は−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、及び−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ただし、ＺはＣ1〜Ｃ6アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
【００２６】
一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、ｎは、好ましくは１１０以上、より好ましくは１８０以上、また、好ましくは４６０以下、より好ましくは３４０以下の整数であり、ｘは、好ましくは２０以上、また、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数であり、ｍは、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数である。
【００２７】
ブロックコポリマーユニット２は、例えば、親水性ポリマー鎖を有するポリマー及びポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、又は必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。一般式（Ｉ）のブロックコポリマーユニット２については、例えば、Ｒ1を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることによっても形成できる。
【００２８】
担体組成物は、例えば、次のようにして形成できる。まず、ブロックコポリマーユニットと荷電脂質、及び必要であれば中性の脂質を、有機溶媒を含有する形成溶液に溶解又は分散させ、十分に溶解又は分散した後に当該有機溶媒を蒸散除去する。有機溶媒としては、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォオキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノールを例示できる。形成溶液は、２種以上の有機溶媒を含有でき、少量の水を更に含有してもよい。得られた固形物又はペーストに、水又は適当な塩若しくは安定化剤などの添加物を含んだ水溶液を加え、攪拌することによりブロックコポリマーユニットと脂質を懸濁させる。これを超音波照射、高圧乳化機又はエクストルーダーなどの手段を用いて分散・微小化することによって、担体組成物を形成できる。
【００２９】
薬物４は、荷電脂質３との静電結合によって医薬組成物１内に保持される。このように、荷電脂質３と薬物４との結合状態は可逆的であり、化学的構造変化を伴わない。薬物４は、担体組成物の形成過程において形成溶液中に添加することによっても、薬物４の溶液に担体組成物を添加することによっても、担体組成物に内包させることができる。
【００３０】
薬物４としては、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性化合物、及び当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性化合物が挙げられる。化合物は、高分子化合物が好ましい。
【００３１】
薬物４に適用できる高分子化合物としては、ペプチド及びタンパク質を例示できる。こうしたペプチド及びタンパク質としては、アルブミン、オブアルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、ペプシノーゲン、α−ラクトアルブミン、カタラーゼ、カーボニックアンヒドラーゼ、インシュリン、ＴＧＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン、ｔ−ＰＡ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２といったインターロイキン類、エリスロポエチン、成長ホルモン（ＧＨ）、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ゴセレリン、リュープロレリンといったＬＨ−ＲＨ誘導体、ブセレリン、ナファレリンといったＧｎＲＨ誘導体、ゴナトトロピン、ＩＧＦ−１、グルカゴン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リゾチーム、セラチオペプチダーゼ、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、コラーゲン、ヒストン、プロタミン、抗体又はこれと類似の活性を有する誘導体、及び免疫治療に用いられる抗原ペプチドを例示できる。
【００３２】
薬物４として適用できる、ペプチド及びタンパク質以外の高分子化合物としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーといったカチオン性高分子、並びにデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランといった糖鎖、オリゴ若しくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴ若しくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴ若しくはポリ一本鎖ＤＮＡ及びオリゴ若しくはポリ一本鎖ＲＮＡといった核酸、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸コポリマー、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドンコポリマー、アニオン性デンドリマー、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸を例示できる。
【００３３】
核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても構わない。核酸の長さは、好ましくは４塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、更に好ましくは１８塩基以上、また、好ましくは２０，０００塩基以下、より好ましくは１０，０００塩基以下、更に好ましくは３０塩基以下である。核酸は、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー及びリボザイムであってよい。
【００３４】
