糖鎖化合物の製造方法
【課題】無水ヒドラジンに比し、安全なヒドラジン水和物を使用して、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造する方法の提供。
【解決手段】式（１）［Ｒ１〜Ｒ３は水素原子、糖残基、Ｒ４は水素原子又はフコース残基、Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基等、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７］の糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させた、式（２）の糖鎖化合物。
【解決手段】式（１）［Ｒ１〜Ｒ３は水素原子、糖残基、Ｒ４は水素原子又はフコース残基、Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基等、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７］の糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させた、式（２）の糖鎖化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖アスパラギン化合物の還元末端Ｃ−Ｎ結合を切断し、還元末端に遊離水酸基を有する糖鎖化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖がタンパク質と共有結合した分子は糖タンパク質と呼ばれている。糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の３次元構造の維持や溶解性の調節、プロテアーゼ耐性の付加などの働きを担っている。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。このように、タンパク質に結合した糖鎖は様々な生理機能に重要な役割を果たしている。しかし、これら糖鎖の構造は多様で、その種類は膨大であるため、どの構造の糖鎖が生命現象に関与しているかを特定するのはきわめて困難な状況である。こういった機能の解明のためにも、単一構造の糖鎖を持った糖タンパク質、糖ペプチドの合成が必要不可欠である。
【０００３】
糖タンパク質は糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−結合型）である。もう一つはセリン（Ｓｅｒ）やトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基に糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−結合型）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、鶏卵より酵素法と化学法を組み合わせることで２分岐複合型糖鎖を大量に調製する方法（特許文献１）を確立し、糖鎖還元末端に遊離水酸基を有する複合型糖鎖からアミノ化複合型糖鎖誘導体を製造し、得られた該誘導体をペプチドのチオール基に選択的に導入できることを示した（特許文献２）。
【０００５】
糖鎖還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖の調製には、糖鎖アスパラギン及びその誘導体や糖タンパク質から酵素により糖鎖を切り出す方法や化学的に切断する方法がある。通常化学的に切断する方法としては、ヒドラジン分解法が用いられる。ヒドラジンを、ヒドラジン水和物や水の存在下で使用した場合、糖鎖還元末端側の糖が脱離（β脱離）するため、無水ヒドラジンが用いられる。
【特許文献１】ＷＯ ０３／００８４３１号公報
【特許文献２】ＷＯ ２００４／０１１０３６号公報
【０００６】
しかしながら、無水ヒドラジンはその毒性や発火性等により、操作には慎重を要し、大量の処理には不向きな試薬であるため、安全で有効なＮ−結合型糖鎖の切り出し方法が求められている。
【０００７】
本発明の課題は、無水ヒドラジンに比し、安全なヒドラジン水和物を使用して、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の発明に係る。
式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させることを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【０００９】
【化１】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【００１０】
【化２】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【００１１】
本発明者等は、これまでβ脱離を生じるために使用できなかったヒドラジン水和物を使用し、ヒドラジン分解させ、引き続きベンジルアミン化合物で置換、精製後、加水分解処理により、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造することができることを見出した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、ヒドラジン分解反応に安全なヒドラジン水和物を使用して、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物は、アスパラギンに糖鎖が結合する糖タンパク質、糖ペプチド又は糖鎖アスパラギン及びそれらの誘導体等を包含する。
本発明の式（２）で表される糖鎖化合物は、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物である。
【００１４】
【化３】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【００１５】
【化４】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【００１６】
糖残基は、水酸基が保護されていてもよく、フッ素等のハロゲン原子で置換されていてもよいマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース等の単糖であってもよく、これら単糖の２つ以上がグリコシド結合して糖鎖を形成したものであってもよい。また、フッ素等のハロゲンが置換していてもよく、カルボキシル基が保護されていてもよいシアル酸を含んだ糖鎖であってもよい。
【００１７】
即ち、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物は従来公知又は未知の糖鎖アスパラギンであってもよく、高マンノース型糖鎖アスパラギン化合物、複合型糖鎖アスパラギン化合物、混成型糖鎖アスパラギン化合物であってよい。また、式（２）で表される糖鎖化合物は従来公知又は未知の糖鎖化合物であってもよく、高マンノース型糖鎖化合物、複合型糖鎖化合物、混成型糖鎖化合物であってよい。
【００１８】
脂溶性の保護基とは、特に制限されるものではなく、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート（Ａｌｌｏｃ）基等のカーボネート含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基等を挙げることができる。また、当該保護基の導入は、例えばProtecting groups in Organic chemistry（John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6）等の公知の方法に従って行えばよい。
【００１９】
Ｒ５におけるアミノ酸残基又はペプチド残基は、アスパラギンのアミノ基とカルボキシル基がアミド結合したアミノ酸又はペプチドであり、特に制限されない。
Ｒ７におけるアミノ酸残基又はペプチド残基は、アスパラギンのカルボキシル基とアミノ基がアミド結合したアミノ酸又はペプチドであり、特に制限されない。
【００２０】
本工程で使用するヒドラジン水和物は従来公知のものであれば使用でき、ヒドラジン一水和物をそのまま、又は水で希釈して使用することができ、ヒドラジン一水和物の濃度としては２０〜１００重量％、特に好ましくは４０〜１００重量％程度とすればよい。
【００２１】
ヒドラジン水和物の使用量としては、特に制限されず、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物１当量に対して０.８当量以上、好ましくは１.０当量以上であるが、通常溶媒をかねて使用するため大過剰量を使用するのがよく、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物１重量部に対して１〜１００００重量部、好ましくは１００〜５０００重量部とするのが好ましい。
