細胞分離用酵素溶液及び細胞分離方法、並びに膵島分離方法
【課題】組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際のダメージを低減することが可能な細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有し、又は塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である。この細胞分離用酵素溶液を用いて酵素処理を行うことで、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離することができる。特に膵臓から膵島を分離する際には、膵菅を介して細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する。
【解決手段】本発明に係る細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有し、又は塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である。この細胞分離用酵素溶液を用いて酵素処理を行うことで、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離することができる。特に膵臓から膵島を分離する際には、膵菅を介して細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンを投与しなければ生命を維持できない、いわゆるインスリン依存状態にある１型糖尿病の患者に対して、膵島移植という技術が大きな社会的注目を集めており、主に欧米において、臨床における治療法として確立されようとしている。
【０００３】
膵島移植とは、生体での血糖調節に中心的役割を果たしている細胞集団である膵島を点滴の要領で門脈内に注入する細胞組織移植である。膵島移植は、移植を受ける側への侵襲が小さく、１型糖尿病患者にとって最も理想に近い治療法と考えられている。
【０００４】
２０００年にカナダ・エドモントンのアルバータ大学で、臨床膵島移植の治験の成功が報告された（非特許文献１を参照）。この報告以来、多数の膵島移植が欧米を中心に行われてきた。それらの膵島移植は、アルバータ大学で確立された、いわゆる「エドモントン・プロトコール」を基本として実施されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ， Ｌａｋｅｙ ＪＲ， Ｒｙａｎ ＥＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ２０００； ３４３：２３０−２３８
【非特許文献２】Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔ Ｈ， Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔ Ｄ， Ｈｅｒｉｎｇ ＢＪ， Ｂｒｅｔｚｅｌ ＲＧ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９９； ６８：３５５−３６１
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ， Ｒｉｇｌｅｙ ＴＨ， Ｒｅｅｍｓ ＪＡ， Ｋｕｒｏｄａ Ｙ， Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＢ， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００３； ３：５３−６３
【非特許文献４】Ｌｕ ＷＴ， Ｌａｋｅｙ ＪＲ， Ｊｕａｎｇ ＪＨ， Ｈｓｕ ＢＲ， Ｒａｊｏｔｔｅ ＲＶ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．， ２００２； ３４：２７００−２７０１
【非特許文献５】Ａｒｉｔａ Ｓ， Ｕｎｅ Ｓ， Ｏｈｔｓｕｋａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｐａｎｃｒｅａｓ， ２００１； ２３：６２−６７
【非特許文献６】Ａｖｉｌａ ＪＧ， Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ Ｔ， Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００３； １２：８７７−８８１
【非特許文献７】Ａｖｉｌａ Ｊ， Ｂａｒｂａｒｏ Ｂ， Ｇａｎｇｅｍｉ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００５； ５：２８３０−２８３７
【非特許文献８】Ｇｏｔｏ Ｔ， Ｔａｎｉｏｋａ Ｙ， Ｓａｋａｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００７； ８３：７５４−７５８
【非特許文献９】Ｉｃｈｉｉ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００６； ６：２０６０−２０６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この膵島移植において問題になっているのが、膵島分離の際の膵島に対するダメージをいかに低減するかということである。膵臓は消化液を分泌する臓器であり、その大半を占める外分泌腺細胞には様々な消化酵素が含まれている。膵島を分離するための酵素処理は、外分泌腺細胞に対しても障害を与え、外分泌腺細胞内に存在する消化酵素の逸脱を引き起こす。細胞外に出た消化酵素は非常に組織障害性が高く、膵島に対して多大なダメージを与える。この問題を解決することは、膵島移植の成功率を飛躍的に高めることとなる。
【０００７】
従来、膵島に対するダメージを低減する方法としては、低温で酵素処理を行う方法（非特許文献２を参照）、トリプシン阻害剤を用いる方法（非特許文献３，４を参照）、プロスタグランジン誘導体を用いる方法（非特許文献５を参照）、グルタミンを用いる方法（非特許文献６，７を参照）、酸素化パーフルオロカーボンを用いる方法（非特許文献８を参照）、ニコチンアミドを用いる方法（非特許文献９を参照）、等が報告されている。
しかし、いずれの方法も十分に満足のいくものとは言えず、膵島に対するダメージを低減する新たなアプローチが望まれていた。
【０００８】
なお、このようなダメージの低減は、膵島分離に限られず、組織又は臓器から酵素処理により単個細胞又は細胞集団を分離する際に共通の課題である。例えば、肝臓、神経、血管等の再生医療、組織からの癌細胞の分離、組織からの幹細胞の分離、生殖医療における卵巣からの卵母細胞の分離等においても、細胞に対するダメージを低減することが望まれている。
【０００９】
本発明は、このような従来の実情に鑑みてなされたものであり、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際のダメージを低減することが可能な細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際に用いられる細胞分離用酵素溶液に塩化物イオンチャネル阻害剤を添加すること、あるいは細胞分離用酵素溶液中の塩化物イオン濃度を低下させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のとおりである。
