精製血清アルブミン及び免疫学的測定方法
【課題】ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供する。
【解決手段】免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミン。
【解決手段】免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿等に含まれる微量物質の測定方法として、免疫学的測定方法が採用されている。免疫学的測定方法は、抗原抗体反応の特異的な強い結合に基づくものであり、様々な物質が混在する試料からでも、目的物質を特異的に感度よく測定することが可能である。
しかし、近年、血液中の癌マーカー、ウイルス等の抗原、細菌やウイルスに対する抗体等の極微量成分を測定するニーズが高まってきており、免疫学的測定方法の更なる高感度化が強く求められるようになってきた。
【０００３】
免疫学的測定方法の高感度化を実現する試みは、例えば、測定試薬中に反応促進剤を添加する方法（特許文献１）、反応系中に不活性なタンパク質を多量に添加する方法（特許文献２）、不溶性担体に抗原又は抗体を固定化し免疫学的に不活性なタンパク質等でブロッキングする際に、ブロッキング剤を熱により変性させる方法（特許文献３）等が提案されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載された反応促進剤を添加する方法では、非特異的な反応を誘発することがあるという問題がある。
一方、特許文献２、３に記載された方法では、非特異的な反応を防止するためのブロッキング剤として血清由来のアルブミンを用いることが一般的である。しかしながら、血清アルブミンは、ロット差により反応性が大きく異なったり、充分に効果が得られなかったりすることがあるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平４−１２２８５８号公報
【特許文献２】特開２０００−４６８２８号公報
【特許文献３】特開平１０−１９７５３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明２は、免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンである。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分、又は、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液として用いた場合には、ロ
ット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
この理由については現時点では定かではない。血液中での血清アルブミンは、通常はビリルビン（黄色色素成分）や遊離脂肪酸等を吸着し、これらを運搬する役目を担っている。従来の血清アルブミンのロット差は、これらの吸着物の有無及び量比で起こっていたのではないかと考えている。本発明１、２の要件を満たす画分は、吸着物が極めて少ない画分であって、これを主成分とする精製血清アルブミンを用いることにより反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定が実現されるのではないかと考えられる。
【００１０】
本発明１の精製血清アルブミンは、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする。好ましくは１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が８．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンであり、より好ましくは１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が７．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンである。
血清アルブミンのこのような画分は、ビリルビン（黄色色素成分、吸収波長４３８ｎｍ（ＢＳＡ結合型ビリルビンの吸収波長は４６３ｎｍ））等の吸着が極めて少ない画分であり、このような画分を主成分とする本発明の精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
【００１１】
混入が許される他の画分の量比は、画分により異なる。１２７Ｔ．Ｕ．での波長７００ｎｍにおける吸光度変化量が０．０６Ａｂｓ以上を維持できる割合を表５及び図１より求めた。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて１３．５ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の４５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて２０．０ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の１５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて２６．０ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の５重量％程度まで混入可能である。
【００１２】
なお、本明細書においてＴ．Ｕ．はトレポネーマ抗体測定キットであるメディエースＴＰＬＡ（積水メディカル社製）により測定される抗トレポネーマ抗体価の単位であるＴＩＴＥＲ ＵＮＩＴＳの略称である。ＷＨＯ標準品（ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＴＡＮＤＡＲＤ ｆｏｒ ＳＹＰＨＩＬＩＴＩＣ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＵＭ［１ｓｔ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ］、ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ １９５８）を測定した場合、１Ｔ．Ｕ．＝２ｍＩＵとなる。また、１０Ｔ．Ｕ．以上を示すものを陽性とする。
【００１３】
本発明２の精製血清アルブミンは、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする。好ましくは１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．８ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンであり、より好ましくは１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．７ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清
アルブミンである。血清アルブミンのこのような画分を主成分とする本発明の精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
【００１４】
なお、血清アルブミンの１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量は、例えば、ビリルビン測定試薬（積水メディカル社製、「オートセラＢＩＬ−２」、「オートセラＤ−ＢＩＬ−２」）を用いたアゾビリルビン法により測定することができる。
【００１５】
混入が許される他の画分の量比は、画分により異なる。１２７Ｔ．Ｕ．での波長７００ｎｍにおける吸光度変化量が０．０６Ａｂｓ以上を維持できる割合を表５及び図１より求めた。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて１．５ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の４５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて２．０ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の１５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて２．７ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の５重量％程度まで混入可能である。
