細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法および細胞培養方法
【課題】良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体、かかる細胞培養担体を容易かつ確実に製造することができる細胞培養担体の製造方法、および、かかる細胞培養担体を用いた細胞培養方法を提供すること。
【解決手段】細胞培養担体１は、粒状の基材２と、この基材２の表面を覆うように設けられ、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層３とを有するものである。このような細胞培養担体１は、その表面に細胞を付着させ、この細胞を増殖させる細胞培養、特に、三次元高密度培養（浮遊培養）に用いられるものである。Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％であるのが好ましい。
【解決手段】細胞培養担体１は、粒状の基材２と、この基材２の表面を覆うように設けられ、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層３とを有するものである。このような細胞培養担体１は、その表面に細胞を付着させ、この細胞を増殖させる細胞培養、特に、三次元高密度培養（浮遊培養）に用いられるものである。Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％であるのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法および細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されている。
【０００３】
現在、この細胞培養には、付着依存性細胞を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる平面培養ではなく、細胞の足場となる担体を用いた三次元高密度培養（浮遊培養）が用いられている。
【０００４】
この三次元高密度培養には、ポリスチレン製、ＤＥＡＥセルロース製、ポリアクリルアミド製等の担体が用いられている。
【０００５】
しかし、これらの担体には、細胞の種類や培養条件等によって、細胞がほとんど付着しなかったり、細胞が付着してもほとんど増殖しなかったりする場合がある。
【０００６】
そこで、最近、ハイドロキシアパタイトを母材に被覆した細胞培養担体が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
この特許文献１に記載の細胞培養担体には、細胞がカルシウムに付着する性質を有するため、細胞が効率よく付着する。
【０００８】
しかしながら、この細胞培養担体では、細胞の付着性がよい反面、その表面で増殖した細胞を使用するに際して、この細胞を担体から取り外し難いという問題点や、細胞の増殖効率が低下するという問題点等がある。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−３１０２５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体、かかる細胞培養担体を容易かつ確実に製造することができる細胞培養担体の製造方法、および、かかる細胞培養担体を用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的は、下記の（１）〜（２０）の本発明により達成される。
（１） 表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【００１２】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体が得られる。
【００１３】
（２） 前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％である上記（１）に記載の細胞培養担体。
【００１４】
これにより、細胞付着性、細胞増殖性、細胞分離性（細胞培養担体からの細胞の取り外し易さ）がより良好なものとなる。
【００１５】
（３） 密度が１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３である上記（１）または（２）に記載の細胞培養担体。
【００１６】
これにより、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができ、細胞培養担体により効率よく細胞を付着させることができる。
【００１７】
（４） 粒状をなしている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞培養担体。
このような細胞培養担体の表面には、細胞が均一に付着して、細胞がより効率よく増殖する。また、粒状の細胞培養担体は、培養液中へより均一に懸濁させることができる。このため、細胞培養担体は、細胞に接触する機会が増大することから、細胞をより効率よく付着させることができる。
【００１８】
（５） 平均粒径が１０〜２０００μｍである上記（４）に記載の細胞培養担体。
このような平均粒径の細胞培養担体は、その表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が付着、増殖するのがより容易となる。
【００１９】
（６） 前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトは、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２０】
ハイドロキシアパタイトは、それ自体が生体材料として用いられるものであるため、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトも、前記特性を有するものとなり、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトとして特に好適である。
【００２１】
（７） 基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主として、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層とを有するものである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２２】
これにより、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（密度等）等を、基材の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができるようになる。
【００２３】
（８） 前記基材は、主として樹脂材料で構成されている上記（７）に記載の細胞培養担体。
【００２４】
これにより、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（比重等）等の調整がより容易となる。
【００２５】
（９） 前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである上記（８）に記載の細胞培養担体。
【００２６】
これらを主材料として基材を構成することにより、次のような効果が得られる。すなわち、前記材料は、それ自体の密度（比重）が水に近いため、細胞培養担体の密度（比重）も水と同程度とすることが容易となる。このように密度が水と同程度の細胞培養担体は、緩やかな攪拌で培養液中に均一に分散させることが可能となる。また、前記材料は、Ｃａ欠損アパタイトとの密着性が高いため、基材の表面をＣａ欠損アパタイトでより確実に被覆することが可能となる。また、前記材料は、耐熱性に優れるため、高い耐熱性を有する細胞培養担体が得られる。このような細胞培養担体には、細胞培養に先立ってオートクレーブ滅菌を施すことが可能となる。
【００２７】
（１０） 前記基材は、磁性材料を含有している上記（７）ないし（９）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２８】
これにより、細胞培養担体は、磁場が与えられることにより培養液中で移動し、細胞培養担体自体で培養液を攪拌することができる。このような細胞培養担体自体による培養液の攪拌は、攪拌子を用いた攪拌より均一かつ緩やか（マイルド）に行うことができるため、細胞が細胞培養担体の表面に付着し易くなるとともに、細胞培養担体同士の衝突により細胞が剥離するのを防止または抑制することができる。また、細胞培養担体に付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになり、より効率よく細胞が増殖することとなる。
【００２９】
（１１） 表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損したアパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【００３０】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体が得られる。
【００３１】
（１２） 上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【００３２】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体を、容易かつ確実に製造することができる。
【００３３】
（１３） 上記（７）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程と、
前記焼成粉体で、基材の表面を被覆する第４の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【００３４】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体を、容易かつ確実に製造することができる。また、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（密度等）等を、基材の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができるようになる。
【００３５】
（１４） 前記第１の工程において、前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸との混合比は、モル比で６：１〜１：１である上記（１２）または（１３）に記載の細胞培養担体の製造方法。
【００３６】
これにより、細胞付着性、細胞増殖性、細胞分離性（細胞培養担体からの細胞の取り外し易さ）がより良好なものとなる。
【００３７】
（１５） 前記第３の工程における焼成温度は、１０００℃以下である上記（１２）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００３８】
これにより、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトをより確実に生成させることができる。
【００３９】
（１６） 前記第３の工程における焼成時間は、０．１〜１０時間である上記（１２）ないし（１５）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００４０】
これにより、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトをより確実に生成させることができる。
【００４１】
（１７） 前記第３の工程における焼成雰囲気は、大気である上記（１２）ないし（１６）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００４２】
これにより、製造コストが増大するのを防止しつつ、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを効率よく生成させることができる。
【００４３】
（１８） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養担体を用いて、細胞の培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。
これにより、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４４】
（１９） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養担体と細胞とを含む培養液中において、前記細胞を前記細胞培養担体に接触させることにより、その表面に付着させ、この状態で前記細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
これにより、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４５】
（２０） 前記細胞を増殖させた後、該増殖した細胞を前記細胞培養担体から取り外す上記（１８）または（１９）に記載の細胞培養方法。
これにより、細胞を各種用途へ供与できる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の細胞培養担体によれば、良好な細胞付着性が得られるとともに、細胞増殖性に優れ、また、その表面から細胞を容易に取り外すことができる。
【００４７】
また、本発明の細胞培養担体の製造方法によれば、このような細胞培養担体を、容易且つ確実に製造することができる。
また、本発明の細胞培養方法によれば、細胞を効率よく増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明の細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法および細胞培養方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４９】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の細胞培養担体の第１実施形態について説明する。
【００５０】
図１は、本発明の細胞培養担体の第１実施形態を示す断面図である。
図１に示す細胞培養担体１は、主として樹脂材料で構成された基材２と、この基材２の表面を覆うように設けられた被覆層３とを有している。被覆層３は、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイト（以下、単に「Ｃａ欠損アパタイト」と言う。）で構成されている。
【００５１】
このような細胞培養担体１は、その表面に細胞を付着させ、この細胞を増殖させる細胞培養、特に、三次元高密度培養（浮遊培養）に用いられるものである。
【００５２】
三次元高密度培養には、例えばマイクロキャリヤー培養、攪拌培養、回転振とう培養、旋回培養等があるが、これらの中でも、細胞培養担体１は、特に、マイクロキャリヤー培養に好適に使用し得るものである。かかるマイクロキャリヤー培養によれば、細胞を大量に、極めて効率よく培養することができる。
【００５３】
細胞培養担体１は、基材２が粒状（図示の構成では、ほぼ球状）とされ、これにより、その全体が粒状（ほぼ球状）をなしている。このような細胞培養担体１の表面には、細胞が均一に付着して、細胞がより効率よく増殖する。また、粒状の細胞培養担体１は、培養液中へより均一に懸濁させることができる。このため、細胞培養担体１は、細胞に接触する機会が増大することから、細胞をより効率よく付着させることができる。
【００５４】
また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）は、特に限定されないが、細胞（付着させる細胞）の最大長さをＬ１［μｍ］とし、細胞培養担体１の平均粒径をＬ２［μｍ］としたとき、Ｌ２／Ｌ１が２〜１００であるのが好ましく、５〜５０であるのがより好ましい。
【００５５】
具体的には、前記Ｌ２は、１０〜２０００μｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００μｍ程度であるのがより好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがさらに好ましい。