【００１１】
（１） 塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する細胞分離用酵素溶液。
【００１２】
（２） 上記塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度が０．０５〜１ｍＭである上記（１）記載の細胞分離用酵素溶液。
【００１３】
（３） 塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である細胞分離用酵素溶液。
【００１４】
（４） 塩化物イオンがハロゲン化物イオン以外の陰イオンによって置換されている上記（３）記載の細胞分離用酵素溶液。
【００１５】
（５） 上記（１）から（４）のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含む細胞分離方法。
【００１６】
（６） 膵菅を介して上記（１）から（４）のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程を含む膵島分離方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際のダメージを低減することが可能な細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法を提供することができる。特に、膵島分離方法に適用した場合には、膵島収量や膵島のバイアビリティ等を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島の収量を示す図である。
【図２】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のバイアビリティを示す図である。
【図３】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のＴＵＮＥＬ染色結果を示す図である。
【図４】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のＨＥ染色結果を示す図である。
【図５】糖尿病モデルＳＣＩＤマウスの左腎に、対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島を移植し、移植後３０日目に膵島移植腎を摘出したときの血糖値変化を示す図である。
【図６】図５の膵島移植後２５日目の糖尿病モデルＳＣＩＤマウスに対して腹腔内グルコース負荷試験を行ったときの血糖値変化を、膵島を移植していない正常群のＳＣＩＤマウスと比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
≪細胞分離用酵素溶液≫
本発明の第１の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有することを特徴とする。
【００２０】
塩化物イオンチャネル阻害剤としては、特に限定されるものではない。具体例としては、４，４’−ジ（イソチオシアノ）スチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩（ＤＩＤＳ）、４−アセチルアミノ−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩（ＳＩＴＳ）、２−［（３−フェニルプロピル）アミノ］−５−ニトロ安息香酸（ＮＰＰＢ）、アラキドン酸、フロレチン、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ）等が挙げられる。
塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度は０．０５〜１ｍＭが好ましく、０．１〜０．５ｍＭがより好ましい。
【００２１】
第１の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する点以外は、従来の細胞分離用酵素溶液と同様である。すなわち、ハンクス液等の緩衝塩類溶液に酵素を添加したものを用いることができる。酵素としてはコラゲナーゼが汎用されるが、プロテアーゼ、ディスパーゼ等を用いても構わない。酵素濃度は、通常０．５〜２ｍｇ／ｍＬである。
【００２２】
本発明の第２の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする。塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である点以外は、従来の細胞分離用酵素溶液と同様である。
【００２３】
塩化物イオン濃度を１０ｍＭ以下とするには、従来組成の細胞分離用酵素溶液を調製する際に、陰イオンとして塩化物イオンを含む塩の代わりに、他の陰イオンを含む塩を用いればよい。他の陰イオンとしては、グルコン酸イオン、グルクロン酸イオン、グルタミン酸イオン、スルフォン酸イオン、硫酸イオン、ホウ酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、リン酸イオン、アスコルビン酸イオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン等が挙げられる。ただし、ヨウ化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンは細胞傷害性があるため好ましくない。陽イオンは置換前後で同じであることが好ましい。
例えば、細胞分離用酵素溶液の組成中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換することにより、塩化物イオン濃度を低下させることができる。
【００２４】
なお、第２の態様の細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有していても構わない。
【００２５】
≪細胞分離方法及び膵島分離方法≫
本発明に係る細胞分離方法は、上述した本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から、特には摘出された組織又は臓器から、単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含むものである。この細胞分離方法は、従来、細胞分離用酵素溶液を用いて組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離している領域に広く適用可能である。このような適用領域としては、例えば、膵臓からの膵島の分離、肝臓、神経、血管等の再生医療、組織からの癌細胞の分離、組織からの幹細胞の分離、生殖医療における卵巣からの卵母細胞の分離等が挙げられる。以下では一例として、膵臓からの膵島を分離する膵島分離方法について説明する。
【００２６】
膵臓分離方法は、細胞分離用酵素溶液を用いて膵臓を分解する分解工程と、分解された膵組織から膵島を回収する純化工程とを含む。
【００２７】
（分解工程）
ヒトを含む動物の場合、膵臓を分解するには、まず、摘出された膵臓の膵菅を介して本発明に係る細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を膨化させる。細胞分離用酵素溶液の注入は、例えば、ポンプを用いて注入圧力調節下に、細胞分離用酵素溶液を主膵菅に注入することにより行うことができる。