【００１６】
上記１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分、又は、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度の溶出液を用いて溶出させることにより得ることができる。
【００１７】
本発明の精製血清アルブミンの原料となる血清アルブミンは、動物血清由来のアルブミンであって、具体的には例えば、ヒト、牛、馬、羊等の大型哺乳動物の血清由来のものが好適である。なかでも、安価で大量に入手できることから、牛血清由来の血清アルブミンが特に好適である。
また、上記血清アルブミンは、陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行う前に、コーン変法やヒートショック法等で粗精製されていることが好ましい。
【００１８】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体は特に限定されず、例えば、弱陰イオン性のＤＥＡＥ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＡＮＸ Ｓｅｐａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗや、強陰イオン性のＱ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ等が挙げられる。
【００１９】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体の粒径の好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は２００μｍである。上記カラムの担体の粒径が１０μｍ未満であると、バックプレッシャーが上昇し、精製時の流速を遅くせざるを得なくなることがある。上記カラムの担体の粒径が２００μｍを超えると、分離能が悪くなることがある。上記カラムの担体の粒径のより好ましい下限は４５μｍ、より好ましい上限は１６５μｍである。
【００２０】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムは、例えば、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ ＦＦ、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＡＮＸ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０Ｑ ＦＦ（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）等の市販品を用いてもよい。
【００２１】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製において血清アルブミンをカラム担体に結合させる際に用いられる緩衝液（以下、結合液ともいう）は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
上記緩衝液の濃度は、通常５〜１５０ｍＭの範囲で用いられる。
上記緩衝液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８がより好ましい。
【００２２】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いられる溶出液としては、塩濃度が１５０ｍＭ以下のものが挙げられ、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等に塩濃度が１５０ｍＭ以下になるように塩が加えられたものが挙げられる。
上記塩は特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）等が挙げられる。
上記溶出液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８がより好ましい。
ただし、通常は、結合液と同じ緩衝液に塩が加えられたものが用いられる。
【００２３】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法の好ましい１例を説明する。
まず、血清アルブミンを結合液（例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加した溶液を調製する。
次いで、該溶液を結合液で平衡化した陰イオン交換カラムに添加し、結合液を流しながら血清アルブミンを陰イオン交換カラムに吸着させる。
次いで、塩濃度が１５０ｍＭ以下である溶出液を流して血清アルブミンを溶出させ、精製血清アルブミンを得る。
【００２４】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製により得られた精製血清アルブミンは、更に、透析法やゲルろ過法等による精製を行ってもよい。
【００２５】
本発明の精製血清アルブミンは、ロット差が極めて少ないものである。
本発明の精製血清アルブミンを免疫学的測定方法におけるブロッキング剤又は不溶性担体の懸濁液として用いれば、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
本発明の精製血清アルブミンを用いてなる免疫学的測定試薬もまた、本発明の１つである。
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液として、本発明の精製血清アルブミンを用いる免疫学的測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンを主成分とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンをゲルろ過によって精製した単量体は、更に免疫学的測定試薬の反応性を向上するために用いられる。
【００２６】
本発明の免疫学的測定法について更に詳しく説明する。
本発明の免疫学的測定法の対象とする被測定物質は、例えば、生体試料中の抗原又は抗体が挙げられる。具体的には例えば、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）由来抗原又は抗体、ＨＩＶ抗原又は抗体、梅毒由来抗体、α−フェトプロテイン等の癌マーカー、インシュリン等のホルモン、オータコイド等が挙げられる。
【００２７】
なかでも、梅毒由来抗原である抗トレポネーマ・パリダム抗体を被測定物質としたときに特に効果的である。
上記抗トレポネーマ・パリダム抗体測定系に用いる抗原は、菌体破砕物であってもよく、精製物であってもよい。また、遺伝子組み換え技術により人工的に合成されたものを１種又はそれ以上組み合わせたものでもよい。
【００２８】
本発明の免疫学的測定法は特に限定されないが、不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものを用いる方法が好適である。
上記不溶性担体は特に限定されず、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等が挙げられる。なかでも有機高分子粉末が好適である。
上記有機高分子粉末は特に限定されず、例えば、天然高分子粉末、合成高分子粉末等が挙げられる。
上記天然高分子粉末は特に限定されず、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が挙げられる。
上記合成高分子粉末は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。
