細胞において多能性を誘導する方法
本願は、細胞を、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種と接触させることによって、細胞において多能性を誘導又は維持する方法を説明する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、細胞における多能性誘導の分野に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００８年１０月９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／１０４，２３１号（その内容全体が参照により援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
転写因子の異所性発現によって体細胞をリプログラムし、多能性にすることができることがマウス及びヒトにおいて実証されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。疾患又は老化によって引き起こされる損傷を修復するために、患者自身の皮膚細胞に由来する幹細胞を使用して細胞及び組織を生成することができるため、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の生成は、完全に個人化された再生医療の実現に大いに有望である（非特許文献１０、非特許文献１１）。転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせの強制発現が成熟細胞を多能性状態へと戻すことが示されている。
【０００４】
以前の研究では、これらの転写因子は複数のウイルスベクターを用いて発現させていた（非特許文献７、非特許文献４、非特許文献２、非特許文献８、非特許文献６、非特許文献９、非特許文献５）。この複数のベクターの使用は、複数の組込みイベントのために問題を生じ、これは発癌性リスクの増大につながるおそれがある（非特許文献７、非特許文献１２）。研究者らは、単一のベクター系（非特許文献１３）、摘出可能なベクター（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）、非組込み型（non-integrating）ベクター（非特許文献１７、非特許文献１８）及び一時的トランスフェクション（非特許文献１９）を用いることによってこの問題を克服しようと試みてきた。しかしながら、これらの方法はエピジェネティックリプログラミングを達成する上で極めて非効率的である。
【０００５】
多能性を誘導する方法には、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃのトランスフェクションが含まれるが、これは癌を引き起こす可能性があるため望ましくない。ｉＰＳ細胞は、ｃ−Ｍｙｃをトランスフェクトすることなく生成することができる（非特許文献３、非特許文献２０）。しかしながら、そのリプログラミングの効率は大幅に低下している。同様に、Ｋｌｆ４は異形成を誘導するおそれがある（非特許文献２１）。
【０００６】
複数のウイルスベクターの組込み、及び多能性を誘導する遺伝子の一部の望ましくない副作用に関連する問題から、多能性誘導遺伝子の一部又は全ての使用を、その発現を調節するか、若しくは多能性誘導遺伝子によって発現が調節されるタンパク質遺伝子産物及びタンパク質、又は多能性を誘導する遺伝子若しくはタンパク質の発現を調節する小分子の使用に置き換える必要がある。この目的で、遺伝子ではなく、遺伝子産物の導入によっても多能性が誘導されたことが報告されている（非特許文献２２）。細胞への侵入を容易にするためにポリアルギニンでタグ付けされた組み換えＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃによって、マウス体細胞がリプログラムされた。小分子を用いて中核となる（core set）遺伝子のうち１つの必要性をなくした例もある。Ｎａｎｏｇを上方調節する小分子によって、同様にＮａｎｏｇを上方調節するＫｌｆ４遺伝子が不要となっている（非特許文献２３）。別の研究では、小分子ＨＤＡＣ阻害剤によってＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの両方が不要とされている（非特許文献２４）。これらの研究から以下のことが示される：１）タンパク質遺伝子産物によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；２）遺伝子を上方調節する小分子によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；及び３）同じ調節経路の遺伝子（又は遺伝子産物）は相互に代用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lowry et al., 2008
【非特許文献２】Maherali et al., 2007
【非特許文献３】Nakagawa et al., 2008
【非特許文献４】Okita et al., 2007
【非特許文献５】Park et al., 2008
【非特許文献６】Takahashi et al., 2006
【非特許文献７】Takahashi and Yamanaka, 2006
【非特許文献８】Wernig et al., 2007
【非特許文献９】Yu et al., 2006
【非特許文献１０】Yamanaka, 2007
【非特許文献１１】Jaenish and Young, 2008
【非特許文献１２】Aoi et al., 2008
【非特許文献１３】Sommer et al., 2009
【非特許文献１４】Kaji et al., 2009
【非特許文献１５】Soldner et al., 2009
【非特許文献１６】Woltjen et al., 2009
【非特許文献１７】Stadtfeld et al., 2009
【非特許文献１８】Yu et al., 2009
【非特許文献１９】Okita et al., 2009
【非特許文献２０】Wernig et al., 2008
【非特許文献２１】Foster et al., 2005
【非特許文献２２】Zhou et al., 2009
【非特許文献２３】Lyssiotis et al., 2009
【非特許文献２４】Huangfu et al., 2008, a&b
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの成果にもかかわらず、これらの方法にはリプログラミングの効率が低いとの欠点があるという大きな問題が残っている。現在の体細胞における多能性の誘導率は低過ぎるため、ｉＰＳ細胞の治療的使用は非実用的である。したがって、単独で、又は既に同定されたものに加えて、細胞において多能性を誘導するか、又は多能性誘導の効率を向上させるタンパク質及び小分子を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、細胞において多能性を誘導又は維持する方法であって、細胞を、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種と接触させることを含む、方法に関する。生物種は遺伝子又はタンパク質であり得る。タンパク質は、好ましくはＭＵＣ１＊リガンドであり得る。リガンドは好ましくはＮＭ２３である。タンパク質は抗体、好ましくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲ配列を特異的に認識する二価抗体であってもよい。別の態様では、化学種は小分子であり得る。好ましくは、小分子はＭＵＣ１、その切断酵素又はＮＭ２３の転写を増進し得る。好ましくは、切断酵素はＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１４又はＡＤＡＭ−１７であり得る。さらに、小分子はＭＵＣ１の切断を増進し得る。小分子はホルボールエステルであってもよい。
【００１０】
別の態様では、上記遺伝子はＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊、又はその有効フラグメント、又はＭＵＣ１＊抗体若しくはＮＭ２３等（これらに限定されない）といったＭＵＣ１＊のリガンドをコードし得る。好ましくは、フラグメントはＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊の細胞質尾部であり得る。
【００１１】
さらに他の態様では、本発明は細胞を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４又はＬＩＮ２８、好ましくはＯＣＴ４及びＳＯＸ２の発現を増大させる分子等（これらに限定されない）といった多能性を誘導する遺伝子産物の発現を増大させるさらなる分子と接触させることに関する。
【００１２】
本発明のこれら及び他の目的は、以下の本発明の説明、添付の参考図面及び添付の特許請求の範囲から、より完全に理解される。
【００１３】
本発明は、本明細書中で下記に与えられる詳細な説明、及び例示目的のみで与えられ、したがって本発明を限定するものでない添付の図面からより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。クローン原性アッセイから、ラット線維芽細胞（３Ｙ１）にＭＵＣ１＊をトランスフェクトすることによって成長速度が増大するが、ＭＵＣ１（完全長）では増大しないことが示される。図１Ｂ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＭＵＣ１＊活性は生存を増大させる。ＴＡＸＯＬ（登録商標）に対する抵抗性を獲得した乳癌細胞では、ＭＵＣ１＊発現を増大させることによって生存が増大する。抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂでの処理によって、獲得されたＴＡＸＯＬ（登録商標）誘導性細胞死に対する抵抗性が取り消される（reverses）。図１Ｃ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのリガンド誘導性二量化は成長を刺激する。二価抗ＭＵＣ１＊抗体の添加によって、ＭＵＣ１＊陽性細胞の成長が刺激される。抗ＭＵＣ１＊（ｍｖ）Ｆａｂでの遮断によって細胞成長が阻害される。この釣鐘型の成長曲線は受容体二量化に特徴的である。対照のＭＵＣ１陰性ＨＥＫ ２９３細胞の成長は影響を受けなかった。図１Ｄ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。特異的ｓｉＲＮＡを用いたＭＵＣ１＊の抑制によって、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの添加の成長刺激効果が無効となる。図１Ｅ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＮＭ２３は天然のＭＵＣ１＊活性化リガンドである。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊陽性癌細胞の成長を刺激し、受容体二量化を示唆する釣鐘型曲線を示す。ｓｉＲＮＡによるＭＵＣ１の抑制によって効果は無効となる。図１Ｆ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＮＭ２３のＭＵＣ１＊ペプチドへの直接結合はＳＰＲによって検出される。１５ｎＭ ＮＭ２３はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドには結合するが、無関係のペプチドには結合しない。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）及びＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭでコートしたＡｕチップを用いて測定を行った。 図１Ｂの縦軸は、細胞死率（％）、non FabはＦａｂなし、Con Fabは対照Ｆａｂ、No TaxolはＴａｘｏｌなしを意味する。図１Ｃの縦軸は正規化細胞成長率（％）、横軸は抗ＭＵＣ１＊抗体濃度を意味する。図１Ｄの縦軸は成長率（％）、横軸は抗ＭＵＣ１＊、controlは対照を意味する。図１Ｅの縦軸は成長率（％）、NM23conc.はＮＭ２３濃度、Controlは対照を意味する。図１Ｆの縦軸は共鳴単位、横軸は時間（秒）、NM23injectionはＮＭ２３注入、MUC1＊surfaceはＭＵＣ１＊細胞外ドメイン表面、contro; peptide surfaceは対照ペプチド表面を意味する。
【図２】ＭＵＣ１が未分化ｈＥＳＣ上で切断されるが、分化ｈＥＳＣ上では切断されないことを示す図である。免疫細胞化学から、未分化（多能性）幹細胞はＭＵＣ１＊を発現するが、完全長タンパク質は発現しないことが示される。ＯＣＴ４は多能性の最も基準となる（gold standard）マーカーである。全ての多能性幹細胞はＭＵＣ１＊陽性である。しかしながら、分化が始まると（ＯＣＴ４発現の消失）、直ぐに切断が停止し、完全長ＭＵＣ１（ＭＵＣ１−ＦＬ）のみが検出される。パネルＡ〜パネルＣは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＡはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体、Ｂは抗ＯＣＴ４、Ｃは抗ＭＵＣ１完全長ＶＵ４Ｈ５で染色している。パネルＤ〜パネルＦは同じ分化したばかりの幹細胞コロニーの写真であり、ＤはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体、Ｅは抗ＯＣＴ４、Ｆは抗ＭＵＣ１完全長ＶＵ４Ｈ５で染色している。 UNDIFFERENTIATED:未分化、DIFFERENTIATED:分化を意味する。
【図３】ＮＭ２３（ＭＵＣ１＊リガンド）が未分化ｈＥＳＣ上ではＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と共局在化するが、分化細胞上では共局在化しないことを示す図である。免疫細胞化学から、未分化（多能性）幹細胞が、ＭＵＣ１＊及びその活性化リガンドであるＮＭ２３を発現することが示される。しかしながら、幹細胞が分化し始めると（ＯＣＴ４発現の消失）、ＭＵＣ１は完全長タンパク質として発現され、ＮＭ２３は分泌されなくなる。点線は、未分化の部分と分化したばかりの部分との間の境界を示す。パネルＡ〜パネルＣは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＡはＮＭ２３を認識する抗体、ＢはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体で染色している。ＣはＡとＢとを重ね合わせたものであり、核を染色するために同じ細胞をＤＡＰＩで染色している。パネルＤ〜パネルＦは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＤはＮＭ２３を認識する抗体、ＥはＯＣＴ４を認識する抗体で染色している。ＦはＤとＥとを重ね合わせたものであり、核を染色するために同じ細胞をＤＡＰＩで染色している。
【図４】ｂＦＧＦ及び馴化培地の非存在下において、ＭＵＣ１＊を刺激することによってｈＥＳＣの成長が促進され、分化が阻害されることを示す図である。二価抗ＭＵＣ１＊抗体を用いたＭＵＣ１＊細胞外ドメインのリガンド誘導性二量化によって、ｂＦＧＦ又は馴化培地を添加していない最小培地での５週間の増殖の後、ほぼ１００％の多能性コロニーが産生された。コロニーはマトリゲル上で増殖させた。ＮＭ２３又はＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ突然変異体をＭＵＣ１＊を活性化するのに用いた場合も同じ結果が得られた。パネルＡ〜パネルＤは、細胞増殖培地に線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地、加えて抗ＭＵＣ１＊又はｂＦＧＦのいずれかを添加したウェルの写真である。パネルＥ〜パネルＨは、幹細胞を抗ＭＵＣ１＊又はｂＦＧＦのいずれかを加えた最小培地において培養したウェルの写真である。画像は、ＡではＯＣＴ４を認識する抗体で染色した細胞、ＢではＡの細胞のＤＡＰＩ染色、Ｃでは抗ＭＵＣ１＊で染色した細胞、ＤではＣの細胞のＤＡＰＩ染色、ＥではＯＣＴ４を認識する抗体で染色した細胞、ＦではＥの細胞のＤＡＰＩ染色、Ｇでは抗ＭＵＣ１＊で染色した細胞、ＨではＧの細胞のＤＡＰＩ染色である。 Conditioned Medium：馴化培地、Feeder Free：フィーダー細胞なし、Anti-MUC1*：抗ＭＵＣ１＊を意味する。
【図５】ＭＵＣ１＊活性が多能性幹細胞の成長に必要とされることを示す棒グラフを示す図である。抗ＭＵＣ１＊ ＦａｂでＭＵＣ１＊を遮断することによって、ｂＦＧＦ及び馴化培地（ＣＭ）が存在する場合であっても、８時間〜１２時間以内に全幹細胞死が引き起こされた。二価抗ＭＵＣ１＊は成長を刺激した。細胞を２５時間培養し、生細胞をカルセイン蛍光アッセイにおいて測定した。 H9 hESCs on Matrigel+CM+bF ：マトリゲル＋ＣＭ＋ｂＦＧＦ上でのＨ９ ｈＥＳＣ、Bivalent Anti-MUC1*：二価抗ＭＵＣ１＊、Fab Amti-MUC1*(monovalent)：Ｆａｂ抗ＭＵＣ１＊（一価）、Control Fab：対照Ｆａｂ、No Antibody：抗体なしを意味する。
【図６】ＭＵＣ１＊が細胞の核に移行することの証拠となる写真を示す図である。ＭＵＣ１＊ Ｆａｂを蛍光標識し（赤色）、次いでＭＵＣ１＊陽性細胞と共にインキュベートした。写真から、ＭＵＣ１＊が最初は細胞表面上に均一に分散していることが示される。しかしながら、４０分後にはＭＵＣ１＊は核内に集中している。比較のため、細胞をＥＥＡ１を認識する蛍光標識した抗体でも染色したが（緑色）、これは実験全体を通して細胞質中に均一に分散したままである。Ａは０時点（time zero）で撮影した細胞の写真であり、Ｂは抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂの添加の４０分後に撮影した細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願において、「a」及び「an」は、単一及び複数の対象の両方を指すように使用される。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」とは、ＭＵＣ１＊シグナル伝達を直接的又は間接的に増大させることを指し、ＭＵＣ１＊受容体の二量化、さらにＭＵＣ１受容体の切断によるＭＵＣ１＊の産生の増大を含むが、これらに限定されない。ＭＵＣ１＊活性は、ＭＵＣ１受容体（さらに切断され、二量化される）の転写発現の増加によっても増大し得る。したがって、一態様では、ＭＵＣ１＊活性はＭＵＣ１＊を二量化するエフェクター分子の活性の増大、又はＭＵＣ１を切断してＭＵＣ１＊を形成する切断分子の活性の増大、又はＭＵＣ１の発現の増加によって増大し得る。したがって、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの活性を増大させることが可能な任意の化学種又は生物種、ＭＵＣ１＊を形成するＭＵＣ１切断酵素、又はＭＵＣ１の発現を増進する任意の転写活性化因子が、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」種として包含される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体」（ＭＧＦＲ）は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用するＭＵＣ１受容体の部分を意味する機能定義である。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近い細胞外部分であり、下記に定義されるように、ＰＳＭＧＦＲの大部分又は全てによって規定される。ＭＧＦＲは、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体の一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）とは、場合によってはＭＧＦＲの大部分又は全て、並びにそのペプチド配列の機能的変異体及び断片を規定するペプチド配列を指す。ＰＳＭＧＦＲは、配列番号６、並びに２０個までの任意の整数値（すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、及び／又は２０個までの任意の整数値のアミノ酸付加若しくは欠失を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に有する、その全ての機能的変異体及び断片として定義される。上記の文脈における「機能的変異体又は断片」とは、配列番号６のペプチドと特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用するリガンドと特異的に結合するか、又は別の形で（otherways）特異的に相互作用する能力を有するが、ペプチド分子が他の同一なペプチド分子と会合する（すなわち自己会合する）能力を有するほど、それら自身と同一な他のペプチド分子の同一な領域とは強く結合しない変異体又は断片を指す。配列番号（SEQ NO:）６のＰＳＭＧＦＲペプチドの機能的変異体であるＰＳＭＧＦＲの一例は配列番号８であり、-SRY-の代わりに-SPY-配列を含むことによって配列番号６とは異なる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊」とは、細胞外ドメインが本質的にＰＳＭＧＦＲ（配列番号５）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質を指す。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊関連因子」とは、ＭＵＣ１＊を修飾する、活性化する、その活性を調節する、又はその発現を調節する作用物質を指す。ＭＵＣ１＊関連因子としては、ＭＵＣ１＊受容体の二量化に影響を及ぼす、ＭＵＣ１＊の産生を増大させる、ＭＵＣ１受容体の切断を誘導する作用物質、ＭＵＣ１受容体（さらに切断され、二量化される）の転写発現の増加によってＭＵＣ１＊の活性を増大させる作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「有効量」とは、有益な又は所望される臨床的又は生化学的な結果をもたらすのに十分な量である。有効量は一回又は複数回投与することができる。本発明の目的上、阻害剤化合物の有効量とは、細胞の多能性を誘導若しくは維持するか、又はＭＵＣ１＊を活性化するのに十分な量である。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「断片」又は「機能的誘導体」とは、天然のリガンド又は本発明の受容体の生物学的に活性なアミノ酸配列変異体及び断片、並びに有機誘導体化剤との反応によって得られた誘導体を含む共有結合修飾、翻訳後修飾、非タンパク性ポリマーを有する誘導体、及びイムノアドヘシンを指す。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「リガンド」とは、ポリペプチド等の分子に共有結合的又は一時的に、特異的に結合する任意の分子又は作用物質又は化合物を指す。或る特定の文脈で使用される場合、リガンドは抗体を含み得る。他の文脈では、「リガンド」は、ＭＵＣ１＊に対する天然若しくは非天然のリガンド、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊に結合する切断酵素、又はＭＵＣ１＊に対する二量化リガンド等（これらに限定されない）といった別の分子によって高親和性で結合される分子を指す場合もある。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、例えば抗原と免疫反応する抗体分子、又はＭＵＣ１＊と特異的に結合するＮＭ２３、又はＭＵＣ１＊に結合する抗体、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊に結合する切断酵素等の別のポリペプチドと反応する非抗体リガンドの間のような２つの分子間の選択的結合反応を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」及び「ポリヌクレオチド構築物」は本明細書中で区別なく使用される。本発明のポリヌクレオチドベクターは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、レトロウイルス外被に封入されたＲＮＡ、アデノウイルス外被に封入されたＤＮＡ、別のウイルス形態若しくはウイルス様形態（単純ヘルペス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等）に包まれたＤＮＡ、リポソームに封入されたＤＮＡ、ポリリシンと複合したＤＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合したＤＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化合物と複合して分子を免疫学的に「遮蔽した」、及び／又は半減期を増大させたＤＮＡ、又は非ウイルスタンパク質に結合したＤＮＡを含む（これらに限定されない）、幾つかの形態のいずれかであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけでなく、メチル化ヌクレオチド、非荷電結合及びチオエート等のヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、並びにポリアミド等の修飾された及び／又は代替的な骨格構造等といった、それらの類似体又はそれらの塩基の修飾形態のいずれかも含む。
【配列表フリーテキスト】
【００２６】
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用については、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（付録２、表１）に記載される規則に従うが、ここでは、ｋはｔ又はｇを表し、ｎはａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｒはａ又はｇを表し、ｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｙはｃ又はｔを表す。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV
