細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細部侵襲方法
【課題】細胞膜に与える影響を極力抑えながら、死滅させることなく細胞内に侵襲する細胞侵襲用プローブおよび細胞侵襲装置の提供。
【解決手段】液中にて基板２上に培養されている細胞Ｓに対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能なプローブであって、先端が先鋭化され、細胞内に穿刺される探針３ａと、該探針を片持ち状態に支持するレバー部３ｂと、探針の外表面上に形成された脂質二分子膜３ｃとを備え、探針を細胞に穿刺したときに脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化される細胞侵襲用プローブ。
【解決手段】液中にて基板２上に培養されている細胞Ｓに対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能なプローブであって、先端が先鋭化され、細胞内に穿刺される探針３ａと、該探針を片持ち状態に支持するレバー部３ｂと、探針の外表面上に形成された脂質二分子膜３ｃとを備え、探針を細胞に穿刺したときに脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化される細胞侵襲用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス分野、再生医療等に関連する分野において、細胞への各種の溶液の導入や、精子、卵子等の物質の導入や、細胞内の内容物の吸引等を行うために細胞内に侵襲する細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細胞侵襲方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフサイエンス分野、再生医療やゲノム創薬等の分野において、細胞に遺伝子や各種の薬剤を導入して、細胞の性質を改変することが行われている。これは、タンパク質発現や細胞動態（細胞の大きさ、形や細胞そのものの動き等の変化）を観察することで、遺伝子機能の解析等を行うためである。
また、細胞生物学の分野においても、１つ１つの細胞の個性を調べる研究が行われるようになっており、１つの細胞での遺伝子発現変化等を観察するために、生きた細胞から僅かな量の生体分子を取り出して解析する技術が不可欠なものとされている。
このように、１つ１つの細胞に各種の溶液を導入したり、精子、卵子等の物質を導入したり、細胞内から生体分子等の内容物を吸引して採取したりすることが、近年では頻繁に行われている。
【０００３】
ところで、細胞への導入方法としては、様々な方法が提供されている。例えば、電気刺激を利用した導入方法や、電荷の差異を利用した導入方法や、リポソームを利用した導入方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、一般的に１個の細胞をターゲットにすることができず、複数の細胞に対して統計的に導入を処理するものであった。具体的には、電気刺激やｐＨの調整等によって、細胞膜（脂質二分子膜）を一時的に破壊することによって細胞膜内への導入を促すものであった。そのため、上述したニーズに対応することができなかった。
【０００４】
一方、単一細胞を対象とした導入方法として、所望する細胞にガラスキャピラリー等の微小針を挿入して、各種溶液や卵子等の物質を導入する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法によれば、１個の細胞に対してのみ導入を行うことができるので、上述したニーズに対応することが可能な方法である。
【特許文献１】特開２００６−３４１７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の方法では以下の課題が残されていた。
即ち、微小針を利用する方法は、該微小針を細胞に侵襲させる（刺す）ことで、各種の溶液や物質を導入したり、細胞内から生体分子等の物質を吸引して採取したりする方法であるが、図１３に示すように、微小針３０を細胞Ｓに刺したときに、穴が開く前に細胞Ｓが自身の軟性（弾性）により凹んでしまい、微小針３０が確実に細胞Ｓ内に侵入したか否かを判断することが困難なものであった。
【０００６】
また、仮に細胞Ｓ内への侵襲ができたとしても、図１４に示すように、細胞Ｓに対して十分に小さくない微小針３０が細胞膜Ｓ１を物理的に突き破って内部に侵襲するので、細胞Ｓ自体を破壊する可能性があった。また、細胞膜Ｓ１に存在する各種タンパク質を微小針３０と一緒に、細胞Ｓ内に混入させる恐れもあった。更に、微小針３０を細胞Ｓから引き上げる際にも、図１５に示すように、細胞Ｓから細胞膜Ｓ１の一部を奪い取ってしまう恐れがあった。これは、細胞Ｓから微小針３０を引き抜く際に、微小針３０に付着した細胞膜Ｓ１の一部が微小針３０と一緒に引き抜かれてしまうからである。
【０００７】
このように従来の方法では、細胞膜Ｓ１表面に存在する各種タンパク質（Ｇタンパクを代表とする膜タンパク質等）や糖鎖糖を物理的に破壊したり、微小針３０と一緒に引き抜いてしまったりする恐れがあった。そのため、細胞Ｓ投入した後に期待される細胞分裂や、細胞Ｓ内部でのタンパク合成等が阻害されてしまうという問題があった。特に、哺乳類等においては、この現象が顕著なものであった。
【０００８】
一方、細胞Ｓ内に含まれる物質を観察したいというニーズが近年高まってきている。一般的な高分解能観察においては、光学顕微鏡を利用する手法が代表的であるが、高分解能とはいえ、やはり分解能に限界があり、細胞Ｓ内を正確に観察することは困難であった。そのため、光学顕微鏡に代わる方法として、細胞Ｓを乾燥させた後にレプリカ法等によってＳＥＭ（走査形電子顕微鏡：Scanning Electron Microscope）による高分解能観察を行ったり、細胞Ｓを凍結させた後にＳＥＭによって観察を行ったりする等の手法が用いられてきた。
【０００９】
しかしながらこれらの方法は、細胞Ｓを一旦死滅させた後に観察を行う方法であるので、正確な観察を行うことができなかった。また、生きたままの状態による経時的な観察に関しても行うことができなかった。
なお、細胞Ｓ内部に蛍光物質を導入した一分子蛍光観察も考えられるが、この手法は対象とした一分子又はその集団の蛍光を追跡することによる観察手法であり、形態学的な知見が得られるものではなかった。
【００１０】
そこで、微小針３０に代えて、先端に探針を有する走査型プローブ顕微鏡のプローブを細胞Ｓ内に侵襲させ、該プローブを利用して観察する方法が考えられる。しかしながら、この場合であっても、プローブを侵襲させる際に細胞Ｓが死滅する可能性があった。また、細胞Ｓが死滅しない場合であっても、図１６に示すように、プローブ先端の探針３１をスキャンさせる際に、探針３１が細胞膜Ｓ１にダメージを与えてしまうと共に、細胞膜Ｓ１から探針３１が微小な抵抗を受けてしまうので、正確な観察を行うことができなかった。
【００１１】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、細胞膜に与える影響を極力抑えながら、死滅させることなく細胞内に侵襲することができると共に、細胞内の内容物を生きたままの状態で正確に観察することができる細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細胞侵襲方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明に係る細胞侵襲用プローブは、液中にて基板上に培養されている細胞に対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能な細胞侵襲用プローブであって、先端が先鋭化され、前記細胞内に穿刺される探針と、該探針を片持ち状態に支持するレバー部と、前記探針の外表面上に形成された脂質二分子膜とを備え、前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とするものである。
【００１３】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、レバー部によって支持された探針の外表面上に、細胞表面の細胞膜と同じ構成の脂質二分子膜が形成されている。つまり、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部同士を内側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が探針の外表面に複数形成されることで脂質二分子膜が形成されている。
そのため、探針と細胞とをＸＹ方向及びＺ方向に向けて相対的に移動させて、探針を細胞に近づけると、まず探針の外表面に形成された脂質二分子膜が細胞膜に接触する。すると細胞膜は、該細胞膜と同じ構成である脂質二分子膜と融合し始め、細胞膜と脂質二分子膜とが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜が脂質二分子膜に引っ張られて、探針の外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜が細胞膜に引っ張られて、細胞膜に移動し始める。このように、細胞膜と脂質二分子膜とが、相互に移動し合って融合する。これにより、探針を細胞内に押し込むにつれて、細胞膜及び脂質二分子膜を探針の外表面上に押し退けることができる。
【００１４】
よって、細胞膜を物理的に突き破ることなく、探針部分のみを細胞内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞を死滅させることなく探針を細胞内に入れて侵襲させることができる。特に、従来のように細胞を物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜と細胞膜とを融合させて一体化できるので、探針を穿刺するにあたり、細胞が凹んで探針から逃げてしまうことがない。この点からも、細胞に刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜を細胞内に混入させてしまうこともない。
【００１５】
上述したように、この細胞侵襲用プローブによれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲できるので、細胞膜に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針によって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
【００１６】
また、探針を細胞内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針の外表面に形成されている脂質二分子膜は、細胞膜と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて探針と共に移動し難い状態となっている。そのため、探針を引き抜くと、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて細胞側に残り易く、主に探針だけを引き抜くことができる。なお、探針側の膜残りの制御は、引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜を引き抜くことなく、探針を細胞内から引き抜くことができる。従って、探針を引き抜いた後であっても、細胞を死滅させることがない。また、探針を引き抜くにつれて、細胞膜は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞の表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜は、その一部が細胞側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜となる。
【００１７】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明の細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針の外表面が、親水化処理がされていることを特徴とするものである。
【００１８】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針の外表面が親水化処理されて濡れ性が向上しているので、脂質二分子膜と外表面との密着性を向上することができる。従って、脂質二分子膜が途中で剥がれてしまうことがなく、プローブの信頼性を向上することができる。
【００１９】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明の細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されていることを特徴とするものである。
【００２０】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針を細胞内に侵襲させた後、管路を介して細胞内に所定の物質、例えば、薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等を導入したり、細胞内から内容物、即ち細胞を構成する各種物質を吸引したりすることができる。このように、管路を利用することで、容易且つ確実に、多種多用の細胞計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測やイオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００２１】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針の先端と前記脂質二分子膜との間には、前記細胞内に投入する特定物質が予め担持されていることを特徴とするものである。