膵臓に細胞分離用酵素溶液を注入した後、適当な装置を用いて細胞分離用酵素溶液の温度を３７℃程度に上昇させて酵素を活性化させることにより、分解を開始することができる。例えば酵素としてコラゲナーゼを用いる場合、温度の上昇によりコラゲナーゼが活性化し、結合組織を形成するコラーゲンを溶解することにより、膵組織が分解する。
分解の停止は、細胞分離用酵素溶液の温度を低下させることにより行うことができる。また、血清蛋白（アルブミン等）を加えて酵素を不活化することにより分解を停止させることもできる。
分解を停止した後は、膵組織を回収する。回収した膵組織は、純化工程の前に遠心分離を行って濃縮しておくことが好ましい。
【００２８】
また、ヒト以外の動物の場合、上記のように膵臓を摘出してから細胞分離用酵素溶液を注入するのではなく、摘出する前に細胞分離用酵素溶液を注入することも可能である。例えば、総胆管をクランプし、総胆管から膵菅を介して膵臓に細胞分離用酵素溶液を注入する。その後、膵臓を摘出し、３７℃程度の温度でインキュベーションを行うことにより、分解を開始することができる。分解の停止する方法等は上記と同様である。
【００２９】
（純化工程）
膵島の純化は、膵島が膵外分泌組織に比べて比重が軽いことを利用して行うことができる。具体的には、回収した膵組織を用いて密度勾配遠心を行うことにより、膵島と膵外分泌組織とを分離し、膵島を回収することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例では９〜１０週齢のラットを膵島のドナーとして用いた。また、レシピエントとして、９〜１０週齢のＳＣＩＤマウスを用いた。このＳＣＩＤマウスに対して、ジエチルエーテルでの麻酔下にストレプトゾシン（ＳＴＺ；２５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与を行い、β細胞を破壊することで糖尿病を誘導した。２日連続して随時血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬを超えたマウスを糖尿病マウスとみなし、レシピエントとした。
【００３１】
＜実施例１：ラットからの膵島の分離＞
ラットを８匹ずつの３群（対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群）に分けた後、各ラットにエーテル麻酔を施して開腹し、十二指腸への入口付近で総胆管をクランプし、カニューレを挿入した。そして、そのカニューレから膵菅を介して膵臓に、コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する１２ｍＬのハンクス液（ＮａＣｌ：８０００ｍｇ／ｍＬ，ＫＣｌ：４００ｍｇ／ｍＬ，ＭｇＳＯ４：４８．８ｍｇ／ｍＬ，ＭｇＣｌ２：４６．８ｍｇ／ｍＬ，ＣａＣｌ２：１４０ｍｇ／ｍＬ，ＫＨ２ＰＯ４：６０ｍｇ／ｍＬ，Ｎａ２ＨＰＯ４：４７．９ｍｇ／ｍＬ，グルコース：１０００ｍｇ／ｍＬ）を注入した。ただし、ＤＩＤＳ群については、塩化物イオンチャネル阻害剤であるＤＩＤＳ（２００μＭ）をさらに添加し、低Ｃｌ−群については、ハンクス液中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換した。
【００３２】
そして、溶液注入により膨化した膵臓を摘出し、３７℃にて３２分間インキュベーションを行った。その後、分解された組織を５０ｍＬのコニカルチューブに入れて、４℃のハンクス液を加え、酵素反応を止めた。チューブを穏やかに震盪し、３２０Ｇで１０〜１５秒間、遠心分離を行った。次いで、ペレットをハンクス液で３回洗浄し、組織懸濁液をメッシュフィルタ（孔径８６０μｍ）に通して未分解の大きな組織を除いた後、Ｆｉｃｏｌｌ（ｔｙｐｅ４００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を用いた密度勾配遠心（密度：１．１２０ｇ／ｃｍ３、１．０９０ｇ／ｃｍ３、及び１．０５０ｇ／ｃｍ３）を行い、膵島を回収した。回収した膵島は、２％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃のＣＯ２インキュベータにて培養した。
【００３３】
膵島の収量については、ＩＥＱ（ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ；直径１５０μｍを基準とした膵島個数）いう単位が用いられている。ジフェニルチオカルバゾンを用いて各ラットから得られた膵島を染色し、顕微鏡観察した。膵島の直径が５０〜１００μｍ、１０１〜１５０μｍ、１５１〜２００μｍ、２０１〜２５０μｍ、２５１〜３００μｍ、３０１〜３５０μｍ、３５１〜４００μｍ、４００μｍ以上の群に分け、各群の個数をＮとしたとき、それぞれＮ×０．１６７、Ｎ×０．６６７、Ｎ×１．６８５、Ｎ×３．５、Ｎ×６．３１５、Ｎ×１０．３５２、Ｎ×１５．８３３、Ｎ×２２．７５というように係数を掛けた値を求めた。そして、それらを合計した値を各ラットからの膵島収量とした。なお、直径が５０μｍ未満の膵島はカウントしなかった。
【００３４】
対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島の収量を図１に示す。図１に示すとおり、対照群における膵島収量は１３１６±２４５ＩＥＱであった。一方、ＤＩＤＳ群における膵島収量は１９６９±２４４ＩＥＱ、低Ｃｌ−群における膵島収量は１７２５±２２１ＩＥＱであり、対照群よりも有意に増加していた。
【００３５】
＜実施例２：膵島のダメージ評価＞
膵島のダメージの程度は、細胞膜のバリア機能が保持できているか否かで評価することができる。そこで、実施例１にて分離した各群の膵島（各群ともにｎ＝８）を、蛍光色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）及びヨウ化プロピジウムを用いて染色した。なお、ＡＯは生細胞においても細胞に取り込まれて緑色の蛍光を発し、ＰＩは細胞膜のバリア機能の破綻によって細胞に取り込まれ、ＤＮＡと結合することで赤色の蛍光を発する。具体的には、ＡＯ（１０μＭ）及びＰＩ（１５μＭ）をＰＢＳに溶かし、その液中にて膵島を１０分間インキュベーションした後、膵島を蛍光顕微鏡観察した。そして、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ ｆｒｅｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、緑色蛍光の面積と赤色蛍光の面積とを求め、赤色蛍光の面積を除いた緑色蛍光の面積の割合（％）を膵島のバイアビリティ（％）とした。
【００３６】
対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のバイアビリティを図２に示す。図２に示すとおり、対照群における膵島のバイアビリティは７４．６±５．６％であった。一方、ＤＩＤＳ群における膵島のバイアビリティは８４．９±４．９％、低Ｃｌ−群における膵島のバイアビリティは８９．６±５．２％であり、対照群よりも有意に増加していた。
【００３７】
＜実施例３：グルコース刺激によるインスリン分泌＞