【００２２】
本工程の反応は加熱下で行い還流温度で行なう。本反応は式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物がヒドラジンと反応して、式（３）で表されるヒドラジノ化合物を形成すると考えられる。本発明者等の検討によれば、理由は定かではないが、β脱離反応が、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物の大部分又は全てが式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物に変換された後に生じることを見出した。換言すれば、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物の大部分又は全てが式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物に変換されるまではβ脱離反応が生じないことになる。
【００２３】
よって本反応は式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物が全て消費されるまで行なうとしてもよいが、消費する手前で反応を終了させるのが好ましい。又はβ脱離反応によって生じる式（４）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物の生成が生じる前に反応を終了させることが好ましい。反応はＴＬＣ若しくはマススペクトルで追跡して行なうのが好ましい。反応の終了は加熱還流を中止することで行なうことができる。
【００２４】
【化３】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記に同じ。]
【００２５】
【化４】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。]
【００２６】
本工程の反応においては、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にアセチル基のようなアミド結合型保護基があるため、過剰のヒドラジンによって当該保護基が脱離してアミノ基になる。そのため、アセチル化剤を作用させてＮ−アセチル化する必要がある。
【００２７】
アセチル化剤としては、Ｎ−アセチル化反応に使用し得る従来公知アセチル化剤を使用することができ、例えば、アセチルクロライド、アセチルブロマイド等のアセチルハライドや無水酢酸を例示することができ、無水酢酸が好適に使用できる。アセチル化剤の使用量は、アミノ基１当量に対して１〜２０当量、好ましくは１.５〜１０当量程度とすればよい。
アセチル化剤を使用するＮ−アセチル化反応は、従来公知の方法を適用でき、例えば前記反応液を減圧下で過剰のヒドラジンを留去後、塩基の存在下、アセチル化剤を作用させることで成される。
【００２８】
塩基としては、従来公知のものを使用でき、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基等が挙げられるが、炭酸水素ナトリウムやピリジンが特に好ましい。塩基の使用量としては、特に制限されずアセチル化剤に対して等量又はそれ以上使用することができるが、大過剰使用するのが好ましく、例えば炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩の場合は飽和水溶液として、アセチル化剤１重量部に対して１〜１００重量部使用することができる。
【００２９】
本反応は溶媒中で行なわれ、溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等を挙げることができ、これらを単独又は２種以上を混合して使用してもよく、水が好ましく使用できる。溶媒の使用量としては特に制限されないが、式（３）で表される糖鎖化合物１重量部に対して、通常１０〜２０００重量部程度、好ましくは１００〜１０００重量部程度とすればよい。
【００３０】
反応は−１０〜１００℃、好ましくは０〜５０℃で行なわれ、通常０.１〜２４時間程度で完了するが、ＴＬＣやマススペクトル等で反応の進行を確認して行なうのが好ましい。
上記アセチル化反応後の化合物は下記式（５）で表される。
【００３１】
【化５】
［Ｒ１〜Ｒ４及びＡｃは上記に同じ。］
【００３２】
以上のようにして得られた式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物を含む生成物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで処理ことによってアスパラギン残基等の切断片やβ脱離した糖残基を除去することができる。
【００３３】
得られた式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物を酸により処理することによって式（１）で表される糖鎖化合物を含む生成物が得られる。
【００３４】
使用する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸類、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等のスルホン酸類を挙げることができ、中でも酢酸が安全性や使用簡便性の観点から好ましい。
酸の使用量としては、式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物１当量に対して、１当量以上であれば特に制限されず、１〜５当量が好ましい。通常は式（５）の化合物の水溶液が十分に酸性を示す程度に酸を加えるのが好ましい。
【００３５】
反応は０〜５０℃程度、好ましくは１０〜４０℃程度とすればよく、通常１〜１５時間程度、好ましくは２〜１０時間程度で完結するが、ＴＬＣやマススペクトルで反応を追跡して、終了を確認するのが好ましい。
以上のようにして式（２）で表される糖鎖化合物を含む生成物を製造することができるが、上記のヒドラジン分解においては、β脱離が生じない段階で反応を終了させた場合には原料となる式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物が残存することになり、反応がやや進行した場合にはβ脱離した式（４）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物のＮ−アセチル体（６）が混入することになる。また、式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖は不安定で時間経過とともにβ脱離を生じる。よって、この段階で得られる式（２）で表される糖鎖化合物には、化合物（１）、（４）、（６）等の他の化合物の混入が認められる。
上記式（６）の化合物は下記に示される。
【００３６】
【化６】
［Ｒ１〜Ｒ３及びＡｃは上記に同じ。］
【００３７】
次に上記で得られた式（２）で表される糖鎖化合物及び他の化合物の混合物に溶媒中、アミン化合物を作用させる。
【００３８】
アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン等の炭素数１〜４のモノアルキルアミン、シクロプロピルアミン、シクロブチルアミン、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、シクロヘプチルアミン、シクロオクチルアミン等の炭素数３〜８のシクロアルキルアミン、置換基を有することのあるベンジルアミン類を挙げることができる。置換基を有することのあるベンジルアミンの置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等のアルコキシ基、ニトロ基等を挙げることができ、これらの置換基が単独又はフェニル環上の任意の位置に、２〜５個が同一又は異なって置換しているものを包含する。これらのベンジルアミン類の中でもベンジルアミン、ｐ−メトキシベンジルアミン、２,４,５−トリメトキシベンジルを好ましく例示でき、中でもｐ−メトキシベンジルアミンが特に好ましい。
アミン化合物の使用量としては、式（２）で表される糖鎖化合物１当量に対して、通常１〜２０当量、好ましくは２〜１０当量とすればよい。
【００３９】
本反応は、樟脳スルホン酸等の酸の存在下で行なうのが好ましい。
酸の使用量としては、式（１）で表される糖鎖化合物１当量に対して０.０１〜５当量、好ましくは０.０５〜１当量とすればよい。
【００４０】
本反応において使用する溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等を挙げることができ、これらを単独又は２種以上を混合して使用してもよい。