【００２２】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針の先端と脂質二分子膜との間に、予め特定物質が担持されているので、探針を細胞内に侵襲させた後、確実且つ速やかにこの特定物質を細胞内に投入することができる。よって、細胞の反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針を細胞内に侵襲するだけで、特定物質を直ちに投入できるので使い易い。
【００２３】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブにおいて、前記脂質二分子膜が、リン脂質又は糖脂質の両親媒性分子からなる膜であることを特徴とするものである。
【００２４】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、脂質二分子膜が、リン脂質（スフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）又は、糖脂質（スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）の両親媒性分子からなる膜とされている。具体的には、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ガラクトセレブロシド、ＧＭ１ガングリオシド、シアル酸（ＮＡＮＡ）等の両親媒性分子からなる膜とされている。
【００２５】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブと、該細胞侵襲用プローブと前記基板とを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に相対移動させて、前記探針を前記細胞に穿刺させる移動手段と、前記細胞を観察する観察手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００２６】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、移動手段により細胞侵襲用プローブと基板とを、ＸＹ方向及びＺ方向に向けて適宜相対的に移動させることで、狙った細胞内に探針を確実に侵襲することができる。この際、観察手段で細胞を観察できるので、より正確に侵襲を行うことができる。また、侵襲後の細胞の動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
【００２７】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明の細胞侵襲装置において、前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整手段を備えていることを特徴とするものである。
【００２８】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、環境調整手段により、培養されている細胞の周囲環境、例えば、温度、湿度、気圧や二酸化炭素濃度等を、所定の環境条件に調整することができる。よって、細胞の種類等に応じて、環境を最適な状態に調整することができる。従って、より正確に細胞の観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【００２９】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明の細胞侵襲装置において、前記レバー部の撓みを測定する変位測定手段を備えていることを特徴とするものである。
【００３０】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、変位測定手段によりレバー部の撓みを測定できるので、細胞への侵襲や細胞からの引き抜きがされたか否かをより正確に判断することができる。また、探針を細胞内に侵襲させた状態で、細胞内をＡＦＭ観察することができる。従って、細胞内に含まれる各種の細胞物質を、生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜と細胞膜とが融合しているので、探針を走査したとしても、従来のように細胞膜にダメージを与えることはない。
【００３１】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、レバー部に片持ち状態に支持され、先端が先鋭化された探針を液中にて基板上に培養されている細胞に穿刺させる細胞侵襲方法であって、前記探針の外表面上に脂質二分子膜を形成する脂質膜形成工程と、該脂質膜形成工程後、前記細胞を観察しながら該細胞上に前記探針を移動させる移動工程と、該移動工程後、前記探針と前記細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺させる穿刺工程とを備え、前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とするものである。
【００３２】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、まず脂質膜形成工程により、レバー部に片持ち状に支持された探針の外表面上に、細胞表面の細胞膜と同じ構成の脂質二分子膜を形成する。形成方法としては、例えば、予め脂質膜を展開した水溶液に探針を浸漬させた後、ゆっくり引き上げることで、探針の外表面に脂質二分子膜を付着させて形成する。つまり、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部同士を内側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が複数形成されることで脂質二分子膜が形成される。
【００３３】
次いで、培養されている細胞を観察しながら、目的の細胞上に探針を移動させる移動工程を行う。この際、細胞を観察しているので、探針を目的の細胞上に正確に位置決めすることができる。
【００３４】
次いで、この状態から探針と細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺する穿刺工程を行う。この穿刺工程を行うにあたり、探針と細胞とを接近させていくと、まず探針の外表面に形成された脂質二分子膜が細胞膜に接触する。すると細胞膜は、該細胞膜と同じ構成である脂質二分子膜と融合し始め、細胞膜と脂質二分子膜とが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜が脂質二分子膜に引っ張られて、探針の外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜が細胞膜に引っ張られて、細胞膜に移動し始める。このように、細胞膜と脂質二分子膜とが、相互に移動し合って融合する。これにより、探針を細胞内に押し込むにつれて、細胞膜及び脂質二分子膜を探針の外表面上に押し退けることができる。
【００３５】
よって、細胞膜を物理的に突き破ることなく、探針部分のみを細胞内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞を死滅させることなく探針を細胞内に入れて侵襲させることができる。特に、従来のように細胞を物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜と細胞膜とを融合させて一体化できるので、探針を穿刺するにあたり、細胞が凹んで探針から逃げてしまうことがない。この点からも、細胞に刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜を細胞内に混入させてしまうこともない。
【００３６】
上述したように、この細胞侵襲方法によれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲できるので、細胞膜に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針によって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
【００３７】
また、探針を細胞内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針の外表面に形成されている脂質二分子膜は、細胞膜と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて探針と共に移動し難い状態となっている。そのため、探針を引き抜くと、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて細胞側に残り易く、主に探針だけを引き抜くことができる。なお、探針側の膜残りの制御は、引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜を引き抜くことなく、探針を細胞内から引き抜くことができる。従って、探針を引き抜いた後であっても、細胞を死滅させることがない。また、探針を引き抜くにつれて、細胞膜は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞の表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜は、その一部が細胞側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜となる。
【００３８】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明の細胞侵襲方法において、前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の外表面を親水化処理する親水化工程を行うことを特徴とするものである。
【００３９】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、親水化工程により、探針の外表面を親水化処理して濡れ性を向上させるので、脂質二分子膜と外表面との密着性を向上することができる。従って、脂質二分子膜が途中で剥がれてしまうことがなく、プローブの信頼性を向上することができる。
【００４０】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明の細胞侵襲方法において、前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されており、前記穿刺工程後、前記管路を利用して前記細胞内に所定の物質を導入、若しくは、細胞内から内容物を吸引する導入吸引工程を備えていることを特徴とするものである。
【００４１】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、探針を細胞内に侵襲させた後、導入吸引工程を行うことで、管路を介して細胞内に所定の物質、例えば、薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等を導入したり、細胞内から内容物、即ち細胞を構成する各種物質を吸引したりすることができる。このように、導入吸引工程を行うことで、容易且つ確実に多種多様な細胞計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測やイオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００４２】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の先端に前記細胞内に投入する特定物質を予め担持させる担持工程を行い、前記穿刺工程時に、前記特定物質を前記細胞内に投入することを特徴とするものである。
【００４３】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、担持工程により探針の先端に予め特定物質を担持しているので、穿刺工程時に確実且つ速やかにこの特定物質を細胞内に投入することができる。よって、細胞の反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針を細胞内に侵襲するだけで、特定物質を直ちに投入できるので使い易い。
【００４４】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記穿刺工程後、前記探針を前記細胞内で走査させて細胞内をＡＦＭ観察する観察工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００４５】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、細胞内に侵襲させた探針を細胞内で走査させて、細胞内をＡＦＭ観察する観察工程を行うことで、細胞内に含まれる各種の細胞物質を生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜と細胞膜とが融合しているので、探針を走査したとしても細胞膜が外表面上に逃げていく。従って、従来のように細胞膜にダメージを与えることはない。
【００４６】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整工程を備えていることを特徴とするものである。
