細胞培養用基板
【課題】本発明は細胞シート、細胞パターン等を所望の対象材料に高速で転写することを可能にする手段を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板を提供する。
【解決手段】本発明は、基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着培養させた細胞を細胞シート、臓器、タンパク質シートなどに対して生きたまま転写することができる、細胞の加工や再生医療などに用いるための、細胞培養用基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。さらに、近年、生体外で細胞を培養する工程を経て患者に培養細胞や培養組織を移植する再生医療の研究が盛んに行われている。
【０００３】
一部の細胞（特に多くの動物細胞）は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にし、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
【０００４】
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
【０００６】
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００７】
しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
【０００８】
さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ Ｍ，ホワイトサイズ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。
【０００９】
最近、細胞をパターンで培養した後に、その細胞を生きたまま組織や臓器などに転写する技術ならびにその技術を用いた組織体が報告された（特許文献８、特許文献９）。しかしながら、この技術では、細胞を転写するのに時間がかかるため、細胞の活性を落とさないための操作が煩雑であるなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平２−２４５１８１号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献４】米国特許第５，５１２，１３１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９００，１６０号明細書
【特許文献６】特開平９−２４０１２５号公報
【特許文献７】特開平１０−１２５４５号公報
【特許文献８】特開２００５−３４２１１２号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００５／０３８０１１パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞シート、まばらな接着細胞、細胞コロニー、細胞ネットワーク、細胞パターン等を、細胞シート、組織、臓器、器官、タンパク質シート等に高速で転写することを可能にする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
（２）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されており、
細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
（３）分解処理が酸化または紫外線照射による分解処理である（１）または（２）記載の細胞培養用基板。
【００１３】
（４）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低いことを特徴とする細胞培養用基板。
（５）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞接着阻害性領域における前記有機化合物の密度と比較して低いことを特徴とする細胞培養用基板。
（６）細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることを特徴とする（２）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
【００１４】
（７）細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることを特徴とする（２）〜（６）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
（８）炭素酸素結合を有する有機化合物がアルキレングリコール系材料である（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板。
【００１５】
（１０）（９）記載の細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む、組織体の作成方法。
（１１）前記工程が複数回行われることを特徴とする（１０）記載の方法。
（１２）（１０）または（１１）記載の方法により作成された組織体。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、細胞シート、まばらな接着細胞、細胞コロニー、細胞ネットワーク、細胞パターン等を、細胞シート、組織、臓器、器官、タンパク質シート等に高速で転写することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は細胞接着基板の作成手順を示す。
【図２】図２は細胞接着基板から対象材料への細胞の転写および培養の手順を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の細胞培養用基板は、基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備えることを特徴とする。
【００１９】
基材表面には、細胞接着性領域だけでなく、細胞接着阻害性領域も形成されていることが好ましい。そして、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。
【００２０】
本発明において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。細胞接着性領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味し、細胞接着阻害性領域とは、細胞の接着性が悪い領域を意味する。従って、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、細胞培養用基板表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
【００２１】
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性が良好とは、ある種の細胞に対する細胞接着性が良好であることを意味する。従って、細胞培養用基板上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。
【００２２】
本発明の細胞培養用基板は、細胞接着性領域の構造に特徴を有する。本発明において、細胞接着性領域の構造は２つの形態に大別することができる。
【００２３】
第一の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されている形態である。この形態では、基材の表面全体に炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理および／または分解処理を施すことにより当該領域に細胞接着性を付与して細胞接着性領域に改変する。前記処理を施さない部分は細胞接着阻害性領域である。細胞接着阻害性の親水性膜の表面の全体に対して酸化処理および／または分解処理を施せば、表面に細胞接着性領域のみを有する細胞培養用基板となる。
【００２４】