また、上記不溶性担体は、表面にスルホン酸基やカルボキシル基等を導入したものも用いることができる。
【００２９】
上記不溶性担体は、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が特に好適である。
上記ラテックス粒子の粒径は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５μｍ、好ましい上限は１．５μｍである。上記ラテックス粒子の粒径が０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがある。上記ラテックス粒子の粒径が１．５μｍを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。上記ラテックス粒子の粒径のより好ましい下限は０．１μｍ、より好ましい上限は０．８μｍである。
【００３０】
不溶性担体に抗原又は抗体を担持させる方法は特に限定されず、物理的、化学的結合により担持させる従来公知の方法を用いることができる。
【００３１】
本発明の免疫学的測定法においては、本発明の精製血清アルブミンを上記不溶性担体（ラテックス粒子）に抗原又は抗体を担持させたものに対してブロッキング剤として用いたり、上記不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものの懸濁液として用いたりする。
【００３２】
このようにして得られた抗原又は抗体を担持させたラテックス粒子懸濁液に対して、検体を添加し、一定時間反応させる。反応後にラテックス粒子に担持された抗原又は抗体と検体中の被測定物質との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより、検体中の被測定物質を測定することができる。
【００３３】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法は特に限定されず、用いる不溶性担体の粒子の大きさ、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度、透過光強度等の増減を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。
上記測定を行う際の光の波長は、３００〜９００ｎｍが好ましい。
【００３４】
上記の光学的測定方法に用いる装置は、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられ、一般的に使用されている生化学自動分析機であればいずれのものであっても用いることができる。
【００３５】
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法は、通常、検体とラテックス粒子懸濁液とを含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラ等で撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】表５の結果を横軸を混入ＢＳＡ比率、縦軸を吸光度変化量としてプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（１）精製血清アルブミンの調製
市販の牛血清アルブミン（セロロジカル社製、「Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ」、以下、「未精製ＢＳＡ」ともいう、Ｌｏｔ８３）を結合液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加し、１５％未精製ＢＳＡ溶液を調整した。
得られた１５％未精製ＢＳＡ溶液５ｍＬを、結合液で平衡化した市販の陰イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、「ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ」４８０ｍＬ／「ＸＫ５０」）に添加し、結合液を４ｍＬ／ｍｉｎで流しながらＢＳＡをカラムに吸着させた。次いで、塩化ナトリウム濃度が８０ｍＭになるように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和した溶出液を、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、８０ｍＭの塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分を得た。また、これとは別に、１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後７３．３〜７４．５分（塩濃度６９．６〜７２．０ｍＭ分画）に溶出されたアルブミン画分を得た。なお、得られたアルブミン画分の塩濃度は、カラム容量を考慮し、カラムから溶出されたアルブミン溶液中の塩化ナトリウム濃度を示した。
【００４０】
得られた画分溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、１％となるように調整した。得られた精製血清アルブミンの１％溶液について波長４６３ｎｍでの吸光度を標準セル（ジーエルサイエンス社製、「Ｓ１０−ＵＶ」、光路長１．０ｃｍ）を用いて測定したところ、それぞれ１．３ｍＡｂｓ、５．１ｍＡｂｓであった。
また、得られた精製血清アルブミンについて、ビリルビン測定試薬（積水メディカル社製、「オートセラＢＩＬ−２」、「オートセラＤ−ＢＩＬ−２」）を用いたアゾビリルビン法により、ＢＳＡ１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量を測定したところ、０．１ｍｍｏｌ、０．５ｍｍｏｌであった。
以下、それぞれを「精製ＢＳＡ（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）」、「精製ＢＳＡ（５．１ｍＡｂｓ／０．５ｍｍｏｌ）」ともいう。
【００４１】
（２）抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５０μｇ／ｍＬの蛋白濃度で溶解した抗トレポネーマ・パリダム抗原液４００μＬを平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０（ｗ／ｖ）％、積水化学工業社製）１００μＬに添加し、４℃にて１時間攪拌した。
次いで、精製ＢＳＡ（５．１ｍＡｂｓ／０．５ｍｍｏｌ）溶液２ｍＬを添加し、１時間攪拌した。得られた液体を１０℃にて１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿物を、精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）４ｍＬに添加し、ラテックスを懸濁させることにより抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製し
た。
【００４２】
（実施例２）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後８７．７〜８８．９分（塩濃度９８．４〜１００．８ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（０．９ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４３】
（実施例３）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１０２．１〜１０３．３分（塩濃度１２７．２〜１２９．６ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（３．３ｍＡｂｓ／０．３ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４４】
（比較例１）
ＢＳＡ溶液を陰イオン交換クロマト精製せずに（以下、未精製ＢＳＡという）用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
