糖の製造方法
【課題】セルロース含有原料から得られるセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供すること。
【解決手段】嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍであるセルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【解決手段】嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍであるセルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルプ等のセルロース含有原料を粉砕して得られるセルロースは、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている（例えば、特許文献１）。セルラーゼ等の酵素を利用してバイオマスから糖を製造する際には、その前処理工程としてセルロース結晶構造が非晶化されたセルロースにすることが有用である。例えば、特許文献１には、塩化リチウム／ジメチルアセトアミド等のセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。
特許文献２の実施例１及び４には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献３の実施例１〜３には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献４の実施例１及び２には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献５には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
【０００３】
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献６）、過酸化水素を用いて熱水処理したセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法（特許文献７及び８）が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２３１５２号公報
【特許文献２】特開昭６２−２３６８０１号公報
【特許文献３】特開２００３−６４１８４号公報
【特許文献４】特開２００４−３３１９１８号公報
【特許文献５】特開２００５−６８１４０号公報
【特許文献６】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献７】特開２００７−７４９９２号公報
【特許文献８】特開２００７−７４９９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、セルロース含有原料から得られるセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、かつ平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理した後にセルラーゼ等の酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得る、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【発明の効果】
【０００８】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、セルロース含有原料から、セルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率良く得ることができるので、酵素の反応により糖を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースのセルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
【００１０】
〔セルロース含有原料〕
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９重量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の酵素処理による糖の生産を効率よく行うことができる。
【００１１】
〔セルロースＩ型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低下させたものである。結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
結晶化度が３３％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でＩ型結晶が検出されない０％が特に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
【００１２】
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
【００１３】
本発明に用いるセルロース含有原料としては、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものである。嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3未満のセルロース含有原料を用いる場合には前処理を行い、嵩密度を１００〜５００ｋｇ／ｍ3にすることが好ましい。
前処理として押出機処理を行うことができる。該押出機へセルロース含有原料を投入する際には、チップ状に粗粉砕しておくことが好ましい。チップ状にしたセルロース含有原料の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ角、より好ましくは１〜３０ｍｍ角である。１〜５０ｍｍ角のチップ状に粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができる。
【００１４】
セルロース含有原料をチップ状に粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。ロータリーカッターを使用する場合、得られるチップ状セルロース含有原料の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、１〜５０ｍｍが好ましく、１〜３０ｍｍがより好ましい。スクリーンの目開きが１ｍｍ以上であれば、セルロース含有原料が綿状化することがなく、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な嵩高さを有するセルロース含有原料が得られ取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが５０ｍｍ以下であれば、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な大きさを有するために押出機処理において負荷を低減することができる。
【００１５】
前記セルロース含有原料を押出機で処理することにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料を得ることができる。更に押出機で処理することにより、セルロース含有原料に圧縮せん断力を作用させ、セルロースの結晶構造を破壊して粉末化させることができる。
圧縮せん断力を作用させてセルロース含有原料を機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、セルロース含有原料が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料が得られ、取扱い性が向上する。
【００１６】
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
【００１７】
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
【００１８】
処理方法としては、セルロース含有原料、好ましくは前記チップ状セルロース含有原料を押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、１０ｓｅｃ-1以上が好ましく、２０〜３００００ｓｅｃ-1がより好ましく、５０〜３０００ｓｅｃ-1が特に好ましい。せん断速度が１０ｓｅｃ-1以上であれば、有効に高嵩密度化が進行する。その他の処理条件としては、特に制限はなく、好ましくは処理温度５〜２００℃である。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、セルロース含有原料を高嵩密度化する観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
【００１９】
押出機処理後に得られる粉末状セルロース含有原料の平均粒径としては、１ｍｍ以下であり、好ましくは０．７ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下である。この平均粒径が１ｍｍ以下であれば、次工程で行う粉砕機中に供給する際に、粉砕機中にセルロース含有原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、０．０１ｍｍ以上であり、好ましくは０．０５ｍｍ以上である。これらの観点から、この平均粒径としては、０．０１〜１ｍｍであり、好ましくは０．０１〜０．７ｍｍ、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｍである。