薬物４としては、特にｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、標的とする遺伝子及びポリヌクレオチドに特異的に作用するように、公知の方法で設計すればよい。このｓｉＲＮＡには、ヌクレオチド１８〜３０個の長さを有する一本鎖又は二本鎖のＲＮＡであって、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用又は機能を有するすべてのヌクレオチドが包含される。遺伝子としては、非小細胞肺癌に関係するＰＫＣα、悪性黒色腫に関係するＢＣＬ−２、クローン病に関係するＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係するＨＣＶ、関節リュウマチ及び乾癬に関係するＴＮＦα、喘息に関係するアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌に関係するｃ−ｒａｆキナーゼ、膵臓癌に関係するＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係するｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係するＰＫＡ Ｒｉａ、エイズに関係するＨＩＶ、固形癌に関係するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、腎臓癌に関係するリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係するＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係するＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係するＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係するＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係するＰＴＰ−１Ｂ、乳癌に関係するＥＧＦＲ、癌に関係するＶＥＧＦ受容体、ｃ−ｍｙｂ、ｍｄｒ１、オータキシン（autotaxin）及びＧＬＵＴ−１を例示できる。
【００３５】
薬物４が血中等において医薬組成物１から早期に脱離してしまうことを抑制すると共に、薬物４が医薬組成物１内に過剰な期間保持され続けることを防止する観点からは、医薬組成物１における荷電脂質３と薬物４との電荷比を、所定範囲に制御することが好ましい。当該電荷比は、例えば、薬物４として核酸を使用する場合、［医薬組成物に含有される荷電脂質中のカチオン性基のモル濃度］／［核酸中のリン酸基のモル濃度］によって規定され、また例えば、タンパク質に代表される両性の荷電性基を有する薬物４を使用する場合、［医薬組成物に含有される荷電脂質中の荷電性基のモル濃度］／（［荷電脂質の電荷と反対の電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］−［荷電脂質の電荷と同じ電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］）によって規定される。当該電荷比は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１以上、更に好ましくは２以上、また、好ましくは５０以下、より好ましくは２０以下、更に好ましくは１０以下である。
【００３６】
担体組成物及び医薬組成物１の平均粒径は、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは３０ｎｍ以上、また、好ましくは３００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明する。
【００３８】
Ｉ．粒子状医薬組成物の調製：
次に記載する手順に従って粒子状医薬組成物を調製し、後述の各種測定に供した。
【００３９】
重量平均分子量（Ｍｗ）１００００のα−メトキシ−ω−アミノ−ポリエチレングリコール（以降、「ＰＥＧ」と表示する場合がある）（日油株式会社）５ｇをジメチルスルホキシド５０ｍｌに溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（以降、「ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）５．５ｇ（ポリエチレングリコールに対し４２等量）を加え、４０℃で２４時間反応を行った。この反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。減圧濾過によりポリマーを回収し、更に乾燥させることで、８．６ｇの固形物を得た。これをＤＭＦ８６ｍｌに溶解し、無水酢酸４３２μｌを加え、４０℃で２４時間反応を行った。反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。ポリマーは減圧濾過により回収し、更に乾燥させることで、８．１ｇのポリエチレングリコール−ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）−Ａｃブロックコポリマー（以降、「ＰＥＧ−ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）を得た。ＰＥＧ−ＰＢＬＧの構造式を下記に示す。1Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＧブロックの重合度は４０であった。
【００４０】
【化３】
【００４１】
以上の手順により得られたブロックコポリマーユニットであるＰＥＧ−ＰＢＬＧ（１０−４０）と、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰと、中性脂質であるＤＯＰＥとを、クロロホルム中で、２．５／１／１の重量比となるように混合し、減圧下で乾固させた。この混合物に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、４℃で終夜攪拌した後、超音波を照射して粒子化を行い、更に０．２２μｍのフィルターを通すことで、脂質ミセル（粒子状担体組成物）の溶液を得た。
【００４２】
ｓｉＲＮＡを１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させ、４０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。このｓｉＲＮＡ溶液を、脂質ミセル（粒子状担体組成物）の溶液、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及び５０％スクロース溶液と混合することにより、薬物として各試験例に記載のｓｉＲＮＡを内包する脂質ミセル（粒子状医薬組成物）の溶液を得た。この際、粒子状医薬組成物溶液中のｓｉＲＮＡ濃度は１０μＭに、スクロース濃度は１０％となるように調製を行った。また、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）の正電荷（カチオン性基）の濃度とｓｉＲＮＡの負電荷（リン酸基）の濃度との比である電荷比（＋／−）が８となるように、混合量比を調整した。
【００４３】
なお、ｓｉＲＮＡとしては、次に説明するものを用いた。これらｓｉＲＮＡは、株式会社日本イージーティーを通じて入手できる。
・ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
・ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）：ヒトＰｌｋ１（Polo-like kinase 1）遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＣＡＵＵＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖として５’−ＵＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＧＵＵＡＡＵＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号４）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。Ｐｌｋ１遺伝子は、細胞分裂のＭ期において重要なキナーゼである。ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）は、細胞内に導入された場合にアポトーシスを誘導する。