第二の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜で形成されている形態である。この形態は、炭素酸素結合を有する有機化合物を高密度で含む親水性膜が細胞接着阻害性を有するのに対して、前記化合物を低密度で含む親水性膜は細胞接着性を有することを利用したものである。基材表面に前記化合物が結合しやすい第一領域と結合しにくい第二領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第一領域は細胞接着阻害性領域となり、第二領域は細胞接着性領域となる。
【００２５】
以下の説明は、特に断りのない限り上記２つの形態のいずれにも適用される。
（基材）
本発明の細胞培養用基板に用いられる基材としては、その表面に炭素酸素結合を有する有機化合物の皮膜を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではない。具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
【００２６】
（細胞接着阻害性領域）
細胞接着阻害性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化および／または分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。
【００２７】
本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。
【００２８】
主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材と物理的または化学的に結合することにより親水性薄膜となる。
【００２９】
具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリメタクリル酸およびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類、等を挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Pluronic F108、Pluronic F127、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体、デキストラン、およびヘパリンが挙げられるがこれらには限定されない。
【００３０】
具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、アクリルアミドオリゴマーおよびその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物およびその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミドおよびその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−〔メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピルトリメトキシシラン、およびトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオールが挙げられるがこれらには限定されない。
【００３１】
親水性膜は、処理前は高い細胞接着阻害性を有し、酸化処理および／または分解処理後は弱い細胞接着性を示すものであることが望ましい。
【００３２】
親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基板表面の親水性薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。
【００３３】
基材表面への親水性膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基板表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。
【００３４】
上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、並びに、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、親水性有機化合物の基材へ密着性を高めることが容易だからである。本明細書では「結合層」という用語を用いる。結合層とは、多段階式に親水性有機化合物の薄膜を形成する場合には最表面の親水性薄膜層と基板との間に存在する層を意味し、基材表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性薄膜層を形成する場合には当該下地層を意味する。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれがリンカーであっても良い。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、基板上にリンカーを有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を例にとると、エポキシシランを付加した基板表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上であれば、次に酸触媒存在下エチレングリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する基板を作ることができる。
【００３５】
（親水性膜の酸化処理および／または分解処理による細胞接着性領域の形成）
本発明の第一の形態では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜により形成される。こうして形成された細胞接着性領域は細胞を接着する能力が比較的弱いために、当該領域上に接着した細胞は、タンパク質シート、細胞シート、組織、臓器などの細胞と相互作用が比較的強い材料に対して高速に転写することが可能である。
【００３６】
本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。
【００３７】
本発明において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。
【００３８】
紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。
【００３９】
以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理および／または分解処理」という用語を使用する。
【００４０】
酸化処理および／または分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。親水性膜全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に酸化処理および／または分解処理してもよい。部分的に酸化処理および／または分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。
【００４１】
紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプなどのＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いると良い。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度などの諸条件に応じて適宜決定することができる。
【００４２】
（親水性膜の低密度化による細胞接着性領域の形成）
本発明の第二の形態では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜により形成される。こうして形成された細胞接着性領域もまた細胞を接着する能力が比較的弱いために、当該領域上に接着した細胞は、タンパク質シート、細胞シート、組織、臓器などの細胞と相互作用が比較的強い材料に対して高速に転写することが可能である。
【００４３】
本発明のこの形態では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とは、ともに炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている。２つの領域は前記有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。一方、細胞接着阻害性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できない程度に高い。