【００２０】
また、押出機処理後に得られるセルロース含有原料の嵩密度としては、１００ｋｇ／ｍ3以上であり、好ましくは１２０ｋｇ／ｍ3以上、より好ましくは１５０ｋｇ／ｍ3以上である。この嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上であれば、セルロース含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、次工程の粉砕機へ原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、５００ｋｇ／ｍ3以下であり、好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは３５０ｋｇ／ｍ3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、１００〜５００ｋｇ／ｍ3であり、好ましくは１２０〜４００ｋｇ／ｍ3、より好ましくは１５０〜３５０ｋｇ／ｍ3である。なお、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径は、実施例に記載の方法により測定することができる。
【００２１】
〔非晶化処理〕
嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロース中のセルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減する。粉砕機で処理することにより、セルロース含有原料を更に粉砕し、かつ結晶化度を低下させ、更にはセルロースを効率的に非晶化させることができる。
粉砕機としては媒体式粉砕機を好ましく用いることができる。媒体式粉砕機には容器駆動式粉砕機と媒体撹拌式粉砕機とがある。容器駆動式粉砕機としては転動ミル、振動ミル、遊星ミル、遠心流動ミル等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、振動ミルが好ましい。媒体撹拌式粉砕機としてはタワーミル等の塔型粉砕機；アトライター、アクアマイザー、サンドグラインダー等の撹拌槽型粉砕機；ビスコミル、パールミル等の流通槽型粉砕機；流通管型粉砕機；コボールミル等のアニュラー型粉砕機；連続式のダイナミック型粉砕機等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、撹拌槽型粉砕機が好ましい。媒体攪拌式粉砕機を用いる場合の攪拌翼の先端の周速は、好ましくは０．５〜２０ｍ／ｓ、より好ましくは１〜１５ｍ／ｓである。
粉砕機の種類は「化学工学の進歩 第３０集 微粒子制御」（社団法人 化学工学会東海支部編、１９９６年１０月１０日発行、槇書店）を参照することができる。
処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
【００２２】
粉砕機の媒体の材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
粉砕機が振動ミルであって、媒体がボールの場合には、ボールの外径としては、好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ボールの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ボールのかけら等が混入してセルロース含有原料が汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。媒体としては、ボール以外にもロッドやチューブ等の媒体を用いることができる。
ボールの充填率は、振動ミルの機種により好適な充填率が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロース含有原料とボールとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの攪拌部の容積に対するボールの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ボールの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは５分〜７２時間である。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
【００２３】
上記の処理方法により、セルロース含有原料を出発原料として、セルロースＩ型結晶化度が３３％以下の非晶化セルロースを効率よく得ることができ、また、粉砕機処理の際に、粉砕機の内部にセルロース含有原料が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
【００２４】
〔セルラーゼ等の酵素による糖化〕
上述した処理にて得られた非晶化セルロースはその結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとはセルロースのβ-1,4-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
【００２５】
かかる糖化の処理に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては特に制限はなく、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。
セルラーゼの例としてはセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）等のトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、またはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N115（FERM P-19726）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N659（FERM P-19730）等の各株由来のセルラーゼ、更にはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム セルロリティクス（Acremonium celluloriticus）、イルペックス ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼを用いることにより、効率良く糖を製造することができる。
【００２６】
また、ヘミセルラーゼの例としてはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）、バチルス アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更にはサーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、メガザイム社製β-グルコシダーゼ）やアグロバクテリウム（Agrobacterium）、サーモトガ マリチマ（Thermotoga maritima）、トリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
【００２７】
上述した処理により得られた非晶化セルロースをセルラーゼによる酵素処理で糖化する場合の反応条件について、前処理により得られた非晶化セルロースの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。
例えば、セルラーゼとしてノボザイム社製のセルクラスト１．５Lを使用し、パルプ由来の結晶化度０％のセルロースを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対してセルクラスト１．５Lを０．００１〜１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質として０．０００１７〜２．５％相当）となる様に添加し、ｐH２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐHを選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくはｐH３〜７、特に好ましくはｐH５付近）の緩衝液中、反応温度１０℃〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは約５０℃）で、反応時間３０分〜５日間、好ましくは０．５〜３日間反応させることにより、糖を製造することができる。
【実施例】
【００２８】
セルロース含有原料、及び非晶化セルロースの平均粒径、嵩密度及びＸ線回折強度の測定は、下記に記載の方法で行った。また、非晶化セルロースまたは粉末セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
（１）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度２５℃にて測定した。