実施例１にて分離した各群の膵島について、低濃度（３．３ｍＭ）及び高濃度（２０ｍＭ）のグルコース刺激に対するインスリン分泌能を測定した。測定の前段階として、直径１５０〜２００μｍの膵島（各群ともにｎ＝１０）を１２穴トランスウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ３４０３；ポアサイズ１２μｍ）上で２４時間培養した。培地としては、３．３ｍＭグルコース及び０．１％牛胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気条件とした。
測定に際しては、膵島が置かれているトランスウェルの培地を３．３ｍＭグルコース及び０．１％牛胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で置き換え、６０分間、前培養を行った。なお、培養は全て３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気条件で実施した。その後、膵島が置かれているトランスウェルを、同様の培地の入った新たなウェルに移して６０分間静置した（サンプルＡ）。さらに、膵島が置かれているトランスウェルを、２０ｍＭグルコースを含有する培地の入った新たなウェルに移して６０分間静置した（サンプルＢ）。その後、サンプルＡ、サンプルＢの培地を回収し、ＥＬＩＳＡ法を利用したインスリン測定キット（森永生化学工業製）を用いて、培地に含まれているインスリンを測定した。そして、サンプルＢのインスリン濃度をサンプルＡのインスリン濃度で割った値をインスリン分泌刺激インデックスとした。結果を下記の表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１から分かるように、対照群におけるインスリン分泌刺激インデックスは７．５６±１．８２であった。一方、ＤＩＤＳ群におけるインスリン分泌刺激インデックスは９．９３±２．１８、低Ｃｌ−群におけるインスリン分泌刺激インデックスは１１．３±３．９０であり、対照群よりも有意に増加していた。
【００４０】
＜実施例４：ＴＵＮＥＬ染色及びＨＥ染色＞
実施例１にて分離した各群の膵島を、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１日間固定し、パラフィン包埋した。その後、５μｍ厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてＴＵＮＥＬ染色を行った。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群におけるＴＵＮＥＬ染色の結果をそれぞれ図３（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
また、実施例１にて分離した各群の膵島を、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１日間固定し、パラフィン包埋した。その後、５μｍ厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、ＨＥ染色を行った。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群におけるＨＥ染色の結果をそれぞれ図４（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
【００４１】
図３から分かるように、いずれの群についてもＴＵＮＥＬ陽性細胞は殆ど検出されなかった。また、図４から分かるように、対照群についてはＨＥ染色で染まっていない部分が確認された。
このことから、膵島分離中に起こる細胞死は、細胞膨化から生じるネクローシスであると考えられる。本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いることで、そのような細胞死を抑制することができる。
【００４２】
＜実施例５：糖尿病モデルＳＣＩＤマウスへの膵島移植＞
実施例１にて分離した各群の膵島（２００ＩＥＱ）を、ＳＴＺ処理による糖尿病モデルＳＣＩＤマウス（各群ともにｎ＝５）の腎皮膜下に移植した。糖尿病モデルＳＣＩＤマウスの選別については、採血により２日連続して随時血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬを超えるものを採用した。移植に際しては、マウスにエーテル麻酔を施し、左腎の腎皮膜下に２５０μＬピペットチップを用いて膵島を注入した。移植後、最初の７日間は毎日採血を行って血糖値を測定し、その後は週に３回、血糖値を測定した。そして、移植後３０日目に膵島移植腎を摘出した。なお、糖尿病の治癒の定義は、血糖値が３日連続して１５０ｍｇ／ｄＬ未満であり、腎摘後に血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬ超まで上昇した場合とした。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群における血糖値の測定結果をそれぞれ図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
【００４３】
図５から分かるように、移植後１〜２日目におけるＤＩＤＳ群の血糖値（７８．７±５２．７ｍｇ／ｄＬ）及び低Ｃｌ−群の血糖値（１１７．８±４４．０ｍｇ／ｄＬ）は、対照群の血糖値（２５２．３±１０７．４ｍｇ／ｄＬ）よりも有意に低かった（ＤＩＤＳ群ｖｓ対照群；ｐ＝０．０００４、低Ｃｌ−群ｖｓ対照群；ｐ＝０．００２）。また、ＤＩＤＳ群については５匹全てが、低Ｃｌ−群については５匹中４匹が、正常血糖（＜１５０ｍｇ／ｄＬ）になったが、対照群については５匹中２匹しか正常血糖にならなかった。
なお、移植後に正常血糖となった全てのマウスは、腎摘後に高血糖に戻った。
【００４４】
＜実施例６：膵島移植後の腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）＞
膵島の機能をさらに調べるため、実施例５における膵島移植後２５日目のマウスに対して腹腔内グルコース負荷試験を行った。試験の前８時間は絶食として、体重ｋｇ当たり２．５ｇのグルコースを生理食塩水に加えてマウスの腹腔内に注入した。マウスとしては、膵島移植を行った糖尿病モデルＳＣＩＤマウス（対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群；各群ともにｎ＝５）と膵島移植を行っていないＳＣＩＤマウス（正常群；ｎ＝５）とを用いた。そして、グルコース投与前、及び投与後１０，３０，６０，９０，１２０分の時点で血糖値を測定した。結果を図６に示す。
【００４５】
図６から分かるように、ＤＩＤＳ群及び低Ｃｌ−群は正常群に近い血糖値変化を示したが、対照群は高血糖のまま推移していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンを投与しなければ生命を維持できない、いわゆるインスリン依存状態にある１型糖尿病の患者に対して、膵島移植という技術が大きな社会的注目を集めており、主に欧米において、臨床における治療法として確立されようとしている。
【０００３】
膵島移植とは、生体での血糖調節に中心的役割を果たしている細胞集団である膵島を点滴の要領で門脈内に注入する細胞組織移植である。膵島移植は、移植を受ける側への侵襲が小さく、１型糖尿病患者にとって最も理想に近い治療法と考えられている。