溶媒の使用量としては特に制限されないが、式（２）で表される糖鎖化合物１重量部に対して、通常１０〜２０００重量部程度、好ましくは１００〜１０００重量部程度とすればよい。
【００４１】
本反応は、通常０〜１００℃、好ましくは１０〜５０℃程度で行なえばよく、通常１〜２４時間程度で完結するが、ＴＬＣ又はマススペクトル等で反応を追跡し、原料が消失する時点で反応を終了させればよい。
【００４２】
本反応により、糖鎖還元末端にアミノ化合物が置換した式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物を得ることができ、本化合物は塩基に対しても安定で、β脱離反応を生じず、糖鎖構造を維持することができる。なお、本反応の原料中に混入した式（６）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物も同様に反応して、相当するアミノ置換化合物を与える。
【００４３】
【化７】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。Ｒ８は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換基を有することのあるベンジル基を示す。]
【００４４】
ここで、Ｒ８の炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基等を挙げることができ、炭素数３〜８のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等を挙げることができる。置換基を有することのあるベンジル基の置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等のアルコキシ基、ニトロ基等を挙げることができ、これらの置換基が単独又はフェニル環上の任意の位置に、２〜５個が同一又は異なって置換しているものを包含する。これらのベンジル基の中でもベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２,４,５−トリメトキシ基を好ましく例示でき、中でもｐ−メトキシベンジル基が特に好ましい。
【００４５】
得られた式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物及びその他の化合物をカラムクロマトグラフィーで処理することによって、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物を単離精製することができる。
クロマトグラフィーでの分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独で又は複数組み合わせて用いることにより行なうことができ、例えばゲルろ過クロマトグラフィーで精製後、逆相系のカラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
逆相系のカラムとしては、例えば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム等を挙げることができるが、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物のアミノ基部がＯＤＳカラムのオクタデシル基と強い相互作用を生み、分離能に優れる。
分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。
得られる式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物は新規化合物である。
【００４６】
上記クロマトグラフィーにより単離した式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物に酸を作用させることで目的の式（２）で表される糖鎖化合物とすることができる。
使用する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸類を挙げることができ、カルボン酸類が好ましく、中でも酢酸が使用上安全且つ簡便で好ましい。
酸の使用量としては、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物１当量に対して、１当量以上であれば特に制限されず、１〜５当量が好ましい。通常は式（７）の化合物の水溶液が十分に酸性を示す程度に酸を加えるのが好ましい。
反応は０〜５０℃程度、好ましくは１０〜４０℃程度とすればよく、通常１〜１５時間程度、好ましくは２〜１０時間程度で完結するが、ＴＬＣやマススペクトルで反応を追跡して、終了を確認するのが好ましい。
得られた式（２）で表される糖鎖化合物は、クロマトグラフィー等で精製することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
糖鎖アスパラギン化合物（１−１）１０ｍｇにヒドラジン水和物（ヒドラジン５５％）１０ｍｌを加えて室温で溶解させた。これを１００℃で加熱還流させた。ＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１：１）で反応を追跡し、ＴＬＣ上で原料が消失した時点で加熱還流を止めた。なお、糖鎖アスパラギン化合物（１−１）においてヒドラジン水和物添加直後にＦｍｏｃ基が脱離するので、Ｆｍｏｃ基が脱離した糖鎖アスパラギン化合物を原料として扱った。
【００４９】
【化８】
【００５０】
反応液を減圧下で乾固するまで濃縮し、得られた残渣に水１ｍｌを加えて溶かした。この水溶液に炭酸水素ナトリウム粉末を飽和するまで加えた後、無水酢酸（０.１ｍＬ）を加えた。反応をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１.５：１）でアセチル化の進行を追跡した。またＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１：１）で原料の消失を確認して、炭酸水素ナトリウム粉末を反応液のｐＨが７〜８になるように加えて中和した。
反応液を減圧下で乾固するまで濃縮し、得られた残渣を水１ｍｌに溶かし、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１６ｍｍ×３４５ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：水）で化合物（５−１）を含むフラクションを分取し、減圧下濃縮した。
【００５１】
【化９】
【００５２】
得られた濃縮残渣の５ｍｇを水１ｍｌに溶かし、酢酸５７２μｌを加えて酢酸水溶液とした。室温で撹拌し、反応をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１.５：１）で追跡した。６.５時間後、反応終了を確認し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥して粉体とした。
【００５３】
得られた粉体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（前記条件と同じ。）で精製し、目的とする化合物（２−１）を含むフラクションを分取し、減圧下濃縮して化合物（２−１）を得た。ただし、未反応原料由来の化合物（１−２）及びβ脱離した化合物（８）の混入を認めた。
収量：８.９ｍｇ〔化合物（２−１）：化合物（２−２）：化合物（８）＝９０：８：２〕
【００５４】
化合物（２−１）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，２９５Ｋ，ＨＯＤ＝４.８１）， ５.２８（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１）， ５.２３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１）， ５.０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−１）， ４.８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１）， ４.７０（ｍ，３Ｈ， ＧｌｃＮＡｃ２，５,５'−Ｈ−１）， ４.５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６'−Ｈ−１）， ４.３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２）， ４.２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２）， ４.２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−２）， ２.７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ｅｑ）， ２.１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）， ２.１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２）， ２.１３（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３）， １.８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ａｘ）．