【００４７】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、環境調整工程により、培養されている細胞の周囲環境、例えば、温度、湿度、気圧や二酸化炭素濃度等を、所定の環境条件に調整することができる。よって、細胞の種類等に応じて、環境を最適な状態に調整することができる。従って、より正確に細胞の観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明に係る細胞侵襲用プローブ及び細胞侵襲方法によれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲することができる。
また、本発明に係る細胞侵襲装置によれば、上記細胞侵襲用プローブを備えているので、細胞の動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明に係る細胞侵襲用プローブ、細胞侵襲装置及び細胞侵襲方法の一実施形態について、図１から図１２を参照して説明する。
本実施形態の細胞侵襲装置１は、図１に示すように、液中で細胞Ｓを培養するセル（基板）２と、細胞侵襲用プローブ３を有する走査型プローブ顕微鏡４と、細胞Ｓを観察する光学顕微鏡５を有する光学装置（観察手段）６とを組み合わせた装置である。
【００５０】
走査型プローブ顕微鏡４は、細胞Ｓに対向配置された細胞侵襲用プローブ３と、該細胞侵襲用プローブ３とセル２とを、セル２の底面（基板表面）に平行なＸＹ方向及びこれらＸＹ方向に垂直なＺ方向に相対移動させて、細胞侵襲用プローブ３の探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる移動手段７と、細胞侵襲用プローブ３のレバー部３ｂの撓みを測定する変位測定手段８と、これら各構成品を総合的に制御する制御部９とを備えている。
【００５１】
上記セル２は、光学的に透明な材料により、上部が開口した断面コ形形状に形成されており、ステージ１０上に保持されている。このセル２の内部には、培地（細胞Ｓが正常な機能を営むための要素を含む培養液）Ｗが貯留されており、底面に複数の細胞Ｓが培養されている。また、このセル２には、図示しないヒータや二酸化炭素供給部等が組み込まれており、例えば、培地Ｗの温度が３７±０．５℃、二酸化炭素濃度が５％になるように調整されている。また、このセル２は、密閉された容器１１内に収納されている。そしてこの容器１１には、内部の圧力を任意の圧力（例えば、真空状態）に調整する真空ポンプ１２と、容器１１内に所定の湿度を持った空気を供給して湿度を調整する湿度調整部１３とが接続されている。
【００５２】
これらヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２及び湿度調整部１３によって、容器１１内における細胞Ｓの周囲環境を培養に適した所定の環境条件に調整できるようになっている。即ち、これら容器１１、ヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２及び湿度調整部１３は、環境調整手段１４を構成している。
なお、セル２には、図示しない管路を介して培地Ｗが循環するようになっており、常に新しい培地Ｗが供給されるようになっている。
【００５３】
上記光学顕微鏡５は、ステージ１０の下方に配置されており、ステージ１０の略中心に形成された開口１０ａを通してセル２の下側から複数の細胞Ｓの培養状態を観察できるようになっている。また、この光学顕微鏡５は、観察した画像を制御部９に接続されたモニタ１５に出力している。これにより、作業者は、モニタ１５に表示された画像を見ながら操作部で細胞Ｓの位置を特定できるようになっている。即ち、これら光学顕微鏡５及びモニタ１５は、上記光学装置６を構成している。なお、モニタ１５は、容器１１の外部に配置されている。
【００５４】
上記細胞侵襲用プローブ３は、先端が先鋭化され、細胞Ｓ内に穿刺される探針３ａと、基端側が本体部に支持された状態で探針３ａを片持ち状態に支持するレバー部３ｂと、探針３ａの外表面上に形成された脂質二分子膜３ｃとで構成されている。
脂質二分子膜３ｃは、図２に示すように、探針３ａを包み込むように該探針３ａの外表面上に形成されている。この脂質二分子膜３ｃは、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部Ｐ１を内側且つ親水部Ｐ２を外側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が探針３ａの外表面に複数形成されて膜状となったものである。
【００５５】
本実施形態の脂質二分子膜３ｃは、リン脂質（スフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）又は、糖脂質（スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）の両親媒性分子からなる脂質膜とされている。具体的には、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ガラクトセレブロシド、ＧＭ１ガングリオシド、シアル酸（ＮＡＮＡ）等の両親媒性分子からなる膜とされている。
【００５６】
ここで、リン脂質についてより詳細に説明すると、このリン脂質は、リン酸を親水部に持つ脂質であり、グリセリンの３つの水酸基の内端の１つにリン酸が、残りに脂肪酸がエステル結合したものである。脂肪酸は、炭素数１２〜１８の飽和、不飽和の炭素鎖の端にカルボン酸がついた疎水的な分子である。脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸等である。
【００５７】
上述した脂質二分子膜３ｃは、図３に示すように、細胞Ｓの表面を覆っている細胞膜Ｓ１と同じ構成からなる脂質膜である。そのため、探針３ａを細胞Ｓに穿刺したときに、脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に融合して一体化するようになっている。これについては、後に詳細に説明する。
【００５８】
この細胞侵襲用プローブ３は、図１に示すように、本体部３ｄを介してＸＹＺスキャナ１６の下面に固定された斜面ブロック１７にワイヤ等により着脱自在に固定されている。この際、細胞侵襲用プローブ３は、斜面ブロック１７によってセル２の底面に対してレバー部３ｂが所定角度傾くように固定されている。また、細胞侵襲用プローブ３は、少なくとも探針３ａ部分が培地Ｗに浸かるように位置が調整されている。
【００５９】
上記ＸＹＺスキャナ１６は、ＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛）等からなる圧電素子であり、容器１１内に設けられている。そして、このＸＹＺスキャナ１６は、容器１１の外側に配置されたドライブ回路１８から電圧が印加されると、その電圧印加量及び極性に応じて、ＸＹ方向（セル２の底面に対して平行な方向）及びＺ方向（セル２の底面に対して垂直な方向）の３方向に対して微小移動するようになっている。これにより、細胞侵襲用プローブ３をＸＹ方向及びＺ方向に移動させることができるようになっている。即ち、ＸＹＺスキャナ１６及びドライブ回路１８は、上記移動手段７を構成している。
【００６０】
なお、本実施形態では、細胞侵襲用プローブ３をＸＹＺ方向に移動させる構成としたが、この場合に限られず、ステージ１０側をＸＹＺ方向に移動させる構成としても構わない。この場合においても、スキャン方式が異なるだけで、以降に説明する作用効果と同様の作用効果を奏することができる。なお、細胞侵襲用プローブ３側及びステージ１０側を共にＸＹＺ方向に移動できるように構成しても構わない。
【００６１】
また、細胞侵襲用プローブ３の上方であって容器１１の外側には、レーザ光Ｌを照射する半導体レーザ光源２０と、レバー部３ｂの図示しない反射面で反射されたレーザ光Ｌを受光するレーザ受光部２１とが、図示しない架台に取り付けられている。レーザ受光部２１は、例えば、４分割フォトディテクタであり、レーザ光Ｌの入射位置に基づいて、レバー部３ｂの撓み変化を検出している。そして、レーザ受光部２１は、検出したレバー部３ｂの撓み変化を撓み信号に変換した後、制御部９に出力している。即ち、これら半導体レーザ光源２０及びレーザ受光部２１は、上記変位測定手段８を構成している。
なお、レーザ光Ｌは、容器１１の上部に取り付けられたウインドウ２２を介して、容器１１内に入射したり、容器１１外に出射したりするようになっている。
【００６２】
制御部９は、レーザ受光部２１から送られてきた撓み信号に応じて、ドライブ回路１８を作動させるようになっている。また、この制御部９には、作業者が各種条件を入力したり、ドライブ回路１８等を作動させたりするための操作部９ａが接続されている。これにより作業者は、操作部９ａを介してＸＹＺスキャナ１６を３次元方向に適宜移動することができるようになっている。
【００６３】
次に、このように構成された細胞侵襲装置１を利用して、探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲させると共に、細胞Ｓ内を観察する細胞侵襲方法について説明する。
本実施形態の細胞侵襲方法は、探針３ａの外表面に脂質二分子膜３ｃを形成する脂質膜形成工程と、該脂質膜形成工程後、細胞Ｓを観察しながら該細胞Ｓ上に探針３ａを移動させる移動工程と、該移動工程後、探針３ａと細胞Ｓとを接近させて探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる穿刺工程と、該穿刺工程後、探針３ａを細胞Ｓ内で走査させて細胞Ｓ内をＡＦＭ観察する観察工程とを行う方法である。また、本実施形態では、細胞Ｓの周囲を培養に適した所定の環境条件に調整する環境調整工程も同時に行う。以下、これら各工程について、詳細に説明する。
【００６４】
まず初めに、脂質膜形成工程により、探針３ａの外表面上に細胞膜Ｓ１と同じ構成の脂質二分子膜３ｃを形成する。この際の形成方法としては、例えば、予め脂質膜を展開した水溶液に探針３ａを浸漬させた後、ゆっくり引き上げることで、探針３ａの外表面に脂質二分子膜３ｃを形成することができる。
そして、脂質二分子膜３ｃを形成した後、細胞侵襲用プローブ３を斜面ブロック１７にセットすると共に、ステージ１０上にセル２をセットする。次いで、ヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２や湿度調整部１３を適宜作動させて、環境条件を培養に最適な条件に調整する環境調整工程を行う。これによって、長期的な細胞Ｓの培養も行うことができる。
【００６５】
次いで、セル２内で培養されている複数の細胞Ｓの培養状態を、セル２の下面側から光学顕微鏡５で観察する。そして作業者は、この観察された画像をモニタ１５で確認しながら、探針３ａを侵襲させる細胞Ｓを特定する。続いて、細胞Ｓの位置を特定した後、該細胞Ｓ上に探針３ａを移動させる移動工程を行う。即ち、ＸＹＺスキャナ１６を適宜ＸＹＺ方向に移動させて、特定した細胞Ｓ上に探針３ａを位置させる。この際、光学顕微鏡５で撮像している画像をモニタ１５で確認しながら行うので、探針３ａを特定した細胞Ｓ上に正確に位置決めさせることができる。
【００６６】
次いで、この状態からＸＹＺスキャナ１６をＺ方向に微小移動させて探針３ａと細胞Ｓとを接近させ、探針３ａを細胞Ｓに穿刺する穿刺工程を行う。この穿刺工程を行うにあたり、探針３ａと細胞Ｓとを接近させていくと、図４に示すように、まず探針３ａの外表面に形成された脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に接触する。すると細胞膜Ｓ１は、該細胞膜Ｓ１と同じ構成である脂質二分子膜３ｃと融合し始め、細胞膜Ｓ１と脂質二分子膜３ｃとが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜Ｓ１が脂質二分子膜３ｃに引っ張られて探針３ａの外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に引っ張られて細胞膜Ｓ１に移動し始める。このように、細胞膜Ｓ１と脂質二分子膜３ｃとが、相互に移動し合って融合する。これにより、図５及び図６に示すように、探針３ａを細胞Ｓ内に押し込むにつれて、細胞膜Ｓ１及び脂質二分子膜３ｃを探針３ａの外表面上に押し退けることができる。
【００６７】
その結果、図７に示すように、細胞膜Ｓ１を物理的に突き破ることなく、探針３ａ部分のみを細胞Ｓ内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜Ｓ１に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞Ｓを死滅させることなく探針３ａを細胞Ｓ内に入れて侵襲させることができる。
特に、従来のように細胞Ｓを物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とを融合させて一体化できるので、探針３ａを穿刺するにあたり、細胞Ｓが凹んで探針３ａから逃げてしまうことがない。この点からも、細胞Ｓに刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜Ｓ１を細胞Ｓ内に混入させてしまうこともない。
【００６８】
このように、本実施形態の細胞侵襲装置１及び細胞侵襲方法によれば、細胞膜Ｓ１に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞Ｓ内に侵入できるので、細胞膜Ｓ１に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針３ａによって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