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ASGSASGSASTLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS
SVPPLTSSNHSTSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS
VSDVPFPFSAQSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号１）は、完全長ＭＵＣ１受容体（ムチン１前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ１５９４１）を表す。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT（配列番号２）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA（配列番号３）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG（配列番号４）
配列番号２、配列番号３及び配列番号４は、ＭＵＣ１受容体及び短縮アイソフォームを細胞膜表面に対して指向付ける（directing）Ｎ末端ＭＵＣ−１シグナル伝達配列を表す。配列番号２、配列番号３及び配列番号４の変異体によって示されるように、Ｃ末端で最大３個のアミノ酸残基が欠けている場合がある。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL（配列番号５）は、そのＮ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列及び細胞質配列を含む短縮ＭＵＣ１受容体アイソフォームを表す。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号６）は、ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号７）は、配列番号６のＮ末端に単一のアミノ酸欠失を有する、ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す）。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号８）は、増進された安定性を有するＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号９）は、配列番号８のＣ末端に単一のアミノ酸欠失を有する、増進された安定性を有するＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す）。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg（配列番号１０）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのヌクレオチド配列を表す。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL（配列番号１１）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのアミノ酸配列を表す。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa（配列番号１２）は、ＮＭＥ７のヌクレオチド配列（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ２０９０４９）を表す。
IGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMY（配列番号１３）は、ＮＭＥ７のアミノ酸配列（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ２０９０４９）を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１４）は、ＮＭ２３−Ｈ１のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１５）は、ＮＭ２３−Ｈ１のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１６）は、ＮＭ２３−Ｈ１ Ｓ１２０Ｇ突然変異体のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１７）は、ＮＭ２３−Ｈ１ Ｓ１２０Ｇ突然変異体のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
atgtacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc
ggggggcggcggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc
ggaccgcgtcaagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa
gatggcccaggagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga
gtggaaacttttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg
agcgctgcacatgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga aaaccaagac
gctcatgaagaaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg gcggcaatag
catggcgagcggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc agcgcatgga
cagttacgcgcacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc aggaccagct
gggctacccgcagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc agcccatgca
ccgctacgacgtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga cctacatgaa
cggctcgcccacctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca tggctcttgg
ctccatgggttcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg ttacctcttc
ctcccactccagggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca gcatgtatct
ccccggcgccgaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt cccagcacta
ccagagcggcccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct cacacatgtg
a（配列番号１８）は、配列番号１ヒトＳＯＸ２のヌクレオチド配列（ＳＯＸ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＮＭ＿００３１０６）を表す。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPK
MHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGG
LLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQ
PMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSH
SRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM（配列番号１９）は、ヒトＳＯＸ２のアミノ酸配列（ＳＯＸ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＮＭ＿００３１０６）を表す。
atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga（配列番号２０）は、ヒトＯＣＴ４のヌクレオチド配列を表す。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN（配列番号２１）は、ヒトＯＣＴ４のアミノ酸配列を表す。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa（配列番号２２）は、ＮＭ２３−Ｈ２のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＫ３１３４４８）を表す。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE（配列番号２３）は、ＮＭ２３−Ｈ２のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＫ３１３４４８）を表す。
atggctgtcagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgtcacgaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtcttgaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt（配列番号２４）は、ＫＬＦ４のヌクレオチド配列（ＫＬＦ４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ０２２１８４）を表す。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPAGPYDLAAATVATDLESAGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKR（配列番号２５）は、ＫＬＦ４のアミノ酸配列（ＫＬＦ４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ０２２１８４）を表す。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgetgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgetcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagctaaaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagccacagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcggaaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcg（配列番号２６）は、ｃ−Ｍｙｃのヌクレオチド配列（ｃ−Ｍｙｃ：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０００９１７）を表す。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA（配列番号２７）は、ｃ−Ｍｙｃのアミノ酸配列（ｃ−Ｍｙｃ：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０００９１７）を表す。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgaggaggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagtggttcaacgtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagtggatgtctttgtgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggagttcacctttaagaagtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattgggagtgagaggcggccaaaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtggaggtctagatcatcatgccaaggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatcagccatatggtagcctcatgtccgctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcgagaggaagaagaagaaatccacagccctaccctgctcccggaggcacagaa（配列番号２８）は、ＬＩＮ２８のヌクレオチド配列（ＬＩＮ２８：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ５２１０９９）を表す。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNVRMGFGFLSMTARAGVALDPPVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSAKGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGGLDHHAKECKLPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLPEAQN（配列番号２９）は、ＬＩＮ２８のアミノ酸配列（ＬＩＮ２８：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ５２１０９９）を表す。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgctccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcctccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccggggacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacggcttgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccagacaagtttggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacataatgaaatcactttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaaggcgttccgcgtgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccatgagaagcaggccgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgagggcggcttcctggcccatgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttggactgtcaggaatgaggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctggggctcgagcattccagtgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgctgcccgatgatgaccgccggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccctcaacccaggactacctcccggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgacgggaactttgacaccgtggccatgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgaggaataaccaagtgatggatggatacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaacactgcctacgagaggaaggatggcaaattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccctggaacctggctaccccaagcacattaaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctcttctggatgcccaatggaaagacctacttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggcagtggatagcgagtaccccaagaacatcaaagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgggcagcgatgaagtcttcacttacttctacaaggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtagaaccgggctaccccaagtcagccctgagggactggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggggactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtggacgaggagggcggcggggcggtgagcgcggctgccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggtgggccttgcagtcttcttcttcagacgccatgggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggacaaggtc（配列番号３０）は、ＭＭＰ１４のヌクレオチド配列（ＭＭＰ１４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０６４８０３）を表す。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGDLRTHTQRSPQSLSAAIAAMQKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGAEIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFWRGLPASINTAYERKDGKFVFFKGDKHWVFWEGIPESPRGSFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEGTEEETEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV（配列番号３１）は、ＭＭＰ１４のアミノ酸配列（ＭＭＰ１４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０６４８０３）を表す。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttgcaaaccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaaagtacggctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagctgccatgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccccgatgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggacagaaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattagaaaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatggagagggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgagccatggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctctgggattggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaaactacctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacctctaccgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggcctccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattcttcgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggatacccaatgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgtgttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacccttggaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttcaagggagacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctggaaagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaaggagtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgggctgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactggacaacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggtttacactgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggtg（配列番号３２）は、ＭＭＰ１６のヌクレオチド配列（ＭＭＰ１６：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ００９３０３）を表す。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVWLQKYGYLPPTDPRMSVLRSAETMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDWMKKPRCGVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFLAHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGPPDKIPPPTRPLPTVPPHRSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFKDQWFWRVRNNRVMDGYPMQITYFWRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYWVFKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDSAIWWEDVGKTYFFKGDRYWRYSEEMKTMDPGYPKPITVWKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYWKFNNQILKVEPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV（配列番号３３）は、ＭＭＰ１６のアミノ酸配列（ＭＭＰ１６：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ００９３０３）を表す。
【００２７】
多能性の誘導
体細胞をリプログラムして、多能性状態へと戻すことができることが最近発見された。転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子、又はタンパク質自体を体細胞に導入し、多能性状態へと戻すことができる。これらの多能性因子の多くは、以前は癌遺伝子であると考えられていた。ｃ−Ｍｙｃはよく知られた癌遺伝子であり、同様にＫｌｆ４は異形成を誘導することが示されている（非特許文献２１）。ＯＣＴ４は多能性幹細胞を同定する上で最も基準となるものとして同定されている。核内のＯＣＴ４の存在は細胞が多能性であることを示唆し、その欠如は細胞が分化過程に入っており、もはや任意の細胞型に分化可能でないことを示唆する。最近では、ＯＣＴ４も同様に多くの癌細胞の核内に存在するが、正常な成熟細胞には存在しないことが知られるようになっている。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質（配列番号１）の切断形態であるＭＵＣ１＊が、固形腫瘍癌のおよそ７５％で発現される強力な成長因子受容体であり（Raina et al., 2009）、多能性幹細胞上でもこの「腫瘍形成」形態で発現される（Hikita et al., 2008）ことを最近発見した。本発明は、ＭＵＣ１＊及びＭＵＣ１＊関連因子、並びにそれらを多能性の誘導若しくは維持のため、又は多能性誘導の効率を増進するために利用する方法に関する。