（２）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。ただし綿状化したサンプルについては、ふるいを通さずにシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。
【００２９】
（３）結晶化度の算出
セルロースＩ型結晶化度は、サンプルのＸ線回折強度を、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、前記計算式に基づいて算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
【００３０】
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／試料採取量（ｇ）］×１００
【００３１】
（６）糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の粉末セルロースまたは非晶化セルロース基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（防腐剤として添加）、蓋つきスクリュー管（実施例１及び２、比較例１：No.3, φ21×45ｍｍ マルエム社、実施例３~６、比較例２〜４：No.5, φ27×55ｍｍ マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら１〜３日間反応した。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量および上清液に遊離した糖量、または還元糖量を、以下に示すフェノール・硫酸法、ＤＮＳ法、またはＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
【００３２】
（７）フェノール硫酸法（生物工学実験書 培風館）による糖の定量
イオン交換水で適宜倍率に希釈した上清液０．１ｍLに対し、５％（ｗ／ｗ）フェノール溶液０．１ｍLを加えて混合した後、さらに硫酸を０．５ｍL加えて良く混合した。２０分間室温に放置した後、波長４９０ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の全糖量を計算した。
【００３３】
（８）ＤＮＳ法（生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
【００３４】
（９）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED４０パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
【００３５】
（１０）タンパク質の定量
DCプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
【００３６】
製造例１
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、結晶化度８１％、セルロース含有量９６質量％（パルプから水を除いた残余の成分中の量）、水分含量７質量％）、をシュレッダー（株式会社明光商会製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。
【００３７】
〔押出機処理〕
得られたチップ状パルプを二軸押出機（株式会社スエヒロＥＰＭ製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、３０〜７０℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径１２０μｍ、嵩密度２１９ｋｇ／ｍ3であった。
【００３８】
〔粉砕機処理〕
得られたパルプを、粉砕機としてバッチ式撹拌槽型粉砕機（五十嵐機械社製「サンドグラインダー」：容器容積８００ｍＬ、５ｍｍφジルコニアビーズを７２０ｇ充填、充填率２５％、攪拌翼径７０ｍｍ）に１３０ｇ投入した。容器ジャケットに冷却水を通しながら、攪拌回転数２０００ｒｐｍで、２．５時間粉砕処理を行い、非晶化セルロースを得た。操作の際の温度は、３０〜７０℃の範囲であった。
処理終了後、撹拌槽型粉砕機内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを前記撹拌槽型粉砕機から取り出し、７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１１７ｇ（投入量の９０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
製造例２
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、バッチ式振動ミル（中央化工機株式会社製「ＭＢ−１」、容器容積２．８Ｌ、２０ｍｍφジルコニアボールを７．６ｋｇ充填、充填率８０％）に代えて、処理条件として投入量２００ｇ、振動数２０Ｈｚ、全振幅８ｍｍ、処理時間４時間としたこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１４２ｇ（投入量の７１質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
製造例３
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に代えて、処理条件として、投入量１００ｇ、回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、転動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、６３ｇ（投入量の６３質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
製造例４〜８
セルロース含有原料としてパルプに代えて、上質紙（製造例４：セルロース含有量８３質量％、水分含量５．７質量％）、ダンボール（製造例５：セルロース含有量８４質量％、水分含量７．２質量％）、新聞紙（製造例６：セルロース含有量８３質量％、水分含量７．７質量％）、稲わら（製造例７：セルロース含有量５５質量％、水分含量８．０質量％）、雑誌（製造例８：セルロース含有量６０質量％、水分含量４．５質量％）を用いて、製造例１の方法及び条件でシュレッダー処理及び押出機処理を行った。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例４：上質紙／平均粒径７１μｍ／嵩密度２７４ｋｇ／ｍ3、製造例５：ダンボール／平均粒径９３μｍ／嵩密度２１６ｋｇ／ｍ3、製造例６：新聞紙／平均粒径６１μｍ／嵩密度３０３ｋｇ／ｍ3、製造例７：稲わら／平均粒径８２μｍ／嵩密度３３９ｋｇ／ｍ3、製造例８：雑誌／平均粒径７２μｍ／嵩密度４３１ｋｇ／ｍ3であった。
更に、製造例１の方法及び条件でバッチ式攪拌槽型粉砕機処理を行い、それぞれ非晶化セルロース（製造例４：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、製造例５：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、製造例６：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例７：稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ、製造例８：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を得た。
【００４３】
比較製造例１
製造例１と同様に、シュレッダー処理、次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの嵩密度及び平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４４】
比較製造例２
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。前記チップ状パルプは、嵩高く、製造例１の半分の量である６５ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内底部にパルプの固着物が見られた。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１６．９ｇ（投入量の２６．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４５】
比較製造例３
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理した。
得られたパルプは、綿状化し、嵩密度は３３ｋｇ／ｍ3であった。次に、この綿状化したパルプを、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。このパルプは嵩高く、３０ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内部にパルプの付着物は見られなかった。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、２３．４ｇ（投入量の７８．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４６】