【００５６】
このような平均粒径の細胞培養担体１は、その表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が付着、増殖するのがより容易となる。なお、細胞培養担体１の平均粒径が小さ過ぎると、細胞が効率よく付着しないばかりでなく、細胞培養担体１同士の間での凝集が生じ易くなる傾向を示す。一方、細胞培養担体１の平均粒径が大き過ぎると、培養液中での細胞培養担体１の沈降速度が大きくなるので、細胞培養の際の攪拌速度を大きくせざるを得ず、この場合、細胞培養担体１同士が互いに衝突し合い、その結果、細胞培養担体１の表面に付着した細胞が破壊されるおそれがある。
【００５７】
また、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させる観点からは、細胞培養担体１の密度は、水の密度に近いのものが好ましい。具体的には、細胞培養担体１の密度を、１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３程度とするのが好ましく、１．０２〜１．２ｇ／ｃｍ３程度とするのがより好ましい。細胞培養担体１の密度を前記範囲とすることにより、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。これにより、細胞培養担体１により効率よく細胞を付着させることができる。
【００５８】
このような細胞培養担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等は、基材２の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができる。
【００５９】
例えば、細胞培養担体１の密度は、基材２の構成材料、形態（例えば、多孔質や中空構造等）等を適宜設定することにより調整することができる。
【００６０】
基材２は、主として樹脂材料で構成されたものである。樹脂材料を主材料として基材２を構成することにより、細胞培養担体１の形状、大きさ、物性（比重等）等の調整がより容易となる。
【００６１】
前述したような平均粒径の細胞培養担体１を製造する場合、基材２の平均粒径は、１０〜２０００μｍ程度であるのが好ましく、５０〜５００μｍ程度であるのがより好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがさらに好ましい。
【００６２】
また、前述したような密度の細胞培養担体１を製造する場合、基材２の密度は、１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３程度とするのが好ましく、１．０２〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。
【００６３】
基材２に用いる樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６４】
これらの中でも、樹脂材料としては、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものが好適である。これらを主材料として基材２を構成することにより、次のような効果が得られる。
【００６５】
前記材料は、それ自体の密度（比重）が水に近いため、細胞培養担体１の密度（比重）も水と同程度とすることが容易となる。このように密度が水と同程度の細胞培養担体１は、緩やかな攪拌で培養液中に均一に分散させることが可能となる。
【００６６】
また、前記材料は、Ｃａ欠損アパタイトとの密着性が高いため、基材２の表面をＣａ欠損アパタイトでより確実に被覆することが可能となる。
【００６７】
また、前記材料は、耐熱性に優れるため、高い耐熱性を有する細胞培養担体１が得られる。このような細胞培養担体１には、細胞培養に先立ってオートクレーブ滅菌を施すことが可能となる。
【００６８】
また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってよい。
【００６９】
このような基材２のほぼ全面を覆うように、被覆層３が設けられている。被覆層３は、前述のように、Ｃａ欠損アパタイト（Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイト）を主材料として構成されている。
【００７０】
ここで、リン酸カルシウム系アパタイトとは、組成式Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｘ２で表される六方晶系の結晶であり、Ｃａ欠損アパタイトは、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトに対して、Ｃａ量が少なくなったものである。
【００７１】
したがって、Ｃａ欠損アパタイトには、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトにＰＯ４およびＸが付加され、Ｃａ量が相対的に少なくなったもの、および、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトからＣａ除去され、Ｃａ量が少なくなったものの双方が含まれる。
【００７２】
細胞は、通常、培養液中に存在する細胞の増殖に関与するタンパク質が細胞培養担体１に付着（吸着）し、このタンパク質を介して細胞培養担体１に付着する。また、前記タンパク質は、負の電荷を有しており、正の電荷を有するＣａに付着（吸着）する性質を有している。このため、各種リン酸カルシウム系化合物は、前記タンパク質の吸着力が強く、結果として、細胞の付着効率が高い。
【００７３】
さらに、本発明者の検討によれば、アパタイト構造を有するリン酸カルシウム系化合物（すなわち、リン酸カルシウム系アパタイト）は、その特徴的な結晶構造から、各種リン酸カルシウム系化合物の中でも、特に、前記タンパク質の吸着力が高いこと、換言すれば、細胞の付着効率が高いことが判っている。
【００７４】
本発明では、リン酸カルシウム系アパタイト（以下、単に「アパタイト」と言う。）に対してＣａ量が少ないＣａ欠損アパタイトを用いるが、このＣａ欠損アパタイトは、アパタイト構造を有するものであることから、前記タンパク質に対して高い吸着力を有している。このため、表面付近（本実施形態では被覆層３）が主としてＣａ欠損アパタイトで構成される細胞培養担体１は、十分に高い細胞の付着効率を維持するものとなる。
【００７５】
また、このような細胞培養担体１は、被覆層３がアパタイト（Ｃａが実質的に欠損していないもの）で構成されるものと比較して、表面に付着した細胞がより効率よく増殖するとともに、増殖した細胞が取り外し易いものとなる。これは、次のようなことが要因の一つであると推察される。
【００７６】
すなわち、細胞は、細胞培養担体１の表面において、前記タンパク質を指標として増殖する。ところが、表面に存在するＣａが多過ぎる場合（アパタイトの場合）、細胞がＣａに直接付着（非特異的に付着）する確率が高くなる。そして、細胞がＣａに直接付着すると、細胞の増殖が阻害される。これに対して、Ｃａ欠損アパタイトは、アパタイトに対してＣａ量が減少しており、細胞がＣａに直接付着する確率を低減することができ、これにより、細胞の増殖が促進されるものと考えられる。
【００７７】
また、細胞のＣａに対する結合力（付着力）は、大きなものであるが、Ｃａ欠損アパタイトでは、細胞がＣａに直接付着（非特異的に付着）する確率を低減することができることから、細胞を細胞培養担体１から容易に取り外すことができるようになると考えられる。
【００７８】
このように、本発明の細胞培養担体１によれば、良好な細胞付着性、細胞増殖性、および、細胞分離性（細胞の取り外し易さ）が得られる。
【００７９】
Ｃａ欠損アパタイトにおいて、Ｃａの欠損率は、アパタイトの種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、１〜３０ｍｏｌ％程度であるのが好ましく、５〜２５ｍｏｌ％程度であるのがより好ましく、８〜２０ｍｏｌ％程度であるのがさらに好ましい。Ｃａの欠損率が低過ぎると、細胞が細胞培養担体１の表面で増殖する効率（細胞増殖性）や、細胞を細胞培養担体１の表面から取り外す効率（細胞分離性）が低下するおそれがあり、一方、Ｃａの欠損率が高過ぎると、細胞が細胞培養担体１の表面に付着する効率（細胞付着性）が低下するおそれがある。
【００８０】
このようなＣａ欠損アパタイトとしては、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２等の各種アパタイトのＣａの一部が欠損したものが挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
これらの中でも、Ｃａ欠損アパタイトとしては、特に、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０−ｘ−３ｙ（ＰＯ４）６−２ｙ（ＯＨ）２−２ｘ ただし、ｘ≦１、ｙ≦３である。）を主成分とするものが好適である。ここで、ハイドロキシアパタイトは、それ自体が生体材料として用いられるものであるため、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトも、前記特性を有するものとなる。
【００８２】
また、Ｃａ欠損アパタイトとして、フッ素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）、塩素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２）のようなハロゲン化アパタイトのＣａの一部が欠損したものを用いることもできる。
【００８３】
なお、Ｃａ欠損アパタイト中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００８４】
また、被覆層３は、基材２の表面に、Ｃａ欠損アパタイトを付着させることにより形成されたものであってもよいが、図１に示すように、基材２の表面付近に、Ｃａ欠損アパタイトを主材料として構成された粒子３１（以下、単に「粒子３１」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、被覆層３の基材２の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００８５】
このような被覆層３は、緻密質なものまたは多孔質なもののいずれであってもよい。
また、被覆層３の平均厚さは、特に限定されないが、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層３の平均厚さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、部分的に基材２が露出してしまうおそれがある。一方、被覆層３の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培養担体１の密度の調整が困難となるおそれがある。
【００８６】
なお、細胞培養担体１は、その表面により多くの細胞を付着させ、増殖させる観点からは、本実施形態のように、基材２の表面のほぼ全てが被覆層３で覆われているのが好ましいが、付着させる細胞の種類や、基材２の構成材料（樹脂材料）の種類等によっては、その表面の一部が被覆層３から露出するような構成であってもよい。
【００８７】
次に、このような細胞培養担体１を用いた細胞培養方法（本発明の細胞培養方法）について説明する。
【００８８】
［１］ まず、細胞培養担体１に滅菌処理を施す。これにより、細胞培養担体１の表面に存在する微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死滅させることができる。このように、細胞培養担体１に滅菌処理を施しておくことにより、微生物やカビ等による細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、より効率よく増殖することができる。
【００８９】
この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体１と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これらの中でも、オートクレーブ滅菌が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養担体１を、より効率よく滅菌することができる。
【００９０】
［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細胞培養担体１と、細胞（付着させる細胞）とを含む培養液を用意する。
【００９１】
この細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。
培養液としては、用いる細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等が挙げられる。
【００９２】
また、これらの培養液中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【００９３】
次いで、用意した培養液を攪拌する。これにより、細胞は、細胞培養担体１に接触してその表面に付着し、この状態で時間の経過とともに増殖する。すなわち、細胞を培養する。このように、培養液を攪拌しつつ、細胞を培養することにより、細胞の増殖効率を向上させることができる。
【００９４】
培養液の攪拌速度は、特に限定されないが、５〜１００ｒｐｍ程度とするのが好ましく、１０〜５０ｒｐｍ程度とするのがより好ましい。攪拌速度が遅すぎると、細胞培養担体１の密度、平均粒径（サイズ）等によっては、細胞培養担体１を培養液中で均一に分散することができない場合があり、この場合、細胞培養担体１の表面で細胞が十分に増殖できない。一方、攪拌速度が速すぎると、細胞培養担体１が攪拌され過ぎ、細胞培養担体１同士が激しく衝突し合い、付着した細胞が破壊されてしまうおそれがある。
【００９５】
また、培養液の温度（培養温度）は、培養する細胞の種類に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、４〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【００９６】
［３］ 次に、細胞培養担体１に付着・増殖した細胞を取り外して回収する。
まず、細胞培養担体１に、その表面から細胞を剥離する剥離液を接触させることにより、細胞培養担体１の表面から剥離液中に遊離させる（取り外す）。
【００９７】
この剥離液としては、例えば、トリプシン溶液、ＥＤＴＡ溶液、低張溶液等が挙げられる。
【００９８】
このときの剥離液の温度は、特に限定されないが、４〜４０℃程度であるのが好ましく、２５〜３７℃程度であるのがより好ましい。
【００９９】
また、細胞培養担体１に剥離液を接触させる時間も、特に限定されないが、１〜３０分間程度であるのが好ましく、５〜１５分間程度であるのがより好ましい。
【０１００】
また、この際、剥離液を、例えば、攪拌、振動、揺動（振とう）等するようにしてもよい。これにより、剥離液中への細胞の収率（回収率）を向上させることができる。
【０１０１】
剥離液を攪拌する場合、その攪拌速度は、特に限定されないが、５〜１００ｒｐｍ程度とするのが好ましく、１０〜５０ｒｐｍ程度とするのがより好ましい。
【０１０２】
次いで、細胞を含有する剥離液を、例えば、フィルター、カラム等を通過させる。これにより、細胞を回収する。
【０１０３】
回収された細胞は、各種実験、研究、タンパク質の生産等に供される。
このような細胞培養担体１は、例えば、次のようにして製造することができる。
【０１０４】
次に、図１に示す細胞培養担体１の製造方法（本発明の細胞培養担体の製造方法の一例）について説明する。
【０１０５】
図１に示す細胞培養担体１の製造方法は、アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る工程と、このスラリーを乾燥して粉体を得る工程と、この粉体を焼成して焼成粉体を得る工程と、焼成粉体で基材の表面を被覆する工程とを有している。以下、各工程について順次説明する。