【００２８】
本発明は、ｉＰＳ細胞の生成を誘導するか、又はその効率を向上させるために、タンパク質因子、それらをコードする遺伝子、又はそれらの発現に影響を及ぼす小分子を含むＭＵＣ１＊関連因子を使用することを包含する。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断形態であるＭＵＣ１＊が、癌細胞及び多能性幹細胞の両方の成長を媒介する主要な成長因子受容体であることを示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインと、その活性化リガンドＮＭ２３との間の相互作用が中断されることは、多能性幹細胞にとって致死的であり（Hikita et al., 2008）、この経路が多能性にとって重要であることを示唆している。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドである（Mahanta et al., 2008）（配列番号１２〜配列番号１７及び配列番号２２〜配列番号２３）。ＮＭ２３は、分化を阻害する一方で多能性幹細胞の成長を刺激するその能力に加えて、ｃ−Ｍｙｃの転写を誘導することが示されている（Dexheimer atal., 2009）。したがって、ＮＭ２３を多能性状態への変換が起きている細胞に添加することによって、ｃ−Ｍｙｃ癌遺伝子をトランスフェクトし、関連する健康上のリスクを緩和するという利益がもたらされる。加えて、ＮＭ２３又は二価抗ＭＵＣ１＊抗体によってＭＵＣ１＊を刺激することで、ＭＡＰキナーゼ増殖経路が活性化され、それにより細胞生存が増大する（Mahanta et al., 2008）。ＮＡＮＯＧ発現は多能性を誘導し、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３はＮａｎｏｇ発現を抑制する（Lin et al., 2007）。したがって、ｐ５３を抑制することによって、多能性の誘導に対するＮＡＮＯＧの必要性が低減又は排除される。ＭＵＣ１細胞質尾部（ＭＵＣ１０−ＣＴ）の異所的に発現される７２アミノ酸の断片は、癌細胞の核内に存在し、そこでｐ５３プロモーターに結合することが示されている（Wei et al., 2007）。配列番号１１に示されるようなＭＵＣ１−ＣＤのおよそ７２アミノ酸の断片は、ｉＰＳ細胞生成を誘導又は増進するために他の多能性誘導因子と組み合わせて使用することができる。しかしながら、このペプチドは天然のＭＵＣ１種とは一致せず、したがって望ましくない影響をもたらすおそれがある。本発明者らは、ＭＵＣ１＊が核に移行し（実施例１及び実施例９、並びに図６）、したがってｉＰＳ細胞生成を誘導若しくは増進するために、単独で、又は他の多能性誘導因子と組み合わせて使用されることを開示する。このアプローチの裏付けとして、中核となる多能性遺伝子からの幾つかの遺伝子が、ＭＵＣ１、その切断酵素及び／又はその活性化リガンドＮＭ２３の転写を調節することが報告されている（Boyer et al., 2005）。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はＭＵＣ１プロモーターに結合し、その切断酵素ＭＭＰ−１４のプロモーターにも結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭ２３プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊がｈＥＳＣの維持にとって重要であり、重要な多能性遺伝子の標的であると仮定して、本発明者らはＭＵＣ１＊、又はＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増大させる作用物質を、その活性化リガンドＮＭ２３と共に導入することを用いて、ｉＰＳ細胞の生成を誘導又は増進するために以前に同定された多能性誘導因子の一部又は全てを置き換えることができることを開示する。
【００２９】
本発明は、細胞において多能性を誘導するための、ＭＵＣ１＊に関与する新規の試薬及び方法を開示する。これらの試薬及び方法は、体細胞又は成熟細胞において多能性を誘導するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は、成熟細胞における多能性誘導の効率を増大させるために使用される。本発明のさらに別の態様では、これらの試薬及び方法は、未熟細胞を未熟状態に維持するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は分化を阻害するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は、幹細胞を多能性状態に維持するために使用される。
【００３０】
本発明は、成熟細胞、又は幾らか分化した細胞に、ＭＵＣ１＊及びその関連因子の発現に影響を及ぼす遺伝子又は遺伝子産物を導入することによって、分化を元に戻すか、又は幹様特性を維持することを含む。ＭＵＣ１＊は膜貫通タンパク質ＭＵＣ１の切断形態である。ＭＵＣ１＊関連因子としては、完全長ＭＵＣ１、ＭＵＣ１を切断する酵素、ＭＵＣ１＊活性化リガンド、さらにはＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊の発現に影響を及ぼす転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の遺伝子又は遺伝子産物の成熟細胞又は幾らか分化した細胞への導入が、これらの細胞又はそれらの子孫において多能性又は幹細胞性を誘導することにも関する（drawn to）。本願は、幹細胞において多能性を維持するためのそれらの使用を説明する。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の発現に影響を及ぼす作用物質は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ｍｙｃ及びＬＩＮ２８等の多能性を誘導することが既に知られている１つ又は複数の遺伝子若しくは遺伝子産物と組み合わせて、又は置き換えて添加することができる。
【００３１】
転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせの強制発現が、成熟細胞を多能性状態へと戻すことが示されている（非特許文献７）。多能性を誘導する転写因子は各々、十数個の遺伝子の転写を調節している。本発明者は、これらのうち幾つかをＭＵＣ１関連因子であると同定した。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＭＵＣ１プロモーター自体に結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＮＭ２３（ＮＭＥとしても知られる）は以前、本発明者によってＭＵＣ１＊の活性化リガンドとして同定された（Mahanta et al., 2008）。ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊の活性化リガンドである。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はどちらも、本明細書中でＭＵＣ１の切断酵素であるとして開示しているＭＭＰ１６のプロモーターに結合する。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２又はＮＡＮＯＧは、切断酵素ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＡＤＡＭ ＴＳＬ−１、ＡＤＡＭ ＴＳ−４、ＡＤＡＭ−１７（ＭＵＣ１切断酵素）、ＡＤＡＭ−ＴＳ１６、ＡＤＡＭ−１９及びＡＤＡＭ−２８のプロモーター部位にも結合する。これらの切断酵素の一部又は全てを、多能性を誘導するか、又はそれを維持するために、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増進するように上方調節することができる（Boyer et al, 2005）。
【００３２】
胚性幹細胞（ＭＵＣ１の切断形態であるＭＵＣ１＊のみを発現する）を用いた本発明者らの以前の研究では、その細胞外ドメインの二量化によって、成長が刺激され、分化が阻害されることが示された（Hikita et al., 2008）。これらの効果は、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを、二価抗ＭＵＣ１＊抗体、組み換えＮＭ２３、又は優先的に二量体を形成する突然変異体ＮＭ２３（Ｓ１２０Ｇ）のいずれかを用いて二量化することによって達成された（Kim et al., 2003）。一価抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂを用いたＭＵＣ１＊細胞外ドメインの阻害は、数時間以内に死をもたらした。これらの発見から、ＭＵＣ１＊が重要な「幹細胞性」因子であることが示唆される。また、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＭＵＣ１遺伝子プロモーター、さらにはその切断酵素のプロモーターに結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断することはｈＥＳＣにとって致死的であるため、多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＭＵＣ１、その切断酵素及びその活性化リガンドの発現を誘導するということになる。既に多能性を誘導することが示されている遺伝子又は遺伝子産物の１つ又は複数は、単独で、又はその切断酵素及び／又は活性化リガンドＮＭＥ７、ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲエピトープを二量化する抗体に加えて、ＭＵＣ１＊の遺伝子をトランスフェクトするか、又はその遺伝子産物を導入することによって置き換えることができる。
【００３３】
当業者にはよく知られているように、トランスフェクトされた遺伝子産物の局所化を指示するシグナル配列を、遺伝子に付加させることができる。シグナル配列の例は配列番号２〜配列番号４として与えられる。本発明は、ＭＵＣ１＊のＮ末端ドメインを、これらの遺伝子又は遺伝子産物の効果を実質的に変化させることなく短縮するか、又は最大で９アミノ酸まで伸長させることができることを意図する。配列番号５として例示されるＭＵＣ１＊、及び細胞外ドメインが基本的に配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で与えられる配列から構成される変異体が好ましい。
【００３４】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は上記で挙げたものを含む関連因子によって、多能性を誘導し、多能性を誘導するため又は多能性を維持するために使用される１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を置き換えることができる。
【００３５】
線維芽細胞及び皮膚線維芽細胞等の体細胞に、幹細胞様特徴の誘導（場合によっては子孫が多能性幹細胞になるよう誘導する）を助けるＭＵＣ１タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトする場合がある。本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の遺伝子を細胞にトランスフェクトして、幹細胞様状態への復帰を誘導する（場合によっては実際の多能性幹細胞を誘導する）。ＭＵＣ１遺伝子又はＭＵＣ１＊遺伝子の各々を、細胞に単独で、又は多能性若しくは幹細胞様特性の誘導を助ける他の遺伝子と組み合わせて導入してもよい。例えば、ＭＵＣ１、又は優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを、細胞にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする１つ又は複数の遺伝子と共に導入する。ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを線維芽細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Yu et al., 2007）。別の実施形態では、ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを体細胞、線維芽細胞又は他の細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Takahashi et al., 2007）。同様に、ＭＵＣ１＊及び／又はその活性化リガンドであるＮＭ２３、又はＮＭ２３のＳ１２０Ｇ突然変異体をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトして多能性を誘導する。ＭＵＣ１＊及び／又はＮＭ２３は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃ等の他の遺伝子と共にトランスフェクトして、多能性又は幹細胞様特性を誘導してもよい。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１を認識する抗体をコードするＤＮＡを細胞に単独で、又は他の遺伝子と共にトランスフェクトして、細胞又はその子孫において幹細胞特性を誘導することもできる。抗ＭＵＣ１＊抗体は分泌されると二量化し、それによりＭＵＣ１＊受容体、及び幹様特性を促進又は維持するその機能を活性化する。
【００３６】
同様に、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又はそれらの関連因子の発現に影響を及ぼす核酸、タンパク質、修飾タンパク質又は小分子等の因子を細胞に導入して、幹細胞の特性を誘導するか、又は多能性への復帰を誘導する。例えば、ＭＵＣ１切断酵素ＭＭＰ１４、ＭＭｐ１６、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＡＤＡＭ ＴＳＬ−１、ＡＤＡＭ ＴＳ−４、ＡＤＡＭ−１７（ＭＵＣ１切断酵素）、ＡＤＡＭ−ＴＳ１６、ＡＤＡＭ−１９及びＡＤＡＭ−２８の遺伝子又は遺伝子産物を細胞に導入して、多能性又は同様の特性を誘導する。
【００３７】
別の実施形態では、非タンパク質作用物質を細胞に添加して、多能性を誘導するか、又はその誘導を増進する。例えば、ホルボールエステルであるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）は、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊への切断を増大させる小分子である（Thathiah et al., 2003）。本発明の一態様では、ホルボールエステルを多能性への変換が起きている細胞に添加して、ｉＰＳ生成を誘導するか、又はその効率を増大させる。
【００３８】
別の例では、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊と相互作用するリガンドを体細胞、皮膚線維芽細胞、線維芽細胞又は幾らか分化した細胞に、単独で、又は多能性を誘導若しくは維持する他の遺伝子と組み合わせて添加して多能性を誘導する。例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子の１つ又は複数を、線維芽細胞又は他の細胞にトランスフェクトした後、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドの存在下で培養する。ＭＵＣ１＊の二量体タンパク質リガンドが好ましい。好ましい実施形態では、二価抗ＭＵＣ１＊抗体を、細胞又はその子孫が多能性幹細胞となるようにする遺伝子をトランスフェクトした細胞に添加する。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＮＭ２３（ＮＭ２３−Ｈ１、ＮＭ２３−Ｈ２又はＮＭＥ７）を、それをコードする遺伝子として、タンパク質自体として、又は細胞への侵入を容易にし、多能性の誘導若しくは維持を助けるポリアルギニントラクト等のリーダー配列を保有するタンパク質として細胞に導入する。本発明者らは、ＮＭ２３が多能性幹細胞（及び癌細胞）によって分泌される場合、ＭＵＣ１の切断形態（ＭＵＣ１＊）の活性化リガンドであり、ＭＡＰキナーゼ増殖経路を誘発することを最近示した。ＮＭ２３によるＭＵＣ１＊の刺激は、多能性ｈＥＳＣの成長を促進し、その分化を阻害することが示されてる（Hikita et al., 2008）。ＮＭ２３はｃ−ＭＹＣの転写も誘導し（Dexheimerat al., 2009）、ｃ−ＭＹＣの必要性をなくす。ＮＭ２３は、ＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化するその天然状態で、又は細胞及び核（そこでＮＭ２３はＣ−ＭＹＣ発現を誘導する）への侵入を容易にするポリアルギニントラクトを有する状態で外部から添加する。ＮＭ２３（ＮＭＥ）は、それをコードする核酸として、又は細胞への侵入を容易にする修飾を有するか、若しくは有しない発現されたタンパク質として添加してもよい。ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２又はＮＭＥ−７は、その天然状態又は突然変異体形態（Ｓ１２０Ｇ突然変異等の二量体状態が好ましい）で使用することができる。
【００４０】
本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメイン（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する二価抗体、又はＮＭ２３等の二量体ＭＵＣ１＊リガンド、又はそれらをコードする遺伝子を、ＭＵＣ１＊発現細胞に添加して、多能性を誘導するか、多能性誘導の効率を増大させるか、多能性を維持するか、又は分化を阻害する。これらのＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊と相互作用するタンパク質が添加される細胞は、天然の細胞、又は幹細胞様特性を誘導する遺伝子を添加した細胞、又は既に分化過程に入った細胞であっても、又は幹細胞であってもよい。
【００４１】
多能性を誘導する遺伝子を、同じか又は異なるプラスミド（レンチウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター、又は任意の組込み型若しくは非組込み型ウイルスベクター又は非ウイルスベクター、又はこれらの遺伝子の所望の細胞への導入を容易にする他の任意の系であり得る）に導入してもよい。
【００４２】
多くの場合、優先的には、多能性誘導タンパク質の効果を、それらをコードする核酸又は遺伝子ではなくタンパク質自体を導入することによって達成する。本発明は、遺伝子産物、タンパク質（天然状態であるか、又は細胞への侵入を可能にするポリアルギニントラクト等のリーダー配列によって修飾されている）によって置き換えることのできる、幹様特性又は多能性の誘導に関してここで開示される遺伝子を包含する。これらの遺伝子の産物、すなわちタンパク質、又はトランスフェクトされた遺伝子の産物の１つ又は複数と相互作用する他のタンパク質を細胞に導入して、多能性又は他の幹細胞様特性を誘導又は維持する。
【００４３】
他の場合では、成熟細胞又は分化細胞において、小分子等の合成作用物質を導入して、幹細胞性を誘導することが有益であり得る（非特許文献２３）。本発明の一態様では、小分子を細胞に添加して、多能性を誘導する遺伝子の転写を直接的又は間接的に誘導する。他の場合では、ＭＵＣ１＊の産生を直接的又は間接的に増大させる小分子を添加する。一例では、これらの小分子は、幹細胞に特徴的なＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増大させる。例えば、ホルボールエステルは、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊への切断を増大させる小分子であるため、細胞に添加されると、ＭＵＣ１＊を生成することによって多能性状態の誘導又は維持を促進する。
【００４４】
腫瘍抑制遺伝子としても知られるｐ５３は、アポトーシスを促進する。したがって、幹細胞を培養するか、又は体細胞若しくは他の細胞において多能性を誘導する場合、ｐ５３を阻害することが有利であり得る。本発明では、幹細胞性を維持するか、又は幹様特性若しくは多能性特性を誘導するために、ｐ５３抑制遺伝子を本発明の他の試薬及び方法と共に用いることが予想される。ｐ５３は多数の方法によって抑制することができる。ピフィスリン−μ等の小分子は、ｐ５３のアポトーシス促進効果を阻害するため（Strom, et al., 2006 Sep、Komarov, et al.,1999）、多能性誘導の効率を増大させるか、又は幹細胞性を維持するために細胞に任意で添加される。好ましい実施形態では、ｐ５３阻害剤は、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊を上方調節する遺伝子又は遺伝子産物（ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊遺伝子又は遺伝子産物、それらの活性化リガンド及びそれらの切断酵素を含むが、これらに限定されない）と共に使用される。
【００４５】
多能性の誘導又は幹細胞性の維持の効率を増大させるためにｐ５３活性を抑制する別の方法は、ＭＵＣ１＊タンパク質を細胞培養物に導入することである。ＭＵＣ１＊タンパク質は、細胞への侵入を容易にするポリアルギニントラクトを追加することによって修飾することができる。ＭＵＣ１の細胞質尾部（ＭＵＣ１−ＣＤ）の過剰発現は単独で、核へのその移行（そこでｐ５３プロモーターと結合することが分かった）をもたらすことが報告されている。これらの研究では、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３を下方制御するか、又は上方調節するかは決定することができなかった。本発明は、多能性又は他の幹様特性の誘導の効率を増大させるためのＭＵＣ１＊の異所性発現によるｐ５３の抑制にも関する。ＭＵＣ１＊は、遺伝子を細胞に挿入するか、タンパク質自体を外から添加するか、又はポリアルギニントラクトによって任意で修飾されたＭＵＣ１＊タンパク質を添加することによって導入することができる。
【００４６】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される実施形態に加えて、本発明の様々な変更形態が、以上の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。以下の実施例は限定としてではなく、本発明の例示として与えられる。
【実施例】
【００４７】
実施例１．ＭＵＣ１＊は成長及び細胞死抵抗性を促進する。
ＭＵＣ１＊は、線維芽細胞のクローン性成長（コロニー拡大）を促進する。完全長ＭＵＣ１（配列番号１）、ＭＵＣ１＊１１１０（配列番号５）又は空ベクターをトランスフェクトした３Ｙ１細胞の単一細胞クローンを、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地中に、６０ｍｍ皿当たり１０００個の細胞でプレーティングした。細胞を９日間増殖させた後、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。皿を水で洗浄した後、７０％メタノール中１％クリスタルバイオレットで室温で２０分間染色した。皿を水で３回洗浄し、室温で一晩乾燥させて、写真に撮った。図１Ａから、吸収されるクリスタルバイオレットの量（細胞数の指標）は、ＭＵＣ１＊単一細胞クローン＃３及び＃４４を増殖させる場合にはるかに高いことが示される。対照的に、完全長ＭＵＣ１をトランスフェクトした細胞（単一細胞クローン＃８及び＃１７）は、空ベクターをトランスフェクトした細胞に対して成長速度の増大を示さなかった。このことから、切断形態のＭＵＣ１＊は成長及び／又は生存の利点を有するが、完全長タンパク質は有しないことが示される。
【００４８】
実施例２．抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂは、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））抵抗性細胞（１ｕｇ／ｍｌのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）中での培養によって抵抗性にされた）において、ＴＡＸＯＬ（登録商標）による細胞死に対する抵抗性を遮断する。
Fessler et al., 2009は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抵抗性細胞がＴＡＸＯＬ（登録商標）、ドキソルビシン及びシクロホスファミドに対しても抵抗性であることを報告している。報告されているように、これらの薬物抵抗性癌細胞はＭＵＣ１＊を過剰発現することによって抵抗性を得る。以下の実験から、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのＰＳＭＧＦＲ部分を遮断することによって、癌細胞において獲得された薬物抵抗性が取り消されることが示された。親細胞（ＢＴ４７４）又は抵抗性細胞（ＢＴＲｅｓ１）を、９６ウェルプレート（４ウェル／条件）において、１００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル、Sigma、Ｔ７１９１）の存在下又は非存在下で、細胞に抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂ、対照Ｆａｂを添加したか、又はＦａｂを添加しなかった。２日後、細胞を５０μｌのトリプシン中に再懸濁し、トリパンブルーの存在下で計数した。細胞死率をトリパンブルー取り込み率として算出した。ＢＴ４７４細胞は、各々の条件下でＴＡＸＯＬ（登録商標）に応答して細胞死を起こし、ＢＴＲｅｓ１細胞はＭＵＣ１＊抗体の存在下でのみ細胞死を起こした（図１Ｂ）。
【００４９】
実施例３．ＭＵＣ１＊は成長因子受容体として働き、人工抗体（抗ＭＵＣ１＊抗体）又はその天然リガンドであるＮＭ２３（ＮＭＥ）を用いたその細胞外ドメインの二量化によって活性化される。
