細胞培養基材
【課題】細胞の分化、増殖、成長などを研究、解析するための最適の足場となる細胞培養基材を提供する。
【解決手段】本発明に係る細胞培養基材は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とし、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養でき、天然物性を保持しているため、構造・力学的特性が生体に近いばかりでなく、より生体環境に近い条件下での細胞培養ができる上に、細胞・遺伝子機能の生体を模した解析が容易となる。さらに、細胞が三次元的に成長する際に、微細構造スキャホールドを足場にして仮足を延ばしていくと言われているので、通常のフラットな培養地では不可能な細胞分化の挙動をより自然に解析することが可能である。さらにまた、目的別に脱細胞化された生体組織を使用することが可能であり、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり得るように構成した。
【解決手段】本発明に係る細胞培養基材は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とし、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養でき、天然物性を保持しているため、構造・力学的特性が生体に近いばかりでなく、より生体環境に近い条件下での細胞培養ができる上に、細胞・遺伝子機能の生体を模した解析が容易となる。さらに、細胞が三次元的に成長する際に、微細構造スキャホールドを足場にして仮足を延ばしていくと言われているので、通常のフラットな培養地では不可能な細胞分化の挙動をより自然に解析することが可能である。さらにまた、目的別に脱細胞化された生体組織を使用することが可能であり、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり得るように構成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養できる細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いままで、細胞機能を解析するために、天然物や合成化合物を含むさまざまなコーティング用ＥＣＭや三次元スキャホールドを生体環境の代替物として用いた細胞培養基材の研究が行われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の細胞培養基材は、変成したＥＣＭや合成物質を主成分とするために、生体環境とは大きく異なることが指摘されるようになった。また、これらの細胞培養基材を培養細胞とともに生体へ治療目的で移植する研究も行われてきたが、生体適合性の低さと扱い難さがあり、問題となっていた。
【０００４】
本発明は、上記の問題点を解消するためのもので、その目的とするところは、細胞の分化（特殊な形態や機能が実現されること）、増殖、成長などを研究、解析するための最適の足場となる細胞培養基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明に係る細胞培養基材は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とし、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養できるように構成した。
【０００６】
また、請求項２の発明に係る細胞培養基材は、前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴とし、人体の諸器官に機能障害が生じた場合に代替できるように構成した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用い、１）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）で構成されているため、生体環境に近い。２）細胞表面抗体が除去されているため、生体適合性が高くなる。３）天然物性を保持しているため、構造・力学的特性が生体に近いばかりでなく、より生体環境に近い条件下での細胞培養ができる上に、細胞・遺伝子機能の生体を模した解析が容易となる。４）細胞は三次元的に成長する際に、微細構造スキャホールドを足場にして仮足を延ばしていくと言われているので、通常のフラットな培養地では不可能な細胞分化の挙動をより自然に解析することが可能である。５）目的別に脱細胞化された生体組織を使用することが可能であり、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり得るなど、各種の優れた効果を奏するものである。
【０００８】