【０１０６】
［Ａ］スラリーを得る工程（第１の工程）
まず、アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを調整する。
【０１０７】
これは、例えば、アパタイト分散液（スラリー）中にリン酸を添加する方法、リン酸溶液中にアパタイトを添加する方法、アパタイト分散液とリン酸溶液とを混合する方法、アパタイトとリン酸とを混合した後、液体（分散媒）を添加する方法等により行うことができる。
【０１０８】
なお、アパタイトは、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。
【０１０９】
アパタイトとリン酸との混合比は、特に限定されないが、モル比で６：１〜１：１程度であるのが好ましく、６：３〜６：５程度であるのがより好ましい。リン酸の混合量（添加量）が少な過ぎると、後工程［Ｃ］で得られる焼成粉体においてＣａの欠損率が低くなり、製造される細胞培養担体１の細胞増殖性や細胞分離性が不十分となるおそれがある。一方、リン酸の混合量が多過ぎると、得られる焼成粉体においてＣａの欠損率が不要に大きくなり、製造される細胞培養担体１の細胞付着性が不十分となるおそれがある。
【０１１０】
［Ｂ］粉体を得る工程（第２の工程）
次に、前記工程［Ａ］で得られたスラリーを乾燥して粉体を得る。
【０１１１】
スラリーを乾燥する方法としては、例えば、加熱乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。
【０１１２】
スラリーの乾燥に際して加熱する場合、スラリーの加熱温度は、４０〜３００℃程度であるのが好ましく、８０〜２５０℃程度であるのがより好ましい。
【０１１３】
なお、例えば、噴霧乾燥のように、スラリーの乾燥物が粉状（粒状）となる場合は、そのまま次工程［Ｃ］に供するようにすればよく、ブロック状となる場合は、乾燥物を粉砕するようにすればよい。
【０１１４】
粉体の平均粒径は、特に限定されないが、３０μｍ以下が好ましく、特に、母粒子（基材２）の直径の１％〜５０％程度が好ましく、１０％〜２５％程度がより好ましい。これにより、被覆層３を所望の厚さに形成するのがより容易になる。
【０１１５】
［Ｃ］粉体を焼成する工程（第３の工程）
次に、前記工程［Ｂ］で得られた粉体を焼成（焼結）して、焼成粉体を得る。
【０１１６】
本発明では、この焼成をアパタイト構造が保持される温度で行う。これにより、粉体中においてアパタイトとリン酸とを反応させることにより、Ｃａ欠損アパタイトを生成して、Ｃａ欠損アパタイトを主としてなる焼成粉体が得られる。
【０１１７】
ここで、アパタイト構造を保持し得る温度を超えた温度で、粉体を焼成した場合、粉体中では、下記式Ｉに示す反応が進行する。
【０１１８】
３Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２＋２Ｈ３（ＰＯ４）
→１０Ｃａ３（ＰＯ４）２＋６Ｈ２Ｏ ・・・（Ｉ）
【０１１９】
すなわち、アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）がリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２：ＴＣＰ）に変化する。
【０１２０】
その結果、得られる焼成粉体において、Ｃａ欠損アパタイトの含有量が小さくなり、最終的に得られる細胞培養担体１は、その細胞付着性、細胞増殖性等の特性が低下する。
【０１２１】
なお、前記式Ｉは、アパタイトがハイドロキシアパタイトの場合について示したが、他のアパタイトを用いた場合も同様である。
【０１２２】
具体的な焼成温度は、アパタイトの種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、１０００℃以下であるのが好ましく、４００〜７５０℃程度であるのがより好ましい。これにより、Ｃａ欠損アパタイトをより確実に生成させることができる。
【０１２３】
また、焼成時間は、０．１〜１０時間程度であるのが好ましく、２〜４時間程度であるのがより好ましい。焼成時間が短過ぎると、十分な量のＣａ欠損アパタイトを生成させるのが困難となるおそれがあり、一方、焼成時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の反応の進行は見込めず、製造時間が長くなるだけで好ましくない。
【０１２４】
また、焼成雰囲気は、特に限定されず、例えば、大気や純酸素雰囲気のような酸素含有雰囲気、アルゴン含有雰囲気、窒素含有雰囲気等のいかなるものであってもよいが、特に、大気であるのが好ましい。これにより、製造コストが増大するのを防止しつつ、Ｃａ欠損アパタイトを効率よく生成させることができる。
【０１２５】
［Ｄ］基材の被覆工程（第４の工程）
次に、前記工程［Ｃ］で得られた焼成粉体で、基材２の表面を覆って被覆層３を形成する。
【０１２６】
図１に示すような細胞培養担体１を製造する場合、すなわち、被覆層３を基材２の表面付近に粒子３１の一部を貫入させて形成する場合、被覆層３は、例えば、焼成粉体を基材２の表面に衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、均一な厚さの被覆層３を形成することができる。
【０１２７】
この基材２と焼成粉体との衝突は、例えば、市販のメカノフュージョン装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材２と焼成粉体との混合比が、重量比で４００：１〜１０：１程度、装置内の温度が、基材２の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【０１２８】
なお、被覆層３の形成方法は、これに限定されるものではない。
以上のような工程を経て、細胞培養担体１が得られる。
【０１２９】
なお、前述したような焼成粉体は、そのまま細胞培養担体１として用いることもできる。この場合、前記工程［Ｄ］は省略される。
【０１３０】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の細胞培養担体の第２実施形態について説明する。
【０１３１】
なお、以下では、第２実施形態の細胞培養担体について、前記第１実施形態の細胞培養担体との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１３２】
図２は、本発明の細胞培養担体の第２実施形態を示す断面図である。
図２に示す細胞培養担体１は、基材２の構成が異なる以外は、前記第１実施形態の細胞培養担体１と同様である。
【０１３３】
図２に示す基材２は、その主材料である樹脂材料２１中に磁性材料２２を含有し、細胞培養担体１全体として磁性を帯びている。
【０１３４】
これにより、細胞培養担体１は、磁場が与えられることにより培養液中で移動し、細胞培養担体１自体で培養液を攪拌することができる。このため、例えばスピナーフラスコを用いた培養のように、羽根（攪拌子）と細胞培養担体１とが衝突して生じる激しい衝撃が細胞培養担体１に加わるのを防止することができる。これにより、付着した細胞が細胞培養担体１の表面から脱落することや、細胞が破壊されるのをより確実に防止することができる。
【０１３５】
また、細胞培養担体１自体による培養液の攪拌は、攪拌子を用いた攪拌より均一かつ緩やか（マイルド）に行うことができる。このため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し易くなるとともに、付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになる。したがって、細胞培養担体１の表面では、より効率よく細胞が増殖することとなる。
【０１３６】
なお、基材２は、その全体が磁性材料で構成されたものであってもよいが、本実施形態のように、樹脂材料２１と磁性材料２２とを複合化してなる複合化粒子とすることにより、樹脂材料２１と磁性材料２２との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に基材２（細胞培養担体１）の密度（比重）を調整することができる。また、細胞培養担体１の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となるという利点もある。
【０１３７】
この複合化粒子（磁性粒子）の形態としては、図２に示すように、樹脂材料２１中に磁性材料（磁性粉体）２２が分散されたものが好適である。かかる基材２は、例えば、磁性材料２２を混合した溶融状態の樹脂材料２１を粒状に成形（造粒）することにより、比較的容易に製造することができる。なお、複合化粒子は、磁性材料２２が樹脂材料２１の表面付近にのみ分散されたものであってもよい。
【０１３８】
この磁性材料２２としては、例えば、酸化鉄、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等を主成分とする強磁性合金、フェライト、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１３９】
以上のような第２実施形態の細胞培養担体においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１４０】
また、このような細胞培養担体１も、前記第１実施形態と同様にして製造することができる。
【０１４１】
なお、前記各実施形態では、いずれも、細胞培養担体１の表面付近（被覆層３）が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されるものについて代表して説明したが、本発明の細胞培養担体は、その表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損した各種アパタイトで構成されるものであってもよい。
【０１４２】
このようなアパタイトとしては、例えば、Ｍｇ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃｄ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｐｂ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｂａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｍｇ１０（ＳＯ４）６（ＯＨ）２等が挙げられる。
【０１４３】
以上、本発明の細胞培養担体および細胞培養担体の製造方法について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１４４】
例えば、細胞培養担体の形状は、粒状に限らず、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状とすることができる。
【０１４５】
また、細胞培養担体は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されるものであってもよい。
【０１４６】
また、本発明の細胞培養担体の製造方法は、前述したような工程に、必要に応じて、１または２以上の任意の目的の工程を追加することもできる。
【実施例】
【０１４７】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．粉体に対する焼成温度の検討
１−１．焼成粉体の製造
【０１４８】
（実験例１）
＜１＞ まず、湿式合成法によりハイドロキシアパタイトを合成した。
＜２＞ 次に、１０ｗｔ％のハイドロキシアパタイト水分散液を調整した。
【０１４９】
＜３＞ 次に、この水分散液１Ｌに、１０ｗｔ％のリン酸水溶液１５ｇを添加してスラリーを得た。
【０１５０】
＜４＞ 次に、このスラリーを、２００℃×２時間で乾燥した後、乳鉢で粉砕することにより、平均粒径２０μｍの粉体を作製した。
【０１５１】
＜５＞ 次に、得られた粉体を、７００℃×２時間で焼成することにより、焼成粉体を得た。
【０１５２】
（実験例２）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１１００℃とした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５３】
（実験例３）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１２００℃とした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５４】
（実験例４）
前記工程＜３＞において、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を４５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５５】
（実験例５）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１１００℃とした以外は、前記実験例４と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５６】
（実験例６）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１２００℃とした以外は、前記実験例４と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５７】
１−２．焼成粉体の結晶構造解析
各実験例で得られた焼成粉体について、それぞれ、Ｘ線回折法により結晶構造解析を行った。
その結果を、図３〜図５に示す。
【０１５８】
図３に示すように、焼成温度が７００℃の場合（実験例１、実験例４）では、ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）に帰属するピークは認められず、アパタイトに帰属する大きなピークが観測された。
【０１５９】
これに対して、焼成温度が１１００℃の場合（実験例２、実験例５）では、図４に示すように、β−ＴＣＰに帰属するピークが観測され、焼成温度が１２００℃の場合（実験例３、実験例６）では、α−ＴＣＰに帰属するピークが観測された。
【０１６０】
特に、ハイドロキシアパタイトに対して、リン酸の添加量を増加した実験例５、実験例６の焼成粉体では、それぞれ、β−ＴＣＰおよびα−ＴＣＰに帰属するピークが最も大きくなり、アパタイトに帰属するピークがほとんど観測されなくなった。
【０１６１】
このことから、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトを得るためには、適切な焼成温度が存在することが確認された。
【０１６２】
２．細胞培養担体の評価
２−１．細胞培養担体の製造
【０１６３】
（実施例１）
まず、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｘ線回折によりＣａの欠損率を測定（以下同様）した結果、３ｍｏｌ％であった。
なお、Ｃａ欠損率の測定は、具体的には以下のとおり行った。
【０１６４】
まず、１１００℃で焼成したハイドロキシアパタイト単体、および、１１００℃で焼成したリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）単体について、基準値を得るため、それぞれＸ線回折測定によりメインピークの強度を求めた。
【０１６５】
その結果、ハイドロキシアパタイト単体のカウント数は５０００counts、β−ＴＣＰ単体のカウント数は３５００countsであった。
【０１６６】
次に、実験例１により得たＣａ欠損ハイドロキシアパタイト（焼成粉体）を１１００℃で焼成した後、Ｘ線回折測定を行った。
【０１６７】
その結果、ハイドロキシアパタイトおよびβ−ＴＣＰの双方が含まれるＸ線回折パターンが得られた。ハイドロキシアパタイトのメインピークのカウント数は３５００counts、β−ＴＣＰのメインピークのカウント数は１０５０countsであった。
【０１６８】
なお、１１００℃による焼成は、各焼成粉体の結晶性を向上させる目的、および、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトをβ−ＴＣＰに相転移させる目的で行っている。
【０１６９】