ＭＵＣ１＊陽性ＺＲ−７５−３０細胞（６０００個／ウェル）、又は対照（ＭＵＣ１陰性）ＨＥＫ２９３細胞（４０００個／ウェル）を、９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、０時間の細胞数を数え、２４時間又は４８時間毎に種々の濃度の抗ＭＵＣ１＊抗体又はＦａｂを低（０．１％）血清培地に添加した。数日間のインキュベーションの後、細胞をトリプシン中に再懸濁し、計数して、正規化成長率を算出した。ＺＲ−７５−３０細胞の刺激は、リガンド誘導性成長刺激について実証されているように、釣鐘型曲線を示したが、ＨＥＫ２９３細胞は示さなかった（図１Ｃ）。ＭＵＣ１を標的とするｓｉＲＮＡ、又は対照ｓｉＲＮＡを安定にトランスフェクトしたＭＵＣ１＊陽性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を用いた同様の実験では、成長の刺激は対照をトランスフェクトした細胞でしか起こらず、抗体の特異性がさらに実証される（図１Ｄ）。同一の結果が、ＭＵＣ１＊の天然リガンドであるＮＭ２３についても実証されている（図１Ｅ）。
【００５０】
実施例４．ＮＭ２３は、基本的にＭＵＣ１＊の細胞外ドメインから構成されるＰＳＭＧＦＲペプチドに特異的に結合する。
結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置及びＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定した。ヒスチジンタグ付きＭＵＣ１＊１１１０−ｅｃｄ（配列番号５）又は無関係のペプチド（HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS（配列番号３４））を、Mahantaet al. 2008に記載されるように、本発明者らの研究室で作製した５．７％ＮＴＡ−Ｎｉ＋＋ ＳＡＭでコートしたＳＰＲチップの別個のフローチャネルに固定化した。精製したウシ又は組み換えヒトＮＭ２３の３５μＬのプラグを５ｕＬ／分という一定流量（flow stream）で注入し、センサーグラム（sensograms）を記録した。ウシ肝臓から精製したＮＭ２３（Sigma、Ｎ−２６３５）を、ＰＢＳ単独で希釈した。親和性を、１：１ラングミュアモデルを用いて広範囲の濃度にわたって測定した。一次速度式ではこの系を適切に表すことができないため、実際の親和性は変わることがある（図１Ｆ）。
【００５１】
実施例５．ＭＵＣ１＊成長因子受容体及びそのリガンドＮＭ２３は、未分化ｈＥＳＣ上に存在するが、分化ｈＥＳＣ上には存在しない。
未分化（多能性）状態又は分化したばかりの状態のヒト胚性幹細胞を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって分析した。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ（dissected）、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライド（Nunc）にプレーティングした。未分化細胞については、細胞をプレーティングの５日後〜７日後に固定した。分化細胞については、プレーティングの５日後〜７日後にｂＦＧＦを培養培地から除去して、細胞を１４日間分化させた後、固定した。細胞はＰＢＳで洗浄してから、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで、４℃で１５分間固定した。細胞を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び１％ロバ又はヤギ血清で１時間ブロッキングした。０．１％ＮＰ−４０を細胞内抗原に対する抗体として使用した。一次抗体をブロッキングバッファー（block）で希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した：ＯＣＴ４（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ Ｃｌｏｎｅｓ Ｈ−１３４及びＣ−１０、１００倍希釈）、完全長ＭＵＣ１（ＶＵ４Ｈ５、Santa Cruz Biotechnology、５０倍希釈）、ＭＵＣ１＊（Minerva、２５０倍希釈）又はＮＭ２３（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ ＮＭ３０１、１００倍希釈））。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、以下の二次抗体と共に３０分間インキュベートした：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ３５０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、２００倍）；ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＴＲ（Santa Cruz、１００倍）。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、退色防止封入剤（anti-fade mounting medium）（Biomeda）を用いてカバースリップを載せた。５分間のＤＡＰＩ染色（１μｇ／ｍｌ）によって核を可視化した。免疫染色した細胞を、OlympusのＢＸ−５１落射蛍光顕微鏡上で可視化した。これらの実験の結果から、ＭＵＣ１＊は未分化細胞（多能性幹細胞）の表面上に存在するが（図２Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）、分化ｈＥＳＣ上には存在しない（図２Ｄ）ことが示される。図３から、ＭＵＣ１＊のリガンドであるＮＭ２３はＭＵＣ１＊と共局在化することが示される（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＭＵＣ１＊及びそのリガンドであるＮＭ２３は、多能性幹細胞（ＯＣＴ４陽性細胞）上でしか発現されず、分化した細胞上では発現されない（図３Ｃ及び図３Ｆ）（ＤＡＰＩによってＯＣＴ４陰性細胞の核が染色される）。
【００５２】
実施例６．ＭＵＣ１＊は多能性幹細胞の成長を媒介する。
二価抗ＭＵＣ１＊を用いたＭＵＣ１＊の刺激の多能性幹細胞に対する効果を決定するために、以下の実験を行った。結果から、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの添加によって、多能性（ＯＣＴ４陽性）幹細胞の成長が刺激され、フィーダー細胞、その抽出物又はｂＦＧＦの非存在下でのその成長も可能となることが示される。
【００５３】
多能性（ＯＣＴ４陽性）ｈＥＳＣの長期的成長は、ＭＵＣ１＊の刺激によって媒介される。ｈＥＳＣをトリプシン解離して、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに４×１０４細胞／ウェルで播種した。培地を交換し、個々のコロニーが見えるようになるまで、抗体を二価抗ＭＵＣ１＊に対する最終濃度１μｇ／ｍｌで一日おきに添加した。培養条件には、ｂＦＧＦを添加した及びｂＦＧＦを添加していない、「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）及びＨｓ２７馴化培地が含まれる。各々の条件について細胞を４連で（in quadruplicate）増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定して、上記のようにＯＣＴ４免疫染色を行った。図４のパネルＡ〜パネルＤは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加したマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。パネルＥ〜パネルＨは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加しなかったマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。抗ＭＵＣ１＊抗体の細胞培養物への添加（図４Ｃ、図４Ｄ）は、ｂＦＧＦを添加したものの成長（図４Ａ、図４Ｂ）と比べて、より多くの多能性幹細胞を生じた。線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地の非存在下で培養した細胞への抗ＭＵＣ１＊抗体の添加（図４Ｇ、図４Ｈ）は、多能性細胞を生じなかった（ＯＣＴ４の非存在）ｂＦＧＦを添加して増殖させた細胞（図４Ｅ、図４Ｆ）とは全く対照的に、豊富な多能性幹細胞を生じた。
【００５４】
実施例７．ＭＵＣ１＊刺激の多能性幹細胞の成長を増進する効果を、定量的カルセインアッセイにおいて直接測定した。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ、９６ウェルプレートのマトリゲルコートウェル上で１．９×１０４細胞／ウェルの密度で増殖させた。培養培地は、３０％Ｈｓ２７馴化培地を添加したｈＥＳＣ培地及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有していた。抗体を、二価抗ＭＵＣ１＊については１μｇ／ｍｌ、一価抗ＭＵＣ１＊については１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。実験は３連で（in triplicate）行った。抗体処理の４１時間後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Molecular Probes）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、生細胞及び死細胞を定量化した。Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて蛍光を測定した。図５の棒グラフから、二量化リガンド（抗ＭＵＣ１＊）を用いたＭＵＣ１＊の刺激は、幹細胞成長を増進し、一方で抗ＭＵＣ１＊ ＦａｂによりＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断し、全幹細胞死をもたらすことが示される。
【００５５】
実施例８．二価抗ＭＵＣ１＊抗体、ＮＭ２３、ＮＭ２３突然変異体又はｂＦＧＦを用いた幹細胞成長の刺激の効果を比較するために、長期的幹細胞成長実験を行った。
ｈＥＳＣをトリプシンで解離させ、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに、８．２×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種した。培地を交換し、抗体又は野生型若しくは突然変異体ＮＭ２３タンパク質を、抗ＭＵＣ１＊抗体については８０ｎｇ／ｍｌ、野生型組み換えＮＭ２３若しくは突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）ＮＭ２３については１ｎＭの最終濃度で、又は組み換えｂＦＧＦを「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）中４ｎｇ／ｍｌの最終濃度で一日おきに添加した。対照として、Ｈｓ２７線維芽細胞からの３０％馴化培地及び４ｎｇ／ｍｌの組み換えｂＦＧＦ（Peprotech、＃１００−１８Ｂ）を含む最小幹細胞培地において、細胞を同様に増殖させた。この実験の結果から、ＭＵＣ１＊リガンドが、マトリゲル上のこれらの細胞の「正常」増殖培地である馴化培地＋ｂＦＧＦと比べて、最小培地における多能性コロニーの成長をより良く刺激することが示される。表１に結果を詳述する。
【００５６】
表１．最小培地において４週間培養したｈＥＳＣ
増殖条件 最初にコロニーが コロニー数 形態
現れた週
最小幹細胞増殖培地
ＮＭ２３
１ｎＭ ２週目 ２つのコロニー 説明Ａ参照
ＮＭ２３−
Ｓ１２０Ｇ
突然変異体
１ｎＭ ２週目 ７つのコロニー 説明Ｂ参照
抗ＭＵＣ１＊
８０ｎｇ／ｍｌ ２週目 ５つのコロニー 説明Ｃ参照
ｂＦＧＦ
４ｎｇ／ｍｌ − ０ 説明Ｄ参照
なし ２週目 ２つのコロニー 説明Ｅ参照
対照 Ｈｓ２７線維芽フィーダー細胞からの３０％馴化培地
ｂＦＧＦ
４ｎｇ／ｍｌ ２週目 ５ 説明Ｆ参照
説明Ａ：２つのウェルの一方において２つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｂ：２つのウェルの一方において７つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｃ：２つのウェルの一方において５つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｄ：コロニーなし
説明Ｅ：２つの非常に小さな分化したコロニー
説明Ｆ：５つのほとんど分化したコロニー
【００５７】
実施例９．ＭＵＣ１＊は細胞の核に移行する。
抗ＭＵＣ１＊モノクローナルＡｂを、Ａｌｅｘａ ５５５色素によってｉｎ ｖｉｔｒｏで標識し、ＭＵＣ１＊をトランスフェクトしたＨＣＴ−１１６細胞（ＭＵＣ１陰性）（冷ＰＢＳで４℃で洗浄した）に４℃で結合させた。２０分後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定するか、又は予熱した（pre-warmed）増殖培地を用いてインキュベートした。４０分後、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した後、ブロッキングし、ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ、２．５％ＦＢＳ及び０．１％ＮＰ−４０で透過化処理した。抗ＥＥＡ１抗体（Cell Signaling Technologies、２４１１Ｓ）及びＡｌｅｘａ ４８８（Invitrogen、２００倍）を用いてエンドソームを染色した（図６）。
【００５８】
実施例１０．ＭＵＣ１＊は核に移行し、そこで転写因子又は補因子として機能する。
ＭＵＣ１の細胞質ドメイン（ＭＵＣ１−ＣＤ）に相当する、人工的に発現させたペプチドが核に移行することが科学文献において以前に報告されている（Huang, et al. 2005）。別の研究では、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３のプロモーター部位に結合することが報告されている（Wei, et al. 2007）。しかしながら、Wei, et al., 2007の報告では、この能力に関して、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３の転写を上方調節するか、又は下方制御するかは決定されていない。幹細胞性又は多能性を誘導又は維持するためには、ｐ５３を抑制するのが望ましい（Maimets, et al., 2008）。さらに、ＭＵＣ１の細胞質ドメイン単独の強制発現は、ＭＵＣ１のいかなる天然状態又は切断状態にも一致しない。したがって、本発明者らは、これが実際に核に移行する多能性のマーカーであるＭＵＣ１＊であるか否かを決定しようとした。
【００５９】
ＭＵＣ１＊上のＰＳＭＧＦＲエピトープを認識するが、ＭＵＣ１が完全長である場合には同じエピトープを認識しない（Mahanta et al 2008）ポリクローナル抗体である抗ＭＵＣ１＊を使用して、ヒト胚性幹細胞をHikita et al (2008)の方法に従って染色した。胚性幹細胞は、ＭＵＣ１＊を排他的に発現し、完全長ＭＵＣ１を発現しない。免疫細胞化学によって、ＭＵＣ１＊が胚性幹細胞の核内で検出されることが多いことが示された。蛍光標識した（tagged）抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂフラグメントを、ＭＵＣ１＊又は空ベクターをトランスフェクトした細胞と共にインキュベートした。過剰のＦａｂを除去し、細胞をＰＢＳで４℃で洗浄してパラホルムアルデヒドで固定するか、又は受容体内在化を促すために予熱した培地を用いて３７℃で１０分間、２５分間若しくは４０分間インキュベートした後、パラホルムアルデヒド固定した。様々な時点で細胞を４℃にし、受容体内在化を停止させた。ＦａｂはＭＵＣ１＊をトランスフェクトした細胞に特異的に結合したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（データは示さない）。図６では、４０分後にＭＵＣ１＊が細胞の核に移行したことが示される。
【００６０】
実施例１１．ＭＵＣ１関連因子を用いて、ｐ５３並びにそのアポトーシス促進効果及び成長阻害効果を阻害し、ｉＰＳ（人工多能性幹）細胞を生成する効率を増大させる。
小分子Ｎｕｔｌｉｎは、ｐ５３とその天然阻害剤ｈＤＭ２との間の相互作用を妨げることによってｐ５３の活性を増大させる（Vassilev et al., 2004）。Ｎｕｔｌｉｎによるｐ５３活性の誘導は、ヒト胚性幹細胞の分化を推進する（Maimets, et al., 2008）。同様に、胚性幹細胞におけるｐ５３の過剰発現は、おそらくはアポトーシスの誘導によってｈＥＳＣの成長を阻害する（Maimets, et al., 2008）。ｐ５３欠損マウスでは、原発腫瘍の形成（establishment）が増進された（Zhou et al., 2000）。このため、ｐ５３活性を妨げることによって、ｉＰＳ細胞株を樹立する効率が増大する。
【００６１】
「中核となる」多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４を用いた新規のｉＰＳ株の樹立において、多能性の誘導は、初めにｐ５３を小分子Ｎｕｔｌｉｎによって阻害し、次いでＭＵＣ１＊を導入することで増進される。ＭＵＣ１＊は、１）ＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡをトランスフェクトすること、及びｂ）効率的に細胞に侵入するようポリアルギニントラクトによって修飾された組み換えＭＵＣ１＊タンパク質を添加することによって、多能性の誘導が起きている細胞に導入する。
【００６２】
中核となる多能性遺伝子を皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした。しかしながら、皮膚線維芽細胞又は他の成熟細胞への直接的又は間接的な遺伝子産物の外因性発現も予想される。本発明では、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は関連因子の添加によって、中核となる多能性因子の一部又は全部が除外され得ることも予想される。
【００６３】
多能性の誘導は、ＭＵＣ１の細胞質尾部に相当するペプチドを、多能性への変換が起きている細胞に外部から添加した場合にも増進される。任意で、ＭＵＣ１−ＣＤを、ペプチドが細胞に侵入することを可能にするポリアルギニントラクト等のリーダー配列で修飾する。
【００６４】
実施例１２．ＭＵＣ１関連タンパク質の導入は、ｃ−ｍｙｃの転写を誘導すること及びＭＵＣ１＊を活性化することによって多能性を増進する。
ｃ−Ｍｙｃは多能性の誘導を増進することが示されている。ＮＭ２３はｃ−ｍｙｃの転写を誘導し（Dexheimer et al., 2009）、ｃ−ｍｙｃの必要性をなくす。ＮＭ２３を、それをコードする核酸のトランスフェクションによって、又はタンパク質自体（細胞侵入を助けるポリアルギニントラクト等の配列で修飾してもよい）を外部から添加することによって、ｉＰＳへの変換が起きている細胞に導入する。ＮＭ２３の野生型又は突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）（二量体形態が好ましい）を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加する。ｉＰＳ細胞生成の効率が増進される。
【００６５】
ＮＭ２３（ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２又はＮＭＥ−７）は、多能性の誘導又は維持を増進する。ＮＭ２３は、以前に同定された多能性因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４を含むが、これらに限定されない）、及び本明細書中で開示される他の因子と共に導入される。
【００６６】
実施例１３．ＭＵＣ１＊関連因子を含む、新たな中核となる多能性因子の同定
多能性を誘導若しくは維持するか、又はｉＰＳｃ形成の効率を向上させるか、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４から構成される多能性遺伝子セットの１つ又は複数を置き換えるために、ＭＵＣ１＊を細胞に導入する。ＭＵＣ１＊をコードする核酸を含有するＤＮＡ構築物を、上述の多能性遺伝子セット（又はそれらの遺伝子産物）の組み合わせと共に皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。ｉＰＳコロニー形成の効率を、生成された幹細胞の数を計数することによって決定する。さらに、細胞をＯＣＴ４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １−６０、ＴＲＡ １−８１、ＴＲＡ ２−４９／６Ｅ（アルカリホスファターゼ）及びＮＡＮＯＧ等の多能性マーカーの免疫蛍光検出によって分析する。得られた細胞を核型安定性、及び３つの異なる生殖細胞系列（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に沿って分化する能力について評価する。これは、中胚葉検出についてはＣＤ３４又は平滑筋アクチン、内胚葉検出についてはＧＡＴＡ−４又はサイトケラチン１９、外胚葉検出についてはネスチン又はβＩＩＩチューブリン等といった生殖細胞系列特異的マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光検出によって決定する。ＭＵＣ１＊活性化リガンド、好ましくは抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３（ＮＭＥ）を任意で添加して、多能性の誘導又は維持をさらに増進する。
【００６７】
引用文献
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【００６８】
本明細書において引用されている引用文献は全て、その全体が参照により援用される。
【００６９】
当業者であれば、日常的な実験しか用いなくても、本明細書において具体的に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は確かめることができる。かかる均等物は特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本願は、細胞における多能性誘導の分野に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００８年１０月９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／１０４，２３１号（その内容全体が参照により援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
転写因子の異所性発現によって体細胞をリプログラムし、多能性にすることができることがマウス及びヒトにおいて実証されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。疾患又は老化によって引き起こされる損傷を修復するために、患者自身の皮膚細胞に由来する幹細胞を使用して細胞及び組織を生成することができるため、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の生成は、完全に個人化された再生医療の実現に大いに有望である（非特許文献１０、非特許文献１１）。転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせの強制発現が成熟細胞を多能性状態へと戻すことが示されている。
【０００４】
以前の研究では、これらの転写因子は複数のウイルスベクターを用いて発現させていた（非特許文献７、非特許文献４、非特許文献２、非特許文献８、非特許文献６、非特許文献９、非特許文献５）。この複数のベクターの使用は、複数の組込みイベントのために問題を生じ、これは発癌性リスクの増大につながるおそれがある（非特許文献７、非特許文献１２）。研究者らは、単一のベクター系（非特許文献１３）、摘出可能なベクター（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）、非組込み型（non-integrating）ベクター（非特許文献１７、非特許文献１８）及び一時的トランスフェクション（非特許文献１９）を用いることによってこの問題を克服しようと試みてきた。しかしながら、これらの方法はエピジェネティックリプログラミングを達成する上で極めて非効率的である。
【０００５】
多能性を誘導する方法には、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃのトランスフェクションが含まれるが、これは癌を引き起こす可能性があるため望ましくない。ｉＰＳ細胞は、ｃ−Ｍｙｃをトランスフェクトすることなく生成することができる（非特許文献３、非特許文献２０）。しかしながら、そのリプログラミングの効率は大幅に低下している。同様に、Ｋｌｆ４は異形成を誘導するおそれがある（非特許文献２１）。
【０００６】