また、未精製ＢＳＡの１％溶液について、実施例１と同様にして測定した波長４６３ｎｍでの吸光度は９．８ｍＡｂｓ、ＢＳＡ１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量は、１．０ｍｍｏｌであった。
【００４５】
（比較例２）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１１６．５〜１１７．７分（塩濃度１５６．０〜１５８．４ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（９．８ｍＡｂｓ／１．０ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４６】
（比較例３）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１３０．９〜１３２．１分（塩濃度１８４．８〜１８７．２ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（１７．９ｍＡｂｓ／１．９ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４７】
（比較例４）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１４５．３〜１４６．５分（塩濃度２１３．６〜２１６．０ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（２４．９ｍＡｂｓ／２．６ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４８】
（評価）
実施例１〜３、比較例１〜４にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００４９】
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液の測定
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表１に示した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）陰性検体測定
生理食塩水及び陰性検体１〜１０を検体とした以外は（１）と同様にして吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、（１）の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。結果を表２に示した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
表１、２より、実施例で調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いた場合には、比較例で調製したものを用いた場合に比べて反応性が高く、かつ、非特異反応が少ないことがわかった。
【００５４】
（実施例４）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を準備した。これらの３種のロットの牛血清アルブミンの各々について実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００５５】
（比較例５）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を未精製のまま用いたこと以外は、比較例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００５６】
（評価）
実施例４、比較例５にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００５７】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表３に示した。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３より、実施例で調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いた場合には、比較例で調製したものを用いた場合に比べてロット差が少ないことが分かった。
【００６０】
（実施例５）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）を濃縮し、市販のゲルろ過カラムＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に添加し、溶離液として１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてゲルろ過精製し、その単量体画分のみからなるＢＳＡを用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６１】
（実施例６）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には実施例１で得られた精製ＢＳＡ（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）溶液を用いたこと以外は実施例５と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６２】
（実施例７）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には未精製ＢＳＡ溶液を用いた以外は実施例５と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６３】
（評価）
実施例５〜７にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００６４】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表４に示した。
【００６５】
【表４】
【００６６】
表４より、ゲルろ過精製することで更に反応性が向上することが分かった。
【００６７】
（参考例１〜１０）
ブロッキング剤として表５に記載した比率で混合したＢＳＡ溶液を用いた以外は実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６８】
（評価）
参考例１〜１０にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００６９】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表５に示した。
また、横軸を混入ＢＳＡ比率、縦軸を吸光度変化量として表５の結果をプロットしたグラフを図１に示した。
【００７０】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿等に含まれる微量物質の測定方法として、免疫学的測定方法が採用されている。免疫学的測定方法は、抗原抗体反応の特異的な強い結合に基づくものであり、様々な物質が混在する試料からでも、目的物質を特異的に感度よく測定することが可能である。
しかし、近年、血液中の癌マーカー、ウイルス等の抗原、細菌やウイルスに対する抗体等の極微量成分を測定するニーズが高まってきており、免疫学的測定方法の更なる高感度化が強く求められるようになってきた。
【０００３】
免疫学的測定方法の高感度化を実現する試みは、例えば、測定試薬中に反応促進剤を添加する方法（特許文献１）、反応系中に不活性なタンパク質を多量に添加する方法（特許文献２）、不溶性担体に抗原又は抗体を固定化し免疫学的に不活性なタンパク質等でブロッキングする際に、ブロッキング剤を熱により変性させる方法（特許文献３）等が提案されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載された反応促進剤を添加する方法では、非特異的な反応を誘発することがあるという問題がある。