【００４４】
親水性有機化合物の密度を制御する方法としては、親水性有機化合物の薄膜と基材表面との間に結合層を設け、当該結合層の親水性有機化合物との結合力を調整する方法が挙げられる。ここで「結合層」とは上記で定義した通りであり、上記で説明した好ましい材料から構成され得る。結合層の結合力は、結合層におけるリンカーを有する材料の密度が高いほど強くなり、同密度が低いほど弱くなる。結合層におけるリンカーを有する材料の密度は、上述の通り、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。
【００４５】
本発明のこの実施形態では、細胞接着性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は低い。細胞接着性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、リンカーを有する材料の被膜（結合層）を基材表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理および／または分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理および／または分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いることにより行うことができる。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理および／または分解処理による細胞接着性領域の形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着性領域が形成できる。
【００４６】
本発明のこの実施形態では、細胞接着阻害性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は高い。細胞接着阻害性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、リンカーを有する材料の被膜を基材表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理および／または分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着阻害性領域が形成できる。
【００４７】
（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域との比較）
以下の説明は上記の２つの形態のどちらにも適用される。
細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（atomic concentration、 ％）」は下記に定義する通りである。
【００４８】
また、細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（atomic concentration、％）」は下記に定義する通りである。
【００４９】
（親水性薄膜の評価方法）
本発明の親水性薄膜（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（atomic concentration、％）で算出される。以下、本発明におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
【００５０】
（親水性薄膜の炭素量の算出方法、および酸素と結合している炭素の割合の算出方法）
本発明において親水性薄膜の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本発明において親水性薄膜の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。以下に具体的な測定方法を２つ記載する。なお、本発明は、これらの測定方法に限定されるものではない。
【００５１】
（測定方法１）
Ｘ線光電子分光装置：サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probe。
Ｘ線源：単色化アルミニウムＫα線（15kV-6.67mA=100W）。
測定面積：400μｍφ
試料と検出器の位置関係：試料法線から53°の位置に光電子取り込みレンズが存在。
炭素量：基材や親水性薄膜を構成する元素を想定し、測定する光電子のセットを決める。測定したトータルの光電子を１００％とした時の各光電子由来の元素濃度（atomic concentration）を算出する。Ｃ１ｓピークの元素濃度（atomic concentration ％）を炭素量とする。
Ｃ１ｓピークのフィッティング方法：Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合、Ｃ−Ｃ結合でフィッティングする。
酸素と結合している炭素の割合の算出式：{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕}÷{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ−Ｃ結合の炭素の割合〕＋〔（必要の場合）その他の結合の炭素の割合〕}×１００（％）。
なお、必要の場合は、その他の結合も加えてフィッティングする。このデータを基にＣ１ｓピークの各結合状態の炭素の濃度（atomic concentration ％）を算出する。
【００５２】
（測定方法２）
Ｘ線光電子分光装置：KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)。
Ｘ線源：非単色化マグネシウムＫα線（10kV-20mA＝200W）。
測定面積：6mmφ
試料と検出器の位置関係：試料法線上に光電子取り込みレンズが存在。
炭素量：基材や親水性薄膜を構成する元素を想定し、測定する光電子のセットを決める。測定したトータルの光電子を１００％とした時の各光電子由来の元素濃度（atomic concentration）を算出する。Ｃ１ｓピークの元素濃度（atomic concentration ％）を炭素量とする。
Ｃ１ｓピークのフィッティング方法：Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合、Ｃ−Ｃ結合でフィッティングする。
酸素と結合している炭素の割合の算出式：{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕}÷{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ−Ｃ結合の炭素の割合〕＋〔（必要の場合）その他の結合の炭素の割合〕}×１００（％）。
【００５３】
なお、必要の場合は、その他の結合も加えてフィッティングする。このデータを基にＣ１ｓピークの各結合状態の炭素の濃度（atomic concentration ％）を算出する。
【００５４】
（パターンの形状）
本発明の細胞培養用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の内部がすべて細胞接着性領域または細胞接着阻害性領域となっているパターンなどを形成することができる。血管内皮細胞または神経細胞を培養して組織を形成する場合は、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状の形状で細胞が接着するようなパターンを形成することが好ましい。これを被転写材料に転写して培養すると、血管内皮細胞の場合は、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状に配列されることにより組織化が促進され、血管の形成が促される。ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状のパターンを形成する場合、パターンにおける線幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは３０〜１００μｍである。特に、血管内皮細胞をライン状に配置して培養することにより毛細血管を形成する場合は、ライン状の細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを形成し、血管内皮細胞をライン状に接着させることが好ましい。このような態様においては、細胞が１〜１０個、好ましくは１〜６個収まる程度のライン幅で細胞が接着されるようなパターンを形成するのが好ましい。具体的には、細胞接着性領域のライン幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは３０〜８０μｍであり、ラインとラインの間にあたる細胞接着阻害性領域のスペース幅は通常８０〜１０００μｍ、好ましくは１００〜８００μｍである。ライン幅を上記の数値範囲とすることにより、血管内皮細胞が効率的に管組織化することができる。このような細胞接着性変化パターンを形成することにより、ライン状に接着され転写された血管内皮細胞は、組織化してライン状の毛細血管を効率的に形成する。複数のラインが交わることなく並ぶような細胞パターンを形成したい場合は、細胞が接着したラインとラインの間のスペース幅を上記のように一定の値以上とすることにより、細胞が組織化する際にラインとライン間で細胞から擬足が伸びてラインにゆがみが生じるのを防ぐことができる。