比較製造例４
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に１００ｇ投入した。回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、転動ミル処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４７】
比較製造例５
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
比較製造例６
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ハンマーミル（株式会社ダルトン製、「ＳＡＭＰＬＥ―ＭＩＬＬ」）に５００ｇ投入し、回転数１３５００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４９】
比較製造例７
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ピンミル（ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」）に５００ｇ投入し、回転数１３０００ｒｐｍの条件で０．２５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
比較製造例８〜１１
製造例４〜７のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、次にバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行わずに粉末セルロース（比較製造例８：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較製造例９：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較製造例１０：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ、比較製造例１１：稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を得た。
【００５２】
実施例１〜２および比較例１
基質として、実施例１では、前述の製造例１で製造した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）、実施例２では、前述の製造例１の粉砕機処理の処理時間２.５時間を３０分間に代えた以外は同様に調製した非晶化セルロース（結晶化度３０％／平均粒径４６μｍ）を使用した。比較例１の基質として市販の粉末セルロース（KCフロック、日本製紙ケミカル株式会社製、結晶化度７６％、粒径２６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１７％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）中、５０℃で振とう攪拌しながら１〜３日間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量を測定し、上清液の遊離糖をフェノール・硫酸法によって定量（グルコース換算）した。結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
実施例３〜５および比較例２〜４
実施例３〜５として、前述の製造例１の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）を使用した。比較例２〜４として、前述の比較製造例１の条件で調製した粉末パルプ（結晶化度７６％／平均粒径１５６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例３及び比較例２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例４及び比較例３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例５及び比較例４：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
【００５６】
実施例６
実施例３で得られた糖化液上清（反応72時間）を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。
注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。グルコースは保持時間約５．５分、キシロースは約６．５分、キシロビオースは約１４分、セロビオースは約１４．５分にピークが現われた。糖化液上清は１００倍希釈し、１０μＬを注入した。結果を表５に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
実施例７〜９及び比較例５〜７
実施例７〜９として、前述の製造例４〜６で得られた非晶化セルロース（実施例７：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、実施例８：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、実施例９：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ）、及び比較例５〜７として、前述の比較製造例８〜１０で得られた粉末セルロース（比較例５：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較例６：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較例７：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例７〜８及び比較例５〜６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例９及び比較例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１２％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質２％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
実施例１０及び比較例８
実施例１０として、前述の製造例７で得られた非晶化セルロース（稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ）、及び比較例８として、前述の比較製造例１１で得られた粉末セルロース（稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表７に示す。
【００６１】
【表７】
【００６２】
実施例１１及び１２
実施例１１及び１２として、前述の製造例６及び８で得られた非晶化セルロース（実施例１１：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例１２：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１１：１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１２：２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
【００６４】
表１及び表２から、製造例１〜３の非晶化セルロースの製造方法は、比較製造例１〜７に比べて、セルロースの結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができ、生産性に優れることが分かる。また、製造例１〜３で得られた非晶化セルロースは、比較製造例１に比べて、適度な平均粒径を有していた。
表３及び表４の結果から、実施例１〜５に示した本発明の糖の製造方法は比較例１〜４に比べてその生産性が高く、また表５の結果から生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表６〜８の結果から本発明の糖の製造方法はパルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類等、また稲わら等の植物茎・葉類等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルプ等のセルロース含有原料を粉砕して得られるセルロースは、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている（例えば、特許文献１）。セルラーゼ等の酵素を利用してバイオマスから糖を製造する際には、その前処理工程としてセルロース結晶構造が非晶化されたセルロースにすることが有用である。例えば、特許文献１には、塩化リチウム／ジメチルアセトアミド等のセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。