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２２２２， ｆｏｕｎｄ；１１１０［（Ｍ−２）−２］
化合物（８）
Ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２０１９， ｆｏｕｎｄ；１００８.３ ［（Ｍ−２）−２］
【００５５】
【化１０】
【００５６】
【化１１】
【００５７】
【化１２】
【００５８】
実施例２
実施例１と同様にして得た化合物（２−１）、化合物（１−２）及び化合物（８）の混合物４５ｍｇをＤＭＳＯ３ｍｌに溶解させた。この溶液にｐ−メトキシベンジルアミン２ｍｌと樟脳スルホン酸５ｍｇを加え、恒温層で約３７℃に維持して反応させた。
反応をマススペクトル（１１１０／−２ピークの消滅と１１７０／−２ピークの生成）で追跡し、反応終了を確認した。反応液に１０ｍＭアンモニア水を加えて２倍に希釈し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１０ｍｍ×９００ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：５０ｍＭ炭酸アンモニウム水溶液又はアンモニア水（ｐＨ９〜１０））で精製し、化合物（７−１）を含有するフラクションを分取し、減圧下濃縮し、凍結乾燥して化合物（７−１）の粉末を得た。ただし、化合物（１−２）及び化合物（９）の混入を認めた。
【００５９】
【化１３】
【００６０】
【化１４】
【００６１】
得られた粉末２０ｍｇを１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液に溶かし、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液で完全に置換したＯＤＳカラム（カラム担体：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク株式会社製）、カラムサイズ：０.７５×０.７５×１０ｃｍ）に充填した。その後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液を担体の５倍量流し、化合物（１−２）を流出させた。その後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液：アセトニトリル（＝９８：２）を担体の５倍量流し、担体を洗浄後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液：アセトニトリル（＝９６：４）を流して、化合物（９）の流出後、化合物（７−１）を分取した。
収量：９ｍｇ
化合物（７−１）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＨＯＤ＝４.８１）， δ５.１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１）， ４.９３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−１）， ４.７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１）， ４.５９（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２, ５,５'−Ｈ−１）， ４.４３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６， ６'−Ｈ−１）， ４.２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２）， ４.１８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２）， ４.１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−２）， ２.６５（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ｅｑ）， １.７１（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ａｘ）．
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２３４１.８， ｆｏｕｎｄ；１１６９.９［（Ｍ−２）−２］
化合物（９）
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２１３９.８， ｆｏｕｎｄ； １０６８.４［（Ｍ−２）−２］
【００６２】
実施例３
実施例２により得られた化合物（７−１）３ｍｇに水１ｍｌを加えて水溶液（ｐＨ１０）とした後、酢酸約２０μｌを加えた。この時のｐＨは約４であった。
反応をマススペクトル（１１７０／−２ピークの消滅と１１１０／−２ピークの生成）で追跡し、反応終了を確認した。反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５〜６に調整し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１０ｍｍ×９００ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：水）で精製し、得られたフラクションを減圧下濃縮して純度（９８％）の化合物（２−１）を２.５ｍｇ得た。
得られた化合物（２−１）のＮＭＲ及びマススペクトルデータは、前記実施例１で得られたものと同一であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖アスパラギン化合物の還元末端Ｃ−Ｎ結合を切断し、還元末端に遊離水酸基を有する糖鎖化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖がタンパク質と共有結合した分子は糖タンパク質と呼ばれている。糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の３次元構造の維持や溶解性の調節、プロテアーゼ耐性の付加などの働きを担っている。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。このように、タンパク質に結合した糖鎖は様々な生理機能に重要な役割を果たしている。しかし、これら糖鎖の構造は多様で、その種類は膨大であるため、どの構造の糖鎖が生命現象に関与しているかを特定するのはきわめて困難な状況である。こういった機能の解明のためにも、単一構造の糖鎖を持った糖タンパク質、糖ペプチドの合成が必要不可欠である。
【０００３】
糖タンパク質は糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−結合型）である。もう一つはセリン（Ｓｅｒ）やトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基に糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−結合型）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、鶏卵より酵素法と化学法を組み合わせることで２分岐複合型糖鎖を大量に調製する方法（特許文献１）を確立し、糖鎖還元末端に遊離水酸基を有する複合型糖鎖からアミノ化複合型糖鎖誘導体を製造し、得られた該誘導体をペプチドのチオール基に選択的に導入できることを示した（特許文献２）。
【０００５】
糖鎖還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖の調製には、糖鎖アスパラギン及びその誘導体や糖タンパク質から酵素により糖鎖を切り出す方法や化学的に切断する方法がある。通常化学的に切断する方法としては、ヒドラジン分解法が用いられる。ヒドラジンを、ヒドラジン水和物や水の存在下で使用した場合、糖鎖還元末端側の糖が脱離（β脱離）するため、無水ヒドラジンが用いられる。