また、光学顕微鏡５により細胞Ｓを観察できるので、侵襲後の細胞Ｓの動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
特に本実施形態では、培養されている細胞Ｓの周囲環境を、培養に適した最適な環境条件に調整できるので、より正確に細胞Ｓの観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【００６９】
更に、探針３ａが確実に細胞Ｓ内に侵襲したか否かに関しては、光学顕微鏡５によっても観察することができるが、本実施形態では、変位測定手段８を有する走査型プローブ顕微鏡４を備えているので、より高精度に侵襲の可否を判断することができる。
つまり、探針３ａと細胞Ｓとを近接させることにより、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とが接触すると、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１との融合等によりレバー部３ｂが撓み始める。そのため、レーザ受光部２１に入射するレーザ光Ｌ（反射面で反射したレーザ光Ｌ）の位置が変化する。レーザ受光部２１は、この変化に応じた撓み信号を制御部９に出力する。このように、制御部９は、探針３ａを穿刺する過程で生じるレバー部３ｂの変位を直ちに知ることができる。そして、制御部９は、この撓み信号と予め定められた規定値とを比較することで、上述したように細胞Ｓ内に侵襲したか否かを高精度に判断することができる。
【００７０】
また、穿刺工程が終了した後、ＸＹＺスキャナ１６により細胞Ｓ内に侵襲させた探針３ａをＸＹ方向に走査させて、細胞Ｓ内をＡＦＭ観察する観察工程を行う。これにより、細胞Ｓ内の内容物である各種物質、例えば、細胞核の孔や微小管、アクチンフィラメント等を、生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とが融合しているので、探針３ａを走査したとしても細胞膜Ｓ１が探針３ａの移動に合わせて探針３ａの外表面上に逃げていく。そのため、従来のように細胞膜Ｓ１にダメージを与えることはない。
【００７１】
なお、探針３ａを細胞Ｓ内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜Ｓ１を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針３ａの外表面に形成されている脂質二分子膜３ｃは、細胞膜Ｓ１と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜３ｃは細胞膜Ｓ１に引っ張られて探針３ａと共に移動し難い状態となっている。そのため、探針３ａを引き抜くと、脂質二分子膜３ｃは細胞膜Ｓ１に引っ張られて細胞Ｓ側に残り易く、主に探針３ａだけを引き抜くことができる。なお、探針３ａ側の膜残りの制御は、探針３ａの引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜Ｓ１を引き抜くことなく、探針３ａを細胞Ｓ内から引き抜くことができる、従って、探針３ａを引き抜いた後であっても、細胞Ｓを死滅させることはない。また、探針３ａを引き抜くにつれて、細胞膜Ｓ１は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞Ｓの表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜３ｃは、その一部が細胞Ｓ側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜Ｓ１となる。
【００７２】
なお、上記実施形態において、脂質膜形成工程の前に、探針３ａの外表面を親水化処理する親水化工程を行っても構わない。
具体的には、探針３ａの外表面にプラズマを照射することで親水化したり、ＵＶオゾン環境による表面改質を行うことで親水化したり、探針３ａの外表面に極薄膜のＳｉＯ２膜を形成し、該ＳｉＯ２膜に存在する微細クラックによる保湿効果を利用することで親水化したりする。このように各種の親水化処理を施すことで、外表面の濡れ性を向上することができ、脂質二分子膜３ｃと探針３ａの外表面との密着性を高めることができる。従って、脂質二分子膜３ｃが途中で剥がれてしまうことがなく、細胞侵襲用プローブ３の信頼性を向上することができる。
【００７３】
また、上記実施形態において、脂質膜形成工程の前に、探針３ａの先端に細胞Ｓ内に投入する特定物質Ｎを予め担持させる担持工程を行っても構わない。この工程を行うことで、図８に示すように、探針３ａの先端と脂質二分子膜３ｃとの間に、何らかの特定物質Ｎ（例えば卵子等）を担持させることができる。
こうすることで、穿刺工程によって探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲させた際に、図９に示すように、担持した特定物質Ｎを確実且つ速やかに細胞Ｓ内に投入することができる。よって、細胞Ｓの反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞Ｓを死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲するだけで、特定物質Ｎを直ちに投入できるので使い易い。
【００７４】
また、上記実施形態において、図１０に示すように、探針３ａの先端に開口を有する管路３ｅを、先端側から基端側に亘って形成しても構わない。このような細胞侵襲用プローブ３を利用することで、より多種多用な細胞Ｓの計測を容易且つ確実に行うことができる。即ち、穿刺工程後に、管路３ｅを利用して細胞Ｓ内に所定の物質を導入、若しくは、細胞Ｓ内から内容物を吸引する導入吸引工程を行うことができる。
具体的には、図１１示すように、管路３ｅを通じて細胞Ｓ内に薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等の各種物質を容易且つ確実に導入することができる。また、図１２に示すように、細胞Ｓ内から内容物である各種物質を、やはり管路３ｅを通じて吸引することもできる。このように導入吸引工程を行うことで、容易且つ確実に多種多用の細胞Ｓ計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測や、イオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞Ｓを死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００７５】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
【００７６】
例えば、上記実施形態では、変位測定手段８がレーザ光Ｌを利用した光てこ方式によりレバー部３ｂの撓みを測定したが、光てこ方式に限定されるものではない。例えば、レバー部３ｂ自身に変位検出機構（例えば、ピエゾ抵抗素子等）を設けた自己検知方式によりレバー部３ｂの撓みを測定するように構成しても構わない。
【００７７】
また、上記実施形態では、光学顕微鏡５を用いた場合を説明したが、細胞Ｓの確認と探針３ａの位置合わせとを行えれば、どのような観察手段でも構わない。例えば、ＣＣＤ等でも良い。但し、好ましくは生物用倒立型光学装置を用いると良い。
更に、上記実施形態では、走査型プローブ顕微鏡４と光学装置６とを組み合わせた場合を例に挙げて説明したが、走査型プローブ顕微鏡４は必須なものではない。例えば、細胞侵襲用プローブ３を有するマイクロマニュピレータと、光学装置とを組み合わせたものでも構わない。このように、細胞侵襲用プローブ３を操作して探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる移動手段と、細胞Ｓを観察する観察手段とを少なくとも備えていれば、細胞侵襲装置を構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明に係る細胞侵襲装置の一実施形態を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞侵襲装置の細胞侵襲用プローブの先端を拡大した図である。
【図３】図１に示す細胞侵襲装置のセルで培養されている細胞の拡大図である。
【図４】図１に示す細胞侵襲装置を利用して本発明に係る細胞侵襲方法を行う場合の工程図であって、探針と細胞とを近接させて脂質二分子膜と細胞膜とを接触させた状態を示す図である。
【図５】図４に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけた状態を示す図である。
【図６】図５に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけた状態を示す図である。
【図７】図６に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけて探針を細胞内に侵襲させた状態を示す図である。
【図８】本発明に係る細胞侵襲用プローブの変形例を示す図であって、探針の先端に特定物質が予め担持されている細胞侵襲用プローブの先端拡大図である。
【図９】図８に示す探針を細胞内に侵襲させて、細胞内に特定物質を投入している状態を示す図である。
【図１０】本発明に係る細胞侵襲用プローブの変形例を示す図であって、探針の先端に開口を有する管路が形成されている細胞侵襲用プローブの先端拡大図である。
【図１１】図１０に示す探針を細胞内に侵襲させて、管路を通じて細胞内に各種物質を導入している状態を示す図である。
【図１２】図１０に示す探針を細胞内に侵襲させて、管路を通じて細胞内から内容物を吸引している状態を示す図である。
【図１３】従来の細胞侵襲方法を説明するための図であって、微小針を細胞膜に押し付けている状態を示す図である。
【図１４】図１３に示す状態から、細胞膜を突き破って微小針を細胞内に穿刺した状態を示す図である。
【図１５】図１４に示す状態から、微小針を細胞内から引き抜いた状態を示す図である。
【図１６】従来の細胞侵襲方法を説明するための図であって、細胞膜を突き破って細胞内に侵襲させた探針をスキャンさせている状態を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
Ｎ 特定物質
Ｓ 細胞
Ｓ１ 細胞膜
１ 細胞侵襲装置
２ セル（基板）
３ 細胞侵襲用プローブ
３ａ 探針
３ｂ レバー部
３ｃ 脂質二分子膜
３ｅ 管路
６ 光学装置（観察手段）
７ 移動手段
８ 変位測定手段
１４ 環境調整手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス分野、再生医療等に関連する分野において、細胞への各種の溶液の導入や、精子、卵子等の物質の導入や、細胞内の内容物の吸引等を行うために細胞内に侵襲する細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細胞侵襲方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフサイエンス分野、再生医療やゲノム創薬等の分野において、細胞に遺伝子や各種の薬剤を導入して、細胞の性質を改変することが行われている。これは、タンパク質発現や細胞動態（細胞の大きさ、形や細胞そのものの動き等の変化）を観察することで、遺伝子機能の解析等を行うためである。
また、細胞生物学の分野においても、１つ１つの細胞の個性を調べる研究が行われるようになっており、１つの細胞での遺伝子発現変化等を観察するために、生きた細胞から僅かな量の生体分子を取り出して解析する技術が不可欠なものとされている。
このように、１つ１つの細胞に各種の溶液を導入したり、精子、卵子等の物質を導入したり、細胞内から生体分子等の内容物を吸引して採取したりすることが、近年では頻繁に行われている。
【０００３】
ところで、細胞への導入方法としては、様々な方法が提供されている。例えば、電気刺激を利用した導入方法や、電荷の差異を利用した導入方法や、リポソームを利用した導入方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、一般的に１個の細胞をターゲットにすることができず、複数の細胞に対して統計的に導入を処理するものであった。具体的には、電気刺激やｐＨの調整等によって、細胞膜（脂質二分子膜）を一時的に破壊することによって細胞膜内への導入を促すものであった。そのため、上述したニーズに対応することができなかった。
【０００４】
一方、単一細胞を対象とした導入方法として、所望する細胞にガラスキャピラリー等の微小針を挿入して、各種溶液や卵子等の物質を導入する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法によれば、１個の細胞に対してのみ導入を行うことができるので、上述したニーズに対応することが可能な方法である。
【特許文献１】特開２００６−３４１７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の方法では以下の課題が残されていた。
即ち、微小針を利用する方法は、該微小針を細胞に侵襲させる（刺す）ことで、各種の溶液や物質を導入したり、細胞内から生体分子等の物質を吸引して採取したりする方法であるが、図１３に示すように、微小針３０を細胞Ｓに刺したときに、穴が開く前に細胞Ｓが自身の軟性（弾性）により凹んでしまい、微小針３０が確実に細胞Ｓ内に侵入したか否かを判断することが困難なものであった。
【０００６】