特許文献２の実施例１及び４には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献３の実施例１〜３には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献４の実施例１及び２には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献５には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
【０００３】
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献６）、過酸化水素を用いて熱水処理したセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法（特許文献７及び８）が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２３１５２号公報
【特許文献２】特開昭６２−２３６８０１号公報
【特許文献３】特開２００３−６４１８４号公報
【特許文献４】特開２００４−３３１９１８号公報
【特許文献５】特開２００５−６８１４０号公報
【特許文献６】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献７】特開２００７−７４９９２号公報
【特許文献８】特開２００７−７４９９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、セルロース含有原料から得られるセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、かつ平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理した後にセルラーゼ等の酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得る、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【発明の効果】
【０００８】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、セルロース含有原料から、セルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率良く得ることができるので、酵素の反応により糖を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースのセルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
【００１０】
〔セルロース含有原料〕
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９重量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の酵素処理による糖の生産を効率よく行うことができる。
【００１１】
〔セルロースＩ型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低下させたものである。結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
結晶化度が３３％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でＩ型結晶が検出されない０％が特に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
【００１２】
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
【００１３】
本発明に用いるセルロース含有原料としては、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものである。嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3未満のセルロース含有原料を用いる場合には前処理を行い、嵩密度を１００〜５００ｋｇ／ｍ3にすることが好ましい。
前処理として押出機処理を行うことができる。該押出機へセルロース含有原料を投入する際には、チップ状に粗粉砕しておくことが好ましい。チップ状にしたセルロース含有原料の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ角、より好ましくは１〜３０ｍｍ角である。１〜５０ｍｍ角のチップ状に粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができる。
【００１４】
セルロース含有原料をチップ状に粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。ロータリーカッターを使用する場合、得られるチップ状セルロース含有原料の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、１〜５０ｍｍが好ましく、１〜３０ｍｍがより好ましい。スクリーンの目開きが１ｍｍ以上であれば、セルロース含有原料が綿状化することがなく、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な嵩高さを有するセルロース含有原料が得られ取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが５０ｍｍ以下であれば、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な大きさを有するために押出機処理において負荷を低減することができる。
【００１５】
前記セルロース含有原料を押出機で処理することにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料を得ることができる。更に押出機で処理することにより、セルロース含有原料に圧縮せん断力を作用させ、セルロースの結晶構造を破壊して粉末化させることができる。
圧縮せん断力を作用させてセルロース含有原料を機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、セルロース含有原料が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料が得られ、取扱い性が向上する。
【００１６】
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
【００１７】
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
【００１８】
処理方法としては、セルロース含有原料、好ましくは前記チップ状セルロース含有原料を押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、１０ｓｅｃ-1以上が好ましく、２０〜３００００ｓｅｃ-1がより好ましく、５０〜３０００ｓｅｃ-1が特に好ましい。せん断速度が１０ｓｅｃ-1以上であれば、有効に高嵩密度化が進行する。その他の処理条件としては、特に制限はなく、好ましくは処理温度５〜２００℃である。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、セルロース含有原料を高嵩密度化する観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
【００１９】
押出機処理後に得られる粉末状セルロース含有原料の平均粒径としては、１ｍｍ以下であり、好ましくは０．７ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下である。この平均粒径が１ｍｍ以下であれば、次工程で行う粉砕機中に供給する際に、粉砕機中にセルロース含有原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、０．０１ｍｍ以上であり、好ましくは０．０５ｍｍ以上である。これらの観点から、この平均粒径としては、０．０１〜１ｍｍであり、好ましくは０．０１〜０．７ｍｍ、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｍである。
【００２０】
また、押出機処理後に得られるセルロース含有原料の嵩密度としては、１００ｋｇ／ｍ3以上であり、好ましくは１２０ｋｇ／ｍ3以上、より好ましくは１５０ｋｇ／ｍ3以上である。この嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上であれば、セルロース含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、次工程の粉砕機へ原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、５００ｋｇ／ｍ3以下であり、好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは３５０ｋｇ／ｍ3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、１００〜５００ｋｇ／ｍ3であり、好ましくは１２０〜４００ｋｇ／ｍ3、より好ましくは１５０〜３５０ｋｇ／ｍ3である。なお、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径は、実施例に記載の方法により測定することができる。