一方、特許文献２、３に記載された方法では、非特異的な反応を防止するためのブロッキング剤として血清由来のアルブミンを用いることが一般的である。しかしながら、血清アルブミンは、ロット差により反応性が大きく異なったり、充分に効果が得られなかったりすることがあるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平４−１２２８５８号公報
【特許文献２】特開２０００−４６８２８号公報
【特許文献３】特開平１０−１９７５３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明２は、免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンである。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分、又は、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液として用いた場合には、ロ
ット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
この理由については現時点では定かではない。血液中での血清アルブミンは、通常はビリルビン（黄色色素成分）や遊離脂肪酸等を吸着し、これらを運搬する役目を担っている。従来の血清アルブミンのロット差は、これらの吸着物の有無及び量比で起こっていたのではないかと考えている。本発明１、２の要件を満たす画分は、吸着物が極めて少ない画分であって、これを主成分とする精製血清アルブミンを用いることにより反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定が実現されるのではないかと考えられる。
【００１０】
本発明１の精製血清アルブミンは、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする。好ましくは１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が８．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンであり、より好ましくは１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が７．０ｍＡｂｓ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンである。
血清アルブミンのこのような画分は、ビリルビン（黄色色素成分、吸収波長４３８ｎｍ（ＢＳＡ結合型ビリルビンの吸収波長は４６３ｎｍ））等の吸着が極めて少ない画分であり、このような画分を主成分とする本発明の精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
【００１１】
混入が許される他の画分の量比は、画分により異なる。１２７Ｔ．Ｕ．での波長７００ｎｍにおける吸光度変化量が０．０６Ａｂｓ以上を維持できる割合を表５及び図１より求めた。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて１３．５ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の４５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて２０．０ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の１５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓを超えて２６．０ｍＡｂｓ以下である画分の場合には、全体の５重量％程度まで混入可能である。
【００１２】
なお、本明細書においてＴ．Ｕ．はトレポネーマ抗体測定キットであるメディエースＴＰＬＡ（積水メディカル社製）により測定される抗トレポネーマ抗体価の単位であるＴＩＴＥＲ ＵＮＩＴＳの略称である。ＷＨＯ標準品（ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＴＡＮＤＡＲＤ ｆｏｒ ＳＹＰＨＩＬＩＴＩＣ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＵＭ［１ｓｔ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ］、ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ １９５８）を測定した場合、１Ｔ．Ｕ．＝２ｍＩＵとなる。また、１０Ｔ．Ｕ．以上を示すものを陽性とする。
【００１３】
本発明２の精製血清アルブミンは、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする。好ましくは１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．８ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンであり、より好ましくは１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．７ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清
アルブミンである。血清アルブミンのこのような画分を主成分とする本発明の精製血清アルブミンをブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
なお、主成分とするとは、上記画分のみからなることが好ましいものの、本発明の目的効果を阻害しない範囲においては、他の画分が混入してもかまわないことを意味する。
【００１４】
なお、血清アルブミンの１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量は、例えば、ビリルビン測定試薬（積水メディカル社製、「オートセラＢＩＬ−２」、「オートセラＤ−ＢＩＬ−２」）を用いたアゾビリルビン法により測定することができる。
【００１５】
混入が許される他の画分の量比は、画分により異なる。１２７Ｔ．Ｕ．での波長７００ｎｍにおける吸光度変化量が０．０６Ａｂｓ以上を維持できる割合を表５及び図１より求めた。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて１．５ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の４５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて２．０ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の１５重量％程度まで混入可能である。
例えば、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌを超えて２．７ｍｍｏｌ以下である画分の場合には、全体の５重量％程度まで混入可能である。
【００１６】
上記１％水溶液としたときに光路長が１．０ｃｍの石英セルを用い４６３ｎｍの波長にて測定した吸光度が９．０ｍＡｂｓ以下である画分、又は、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度の溶出液を用いて溶出させることにより得ることができる。
【００１７】
本発明の精製血清アルブミンの原料となる血清アルブミンは、動物血清由来のアルブミンであって、具体的には例えば、ヒト、牛、馬、羊等の大型哺乳動物の血清由来のものが好適である。なかでも、安価で大量に入手できることから、牛血清由来の血清アルブミンが特に好適である。
また、上記血清アルブミンは、陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行う前に、コーン変法やヒートショック法等で粗精製されていることが好ましい。