また、仮に細胞Ｓ内への侵襲ができたとしても、図１４に示すように、細胞Ｓに対して十分に小さくない微小針３０が細胞膜Ｓ１を物理的に突き破って内部に侵襲するので、細胞Ｓ自体を破壊する可能性があった。また、細胞膜Ｓ１に存在する各種タンパク質を微小針３０と一緒に、細胞Ｓ内に混入させる恐れもあった。更に、微小針３０を細胞Ｓから引き上げる際にも、図１５に示すように、細胞Ｓから細胞膜Ｓ１の一部を奪い取ってしまう恐れがあった。これは、細胞Ｓから微小針３０を引き抜く際に、微小針３０に付着した細胞膜Ｓ１の一部が微小針３０と一緒に引き抜かれてしまうからである。
【０００７】
このように従来の方法では、細胞膜Ｓ１表面に存在する各種タンパク質（Ｇタンパクを代表とする膜タンパク質等）や糖鎖糖を物理的に破壊したり、微小針３０と一緒に引き抜いてしまったりする恐れがあった。そのため、細胞Ｓ投入した後に期待される細胞分裂や、細胞Ｓ内部でのタンパク合成等が阻害されてしまうという問題があった。特に、哺乳類等においては、この現象が顕著なものであった。
【０００８】
一方、細胞Ｓ内に含まれる物質を観察したいというニーズが近年高まってきている。一般的な高分解能観察においては、光学顕微鏡を利用する手法が代表的であるが、高分解能とはいえ、やはり分解能に限界があり、細胞Ｓ内を正確に観察することは困難であった。そのため、光学顕微鏡に代わる方法として、細胞Ｓを乾燥させた後にレプリカ法等によってＳＥＭ（走査形電子顕微鏡：Scanning Electron Microscope）による高分解能観察を行ったり、細胞Ｓを凍結させた後にＳＥＭによって観察を行ったりする等の手法が用いられてきた。
【０００９】
しかしながらこれらの方法は、細胞Ｓを一旦死滅させた後に観察を行う方法であるので、正確な観察を行うことができなかった。また、生きたままの状態による経時的な観察に関しても行うことができなかった。
なお、細胞Ｓ内部に蛍光物質を導入した一分子蛍光観察も考えられるが、この手法は対象とした一分子又はその集団の蛍光を追跡することによる観察手法であり、形態学的な知見が得られるものではなかった。
【００１０】
そこで、微小針３０に代えて、先端に探針を有する走査型プローブ顕微鏡のプローブを細胞Ｓ内に侵襲させ、該プローブを利用して観察する方法が考えられる。しかしながら、この場合であっても、プローブを侵襲させる際に細胞Ｓが死滅する可能性があった。また、細胞Ｓが死滅しない場合であっても、図１６に示すように、プローブ先端の探針３１をスキャンさせる際に、探針３１が細胞膜Ｓ１にダメージを与えてしまうと共に、細胞膜Ｓ１から探針３１が微小な抵抗を受けてしまうので、正確な観察を行うことができなかった。
【００１１】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、細胞膜に与える影響を極力抑えながら、死滅させることなく細胞内に侵襲することができると共に、細胞内の内容物を生きたままの状態で正確に観察することができる細胞侵襲用プローブ及び該細胞侵襲用プローブを有する細胞侵襲装置、並びに、細胞侵襲方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明に係る細胞侵襲用プローブは、液中にて基板上に培養されている細胞に対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能な細胞侵襲用プローブであって、先端が先鋭化され、前記細胞内に穿刺される探針と、該探針を片持ち状態に支持するレバー部と、前記探針の外表面上に形成された脂質二分子膜とを備え、前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とするものである。
【００１３】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、レバー部によって支持された探針の外表面上に、細胞表面の細胞膜と同じ構成の脂質二分子膜が形成されている。つまり、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部同士を内側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が探針の外表面に複数形成されることで脂質二分子膜が形成されている。
そのため、探針と細胞とをＸＹ方向及びＺ方向に向けて相対的に移動させて、探針を細胞に近づけると、まず探針の外表面に形成された脂質二分子膜が細胞膜に接触する。すると細胞膜は、該細胞膜と同じ構成である脂質二分子膜と融合し始め、細胞膜と脂質二分子膜とが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜が脂質二分子膜に引っ張られて、探針の外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜が細胞膜に引っ張られて、細胞膜に移動し始める。このように、細胞膜と脂質二分子膜とが、相互に移動し合って融合する。これにより、探針を細胞内に押し込むにつれて、細胞膜及び脂質二分子膜を探針の外表面上に押し退けることができる。
【００１４】
よって、細胞膜を物理的に突き破ることなく、探針部分のみを細胞内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞を死滅させることなく探針を細胞内に入れて侵襲させることができる。特に、従来のように細胞を物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜と細胞膜とを融合させて一体化できるので、探針を穿刺するにあたり、細胞が凹んで探針から逃げてしまうことがない。この点からも、細胞に刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜を細胞内に混入させてしまうこともない。
【００１５】
上述したように、この細胞侵襲用プローブによれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲できるので、細胞膜に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針によって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
【００１６】
また、探針を細胞内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針の外表面に形成されている脂質二分子膜は、細胞膜と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて探針と共に移動し難い状態となっている。そのため、探針を引き抜くと、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて細胞側に残り易く、主に探針だけを引き抜くことができる。なお、探針側の膜残りの制御は、引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜を引き抜くことなく、探針を細胞内から引き抜くことができる。従って、探針を引き抜いた後であっても、細胞を死滅させることがない。また、探針を引き抜くにつれて、細胞膜は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞の表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜は、その一部が細胞側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜となる。
【００１７】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明の細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針の外表面が、親水化処理がされていることを特徴とするものである。
【００１８】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針の外表面が親水化処理されて濡れ性が向上しているので、脂質二分子膜と外表面との密着性を向上することができる。従って、脂質二分子膜が途中で剥がれてしまうことがなく、プローブの信頼性を向上することができる。
【００１９】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明の細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されていることを特徴とするものである。
【００２０】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針を細胞内に侵襲させた後、管路を介して細胞内に所定の物質、例えば、薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等を導入したり、細胞内から内容物、即ち細胞を構成する各種物質を吸引したりすることができる。このように、管路を利用することで、容易且つ確実に、多種多用の細胞計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測やイオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００２１】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブにおいて、前記探針の先端と前記脂質二分子膜との間には、前記細胞内に投入する特定物質が予め担持されていることを特徴とするものである。
【００２２】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、探針の先端と脂質二分子膜との間に、予め特定物質が担持されているので、探針を細胞内に侵襲させた後、確実且つ速やかにこの特定物質を細胞内に投入することができる。よって、細胞の反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針を細胞内に侵襲するだけで、特定物質を直ちに投入できるので使い易い。
【００２３】
また、本発明に係る細胞侵襲用プローブは、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブにおいて、前記脂質二分子膜が、リン脂質又は糖脂質の両親媒性分子からなる膜であることを特徴とするものである。
【００２４】
この発明に係る細胞侵襲用プローブにおいては、脂質二分子膜が、リン脂質（スフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）又は、糖脂質（スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）の両親媒性分子からなる膜とされている。具体的には、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ガラクトセレブロシド、ＧＭ１ガングリオシド、シアル酸（ＮＡＮＡ）等の両親媒性分子からなる膜とされている。
【００２５】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲用プローブと、該細胞侵襲用プローブと前記基板とを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に相対移動させて、前記探針を前記細胞に穿刺させる移動手段と、前記細胞を観察する観察手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００２６】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、移動手段により細胞侵襲用プローブと基板とを、ＸＹ方向及びＺ方向に向けて適宜相対的に移動させることで、狙った細胞内に探針を確実に侵襲することができる。この際、観察手段で細胞を観察できるので、より正確に侵襲を行うことができる。また、侵襲後の細胞の動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
【００２７】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明の細胞侵襲装置において、前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整手段を備えていることを特徴とするものである。
【００２８】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、環境調整手段により、培養されている細胞の周囲環境、例えば、温度、湿度、気圧や二酸化炭素濃度等を、所定の環境条件に調整することができる。よって、細胞の種類等に応じて、環境を最適な状態に調整することができる。従って、より正確に細胞の観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【００２９】
また、本発明に係る細胞侵襲装置は、上記本発明の細胞侵襲装置において、前記レバー部の撓みを測定する変位測定手段を備えていることを特徴とするものである。
【００３０】
この発明に係る細胞侵襲装置においては、変位測定手段によりレバー部の撓みを測定できるので、細胞への侵襲や細胞からの引き抜きがされたか否かをより正確に判断することができる。また、探針を細胞内に侵襲させた状態で、細胞内をＡＦＭ観察することができる。従って、細胞内に含まれる各種の細胞物質を、生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜と細胞膜とが融合しているので、探針を走査したとしても、従来のように細胞膜にダメージを与えることはない。