次に、先に求めた基準値と、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトで計測されたカウント数の値とからＣａ欠損率を計算した。
【０１７０】
Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトの構造式（組成式）は、３５００／５０００（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）＝Ｃａ７（ＰＯ４）４．２（ＯＨ）１．４と、１０５０／３５００（Ｃａ９（ＰＯ４）６）＝Ｃａ２．７（ＰＯ４）１．８とを合計したもの、すなわち、Ｃａ９．７（ＰＯ４）６（ＯＨ）１．４となる。
【０１７１】
ここで、本来、ハイドロキシアパタイトにおいて、カルシウムは１０ｍｏｌ存在するはずであるが、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイト（焼成粉体）において、カルシウムは９．７ｍｏｌしか存在せず、このことよりＣａの欠損率は、３ｍｏｌ％と求まる。
【０１７２】
なお、β−ＴＣＰは、通常、組成式：Ｃａ３（ＰＯ４）２で表されるが、計算上の都合、Ｃａ９（ＰＯ４）６へ置き直している。
【０１７３】
また、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）を用意した。
【０１７４】
次に、焼成粉体３ｇおよびナイロン粒子３００ｇを、それぞれ、メカノフュージョンシステムＡＭＳ−ＬＡＢ（ホソカワミクロン（株））に投入し、この装置を２６５０ｒｐｍ、４５℃で７０分間稼動させた。これにより、図１に示すような細胞培養担体を得た。
【０１７５】
なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径１５１μｍ（被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１７６】
（実施例２）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を３０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、５ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７７】
（実施例３）
まず、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１１ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７８】
（実施例４）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を５０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１５ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７９】
（実施例５）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を５５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１９ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８０】
（実施例６）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を６０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、２３ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８１】
（実施例７）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を６５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、２９ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８２】
（実施例８）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、フッ素アパタイトを用いた以外は、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１２ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８３】
（実施例９）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、塩素アパタイトを用いた以外は、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８４】
（実施例１０）
基材としてナイロン粒子に代えて、フェライト複合化ナイロン粒子を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、図２に示すような細胞培養担体を得た。
【０１８５】
なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径１５１μｍ（被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．２３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１８６】
（比較例１）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８７】
（比較例２）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、フッ素アパタイトを用い、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８８】
（比較例３）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、塩素アパタイトを用い、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８９】
２−２．細胞培養
＜Ｉ＞ 実施例１〜９および比較例１〜３で得られた細胞培養担体を用いて、次のようにして細胞培養を行った。
【０１９０】
まず、各実施例および各比較例の細胞培養担体に、オートクレーブ滅菌を施した。
次に、各細胞培養担体１ｇと、２×１０５個／ｍＬのアフリカミドリザル腎臓由来ｖｅｒｏ細胞とを、ＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。
【０１９１】
この培地を、スピナーフラスコに収納し、温度３７℃、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌して、３日間、細胞培養を行った。
【０１９２】
＜II＞ 実施例１０で得られた細胞培養担体を用いて、図６に示すような細胞培養装置を用いて、次のようにして細胞培養を行った。
【０１９３】
ここで、細胞培養装置１００の構成について説明する。
図６に示す細胞培養装置１００は、培養容器１１０と、磁場発生装置１２０と、コントローラ（制御部）１３０と、加温装置１５０とを有している。コントローラ１３０が電源に接続されることにより、細胞培養装置１００の各部の作動に必要な電力が供給される。
【０１９４】
培養容器１１０は、培養液を収納するものであり、上部に培養液を供給・排出するための開口部１１１が形成されている。この開口部１１１は、栓体１１２によって閉塞されることにより、培養容器１１０内の気密性が保たれるようになっている。
【０１９５】
磁場発生装置１２０は、培養液中で細胞培養担体１を移動させるための磁場を発生するものであり、培養容器１１０の外周を囲むように設けられた電磁石１２１を有している。この電磁石１２１は、金属製の環状の芯材１２２と、この芯材１２２の外周部にラセン状に巻回された導線１２３とで構成され、導線１２３に通電することにより周辺に磁場を発生する。
【０１９６】
磁場発生装置１２０が、磁場を発生させると、細胞培養担体１が磁場発生装置１２０側に引き寄せられ、培養液中で浮上する。また、この状態から磁場の発生を停止すると、磁場発生装置１２０側に引き寄せられた細胞培養担体１がその自重によって沈降する。このような細胞培養担体１の上下移動の繰り返しにより培養液には乱流が生じ、均一かつ緩やかに撹拌される。
【０１９７】
また、コントローラ１３０には、加温装置１５０が電気的に接続されている。この加温装置１５０は、コントローラ１３０の制御により培養液を加温する。
【０１９８】
次に、細胞培養の方法について説明する。
まず、実施例１０の細胞培養担体に、オートクレーブ滅菌を施した。
【０１９９】
次に、この細胞培養担体１ｇと、２×１０５個／ｍＬのアフリカミドリザル腎臓由来ｖｅｒｏ細胞とを、ＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。
この培地を、培養容器１１０内に収納し、温度３７℃に加温した。
【０２００】
この状態で、磁場発生装置１２０を、所定時間でオン／オフするように作動させ、３日間、細胞培養を行った。なお、発生させる磁場の強度は、０．５Ｗｂ／ｍ２とした。
【０２０１】
以上のような細胞培養の操作を、各実施例および各比較例において、それぞれ、１０回ずつ行った。
【０２０２】
そして、１０回のうち５回については、細胞培養３日間後、細胞培養担体を培地から取り出し、細胞代謝活性をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ還元法により測定した。
【０２０３】
また、残り５回については、細胞培養３日間後、細胞培養担体を培地中から取り出した後、トリプシン溶液（回収液）２ｍＬ中に５分間添加して、細胞培養担体から細胞を取り外した。
【０２０４】
次に、トリプシン溶液（回収液）から細胞培養担体を取り出し、細胞代謝活性をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ還元法により測定した。
これらの結果を、Ｃａの欠損率と併せて表１に示す。
【０２０５】
なお、表１中、細胞代謝活性は、比較例１において、細胞培養担体から細胞を取り外す前の細胞代謝活性を１００としたときの相対値である。
また、各値は、それぞれ、５回の平均値である。
【０２０６】
【表１】
【０２０７】
表１に示すように、各実施例では、いずれも、細胞培養３日間後（細胞取り外し前）において、細胞代謝活性が対応する各比較例に対して明らかに高かった。また、Ｃａの欠損率を適宜設定することにより、細胞培養３日間後（細胞取り外し前）における細胞代謝活性が高くなる傾向を示した。
【０２０８】
また、各実施例では、いずれも、細胞培養担体から細胞を取り外すことにより、細胞代謝活性が顕著に低下した。これに対して、各比較例の細胞培養担体は、いずれも、細胞培養担体から細胞を取り外した後においても、細胞代謝活性の変動は小さいものであった。
【０２０９】
このようなことから、各実施例の細胞培養担体（本発明の細胞培養担体）は、良好な細胞付着性を有し、かつ、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができることが明らかとなった。
【０２１０】
また、Ｃａの欠損率を適宜設定することにより、細胞の増殖速度（増殖効率）が高くできることや、細胞の取り外し易さが向上することも判った。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】本発明の細胞培養担体の第１実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明の細胞培養担体の第２実施形態を示す断面図である。
【図３】７００℃で焼成された焼成粉体のＸ線回折パターンを示す図である。
【図４】１１００℃で焼成された焼成粉末のＸ線回折パターンを示す図である。
【図５】１２００℃で焼成された焼成粉末のＸ線回折パターンを示す図である。
【図６】細胞培養装置の構成を示す模式図である。
【符号の説明】
【０２１２】
１ 細胞培養担体
２ 基材
２１ 樹脂材料
２２ 磁性材料
３ 被覆層
３１ 粒子
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 開口部
１１２ 栓体
１２０ 磁場発生装置
１２１ 電磁石
１２２ 芯材
１２３ 導線
１３０ コントローラ
１５０ 加温装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法および細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されている。
【０００３】
現在、この細胞培養には、付着依存性細胞を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる平面培養ではなく、細胞の足場となる担体を用いた三次元高密度培養（浮遊培養）が用いられている。
【０００４】
この三次元高密度培養には、ポリスチレン製、ＤＥＡＥセルロース製、ポリアクリルアミド製等の担体が用いられている。
【０００５】
しかし、これらの担体には、細胞の種類や培養条件等によって、細胞がほとんど付着しなかったり、細胞が付着してもほとんど増殖しなかったりする場合がある。
【０００６】
そこで、最近、ハイドロキシアパタイトを母材に被覆した細胞培養担体が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
この特許文献１に記載の細胞培養担体には、細胞がカルシウムに付着する性質を有するため、細胞が効率よく付着する。
【０００８】
しかしながら、この細胞培養担体では、細胞の付着性がよい反面、その表面で増殖した細胞を使用するに際して、この細胞を担体から取り外し難いという問題点や、細胞の増殖効率が低下するという問題点等がある。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−３１０２５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体、かかる細胞培養担体を容易かつ確実に製造することができる細胞培養担体の製造方法、および、かかる細胞培養担体を用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的は、下記の（１）〜（２０）の本発明により達成される。
（１） 表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【００１２】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体が得られる。
【００１３】
（２） 前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％である上記（１）に記載の細胞培養担体。
【００１４】
これにより、細胞付着性、細胞増殖性、細胞分離性（細胞培養担体からの細胞の取り外し易さ）がより良好なものとなる。
【００１５】
（３） 密度が１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３である上記（１）または（２）に記載の細胞培養担体。
【００１６】
これにより、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができ、細胞培養担体により効率よく細胞を付着させることができる。
【００１７】
（４） 粒状をなしている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞培養担体。
このような細胞培養担体の表面には、細胞が均一に付着して、細胞がより効率よく増殖する。また、粒状の細胞培養担体は、培養液中へより均一に懸濁させることができる。このため、細胞培養担体は、細胞に接触する機会が増大することから、細胞をより効率よく付着させることができる。
【００１８】
（５） 平均粒径が１０〜２０００μｍである上記（４）に記載の細胞培養担体。