【特許文献１】ＷＯ ０３／００８４３１号公報
【特許文献２】ＷＯ ２００４／０１１０３６号公報
【０００６】
しかしながら、無水ヒドラジンはその毒性や発火性等により、操作には慎重を要し、大量の処理には不向きな試薬であるため、安全で有効なＮ−結合型糖鎖の切り出し方法が求められている。
【０００７】
本発明の課題は、無水ヒドラジンに比し、安全なヒドラジン水和物を使用して、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の発明に係る。
式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させることを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【０００９】
【化１】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【００１０】
【化２】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【００１１】
本発明者等は、これまでβ脱離を生じるために使用できなかったヒドラジン水和物を使用し、ヒドラジン分解させ、引き続きベンジルアミン化合物で置換、精製後、加水分解処理により、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造することができることを見出した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、ヒドラジン分解反応に安全なヒドラジン水和物を使用して、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物は、アスパラギンに糖鎖が結合する糖タンパク質、糖ペプチド又は糖鎖アスパラギン及びそれらの誘導体等を包含する。
本発明の式（２）で表される糖鎖化合物は、還元末端に遊離水酸基を有するＮ−結合型糖鎖化合物である。
【００１４】
【化３】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【００１５】
【化４】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【００１６】
糖残基は、水酸基が保護されていてもよく、フッ素等のハロゲン原子で置換されていてもよいマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース等の単糖であってもよく、これら単糖の２つ以上がグリコシド結合して糖鎖を形成したものであってもよい。また、フッ素等のハロゲンが置換していてもよく、カルボキシル基が保護されていてもよいシアル酸を含んだ糖鎖であってもよい。
【００１７】
即ち、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物は従来公知又は未知の糖鎖アスパラギンであってもよく、高マンノース型糖鎖アスパラギン化合物、複合型糖鎖アスパラギン化合物、混成型糖鎖アスパラギン化合物であってよい。また、式（２）で表される糖鎖化合物は従来公知又は未知の糖鎖化合物であってもよく、高マンノース型糖鎖化合物、複合型糖鎖化合物、混成型糖鎖化合物であってよい。
【００１８】
脂溶性の保護基とは、特に制限されるものではなく、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート（Ａｌｌｏｃ）基等のカーボネート含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基等を挙げることができる。また、当該保護基の導入は、例えばProtecting groups in Organic chemistry（John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6）等の公知の方法に従って行えばよい。
【００１９】
Ｒ５におけるアミノ酸残基又はペプチド残基は、アスパラギンのアミノ基とカルボキシル基がアミド結合したアミノ酸又はペプチドであり、特に制限されない。
Ｒ７におけるアミノ酸残基又はペプチド残基は、アスパラギンのカルボキシル基とアミノ基がアミド結合したアミノ酸又はペプチドであり、特に制限されない。
【００２０】
本工程で使用するヒドラジン水和物は従来公知のものであれば使用でき、ヒドラジン一水和物をそのまま、又は水で希釈して使用することができ、ヒドラジン一水和物の濃度としては２０〜１００重量％、特に好ましくは４０〜１００重量％程度とすればよい。
【００２１】
ヒドラジン水和物の使用量としては、特に制限されず、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物１当量に対して０.８当量以上、好ましくは１.０当量以上であるが、通常溶媒をかねて使用するため大過剰量を使用するのがよく、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物１重量部に対して１〜１００００重量部、好ましくは１００〜５０００重量部とするのが好ましい。
【００２２】
本工程の反応は加熱下で行い還流温度で行なう。本反応は式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物がヒドラジンと反応して、式（３）で表されるヒドラジノ化合物を形成すると考えられる。本発明者等の検討によれば、理由は定かではないが、β脱離反応が、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物の大部分又は全てが式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物に変換された後に生じることを見出した。換言すれば、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物の大部分又は全てが式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物に変換されるまではβ脱離反応が生じないことになる。
【００２３】
よって本反応は式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物が全て消費されるまで行なうとしてもよいが、消費する手前で反応を終了させるのが好ましい。又はβ脱離反応によって生じる式（４）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物の生成が生じる前に反応を終了させることが好ましい。反応はＴＬＣ若しくはマススペクトルで追跡して行なうのが好ましい。反応の終了は加熱還流を中止することで行なうことができる。
【００２４】
【化３】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記に同じ。]
【００２５】
【化４】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記に同じ。]
【００２６】
本工程の反応においては、式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にアセチル基のようなアミド結合型保護基があるため、過剰のヒドラジンによって当該保護基が脱離してアミノ基になる。そのため、アセチル化剤を作用させてＮ−アセチル化する必要がある。
【００２７】
アセチル化剤としては、Ｎ−アセチル化反応に使用し得る従来公知アセチル化剤を使用することができ、例えば、アセチルクロライド、アセチルブロマイド等のアセチルハライドや無水酢酸を例示することができ、無水酢酸が好適に使用できる。アセチル化剤の使用量は、アミノ基１当量に対して１〜２０当量、好ましくは１.５〜１０当量程度とすればよい。
アセチル化剤を使用するＮ−アセチル化反応は、従来公知の方法を適用でき、例えば前記反応液を減圧下で過剰のヒドラジンを留去後、塩基の存在下、アセチル化剤を作用させることで成される。
【００２８】
塩基としては、従来公知のものを使用でき、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基等が挙げられるが、炭酸水素ナトリウムやピリジンが特に好ましい。塩基の使用量としては、特に制限されずアセチル化剤に対して等量又はそれ以上使用することができるが、大過剰使用するのが好ましく、例えば炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩の場合は飽和水溶液として、アセチル化剤１重量部に対して１〜１００重量部使用することができる。