【００３１】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、レバー部に片持ち状態に支持され、先端が先鋭化された探針を液中にて基板上に培養されている細胞に穿刺させる細胞侵襲方法であって、前記探針の外表面上に脂質二分子膜を形成する脂質膜形成工程と、該脂質膜形成工程後、前記細胞を観察しながら該細胞上に前記探針を移動させる移動工程と、該移動工程後、前記探針と前記細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺させる穿刺工程とを備え、前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とするものである。
【００３２】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、まず脂質膜形成工程により、レバー部に片持ち状に支持された探針の外表面上に、細胞表面の細胞膜と同じ構成の脂質二分子膜を形成する。形成方法としては、例えば、予め脂質膜を展開した水溶液に探針を浸漬させた後、ゆっくり引き上げることで、探針の外表面に脂質二分子膜を付着させて形成する。つまり、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部同士を内側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が複数形成されることで脂質二分子膜が形成される。
【００３３】
次いで、培養されている細胞を観察しながら、目的の細胞上に探針を移動させる移動工程を行う。この際、細胞を観察しているので、探針を目的の細胞上に正確に位置決めすることができる。
【００３４】
次いで、この状態から探針と細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺する穿刺工程を行う。この穿刺工程を行うにあたり、探針と細胞とを接近させていくと、まず探針の外表面に形成された脂質二分子膜が細胞膜に接触する。すると細胞膜は、該細胞膜と同じ構成である脂質二分子膜と融合し始め、細胞膜と脂質二分子膜とが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜が脂質二分子膜に引っ張られて、探針の外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜が細胞膜に引っ張られて、細胞膜に移動し始める。このように、細胞膜と脂質二分子膜とが、相互に移動し合って融合する。これにより、探針を細胞内に押し込むにつれて、細胞膜及び脂質二分子膜を探針の外表面上に押し退けることができる。
【００３５】
よって、細胞膜を物理的に突き破ることなく、探針部分のみを細胞内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞を死滅させることなく探針を細胞内に入れて侵襲させることができる。特に、従来のように細胞を物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜と細胞膜とを融合させて一体化できるので、探針を穿刺するにあたり、細胞が凹んで探針から逃げてしまうことがない。この点からも、細胞に刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜を細胞内に混入させてしまうこともない。
【００３６】
上述したように、この細胞侵襲方法によれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲できるので、細胞膜に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針によって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
【００３７】
また、探針を細胞内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針の外表面に形成されている脂質二分子膜は、細胞膜と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて探針と共に移動し難い状態となっている。そのため、探針を引き抜くと、脂質二分子膜は細胞膜に引っ張られて細胞側に残り易く、主に探針だけを引き抜くことができる。なお、探針側の膜残りの制御は、引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜を引き抜くことなく、探針を細胞内から引き抜くことができる。従って、探針を引き抜いた後であっても、細胞を死滅させることがない。また、探針を引き抜くにつれて、細胞膜は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞の表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜は、その一部が細胞側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜となる。
【００３８】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明の細胞侵襲方法において、前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の外表面を親水化処理する親水化工程を行うことを特徴とするものである。
【００３９】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、親水化工程により、探針の外表面を親水化処理して濡れ性を向上させるので、脂質二分子膜と外表面との密着性を向上することができる。従って、脂質二分子膜が途中で剥がれてしまうことがなく、プローブの信頼性を向上することができる。
【００４０】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明の細胞侵襲方法において、前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されており、前記穿刺工程後、前記管路を利用して前記細胞内に所定の物質を導入、若しくは、細胞内から内容物を吸引する導入吸引工程を備えていることを特徴とするものである。
【００４１】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、探針を細胞内に侵襲させた後、導入吸引工程を行うことで、管路を介して細胞内に所定の物質、例えば、薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等を導入したり、細胞内から内容物、即ち細胞を構成する各種物質を吸引したりすることができる。このように、導入吸引工程を行うことで、容易且つ確実に多種多様な細胞計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測やイオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００４２】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の先端に前記細胞内に投入する特定物質を予め担持させる担持工程を行い、前記穿刺工程時に、前記特定物質を前記細胞内に投入することを特徴とするものである。
【００４３】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、担持工程により探針の先端に予め特定物質を担持しているので、穿刺工程時に確実且つ速やかにこの特定物質を細胞内に投入することができる。よって、細胞の反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞を死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針を細胞内に侵襲するだけで、特定物質を直ちに投入できるので使い易い。
【００４４】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記穿刺工程後、前記探針を前記細胞内で走査させて細胞内をＡＦＭ観察する観察工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００４５】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、細胞内に侵襲させた探針を細胞内で走査させて、細胞内をＡＦＭ観察する観察工程を行うことで、細胞内に含まれる各種の細胞物質を生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜と細胞膜とが融合しているので、探針を走査したとしても細胞膜が外表面上に逃げていく。従って、従来のように細胞膜にダメージを与えることはない。
【００４６】
また、本発明に係る細胞侵襲方法は、上記本発明のいずれかの細胞侵襲方法において、前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整工程を備えていることを特徴とするものである。
【００４７】
この発明に係る細胞侵襲方法においては、環境調整工程により、培養されている細胞の周囲環境、例えば、温度、湿度、気圧や二酸化炭素濃度等を、所定の環境条件に調整することができる。よって、細胞の種類等に応じて、環境を最適な状態に調整することができる。従って、より正確に細胞の観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明に係る細胞侵襲用プローブ及び細胞侵襲方法によれば、細胞膜に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞内に侵襲することができる。
また、本発明に係る細胞侵襲装置によれば、上記細胞侵襲用プローブを備えているので、細胞の動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明に係る細胞侵襲用プローブ、細胞侵襲装置及び細胞侵襲方法の一実施形態について、図１から図１２を参照して説明する。
本実施形態の細胞侵襲装置１は、図１に示すように、液中で細胞Ｓを培養するセル（基板）２と、細胞侵襲用プローブ３を有する走査型プローブ顕微鏡４と、細胞Ｓを観察する光学顕微鏡５を有する光学装置（観察手段）６とを組み合わせた装置である。
【００５０】
走査型プローブ顕微鏡４は、細胞Ｓに対向配置された細胞侵襲用プローブ３と、該細胞侵襲用プローブ３とセル２とを、セル２の底面（基板表面）に平行なＸＹ方向及びこれらＸＹ方向に垂直なＺ方向に相対移動させて、細胞侵襲用プローブ３の探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる移動手段７と、細胞侵襲用プローブ３のレバー部３ｂの撓みを測定する変位測定手段８と、これら各構成品を総合的に制御する制御部９とを備えている。
【００５１】
上記セル２は、光学的に透明な材料により、上部が開口した断面コ形形状に形成されており、ステージ１０上に保持されている。このセル２の内部には、培地（細胞Ｓが正常な機能を営むための要素を含む培養液）Ｗが貯留されており、底面に複数の細胞Ｓが培養されている。また、このセル２には、図示しないヒータや二酸化炭素供給部等が組み込まれており、例えば、培地Ｗの温度が３７±０．５℃、二酸化炭素濃度が５％になるように調整されている。また、このセル２は、密閉された容器１１内に収納されている。そしてこの容器１１には、内部の圧力を任意の圧力（例えば、真空状態）に調整する真空ポンプ１２と、容器１１内に所定の湿度を持った空気を供給して湿度を調整する湿度調整部１３とが接続されている。
【００５２】
これらヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２及び湿度調整部１３によって、容器１１内における細胞Ｓの周囲環境を培養に適した所定の環境条件に調整できるようになっている。即ち、これら容器１１、ヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２及び湿度調整部１３は、環境調整手段１４を構成している。
なお、セル２には、図示しない管路を介して培地Ｗが循環するようになっており、常に新しい培地Ｗが供給されるようになっている。
【００５３】
上記光学顕微鏡５は、ステージ１０の下方に配置されており、ステージ１０の略中心に形成された開口１０ａを通してセル２の下側から複数の細胞Ｓの培養状態を観察できるようになっている。また、この光学顕微鏡５は、観察した画像を制御部９に接続されたモニタ１５に出力している。これにより、作業者は、モニタ１５に表示された画像を見ながら操作部で細胞Ｓの位置を特定できるようになっている。即ち、これら光学顕微鏡５及びモニタ１５は、上記光学装置６を構成している。なお、モニタ１５は、容器１１の外部に配置されている。
【００５４】
上記細胞侵襲用プローブ３は、先端が先鋭化され、細胞Ｓ内に穿刺される探針３ａと、基端側が本体部に支持された状態で探針３ａを片持ち状態に支持するレバー部３ｂと、探針３ａの外表面上に形成された脂質二分子膜３ｃとで構成されている。
脂質二分子膜３ｃは、図２に示すように、探針３ａを包み込むように該探針３ａの外表面上に形成されている。この脂質二分子膜３ｃは、親水性、疎水性の両方の性質を持つ両親媒性の単一の分子が、疎水部Ｐ１を内側且つ親水部Ｐ２を外側にした状態で配列されて二分子となり、これら二分子が探針３ａの外表面に複数形成されて膜状となったものである。