【００５５】
（細胞）
細胞培養用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
【００５６】
（細胞接着基板）
本発明は、細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板を提供する。当該細胞接着基板はそれ自体製品として流通され得る。
【００５７】
細胞接着基板の作成方法を、図１を参照して説明する。図１では、基材上に細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板を使用した場合を一例として説明するが、これは説明のためのものであり、基材表面の全体が細胞接着性領域である細胞培養用基板を使用する場合もまた本発明の範囲内である。
【００５８】
図１（ａ）に示すように、細胞培養用基板の表面に細胞を均一に播き、図１（ｂ）に示すように、一定時間細胞を培養し、細胞接着阻害性領域にある余分な細胞を除去するために洗浄すると、図１（ｃ）に示すように、細胞接着性領域には細胞が接着しているが細胞接着阻害性領域には細胞が接着していない細胞パターンが形成された細胞接着基板が得られる。
【００５９】
目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。
【００６０】
細胞培養用基板への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲンおよびゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシートおよびプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。
【００６１】
予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。
【００６２】
上記のように予備培養した細胞を、図１（ａ）に示すように、培養液中の細胞培養用基板上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞培養用基板上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基板１ｃｍ２当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。細胞が凝集すると細胞の組織化が阻害され、対象材料に転写して培養しても機能が低下するからである。具体的には、４００ｍｍ２あたり２×１０５個程度で播種する。
【００６３】
細胞を播種した細胞培養用基板を培養液中で培養することにより、細胞を細胞接着性領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。
【００６４】
図１（ｂ）に示すように、細胞を培養する工程は、細胞培養用基板の細胞接着性領域に細胞を接着することを目的とする。培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。適度な時間で培養することによって、洗い流したときに細胞培養用基板の細胞接着阻害性領域の細胞が流されるとともに、細胞接着性領域の細胞は適切な接着力で細胞培養用基板上に残るため、残った細胞を対象材料に容易に転写することが可能になる。
【００６５】
培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞培養用基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着性領域に細胞が接着した本発明の細胞接着基板を作成することができる。
【００６６】
（細胞接着基板の使用方法）
上記の手順で作成された細胞接着基板を用いた対象材料への細胞の転写および転写後の細胞の培養方法について説明する。図２では、転写の対象材料として、表面に細胞培養層が設けられた基材を用い、細胞として血管内皮細胞を用いた場合について図示するが、これは例示のためであり、本発明はこの態様には限定されない。
【００６７】
図２（ａ）に示すように、細胞培養用基板の細胞接着性領域に細胞が接着している細胞接着基板を対象材料の細胞培養層に密着させる。次いで、図２（ｂ）に示すように、細胞を培養することで対象材料の細胞培養層に細胞を接着させる。さらに、細胞の細胞接着性領域への接着力は、細胞培養層への接着力に比べて小さいことから、図２（ｃ）に示すように、細胞培養用基板を対象材料から剥離すると、対象材料に細胞が転写される。この転写された細胞をさらに培養すると、図２（ｄ）に示すように細胞が機能化され、血管内皮細胞であれば環状構造が再現される。
【００６８】
細胞が転写される対象材料としては、細胞を接着可能かつ培養可能なものであれば特に制限されないが、細胞培養用基板の細胞接着性領域よりも細胞に対する接着性が強い表面を有するものが好ましい。例えば、細胞の組織化を安定的に行う為には対象材料の表面が柔らかく、また細胞被接着性が高すぎないものが望ましいことが次の参考文献に示されている。Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: Role of extracellular matrix. Donald E. Ingber 他、J. of cell biol. (1989) p.317。特に好ましくは、以下に詳述するとおり、細胞シート、組織、器官、臓器、タンパク質シート、生体由来ゲル、タンパク質コーティング等を対象材料とすることができる。
【００６９】
好適な対象材料としては、コラーゲンシート、フィブリンシート、エラスチンシート、羊膜などを用いることができる。また、基材上に、後述の細胞培養層を設ける場合は、基材の材料は、細胞培養層上の細胞の培養を阻害しない材料であればよく、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ（グリセロール−セバケート）などを用いることができる。細胞培養用基板に用いられる基材について例示したものを使用することもできる。
【００７０】
細胞培養層は、その表面に細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質や細胞接着因子を含むことが好ましい。具体的には、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、ペプチドおよびインテグリン等の細胞外基質を挙げることができ、これらは1種のみを用いても、２種以上併用してもよい。細胞接着性が高いという点で、各種コラーゲンを用いることがより好ましく、各種コラーゲンの中でも、タイプIコラーゲンやタイプIVコラーゲンを用いることが特に好ましい。骨芽細胞などの細胞外基質産生細胞を培養して細胞外基質を生成させることにより細胞培養層を形成することもできる。
【００７１】
対象材料の形状は、特に限定されるわけではなく、細胞を転写できる表面を備えていればよい。例えば、ペトリ皿やマルチデッシュなどの培養皿を用いることができる。また、ガラスや上述のプラスチックからなる培養プレートを用いることもできる。
【００７２】