複数のウイルスベクターの組込み、及び多能性を誘導する遺伝子の一部の望ましくない副作用に関連する問題から、多能性誘導遺伝子の一部又は全ての使用を、その発現を調節するか、若しくは多能性誘導遺伝子によって発現が調節されるタンパク質遺伝子産物及びタンパク質、又は多能性を誘導する遺伝子若しくはタンパク質の発現を調節する小分子の使用に置き換える必要がある。この目的で、遺伝子ではなく、遺伝子産物の導入によっても多能性が誘導されたことが報告されている（非特許文献２２）。細胞への侵入を容易にするためにポリアルギニンでタグ付けされた組み換えＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃによって、マウス体細胞がリプログラムされた。小分子を用いて中核となる（core set）遺伝子のうち１つの必要性をなくした例もある。Ｎａｎｏｇを上方調節する小分子によって、同様にＮａｎｏｇを上方調節するＫｌｆ４遺伝子が不要となっている（非特許文献２３）。別の研究では、小分子ＨＤＡＣ阻害剤によってＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの両方が不要とされている（非特許文献２４）。これらの研究から以下のことが示される：１）タンパク質遺伝子産物によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；２）遺伝子を上方調節する小分子によって上記遺伝子の必要性をなくすことができる；及び３）同じ調節経路の遺伝子（又は遺伝子産物）は相互に代用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lowry et al., 2008
【非特許文献２】Maherali et al., 2007
【非特許文献３】Nakagawa et al., 2008
【非特許文献４】Okita et al., 2007
【非特許文献５】Park et al., 2008
【非特許文献６】Takahashi et al., 2006
【非特許文献７】Takahashi and Yamanaka, 2006
【非特許文献８】Wernig et al., 2007
【非特許文献９】Yu et al., 2006
【非特許文献１０】Yamanaka, 2007
【非特許文献１１】Jaenish and Young, 2008
【非特許文献１２】Aoi et al., 2008
【非特許文献１３】Sommer et al., 2009
【非特許文献１４】Kaji et al., 2009
【非特許文献１５】Soldner et al., 2009
【非特許文献１６】Woltjen et al., 2009
【非特許文献１７】Stadtfeld et al., 2009
【非特許文献１８】Yu et al., 2009
【非特許文献１９】Okita et al., 2009
【非特許文献２０】Wernig et al., 2008
【非特許文献２１】Foster et al., 2005
【非特許文献２２】Zhou et al., 2009
【非特許文献２３】Lyssiotis et al., 2009
【非特許文献２４】Huangfu et al., 2008, a&b
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの成果にもかかわらず、これらの方法にはリプログラミングの効率が低いとの欠点があるという大きな問題が残っている。現在の体細胞における多能性の誘導率は低過ぎるため、ｉＰＳ細胞の治療的使用は非実用的である。したがって、単独で、又は既に同定されたものに加えて、細胞において多能性を誘導するか、又は多能性誘導の効率を向上させるタンパク質及び小分子を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、細胞において多能性を誘導又は維持する方法であって、細胞を、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種と接触させることを含む、方法に関する。生物種は遺伝子又はタンパク質であり得る。タンパク質は、好ましくはＭＵＣ１＊リガンドであり得る。リガンドは好ましくはＮＭ２３である。タンパク質は抗体、好ましくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲ配列を特異的に認識する二価抗体であってもよい。別の態様では、化学種は小分子であり得る。好ましくは、小分子はＭＵＣ１、その切断酵素又はＮＭ２３の転写を増進し得る。好ましくは、切断酵素はＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１４又はＡＤＡＭ−１７であり得る。さらに、小分子はＭＵＣ１の切断を増進し得る。小分子はホルボールエステルであってもよい。
【００１０】
別の態様では、上記遺伝子はＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊、又はその有効フラグメント、又はＭＵＣ１＊抗体若しくはＮＭ２３等（これらに限定されない）といったＭＵＣ１＊のリガンドをコードし得る。好ましくは、フラグメントはＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊の細胞質尾部であり得る。
【００１１】
さらに他の態様では、本発明は細胞を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４又はＬＩＮ２８、好ましくはＯＣＴ４及びＳＯＸ２の発現を増大させる分子等（これらに限定されない）といった多能性を誘導する遺伝子産物の発現を増大させるさらなる分子と接触させることに関する。
【００１２】
本発明のこれら及び他の目的は、以下の本発明の説明、添付の参考図面及び添付の特許請求の範囲から、より完全に理解される。
【００１３】
本発明は、本明細書中で下記に与えられる詳細な説明、及び例示目的のみで与えられ、したがって本発明を限定するものでない添付の図面からより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。クローン原性アッセイから、ラット線維芽細胞（３Ｙ１）にＭＵＣ１＊をトランスフェクトすることによって成長速度が増大するが、ＭＵＣ１（完全長）では増大しないことが示される。図１Ｂ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＭＵＣ１＊活性は生存を増大させる。ＴＡＸＯＬ（登録商標）に対する抵抗性を獲得した乳癌細胞では、ＭＵＣ１＊発現を増大させることによって生存が増大する。抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂでの処理によって、獲得されたＴＡＸＯＬ（登録商標）誘導性細胞死に対する抵抗性が取り消される（reverses）。図１Ｃ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのリガンド誘導性二量化は成長を刺激する。二価抗ＭＵＣ１＊抗体の添加によって、ＭＵＣ１＊陽性細胞の成長が刺激される。抗ＭＵＣ１＊（ｍｖ）Ｆａｂでの遮断によって細胞成長が阻害される。この釣鐘型の成長曲線は受容体二量化に特徴的である。対照のＭＵＣ１陰性ＨＥＫ ２９３細胞の成長は影響を受けなかった。図１Ｄ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。特異的ｓｉＲＮＡを用いたＭＵＣ１＊の抑制によって、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの添加の成長刺激効果が無効となる。図１Ｅ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＮＭ２３は天然のＭＵＣ１＊活性化リガンドである。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊陽性癌細胞の成長を刺激し、受容体二量化を示唆する釣鐘型曲線を示す。ｓｉＲＮＡによるＭＵＣ１の抑制によって効果は無効となる。図１Ｆ：ＭＵＣ１＊が成長速度を増大させることを示す図である。ＮＭ２３のＭＵＣ１＊ペプチドへの直接結合はＳＰＲによって検出される。１５ｎＭ ＮＭ２３はＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドには結合するが、無関係のペプチドには結合しない。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）及びＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭでコートしたＡｕチップを用いて測定を行った。 図１Ｂの縦軸は、細胞死率（％）、non FabはＦａｂなし、Con Fabは対照Ｆａｂ、No TaxolはＴａｘｏｌなしを意味する。図１Ｃの縦軸は正規化細胞成長率（％）、横軸は抗ＭＵＣ１＊抗体濃度を意味する。図１Ｄの縦軸は成長率（％）、横軸は抗ＭＵＣ１＊、controlは対照を意味する。図１Ｅの縦軸は成長率（％）、NM23conc.はＮＭ２３濃度、Controlは対照を意味する。図１Ｆの縦軸は共鳴単位、横軸は時間（秒）、NM23injectionはＮＭ２３注入、MUC1＊surfaceはＭＵＣ１＊細胞外ドメイン表面、contro; peptide surfaceは対照ペプチド表面を意味する。
【図２】ＭＵＣ１が未分化ｈＥＳＣ上で切断されるが、分化ｈＥＳＣ上では切断されないことを示す図である。免疫細胞化学から、未分化（多能性）幹細胞はＭＵＣ１＊を発現するが、完全長タンパク質は発現しないことが示される。ＯＣＴ４は多能性の最も基準となる（gold standard）マーカーである。全ての多能性幹細胞はＭＵＣ１＊陽性である。しかしながら、分化が始まると（ＯＣＴ４発現の消失）、直ぐに切断が停止し、完全長ＭＵＣ１（ＭＵＣ１−ＦＬ）のみが検出される。パネルＡ〜パネルＣは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＡはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体、Ｂは抗ＯＣＴ４、Ｃは抗ＭＵＣ１完全長ＶＵ４Ｈ５で染色している。パネルＤ〜パネルＦは同じ分化したばかりの幹細胞コロニーの写真であり、ＤはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体、Ｅは抗ＯＣＴ４、Ｆは抗ＭＵＣ１完全長ＶＵ４Ｈ５で染色している。 UNDIFFERENTIATED:未分化、DIFFERENTIATED:分化を意味する。
【図３】ＮＭ２３（ＭＵＣ１＊リガンド）が未分化ｈＥＳＣ上ではＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と共局在化するが、分化細胞上では共局在化しないことを示す図である。免疫細胞化学から、未分化（多能性）幹細胞が、ＭＵＣ１＊及びその活性化リガンドであるＮＭ２３を発現することが示される。しかしながら、幹細胞が分化し始めると（ＯＣＴ４発現の消失）、ＭＵＣ１は完全長タンパク質として発現され、ＮＭ２３は分泌されなくなる。点線は、未分化の部分と分化したばかりの部分との間の境界を示す。パネルＡ〜パネルＣは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＡはＮＭ２３を認識する抗体、ＢはＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗ＭＵＣ１＊抗体で染色している。ＣはＡとＢとを重ね合わせたものであり、核を染色するために同じ細胞をＤＡＰＩで染色している。パネルＤ〜パネルＦは同じ未分化幹細胞コロニーの写真であり、ＤはＮＭ２３を認識する抗体、ＥはＯＣＴ４を認識する抗体で染色している。ＦはＤとＥとを重ね合わせたものであり、核を染色するために同じ細胞をＤＡＰＩで染色している。
【図４】ｂＦＧＦ及び馴化培地の非存在下において、ＭＵＣ１＊を刺激することによってｈＥＳＣの成長が促進され、分化が阻害されることを示す図である。二価抗ＭＵＣ１＊抗体を用いたＭＵＣ１＊細胞外ドメインのリガンド誘導性二量化によって、ｂＦＧＦ又は馴化培地を添加していない最小培地での５週間の増殖の後、ほぼ１００％の多能性コロニーが産生された。コロニーはマトリゲル上で増殖させた。ＮＭ２３又はＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ突然変異体をＭＵＣ１＊を活性化するのに用いた場合も同じ結果が得られた。パネルＡ〜パネルＤは、細胞増殖培地に線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地、加えて抗ＭＵＣ１＊又はｂＦＧＦのいずれかを添加したウェルの写真である。パネルＥ〜パネルＨは、幹細胞を抗ＭＵＣ１＊又はｂＦＧＦのいずれかを加えた最小培地において培養したウェルの写真である。画像は、ＡではＯＣＴ４を認識する抗体で染色した細胞、ＢではＡの細胞のＤＡＰＩ染色、Ｃでは抗ＭＵＣ１＊で染色した細胞、ＤではＣの細胞のＤＡＰＩ染色、ＥではＯＣＴ４を認識する抗体で染色した細胞、ＦではＥの細胞のＤＡＰＩ染色、Ｇでは抗ＭＵＣ１＊で染色した細胞、ＨではＧの細胞のＤＡＰＩ染色である。 Conditioned Medium：馴化培地、Feeder Free：フィーダー細胞なし、Anti-MUC1*：抗ＭＵＣ１＊を意味する。
【図５】ＭＵＣ１＊活性が多能性幹細胞の成長に必要とされることを示す棒グラフを示す図である。抗ＭＵＣ１＊ ＦａｂでＭＵＣ１＊を遮断することによって、ｂＦＧＦ及び馴化培地（ＣＭ）が存在する場合であっても、８時間〜１２時間以内に全幹細胞死が引き起こされた。二価抗ＭＵＣ１＊は成長を刺激した。細胞を２５時間培養し、生細胞をカルセイン蛍光アッセイにおいて測定した。 H9 hESCs on Matrigel+CM+bF ：マトリゲル＋ＣＭ＋ｂＦＧＦ上でのＨ９ ｈＥＳＣ、Bivalent Anti-MUC1*：二価抗ＭＵＣ１＊、Fab Amti-MUC1*(monovalent)：Ｆａｂ抗ＭＵＣ１＊（一価）、Control Fab：対照Ｆａｂ、No Antibody：抗体なしを意味する。
【図６】ＭＵＣ１＊が細胞の核に移行することの証拠となる写真を示す図である。ＭＵＣ１＊ Ｆａｂを蛍光標識し（赤色）、次いでＭＵＣ１＊陽性細胞と共にインキュベートした。写真から、ＭＵＣ１＊が最初は細胞表面上に均一に分散していることが示される。しかしながら、４０分後にはＭＵＣ１＊は核内に集中している。比較のため、細胞をＥＥＡ１を認識する蛍光標識した抗体でも染色したが（緑色）、これは実験全体を通して細胞質中に均一に分散したままである。Ａは０時点（time zero）で撮影した細胞の写真であり、Ｂは抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂの添加の４０分後に撮影した細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願において、「a」及び「an」は、単一及び複数の対象の両方を指すように使用される。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」とは、ＭＵＣ１＊シグナル伝達を直接的又は間接的に増大させることを指し、ＭＵＣ１＊受容体の二量化、さらにＭＵＣ１受容体の切断によるＭＵＣ１＊の産生の増大を含むが、これらに限定されない。ＭＵＣ１＊活性は、ＭＵＣ１受容体（さらに切断され、二量化される）の転写発現の増加によっても増大し得る。したがって、一態様では、ＭＵＣ１＊活性はＭＵＣ１＊を二量化するエフェクター分子の活性の増大、又はＭＵＣ１を切断してＭＵＣ１＊を形成する切断分子の活性の増大、又はＭＵＣ１の発現の増加によって増大し得る。したがって、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの活性を増大させることが可能な任意の化学種又は生物種、ＭＵＣ１＊を形成するＭＵＣ１切断酵素、又はＭＵＣ１の発現を増進する任意の転写活性化因子が、「ＭＵＣ１＊活性を増大させる」種として包含される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体」（ＭＧＦＲ）は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用するＭＵＣ１受容体の部分を意味する機能定義である。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近い細胞外部分であり、下記に定義されるように、ＰＳＭＧＦＲの大部分又は全てによって規定される。ＭＧＦＲは、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体の一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）とは、場合によってはＭＧＦＲの大部分又は全て、並びにそのペプチド配列の機能的変異体及び断片を規定するペプチド配列を指す。ＰＳＭＧＦＲは、配列番号６、並びに２０個までの任意の整数値（すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、及び／又は２０個までの任意の整数値のアミノ酸付加若しくは欠失を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に有する、その全ての機能的変異体及び断片として定義される。上記の文脈における「機能的変異体又は断片」とは、配列番号６のペプチドと特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用するリガンドと特異的に結合するか、又は別の形で（otherways）特異的に相互作用する能力を有するが、ペプチド分子が他の同一なペプチド分子と会合する（すなわち自己会合する）能力を有するほど、それら自身と同一な他のペプチド分子の同一な領域とは強く結合しない変異体又は断片を指す。配列番号（SEQ NO:）６のＰＳＭＧＦＲペプチドの機能的変異体であるＰＳＭＧＦＲの一例は配列番号８であり、-SRY-の代わりに-SPY-配列を含むことによって配列番号６とは異なる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊」とは、細胞外ドメインが本質的にＰＳＭＧＦＲ（配列番号５）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質を指す。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊関連因子」とは、ＭＵＣ１＊を修飾する、活性化する、その活性を調節する、又はその発現を調節する作用物質を指す。ＭＵＣ１＊関連因子としては、ＭＵＣ１＊受容体の二量化に影響を及ぼす、ＭＵＣ１＊の産生を増大させる、ＭＵＣ１受容体の切断を誘導する作用物質、ＭＵＣ１受容体（さらに切断され、二量化される）の転写発現の増加によってＭＵＣ１＊の活性を増大させる作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「有効量」とは、有益な又は所望される臨床的又は生化学的な結果をもたらすのに十分な量である。有効量は一回又は複数回投与することができる。本発明の目的上、阻害剤化合物の有効量とは、細胞の多能性を誘導若しくは維持するか、又はＭＵＣ１＊を活性化するのに十分な量である。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「断片」又は「機能的誘導体」とは、天然のリガンド又は本発明の受容体の生物学的に活性なアミノ酸配列変異体及び断片、並びに有機誘導体化剤との反応によって得られた誘導体を含む共有結合修飾、翻訳後修飾、非タンパク性ポリマーを有する誘導体、及びイムノアドヘシンを指す。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「リガンド」とは、ポリペプチド等の分子に共有結合的又は一時的に、特異的に結合する任意の分子又は作用物質又は化合物を指す。或る特定の文脈で使用される場合、リガンドは抗体を含み得る。他の文脈では、「リガンド」は、ＭＵＣ１＊に対する天然若しくは非天然のリガンド、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊に結合する切断酵素、又はＭＵＣ１＊に対する二量化リガンド等（これらに限定されない）といった別の分子によって高親和性で結合される分子を指す場合もある。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、例えば抗原と免疫反応する抗体分子、又はＭＵＣ１＊と特異的に結合するＮＭ２３、又はＭＵＣ１＊に結合する抗体、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊に結合する切断酵素等の別のポリペプチドと反応する非抗体リガンドの間のような２つの分子間の選択的結合反応を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」及び「ポリヌクレオチド構築物」は本明細書中で区別なく使用される。本発明のポリヌクレオチドベクターは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、レトロウイルス外被に封入されたＲＮＡ、アデノウイルス外被に封入されたＤＮＡ、別のウイルス形態若しくはウイルス様形態（単純ヘルペス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等）に包まれたＤＮＡ、リポソームに封入されたＤＮＡ、ポリリシンと複合したＤＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合したＤＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の化合物と複合して分子を免疫学的に「遮蔽した」、及び／又は半減期を増大させたＤＮＡ、又は非ウイルスタンパク質に結合したＤＮＡを含む（これらに限定されない）、幾つかの形態のいずれかであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけでなく、メチル化ヌクレオチド、非荷電結合及びチオエート等のヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、並びにポリアミド等の修飾された及び／又は代替的な骨格構造等といった、それらの類似体又はそれらの塩基の修飾形態のいずれかも含む。
【配列表フリーテキスト】
【００２６】
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用については、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（付録２、表１）に記載される規則に従うが、ここでは、ｋはｔ又はｇを表し、ｎはａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｒはａ又はｇを表し、ｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｙはｃ又はｔを表す。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV
LSSHSPGSGSSTTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS
APDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
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ASGSASGSASTLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS
SVPPLTSSNHSTSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS
VSDVPFPFSAQSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号１）は、完全長ＭＵＣ１受容体（ムチン１前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ１５９４１）を表す。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT（配列番号２）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA（配列番号３）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG（配列番号４）
配列番号２、配列番号３及び配列番号４は、ＭＵＣ１受容体及び短縮アイソフォームを細胞膜表面に対して指向付ける（directing）Ｎ末端ＭＵＣ−１シグナル伝達配列を表す。配列番号２、配列番号３及び配列番号４の変異体によって示されるように、Ｃ末端で最大３個のアミノ酸残基が欠けている場合がある。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL（配列番号５）は、そのＮ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列及び細胞質配列を含む短縮ＭＵＣ１受容体アイソフォームを表す。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号６）は、ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号７）は、配列番号６のＮ末端に単一のアミノ酸欠失を有する、ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す）。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号８）は、増進された安定性を有するＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号９）は、配列番号８のＣ末端に単一のアミノ酸欠失を有する、増進された安定性を有するＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）を表す）。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg（配列番号１０）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのヌクレオチド配列を表す。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL（配列番号１１）は、ＭＵＣ１細胞質ドメインのアミノ酸配列を表す。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa（配列番号１２）は、ＮＭＥ７のヌクレオチド配列（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ２０９０４９）を表す。
IGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMY（配列番号１３）は、ＮＭＥ７のアミノ酸配列（ＮＭＥ７：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ２０９０４９）を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１４）は、ＮＭ２３−Ｈ１のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１５）は、ＮＭ２３−Ｈ１のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga（配列番号１６）は、ＮＭ２３−Ｈ１ Ｓ１２０Ｇ突然変異体のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE（配列番号１７）は、ＮＭ２３−Ｈ１ Ｓ１２０Ｇ突然変異体のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ１：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ４８７３３９）を表す。
atgtacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc
ggggggcggcggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc
ggaccgcgtcaagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa
gatggcccaggagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga
gtggaaacttttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg
agcgctgcacatgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga aaaccaagac
gctcatgaagaaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg gcggcaatag
catggcgagcggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc agcgcatgga
cagttacgcgcacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc aggaccagct
gggctacccgcagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc agcccatgca
ccgctacgacgtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga cctacatgaa
cggctcgcccacctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca tggctcttgg
ctccatgggttcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg ttacctcttc
ctcccactccagggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca gcatgtatct
ccccggcgccgaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt cccagcacta
ccagagcggcccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct cacacatgtg
a（配列番号１８）は、配列番号１ヒトＳＯＸ２のヌクレオチド配列（ＳＯＸ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＮＭ＿００３１０６）を表す。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPK
MHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGG
LLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQ
PMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSH
SRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM（配列番号１９）は、ヒトＳＯＸ２のアミノ酸配列（ＳＯＸ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＮＭ＿００３１０６）を表す。
atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga（配列番号２０）は、ヒトＯＣＴ４のヌクレオチド配列を表す。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN（配列番号２１）は、ヒトＯＣＴ４のアミノ酸配列を表す。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa（配列番号２２）は、ＮＭ２３−Ｈ２のヌクレオチド配列（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＫ３１３４４８）を表す。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE（配列番号２３）は、ＮＭ２３−Ｈ２のアミノ酸配列（ＮＭ２３−Ｈ２：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＫ３１３４４８）を表す。
atggctgtcagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgtcacgaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtcttgaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt（配列番号２４）は、ＫＬＦ４のヌクレオチド配列（ＫＬＦ４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ０２２１８４）を表す。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPAGPYDLAAATVATDLESAGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKR（配列番号２５）は、ＫＬＦ４のアミノ酸配列（ＫＬＦ４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ０２２１８４）を表す。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgetgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgetcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagctaaaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagccacagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcggaaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcg（配列番号２６）は、ｃ−Ｍｙｃのヌクレオチド配列（ｃ−Ｍｙｃ：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０００９１７）を表す。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA（配列番号２７）は、ｃ−Ｍｙｃのアミノ酸配列（ｃ−Ｍｙｃ：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０００９１７）を表す。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgaggaggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagtggttcaacgtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagtggatgtctttgtgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggagttcacctttaagaagtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattgggagtgagaggcggccaaaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtggaggtctagatcatcatgccaaggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatcagccatatggtagcctcatgtccgctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcgagaggaagaagaagaaatccacagccctaccctgctcccggaggcacagaa（配列番号２８）は、ＬＩＮ２８のヌクレオチド配列（ＬＩＮ２８：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ５２１０９９）を表す。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNVRMGFGFLSMTARAGVALDPPVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSAKGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGGLDHHAKECKLPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLPEAQN（配列番号２９）は、ＬＩＮ２８のアミノ酸配列（ＬＩＮ２８：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＦ５２１０９９）を表す。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgctccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcctccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccggggacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacggcttgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccagacaagtttggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacataatgaaatcactttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaaggcgttccgcgtgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccatgagaagcaggccgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgagggcggcttcctggcccatgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttggactgtcaggaatgaggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctggggctcgagcattccagtgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgctgcccgatgatgaccgccggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccctcaacccaggactacctcccggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgacgggaactttgacaccgtggccatgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgaggaataaccaagtgatggatggatacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaacactgcctacgagaggaaggatggcaaattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccctggaacctggctaccccaagcacattaaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctcttctggatgcccaatggaaagacctacttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggcagtggatagcgagtaccccaagaacatcaaagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgggcagcgatgaagtcttcacttacttctacaaggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtagaaccgggctaccccaagtcagccctgagggactggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggggactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtggacgaggagggcggcggggcggtgagcgcggctgccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggtgggccttgcagtcttcttcttcagacgccatgggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggacaaggtc（配列番号３０）は、ＭＭＰ１４のヌクレオチド配列（ＭＭＰ１４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０６４８０３）を表す。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGDLRTHTQRSPQSLSAAIAAMQKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGAEIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFWRGLPASINTAYERKDGKFVFFKGDKHWVFWEGIPESPRGSFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEGTEEETEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV（配列番号３１）は、ＭＭＰ１４のアミノ酸配列（ＭＭＰ１４：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＢＣ０６４８０３）を表す。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttgcaaaccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaaagtacggctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagctgccatgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccccgatgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggacagaaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattagaaaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatggagagggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgagccatggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctctgggattggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaaactacctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacctctaccgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggcctccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattcttcgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggatacccaatgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgtgttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacccttggaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttcaagggagacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctggaaagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaaggagtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgggctgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactggacaacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggtttacactgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggtg（配列番号３２）は、ＭＭＰ１６のヌクレオチド配列（ＭＭＰ１６：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ００９３０３）を表す。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVWLQKYGYLPPTDPRMSVLRSAETMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDWMKKPRCGVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFLAHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGPPDKIPPPTRPLPTVPPHRSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFKDQWFWRVRNNRVMDGYPMQITYFWRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYWVFKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDSAIWWEDVGKTYFFKGDRYWRYSEEMKTMDPGYPKPITVWKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYWKFNNQILKVEPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV（配列番号３３）は、ＭＭＰ１６のアミノ酸配列（ＭＭＰ１６：ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＡＢ００９３０３）を表す。
【００２７】
多能性の誘導
体細胞をリプログラムして、多能性状態へと戻すことができることが最近発見された。転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子、又はタンパク質自体を体細胞に導入し、多能性状態へと戻すことができる。これらの多能性因子の多くは、以前は癌遺伝子であると考えられていた。ｃ−Ｍｙｃはよく知られた癌遺伝子であり、同様にＫｌｆ４は異形成を誘導することが示されている（非特許文献２１）。ＯＣＴ４は多能性幹細胞を同定する上で最も基準となるものとして同定されている。核内のＯＣＴ４の存在は細胞が多能性であることを示唆し、その欠如は細胞が分化過程に入っており、もはや任意の細胞型に分化可能でないことを示唆する。最近では、ＯＣＴ４も同様に多くの癌細胞の核内に存在するが、正常な成熟細胞には存在しないことが知られるようになっている。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質（配列番号１）の切断形態であるＭＵＣ１＊が、固形腫瘍癌のおよそ７５％で発現される強力な成長因子受容体であり（Raina et al., 2009）、多能性幹細胞上でもこの「腫瘍形成」形態で発現される（Hikita et al., 2008）ことを最近発見した。本発明は、ＭＵＣ１＊及びＭＵＣ１＊関連因子、並びにそれらを多能性の誘導若しくは維持のため、又は多能性誘導の効率を増進するために利用する方法に関する。
【００２８】
本発明は、ｉＰＳ細胞の生成を誘導するか、又はその効率を向上させるために、タンパク質因子、それらをコードする遺伝子、又はそれらの発現に影響を及ぼす小分子を含むＭＵＣ１＊関連因子を使用することを包含する。本発明者らは、ＭＵＣ１膜貫通タンパク質の切断形態であるＭＵＣ１＊が、癌細胞及び多能性幹細胞の両方の成長を媒介する主要な成長因子受容体であることを示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインと、その活性化リガンドＮＭ２３との間の相互作用が中断されることは、多能性幹細胞にとって致死的であり（Hikita et al., 2008）、この経路が多能性にとって重要であることを示唆している。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドである（Mahanta et al., 2008）（配列番号１２〜配列番号１７及び配列番号２２〜配列番号２３）。ＮＭ２３は、分化を阻害する一方で多能性幹細胞の成長を刺激するその能力に加えて、ｃ−Ｍｙｃの転写を誘導することが示されている（Dexheimer atal., 2009）。したがって、ＮＭ２３を多能性状態への変換が起きている細胞に添加することによって、ｃ−Ｍｙｃ癌遺伝子をトランスフェクトし、関連する健康上のリスクを緩和するという利益がもたらされる。加えて、ＮＭ２３又は二価抗ＭＵＣ１＊抗体によってＭＵＣ１＊を刺激することで、ＭＡＰキナーゼ増殖経路が活性化され、それにより細胞生存が増大する（Mahanta et al., 2008）。ＮＡＮＯＧ発現は多能性を誘導し、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３はＮａｎｏｇ発現を抑制する（Lin et al., 2007）。したがって、ｐ５３を抑制することによって、多能性の誘導に対するＮＡＮＯＧの必要性が低減又は排除される。ＭＵＣ１細胞質尾部（ＭＵＣ１０−ＣＴ）の異所的に発現される７２アミノ酸の断片は、癌細胞の核内に存在し、そこでｐ５３プロモーターに結合することが示されている（Wei et al., 2007）。配列番号１１に示されるようなＭＵＣ１−ＣＤのおよそ７２アミノ酸の断片は、ｉＰＳ細胞生成を誘導又は増進するために他の多能性誘導因子と組み合わせて使用することができる。しかしながら、このペプチドは天然のＭＵＣ１種とは一致せず、したがって望ましくない影響をもたらすおそれがある。本発明者らは、ＭＵＣ１＊が核に移行し（実施例１及び実施例９、並びに図６）、したがってｉＰＳ細胞生成を誘導若しくは増進するために、単独で、又は他の多能性誘導因子と組み合わせて使用されることを開示する。このアプローチの裏付けとして、中核となる多能性遺伝子からの幾つかの遺伝子が、ＭＵＣ１、その切断酵素及び／又はその活性化リガンドＮＭ２３の転写を調節することが報告されている（Boyer et al., 2005）。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はＭＵＣ１プロモーターに結合し、その切断酵素ＭＭＰ−１４のプロモーターにも結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧはＮＭ２３プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊がｈＥＳＣの維持にとって重要であり、重要な多能性遺伝子の標的であると仮定して、本発明者らはＭＵＣ１＊、又はＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増大させる作用物質を、その活性化リガンドＮＭ２３と共に導入することを用いて、ｉＰＳ細胞の生成を誘導又は増進するために以前に同定された多能性誘導因子の一部又は全てを置き換えることができることを開示する。