【００２９】
本反応は溶媒中で行なわれ、溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等を挙げることができ、これらを単独又は２種以上を混合して使用してもよく、水が好ましく使用できる。溶媒の使用量としては特に制限されないが、式（３）で表される糖鎖化合物１重量部に対して、通常１０〜２０００重量部程度、好ましくは１００〜１０００重量部程度とすればよい。
【００３０】
反応は−１０〜１００℃、好ましくは０〜５０℃で行なわれ、通常０.１〜２４時間程度で完了するが、ＴＬＣやマススペクトル等で反応の進行を確認して行なうのが好ましい。
上記アセチル化反応後の化合物は下記式（５）で表される。
【００３１】
【化５】
［Ｒ１〜Ｒ４及びＡｃは上記に同じ。］
【００３２】
以上のようにして得られた式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物を含む生成物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで処理ことによってアスパラギン残基等の切断片やβ脱離した糖残基を除去することができる。
【００３３】
得られた式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物を酸により処理することによって式（１）で表される糖鎖化合物を含む生成物が得られる。
【００３４】
使用する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸類、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等のスルホン酸類を挙げることができ、中でも酢酸が安全性や使用簡便性の観点から好ましい。
酸の使用量としては、式（５）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物１当量に対して、１当量以上であれば特に制限されず、１〜５当量が好ましい。通常は式（５）の化合物の水溶液が十分に酸性を示す程度に酸を加えるのが好ましい。
【００３５】
反応は０〜５０℃程度、好ましくは１０〜４０℃程度とすればよく、通常１〜１５時間程度、好ましくは２〜１０時間程度で完結するが、ＴＬＣやマススペクトルで反応を追跡して、終了を確認するのが好ましい。
以上のようにして式（２）で表される糖鎖化合物を含む生成物を製造することができるが、上記のヒドラジン分解においては、β脱離が生じない段階で反応を終了させた場合には原料となる式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物が残存することになり、反応がやや進行した場合にはβ脱離した式（４）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物のＮ−アセチル体（６）が混入することになる。また、式（３）で表されるヒドラジノ糖鎖は不安定で時間経過とともにβ脱離を生じる。よって、この段階で得られる式（２）で表される糖鎖化合物には、化合物（１）、（４）、（６）等の他の化合物の混入が認められる。
上記式（６）の化合物は下記に示される。
【００３６】
【化６】
［Ｒ１〜Ｒ３及びＡｃは上記に同じ。］
【００３７】
次に上記で得られた式（２）で表される糖鎖化合物及び他の化合物の混合物に溶媒中、アミン化合物を作用させる。
【００３８】
アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン等の炭素数１〜４のモノアルキルアミン、シクロプロピルアミン、シクロブチルアミン、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、シクロヘプチルアミン、シクロオクチルアミン等の炭素数３〜８のシクロアルキルアミン、置換基を有することのあるベンジルアミン類を挙げることができる。置換基を有することのあるベンジルアミンの置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等のアルコキシ基、ニトロ基等を挙げることができ、これらの置換基が単独又はフェニル環上の任意の位置に、２〜５個が同一又は異なって置換しているものを包含する。これらのベンジルアミン類の中でもベンジルアミン、ｐ−メトキシベンジルアミン、２,４,５−トリメトキシベンジルを好ましく例示でき、中でもｐ−メトキシベンジルアミンが特に好ましい。
アミン化合物の使用量としては、式（２）で表される糖鎖化合物１当量に対して、通常１〜２０当量、好ましくは２〜１０当量とすればよい。
【００３９】
本反応は、樟脳スルホン酸等の酸の存在下で行なうのが好ましい。
酸の使用量としては、式（１）で表される糖鎖化合物１当量に対して０.０１〜５当量、好ましくは０.０５〜１当量とすればよい。
【００４０】
本反応において使用する溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等を挙げることができ、これらを単独又は２種以上を混合して使用してもよい。
溶媒の使用量としては特に制限されないが、式（２）で表される糖鎖化合物１重量部に対して、通常１０〜２０００重量部程度、好ましくは１００〜１０００重量部程度とすればよい。
【００４１】
本反応は、通常０〜１００℃、好ましくは１０〜５０℃程度で行なえばよく、通常１〜２４時間程度で完結するが、ＴＬＣ又はマススペクトル等で反応を追跡し、原料が消失する時点で反応を終了させればよい。
【００４２】
本反応により、糖鎖還元末端にアミノ化合物が置換した式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物を得ることができ、本化合物は塩基に対しても安定で、β脱離反応を生じず、糖鎖構造を維持することができる。なお、本反応の原料中に混入した式（６）で表されるヒドラジノ糖鎖化合物も同様に反応して、相当するアミノ置換化合物を与える。
【００４３】
【化７】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。Ｒ８は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換基を有することのあるベンジル基を示す。]
【００４４】
ここで、Ｒ８の炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基等を挙げることができ、炭素数３〜８のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等を挙げることができる。置換基を有することのあるベンジル基の置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等のアルコキシ基、ニトロ基等を挙げることができ、これらの置換基が単独又はフェニル環上の任意の位置に、２〜５個が同一又は異なって置換しているものを包含する。これらのベンジル基の中でもベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２,４,５−トリメトキシ基を好ましく例示でき、中でもｐ−メトキシベンジル基が特に好ましい。
【００４５】
得られた式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物及びその他の化合物をカラムクロマトグラフィーで処理することによって、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物を単離精製することができる。
クロマトグラフィーでの分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独で又は複数組み合わせて用いることにより行なうことができ、例えばゲルろ過クロマトグラフィーで精製後、逆相系のカラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
逆相系のカラムとしては、例えば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム等を挙げることができるが、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物のアミノ基部がＯＤＳカラムのオクタデシル基と強い相互作用を生み、分離能に優れる。
分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。
得られる式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物は新規化合物である。