細胞接着基板から対象材料への細胞の転写は、細胞接着基板の細胞接着面と対象材料の表面、例えば細胞培養層とを接触させることにより実施できる。このように細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で、培養することにより細胞を転写することができる。培養は、用いる基板や細胞によって適当な条件を選択することができるが、通常、ＣＯ２濃度５％、３７℃で、１５分〜９６時間、好ましくは３０分〜３６時間行う。
【００７３】
その後、培養液中で細胞培養を行うが、細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で細胞培養を行ってもよいし、細胞接着基板を取り除いて対象材料のみで細胞培養を行ってもよい。細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で一定時間細胞培養を行った後、細胞接着基板を取り除いてさらに細胞培養を行うのが好ましい。培養条件としては、特に制限はなく、培養する細胞種によって選択することができる。培養液としては、上記と同様のものを使用することができる。
【００７４】
本発明の細胞接着基板は、パターン状に接着している細胞を対象材料にパターン化された状態で容易に転写することができるとともに、転写した後は洗浄して再び細胞を播種する細胞培養用基板とすることができるため、再度細胞パターンを形成し、これを転写して培養することができる。従って、細胞パターンを安価かつ効率的に作成することができる。また、対象材料には、特別のパターンを形成させる必要がないので、細胞培養のために通常用いられるものを使用でき、材料選択の幅も広がるとともに、現像液などの細胞にとって有害な物質の影響を受けることもない。
【００７５】
対象材料には、生体材料も含まれる。生体材料とは生体由来の材料を意味し、例えば生体由来の組織、器官等が含まれる。具体的には、肺、心臓、肝臓、腎臓、脳、胃、小腸、大腸等の臓器、骨、軟骨、皮膚、筋肉、眼球、舌、腹膜等の組織などが挙げられる。また、細胞シートやスフェロイドなどの細胞集合体もまた対象材料として使用することができる。細胞集合体を構成する細胞としては、細胞外基質を産生する細胞、例えば、間質系細胞、上皮細胞、実質細胞などが挙げられる。具体的には、骨芽細胞、線維芽細胞、肝実質細胞、フィーダー細胞等の集合体を好ましく使用できる。
【００７６】
細胞培養用基板上の細胞をこれらの生体材料に直接転写することにより、組織または器官上で直接細胞をパターン状に培養することができる。細胞が転写される生体材料と該生体材料に転写されて培養される細胞との組合せとしては、例えば、肝臓と血管内皮細胞、真皮と血管内皮細胞、骨芽細胞層と血管内皮細胞、線維芽細胞層と肝実質細胞、内皮細胞層と肝実質細胞、フィーダー細胞層と角膜上皮細胞が挙げられる。
【００７７】
このような態様においては、器官等の生体材料に直接細胞を転写して培養できることから、細胞培養用の担体から細胞を酵素処理等により剥がして回収する必要がなく、細胞の損傷を防ぐことができる。
【００７８】
臓器移植においては、移植後、当該臓器の表面に毛細血管が形成されるが、この毛細血管を移植する臓器の表面に予め形成させてから移植することにより、移植を効果的に行う技術が知られている。しかし、移植前に毛細血管を形成しこれを臓器表面に付着させる従来技術の方法では、毛細血管の作成に時間がかかり迅速な移植が不可能である。さらに、培養用基材等で予め形成した血管を基材から剥がして臓器表面に移す際に組織が損傷する。本発明の方法では、細胞接着基板にパターン状に配置された細胞を臓器表面に転写した後、毛細血管が完全に形成されるのを待たずに移植を行うことができるので、迅速な移植が可能になる。臓器表面に線状または網目状に転写された血管内皮細胞は組織化されやすいので、体内における毛細血管の形成が促進される。さらに、本発明では、細胞を移す際に、細胞培養用基板から細胞を剥がすための処理が不要であるため、組織の損傷が問題となることもない。さらに、本発明では、転写が迅速に行われるため組織または器官への悪影響が少ない。
【００７９】
転写した細胞の培養においては、必要に応じて、細胞刺激因子を添加することにより、細胞活性を高めたり、細胞が本来有する機能を発現させ組織化を促進することができる。細胞刺激因子としては、細胞の組織化を促進する活性を有する物質であればいずれも使用でき、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）等が挙げられる。
【００８０】
細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程は複数回行い、多層構造の組織体を作成することが可能である。
【００８１】
本発明はまた、上述の手順により、細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む方法により作成された組織体に関する。転写工程が複数回行われる場合、作成される組織体は多層構造を有する。転写の対象材料が生体組織または器官である場合は、これらの組織または器官上に形成された組織体もまた本発明の範囲に包含される。
【００８２】
本発明はまた、被検体由来の細胞を本発明の細胞培養用基板にパターン状に接着した後、これを被検体の生体組織、例えば上記のような臓器、皮膚および骨等の表面にパターン化された状態で転写し、該細胞を増殖させることにより被検体の組織を再生する方法に関する。被検体としては、特に限定されないが、例えば哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。例えば、本発明の方法により真皮繊維芽細胞や上皮細胞を生体における皮膚損傷部分に直接転写して細胞を増殖させることにより、被検体において皮膚組織を再生することができる。また、被検体において皮膚が損傷した部分に、血管内皮細胞をパターン状に転写して増殖させることにより毛細血管を形成させて、皮膚の再生を促すことも可能である。さらに、神経細胞をパターン状に配列して培養することにより、神経回路や神経細胞コンピューターを作成することも可能になる。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、この混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。あらかじめＵＶ洗浄した１０ｃｍ角のガラス基板を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１２時間室温で放置した。その後、下地処理されたガラス基板をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。成膜後の基板表面の水の接触角の平均値は５０．２°であった。
【００８４】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール５０ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ処理された基板を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【００８５】
（酸化処理）
酸化チタン系光触媒を塗布した石英板を作製した。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記光触媒付き石英板を、親水性薄膜と石英板の光触媒層が対向するように配置し、石英板の裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。２５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【００８６】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、酸化処理前の親水性薄膜、酸化処理後の親水性薄膜を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした酸化処理後の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理前の親水性薄膜の炭素量の９２．２％であった。酸化処理前の親水性薄膜における酸素と結合している炭素の割合は６０．８％、酸化処理後の親水性薄膜における酸素と結合している炭素の割合は５９．２％であった。
【００８７】