【００２１】
〔非晶化処理〕
嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロース中のセルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減する。粉砕機で処理することにより、セルロース含有原料を更に粉砕し、かつ結晶化度を低下させ、更にはセルロースを効率的に非晶化させることができる。
粉砕機としては媒体式粉砕機を好ましく用いることができる。媒体式粉砕機には容器駆動式粉砕機と媒体撹拌式粉砕機とがある。容器駆動式粉砕機としては転動ミル、振動ミル、遊星ミル、遠心流動ミル等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、振動ミルが好ましい。媒体撹拌式粉砕機としてはタワーミル等の塔型粉砕機；アトライター、アクアマイザー、サンドグラインダー等の撹拌槽型粉砕機；ビスコミル、パールミル等の流通槽型粉砕機；流通管型粉砕機；コボールミル等のアニュラー型粉砕機；連続式のダイナミック型粉砕機等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、撹拌槽型粉砕機が好ましい。媒体攪拌式粉砕機を用いる場合の攪拌翼の先端の周速は、好ましくは０．５〜２０ｍ／ｓ、より好ましくは１〜１５ｍ／ｓである。
粉砕機の種類は「化学工学の進歩 第３０集 微粒子制御」（社団法人 化学工学会東海支部編、１９９６年１０月１０日発行、槇書店）を参照することができる。
処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
【００２２】
粉砕機の媒体の材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
粉砕機が振動ミルであって、媒体がボールの場合には、ボールの外径としては、好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ボールの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ボールのかけら等が混入してセルロース含有原料が汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。媒体としては、ボール以外にもロッドやチューブ等の媒体を用いることができる。
ボールの充填率は、振動ミルの機種により好適な充填率が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロース含有原料とボールとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの攪拌部の容積に対するボールの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ボールの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは５分〜７２時間である。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
【００２３】
上記の処理方法により、セルロース含有原料を出発原料として、セルロースＩ型結晶化度が３３％以下の非晶化セルロースを効率よく得ることができ、また、粉砕機処理の際に、粉砕機の内部にセルロース含有原料が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
【００２４】
〔セルラーゼ等の酵素による糖化〕
上述した処理にて得られた非晶化セルロースはその結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとはセルロースのβ-1,4-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
【００２５】
かかる糖化の処理に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては特に制限はなく、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。
セルラーゼの例としてはセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）等のトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、またはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N115（FERM P-19726）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N659（FERM P-19730）等の各株由来のセルラーゼ、更にはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム セルロリティクス（Acremonium celluloriticus）、イルペックス ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼを用いることにより、効率良く糖を製造することができる。
【００２６】
また、ヘミセルラーゼの例としてはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）、バチルス アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更にはサーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、メガザイム社製β-グルコシダーゼ）やアグロバクテリウム（Agrobacterium）、サーモトガ マリチマ（Thermotoga maritima）、トリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
【００２７】
上述した処理により得られた非晶化セルロースをセルラーゼによる酵素処理で糖化する場合の反応条件について、前処理により得られた非晶化セルロースの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。
例えば、セルラーゼとしてノボザイム社製のセルクラスト１．５Lを使用し、パルプ由来の結晶化度０％のセルロースを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対してセルクラスト１．５Lを０．００１〜１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質として０．０００１７〜２．５％相当）となる様に添加し、ｐH２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐHを選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくはｐH３〜７、特に好ましくはｐH５付近）の緩衝液中、反応温度１０℃〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは約５０℃）で、反応時間３０分〜５日間、好ましくは０．５〜３日間反応させることにより、糖を製造することができる。
【実施例】
【００２８】
セルロース含有原料、及び非晶化セルロースの平均粒径、嵩密度及びＸ線回折強度の測定は、下記に記載の方法で行った。また、非晶化セルロースまたは粉末セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
（１）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度２５℃にて測定した。
（２）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。ただし綿状化したサンプルについては、ふるいを通さずにシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。
【００２９】
（３）結晶化度の算出
セルロースＩ型結晶化度は、サンプルのＸ線回折強度を、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、前記計算式に基づいて算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
【００３０】
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／試料採取量（ｇ）］×１００
【００３１】
（６）糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の粉末セルロースまたは非晶化セルロース基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（防腐剤として添加）、蓋つきスクリュー管（実施例１及び２、比較例１：No.3, φ21×45ｍｍ マルエム社、実施例３~６、比較例２〜４：No.5, φ27×55ｍｍ マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら１〜３日間反応した。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量および上清液に遊離した糖量、または還元糖量を、以下に示すフェノール・硫酸法、ＤＮＳ法、またはＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