また、請求項２に記載の発明によれば、前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴としているため、特別な生体組織を使用することで、個別化された脱細胞臓器、例えば、心臓弁、血管、心筋、心膜、硬膜、腹膜、皮膚、器官、食道、尿細管、膀胱、肺、腎、肝、消化器、骨、軟骨、腱、靱帯など多くに適用できるという優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の最良の形態を図面に基いて説明する。図１は本願基材の略示的平面図、図２は高細胞親和性の比較グラフで（ａ）はヒトの血管内皮細胞値、（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞値、図３は高生体適合性の比較グラフで、（ａ）はプロテイン値、（ｂ）はαガラクトース値、図４は本願基材の作成装置の略示的説明図、である。
【００１０】
本願基材１は、ブタ等の動物から採取された異種生体を原料としたものであって、図面上はシート状に示しているが、生体自体の形状であってもよい。本願基材１は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化してなり、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を未変成に維持しつつ抗体を除去したもので、生体と同様のコラーゲン構造（点々で示す）２を有している。この結果、生体環境に近く、高い生体適合性が確保されている。
【００１１】
前記本願基材１の作成手段３の構成を図４に示す。図４によれば、ターンテーブル４をその下面に固定した円盤体５の周側に設けたラックギアにピニオンを介して噛合した駆動モータ６により回転駆動できるようになっている。該ターンテーブル４の中央透孔７には細胞除去溶液Ｂが循環するエンドレスに繋がった流路管８がセットされている。
【００１２】
前記ターンテーブル４及び円盤体５の周縁部には中央透孔７に連通する横断溝（図示せず）が設けられ、該横断溝を通して流路管８がセットされた後、ターンテーブル４及び円盤体５の横断溝は修復されるようになっている。前記流路管８の途中には、ブタ等の動物から採取された生体組織Ａを保持するための保持容器９がマイクロ波透過材（たとえば、アクリル系樹脂）により設けられている。
【００１３】
前記ターンテーブル４の中央透孔７を囲んでマイクロ波透過材からなるハウジング１０が設けられている。該ハウジング１０内には前記流路管８の途中に設けた保持容器９がセットされる。また、前記ターンテーブル４の周辺部上面には前記保持容器９内の生体組織Ａに向けてマイクロ波を照射するマイクロ波照射装置１１が設置されている。すなわち、該マイクロ波照射装置１１は、ターンテーブル４とともに、静止している生体組織Ａを中心にして公転して導波管１２を通してマイクロ波が照射できるようにしている。
【００１４】
前記流路管８には、該流路管内の細胞除去溶液Ｂを循環させる駆動ポンプ１３が連結している。該駆動ポンプ１３は、ダイヤフラム１４を介して液室１３ａと空気室１３ｂとを隣接して備え、該空気室１３ｂには空気吸送器１５が連通している。しかして、空気吸送器１５の作動により空気室１３ｂに一定タイミングで圧縮空気を送入及び排出させると、前記ダイヤフラム１４が変動して液室１３ａ内を、圧縮・拡大させるから、該液室１３ａ内の細胞除去溶液Ｂを吐出・吸入させて流路管８内に循環させることができるようになっている。勿論、該駆動ポンプ１３は２基以上あってもよい。
【００１５】
前記駆動ポンプ１３による細胞除去溶液Ｂの吐出・吸入には、心臓の鼓動と同等の拍動流を発生させる。すなわち、前記保持容器９内に保持された生体組織Ａは常に拍動流が付与された状態で細胞除去溶液Ｂ中に浸漬されている。前記流路管８の途中には、人体の抹消抵抗を想定した抵抗付与手段１６が設けられ、人体とほぼ同等の平均血圧（最高血圧／最低血圧）が得られるように調整されている。
【００１６】
前記流路管８への細胞除去溶液Ｂの充填及び保持容器９内への生体組織Ａのセットは、無菌室（図示せず）において行われる。この充填及び生体組織Ａのセット後、流路管８は閉ループに連結され、前述の如く組み付けられる。
【００１７】
前記ターンテーブル４上に設置されているマイクロ波照射装置１１は、前記ハウジング１０の周囲を公転しつつ導波路１２を介して生体組織Ａに向けてマイクロ波を照射する。このとき、生体組織Ａは駆動ポンプ１３の作用により心臓の鼓動と同等の拍動流下にて細胞除去溶液Ｂに接している。
【００１８】
本願基材１は、上述のように、拍動流下にてマイクロ波の照射を受けた未変成のＥＣＭで構成されているため、図１の如く、生体と同様のコラーゲン構造２を有している。したがって、ヒトの血管内皮細胞と、マウス血管平滑筋細胞とを、本願基材１上と比較品基材１′上とで１４日間培養した後、細胞数を計測し、高細胞親和性について比較した処、図２（ａ）、（ｂ）の結果を得た。なお、（ａ）はヒトの血管内皮細胞を示し、本願基材１は５００超え、比較品基材１′では１００未満である。（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞を示し、本願基材１は５０以上、比較品基材１′では２０未満である。なお、縦軸はセルナンバーを示している。