【００１８】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体は特に限定されず、例えば、弱陰イオン性のＤＥＡＥ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＡＮＸ Ｓｅｐａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗや、強陰イオン性のＱ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ等が挙げられる。
【００１９】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体の粒径の好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は２００μｍである。上記カラムの担体の粒径が１０μｍ未満であると、バックプレッシャーが上昇し、精製時の流速を遅くせざるを得なくなることがある。上記カラムの担体の粒径が２００μｍを超えると、分離能が悪くなることがある。上記カラムの担体の粒径のより好ましい下限は４５μｍ、より好ましい上限は１６５μｍである。
【００２０】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムは、例えば、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ ＦＦ、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＡＮＸ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０Ｑ ＦＦ（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）等の市販品を用いてもよい。
【００２１】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製において血清アルブミンをカラム担体に結合させる際に用いられる緩衝液（以下、結合液ともいう）は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
上記緩衝液の濃度は、通常５〜１５０ｍＭの範囲で用いられる。
上記緩衝液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８がより好ましい。
【００２２】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いられる溶出液としては、塩濃度が１５０ｍＭ以下のものが挙げられ、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等に塩濃度が１５０ｍＭ以下になるように塩が加えられたものが挙げられる。
上記塩は特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）等が挙げられる。
上記溶出液のｐＨは４〜９が好ましく、５〜８がより好ましい。
ただし、通常は、結合液と同じ緩衝液に塩が加えられたものが用いられる。
【００２３】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法の好ましい１例を説明する。
まず、血清アルブミンを結合液（例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加した溶液を調製する。
次いで、該溶液を結合液で平衡化した陰イオン交換カラムに添加し、結合液を流しながら血清アルブミンを陰イオン交換カラムに吸着させる。
次いで、塩濃度が１５０ｍＭ以下である溶出液を流して血清アルブミンを溶出させ、精製血清アルブミンを得る。
【００２４】
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製により得られた精製血清アルブミンは、更に、透析法やゲルろ過法等による精製を行ってもよい。
【００２５】
本発明の精製血清アルブミンは、ロット差が極めて少ないものである。
本発明の精製血清アルブミンを免疫学的測定方法におけるブロッキング剤又は不溶性担体の懸濁液として用いれば、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
本発明の精製血清アルブミンを用いてなる免疫学的測定試薬もまた、本発明の１つである。
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液として、本発明の精製血清アルブミンを用いる免疫学的測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンを主成分とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンをゲルろ過によって精製した単量体は、更に免疫学的測定試薬の反応性を向上するために用いられる。
【００２６】
本発明の免疫学的測定法について更に詳しく説明する。
本発明の免疫学的測定法の対象とする被測定物質は、例えば、生体試料中の抗原又は抗体が挙げられる。具体的には例えば、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）由来抗原又は抗体、ＨＩＶ抗原又は抗体、梅毒由来抗体、α−フェトプロテイン等の癌マーカー、インシュリン等のホルモン、オータコイド等が挙げられる。
【００２７】
なかでも、梅毒由来抗原である抗トレポネーマ・パリダム抗体を被測定物質としたときに特に効果的である。
上記抗トレポネーマ・パリダム抗体測定系に用いる抗原は、菌体破砕物であってもよく、精製物であってもよい。また、遺伝子組み換え技術により人工的に合成されたものを１種又はそれ以上組み合わせたものでもよい。
【００２８】
本発明の免疫学的測定法は特に限定されないが、不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものを用いる方法が好適である。
上記不溶性担体は特に限定されず、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等が挙げられる。なかでも有機高分子粉末が好適である。
上記有機高分子粉末は特に限定されず、例えば、天然高分子粉末、合成高分子粉末等が挙げられる。
上記天然高分子粉末は特に限定されず、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が挙げられる。
上記合成高分子粉末は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。
また、上記不溶性担体は、表面にスルホン酸基やカルボキシル基等を導入したものも用いることができる。
【００２９】
上記不溶性担体は、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が特に好適である。
上記ラテックス粒子の粒径は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５μｍ、好ましい上限は１．５μｍである。上記ラテックス粒子の粒径が０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがある。上記ラテックス粒子の粒径が１．５μｍを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。上記ラテックス粒子の粒径のより好ましい下限は０．１μｍ、より好ましい上限は０．８μｍである。
【００３０】
不溶性担体に抗原又は抗体を担持させる方法は特に限定されず、物理的、化学的結合により担持させる従来公知の方法を用いることができる。
【００３１】
本発明の免疫学的測定法においては、本発明の精製血清アルブミンを上記不溶性担体（ラテックス粒子）に抗原又は抗体を担持させたものに対してブロッキング剤として用いたり、上記不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものの懸濁液として用いたりする。
【００３２】
このようにして得られた抗原又は抗体を担持させたラテックス粒子懸濁液に対して、検体を添加し、一定時間反応させる。反応後にラテックス粒子に担持された抗原又は抗体と検体中の被測定物質との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより、検体中の被測定物質を測定することができる。