・Ｆ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）において、配列番号２のアンチセンス鎖の５’末端にＣｙ３標識を付したアンチセンス鎖（５’−Ｃｙ３−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’）を用いて形成したｓｉＲＮＡである。
【００４４】
得られたｓｉＲＮＡ内包脂質ミセル（粒子状医薬組成物）の溶液を未処理のまま、或いは凍結融解処理を１回、２回、又は３回行い、以下の各種測定に供した。なお、各凍結融解処理は、−８０℃で１２時間放置して凍結させた後、室温で１時間放置して融解させることにより行った。
【００４５】
以降、未処理の粒子状医薬組成物を「参考例１の医薬組成物」、凍結融解を１回行った粒子状医薬組成物を「実施例１の医薬組成物」、凍結融解を２回行った粒子状医薬組成物を「実施例２の医薬組成物」、凍結融解を３回行った粒子状医薬組成物を「実施例３の医薬組成物」、と表示する場合がある。また、これらを総称して単に「試料」と表示する場合がある。
【００４６】
なお、参考例１及び実施例１〜３の各医薬組成物は、何れも、荷電脂質（ＤＯＴＡＰ）が、薬物（ｓｉＲＮＡ）を静電結合によって粒子内に保持する一方、疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置されることによって、荷電脂質とは反対の電荷を帯びた帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止された状態にある。また、参考例１及び実施例１〜３の各医薬組成物は、ポリアミノ酸鎖由来の疎水性ポリマー鎖セグメント（ＰＢＬＧ）がαヘリックスを形成し、荷電脂質（ＤＯＴＡＰ）はこのαヘリックスの周辺に分散していると考えられる。更に、実施例１〜３の各医薬組成物は、何れも、薬物が疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在する状態にある。
【００４７】
II．粒子状医薬組成物の各種測定：
II−１．光散乱測定：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１（未処理）、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００４８】
各試料を１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで１０倍に希釈し、ｓｉＲＮＡ濃度を１μＭとして用いた。光散乱分析装置（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments）により、各試料中のミセルの粒子径、散乱強度及びゼータ電位を測定した。
【００４９】
粒子径及びゼータ電位の測定結果を表１に示す。参考例１（未処理）の医薬組成物と比べ、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物では、ミセルの粒子径及び散乱強度については大きな変化は見られず安定であったが、ゼータ電位が増加するという現象がみられた。理由としては、（ｉ）ミセル中から脂質が解離してしまったこと、及び、（ii）ｓｉＲＮＡがミセルの内部に移行し、ミセル表面の正電荷が相対的に増加したこと、が考えられる。しかし、上記（ｉ）の場合には粒子径や散乱強度にも大きな変化が生じるはずであるのに対し、実際には上述のように粒子径や散乱強度に大きな変化は生じていない。よって、上記（ii）のように、ｓｉＲＮＡがミセルの内部へ移行したためであると考えられる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
II−２．内包率の測定：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１（未処理）、実施例１（凍結融解１回）、実施例２（凍結融解２回）及び実施例３（凍結融解３回）の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００５２】
II−２−１．検量線の作成：
４０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで希釈し、１／３の希釈系列を５０μＬずつ作製した（４０μＭから０．６８ｎＭまでの１１段階）。得られた希釈系列の各ｓｉＲＮＡ溶液５０μＬについて、以下の手順で蛍光強度を測定し、検量線を作成した。すなわち、各ｓｉＲＮＡ溶液５０μＬに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー７５０μＬ及び１％TRITONX-100水溶液２００μＬを加えてよく混合した。得られた混合液のうち１００μＬを９６ウェルプレート（黒色）のウェルに移した。各ウェルにPicoGreen（登録商標）溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーで２００倍希釈したもの）１００μＬを加えて混合し、遮光下、室温で５分間放置した後に、プレートリーダーで蛍光強度を測定し、検量線を作成した。得られた検量線は、ｓｉＲＮＡ濃度が１．４８μＭから２ｎＭまでの範囲がリニアであったため、この範囲で試料の測定を行った。
【００５３】
II−２−２．試料の測定：
各試料を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）によりｓｉＲＮＡ濃度が１μＭとなるように希釈して（規格化して）用いた。この溶液５００μＬを超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、１時間）処理してミセルを沈殿させ、上清５０μＬを静かに採取した。得られた上清について、上記「II−２−１．検量線の作成」に記載の手法で蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度を上記の検量線と照合することで、各試料由来の上清中に存在するｓｉＲＮＡ濃度である規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度を算出した。次式より、各試料中のミセルのｓｉＲＮＡ内包率を求めた。
ｓｉＲＮＡ内包率（％）＝（１−ｘ）×１００
ｘ：規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度（μＭ）
【００５４】
II−２−３．結果：
得られたｓｉＲＮＡ内包率の結果を表２に示す。参考例１、実施例１〜３の何れの医薬組成物を用いた場合でも、超遠心後の上清中に存在するｓｉＲＮＡは殆どなく、ほぼ全てのｓｉＲＮＡがミセルに内包されていた。
【００５５】
【表２】
【００５６】
II−３．封入安定性の評価：
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１及び実施例３の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００５７】