【００１９】
また、本願基材１は、上述のように拍動流下にてマイクロ波の照射を受けた脱細胞処理によって、抗原性を低下乃至無くしているので、動物へ移植しても拒絶による分解は起こらず、速やかに周囲の組織に生着するかについて高生体適合性を本願基材１と無処理組織１″とで比較して図３（ａ）、（ｂ）に示した。（ａ）は縦軸にプロテイン、（ｂ）は縦軸にリラティブαガラクトースである。なお、無処理組織１″と本願基材１中に含まれるタンパク質、αガラクトース（いずれも異種抗原となり得る）を定着した処、本願基材１においては原材料に比べて大幅な減少が見られた。
【００２０】
次に、本願基材１を用いて血管内皮細胞培養方法を説明する。
（１）滅菌したピンセットなどで本願基材をケースから取出す。
（２）３７°ＣのＣＯ2 インキュベータに３０分置き、平衡化を行う。
（３）ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を播く。この播く細胞数は特に限定しない（任意である）が、１×１０5 セルス／ウエルが適当である。
（４）細胞が本願基材上に均等に散らばるようにする。
（５）通常１週間程度でコンフルエントになる。内皮細胞活性測定や移植実験にこのまま使用できるようになる。
【００２１】
上記血管内皮細胞培養方法の結果を蛍光標識して観察したところ、本願基材１上の血管内皮細胞（播種２週間後）には安定に接着した状態が視認できた。すなわち、本願基材１には、細胞の分化、増殖、成長などを研究、解析するための最適の足場となることが確認された
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本願細胞培養基材は、今後の幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり、治療目的で移植する生体臓器の具体的研究において、リサーチツールとして最適で非常に価値ある産業上の利用可能性の極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本願基材の略示的平面図である。
【図２】高細胞親和性の比較グラフで（ａ）はヒトの血管内皮細胞値、（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞値である。
【図３】高生体適合性の比較グラフで、（ａ）はプロテイン値、（ｂ）はαガラクトース値である。
【図４】本願基材の作成装置の略示的説明図である。
【符号の説明】
【００２４】
１ 本願基材
１′ 比較品基材
１″ 無処理組織
２ コラーゲン構造
３ 本願基材の作成手段
４ ターンテーブル
５ 円盤体
６ 駆動モータ
７ 中央透孔
８ 流路管
９ 保持容器
１０ ハウジング
１１ マイクロ波照射装置
１２ 導波路
１３ 駆動ポンプ
１３ａ 液室
１３ｂ 空気室
１４ ダイヤフラム
１５ 空気吸送器
１６ 抵抗付与手段
Ａ 生体組織
Ｂ 細胞除去溶液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養できる細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いままで、細胞機能を解析するために、天然物や合成化合物を含むさまざまなコーティング用ＥＣＭや三次元スキャホールドを生体環境の代替物として用いた細胞培養基材の研究が行われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の細胞培養基材は、変成したＥＣＭや合成物質を主成分とするために、生体環境とは大きく異なることが指摘されるようになった。また、これらの細胞培養基材を培養細胞とともに生体へ治療目的で移植する研究も行われてきたが、生体適合性の低さと扱い難さがあり、問題となっていた。
【０００４】
本発明は、上記の問題点を解消するためのもので、その目的とするところは、細胞の分化（特殊な形態や機能が実現されること）、増殖、成長などを研究、解析するための最適の足場となる細胞培養基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明に係る細胞培養基材は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とし、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞を培養できるように構成した。
【０００６】