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、基板一枚あたり２．６×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。５％血清を含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはコンフルエントの状態で接着していた。
【００８８】
（細胞転写）
氷上に培養容器を配置し、培養容器内に成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）を２００μｌ添加し、４℃に冷やしたセルスクレイパーで細胞接着基板と同程度の大きさにマトリゲルを広げた。その後、培養容器を室温で約５分放置し、マトリゲルをゲル化させた。ゲル化させたマトリゲルの上に細胞接着基板を細胞接着面がマトリゲルと対向するように静かに配置した。ｂＥＣがマトリゲルに接触している状態で数分保持した。その後、０．３％血清を含むＭＥＭ培地を培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。２時間後、細胞培養用基板のみを簡単に剥がすことができた。ｂＥＣがほぼ１００％マトリゲルに転写されたことを位相差顕微鏡観察で確認した。
【００８９】
（比較例１）
（細胞培養用基板の作製）
実施例１で用いたガラスをＵＶ洗浄し、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、実施例１と同条件で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはコンフルエントの状態で接着していた。
【００９０】
（細胞転写）
実施例１と同様に、ｂＥＣがマトリゲルに接触している状態で数分保持し、次いで０．３％血清を含むＭＥＭ培地を培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。２時間後、細胞培養用基板を剥がす操作をしたところ、ｂＥＣは転写されなかった。別の試料をさらに２．５時間、合計４．５時間培養した後に細胞培養用基板を剥がす操作をしたところ、細胞転写率は２０％であった。
【００９１】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、ＵＶ洗浄し高圧水蒸気滅菌した後のガラス基板を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした。酸素と結合している炭素の割合は３２．０％であった。
【００９２】
（実施例２）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン１９．５ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）６．８ｇを混合し、この混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。あらかじめＵＶ洗浄した１０ｃｍ角のガラス基板を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１４時間室温で放置した。次いで、このエポキシ化ガラス基板をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は、５１．４°であった。
【００９３】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）２５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ化基板をＴＥＧに浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【００９４】
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、幅６０μｍの開口部が３００μｍピッチで形成されたラインパターンに２．５ｃｍ間隔で左記ラインパターンに直交する幅６０μｍのライン状の開口部が形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。７５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【００９５】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、ベースのガラス基板、酸化処理前の親水性薄膜、酸化処理後の親水性薄膜の領域（上記フォトマスク周囲の幅約１．５ｃｍの開口部の領域）を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の８９．９％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は親水性薄膜の酸化処理されていない領域では７１．９％、親水性薄膜の酸化処理された領域では４７．６％であった。なお基材として用いたガラスを測定したところ、酸素に結合した炭素の割合は、３０．２％であった。
【００９６】
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、基板一枚あたり１．５×１０５個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を播種した。正常ヒト血管内皮細胞増殖用低血清培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用い、最終細胞濃度が１．２×１０５個／ｍｌになるようにした。３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣは酸化処理された部分にのみコンフルエントな状態で接着していた。
【００９７】
（細胞転写）
氷上に培養容器を配置し、培養容器内に成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）を２００μｌ添加し、４℃に冷やしたセルスクレイパーで細胞接着基板と同程度の大きさにマトリゲルを広げた。その後、培養容器を室温で約５分放置し、マトリゲルをゲル化させた。ゲル化させたマトリゲルの上に細胞接着基板を細胞接着面がマトリゲルと対向するように静かに配置した。細胞パターンがマトリゲルに接触している状態で数分保持した。その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に加えた。３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。３０分後、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを位相差顕微鏡観察で確認した。細胞培養用基板のみを簡単に剥がすことができた。ＨＵＶＥＣは、ほぼ１００％マトリゲルに転写され、そのチューブ状の形態もほとんど乱れなかったことを位相差顕微鏡観察で確認した。
【００９８】
（実施例３）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４８．９°であった。
【００９９】
（二段階目の反応）
５０ｇのＴＥＧを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１００】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１０１】
（表面分析）
KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)を用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の６３．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、親水性薄膜の酸化処理されていない領域では７１．９％および親水性薄膜の酸化処理された領域では６２．６％であった。