【００５５】
本実施形態の脂質二分子膜３ｃは、リン脂質（スフィンゴリン脂質、グリセロリン脂質）又は、糖脂質（スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質）の両親媒性分子からなる脂質膜とされている。具体的には、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ガラクトセレブロシド、ＧＭ１ガングリオシド、シアル酸（ＮＡＮＡ）等の両親媒性分子からなる膜とされている。
【００５６】
ここで、リン脂質についてより詳細に説明すると、このリン脂質は、リン酸を親水部に持つ脂質であり、グリセリンの３つの水酸基の内端の１つにリン酸が、残りに脂肪酸がエステル結合したものである。脂肪酸は、炭素数１２〜１８の飽和、不飽和の炭素鎖の端にカルボン酸がついた疎水的な分子である。脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸等である。
【００５７】
上述した脂質二分子膜３ｃは、図３に示すように、細胞Ｓの表面を覆っている細胞膜Ｓ１と同じ構成からなる脂質膜である。そのため、探針３ａを細胞Ｓに穿刺したときに、脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に融合して一体化するようになっている。これについては、後に詳細に説明する。
【００５８】
この細胞侵襲用プローブ３は、図１に示すように、本体部３ｄを介してＸＹＺスキャナ１６の下面に固定された斜面ブロック１７にワイヤ等により着脱自在に固定されている。この際、細胞侵襲用プローブ３は、斜面ブロック１７によってセル２の底面に対してレバー部３ｂが所定角度傾くように固定されている。また、細胞侵襲用プローブ３は、少なくとも探針３ａ部分が培地Ｗに浸かるように位置が調整されている。
【００５９】
上記ＸＹＺスキャナ１６は、ＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛）等からなる圧電素子であり、容器１１内に設けられている。そして、このＸＹＺスキャナ１６は、容器１１の外側に配置されたドライブ回路１８から電圧が印加されると、その電圧印加量及び極性に応じて、ＸＹ方向（セル２の底面に対して平行な方向）及びＺ方向（セル２の底面に対して垂直な方向）の３方向に対して微小移動するようになっている。これにより、細胞侵襲用プローブ３をＸＹ方向及びＺ方向に移動させることができるようになっている。即ち、ＸＹＺスキャナ１６及びドライブ回路１８は、上記移動手段７を構成している。
【００６０】
なお、本実施形態では、細胞侵襲用プローブ３をＸＹＺ方向に移動させる構成としたが、この場合に限られず、ステージ１０側をＸＹＺ方向に移動させる構成としても構わない。この場合においても、スキャン方式が異なるだけで、以降に説明する作用効果と同様の作用効果を奏することができる。なお、細胞侵襲用プローブ３側及びステージ１０側を共にＸＹＺ方向に移動できるように構成しても構わない。
【００６１】
また、細胞侵襲用プローブ３の上方であって容器１１の外側には、レーザ光Ｌを照射する半導体レーザ光源２０と、レバー部３ｂの図示しない反射面で反射されたレーザ光Ｌを受光するレーザ受光部２１とが、図示しない架台に取り付けられている。レーザ受光部２１は、例えば、４分割フォトディテクタであり、レーザ光Ｌの入射位置に基づいて、レバー部３ｂの撓み変化を検出している。そして、レーザ受光部２１は、検出したレバー部３ｂの撓み変化を撓み信号に変換した後、制御部９に出力している。即ち、これら半導体レーザ光源２０及びレーザ受光部２１は、上記変位測定手段８を構成している。
なお、レーザ光Ｌは、容器１１の上部に取り付けられたウインドウ２２を介して、容器１１内に入射したり、容器１１外に出射したりするようになっている。
【００６２】
制御部９は、レーザ受光部２１から送られてきた撓み信号に応じて、ドライブ回路１８を作動させるようになっている。また、この制御部９には、作業者が各種条件を入力したり、ドライブ回路１８等を作動させたりするための操作部９ａが接続されている。これにより作業者は、操作部９ａを介してＸＹＺスキャナ１６を３次元方向に適宜移動することができるようになっている。
【００６３】
次に、このように構成された細胞侵襲装置１を利用して、探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲させると共に、細胞Ｓ内を観察する細胞侵襲方法について説明する。
本実施形態の細胞侵襲方法は、探針３ａの外表面に脂質二分子膜３ｃを形成する脂質膜形成工程と、該脂質膜形成工程後、細胞Ｓを観察しながら該細胞Ｓ上に探針３ａを移動させる移動工程と、該移動工程後、探針３ａと細胞Ｓとを接近させて探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる穿刺工程と、該穿刺工程後、探針３ａを細胞Ｓ内で走査させて細胞Ｓ内をＡＦＭ観察する観察工程とを行う方法である。また、本実施形態では、細胞Ｓの周囲を培養に適した所定の環境条件に調整する環境調整工程も同時に行う。以下、これら各工程について、詳細に説明する。
【００６４】
まず初めに、脂質膜形成工程により、探針３ａの外表面上に細胞膜Ｓ１と同じ構成の脂質二分子膜３ｃを形成する。この際の形成方法としては、例えば、予め脂質膜を展開した水溶液に探針３ａを浸漬させた後、ゆっくり引き上げることで、探針３ａの外表面に脂質二分子膜３ｃを形成することができる。
そして、脂質二分子膜３ｃを形成した後、細胞侵襲用プローブ３を斜面ブロック１７にセットすると共に、ステージ１０上にセル２をセットする。次いで、ヒータ、二酸化炭素供給部、真空ポンプ１２や湿度調整部１３を適宜作動させて、環境条件を培養に最適な条件に調整する環境調整工程を行う。これによって、長期的な細胞Ｓの培養も行うことができる。
【００６５】
次いで、セル２内で培養されている複数の細胞Ｓの培養状態を、セル２の下面側から光学顕微鏡５で観察する。そして作業者は、この観察された画像をモニタ１５で確認しながら、探針３ａを侵襲させる細胞Ｓを特定する。続いて、細胞Ｓの位置を特定した後、該細胞Ｓ上に探針３ａを移動させる移動工程を行う。即ち、ＸＹＺスキャナ１６を適宜ＸＹＺ方向に移動させて、特定した細胞Ｓ上に探針３ａを位置させる。この際、光学顕微鏡５で撮像している画像をモニタ１５で確認しながら行うので、探針３ａを特定した細胞Ｓ上に正確に位置決めさせることができる。
【００６６】
次いで、この状態からＸＹＺスキャナ１６をＺ方向に微小移動させて探針３ａと細胞Ｓとを接近させ、探針３ａを細胞Ｓに穿刺する穿刺工程を行う。この穿刺工程を行うにあたり、探針３ａと細胞Ｓとを接近させていくと、図４に示すように、まず探針３ａの外表面に形成された脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に接触する。すると細胞膜Ｓ１は、該細胞膜Ｓ１と同じ構成である脂質二分子膜３ｃと融合し始め、細胞膜Ｓ１と脂質二分子膜３ｃとが徐々に一体化し始める。即ち、細胞膜Ｓ１が脂質二分子膜３ｃに引っ張られて探針３ａの外表面に移動し始めると共に、脂質二分子膜３ｃが細胞膜Ｓ１に引っ張られて細胞膜Ｓ１に移動し始める。このように、細胞膜Ｓ１と脂質二分子膜３ｃとが、相互に移動し合って融合する。これにより、図５及び図６に示すように、探針３ａを細胞Ｓ内に押し込むにつれて、細胞膜Ｓ１及び脂質二分子膜３ｃを探針３ａの外表面上に押し退けることができる。
【００６７】
その結果、図７に示すように、細胞膜Ｓ１を物理的に突き破ることなく、探針３ａ部分のみを細胞Ｓ内に穿刺することができる。従って、従来のものとは異なり、細胞膜Ｓ１に与える影響を極力抑えることができ、培養中の細胞Ｓを死滅させることなく探針３ａを細胞Ｓ内に入れて侵襲させることができる。
特に、従来のように細胞Ｓを物理的に穿刺するのではなく、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とを融合させて一体化できるので、探針３ａを穿刺するにあたり、細胞Ｓが凹んで探針３ａから逃げてしまうことがない。この点からも、細胞Ｓに刺激等の影響を与えることなく、確実に侵襲を行うことができる。しかも、従来のように細胞膜Ｓ１を細胞Ｓ内に混入させてしまうこともない。
【００６８】
このように、本実施形態の細胞侵襲装置１及び細胞侵襲方法によれば、細胞膜Ｓ１に与える影響を極力抑えながら死滅させることなく細胞Ｓ内に侵入できるので、細胞膜Ｓ１に存在する各種タンパク質に影響を与えずに、探針３ａによって各種の計測を行うという、従来技術では困難であったことを可能にすることができる。
また、光学顕微鏡５により細胞Ｓを観察できるので、侵襲後の細胞Ｓの動態を生きたままの状態で観察して、正確な解析を行うことができる。
特に本実施形態では、培養されている細胞Ｓの周囲環境を、培養に適した最適な環境条件に調整できるので、より正確に細胞Ｓの観察を行うことができると共に、長期的な観察を行って解析することができる。
【００６９】
更に、探針３ａが確実に細胞Ｓ内に侵襲したか否かに関しては、光学顕微鏡５によっても観察することができるが、本実施形態では、変位測定手段８を有する走査型プローブ顕微鏡４を備えているので、より高精度に侵襲の可否を判断することができる。
つまり、探針３ａと細胞Ｓとを近接させることにより、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とが接触すると、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１との融合等によりレバー部３ｂが撓み始める。そのため、レーザ受光部２１に入射するレーザ光Ｌ（反射面で反射したレーザ光Ｌ）の位置が変化する。レーザ受光部２１は、この変化に応じた撓み信号を制御部９に出力する。このように、制御部９は、探針３ａを穿刺する過程で生じるレバー部３ｂの変位を直ちに知ることができる。そして、制御部９は、この撓み信号と予め定められた規定値とを比較することで、上述したように細胞Ｓ内に侵襲したか否かを高精度に判断することができる。
【００７０】
また、穿刺工程が終了した後、ＸＹＺスキャナ１６により細胞Ｓ内に侵襲させた探針３ａをＸＹ方向に走査させて、細胞Ｓ内をＡＦＭ観察する観察工程を行う。これにより、細胞Ｓ内の内容物である各種物質、例えば、細胞核の孔や微小管、アクチンフィラメント等を、生きたままの状態で高分解能且つ高精度に観察することができる。特に、脂質二分子膜３ｃと細胞膜Ｓ１とが融合しているので、探針３ａを走査したとしても細胞膜Ｓ１が探針３ａの移動に合わせて探針３ａの外表面上に逃げていく。そのため、従来のように細胞膜Ｓ１にダメージを与えることはない。
【００７１】
なお、探針３ａを細胞Ｓ内から引き抜く場合であっても、従来のように細胞膜Ｓ１を引き抜いてしまう恐れがない。つまり、探針３ａの外表面に形成されている脂質二分子膜３ｃは、細胞膜Ｓ１と融合して既に一体的になっているので、脂質二分子膜３ｃは細胞膜Ｓ１に引っ張られて探針３ａと共に移動し難い状態となっている。そのため、探針３ａを引き抜くと、脂質二分子膜３ｃは細胞膜Ｓ１に引っ張られて細胞Ｓ側に残り易く、主に探針３ａだけを引き抜くことができる。なお、探針３ａ側の膜残りの制御は、探針３ａの引き上げスピードを変える等の動作によって行うことが可能である。
その結果、細胞膜Ｓ１を引き抜くことなく、探針３ａを細胞Ｓ内から引き抜くことができる、従って、探針３ａを引き抜いた後であっても、細胞Ｓを死滅させることはない。また、探針３ａを引き抜くにつれて、細胞膜Ｓ１は徐々に元の状態に戻り始めるので、細胞Ｓの表面を再び覆うことができる。なお、脂質二分子膜３ｃは、その一部が細胞Ｓ側に残る場合があるが、この場合にはそのまま細胞膜Ｓ１となる。
【００７２】
なお、上記実施形態において、脂質膜形成工程の前に、探針３ａの外表面を親水化処理する親水化工程を行っても構わない。
具体的には、探針３ａの外表面にプラズマを照射することで親水化したり、ＵＶオゾン環境による表面改質を行うことで親水化したり、探針３ａの外表面に極薄膜のＳｉＯ２膜を形成し、該ＳｉＯ２膜に存在する微細クラックによる保湿効果を利用することで親水化したりする。このように各種の親水化処理を施すことで、外表面の濡れ性を向上することができ、脂質二分子膜３ｃと探針３ａの外表面との密着性を高めることができる。従って、脂質二分子膜３ｃが途中で剥がれてしまうことがなく、細胞侵襲用プローブ３の信頼性を向上することができる。
【００７３】
また、上記実施形態において、脂質膜形成工程の前に、探針３ａの先端に細胞Ｓ内に投入する特定物質Ｎを予め担持させる担持工程を行っても構わない。この工程を行うことで、図８に示すように、探針３ａの先端と脂質二分子膜３ｃとの間に、何らかの特定物質Ｎ（例えば卵子等）を担持させることができる。
こうすることで、穿刺工程によって探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲させた際に、図９に示すように、担持した特定物質Ｎを確実且つ速やかに細胞Ｓ内に投入することができる。よって、細胞Ｓの反応を観察する等、さらに多角的な解析を行うことができる。特に、細胞Ｓを死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。また、探針３ａを細胞Ｓ内に侵襲するだけで、特定物質Ｎを直ちに投入できるので使い易い。
【００７４】
また、上記実施形態において、図１０に示すように、探針３ａの先端に開口を有する管路３ｅを、先端側から基端側に亘って形成しても構わない。このような細胞侵襲用プローブ３を利用することで、より多種多用な細胞Ｓの計測を容易且つ確実に行うことができる。即ち、穿刺工程後に、管路３ｅを利用して細胞Ｓ内に所定の物質を導入、若しくは、細胞Ｓ内から内容物を吸引する導入吸引工程を行うことができる。