このような平均粒径の細胞培養担体は、その表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が付着、増殖するのがより容易となる。
【００１９】
（６） 前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトは、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２０】
ハイドロキシアパタイトは、それ自体が生体材料として用いられるものであるため、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトも、前記特性を有するものとなり、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトとして特に好適である。
【００２１】
（７） 基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主として、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層とを有するものである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２２】
これにより、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（密度等）等を、基材の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができるようになる。
【００２３】
（８） 前記基材は、主として樹脂材料で構成されている上記（７）に記載の細胞培養担体。
【００２４】
これにより、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（比重等）等の調整がより容易となる。
【００２５】
（９） 前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである上記（８）に記載の細胞培養担体。
【００２６】
これらを主材料として基材を構成することにより、次のような効果が得られる。すなわち、前記材料は、それ自体の密度（比重）が水に近いため、細胞培養担体の密度（比重）も水と同程度とすることが容易となる。このように密度が水と同程度の細胞培養担体は、緩やかな攪拌で培養液中に均一に分散させることが可能となる。また、前記材料は、Ｃａ欠損アパタイトとの密着性が高いため、基材の表面をＣａ欠損アパタイトでより確実に被覆することが可能となる。また、前記材料は、耐熱性に優れるため、高い耐熱性を有する細胞培養担体が得られる。このような細胞培養担体には、細胞培養に先立ってオートクレーブ滅菌を施すことが可能となる。
【００２７】
（１０） 前記基材は、磁性材料を含有している上記（７）ないし（９）のいずれかに記載の細胞培養担体。
【００２８】
これにより、細胞培養担体は、磁場が与えられることにより培養液中で移動し、細胞培養担体自体で培養液を攪拌することができる。このような細胞培養担体自体による培養液の攪拌は、攪拌子を用いた攪拌より均一かつ緩やか（マイルド）に行うことができるため、細胞が細胞培養担体の表面に付着し易くなるとともに、細胞培養担体同士の衝突により細胞が剥離するのを防止または抑制することができる。また、細胞培養担体に付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになり、より効率よく細胞が増殖することとなる。
【００２９】
（１１） 表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損したアパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【００３０】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体が得られる。
【００３１】
（１２） 上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【００３２】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体を、容易かつ確実に製造することができる。
【００３３】
（１３） 上記（７）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程と、
前記焼成粉体で、基材の表面を被覆する第４の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【００３４】
これにより、良好な細胞付着性を有するとともに、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができる細胞培養担体を、容易かつ確実に製造することができる。また、細胞培養担体の形状、大きさ、物性（密度等）等を、基材の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができるようになる。
【００３５】
（１４） 前記第１の工程において、前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸との混合比は、モル比で６：１〜１：１である上記（１２）または（１３）に記載の細胞培養担体の製造方法。
【００３６】
これにより、細胞付着性、細胞増殖性、細胞分離性（細胞培養担体からの細胞の取り外し易さ）がより良好なものとなる。
【００３７】
（１５） 前記第３の工程における焼成温度は、１０００℃以下である上記（１２）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００３８】
これにより、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトをより確実に生成させることができる。
【００３９】
（１６） 前記第３の工程における焼成時間は、０．１〜１０時間である上記（１２）ないし（１５）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００４０】
これにより、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトをより確実に生成させることができる。
【００４１】
（１７） 前記第３の工程における焼成雰囲気は、大気である上記（１２）ないし（１６）のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【００４２】
これにより、製造コストが増大するのを防止しつつ、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを効率よく生成させることができる。
【００４３】
（１８） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養担体を用いて、細胞の培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。
これにより、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４４】
（１９） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養担体と細胞とを含む培養液中において、前記細胞を前記細胞培養担体に接触させることにより、その表面に付着させ、この状態で前記細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
これにより、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４５】
（２０） 前記細胞を増殖させた後、該増殖した細胞を前記細胞培養担体から取り外す上記（１８）または（１９）に記載の細胞培養方法。
これにより、細胞を各種用途へ供与できる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の細胞培養担体によれば、良好な細胞付着性が得られるとともに、細胞増殖性に優れ、また、その表面から細胞を容易に取り外すことができる。
【００４７】
また、本発明の細胞培養担体の製造方法によれば、このような細胞培養担体を、容易且つ確実に製造することができる。
また、本発明の細胞培養方法によれば、細胞を効率よく増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明の細胞培養担体、細胞培養担体の製造方法および細胞培養方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４９】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の細胞培養担体の第１実施形態について説明する。
【００５０】
図１は、本発明の細胞培養担体の第１実施形態を示す断面図である。
図１に示す細胞培養担体１は、主として樹脂材料で構成された基材２と、この基材２の表面を覆うように設けられた被覆層３とを有している。被覆層３は、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイト（以下、単に「Ｃａ欠損アパタイト」と言う。）で構成されている。
【００５１】
このような細胞培養担体１は、その表面に細胞を付着させ、この細胞を増殖させる細胞培養、特に、三次元高密度培養（浮遊培養）に用いられるものである。
【００５２】
三次元高密度培養には、例えばマイクロキャリヤー培養、攪拌培養、回転振とう培養、旋回培養等があるが、これらの中でも、細胞培養担体１は、特に、マイクロキャリヤー培養に好適に使用し得るものである。かかるマイクロキャリヤー培養によれば、細胞を大量に、極めて効率よく培養することができる。
【００５３】
細胞培養担体１は、基材２が粒状（図示の構成では、ほぼ球状）とされ、これにより、その全体が粒状（ほぼ球状）をなしている。このような細胞培養担体１の表面には、細胞が均一に付着して、細胞がより効率よく増殖する。また、粒状の細胞培養担体１は、培養液中へより均一に懸濁させることができる。このため、細胞培養担体１は、細胞に接触する機会が増大することから、細胞をより効率よく付着させることができる。
【００５４】
また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）は、特に限定されないが、細胞（付着させる細胞）の最大長さをＬ１［μｍ］とし、細胞培養担体１の平均粒径をＬ２［μｍ］としたとき、Ｌ２／Ｌ１が２〜１００であるのが好ましく、５〜５０であるのがより好ましい。
【００５５】
具体的には、前記Ｌ２は、１０〜２０００μｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００μｍ程度であるのがより好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがさらに好ましい。
【００５６】
このような平均粒径の細胞培養担体１は、その表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が付着、増殖するのがより容易となる。なお、細胞培養担体１の平均粒径が小さ過ぎると、細胞が効率よく付着しないばかりでなく、細胞培養担体１同士の間での凝集が生じ易くなる傾向を示す。一方、細胞培養担体１の平均粒径が大き過ぎると、培養液中での細胞培養担体１の沈降速度が大きくなるので、細胞培養の際の攪拌速度を大きくせざるを得ず、この場合、細胞培養担体１同士が互いに衝突し合い、その結果、細胞培養担体１の表面に付着した細胞が破壊されるおそれがある。
【００５７】
また、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させる観点からは、細胞培養担体１の密度は、水の密度に近いのものが好ましい。具体的には、細胞培養担体１の密度を、１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３程度とするのが好ましく、１．０２〜１．２ｇ／ｃｍ３程度とするのがより好ましい。細胞培養担体１の密度を前記範囲とすることにより、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。これにより、細胞培養担体１により効率よく細胞を付着させることができる。
【００５８】
このような細胞培養担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等は、基材２の形状、大きさ、物性等を適宜設定することにより調整することができる。
【００５９】
例えば、細胞培養担体１の密度は、基材２の構成材料、形態（例えば、多孔質や中空構造等）等を適宜設定することにより調整することができる。
【００６０】
基材２は、主として樹脂材料で構成されたものである。樹脂材料を主材料として基材２を構成することにより、細胞培養担体１の形状、大きさ、物性（比重等）等の調整がより容易となる。
【００６１】
前述したような平均粒径の細胞培養担体１を製造する場合、基材２の平均粒径は、１０〜２０００μｍ程度であるのが好ましく、５０〜５００μｍ程度であるのがより好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがさらに好ましい。
【００６２】
また、前述したような密度の細胞培養担体１を製造する場合、基材２の密度は、１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３程度とするのが好ましく、１．０２〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。
【００６３】
基材２に用いる樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６４】
これらの中でも、樹脂材料としては、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものが好適である。これらを主材料として基材２を構成することにより、次のような効果が得られる。
【００６５】
前記材料は、それ自体の密度（比重）が水に近いため、細胞培養担体１の密度（比重）も水と同程度とすることが容易となる。このように密度が水と同程度の細胞培養担体１は、緩やかな攪拌で培養液中に均一に分散させることが可能となる。
【００６６】
また、前記材料は、Ｃａ欠損アパタイトとの密着性が高いため、基材２の表面をＣａ欠損アパタイトでより確実に被覆することが可能となる。
【００６７】
また、前記材料は、耐熱性に優れるため、高い耐熱性を有する細胞培養担体１が得られる。このような細胞培養担体１には、細胞培養に先立ってオートクレーブ滅菌を施すことが可能となる。
【００６８】
また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってよい。
【００６９】
このような基材２のほぼ全面を覆うように、被覆層３が設けられている。被覆層３は、前述のように、Ｃａ欠損アパタイト（Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイト）を主材料として構成されている。
【００７０】
ここで、リン酸カルシウム系アパタイトとは、組成式Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｘ２で表される六方晶系の結晶であり、Ｃａ欠損アパタイトは、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトに対して、Ｃａ量が少なくなったものである。
【００７１】
したがって、Ｃａ欠損アパタイトには、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトにＰＯ４およびＸが付加され、Ｃａ量が相対的に少なくなったもの、および、前記組成式で表されるリン酸カルシウム系アパタイトからＣａ除去され、Ｃａ量が少なくなったものの双方が含まれる。
【００７２】
細胞は、通常、培養液中に存在する細胞の増殖に関与するタンパク質が細胞培養担体１に付着（吸着）し、このタンパク質を介して細胞培養担体１に付着する。また、前記タンパク質は、負の電荷を有しており、正の電荷を有するＣａに付着（吸着）する性質を有している。このため、各種リン酸カルシウム系化合物は、前記タンパク質の吸着力が強く、結果として、細胞の付着効率が高い。