【０００４】
２０００年にカナダ・エドモントンのアルバータ大学で、臨床膵島移植の治験の成功が報告された（非特許文献１を参照）。この報告以来、多数の膵島移植が欧米を中心に行われてきた。それらの膵島移植は、アルバータ大学で確立された、いわゆる「エドモントン・プロトコール」を基本として実施されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ， Ｌａｋｅｙ ＪＲ， Ｒｙａｎ ＥＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ２０００； ３４３：２３０−２３８
【非特許文献２】Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔ Ｈ， Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔ Ｄ， Ｈｅｒｉｎｇ ＢＪ， Ｂｒｅｔｚｅｌ ＲＧ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９９； ６８：３５５−３６１
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ， Ｒｉｇｌｅｙ ＴＨ， Ｒｅｅｍｓ ＪＡ， Ｋｕｒｏｄａ Ｙ， Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＢ， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００３； ３：５３−６３
【非特許文献４】Ｌｕ ＷＴ， Ｌａｋｅｙ ＪＲ， Ｊｕａｎｇ ＪＨ， Ｈｓｕ ＢＲ， Ｒａｊｏｔｔｅ ＲＶ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．， ２００２； ３４：２７００−２７０１
【非特許文献５】Ａｒｉｔａ Ｓ， Ｕｎｅ Ｓ， Ｏｈｔｓｕｋａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｐａｎｃｒｅａｓ， ２００１； ２３：６２−６７
【非特許文献６】Ａｖｉｌａ ＪＧ， Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ Ｔ， Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００３； １２：８７７−８８１
【非特許文献７】Ａｖｉｌａ Ｊ， Ｂａｒｂａｒｏ Ｂ， Ｇａｎｇｅｍｉ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００５； ５：２８３０−２８３７
【非特許文献８】Ｇｏｔｏ Ｔ， Ｔａｎｉｏｋａ Ｙ， Ｓａｋａｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ２００７； ８３：７５４−７５８
【非特許文献９】Ｉｃｈｉｉ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．， ２００６； ６：２０６０−２０６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この膵島移植において問題になっているのが、膵島分離の際の膵島に対するダメージをいかに低減するかということである。膵臓は消化液を分泌する臓器であり、その大半を占める外分泌腺細胞には様々な消化酵素が含まれている。膵島を分離するための酵素処理は、外分泌腺細胞に対しても障害を与え、外分泌腺細胞内に存在する消化酵素の逸脱を引き起こす。細胞外に出た消化酵素は非常に組織障害性が高く、膵島に対して多大なダメージを与える。この問題を解決することは、膵島移植の成功率を飛躍的に高めることとなる。
【０００７】
従来、膵島に対するダメージを低減する方法としては、低温で酵素処理を行う方法（非特許文献２を参照）、トリプシン阻害剤を用いる方法（非特許文献３，４を参照）、プロスタグランジン誘導体を用いる方法（非特許文献５を参照）、グルタミンを用いる方法（非特許文献６，７を参照）、酸素化パーフルオロカーボンを用いる方法（非特許文献８を参照）、ニコチンアミドを用いる方法（非特許文献９を参照）、等が報告されている。
しかし、いずれの方法も十分に満足のいくものとは言えず、膵島に対するダメージを低減する新たなアプローチが望まれていた。
【０００８】
なお、このようなダメージの低減は、膵島分離に限られず、組織又は臓器から酵素処理により単個細胞又は細胞集団を分離する際に共通の課題である。例えば、肝臓、神経、血管等の再生医療、組織からの癌細胞の分離、組織からの幹細胞の分離、生殖医療における卵巣からの卵母細胞の分離等においても、細胞に対するダメージを低減することが望まれている。
【０００９】
本発明は、このような従来の実情に鑑みてなされたものであり、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際のダメージを低減することが可能な細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際に用いられる細胞分離用酵素溶液に塩化物イオンチャネル阻害剤を添加すること、あるいは細胞分離用酵素溶液中の塩化物イオン濃度を低下させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のとおりである。
【００１１】
（１） 塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する細胞分離用酵素溶液。
【００１２】
（２） 上記塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度が０．０５〜１ｍＭである上記（１）記載の細胞分離用酵素溶液。
【００１３】
（３） 塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である細胞分離用酵素溶液。
【００１４】
（４） 塩化物イオンがハロゲン化物イオン以外の陰イオンによって置換されている上記（３）記載の細胞分離用酵素溶液。
【００１５】
（５） 上記（１）から（４）のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含む細胞分離方法。
【００１６】
（６） 膵菅を介して上記（１）から（４）のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程を含む膵島分離方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する際のダメージを低減することが可能な細胞分離用酵素溶液、並びにそれを用いた細胞分離方法及び膵島分離方法を提供することができる。特に、膵島分離方法に適用した場合には、膵島収量や膵島のバイアビリティ等を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島の収量を示す図である。
【図２】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のバイアビリティを示す図である。
【図３】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のＴＵＮＥＬ染色結果を示す図である。