【００３３】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法は特に限定されず、用いる不溶性担体の粒子の大きさ、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度、透過光強度等の増減を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。
上記測定を行う際の光の波長は、３００〜９００ｎｍが好ましい。
【００３４】
上記の光学的測定方法に用いる装置は、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられ、一般的に使用されている生化学自動分析機であればいずれのものであっても用いることができる。
【００３５】
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法は、通常、検体とラテックス粒子懸濁液とを含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラ等で撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】表５の結果を横軸を混入ＢＳＡ比率、縦軸を吸光度変化量としてプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（１）精製血清アルブミンの調製
市販の牛血清アルブミン（セロロジカル社製、「Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ」、以下、「未精製ＢＳＡ」ともいう、Ｌｏｔ８３）を結合液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加し、１５％未精製ＢＳＡ溶液を調整した。
得られた１５％未精製ＢＳＡ溶液５ｍＬを、結合液で平衡化した市販の陰イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、「ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ」４８０ｍＬ／「ＸＫ５０」）に添加し、結合液を４ｍＬ／ｍｉｎで流しながらＢＳＡをカラムに吸着させた。次いで、塩化ナトリウム濃度が８０ｍＭになるように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和した溶出液を、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、８０ｍＭの塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分を得た。また、これとは別に、１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後７３．３〜７４．５分（塩濃度６９．６〜７２．０ｍＭ分画）に溶出されたアルブミン画分を得た。なお、得られたアルブミン画分の塩濃度は、カラム容量を考慮し、カラムから溶出されたアルブミン溶液中の塩化ナトリウム濃度を示した。
【００４０】
得られた画分溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、１％となるように調整した。得られた精製血清アルブミンの１％溶液について波長４６３ｎｍでの吸光度を標準セル（ジーエルサイエンス社製、「Ｓ１０−ＵＶ」、光路長１．０ｃｍ）を用いて測定したところ、それぞれ１．３ｍＡｂｓ、５．１ｍＡｂｓであった。
また、得られた精製血清アルブミンについて、ビリルビン測定試薬（積水メディカル社製、「オートセラＢＩＬ−２」、「オートセラＤ−ＢＩＬ−２」）を用いたアゾビリルビン法により、ＢＳＡ１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量を測定したところ、０．１ｍｍｏｌ、０．５ｍｍｏｌであった。
以下、それぞれを「精製ＢＳＡ（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）」、「精製ＢＳＡ（５．１ｍＡｂｓ／０．５ｍｍｏｌ）」ともいう。
【００４１】
（２）抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５０μｇ／ｍＬの蛋白濃度で溶解した抗トレポネーマ・パリダム抗原液４００μＬを平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０（ｗ／ｖ）％、積水化学工業社製）１００μＬに添加し、４℃にて１時間攪拌した。
次いで、精製ＢＳＡ（５．１ｍＡｂｓ／０．５ｍｍｏｌ）溶液２ｍＬを添加し、１時間攪拌した。得られた液体を１０℃にて１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿物を、精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）４ｍＬに添加し、ラテックスを懸濁させることにより抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製し
た。
【００４２】
（実施例２）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後８７．７〜８８．９分（塩濃度９８．４〜１００．８ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（０．９ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４３】
（実施例３）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１０２．１〜１０３．３分（塩濃度１２７．２〜１２９．６ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（３．３ｍＡｂｓ／０．３ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４４】
（比較例１）
ＢＳＡ溶液を陰イオン交換クロマト精製せずに（以下、未精製ＢＳＡという）用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
また、未精製ＢＳＡの１％溶液について、実施例１と同様にして測定した波長４６３ｎｍでの吸光度は９．８ｍＡｂｓ、ＢＳＡ１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量は、１．０ｍｍｏｌであった。
【００４５】
（比較例２）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１１６．５〜１１７．７分（塩濃度１５６．０〜１５８．４ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（９．８ｍＡｂｓ／１．０ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４６】
（比較例３）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１３０．９〜１３２．１分（塩濃度１８４．８〜１８７．２ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（１７．９ｍＡｂｓ／１．９ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４７】
（比較例４）
１分間に塩化ナトリウム濃度が２ｍＭずつ増加するように２Ｍの塩化ナトリウム溶液を結合液に混和しながら、流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流し、混和開始後１４５．３〜１４６．５分（塩濃度２１３．６〜２１６．０ｍＭ分画）に溶出される精製ＢＳＡ（２４．９ｍＡｂｓ／２．６ｍｍｏｌ）溶液をブロッキング剤として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００４８】