【００３２】
（７）フェノール硫酸法（生物工学実験書 培風館）による糖の定量
イオン交換水で適宜倍率に希釈した上清液０．１ｍLに対し、５％（ｗ／ｗ）フェノール溶液０．１ｍLを加えて混合した後、さらに硫酸を０．５ｍL加えて良く混合した。２０分間室温に放置した後、波長４９０ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の全糖量を計算した。
【００３３】
（８）ＤＮＳ法（生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
【００３４】
（９）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED４０パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
【００３５】
（１０）タンパク質の定量
DCプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
【００３６】
製造例１
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、結晶化度８１％、セルロース含有量９６質量％（パルプから水を除いた残余の成分中の量）、水分含量７質量％）、をシュレッダー（株式会社明光商会製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。
【００３７】
〔押出機処理〕
得られたチップ状パルプを二軸押出機（株式会社スエヒロＥＰＭ製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、３０〜７０℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径１２０μｍ、嵩密度２１９ｋｇ／ｍ3であった。
【００３８】
〔粉砕機処理〕
得られたパルプを、粉砕機としてバッチ式撹拌槽型粉砕機（五十嵐機械社製「サンドグラインダー」：容器容積８００ｍＬ、５ｍｍφジルコニアビーズを７２０ｇ充填、充填率２５％、攪拌翼径７０ｍｍ）に１３０ｇ投入した。容器ジャケットに冷却水を通しながら、攪拌回転数２０００ｒｐｍで、２．５時間粉砕処理を行い、非晶化セルロースを得た。操作の際の温度は、３０〜７０℃の範囲であった。
処理終了後、撹拌槽型粉砕機内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを前記撹拌槽型粉砕機から取り出し、７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１１７ｇ（投入量の９０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
製造例２
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、バッチ式振動ミル（中央化工機株式会社製「ＭＢ−１」、容器容積２．８Ｌ、２０ｍｍφジルコニアボールを７．６ｋｇ充填、充填率８０％）に代えて、処理条件として投入量２００ｇ、振動数２０Ｈｚ、全振幅８ｍｍ、処理時間４時間としたこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１４２ｇ（投入量の７１質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
製造例３
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に代えて、処理条件として、投入量１００ｇ、回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、転動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、６３ｇ（投入量の６３質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
製造例４〜８
セルロース含有原料としてパルプに代えて、上質紙（製造例４：セルロース含有量８３質量％、水分含量５．７質量％）、ダンボール（製造例５：セルロース含有量８４質量％、水分含量７．２質量％）、新聞紙（製造例６：セルロース含有量８３質量％、水分含量７．７質量％）、稲わら（製造例７：セルロース含有量５５質量％、水分含量８．０質量％）、雑誌（製造例８：セルロース含有量６０質量％、水分含量４．５質量％）を用いて、製造例１の方法及び条件でシュレッダー処理及び押出機処理を行った。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例４：上質紙／平均粒径７１μｍ／嵩密度２７４ｋｇ／ｍ3、製造例５：ダンボール／平均粒径９３μｍ／嵩密度２１６ｋｇ／ｍ3、製造例６：新聞紙／平均粒径６１μｍ／嵩密度３０３ｋｇ／ｍ3、製造例７：稲わら／平均粒径８２μｍ／嵩密度３３９ｋｇ／ｍ3、製造例８：雑誌／平均粒径７２μｍ／嵩密度４３１ｋｇ／ｍ3であった。
更に、製造例１の方法及び条件でバッチ式攪拌槽型粉砕機処理を行い、それぞれ非晶化セルロース（製造例４：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、製造例５：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、製造例６：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例７：稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ、製造例８：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を得た。
【００４３】
比較製造例１
製造例１と同様に、シュレッダー処理、次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの嵩密度及び平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４４】
比較製造例２
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。前記チップ状パルプは、嵩高く、製造例１の半分の量である６５ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内底部にパルプの固着物が見られた。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１６．９ｇ（投入量の２６．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４５】
比較製造例３
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理した。
得られたパルプは、綿状化し、嵩密度は３３ｋｇ／ｍ3であった。次に、この綿状化したパルプを、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。このパルプは嵩高く、３０ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内部にパルプの付着物は見られなかった。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、２３．４ｇ（投入量の７８．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４６】
比較製造例４
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に１００ｇ投入した。回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、転動ミル処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４７】
比較製造例５
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
比較製造例６
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ハンマーミル（株式会社ダルトン製、「ＳＡＭＰＬＥ―ＭＩＬＬ」）に５００ｇ投入し、回転数１３５００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００４９】
比較製造例７
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ピンミル（ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」）に５００ｇ投入し、回転数１３０００ｒｐｍの条件で０．２５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
比較製造例８〜１１