また、請求項２の発明に係る細胞培養基材は、前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴とし、人体の諸器官に機能障害が生じた場合に代替できるように構成した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用い、１）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）で構成されているため、生体環境に近い。２）細胞表面抗体が除去されているため、生体適合性が高くなる。３）天然物性を保持しているため、構造・力学的特性が生体に近いばかりでなく、より生体環境に近い条件下での細胞培養ができる上に、細胞・遺伝子機能の生体を模した解析が容易となる。４）細胞は三次元的に成長する際に、微細構造スキャホールドを足場にして仮足を延ばしていくと言われているので、通常のフラットな培養地では不可能な細胞分化の挙動をより自然に解析することが可能である。５）目的別に脱細胞化された生体組織を使用することが可能であり、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり得るなど、各種の優れた効果を奏するものである。
【０００８】
また、請求項２に記載の発明によれば、前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴としているため、特別な生体組織を使用することで、個別化された脱細胞臓器、例えば、心臓弁、血管、心筋、心膜、硬膜、腹膜、皮膚、器官、食道、尿細管、膀胱、肺、腎、肝、消化器、骨、軟骨、腱、靱帯など多くに適用できるという優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の最良の形態を図面に基いて説明する。図１は本願基材の略示的平面図、図２は高細胞親和性の比較グラフで（ａ）はヒトの血管内皮細胞値、（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞値、図３は高生体適合性の比較グラフで、（ａ）はプロテイン値、（ｂ）はαガラクトース値、図４は本願基材の作成装置の略示的説明図、である。
【００１０】
本願基材１は、ブタ等の動物から採取された異種生体を原料としたものであって、図面上はシート状に示しているが、生体自体の形状であってもよい。本願基材１は、拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化してなり、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を未変成に維持しつつ抗体を除去したもので、生体と同様のコラーゲン構造（点々で示す）２を有している。この結果、生体環境に近く、高い生体適合性が確保されている。
【００１１】
前記本願基材１の作成手段３の構成を図４に示す。図４によれば、ターンテーブル４をその下面に固定した円盤体５の周側に設けたラックギアにピニオンを介して噛合した駆動モータ６により回転駆動できるようになっている。該ターンテーブル４の中央透孔７には細胞除去溶液Ｂが循環するエンドレスに繋がった流路管８がセットされている。
【００１２】
前記ターンテーブル４及び円盤体５の周縁部には中央透孔７に連通する横断溝（図示せず）が設けられ、該横断溝を通して流路管８がセットされた後、ターンテーブル４及び円盤体５の横断溝は修復されるようになっている。前記流路管８の途中には、ブタ等の動物から採取された生体組織Ａを保持するための保持容器９がマイクロ波透過材（たとえば、アクリル系樹脂）により設けられている。
【００１３】
前記ターンテーブル４の中央透孔７を囲んでマイクロ波透過材からなるハウジング１０が設けられている。該ハウジング１０内には前記流路管８の途中に設けた保持容器９がセットされる。また、前記ターンテーブル４の周辺部上面には前記保持容器９内の生体組織Ａに向けてマイクロ波を照射するマイクロ波照射装置１１が設置されている。すなわち、該マイクロ波照射装置１１は、ターンテーブル４とともに、静止している生体組織Ａを中心にして公転して導波管１２を通してマイクロ波が照射できるようにしている。
【００１４】
前記流路管８には、該流路管内の細胞除去溶液Ｂを循環させる駆動ポンプ１３が連結している。該駆動ポンプ１３は、ダイヤフラム１４を介して液室１３ａと空気室１３ｂとを隣接して備え、該空気室１３ｂには空気吸送器１５が連通している。しかして、空気吸送器１５の作動により空気室１３ｂに一定タイミングで圧縮空気を送入及び排出させると、前記ダイヤフラム１４が変動して液室１３ａ内を、圧縮・拡大させるから、該液室１３ａ内の細胞除去溶液Ｂを吐出・吸入させて流路管８内に循環させることができるようになっている。勿論、該駆動ポンプ１３は２基以上あってもよい。
【００１５】
前記駆動ポンプ１３による細胞除去溶液Ｂの吐出・吸入には、心臓の鼓動と同等の拍動流を発生させる。すなわち、前記保持容器９内に保持された生体組織Ａは常に拍動流が付与された状態で細胞除去溶液Ｂ中に浸漬されている。前記流路管８の途中には、人体の抹消抵抗を想定した抵抗付与手段１６が設けられ、人体とほぼ同等の平均血圧（最高血圧／最低血圧）が得られるように調整されている。
【００１６】
前記流路管８への細胞除去溶液Ｂの充填及び保持容器９内への生体組織Ａのセットは、無菌室（図示せず）において行われる。この充填及び生体組織Ａのセット後、流路管８は閉ループに連結され、前述の如く組み付けられる。
【００１７】