【図４】対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のＨＥ染色結果を示す図である。
【図５】糖尿病モデルＳＣＩＤマウスの左腎に、対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島を移植し、移植後３０日目に膵島移植腎を摘出したときの血糖値変化を示す図である。
【図６】図５の膵島移植後２５日目の糖尿病モデルＳＣＩＤマウスに対して腹腔内グルコース負荷試験を行ったときの血糖値変化を、膵島を移植していない正常群のＳＣＩＤマウスと比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
≪細胞分離用酵素溶液≫
本発明の第１の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有することを特徴とする。
【００２０】
塩化物イオンチャネル阻害剤としては、特に限定されるものではない。具体例としては、４，４’−ジ（イソチオシアノ）スチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩（ＤＩＤＳ）、４−アセチルアミノ−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩（ＳＩＴＳ）、２−［（３−フェニルプロピル）アミノ］−５−ニトロ安息香酸（ＮＰＰＢ）、アラキドン酸、フロレチン、９−アントラセンカルボン酸（９−ＡＣ）等が挙げられる。
塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度は０．０５〜１ｍＭが好ましく、０．１〜０．５ｍＭがより好ましい。
【００２１】
第１の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する点以外は、従来の細胞分離用酵素溶液と同様である。すなわち、ハンクス液等の緩衝塩類溶液に酵素を添加したものを用いることができる。酵素としてはコラゲナーゼが汎用されるが、プロテアーゼ、ディスパーゼ等を用いても構わない。酵素濃度は、通常０．５〜２ｍｇ／ｍＬである。
【００２２】
本発明の第２の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする。塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である点以外は、従来の細胞分離用酵素溶液と同様である。
【００２３】
塩化物イオン濃度を１０ｍＭ以下とするには、従来組成の細胞分離用酵素溶液を調製する際に、陰イオンとして塩化物イオンを含む塩の代わりに、他の陰イオンを含む塩を用いればよい。他の陰イオンとしては、グルコン酸イオン、グルクロン酸イオン、グルタミン酸イオン、スルフォン酸イオン、硫酸イオン、ホウ酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、リン酸イオン、アスコルビン酸イオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン等が挙げられる。ただし、ヨウ化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオンは細胞傷害性があるため好ましくない。陽イオンは置換前後で同じであることが好ましい。
例えば、細胞分離用酵素溶液の組成中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換することにより、塩化物イオン濃度を低下させることができる。
【００２４】
なお、第２の態様の細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有していても構わない。
【００２５】
≪細胞分離方法及び膵島分離方法≫
本発明に係る細胞分離方法は、上述した本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から、特には摘出された組織又は臓器から、単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含むものである。この細胞分離方法は、従来、細胞分離用酵素溶液を用いて組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離している領域に広く適用可能である。このような適用領域としては、例えば、膵臓からの膵島の分離、肝臓、神経、血管等の再生医療、組織からの癌細胞の分離、組織からの幹細胞の分離、生殖医療における卵巣からの卵母細胞の分離等が挙げられる。以下では一例として、膵臓からの膵島を分離する膵島分離方法について説明する。
【００２６】
膵臓分離方法は、細胞分離用酵素溶液を用いて膵臓を分解する分解工程と、分解された膵組織から膵島を回収する純化工程とを含む。
【００２７】
（分解工程）
ヒトを含む動物の場合、膵臓を分解するには、まず、摘出された膵臓の膵菅を介して本発明に係る細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を膨化させる。細胞分離用酵素溶液の注入は、例えば、ポンプを用いて注入圧力調節下に、細胞分離用酵素溶液を主膵菅に注入することにより行うことができる。
膵臓に細胞分離用酵素溶液を注入した後、適当な装置を用いて細胞分離用酵素溶液の温度を３７℃程度に上昇させて酵素を活性化させることにより、分解を開始することができる。例えば酵素としてコラゲナーゼを用いる場合、温度の上昇によりコラゲナーゼが活性化し、結合組織を形成するコラーゲンを溶解することにより、膵組織が分解する。
分解の停止は、細胞分離用酵素溶液の温度を低下させることにより行うことができる。また、血清蛋白（アルブミン等）を加えて酵素を不活化することにより分解を停止させることもできる。
分解を停止した後は、膵組織を回収する。回収した膵組織は、純化工程の前に遠心分離を行って濃縮しておくことが好ましい。
【００２８】
また、ヒト以外の動物の場合、上記のように膵臓を摘出してから細胞分離用酵素溶液を注入するのではなく、摘出する前に細胞分離用酵素溶液を注入することも可能である。例えば、総胆管をクランプし、総胆管から膵菅を介して膵臓に細胞分離用酵素溶液を注入する。その後、膵臓を摘出し、３７℃程度の温度でインキュベーションを行うことにより、分解を開始することができる。分解の停止する方法等は上記と同様である。
【００２９】
（純化工程）
膵島の純化は、膵島が膵外分泌組織に比べて比重が軽いことを利用して行うことができる。具体的には、回収した膵組織を用いて密度勾配遠心を行うことにより、膵島と膵外分泌組織とを分離し、膵島を回収することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例では９〜１０週齢のラットを膵島のドナーとして用いた。また、レシピエントとして、９〜１０週齢のＳＣＩＤマウスを用いた。このＳＣＩＤマウスに対して、ジエチルエーテルでの麻酔下にストレプトゾシン（ＳＴＺ；２５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与を行い、β細胞を破壊することで糖尿病を誘導した。２日連続して随時血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬを超えたマウスを糖尿病マウスとみなし、レシピエントとした。