【０１０２】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４０時間培養し、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１０３】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを培養容器上に広げ、室温で約１分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置し、完全にゲル化させた後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。２時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンの幅が数十％程度減少していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。インキュベーターに戻しさらに１時間培養すると、ｂＥＣはゲル内でチューブ上の構造体へと分化していた。
【０１０４】
（実施例４）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４７．２°であった。
【０１０５】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の有機薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで２５秒間露光し、基板表面の有機薄膜を部分的に酸化分解した。酸化処理後における、マスクの周囲の１．５ｃｍ幅の開口部に相対していた領域の基板表面の水接触角の値は３９．７°であった。
【０１０６】
（二段階目の反応）
５０ｇのテトラエチレングリコールを攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌した後、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、炭素濃度が相対的に異なる２種類の領域からなる親水性薄膜がガラス基板表面に形成された。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１０７】
（表面分析）
KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)を用いて、酸化分解されなかった領域に形成された親水性薄膜と酸化分解された領域に形成された親水性薄膜の元素分析を行った。酸化処理された領域、すなわち親水性材料密度が低い領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域、すなわち親水性材料密度が高い領域の親水性薄膜の炭素量の９１．２％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域、すなわち親水性材料密度が高い領域では７５．１％、酸化処理された領域、すなわち親水性材料密度が低い領域では７０．１％であった。
【０１０８】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４０時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１０９】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを培養容器上に広げ、室温で約１分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置し、完全にゲル化させた後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。１時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンの幅が数十％程度減少していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。インキュベーターに戻しさらに１時間培養すると、ｂＥＣはゲル内でチューブ上の構造体へ分化していた。
【０１１０】
（実施例５）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４９．８°であった。
【０１１１】
（二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１１２】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１１３】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の８４．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域では７２．５％、酸化処理された領域では７７．１％であった。
【０１１４】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で２４時間培養し、位相差顕微鏡で観察ところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１１５】
（実施例６）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は５２．０°であった。
【０１１６】
（二段階目の反応）
５０ｇのＴＥＧを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌を続けた後、全量をガラス皿に移した。ここに上記のシラン処理された基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１１７】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで１００秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１１８】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の６１．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域では７１．９％、酸化処理された領域では４４．５％であった。
【０１１９】
（ＢＳＡ−ＦＩＴＣのパターン吸着）
ＰＢＳバッファーを用いて２０μｇ/ｍｌ ＢＳＡ−ＦＩＴＣを２ｍｌ調製し、３５ｍｍディッシュに移した。ここに上記の基板を親水性薄膜が上向きとなるように浸漬し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で一晩放置した。基板をＰＢＳで２回洗浄した後、蛍光顕微鏡で基板表面を観察したところ、明瞭な蛍光パターンが観察された。これは、酸化処理された領域にのみＢＳＡ−ＦＩＴＣが吸着したためである。
【０１２０】
（実施例７）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。
【０１２１】
（二段階目の反応）
ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ、アルドリッチ製）１０ｇに重合開始剤２，２’−ジメトキシ−２−フェニル−アセトフェノン（ＤＭＰＡ、アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。平均乾燥膜厚は、０．３３μｍであった。
【０１２２】
（酸化処理）
実施例２で用いたフォトマスクと同じパターンを有する光触媒化されていない一般的なフォトマスクを用いた。マスクをＰＥＧｄＡ化基板のＰＥＧｄＡ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。基板を２．５ｃｍ角に切断し細胞培養に用いた。
【０１２３】
（細胞培養）
７０％エタノールで滅菌処理した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、８．３×１０４個／ｃｍ２のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４３時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはＰＥＧｄＡ膜の酸化処理された領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１２４】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）４００μｌをセルスクレイパーを用いて培養容器上に広げ、室温で約３分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置した後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。５時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。