【００７３】
さらに、本発明者の検討によれば、アパタイト構造を有するリン酸カルシウム系化合物（すなわち、リン酸カルシウム系アパタイト）は、その特徴的な結晶構造から、各種リン酸カルシウム系化合物の中でも、特に、前記タンパク質の吸着力が高いこと、換言すれば、細胞の付着効率が高いことが判っている。
【００７４】
本発明では、リン酸カルシウム系アパタイト（以下、単に「アパタイト」と言う。）に対してＣａ量が少ないＣａ欠損アパタイトを用いるが、このＣａ欠損アパタイトは、アパタイト構造を有するものであることから、前記タンパク質に対して高い吸着力を有している。このため、表面付近（本実施形態では被覆層３）が主としてＣａ欠損アパタイトで構成される細胞培養担体１は、十分に高い細胞の付着効率を維持するものとなる。
【００７５】
また、このような細胞培養担体１は、被覆層３がアパタイト（Ｃａが実質的に欠損していないもの）で構成されるものと比較して、表面に付着した細胞がより効率よく増殖するとともに、増殖した細胞が取り外し易いものとなる。これは、次のようなことが要因の一つであると推察される。
【００７６】
すなわち、細胞は、細胞培養担体１の表面において、前記タンパク質を指標として増殖する。ところが、表面に存在するＣａが多過ぎる場合（アパタイトの場合）、細胞がＣａに直接付着（非特異的に付着）する確率が高くなる。そして、細胞がＣａに直接付着すると、細胞の増殖が阻害される。これに対して、Ｃａ欠損アパタイトは、アパタイトに対してＣａ量が減少しており、細胞がＣａに直接付着する確率を低減することができ、これにより、細胞の増殖が促進されるものと考えられる。
【００７７】
また、細胞のＣａに対する結合力（付着力）は、大きなものであるが、Ｃａ欠損アパタイトでは、細胞がＣａに直接付着（非特異的に付着）する確率を低減することができることから、細胞を細胞培養担体１から容易に取り外すことができるようになると考えられる。
【００７８】
このように、本発明の細胞培養担体１によれば、良好な細胞付着性、細胞増殖性、および、細胞分離性（細胞の取り外し易さ）が得られる。
【００７９】
Ｃａ欠損アパタイトにおいて、Ｃａの欠損率は、アパタイトの種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、１〜３０ｍｏｌ％程度であるのが好ましく、５〜２５ｍｏｌ％程度であるのがより好ましく、８〜２０ｍｏｌ％程度であるのがさらに好ましい。Ｃａの欠損率が低過ぎると、細胞が細胞培養担体１の表面で増殖する効率（細胞増殖性）や、細胞を細胞培養担体１の表面から取り外す効率（細胞分離性）が低下するおそれがあり、一方、Ｃａの欠損率が高過ぎると、細胞が細胞培養担体１の表面に付着する効率（細胞付着性）が低下するおそれがある。
【００８０】
このようなＣａ欠損アパタイトとしては、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２等の各種アパタイトのＣａの一部が欠損したものが挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
これらの中でも、Ｃａ欠損アパタイトとしては、特に、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０−ｘ−３ｙ（ＰＯ４）６−２ｙ（ＯＨ）２−２ｘ ただし、ｘ≦１、ｙ≦３である。）を主成分とするものが好適である。ここで、ハイドロキシアパタイトは、それ自体が生体材料として用いられるものであるため、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。このため、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトも、前記特性を有するものとなる。
【００８２】
また、Ｃａ欠損アパタイトとして、フッ素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）、塩素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２）のようなハロゲン化アパタイトのＣａの一部が欠損したものを用いることもできる。
【００８３】
なお、Ｃａ欠損アパタイト中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００８４】
また、被覆層３は、基材２の表面に、Ｃａ欠損アパタイトを付着させることにより形成されたものであってもよいが、図１に示すように、基材２の表面付近に、Ｃａ欠損アパタイトを主材料として構成された粒子３１（以下、単に「粒子３１」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、被覆層３の基材２の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００８５】
このような被覆層３は、緻密質なものまたは多孔質なもののいずれであってもよい。
また、被覆層３の平均厚さは、特に限定されないが、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層３の平均厚さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、部分的に基材２が露出してしまうおそれがある。一方、被覆層３の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培養担体１の密度の調整が困難となるおそれがある。
【００８６】
なお、細胞培養担体１は、その表面により多くの細胞を付着させ、増殖させる観点からは、本実施形態のように、基材２の表面のほぼ全てが被覆層３で覆われているのが好ましいが、付着させる細胞の種類や、基材２の構成材料（樹脂材料）の種類等によっては、その表面の一部が被覆層３から露出するような構成であってもよい。
【００８７】
次に、このような細胞培養担体１を用いた細胞培養方法（本発明の細胞培養方法）について説明する。
【００８８】
［１］ まず、細胞培養担体１に滅菌処理を施す。これにより、細胞培養担体１の表面に存在する微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死滅させることができる。このように、細胞培養担体１に滅菌処理を施しておくことにより、微生物やカビ等による細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、より効率よく増殖することができる。
【００８９】
この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体１と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これらの中でも、オートクレーブ滅菌が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養担体１を、より効率よく滅菌することができる。
【００９０】
［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細胞培養担体１と、細胞（付着させる細胞）とを含む培養液を用意する。
【００９１】
この細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。
培養液としては、用いる細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等が挙げられる。
【００９２】
また、これらの培養液中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【００９３】
次いで、用意した培養液を攪拌する。これにより、細胞は、細胞培養担体１に接触してその表面に付着し、この状態で時間の経過とともに増殖する。すなわち、細胞を培養する。このように、培養液を攪拌しつつ、細胞を培養することにより、細胞の増殖効率を向上させることができる。
【００９４】
培養液の攪拌速度は、特に限定されないが、５〜１００ｒｐｍ程度とするのが好ましく、１０〜５０ｒｐｍ程度とするのがより好ましい。攪拌速度が遅すぎると、細胞培養担体１の密度、平均粒径（サイズ）等によっては、細胞培養担体１を培養液中で均一に分散することができない場合があり、この場合、細胞培養担体１の表面で細胞が十分に増殖できない。一方、攪拌速度が速すぎると、細胞培養担体１が攪拌され過ぎ、細胞培養担体１同士が激しく衝突し合い、付着した細胞が破壊されてしまうおそれがある。
【００９５】
また、培養液の温度（培養温度）は、培養する細胞の種類に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、４〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【００９６】
［３］ 次に、細胞培養担体１に付着・増殖した細胞を取り外して回収する。
まず、細胞培養担体１に、その表面から細胞を剥離する剥離液を接触させることにより、細胞培養担体１の表面から剥離液中に遊離させる（取り外す）。
【００９７】
この剥離液としては、例えば、トリプシン溶液、ＥＤＴＡ溶液、低張溶液等が挙げられる。
【００９８】
このときの剥離液の温度は、特に限定されないが、４〜４０℃程度であるのが好ましく、２５〜３７℃程度であるのがより好ましい。
【００９９】
また、細胞培養担体１に剥離液を接触させる時間も、特に限定されないが、１〜３０分間程度であるのが好ましく、５〜１５分間程度であるのがより好ましい。
【０１００】
また、この際、剥離液を、例えば、攪拌、振動、揺動（振とう）等するようにしてもよい。これにより、剥離液中への細胞の収率（回収率）を向上させることができる。
【０１０１】
剥離液を攪拌する場合、その攪拌速度は、特に限定されないが、５〜１００ｒｐｍ程度とするのが好ましく、１０〜５０ｒｐｍ程度とするのがより好ましい。
【０１０２】
次いで、細胞を含有する剥離液を、例えば、フィルター、カラム等を通過させる。これにより、細胞を回収する。
【０１０３】
回収された細胞は、各種実験、研究、タンパク質の生産等に供される。
このような細胞培養担体１は、例えば、次のようにして製造することができる。
【０１０４】
次に、図１に示す細胞培養担体１の製造方法（本発明の細胞培養担体の製造方法の一例）について説明する。
【０１０５】
図１に示す細胞培養担体１の製造方法は、アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る工程と、このスラリーを乾燥して粉体を得る工程と、この粉体を焼成して焼成粉体を得る工程と、焼成粉体で基材の表面を被覆する工程とを有している。以下、各工程について順次説明する。
【０１０６】
［Ａ］スラリーを得る工程（第１の工程）
まず、アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを調整する。
【０１０７】
これは、例えば、アパタイト分散液（スラリー）中にリン酸を添加する方法、リン酸溶液中にアパタイトを添加する方法、アパタイト分散液とリン酸溶液とを混合する方法、アパタイトとリン酸とを混合した後、液体（分散媒）を添加する方法等により行うことができる。
【０１０８】
なお、アパタイトは、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。
【０１０９】
アパタイトとリン酸との混合比は、特に限定されないが、モル比で６：１〜１：１程度であるのが好ましく、６：３〜６：５程度であるのがより好ましい。リン酸の混合量（添加量）が少な過ぎると、後工程［Ｃ］で得られる焼成粉体においてＣａの欠損率が低くなり、製造される細胞培養担体１の細胞増殖性や細胞分離性が不十分となるおそれがある。一方、リン酸の混合量が多過ぎると、得られる焼成粉体においてＣａの欠損率が不要に大きくなり、製造される細胞培養担体１の細胞付着性が不十分となるおそれがある。
【０１１０】
［Ｂ］粉体を得る工程（第２の工程）
次に、前記工程［Ａ］で得られたスラリーを乾燥して粉体を得る。
【０１１１】
スラリーを乾燥する方法としては、例えば、加熱乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。
【０１１２】
スラリーの乾燥に際して加熱する場合、スラリーの加熱温度は、４０〜３００℃程度であるのが好ましく、８０〜２５０℃程度であるのがより好ましい。
【０１１３】
なお、例えば、噴霧乾燥のように、スラリーの乾燥物が粉状（粒状）となる場合は、そのまま次工程［Ｃ］に供するようにすればよく、ブロック状となる場合は、乾燥物を粉砕するようにすればよい。
【０１１４】
粉体の平均粒径は、特に限定されないが、３０μｍ以下が好ましく、特に、母粒子（基材２）の直径の１％〜５０％程度が好ましく、１０％〜２５％程度がより好ましい。これにより、被覆層３を所望の厚さに形成するのがより容易になる。
【０１１５】
［Ｃ］粉体を焼成する工程（第３の工程）
次に、前記工程［Ｂ］で得られた粉体を焼成（焼結）して、焼成粉体を得る。
【０１１６】
本発明では、この焼成をアパタイト構造が保持される温度で行う。これにより、粉体中においてアパタイトとリン酸とを反応させることにより、Ｃａ欠損アパタイトを生成して、Ｃａ欠損アパタイトを主としてなる焼成粉体が得られる。
【０１１７】
ここで、アパタイト構造を保持し得る温度を超えた温度で、粉体を焼成した場合、粉体中では、下記式Ｉに示す反応が進行する。
【０１１８】
３Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２＋２Ｈ３（ＰＯ４）
→１０Ｃａ３（ＰＯ４）２＋６Ｈ２Ｏ ・・・（Ｉ）
【０１１９】
すなわち、アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）がリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２：ＴＣＰ）に変化する。
【０１２０】
その結果、得られる焼成粉体において、Ｃａ欠損アパタイトの含有量が小さくなり、最終的に得られる細胞培養担体１は、その細胞付着性、細胞増殖性等の特性が低下する。
【０１２１】
なお、前記式Ｉは、アパタイトがハイドロキシアパタイトの場合について示したが、他のアパタイトを用いた場合も同様である。
【０１２２】
具体的な焼成温度は、アパタイトの種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、１０００℃以下であるのが好ましく、４００〜７５０℃程度であるのがより好ましい。これにより、Ｃａ欠損アパタイトをより確実に生成させることができる。
【０１２３】
また、焼成時間は、０．１〜１０時間程度であるのが好ましく、２〜４時間程度であるのがより好ましい。焼成時間が短過ぎると、十分な量のＣａ欠損アパタイトを生成させるのが困難となるおそれがあり、一方、焼成時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の反応の進行は見込めず、製造時間が長くなるだけで好ましくない。
【０１２４】
また、焼成雰囲気は、特に限定されず、例えば、大気や純酸素雰囲気のような酸素含有雰囲気、アルゴン含有雰囲気、窒素含有雰囲気等のいかなるものであってもよいが、特に、大気であるのが好ましい。これにより、製造コストが増大するのを防止しつつ、Ｃａ欠損アパタイトを効率よく生成させることができる。
【０１２５】
［Ｄ］基材の被覆工程（第４の工程）
次に、前記工程［Ｃ］で得られた焼成粉体で、基材２の表面を覆って被覆層３を形成する。
【０１２６】
図１に示すような細胞培養担体１を製造する場合、すなわち、被覆層３を基材２の表面付近に粒子３１の一部を貫入させて形成する場合、被覆層３は、例えば、焼成粉体を基材２の表面に衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、均一な厚さの被覆層３を形成することができる。
【０１２７】