前記ターンテーブル４上に設置されているマイクロ波照射装置１１は、前記ハウジング１０の周囲を公転しつつ導波路１２を介して生体組織Ａに向けてマイクロ波を照射する。このとき、生体組織Ａは駆動ポンプ１３の作用により心臓の鼓動と同等の拍動流下にて細胞除去溶液Ｂに接している。
【００１８】
本願基材１は、上述のように、拍動流下にてマイクロ波の照射を受けた未変成のＥＣＭで構成されているため、図１の如く、生体と同様のコラーゲン構造２を有している。したがって、ヒトの血管内皮細胞と、マウス血管平滑筋細胞とを、本願基材１上と比較品基材１′上とで１４日間培養した後、細胞数を計測し、高細胞親和性について比較した処、図２（ａ）、（ｂ）の結果を得た。なお、（ａ）はヒトの血管内皮細胞を示し、本願基材１は５００超え、比較品基材１′では１００未満である。（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞を示し、本願基材１は５０以上、比較品基材１′では２０未満である。なお、縦軸はセルナンバーを示している。
【００１９】
また、本願基材１は、上述のように拍動流下にてマイクロ波の照射を受けた脱細胞処理によって、抗原性を低下乃至無くしているので、動物へ移植しても拒絶による分解は起こらず、速やかに周囲の組織に生着するかについて高生体適合性を本願基材１と無処理組織１″とで比較して図３（ａ）、（ｂ）に示した。（ａ）は縦軸にプロテイン、（ｂ）は縦軸にリラティブαガラクトースである。なお、無処理組織１″と本願基材１中に含まれるタンパク質、αガラクトース（いずれも異種抗原となり得る）を定着した処、本願基材１においては原材料に比べて大幅な減少が見られた。
【００２０】
次に、本願基材１を用いて血管内皮細胞培養方法を説明する。
（１）滅菌したピンセットなどで本願基材をケースから取出す。
（２）３７°ＣのＣＯ2 インキュベータに３０分置き、平衡化を行う。
（３）ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を播く。この播く細胞数は特に限定しない（任意である）が、１×１０5 セルス／ウエルが適当である。
（４）細胞が本願基材上に均等に散らばるようにする。
（５）通常１週間程度でコンフルエントになる。内皮細胞活性測定や移植実験にこのまま使用できるようになる。
【００２１】
上記血管内皮細胞培養方法の結果を蛍光標識して観察したところ、本願基材１上の血管内皮細胞（播種２週間後）には安定に接着した状態が視認できた。すなわち、本願基材１には、細胞の分化、増殖、成長などを研究、解析するための最適の足場となることが確認された
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本願細胞培養基材は、今後の幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）の再生医療の主役となり、治療目的で移植する生体臓器の具体的研究において、リサーチツールとして最適で非常に価値ある産業上の利用可能性の極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本願基材の略示的平面図である。
【図２】高細胞親和性の比較グラフで（ａ）はヒトの血管内皮細胞値、（ｂ）はマウス血管平滑筋細胞値である。
【図３】高生体適合性の比較グラフで、（ａ）はプロテイン値、（ｂ）はαガラクトース値である。
【図４】本願基材の作成装置の略示的説明図である。
【符号の説明】
【００２４】
１ 本願基材
１′ 比較品基材
１″ 無処理組織
２ コラーゲン構造
３ 本願基材の作成手段
４ ターンテーブル
５ 円盤体
６ 駆動モータ
７ 中央透孔
８ 流路管
９ 保持容器
１０ ハウジング
１１ マイクロ波照射装置
１２ 導波路
１３ 駆動ポンプ
１３ａ 液室
１３ｂ 空気室
１４ ダイヤフラム
１５ 空気吸送器
１６ 抵抗付与手段
Ａ 生体組織
Ｂ 細胞除去溶液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項１】
拍動流の付与下にてマイクロ波を照射して脱細胞化処理してなる生体組織を用いたことを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
前記生体組織が、ブタ等の動物から採取された異種生体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２７８９６１（Ｐ２００９−２７８９６１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３７３３３（Ｐ２００８−１３７３３３）
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【出願人】（５０８０６６７４０）株式会社セルリムーバー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【出願人】（５０８０６６７４０）株式会社セルリムーバー (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]