【００４６】
上記クロマトグラフィーにより単離した式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物に酸を作用させることで目的の式（２）で表される糖鎖化合物とすることができる。
使用する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸類、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸類を挙げることができ、カルボン酸類が好ましく、中でも酢酸が使用上安全且つ簡便で好ましい。
酸の使用量としては、式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物１当量に対して、１当量以上であれば特に制限されず、１〜５当量が好ましい。通常は式（７）の化合物の水溶液が十分に酸性を示す程度に酸を加えるのが好ましい。
反応は０〜５０℃程度、好ましくは１０〜４０℃程度とすればよく、通常１〜１５時間程度、好ましくは２〜１０時間程度で完結するが、ＴＬＣやマススペクトルで反応を追跡して、終了を確認するのが好ましい。
得られた式（２）で表される糖鎖化合物は、クロマトグラフィー等で精製することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
糖鎖アスパラギン化合物（１−１）１０ｍｇにヒドラジン水和物（ヒドラジン５５％）１０ｍｌを加えて室温で溶解させた。これを１００℃で加熱還流させた。ＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１：１）で反応を追跡し、ＴＬＣ上で原料が消失した時点で加熱還流を止めた。なお、糖鎖アスパラギン化合物（１−１）においてヒドラジン水和物添加直後にＦｍｏｃ基が脱離するので、Ｆｍｏｃ基が脱離した糖鎖アスパラギン化合物を原料として扱った。
【００４９】
【化８】
【００５０】
反応液を減圧下で乾固するまで濃縮し、得られた残渣に水１ｍｌを加えて溶かした。この水溶液に炭酸水素ナトリウム粉末を飽和するまで加えた後、無水酢酸（０.１ｍＬ）を加えた。反応をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１.５：１）でアセチル化の進行を追跡した。またＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１：１）で原料の消失を確認して、炭酸水素ナトリウム粉末を反応液のｐＨが７〜８になるように加えて中和した。
反応液を減圧下で乾固するまで濃縮し、得られた残渣を水１ｍｌに溶かし、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１６ｍｍ×３４５ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：水）で化合物（５−１）を含むフラクションを分取し、減圧下濃縮した。
【００５１】
【化９】
【００５２】
得られた濃縮残渣の５ｍｇを水１ｍｌに溶かし、酢酸５７２μｌを加えて酢酸水溶液とした。室温で撹拌し、反応をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝１.５：１）で追跡した。６.５時間後、反応終了を確認し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、凍結乾燥して粉体とした。
【００５３】
得られた粉体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（前記条件と同じ。）で精製し、目的とする化合物（２−１）を含むフラクションを分取し、減圧下濃縮して化合物（２−１）を得た。ただし、未反応原料由来の化合物（１−２）及びβ脱離した化合物（８）の混入を認めた。
収量：８.９ｍｇ〔化合物（２−１）：化合物（２−２）：化合物（８）＝９０：８：２〕
【００５４】
化合物（２−１）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，２９５Ｋ，ＨＯＤ＝４.８１）， ５.２８（ｂｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１）， ５.２３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１）， ５.０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−１）， ４.８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１）， ４.７０（ｍ，３Ｈ， ＧｌｃＮＡｃ２，５,５'−Ｈ−１）， ４.５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６'−Ｈ−１）， ４.３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２）， ４.２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２）， ４.２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−２）， ２.７６（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ｅｑ）， ２.１７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）， ２.１６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２）， ２.１３（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×３）， １.８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ａｘ）．
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２２２２， ｆｏｕｎｄ；１１１０［（Ｍ−２）−２］
化合物（８）
Ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２０１９， ｆｏｕｎｄ；１００８.３ ［（Ｍ−２）−２］
【００５５】
【化１０】
【００５６】
【化１１】
【００５７】
【化１２】
【００５８】
実施例２
実施例１と同様にして得た化合物（２−１）、化合物（１−２）及び化合物（８）の混合物４５ｍｇをＤＭＳＯ３ｍｌに溶解させた。この溶液にｐ−メトキシベンジルアミン２ｍｌと樟脳スルホン酸５ｍｇを加え、恒温層で約３７℃に維持して反応させた。
反応をマススペクトル（１１１０／−２ピークの消滅と１１７０／−２ピークの生成）で追跡し、反応終了を確認した。反応液に１０ｍＭアンモニア水を加えて２倍に希釈し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１０ｍｍ×９００ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：５０ｍＭ炭酸アンモニウム水溶液又はアンモニア水（ｐＨ９〜１０））で精製し、化合物（７−１）を含有するフラクションを分取し、減圧下濃縮し、凍結乾燥して化合物（７−１）の粉末を得た。ただし、化合物（１−２）及び化合物（９）の混入を認めた。
【００５９】
【化１３】
【００６０】
【化１４】
【００６１】
得られた粉末２０ｍｇを１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液に溶かし、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液で完全に置換したＯＤＳカラム（カラム担体：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク株式会社製）、カラムサイズ：０.７５×０.７５×１０ｃｍ）に充填した。その後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液を担体の５倍量流し、化合物（１−２）を流出させた。その後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液：アセトニトリル（＝９８：２）を担体の５倍量流し、担体を洗浄後、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液：アセトニトリル（＝９６：４）を流して、化合物（９）の流出後、化合物（７−１）を分取した。