この基材２と焼成粉体との衝突は、例えば、市販のメカノフュージョン装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材２と焼成粉体との混合比が、重量比で４００：１〜１０：１程度、装置内の温度が、基材２の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【０１２８】
なお、被覆層３の形成方法は、これに限定されるものではない。
以上のような工程を経て、細胞培養担体１が得られる。
【０１２９】
なお、前述したような焼成粉体は、そのまま細胞培養担体１として用いることもできる。この場合、前記工程［Ｄ］は省略される。
【０１３０】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の細胞培養担体の第２実施形態について説明する。
【０１３１】
なお、以下では、第２実施形態の細胞培養担体について、前記第１実施形態の細胞培養担体との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１３２】
図２は、本発明の細胞培養担体の第２実施形態を示す断面図である。
図２に示す細胞培養担体１は、基材２の構成が異なる以外は、前記第１実施形態の細胞培養担体１と同様である。
【０１３３】
図２に示す基材２は、その主材料である樹脂材料２１中に磁性材料２２を含有し、細胞培養担体１全体として磁性を帯びている。
【０１３４】
これにより、細胞培養担体１は、磁場が与えられることにより培養液中で移動し、細胞培養担体１自体で培養液を攪拌することができる。このため、例えばスピナーフラスコを用いた培養のように、羽根（攪拌子）と細胞培養担体１とが衝突して生じる激しい衝撃が細胞培養担体１に加わるのを防止することができる。これにより、付着した細胞が細胞培養担体１の表面から脱落することや、細胞が破壊されるのをより確実に防止することができる。
【０１３５】
また、細胞培養担体１自体による培養液の攪拌は、攪拌子を用いた攪拌より均一かつ緩やか（マイルド）に行うことができる。このため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し易くなるとともに、付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになる。したがって、細胞培養担体１の表面では、より効率よく細胞が増殖することとなる。
【０１３６】
なお、基材２は、その全体が磁性材料で構成されたものであってもよいが、本実施形態のように、樹脂材料２１と磁性材料２２とを複合化してなる複合化粒子とすることにより、樹脂材料２１と磁性材料２２との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に基材２（細胞培養担体１）の密度（比重）を調整することができる。また、細胞培養担体１の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となるという利点もある。
【０１３７】
この複合化粒子（磁性粒子）の形態としては、図２に示すように、樹脂材料２１中に磁性材料（磁性粉体）２２が分散されたものが好適である。かかる基材２は、例えば、磁性材料２２を混合した溶融状態の樹脂材料２１を粒状に成形（造粒）することにより、比較的容易に製造することができる。なお、複合化粒子は、磁性材料２２が樹脂材料２１の表面付近にのみ分散されたものであってもよい。
【０１３８】
この磁性材料２２としては、例えば、酸化鉄、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等を主成分とする強磁性合金、フェライト、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１３９】
以上のような第２実施形態の細胞培養担体においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１４０】
また、このような細胞培養担体１も、前記第１実施形態と同様にして製造することができる。
【０１４１】
なお、前記各実施形態では、いずれも、細胞培養担体１の表面付近（被覆層３）が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されるものについて代表して説明したが、本発明の細胞培養担体は、その表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損した各種アパタイトで構成されるものであってもよい。
【０１４２】
このようなアパタイトとしては、例えば、Ｍｇ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃｄ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｐｂ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｂａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｍｇ１０（ＳＯ４）６（ＯＨ）２等が挙げられる。
【０１４３】
以上、本発明の細胞培養担体および細胞培養担体の製造方法について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１４４】
例えば、細胞培養担体の形状は、粒状に限らず、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状とすることができる。
【０１４５】
また、細胞培養担体は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されるものであってもよい。
【０１４６】
また、本発明の細胞培養担体の製造方法は、前述したような工程に、必要に応じて、１または２以上の任意の目的の工程を追加することもできる。
【実施例】
【０１４７】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．粉体に対する焼成温度の検討
１−１．焼成粉体の製造
【０１４８】
（実験例１）
＜１＞ まず、湿式合成法によりハイドロキシアパタイトを合成した。
＜２＞ 次に、１０ｗｔ％のハイドロキシアパタイト水分散液を調整した。
【０１４９】
＜３＞ 次に、この水分散液１Ｌに、１０ｗｔ％のリン酸水溶液１５ｇを添加してスラリーを得た。
【０１５０】
＜４＞ 次に、このスラリーを、２００℃×２時間で乾燥した後、乳鉢で粉砕することにより、平均粒径２０μｍの粉体を作製した。
【０１５１】
＜５＞ 次に、得られた粉体を、７００℃×２時間で焼成することにより、焼成粉体を得た。
【０１５２】
（実験例２）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１１００℃とした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５３】
（実験例３）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１２００℃とした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５４】
（実験例４）
前記工程＜３＞において、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を４５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５５】
（実験例５）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１１００℃とした以外は、前記実験例４と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５６】
（実験例６）
前記工程＜５＞において、粉体を焼成する際の焼成温度を１２００℃とした以外は、前記実験例４と同様にして、細胞培養担体を得た。
【０１５７】
１−２．焼成粉体の結晶構造解析
各実験例で得られた焼成粉体について、それぞれ、Ｘ線回折法により結晶構造解析を行った。
その結果を、図３〜図５に示す。
【０１５８】
図３に示すように、焼成温度が７００℃の場合（実験例１、実験例４）では、ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）に帰属するピークは認められず、アパタイトに帰属する大きなピークが観測された。
【０１５９】
これに対して、焼成温度が１１００℃の場合（実験例２、実験例５）では、図４に示すように、β−ＴＣＰに帰属するピークが観測され、焼成温度が１２００℃の場合（実験例３、実験例６）では、α−ＴＣＰに帰属するピークが観測された。
【０１６０】
特に、ハイドロキシアパタイトに対して、リン酸の添加量を増加した実験例５、実験例６の焼成粉体では、それぞれ、β−ＴＣＰおよびα−ＴＣＰに帰属するピークが最も大きくなり、アパタイトに帰属するピークがほとんど観測されなくなった。
【０１６１】
このことから、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトを得るためには、適切な焼成温度が存在することが確認された。
【０１６２】
２．細胞培養担体の評価
２−１．細胞培養担体の製造
【０１６３】
（実施例１）
まず、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｘ線回折によりＣａの欠損率を測定（以下同様）した結果、３ｍｏｌ％であった。
なお、Ｃａ欠損率の測定は、具体的には以下のとおり行った。
【０１６４】
まず、１１００℃で焼成したハイドロキシアパタイト単体、および、１１００℃で焼成したリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）単体について、基準値を得るため、それぞれＸ線回折測定によりメインピークの強度を求めた。
【０１６５】
その結果、ハイドロキシアパタイト単体のカウント数は５０００counts、β−ＴＣＰ単体のカウント数は３５００countsであった。
【０１６６】
次に、実験例１により得たＣａ欠損ハイドロキシアパタイト（焼成粉体）を１１００℃で焼成した後、Ｘ線回折測定を行った。
【０１６７】
その結果、ハイドロキシアパタイトおよびβ−ＴＣＰの双方が含まれるＸ線回折パターンが得られた。ハイドロキシアパタイトのメインピークのカウント数は３５００counts、β−ＴＣＰのメインピークのカウント数は１０５０countsであった。
【０１６８】
なお、１１００℃による焼成は、各焼成粉体の結晶性を向上させる目的、および、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトをβ−ＴＣＰに相転移させる目的で行っている。
【０１６９】
次に、先に求めた基準値と、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトで計測されたカウント数の値とからＣａ欠損率を計算した。
【０１７０】
Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイトの構造式（組成式）は、３５００／５０００（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）＝Ｃａ７（ＰＯ４）４．２（ＯＨ）１．４と、１０５０／３５００（Ｃａ９（ＰＯ４）６）＝Ｃａ２．７（ＰＯ４）１．８とを合計したもの、すなわち、Ｃａ９．７（ＰＯ４）６（ＯＨ）１．４となる。
【０１７１】
ここで、本来、ハイドロキシアパタイトにおいて、カルシウムは１０ｍｏｌ存在するはずであるが、Ｃａ欠損ハイドロキシアパタイト（焼成粉体）において、カルシウムは９．７ｍｏｌしか存在せず、このことよりＣａの欠損率は、３ｍｏｌ％と求まる。
【０１７２】
なお、β−ＴＣＰは、通常、組成式：Ｃａ３（ＰＯ４）２で表されるが、計算上の都合、Ｃａ９（ＰＯ４）６へ置き直している。
【０１７３】
また、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）を用意した。
【０１７４】
次に、焼成粉体３ｇおよびナイロン粒子３００ｇを、それぞれ、メカノフュージョンシステムＡＭＳ−ＬＡＢ（ホソカワミクロン（株））に投入し、この装置を２６５０ｒｐｍ、４５℃で７０分間稼動させた。これにより、図１に示すような細胞培養担体を得た。
【０１７５】
なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径１５１μｍ（被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１７６】
（実施例２）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を３０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、５ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７７】
（実施例３）
まず、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１１ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７８】
（実施例４）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を５０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１５ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１７９】
（実施例５）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を５５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１９ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８０】
（実施例６）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を６０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、２３ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８１】
（実施例７）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を６５ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、２９ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８２】
（実施例８）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、フッ素アパタイトを用いた以外は、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１２ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８３】
（実施例９）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、塩素アパタイトを用いた以外は、前記実験例４と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、１０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８４】
（実施例１０）
基材としてナイロン粒子に代えて、フェライト複合化ナイロン粒子を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、図２に示すような細胞培養担体を得た。
【０１８５】
なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径１５１μｍ（被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．２３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１８６】