【００３１】
＜実施例１：ラットからの膵島の分離＞
ラットを８匹ずつの３群（対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群）に分けた後、各ラットにエーテル麻酔を施して開腹し、十二指腸への入口付近で総胆管をクランプし、カニューレを挿入した。そして、そのカニューレから膵菅を介して膵臓に、コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する１２ｍＬのハンクス液（ＮａＣｌ：８０００ｍｇ／ｍＬ，ＫＣｌ：４００ｍｇ／ｍＬ，ＭｇＳＯ４：４８．８ｍｇ／ｍＬ，ＭｇＣｌ２：４６．８ｍｇ／ｍＬ，ＣａＣｌ２：１４０ｍｇ／ｍＬ，ＫＨ２ＰＯ４：６０ｍｇ／ｍＬ，Ｎａ２ＨＰＯ４：４７．９ｍｇ／ｍＬ，グルコース：１０００ｍｇ／ｍＬ）を注入した。ただし、ＤＩＤＳ群については、塩化物イオンチャネル阻害剤であるＤＩＤＳ（２００μＭ）をさらに添加し、低Ｃｌ−群については、ハンクス液中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換した。
【００３２】
そして、溶液注入により膨化した膵臓を摘出し、３７℃にて３２分間インキュベーションを行った。その後、分解された組織を５０ｍＬのコニカルチューブに入れて、４℃のハンクス液を加え、酵素反応を止めた。チューブを穏やかに震盪し、３２０Ｇで１０〜１５秒間、遠心分離を行った。次いで、ペレットをハンクス液で３回洗浄し、組織懸濁液をメッシュフィルタ（孔径８６０μｍ）に通して未分解の大きな組織を除いた後、Ｆｉｃｏｌｌ（ｔｙｐｅ４００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を用いた密度勾配遠心（密度：１．１２０ｇ／ｃｍ３、１．０９０ｇ／ｃｍ３、及び１．０５０ｇ／ｃｍ３）を行い、膵島を回収した。回収した膵島は、２％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃のＣＯ２インキュベータにて培養した。
【００３３】
膵島の収量については、ＩＥＱ（ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ；直径１５０μｍを基準とした膵島個数）いう単位が用いられている。ジフェニルチオカルバゾンを用いて各ラットから得られた膵島を染色し、顕微鏡観察した。膵島の直径が５０〜１００μｍ、１０１〜１５０μｍ、１５１〜２００μｍ、２０１〜２５０μｍ、２５１〜３００μｍ、３０１〜３５０μｍ、３５１〜４００μｍ、４００μｍ以上の群に分け、各群の個数をＮとしたとき、それぞれＮ×０．１６７、Ｎ×０．６６７、Ｎ×１．６８５、Ｎ×３．５、Ｎ×６．３１５、Ｎ×１０．３５２、Ｎ×１５．８３３、Ｎ×２２．７５というように係数を掛けた値を求めた。そして、それらを合計した値を各ラットからの膵島収量とした。なお、直径が５０μｍ未満の膵島はカウントしなかった。
【００３４】
対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島の収量を図１に示す。図１に示すとおり、対照群における膵島収量は１３１６±２４５ＩＥＱであった。一方、ＤＩＤＳ群における膵島収量は１９６９±２４４ＩＥＱ、低Ｃｌ−群における膵島収量は１７２５±２２１ＩＥＱであり、対照群よりも有意に増加していた。
【００３５】
＜実施例２：膵島のダメージ評価＞
膵島のダメージの程度は、細胞膜のバリア機能が保持できているか否かで評価することができる。そこで、実施例１にて分離した各群の膵島（各群ともにｎ＝８）を、蛍光色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）及びヨウ化プロピジウムを用いて染色した。なお、ＡＯは生細胞においても細胞に取り込まれて緑色の蛍光を発し、ＰＩは細胞膜のバリア機能の破綻によって細胞に取り込まれ、ＤＮＡと結合することで赤色の蛍光を発する。具体的には、ＡＯ（１０μＭ）及びＰＩ（１５μＭ）をＰＢＳに溶かし、その液中にて膵島を１０分間インキュベーションした後、膵島を蛍光顕微鏡観察した。そして、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ ｆｒｅｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、緑色蛍光の面積と赤色蛍光の面積とを求め、赤色蛍光の面積を除いた緑色蛍光の面積の割合（％）を膵島のバイアビリティ（％）とした。
【００３６】
対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群のラットから分離された膵島のバイアビリティを図２に示す。図２に示すとおり、対照群における膵島のバイアビリティは７４．６±５．６％であった。一方、ＤＩＤＳ群における膵島のバイアビリティは８４．９±４．９％、低Ｃｌ−群における膵島のバイアビリティは８９．６±５．２％であり、対照群よりも有意に増加していた。
【００３７】
＜実施例３：グルコース刺激によるインスリン分泌＞
実施例１にて分離した各群の膵島について、低濃度（３．３ｍＭ）及び高濃度（２０ｍＭ）のグルコース刺激に対するインスリン分泌能を測定した。測定の前段階として、直径１５０〜２００μｍの膵島（各群ともにｎ＝１０）を１２穴トランスウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ３４０３；ポアサイズ１２μｍ）上で２４時間培養した。培地としては、３．３ｍＭグルコース及び０．１％牛胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気条件とした。
測定に際しては、膵島が置かれているトランスウェルの培地を３．３ｍＭグルコース及び０．１％牛胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で置き換え、６０分間、前培養を行った。なお、培養は全て３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気条件で実施した。その後、膵島が置かれているトランスウェルを、同様の培地の入った新たなウェルに移して６０分間静置した（サンプルＡ）。さらに、膵島が置かれているトランスウェルを、２０ｍＭグルコースを含有する培地の入った新たなウェルに移して６０分間静置した（サンプルＢ）。その後、サンプルＡ、サンプルＢの培地を回収し、ＥＬＩＳＡ法を利用したインスリン測定キット（森永生化学工業製）を用いて、培地に含まれているインスリンを測定した。そして、サンプルＢのインスリン濃度をサンプルＡのインスリン濃度で割った値をインスリン分泌刺激インデックスとした。結果を下記の表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１から分かるように、対照群におけるインスリン分泌刺激インデックスは７．５６±１．８２であった。一方、ＤＩＤＳ群におけるインスリン分泌刺激インデックスは９．９３±２．１８、低Ｃｌ−群におけるインスリン分泌刺激インデックスは１１．３±３．９０であり、対照群よりも有意に増加していた。
【００４０】
＜実施例４：ＴＵＮＥＬ染色及びＨＥ染色＞