【００２９】
本発明は、細胞において多能性を誘導するための、ＭＵＣ１＊に関与する新規の試薬及び方法を開示する。これらの試薬及び方法は、体細胞又は成熟細胞において多能性を誘導するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は、成熟細胞における多能性誘導の効率を増大させるために使用される。本発明のさらに別の態様では、これらの試薬及び方法は、未熟細胞を未熟状態に維持するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は分化を阻害するために使用される。本発明の別の態様では、これらの試薬及び方法は、幹細胞を多能性状態に維持するために使用される。
【００３０】
本発明は、成熟細胞、又は幾らか分化した細胞に、ＭＵＣ１＊及びその関連因子の発現に影響を及ぼす遺伝子又は遺伝子産物を導入することによって、分化を元に戻すか、又は幹様特性を維持することを含む。ＭＵＣ１＊は膜貫通タンパク質ＭＵＣ１の切断形態である。ＭＵＣ１＊関連因子としては、完全長ＭＵＣ１、ＭＵＣ１を切断する酵素、ＭＵＣ１＊活性化リガンド、さらにはＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊の発現に影響を及ぼす転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の遺伝子又は遺伝子産物の成熟細胞又は幾らか分化した細胞への導入が、これらの細胞又はそれらの子孫において多能性又は幹細胞性を誘導することにも関する（drawn to）。本願は、幹細胞において多能性を維持するためのそれらの使用を説明する。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊関連因子の発現に影響を及ぼす作用物質は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ｍｙｃ及びＬＩＮ２８等の多能性を誘導することが既に知られている１つ又は複数の遺伝子若しくは遺伝子産物と組み合わせて、又は置き換えて添加することができる。
【００３１】
転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせの強制発現が、成熟細胞を多能性状態へと戻すことが示されている（非特許文献７）。多能性を誘導する転写因子は各々、十数個の遺伝子の転写を調節している。本発明者は、これらのうち幾つかをＭＵＣ１関連因子であると同定した。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＭＵＣ１プロモーター自体に結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＮＭ２３（ＮＭＥとしても知られる）は以前、本発明者によってＭＵＣ１＊の活性化リガンドとして同定された（Mahanta et al., 2008）。ＮＭＥ７はＭＵＣ１＊の活性化リガンドである。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２はどちらも、本明細書中でＭＵＣ１の切断酵素であるとして開示しているＭＭＰ１６のプロモーターに結合する。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２又はＮＡＮＯＧは、切断酵素ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＡＤＡＭ ＴＳＬ−１、ＡＤＡＭ ＴＳ−４、ＡＤＡＭ−１７（ＭＵＣ１切断酵素）、ＡＤＡＭ−ＴＳ１６、ＡＤＡＭ−１９及びＡＤＡＭ−２８のプロモーター部位にも結合する。これらの切断酵素の一部又は全てを、多能性を誘導するか、又はそれを維持するために、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増進するように上方調節することができる（Boyer et al, 2005）。
【００３２】
胚性幹細胞（ＭＵＣ１の切断形態であるＭＵＣ１＊のみを発現する）を用いた本発明者らの以前の研究では、その細胞外ドメインの二量化によって、成長が刺激され、分化が阻害されることが示された（Hikita et al., 2008）。これらの効果は、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインを、二価抗ＭＵＣ１＊抗体、組み換えＮＭ２３、又は優先的に二量体を形成する突然変異体ＮＭ２３（Ｓ１２０Ｇ）のいずれかを用いて二量化することによって達成された（Kim et al., 2003）。一価抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂを用いたＭＵＣ１＊細胞外ドメインの阻害は、数時間以内に死をもたらした。これらの発見から、ＭＵＣ１＊が重要な「幹細胞性」因子であることが示唆される。また、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＭＵＣ１遺伝子プロモーター、さらにはその切断酵素のプロモーターに結合する。ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＮＭ２３（ＮＭＥ７）プロモーターに結合する。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断することはｈＥＳＣにとって致死的であるため、多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧは、ＭＵＣ１、その切断酵素及びその活性化リガンドの発現を誘導するということになる。既に多能性を誘導することが示されている遺伝子又は遺伝子産物の１つ又は複数は、単独で、又はその切断酵素及び／又は活性化リガンドＮＭＥ７、ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２、又はＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲエピトープを二量化する抗体に加えて、ＭＵＣ１＊の遺伝子をトランスフェクトするか、又はその遺伝子産物を導入することによって置き換えることができる。
【００３３】
当業者にはよく知られているように、トランスフェクトされた遺伝子産物の局所化を指示するシグナル配列を、遺伝子に付加させることができる。シグナル配列の例は配列番号２〜配列番号４として与えられる。本発明は、ＭＵＣ１＊のＮ末端ドメインを、これらの遺伝子又は遺伝子産物の効果を実質的に変化させることなく短縮するか、又は最大で９アミノ酸まで伸長させることができることを意図する。配列番号５として例示されるＭＵＣ１＊、及び細胞外ドメインが基本的に配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で与えられる配列から構成される変異体が好ましい。
【００３４】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は上記で挙げたものを含む関連因子によって、多能性を誘導し、多能性を誘導するため又は多能性を維持するために使用される１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を置き換えることができる。
【００３５】
線維芽細胞及び皮膚線維芽細胞等の体細胞に、幹細胞様特徴の誘導（場合によっては子孫が多能性幹細胞になるよう誘導する）を助けるＭＵＣ１タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトする場合がある。本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の遺伝子を細胞にトランスフェクトして、幹細胞様状態への復帰を誘導する（場合によっては実際の多能性幹細胞を誘導する）。ＭＵＣ１遺伝子又はＭＵＣ１＊遺伝子の各々を、細胞に単独で、又は多能性若しくは幹細胞様特性の誘導を助ける他の遺伝子と組み合わせて導入してもよい。例えば、ＭＵＣ１、又は優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを、細胞にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする１つ又は複数の遺伝子と共に導入する。ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを線維芽細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８をコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Yu et al., 2007）。別の実施形態では、ＭＵＣ１の短縮形態、優先的にはＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡを体細胞、線維芽細胞又は他の細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子と共にトランスフェクトする（Takahashi et al., 2007）。同様に、ＭＵＣ１＊及び／又はその活性化リガンドであるＮＭ２３、又はＮＭ２３のＳ１２０Ｇ突然変異体をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトして多能性を誘導する。ＭＵＣ１＊及び／又はＮＭ２３は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃ等の他の遺伝子と共にトランスフェクトして、多能性又は幹細胞様特性を誘導してもよい。ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１を認識する抗体をコードするＤＮＡを細胞に単独で、又は他の遺伝子と共にトランスフェクトして、細胞又はその子孫において幹細胞特性を誘導することもできる。抗ＭＵＣ１＊抗体は分泌されると二量化し、それによりＭＵＣ１＊受容体、及び幹様特性を促進又は維持するその機能を活性化する。
【００３６】
同様に、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又はそれらの関連因子の発現に影響を及ぼす核酸、タンパク質、修飾タンパク質又は小分子等の因子を細胞に導入して、幹細胞の特性を誘導するか、又は多能性への復帰を誘導する。例えば、ＭＵＣ１切断酵素ＭＭＰ１４、ＭＭｐ１６、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＡＤＡＭ ＴＳＬ−１、ＡＤＡＭ ＴＳ−４、ＡＤＡＭ−１７（ＭＵＣ１切断酵素）、ＡＤＡＭ−ＴＳ１６、ＡＤＡＭ−１９及びＡＤＡＭ−２８の遺伝子又は遺伝子産物を細胞に導入して、多能性又は同様の特性を誘導する。
【００３７】
別の実施形態では、非タンパク質作用物質を細胞に添加して、多能性を誘導するか、又はその誘導を増進する。例えば、ホルボールエステルであるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）は、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊への切断を増大させる小分子である（Thathiah et al., 2003）。本発明の一態様では、ホルボールエステルを多能性への変換が起きている細胞に添加して、ｉＰＳ生成を誘導するか、又はその効率を増大させる。
【００３８】
別の例では、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊と相互作用するリガンドを体細胞、皮膚線維芽細胞、線維芽細胞又は幾らか分化した細胞に、単独で、又は多能性を誘導若しくは維持する他の遺伝子と組み合わせて添加して多能性を誘導する。例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及び／又はｃ−Ｍｙｃをコードする遺伝子の１つ又は複数を、線維芽細胞又は他の細胞にトランスフェクトした後、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊を活性化するリガンドの存在下で培養する。ＭＵＣ１＊の二量体タンパク質リガンドが好ましい。好ましい実施形態では、二価抗ＭＵＣ１＊抗体を、細胞又はその子孫が多能性幹細胞となるようにする遺伝子をトランスフェクトした細胞に添加する。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＮＭ２３（ＮＭ２３−Ｈ１、ＮＭ２３−Ｈ２又はＮＭＥ７）を、それをコードする遺伝子として、タンパク質自体として、又は細胞への侵入を容易にし、多能性の誘導若しくは維持を助けるポリアルギニントラクト等のリーダー配列を保有するタンパク質として細胞に導入する。本発明者らは、ＮＭ２３が多能性幹細胞（及び癌細胞）によって分泌される場合、ＭＵＣ１の切断形態（ＭＵＣ１＊）の活性化リガンドであり、ＭＡＰキナーゼ増殖経路を誘発することを最近示した。ＮＭ２３によるＭＵＣ１＊の刺激は、多能性ｈＥＳＣの成長を促進し、その分化を阻害することが示されてる（Hikita et al., 2008）。ＮＭ２３はｃ−ＭＹＣの転写も誘導し（Dexheimerat al., 2009）、ｃ−ＭＹＣの必要性をなくす。ＮＭ２３は、ＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化するその天然状態で、又は細胞及び核（そこでＮＭ２３はＣ−ＭＹＣ発現を誘導する）への侵入を容易にするポリアルギニントラクトを有する状態で外部から添加する。ＮＭ２３（ＮＭＥ）は、それをコードする核酸として、又は細胞への侵入を容易にする修飾を有するか、若しくは有しない発現されたタンパク質として添加してもよい。ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２又はＮＭＥ−７は、その天然状態又は突然変異体形態（Ｓ１２０Ｇ突然変異等の二量体状態が好ましい）で使用することができる。
【００４０】
本発明の別の態様では、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメイン（ＰＳＭＧＦＲ）に結合する二価抗体、又はＮＭ２３等の二量体ＭＵＣ１＊リガンド、又はそれらをコードする遺伝子を、ＭＵＣ１＊発現細胞に添加して、多能性を誘導するか、多能性誘導の効率を増大させるか、多能性を維持するか、又は分化を阻害する。これらのＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊と相互作用するタンパク質が添加される細胞は、天然の細胞、又は幹細胞様特性を誘導する遺伝子を添加した細胞、又は既に分化過程に入った細胞であっても、又は幹細胞であってもよい。
【００４１】
多能性を誘導する遺伝子を、同じか又は異なるプラスミド（レンチウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター、又は任意の組込み型若しくは非組込み型ウイルスベクター又は非ウイルスベクター、又はこれらの遺伝子の所望の細胞への導入を容易にする他の任意の系であり得る）に導入してもよい。
【００４２】
多くの場合、優先的には、多能性誘導タンパク質の効果を、それらをコードする核酸又は遺伝子ではなくタンパク質自体を導入することによって達成する。本発明は、遺伝子産物、タンパク質（天然状態であるか、又は細胞への侵入を可能にするポリアルギニントラクト等のリーダー配列によって修飾されている）によって置き換えることのできる、幹様特性又は多能性の誘導に関してここで開示される遺伝子を包含する。これらの遺伝子の産物、すなわちタンパク質、又はトランスフェクトされた遺伝子の産物の１つ又は複数と相互作用する他のタンパク質を細胞に導入して、多能性又は他の幹細胞様特性を誘導又は維持する。
【００４３】
他の場合では、成熟細胞又は分化細胞において、小分子等の合成作用物質を導入して、幹細胞性を誘導することが有益であり得る（非特許文献２３）。本発明の一態様では、小分子を細胞に添加して、多能性を誘導する遺伝子の転写を直接的又は間接的に誘導する。他の場合では、ＭＵＣ１＊の産生を直接的又は間接的に増大させる小分子を添加する。一例では、これらの小分子は、幹細胞に特徴的なＭＵＣ１のＭＵＣ１＊形態への切断を増大させる。例えば、ホルボールエステルは、ＭＵＣ１のＭＵＣ１＊への切断を増大させる小分子であるため、細胞に添加されると、ＭＵＣ１＊を生成することによって多能性状態の誘導又は維持を促進する。
【００４４】
腫瘍抑制遺伝子としても知られるｐ５３は、アポトーシスを促進する。したがって、幹細胞を培養するか、又は体細胞若しくは他の細胞において多能性を誘導する場合、ｐ５３を阻害することが有利であり得る。本発明では、幹細胞性を維持するか、又は幹様特性若しくは多能性特性を誘導するために、ｐ５３抑制遺伝子を本発明の他の試薬及び方法と共に用いることが予想される。ｐ５３は多数の方法によって抑制することができる。ピフィスリン−μ等の小分子は、ｐ５３のアポトーシス促進効果を阻害するため（Strom, et al., 2006 Sep、Komarov, et al.,1999）、多能性誘導の効率を増大させるか、又は幹細胞性を維持するために細胞に任意で添加される。好ましい実施形態では、ｐ５３阻害剤は、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊を上方調節する遺伝子又は遺伝子産物（ＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊遺伝子又は遺伝子産物、それらの活性化リガンド及びそれらの切断酵素を含むが、これらに限定されない）と共に使用される。
【００４５】
多能性の誘導又は幹細胞性の維持の効率を増大させるためにｐ５３活性を抑制する別の方法は、ＭＵＣ１＊タンパク質を細胞培養物に導入することである。ＭＵＣ１＊タンパク質は、細胞への侵入を容易にするポリアルギニントラクトを追加することによって修飾することができる。ＭＵＣ１の細胞質尾部（ＭＵＣ１−ＣＤ）の過剰発現は単独で、核へのその移行（そこでｐ５３プロモーターと結合することが分かった）をもたらすことが報告されている。これらの研究では、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３を下方制御するか、又は上方調節するかは決定することができなかった。本発明は、多能性又は他の幹様特性の誘導の効率を増大させるためのＭＵＣ１＊の異所性発現によるｐ５３の抑制にも関する。ＭＵＣ１＊は、遺伝子を細胞に挿入するか、タンパク質自体を外から添加するか、又はポリアルギニントラクトによって任意で修飾されたＭＵＣ１＊タンパク質を添加することによって導入することができる。
【００４６】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される実施形態に加えて、本発明の様々な変更形態が、以上の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。以下の実施例は限定としてではなく、本発明の例示として与えられる。
【実施例】
【００４７】
実施例１．ＭＵＣ１＊は成長及び細胞死抵抗性を促進する。
ＭＵＣ１＊は、線維芽細胞のクローン性成長（コロニー拡大）を促進する。完全長ＭＵＣ１（配列番号１）、ＭＵＣ１＊１１１０（配列番号５）又は空ベクターをトランスフェクトした３Ｙ１細胞の単一細胞クローンを、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地中に、６０ｍｍ皿当たり１０００個の細胞でプレーティングした。細胞を９日間増殖させた後、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。皿を水で洗浄した後、７０％メタノール中１％クリスタルバイオレットで室温で２０分間染色した。皿を水で３回洗浄し、室温で一晩乾燥させて、写真に撮った。図１Ａから、吸収されるクリスタルバイオレットの量（細胞数の指標）は、ＭＵＣ１＊単一細胞クローン＃３及び＃４４を増殖させる場合にはるかに高いことが示される。対照的に、完全長ＭＵＣ１をトランスフェクトした細胞（単一細胞クローン＃８及び＃１７）は、空ベクターをトランスフェクトした細胞に対して成長速度の増大を示さなかった。このことから、切断形態のＭＵＣ１＊は成長及び／又は生存の利点を有するが、完全長タンパク質は有しないことが示される。
【００４８】
実施例２．抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂは、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））抵抗性細胞（１ｕｇ／ｍｌのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）中での培養によって抵抗性にされた）において、ＴＡＸＯＬ（登録商標）による細胞死に対する抵抗性を遮断する。
Fessler et al., 2009は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抵抗性細胞がＴＡＸＯＬ（登録商標）、ドキソルビシン及びシクロホスファミドに対しても抵抗性であることを報告している。報告されているように、これらの薬物抵抗性癌細胞はＭＵＣ１＊を過剰発現することによって抵抗性を得る。以下の実験から、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのＰＳＭＧＦＲ部分を遮断することによって、癌細胞において獲得された薬物抵抗性が取り消されることが示された。親細胞（ＢＴ４７４）又は抵抗性細胞（ＢＴＲｅｓ１）を、９６ウェルプレート（４ウェル／条件）において、１００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル、Sigma、Ｔ７１９１）の存在下又は非存在下で、細胞に抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂ、対照Ｆａｂを添加したか、又はＦａｂを添加しなかった。２日後、細胞を５０μｌのトリプシン中に再懸濁し、トリパンブルーの存在下で計数した。細胞死率をトリパンブルー取り込み率として算出した。ＢＴ４７４細胞は、各々の条件下でＴＡＸＯＬ（登録商標）に応答して細胞死を起こし、ＢＴＲｅｓ１細胞はＭＵＣ１＊抗体の存在下でのみ細胞死を起こした（図１Ｂ）。
【００４９】
実施例３．ＭＵＣ１＊は成長因子受容体として働き、人工抗体（抗ＭＵＣ１＊抗体）又はその天然リガンドであるＮＭ２３（ＮＭＥ）を用いたその細胞外ドメインの二量化によって活性化される。
ＭＵＣ１＊陽性ＺＲ−７５−３０細胞（６０００個／ウェル）、又は対照（ＭＵＣ１陰性）ＨＥＫ２９３細胞（４０００個／ウェル）を、９６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、０時間の細胞数を数え、２４時間又は４８時間毎に種々の濃度の抗ＭＵＣ１＊抗体又はＦａｂを低（０．１％）血清培地に添加した。数日間のインキュベーションの後、細胞をトリプシン中に再懸濁し、計数して、正規化成長率を算出した。ＺＲ−７５−３０細胞の刺激は、リガンド誘導性成長刺激について実証されているように、釣鐘型曲線を示したが、ＨＥＫ２９３細胞は示さなかった（図１Ｃ）。ＭＵＣ１を標的とするｓｉＲＮＡ、又は対照ｓｉＲＮＡを安定にトランスフェクトしたＭＵＣ１＊陽性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を用いた同様の実験では、成長の刺激は対照をトランスフェクトした細胞でしか起こらず、抗体の特異性がさらに実証される（図１Ｄ）。同一の結果が、ＭＵＣ１＊の天然リガンドであるＮＭ２３についても実証されている（図１Ｅ）。
【００５０】
実施例４．ＮＭ２３は、基本的にＭＵＣ１＊の細胞外ドメインから構成されるＰＳＭＧＦＲペプチドに特異的に結合する。
結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置及びＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定した。ヒスチジンタグ付きＭＵＣ１＊１１１０−ｅｃｄ（配列番号５）又は無関係のペプチド（HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS（配列番号３４））を、Mahantaet al. 2008に記載されるように、本発明者らの研究室で作製した５．７％ＮＴＡ−Ｎｉ＋＋ ＳＡＭでコートしたＳＰＲチップの別個のフローチャネルに固定化した。精製したウシ又は組み換えヒトＮＭ２３の３５μＬのプラグを５ｕＬ／分という一定流量（flow stream）で注入し、センサーグラム（sensograms）を記録した。ウシ肝臓から精製したＮＭ２３（Sigma、Ｎ−２６３５）を、ＰＢＳ単独で希釈した。親和性を、１：１ラングミュアモデルを用いて広範囲の濃度にわたって測定した。一次速度式ではこの系を適切に表すことができないため、実際の親和性は変わることがある（図１Ｆ）。
【００５１】
実施例５．ＭＵＣ１＊成長因子受容体及びそのリガンドＮＭ２３は、未分化ｈＥＳＣ上に存在するが、分化ｈＥＳＣ上には存在しない。