各試料に対して、アニオン性高分子であるデキストラン硫酸を添加し、デキストラン硫酸との置換によりミセルから放出されたｓｉＲＮＡの比率（ｓｉＲＮＡ放出率）を測定することにより、各試料の封入安定性を評価した。より具体的には、次のように評価を行った。各試料に対してデキストラン硫酸を過剰量（ｓｉＲＮＡに対し電荷比で８０倍）加えた後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）によりｓｉＲＮＡ濃度が１μＭとなるように希釈（規格化）した。この溶液５００μＬを超遠心（１００，０００×ｇ、４℃、１時間）処理してミセルを沈殿させ、上清５０μＬを採取した。この上清について、上記「II−２−１．検量線の作成」に記載の手法で蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度を上記「II−２．内包率の測定」の検量線と照合することで、各試料由来の上清中に存在する規格化されたｓｉＲＮＡ濃度を算出し、これを各試料のミセルから放出されたｓｉＲＮＡ量とした。次式に従って、ｓｉＲＮＡ放出率（ミセルに内包されたｓｉＲＮＡに対する、デキストラン硫酸との置換によりミセルから放出されたｓｉＲＮＡの比率）を求めた。
ｓｉＲＮＡ放出率（％）＝｛（ｙ−ｘ）／１｝｛ｙ−ｘ｝×１００
ｘ：規格化された非内包ｓｉＲＮＡ濃度（μＭ）ｙ：ミセルから放出されたｓｉＲＮＡ量（μＭ）
【００５８】
結果を図３に示す。実施例３の医薬組成物では、参考例１の医薬組成物に比べ、ｓｉＲＮＡ放出率は約半分に減少した。
【００５９】
II−４．血中滞留性評価：
ｓｉＲＮＡとしてＦ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、上記「Ｉ．粒子状医薬組成物の調製」の手順に従って調製した、参考例１及び実施例３の各医薬組成物を試料として、以下の測定に供した。
【００６０】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー）の尾静脈に各試料を投与し、その１時間後に下大静脈から血液２００μｌを採取した。各サンプルの投与量は、マウス体重に対するＦ−ｓｉＲＮＡの比率が１ｍｇ／ｋｇとなるように調整した。採取した血液を４℃、２０００×ｇで１０分遠心し、上清から８０μｌの血漿を得た。この血漿の蛍光強度を、プレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）し、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡを定量して、血中残存性の指標とした。
【００６１】
結果を図４に示す。実施例３の医薬組成物と参考例１の医薬組成物とを比較すると、実施例３の医薬組成物の方が、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡ量が多く、血中滞留性が高かった。
【符号の説明】
【００６２】
１ 医薬組成物
１’ 医薬組成物前駆体
２ ブロックコポリマーユニット
２ａ 親水性ポリマー鎖セグメント
２ｂ 疎水性ポリマー鎖セグメント
３ 荷電脂質
４ 薬物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットと、薬物と、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質とを含有する粒子状医薬組成物であって、
複数の前記ブロックコポリマーユニットが、前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置され、前記荷電脂質が、前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置され、前記薬物が、前記疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在することによって、当該薬物の粒子外への脱落が防止された、粒子状医薬組成物。
【請求項２】
凍結融解を経て形成される、請求項１に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項３】
前記疎水性ポリマー鎖セグメントがポリアミノ酸鎖由来のセグメントである、請求項１又は２に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリアミノ酸鎖の一部又は全部がαヘリックスを形成している、請求項３に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項５】
前記荷電脂質が前記αヘリックスの周辺に分散している、請求項４に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項１】
疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットと、薬物と、薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質とを含有する粒子状医薬組成物であって、
複数の前記ブロックコポリマーユニットが、前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置され、前記荷電脂質が、前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置され、前記薬物が、前記疎水性ポリマー鎖セグメントよりも粒子内側に存在することによって、当該薬物の粒子外への脱落が防止された、粒子状医薬組成物。
【請求項２】
凍結融解を経て形成される、請求項１に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項３】
前記疎水性ポリマー鎖セグメントがポリアミノ酸鎖由来のセグメントである、請求項１又は２に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリアミノ酸鎖の一部又は全部がαヘリックスを形成している、請求項３に記載の粒子状医薬組成物。
【請求項５】
前記荷電脂質が前記αヘリックスの周辺に分散している、請求項４に記載の粒子状医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１６２５１２（Ｐ２０１１−１６２５１２Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９４８６（Ｐ２０１０−２９４８６）
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【特許番号】特許第４６５３２４２号（Ｐ４６５３２４２）
【特許公報発行日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【出願人】（５９７１４４６７９）ナノキャリア株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【特許番号】特許第４６５３２４２号（Ｐ４６５３２４２）
【特許公報発行日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【出願人】（５９７１４４６７９）ナノキャリア株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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