（比較例１）
まず、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８７】
（比較例２）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、フッ素アパタイトを用い、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８８】
（比較例３）
まず、ハイドロキシアパタイトに代えて、塩素アパタイトを用い、水分散液に添加するリン酸水溶液の量を０ｇとした以外は、前記実験例１と同様にして焼成粉体を得た。なお、Ｃａの欠損率は、０ｍｏｌ％であった。
この焼成粉体を用いて、前記実施例１と同様にして細胞培養担体を得た。
【０１８９】
２−２．細胞培養
＜Ｉ＞ 実施例１〜９および比較例１〜３で得られた細胞培養担体を用いて、次のようにして細胞培養を行った。
【０１９０】
まず、各実施例および各比較例の細胞培養担体に、オートクレーブ滅菌を施した。
次に、各細胞培養担体１ｇと、２×１０５個／ｍＬのアフリカミドリザル腎臓由来ｖｅｒｏ細胞とを、ＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。
【０１９１】
この培地を、スピナーフラスコに収納し、温度３７℃、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌して、３日間、細胞培養を行った。
【０１９２】
＜II＞ 実施例１０で得られた細胞培養担体を用いて、図６に示すような細胞培養装置を用いて、次のようにして細胞培養を行った。
【０１９３】
ここで、細胞培養装置１００の構成について説明する。
図６に示す細胞培養装置１００は、培養容器１１０と、磁場発生装置１２０と、コントローラ（制御部）１３０と、加温装置１５０とを有している。コントローラ１３０が電源に接続されることにより、細胞培養装置１００の各部の作動に必要な電力が供給される。
【０１９４】
培養容器１１０は、培養液を収納するものであり、上部に培養液を供給・排出するための開口部１１１が形成されている。この開口部１１１は、栓体１１２によって閉塞されることにより、培養容器１１０内の気密性が保たれるようになっている。
【０１９５】
磁場発生装置１２０は、培養液中で細胞培養担体１を移動させるための磁場を発生するものであり、培養容器１１０の外周を囲むように設けられた電磁石１２１を有している。この電磁石１２１は、金属製の環状の芯材１２２と、この芯材１２２の外周部にラセン状に巻回された導線１２３とで構成され、導線１２３に通電することにより周辺に磁場を発生する。
【０１９６】
磁場発生装置１２０が、磁場を発生させると、細胞培養担体１が磁場発生装置１２０側に引き寄せられ、培養液中で浮上する。また、この状態から磁場の発生を停止すると、磁場発生装置１２０側に引き寄せられた細胞培養担体１がその自重によって沈降する。このような細胞培養担体１の上下移動の繰り返しにより培養液には乱流が生じ、均一かつ緩やかに撹拌される。
【０１９７】
また、コントローラ１３０には、加温装置１５０が電気的に接続されている。この加温装置１５０は、コントローラ１３０の制御により培養液を加温する。
【０１９８】
次に、細胞培養の方法について説明する。
まず、実施例１０の細胞培養担体に、オートクレーブ滅菌を施した。
【０１９９】
次に、この細胞培養担体１ｇと、２×１０５個／ｍＬのアフリカミドリザル腎臓由来ｖｅｒｏ細胞とを、ＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。
この培地を、培養容器１１０内に収納し、温度３７℃に加温した。
【０２００】
この状態で、磁場発生装置１２０を、所定時間でオン／オフするように作動させ、３日間、細胞培養を行った。なお、発生させる磁場の強度は、０．５Ｗｂ／ｍ２とした。
【０２０１】
以上のような細胞培養の操作を、各実施例および各比較例において、それぞれ、１０回ずつ行った。
【０２０２】
そして、１０回のうち５回については、細胞培養３日間後、細胞培養担体を培地から取り出し、細胞代謝活性をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ還元法により測定した。
【０２０３】
また、残り５回については、細胞培養３日間後、細胞培養担体を培地中から取り出した後、トリプシン溶液（回収液）２ｍＬ中に５分間添加して、細胞培養担体から細胞を取り外した。
【０２０４】
次に、トリプシン溶液（回収液）から細胞培養担体を取り出し、細胞代謝活性をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ還元法により測定した。
これらの結果を、Ｃａの欠損率と併せて表１に示す。
【０２０５】
なお、表１中、細胞代謝活性は、比較例１において、細胞培養担体から細胞を取り外す前の細胞代謝活性を１００としたときの相対値である。
また、各値は、それぞれ、５回の平均値である。
【０２０６】
【表１】
【０２０７】
表１に示すように、各実施例では、いずれも、細胞培養３日間後（細胞取り外し前）において、細胞代謝活性が対応する各比較例に対して明らかに高かった。また、Ｃａの欠損率を適宜設定することにより、細胞培養３日間後（細胞取り外し前）における細胞代謝活性が高くなる傾向を示した。
【０２０８】
また、各実施例では、いずれも、細胞培養担体から細胞を取り外すことにより、細胞代謝活性が顕著に低下した。これに対して、各比較例の細胞培養担体は、いずれも、細胞培養担体から細胞を取り外した後においても、細胞代謝活性の変動は小さいものであった。
【０２０９】
このようなことから、各実施例の細胞培養担体（本発明の細胞培養担体）は、良好な細胞付着性を有し、かつ、細胞増殖性に優れ、また、細胞を容易に取り外すことができることが明らかとなった。
【０２１０】
また、Ｃａの欠損率を適宜設定することにより、細胞の増殖速度（増殖効率）が高くできることや、細胞の取り外し易さが向上することも判った。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】本発明の細胞培養担体の第１実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明の細胞培養担体の第２実施形態を示す断面図である。
【図３】７００℃で焼成された焼成粉体のＸ線回折パターンを示す図である。
【図４】１１００℃で焼成された焼成粉末のＸ線回折パターンを示す図である。
【図５】１２００℃で焼成された焼成粉末のＸ線回折パターンを示す図である。
【図６】細胞培養装置の構成を示す模式図である。
【符号の説明】
【０２１２】
１ 細胞培養担体
２ 基材
２１ 樹脂材料
２２ 磁性材料
３ 被覆層
３１ 粒子
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 開口部
１１２ 栓体
１２０ 磁場発生装置
１２１ 電磁石
１２２ 芯材
１２３ 導線
１３０ コントローラ
１５０ 加温装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％である請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
密度が１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３である請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
粒状をなしている請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
平均粒径が１０〜２０００μｍである請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトは、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項７】
基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主として、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層とを有するものである請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項８】
前記基材は、主として樹脂材料で構成されている請求項７に記載の細胞培養担体。
【請求項９】
前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである請求項８に記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
前記基材は、磁性材料を含有している請求項７ないし９のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１１】
表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損したアパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項１３】
請求項７ないし１０のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程と、
前記焼成粉体で、基材の表面を被覆する第４の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項１４】
前記第１の工程において、前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸との混合比は、モル比で６：１〜１：１である請求項１２または１３に記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１５】
前記第３の工程における焼成温度は、１０００℃以下である請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１６】
前記第３の工程における焼成時間は、０．１〜１０時間である請求項１２ないし１５のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１７】
前記第３の工程における焼成雰囲気は、大気である請求項１２ないし１６のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞培養担体を用いて、細胞の培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞培養担体と細胞とを含む培養液中において、前記細胞を前記細胞培養担体に接触させることにより、その表面に付着させ、この状態で前記細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２０】
前記細胞を増殖させた後、該増殖した細胞を前記細胞培養担体から取り外す請求項１８または１９に記載の細胞培養方法。
【請求項１】
表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトにおけるＣａの欠損率は、１〜３０ｍｏｌ％である請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
密度が１．０１〜１．５ｇ／ｃｍ３である請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
粒状をなしている請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
平均粒径が１０〜２０００μｍである請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトは、Ｃａの一部が欠損したハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項７】
基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主として、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトで構成される被覆層とを有するものである請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項８】
前記基材は、主として樹脂材料で構成されている請求項７に記載の細胞培養担体。
【請求項９】
前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである請求項８に記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
前記基材は、磁性材料を含有している請求項７ないし９のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１１】
表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養担体であって、
その少なくとも表面付近が、主として、２価の構成元素の一部が欠損したアパタイトで構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項１３】
請求項７ないし１０のいずれかに記載の細胞培養担体を製造する細胞培養担体の製造方法であって、
リン酸カルシウム系アパタイトおよびリン酸を含むスラリーを得る第１の工程と、
該スラリーを乾燥して粉体を得る第２の工程と、
該粉体を焼成して、前記粉体中において前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸とをアパタイト構造を保持しつつ反応させることにより、前記Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを生成させて、該Ｃａの一部が欠損したリン酸カルシウム系アパタイトを主としてなる焼成粉体を得る第３の工程と、
前記焼成粉体で、基材の表面を被覆する第４の工程とを有することを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項１４】
前記第１の工程において、前記リン酸カルシウム系アパタイトと前記リン酸との混合比は、モル比で６：１〜１：１である請求項１２または１３に記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１５】
前記第３の工程における焼成温度は、１０００℃以下である請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１６】
前記第３の工程における焼成時間は、０．１〜１０時間である請求項１２ないし１５のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１７】
前記第３の工程における焼成雰囲気は、大気である請求項１２ないし１６のいずれかに記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞培養担体を用いて、細胞の培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞培養担体と細胞とを含む培養液中において、前記細胞を前記細胞培養担体に接触させることにより、その表面に付着させ、この状態で前記細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２０】
前記細胞を増殖させた後、該増殖した細胞を前記細胞培養担体から取り外す請求項１８または１９に記載の細胞培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−３４２００（Ｐ２００６−３４２００Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２０８７０（Ｐ２００４−２２０８７０）
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
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