未分化（多能性）状態又は分化したばかりの状態のヒト胚性幹細胞を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって分析した。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ（dissected）、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライド（Nunc）にプレーティングした。未分化細胞については、細胞をプレーティングの５日後〜７日後に固定した。分化細胞については、プレーティングの５日後〜７日後にｂＦＧＦを培養培地から除去して、細胞を１４日間分化させた後、固定した。細胞はＰＢＳで洗浄してから、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで、４℃で１５分間固定した。細胞を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び１％ロバ又はヤギ血清で１時間ブロッキングした。０．１％ＮＰ−４０を細胞内抗原に対する抗体として使用した。一次抗体をブロッキングバッファー（block）で希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。以下のタンパク質に対する一次抗体を使用した：ＯＣＴ４（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ Ｃｌｏｎｅｓ Ｈ−１３４及びＣ−１０、１００倍希釈）、完全長ＭＵＣ１（ＶＵ４Ｈ５、Santa Cruz Biotechnology、５０倍希釈）、ＭＵＣ１＊（Minerva、２５０倍希釈）又はＮＭ２３（Santa Cruz、Ｃｌｏｎｅ ＮＭ３０１、１００倍希釈））。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、以下の二次抗体と共に３０分間インキュベートした：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ３５０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、２００倍）；ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＴＲ（Santa Cruz、１００倍）。細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、退色防止封入剤（anti-fade mounting medium）（Biomeda）を用いてカバースリップを載せた。５分間のＤＡＰＩ染色（１μｇ／ｍｌ）によって核を可視化した。免疫染色した細胞を、OlympusのＢＸ−５１落射蛍光顕微鏡上で可視化した。これらの実験の結果から、ＭＵＣ１＊は未分化細胞（多能性幹細胞）の表面上に存在するが（図２Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）、分化ｈＥＳＣ上には存在しない（図２Ｄ）ことが示される。図３から、ＭＵＣ１＊のリガンドであるＮＭ２３はＭＵＣ１＊と共局在化することが示される（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＭＵＣ１＊及びそのリガンドであるＮＭ２３は、多能性幹細胞（ＯＣＴ４陽性細胞）上でしか発現されず、分化した細胞上では発現されない（図３Ｃ及び図３Ｆ）（ＤＡＰＩによってＯＣＴ４陰性細胞の核が染色される）。
【００５２】
実施例６．ＭＵＣ１＊は多能性幹細胞の成長を媒介する。
二価抗ＭＵＣ１＊を用いたＭＵＣ１＊の刺激の多能性幹細胞に対する効果を決定するために、以下の実験を行った。結果から、ＭＵＣ１＊を二量化するリガンドの添加によって、多能性（ＯＣＴ４陽性）幹細胞の成長が刺激され、フィーダー細胞、その抽出物又はｂＦＧＦの非存在下でのその成長も可能となることが示される。
【００５３】
多能性（ＯＣＴ４陽性）ｈＥＳＣの長期的成長は、ＭＵＣ１＊の刺激によって媒介される。ｈＥＳＣをトリプシン解離して、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに４×１０４細胞／ウェルで播種した。培地を交換し、個々のコロニーが見えるようになるまで、抗体を二価抗ＭＵＣ１＊に対する最終濃度１μｇ／ｍｌで一日おきに添加した。培養条件には、ｂＦＧＦを添加した及びｂＦＧＦを添加していない、「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）及びＨｓ２７馴化培地が含まれる。各々の条件について細胞を４連で（in quadruplicate）増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、固定して、上記のようにＯＣＴ４免疫染色を行った。図４のパネルＡ〜パネルＤは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加したマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。パネルＥ〜パネルＨは、線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地を添加しなかったマトリゲル上で増殖させた細胞の写真である。抗ＭＵＣ１＊抗体の細胞培養物への添加（図４Ｃ、図４Ｄ）は、ｂＦＧＦを添加したものの成長（図４Ａ、図４Ｂ）と比べて、より多くの多能性幹細胞を生じた。線維芽細胞フィーダー細胞からの馴化培地の非存在下で培養した細胞への抗ＭＵＣ１＊抗体の添加（図４Ｇ、図４Ｈ）は、多能性細胞を生じなかった（ＯＣＴ４の非存在）ｂＦＧＦを添加して増殖させた細胞（図４Ｅ、図４Ｆ）とは全く対照的に、豊富な多能性幹細胞を生じた。
【００５４】
実施例７．ＭＵＣ１＊刺激の多能性幹細胞の成長を増進する効果を、定量的カルセインアッセイにおいて直接測定した。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を手で解離させ、９６ウェルプレートのマトリゲルコートウェル上で１．９×１０４細胞／ウェルの密度で増殖させた。培養培地は、３０％Ｈｓ２７馴化培地を添加したｈＥＳＣ培地及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有していた。抗体を、二価抗ＭＵＣ１＊については１μｇ／ｍｌ、一価抗ＭＵＣ１＊については１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。実験は３連で（in triplicate）行った。抗体処理の４１時間後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Molecular Probes）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、生細胞及び死細胞を定量化した。Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて蛍光を測定した。図５の棒グラフから、二量化リガンド（抗ＭＵＣ１＊）を用いたＭＵＣ１＊の刺激は、幹細胞成長を増進し、一方で抗ＭＵＣ１＊ ＦａｂによりＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを遮断し、全幹細胞死をもたらすことが示される。
【００５５】
実施例８．二価抗ＭＵＣ１＊抗体、ＮＭ２３、ＮＭ２３突然変異体又はｂＦＧＦを用いた幹細胞成長の刺激の効果を比較するために、長期的幹細胞成長実験を行った。
ｈＥＳＣをトリプシンで解離させ、マトリゲルでプレコートした８ウェルチャンバースライドに、８．２×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種した。培地を交換し、抗体又は野生型若しくは突然変異体ＮＭ２３タンパク質を、抗ＭＵＣ１＊抗体については８０ｎｇ／ｍｌ、野生型組み換えＮＭ２３若しくは突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）ＮＭ２３については１ｎＭの最終濃度で、又は組み換えｂＦＧＦを「最小幹細胞培地」（フィーダー馴化培地を含まないｈＥＳＣ培地）中４ｎｇ／ｍｌの最終濃度で一日おきに添加した。対照として、Ｈｓ２７線維芽細胞からの３０％馴化培地及び４ｎｇ／ｍｌの組み換えｂＦＧＦ（Peprotech、＃１００−１８Ｂ）を含む最小幹細胞培地において、細胞を同様に増殖させた。この実験の結果から、ＭＵＣ１＊リガンドが、マトリゲル上のこれらの細胞の「正常」増殖培地である馴化培地＋ｂＦＧＦと比べて、最小培地における多能性コロニーの成長をより良く刺激することが示される。表１に結果を詳述する。
【００５６】
表１．最小培地において４週間培養したｈＥＳＣ
増殖条件 最初にコロニーが コロニー数 形態
現れた週
最小幹細胞増殖培地
ＮＭ２３
１ｎＭ ２週目 ２つのコロニー 説明Ａ参照
ＮＭ２３−
Ｓ１２０Ｇ
突然変異体
１ｎＭ ２週目 ７つのコロニー 説明Ｂ参照
抗ＭＵＣ１＊
８０ｎｇ／ｍｌ ２週目 ５つのコロニー 説明Ｃ参照
ｂＦＧＦ
４ｎｇ／ｍｌ − ０ 説明Ｄ参照
なし ２週目 ２つのコロニー 説明Ｅ参照
対照 Ｈｓ２７線維芽フィーダー細胞からの３０％馴化培地
ｂＦＧＦ
４ｎｇ／ｍｌ ２週目 ５ 説明Ｆ参照
説明Ａ：２つのウェルの一方において２つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｂ：２つのウェルの一方において７つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｃ：２つのウェルの一方において５つの大きな未分化のコロニー；３週目にコロニーの中心が分化し始めるように見える；４週目の終わりには、各コロニーの大部分が未分化のままである
説明Ｄ：コロニーなし
説明Ｅ：２つの非常に小さな分化したコロニー
説明Ｆ：５つのほとんど分化したコロニー
【００５７】
実施例９．ＭＵＣ１＊は細胞の核に移行する。
抗ＭＵＣ１＊モノクローナルＡｂを、Ａｌｅｘａ ５５５色素によってｉｎ ｖｉｔｒｏで標識し、ＭＵＣ１＊をトランスフェクトしたＨＣＴ−１１６細胞（ＭＵＣ１陰性）（冷ＰＢＳで４℃で洗浄した）に４℃で結合させた。２０分後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定するか、又は予熱した（pre-warmed）増殖培地を用いてインキュベートした。４０分後、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した後、ブロッキングし、ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ、２．５％ＦＢＳ及び０．１％ＮＰ−４０で透過化処理した。抗ＥＥＡ１抗体（Cell Signaling Technologies、２４１１Ｓ）及びＡｌｅｘａ ４８８（Invitrogen、２００倍）を用いてエンドソームを染色した（図６）。
【００５８】
実施例１０．ＭＵＣ１＊は核に移行し、そこで転写因子又は補因子として機能する。
ＭＵＣ１の細胞質ドメイン（ＭＵＣ１−ＣＤ）に相当する、人工的に発現させたペプチドが核に移行することが科学文献において以前に報告されている（Huang, et al. 2005）。別の研究では、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３のプロモーター部位に結合することが報告されている（Wei, et al. 2007）。しかしながら、Wei, et al., 2007の報告では、この能力に関して、ＭＵＣ１−ＣＤがｐ５３の転写を上方調節するか、又は下方制御するかは決定されていない。幹細胞性又は多能性を誘導又は維持するためには、ｐ５３を抑制するのが望ましい（Maimets, et al., 2008）。さらに、ＭＵＣ１の細胞質ドメイン単独の強制発現は、ＭＵＣ１のいかなる天然状態又は切断状態にも一致しない。したがって、本発明者らは、これが実際に核に移行する多能性のマーカーであるＭＵＣ１＊であるか否かを決定しようとした。
【００５９】
ＭＵＣ１＊上のＰＳＭＧＦＲエピトープを認識するが、ＭＵＣ１が完全長である場合には同じエピトープを認識しない（Mahanta et al 2008）ポリクローナル抗体である抗ＭＵＣ１＊を使用して、ヒト胚性幹細胞をHikita et al (2008)の方法に従って染色した。胚性幹細胞は、ＭＵＣ１＊を排他的に発現し、完全長ＭＵＣ１を発現しない。免疫細胞化学によって、ＭＵＣ１＊が胚性幹細胞の核内で検出されることが多いことが示された。蛍光標識した（tagged）抗ＭＵＣ１＊ Ｆａｂフラグメントを、ＭＵＣ１＊又は空ベクターをトランスフェクトした細胞と共にインキュベートした。過剰のＦａｂを除去し、細胞をＰＢＳで４℃で洗浄してパラホルムアルデヒドで固定するか、又は受容体内在化を促すために予熱した培地を用いて３７℃で１０分間、２５分間若しくは４０分間インキュベートした後、パラホルムアルデヒド固定した。様々な時点で細胞を４℃にし、受容体内在化を停止させた。ＦａｂはＭＵＣ１＊をトランスフェクトした細胞に特異的に結合したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（データは示さない）。図６では、４０分後にＭＵＣ１＊が細胞の核に移行したことが示される。
【００６０】
実施例１１．ＭＵＣ１関連因子を用いて、ｐ５３並びにそのアポトーシス促進効果及び成長阻害効果を阻害し、ｉＰＳ（人工多能性幹）細胞を生成する効率を増大させる。
小分子Ｎｕｔｌｉｎは、ｐ５３とその天然阻害剤ｈＤＭ２との間の相互作用を妨げることによってｐ５３の活性を増大させる（Vassilev et al., 2004）。Ｎｕｔｌｉｎによるｐ５３活性の誘導は、ヒト胚性幹細胞の分化を推進する（Maimets, et al., 2008）。同様に、胚性幹細胞におけるｐ５３の過剰発現は、おそらくはアポトーシスの誘導によってｈＥＳＣの成長を阻害する（Maimets, et al., 2008）。ｐ５３欠損マウスでは、原発腫瘍の形成（establishment）が増進された（Zhou et al., 2000）。このため、ｐ５３活性を妨げることによって、ｉＰＳ細胞株を樹立する効率が増大する。
【００６１】
「中核となる」多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４を用いた新規のｉＰＳ株の樹立において、多能性の誘導は、初めにｐ５３を小分子Ｎｕｔｌｉｎによって阻害し、次いでＭＵＣ１＊を導入することで増進される。ＭＵＣ１＊は、１）ＭＵＣ１＊をコードするＤＮＡをトランスフェクトすること、及びｂ）効率的に細胞に侵入するようポリアルギニントラクトによって修飾された組み換えＭＵＣ１＊タンパク質を添加することによって、多能性の誘導が起きている細胞に導入する。
【００６２】
中核となる多能性遺伝子を皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした。しかしながら、皮膚線維芽細胞又は他の成熟細胞への直接的又は間接的な遺伝子産物の外因性発現も予想される。本発明では、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１＊又は関連因子の添加によって、中核となる多能性因子の一部又は全部が除外され得ることも予想される。
【００６３】
多能性の誘導は、ＭＵＣ１の細胞質尾部に相当するペプチドを、多能性への変換が起きている細胞に外部から添加した場合にも増進される。任意で、ＭＵＣ１−ＣＤを、ペプチドが細胞に侵入することを可能にするポリアルギニントラクト等のリーダー配列で修飾する。
【００６４】
実施例１２．ＭＵＣ１関連タンパク質の導入は、ｃ−ｍｙｃの転写を誘導すること及びＭＵＣ１＊を活性化することによって多能性を増進する。
ｃ−Ｍｙｃは多能性の誘導を増進することが示されている。ＮＭ２３はｃ−ｍｙｃの転写を誘導し（Dexheimer et al., 2009）、ｃ−ｍｙｃの必要性をなくす。ＮＭ２３を、それをコードする核酸のトランスフェクションによって、又はタンパク質自体（細胞侵入を助けるポリアルギニントラクト等の配列で修飾してもよい）を外部から添加することによって、ｉＰＳへの変換が起きている細胞に導入する。ＮＭ２３の野生型又は突然変異体（Ｓ１２０Ｇ）（二量体形態が好ましい）を、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４をトランスフェクトした皮膚線維芽細胞に添加する。ｉＰＳ細胞生成の効率が増進される。
【００６５】
ＮＭ２３（ＮＭＥ−Ｈ１、ＮＭＥ−Ｈ２又はＮＭＥ−７）は、多能性の誘導又は維持を増進する。ＮＭ２３は、以前に同定された多能性因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４を含むが、これらに限定されない）、及び本明細書中で開示される他の因子と共に導入される。
【００６６】
実施例１３．ＭＵＣ１＊関連因子を含む、新たな中核となる多能性因子の同定
多能性を誘導若しくは維持するか、又はｉＰＳｃ形成の効率を向上させるか、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４から構成される多能性遺伝子セットの１つ又は複数を置き換えるために、ＭＵＣ１＊を細胞に導入する。ＭＵＣ１＊をコードする核酸を含有するＤＮＡ構築物を、上述の多能性遺伝子セット（又はそれらの遺伝子産物）の組み合わせと共に皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。ｉＰＳコロニー形成の効率を、生成された幹細胞の数を計数することによって決定する。さらに、細胞をＯＣＴ４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １−６０、ＴＲＡ １−８１、ＴＲＡ ２−４９／６Ｅ（アルカリホスファターゼ）及びＮＡＮＯＧ等の多能性マーカーの免疫蛍光検出によって分析する。得られた細胞を核型安定性、及び３つの異なる生殖細胞系列（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に沿って分化する能力について評価する。これは、中胚葉検出についてはＣＤ３４又は平滑筋アクチン、内胚葉検出についてはＧＡＴＡ−４又はサイトケラチン１９、外胚葉検出についてはネスチン又はβＩＩＩチューブリン等といった生殖細胞系列特異的マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光検出によって決定する。ＭＵＣ１＊活性化リガンド、好ましくは抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３（ＮＭＥ）を任意で添加して、多能性の誘導又は維持をさらに増進する。
【００６７】
引用文献
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Zhou et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009)
【００６８】
本明細書において引用されている引用文献は全て、その全体が参照により援用される。
【００６９】
当業者であれば、日常的な実験しか用いなくても、本明細書において具体的に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は確かめることができる。かかる均等物は特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において多能性を誘導又は維持する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記生物種が遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物種がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊リガンドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドがＮＭ２３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲ配列を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化学種が小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記小分子がＭＵＣ１、その切断酵素又はＮＭ２３の転写を増進する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記切断酵素がＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１４又はＡＤＡＭ−１７である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記小分子がＭＵＣ１の切断を増進する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記小分子がホルボールエステルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＭＵＣ１をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子がＭＵＣ１＊をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がＭＵＣ１＊のリガンドをコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リガンドがＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊又はその有効フラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラグメントが細胞質尾部である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞を、多能性を誘導する遺伝子産物の発現を増大させる分子と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分子がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４又はＬＩＮ２８の発現を増大させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分子がＯＣＴ４及びＳＯＸ２の発現を増大させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
細胞において多能性を誘導又は維持する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊活性を増大させる生物種又は化学種と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記生物種が遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物種がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊リガンドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドがＮＭ２３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊のＰＳＭＧＦＲ配列を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化学種が小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記小分子がＭＵＣ１、その切断酵素又はＮＭ２３の転写を増進する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記切断酵素がＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１４又はＡＤＡＭ−１７である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記小分子がＭＵＣ１の切断を増進する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記小分子がホルボールエステルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＭＵＣ１をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子がＭＵＣ１＊をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がＭＵＣ１＊のリガンドをコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リガンドがＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質がＭＵＣ１＊又はその有効フラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラグメントが細胞質尾部である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞を、多能性を誘導する遺伝子産物の発現を増大させる分子と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分子がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４又はＬＩＮ２８の発現を増大させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分子がＯＣＴ４及びＳＯＸ２の発現を増大させる、請求項１９に記載の方法。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５０５６３６（Ｐ２０１２−５０５６３６Ａ）
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３１２３５（Ｐ２０１１−５３１２３５）
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４２８９１
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０７０８１０９４）ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション (4)
【出願人】（３１１０１７９３５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４２８９１
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０７０８１０９４）ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション (4)
【出願人】（３１１０１７９３５）
【Ｆターム（参考）】
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