製造例４〜７のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、次にバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行わずに粉末セルロース（比較製造例８：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較製造例９：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較製造例１０：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ、比較製造例１１：稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を得た。
【００５２】
実施例１〜２および比較例１
基質として、実施例１では、前述の製造例１で製造した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）、実施例２では、前述の製造例１の粉砕機処理の処理時間２.５時間を３０分間に代えた以外は同様に調製した非晶化セルロース（結晶化度３０％／平均粒径４６μｍ）を使用した。比較例１の基質として市販の粉末セルロース（KCフロック、日本製紙ケミカル株式会社製、結晶化度７６％、粒径２６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１７％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）中、５０℃で振とう攪拌しながら１〜３日間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量を測定し、上清液の遊離糖をフェノール・硫酸法によって定量（グルコース換算）した。結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
実施例３〜５および比較例２〜４
実施例３〜５として、前述の製造例１の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）を使用した。比較例２〜４として、前述の比較製造例１の条件で調製した粉末パルプ（結晶化度７６％／平均粒径１５６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例３及び比較例２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例４及び比較例３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例５及び比較例４：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
【００５６】
実施例６
実施例３で得られた糖化液上清（反応72時間）を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。
注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。グルコースは保持時間約５．５分、キシロースは約６．５分、キシロビオースは約１４分、セロビオースは約１４．５分にピークが現われた。糖化液上清は１００倍希釈し、１０μＬを注入した。結果を表５に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
実施例７〜９及び比較例５〜７
実施例７〜９として、前述の製造例４〜６で得られた非晶化セルロース（実施例７：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、実施例８：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、実施例９：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ）、及び比較例５〜７として、前述の比較製造例８〜１０で得られた粉末セルロース（比較例５：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較例６：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較例７：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例７〜８及び比較例５〜６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例９及び比較例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１２％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質２％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
実施例１０及び比較例８
実施例１０として、前述の製造例７で得られた非晶化セルロース（稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ）、及び比較例８として、前述の比較製造例１１で得られた粉末セルロース（稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表７に示す。
【００６１】
【表７】
【００６２】
実施例１１及び１２
実施例１１及び１２として、前述の製造例６及び８で得られた非晶化セルロース（実施例１１：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例１２：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１１：１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１２：２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
【００６４】
表１及び表２から、製造例１〜３の非晶化セルロースの製造方法は、比較製造例１〜７に比べて、セルロースの結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができ、生産性に優れることが分かる。また、製造例１〜３で得られた非晶化セルロースは、比較製造例１に比べて、適度な平均粒径を有していた。
表３及び表４の結果から、実施例１〜５に示した本発明の糖の製造方法は比較例１〜４に比べてその生産性が高く、また表５の結果から生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表６〜８の結果から本発明の糖の製造方法はパルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類等、また稲わら等の植物茎・葉類等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【請求項２】
セルロース含有原料が、押出機で処理された原料である、請求項１に記載の糖の製造方法。
【請求項３】
押出機が二軸押出機である、請求項２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
粉砕機が媒体式粉砕機である、請求項１〜３のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項５】
媒体式粉砕機が、容器駆動式粉砕機又は媒体撹拌式粉砕機である、請求項４に記載の糖の製造方法。
【請求項６】
セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉類からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１】
下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【請求項２】
セルロース含有原料が、押出機で処理された原料である、請求項１に記載の糖の製造方法。
【請求項３】
押出機が二軸押出機である、請求項２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
粉砕機が媒体式粉砕機である、請求項１〜３のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項５】
媒体式粉砕機が、容器駆動式粉砕機又は媒体撹拌式粉砕機である、請求項４に記載の糖の製造方法。
【請求項６】
セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉類からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載の糖の製造方法。
【公開番号】特開２００９−１７１９５２（Ｐ２００９−１７１９５２Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０９１５４（Ｐ２００８−２０９１５４）
【出願日】平成２０年８月１５日（２００８．８．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１５日（２００８．８．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]