具体的には、図１１示すように、管路３ｅを通じて細胞Ｓ内に薬液、ＤＮＡ溶液、精子や卵子等の各種物質を容易且つ確実に導入することができる。また、図１２に示すように、細胞Ｓ内から内容物である各種物質を、やはり管路３ｅを通じて吸引することもできる。このように導入吸引工程を行うことで、容易且つ確実に多種多用の細胞Ｓ計測（例えば、導電性流体を導入することによる電気刺激反応計測や、イオン計測等）を行うことができ、より多角的な解析を行うことができる。特に、細胞Ｓを死滅させることなく行えるので、正確な解析を行うことができる。
【００７５】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
【００７６】
例えば、上記実施形態では、変位測定手段８がレーザ光Ｌを利用した光てこ方式によりレバー部３ｂの撓みを測定したが、光てこ方式に限定されるものではない。例えば、レバー部３ｂ自身に変位検出機構（例えば、ピエゾ抵抗素子等）を設けた自己検知方式によりレバー部３ｂの撓みを測定するように構成しても構わない。
【００７７】
また、上記実施形態では、光学顕微鏡５を用いた場合を説明したが、細胞Ｓの確認と探針３ａの位置合わせとを行えれば、どのような観察手段でも構わない。例えば、ＣＣＤ等でも良い。但し、好ましくは生物用倒立型光学装置を用いると良い。
更に、上記実施形態では、走査型プローブ顕微鏡４と光学装置６とを組み合わせた場合を例に挙げて説明したが、走査型プローブ顕微鏡４は必須なものではない。例えば、細胞侵襲用プローブ３を有するマイクロマニュピレータと、光学装置とを組み合わせたものでも構わない。このように、細胞侵襲用プローブ３を操作して探針３ａを細胞Ｓに穿刺させる移動手段と、細胞Ｓを観察する観察手段とを少なくとも備えていれば、細胞侵襲装置を構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明に係る細胞侵襲装置の一実施形態を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞侵襲装置の細胞侵襲用プローブの先端を拡大した図である。
【図３】図１に示す細胞侵襲装置のセルで培養されている細胞の拡大図である。
【図４】図１に示す細胞侵襲装置を利用して本発明に係る細胞侵襲方法を行う場合の工程図であって、探針と細胞とを近接させて脂質二分子膜と細胞膜とを接触させた状態を示す図である。
【図５】図４に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけた状態を示す図である。
【図６】図５に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけた状態を示す図である。
【図７】図６に示す状態から、さらに探針と細胞とを近づけて探針を細胞内に侵襲させた状態を示す図である。
【図８】本発明に係る細胞侵襲用プローブの変形例を示す図であって、探針の先端に特定物質が予め担持されている細胞侵襲用プローブの先端拡大図である。
【図９】図８に示す探針を細胞内に侵襲させて、細胞内に特定物質を投入している状態を示す図である。
【図１０】本発明に係る細胞侵襲用プローブの変形例を示す図であって、探針の先端に開口を有する管路が形成されている細胞侵襲用プローブの先端拡大図である。
【図１１】図１０に示す探針を細胞内に侵襲させて、管路を通じて細胞内に各種物質を導入している状態を示す図である。
【図１２】図１０に示す探針を細胞内に侵襲させて、管路を通じて細胞内から内容物を吸引している状態を示す図である。
【図１３】従来の細胞侵襲方法を説明するための図であって、微小針を細胞膜に押し付けている状態を示す図である。
【図１４】図１３に示す状態から、細胞膜を突き破って微小針を細胞内に穿刺した状態を示す図である。
【図１５】図１４に示す状態から、微小針を細胞内から引き抜いた状態を示す図である。
【図１６】従来の細胞侵襲方法を説明するための図であって、細胞膜を突き破って細胞内に侵襲させた探針をスキャンさせている状態を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
Ｎ 特定物質
Ｓ 細胞
Ｓ１ 細胞膜
１ 細胞侵襲装置
２ セル（基板）
３ 細胞侵襲用プローブ
３ａ 探針
３ｂ レバー部
３ｃ 脂質二分子膜
３ｅ 管路
６ 光学装置（観察手段）
７ 移動手段
８ 変位測定手段
１４ 環境調整手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液中にて基板上に培養されている細胞に対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能な細胞侵襲用プローブであって、
先端が先鋭化され、前記細胞内に穿刺される探針と、
該探針を片持ち状態に支持するレバー部と、
前記探針の外表面上に形成された脂質二分子膜とを備え、
前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針の外表面は、親水化処理がされていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針の先端と前記脂質二分子膜との間には、前記細胞内に投入する特定物質が予め担持されていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記脂質二分子膜は、リン脂質又は糖脂質の両親媒性分子からなる膜であることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブと、
該細胞侵襲用プローブと前記基板とを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に相対移動させて、前記探針を前記細胞に穿刺させる移動手段と、
前記細胞を観察する観察手段とを備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞侵襲装置において、
前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整手段を備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の細胞侵襲装置において、
前記レバー部の撓みを測定する変位測定手段を備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項９】
レバー部に片持ち状態に支持され、先端が先鋭化された探針を液中にて基板上に培養されている細胞に穿刺させる細胞侵襲方法であって、
前記探針の外表面上に脂質二分子膜を形成する脂質膜形成工程と、
該脂質膜形成工程後、前記細胞を観察しながら該細胞上に前記探針を移動させる移動工程と、
該移動工程後、前記探針と前記細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺させる穿刺工程とを備え、
前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞侵襲方法において、
前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の外表面を親水化処理する親水化工程を行うことを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞侵襲方法において、
前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されており、
前記穿刺工程後、前記管路を利用して前記細胞内に所定の物質を導入、若しくは、細胞内から内容物を吸引する導入吸引工程を備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の先端に前記細胞内に投入する特定物質を予め担持させる担持工程を行い、
前記穿刺工程時に、前記特定物質を前記細胞内に投入することを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記穿刺工程後、前記探針を前記細胞内で走査させて細胞内をＡＦＭ観察する観察工程とを備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整工程を備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１】
液中にて基板上に培養されている細胞に対向配置されると共に、基板表面に平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に直交するＺ方向に相対移動可能な細胞侵襲用プローブであって、
先端が先鋭化され、前記細胞内に穿刺される探針と、
該探針を片持ち状態に支持するレバー部と、
前記探針の外表面上に形成された脂質二分子膜とを備え、
前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針の外表面は、親水化処理がされていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記探針の先端と前記脂質二分子膜との間には、前記細胞内に投入する特定物質が予め担持されていることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブにおいて、
前記脂質二分子膜は、リン脂質又は糖脂質の両親媒性分子からなる膜であることを特徴とする細胞侵襲用プローブ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞侵襲用プローブと、
該細胞侵襲用プローブと前記基板とを前記ＸＹ方向及び前記Ｚ方向に相対移動させて、前記探針を前記細胞に穿刺させる移動手段と、
前記細胞を観察する観察手段とを備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞侵襲装置において、
前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整手段を備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の細胞侵襲装置において、
前記レバー部の撓みを測定する変位測定手段を備えていることを特徴とする細胞侵襲装置。
【請求項９】
レバー部に片持ち状態に支持され、先端が先鋭化された探針を液中にて基板上に培養されている細胞に穿刺させる細胞侵襲方法であって、
前記探針の外表面上に脂質二分子膜を形成する脂質膜形成工程と、
該脂質膜形成工程後、前記細胞を観察しながら該細胞上に前記探針を移動させる移動工程と、
該移動工程後、前記探針と前記細胞とを接近させて、探針を細胞に穿刺させる穿刺工程とを備え、
前記探針を前記細胞に穿刺したときに、前記脂質二分子膜が細胞表面の細胞膜に融合して一体化されることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞侵襲方法において、
前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の外表面を親水化処理する親水化工程を行うことを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞侵襲方法において、
前記探針には、先端に開口を有する管路が先端側から基端側に亘って形成されており、
前記穿刺工程後、前記管路を利用して前記細胞内に所定の物質を導入、若しくは、細胞内から内容物を吸引する導入吸引工程を備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記脂質膜形成工程の前に、前記探針の先端に前記細胞内に投入する特定物質を予め担持させる担持工程を行い、
前記穿刺工程時に、前記特定物質を前記細胞内に投入することを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記穿刺工程後、前記探針を前記細胞内で走査させて細胞内をＡＦＭ観察する観察工程とを備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか１項に記載の細胞侵襲方法において、
前記細胞の周囲環境を所定の環境条件に調整する環境調整工程を備えていることを特徴とする細胞侵襲方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−９２８２４（Ｐ２００８−９２８２４Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７６２９１（Ｐ２００６−２７６２９１）
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／物性・生体情報ナノマッピングシステム（機能性プローブ）」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）」
【出願人】（０００００２３２５）セイコーインスツル株式会社 (3,629)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／物性・生体情報ナノマッピングシステム（機能性プローブ）」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）」
【出願人】（０００００２３２５）セイコーインスツル株式会社 (3,629)
【Ｆターム（参考）】
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