収量：９ｍｇ
化合物（７−１）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＨＯＤ＝４.８１）， δ５.１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１）， ４.９３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−１）， ４.７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１）， ４.５９（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２, ５,５'−Ｈ−１）， ４.４３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６， ６'−Ｈ−１）， ４.２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２）， ４.１８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２）， ４.１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４'−Ｈ−２）， ２.６５（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ｅｑ）， １.７１（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７'−Ｈ−３ａｘ）．
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２３４１.８， ｆｏｕｎｄ；１１６９.９［（Ｍ−２）−２］
化合物（９）
Ｍａｓｓ： ＥＳＩ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ２１３９.８， ｆｏｕｎｄ； １０６８.４［（Ｍ−２）−２］
【００６２】
実施例３
実施例２により得られた化合物（７−１）３ｍｇに水１ｍｌを加えて水溶液（ｐＨ１０）とした後、酢酸約２０μｌを加えた。この時のｐＨは約４であった。
反応をマススペクトル（１１７０／−２ピークの消滅と１１１０／−２ピークの生成）で追跡し、反応終了を確認した。反応液に水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５〜６に調整し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（カラム担体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、カラムサイズ：φ１０ｍｍ×９００ｍｍ、流速：０.８ｍｌ／ｍｉｎ、展開溶媒：水）で精製し、得られたフラクションを減圧下濃縮して純度（９８％）の化合物（２−１）を２.５ｍｇ得た。
得られた化合物（２−１）のＮＭＲ及びマススペクトルデータは、前記実施例１で得られたものと同一であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させることを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【化１】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【化２】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【請求項２】
糖鎖還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンがβ脱離する前にヒドラジン水和物の作用を終了させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
（Ａ）式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させる工程、
（Ｂ）アセチル化剤を作用させる工程、
（Ｃ）酸を作用させる工程、
（Ｄ）炭素数１〜４のモノアルキルアミン、炭素数３〜８のシクロアルキルアミン及び置換基を有することのあるベンジルアミンから選ばれる少なくとも１種のアミン化合物を作用させる工程、
（Ｅ）カラムクロマトグラフィーで精製する工程、
（Ｆ）酸を作用させる工程、
をこの順序で実施することを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【請求項４】
（Ａ）のヒドラジン水和物の作用を、糖鎖還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンがβ脱離する前に終了させる請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
（Ｄ）のアミン化合物が、ｐ−メトキシベンジルアミンである請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
（Ｃ）及び（Ｆ）の酸が酢酸である請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物。
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。Ｒ８は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換基を有することのあるベンジル基を示す。]
【請求項１】
式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させることを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【化１】
[式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって水素原子、糖残基を示す。Ｒ４は水素原子又はフコース残基を示す。Ａｃはアセチル基を示す。Ｒ５は水素原子、脂溶性の保護基、アミノ酸残基、又はペプチド残基を示し、Ｒ６はカルボキシル基又は基−ＣＯＮＨＲ７を示す。Ｒ７は、アミノ酸残基又はペプチド残基を示す。]
【化２】
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。]
【請求項２】
糖鎖還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンがβ脱離する前にヒドラジン水和物の作用を終了させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
（Ａ）式（１）で表される糖鎖アスパラギン化合物にヒドラジン水和物を作用させる工程、
（Ｂ）アセチル化剤を作用させる工程、
（Ｃ）酸を作用させる工程、
（Ｄ）炭素数１〜４のモノアルキルアミン、炭素数３〜８のシクロアルキルアミン及び置換基を有することのあるベンジルアミンから選ばれる少なくとも１種のアミン化合物を作用させる工程、
（Ｅ）カラムクロマトグラフィーで精製する工程、
（Ｆ）酸を作用させる工程、
をこの順序で実施することを特徴とする式（２）で表される糖鎖化合物の製造方法。
【請求項４】
（Ａ）のヒドラジン水和物の作用を、糖鎖還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンがβ脱離する前に終了させる請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
（Ｄ）のアミン化合物が、ｐ−メトキシベンジルアミンである請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
（Ｃ）及び（Ｆ）の酸が酢酸である請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
式（７）で表されるアミノ糖鎖化合物。
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｃは前記に同じ。Ｒ８は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、置換基を有することのあるベンジル基を示す。]
【公開番号】特開２００９−１５５３５３（Ｐ２００９−１５５３５３Ａ）
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９２７０２（Ｐ２００６−９２７０２）
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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