実施例１にて分離した各群の膵島を、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１日間固定し、パラフィン包埋した。その後、５μｍ厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてＴＵＮＥＬ染色を行った。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群におけるＴＵＮＥＬ染色の結果をそれぞれ図３（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
また、実施例１にて分離した各群の膵島を、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１日間固定し、パラフィン包埋した。その後、５μｍ厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、ＨＥ染色を行った。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群におけるＨＥ染色の結果をそれぞれ図４（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
【００４１】
図３から分かるように、いずれの群についてもＴＵＮＥＬ陽性細胞は殆ど検出されなかった。また、図４から分かるように、対照群についてはＨＥ染色で染まっていない部分が確認された。
このことから、膵島分離中に起こる細胞死は、細胞膨化から生じるネクローシスであると考えられる。本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いることで、そのような細胞死を抑制することができる。
【００４２】
＜実施例５：糖尿病モデルＳＣＩＤマウスへの膵島移植＞
実施例１にて分離した各群の膵島（２００ＩＥＱ）を、ＳＴＺ処理による糖尿病モデルＳＣＩＤマウス（各群ともにｎ＝５）の腎皮膜下に移植した。糖尿病モデルＳＣＩＤマウスの選別については、採血により２日連続して随時血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬを超えるものを採用した。移植に際しては、マウスにエーテル麻酔を施し、左腎の腎皮膜下に２５０μＬピペットチップを用いて膵島を注入した。移植後、最初の７日間は毎日採血を行って血糖値を測定し、その後は週に３回、血糖値を測定した。そして、移植後３０日目に膵島移植腎を摘出した。なお、糖尿病の治癒の定義は、血糖値が３日連続して１５０ｍｇ／ｄＬ未満であり、腎摘後に血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬ超まで上昇した場合とした。対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群における血糖値の測定結果をそれぞれ図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示す。
【００４３】
図５から分かるように、移植後１〜２日目におけるＤＩＤＳ群の血糖値（７８．７±５２．７ｍｇ／ｄＬ）及び低Ｃｌ−群の血糖値（１１７．８±４４．０ｍｇ／ｄＬ）は、対照群の血糖値（２５２．３±１０７．４ｍｇ／ｄＬ）よりも有意に低かった（ＤＩＤＳ群ｖｓ対照群；ｐ＝０．０００４、低Ｃｌ−群ｖｓ対照群；ｐ＝０．００２）。また、ＤＩＤＳ群については５匹全てが、低Ｃｌ−群については５匹中４匹が、正常血糖（＜１５０ｍｇ／ｄＬ）になったが、対照群については５匹中２匹しか正常血糖にならなかった。
なお、移植後に正常血糖となった全てのマウスは、腎摘後に高血糖に戻った。
【００４４】
＜実施例６：膵島移植後の腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）＞
膵島の機能をさらに調べるため、実施例５における膵島移植後２５日目のマウスに対して腹腔内グルコース負荷試験を行った。試験の前８時間は絶食として、体重ｋｇ当たり２．５ｇのグルコースを生理食塩水に加えてマウスの腹腔内に注入した。マウスとしては、膵島移植を行った糖尿病モデルＳＣＩＤマウス（対照群、ＤＩＤＳ群、低Ｃｌ−群；各群ともにｎ＝５）と膵島移植を行っていないＳＣＩＤマウス（正常群；ｎ＝５）とを用いた。そして、グルコース投与前、及び投与後１０，３０，６０，９０，１２０分の時点で血糖値を測定した。結果を図６に示す。
【００４５】
図６から分かるように、ＤＩＤＳ群及び低Ｃｌ−群は正常群に近い血糖値変化を示したが、対照群は高血糖のまま推移していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する細胞分離用酵素溶液。
【請求項２】
前記塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度が０．０５〜１ｍＭである請求項１記載の細胞分離用酵素溶液。
【請求項３】
塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である細胞分離用酵素溶液。
【請求項４】
塩化物イオンがハロゲン化物イオン以外の陰イオンによって置換されている請求項３記載の細胞分離用酵素溶液。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含む細胞分離方法。
【請求項６】
膵菅を介して請求項１から４のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程を含む膵島分離方法。
【請求項１】
塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する細胞分離用酵素溶液。
【請求項２】
前記塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度が０．０５〜１ｍＭである請求項１記載の細胞分離用酵素溶液。
【請求項３】
塩化物イオン濃度が１０ｍＭ以下である細胞分離用酵素溶液。
【請求項４】
塩化物イオンがハロゲン化物イオン以外の陰イオンによって置換されている請求項３記載の細胞分離用酵素溶液。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含む細胞分離方法。
【請求項６】
膵菅を介して請求項１から４のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程を含む膵島分離方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２９６２３（Ｐ２０１２−２９６２３Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７１８６７（Ｐ２０１０−１７１８６７）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３０２０２５６６０）株式会社 バイオリンクインク (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３０２０２５６６０）株式会社 バイオリンクインク (2)
【Ｆターム（参考）】
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