（評価）
実施例１〜３、比較例１〜４にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００４９】
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液の測定
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表１に示した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）陰性検体測定
生理食塩水及び陰性検体１〜１０を検体とした以外は（１）と同様にして吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、（１）の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。結果を表２に示した。
【００５２】
【表２】
【００５３】
表１、２より、実施例で調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いた場合には、比較例で調製したものを用いた場合に比べて反応性が高く、かつ、非特異反応が少ないことがわかった。
【００５４】
（実施例４）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を準備した。これらの３種のロットの牛血清アルブミンの各々について実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００５５】
（比較例５）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を未精製のまま用いたこと以外は、比較例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００５６】
（評価）
実施例４、比較例５にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００５７】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表３に示した。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３より、実施例で調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いた場合には、比較例で調製したものを用いた場合に比べてロット差が少ないことが分かった。
【００６０】
（実施例５）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）を濃縮し、市販のゲルろ過カラムＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に添加し、溶離液として１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてゲルろ過精製し、その単量体画分のみからなるＢＳＡを用いたこと以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６１】
（実施例６）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には実施例１で得られた精製ＢＳＡ（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）溶液を用いたこと以外は実施例５と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６２】
（実施例７）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（１．３ｍＡｂｓ／０．１ｍｍｏｌ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には未精製ＢＳＡ溶液を用いた以外は実施例５と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６３】
（評価）
実施例５〜７にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００６４】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表４に示した。
【００６５】
【表４】
【００６６】
表４より、ゲルろ過精製することで更に反応性が向上することが分かった。
【００６７】
（参考例１〜１０）
ブロッキング剤として表５に記載した比率で混合したＢＳＡ溶液を用いた以外は実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００６８】
（評価）
参考例１〜１０にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
【００６９】
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。
なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表５に示した。
また、横軸を混入ＢＳＡ比率、縦軸を吸光度変化量として表５の結果をプロットしたグラフを図１に示した。
【００７０】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とすることを特徴とする精製血清アルブミン。
【請求項２】
１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いてなることを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項３】
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いることを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項４】
請求項１記載の精製血清アルブミンを主成分とすることを特徴とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬。
【請求項１】
免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とすることを特徴とする精製血清アルブミン。
【請求項２】
１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いてなることを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項３】
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に、１ｍｏｌあたりのビリルビン結合量が０．９ｍｍｏｌ以下である画分を主成分とする精製血清アルブミンを用いることを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項４】
請求項１記載の精製血清アルブミンを主成分とすることを特徴とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−４８８１８（Ｐ２０１０−４８８１８Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７１３１５（Ｐ２００９−２７１３１５）
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５３２４７２（Ｐ２００９−５３２４７２）の分割
【原出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５３２４７２（Ｐ２００９−５３２４７２）の分割
【原出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
[ Back to top ]