【０１２５】
（実施例８）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．９６ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。
【０１２６】
（二段階目の反応）
ＰＥＧｄＡ（アルドリッチ製）８ｇと１−ビニル２−ピロリドン（ＶＰ、東京化成製）２ｇの混合物に重合開始剤ＤＭＰＡ（アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ−ＶＰ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。平均乾燥膜厚は、０．２８μｍであった。
【０１２７】
（酸化処理）
実施例２で用いたフォトマスクと同じパターンを有する光触媒化されていない一般的なフォトマスクを用いた。マスクをＰＥＧｄＡ−ＶＰ化基板のＰＥＧｄＡ−ＶＰ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ−ＶＰ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。基板を２．５ｃｍ角に切断し細胞培養に用いた。
【０１２８】
（細胞培養）
７０％エタノールで滅菌処理した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、８．３×１０４個／ｃｍ２のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４３時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはＰＥＧｄＡ−ＶＰ膜の酸化処理された領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１２９】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）４００μｌをセルスクレイパーを用いて培養容器上に広げ、室温で約３分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置した後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。５時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。
【０１３０】
（実施例９）
（細胞培養用ディッシュの作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを２２５μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角、厚さ０．１ｍｍのガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は、４９．８°であった。
【０１３１】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール２５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ処理された基板を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、８０℃で６０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【０１３２】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が１８．６ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで１８８秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２１ｍｍ×２１ｍｍの大きさに切断した。
【０１３３】
（パターン培養用ディッシュ）
底の中央部に直径１４ｍｍの穴があいた直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（コーニング製）を用いた。上記の厚さ０．１ｍｍの細胞培養用基板をディッシュの底の穴を塞ぐように、接着剤ＫＥ４５Ｔ（信越シリコーン製）を用いて貼りつけた。３５℃で４時間乾燥させ、さらに室温で二日間乾燥させた。７０％エタノールで滅菌し、リン酸緩衝液で洗浄した。
【０１３４】
（細胞培養）
２×１０５個のｂＥＣを２．５ｍｌの５％ウシ血清入りＭＥＭ培地に懸濁し上記パターン培養用ディッシュに播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で６８時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは基板の酸化処理された部分にのみ接着していた。
【０１３５】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを直径２３ｍｍの組織培養用プラスチックシート（和光純薬製）上に直径１５ｍｍ程度に広げ、室温で約１０分間放置した。ディッシュ内の培地を吸引除去し、マトリゲルが載ったプラスチックシートをマトリゲルがディッシュ底面上のパターン培養された細胞と相対するように静かに置いた。ディッシュの蓋をし、約５分間室温で放置した後、０．３％ウシ血清入りＭＥＭ培地を２．５ｍｌ加え、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３時間培養を行った。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このときプラスチックシートを剥がしてみると、ｂＥＣはすべてプラスチックシート上のマトリゲルに移っていた。
【０１３６】
（実施例１０）
（線維芽細胞の培養）
６ｃｍディッシュを使い、マウス胚の線維芽細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて培養した。１００％コンフルエントになってから、さらに２４時間培養を続けた。
【０１３７】
（ウシ血管内皮細胞の蛍光染色）
ウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を蛍光色素ＰＫＨ２６（アルドリッチ製）を使って染色した。染色方法はメーカーのプロトコルシートに則って行った。
【０１３８】
（蛍光染色したｂＥＣのパターン培養）
実施例９で作製した厚さ０．１ｍｍの細胞培養用基板を用いて、蛍光染色したｂＥＣを５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を用いてインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４８時間パターン培養した。位相差顕微鏡観察により細胞パターンが良好であることを確認した。また、蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣが良く染まっていることを確認した。
【０１３９】
（細胞転写）
上記線維芽細胞を培養しているディッシュから培地を吸引除去し、上記蛍光染色ｂＥＣをパターン培養した基板を、線維芽細胞シートとパターン培養されたｂＥＣが相対するように配置し、ディッシュの蓋をし、インキュベータ内で１０分間保持した。その後、ディッシュ内に、基板を動かさないよう注意して静かに０．３％ウシ血清含有ＭＥＭ培地を加え、さらにインキュベータ内で６時間培養した。蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣパターンの幅が５０％程度細くなっていることを確認した。また、細胞培養用基板を注意深く剥離したところ、細胞培養用基板にはｂＥＣは残っておらず、ｂＥＣパターンは線維芽細胞シート上に転写されたことを顕微鏡観察により確認した。
【０１４０】
（実施例１１）
（親水性薄膜が形成された基板）
実施例２で作製した基板を用いた。
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、幅６０μｍの開口部が１４０μｍ間隔でライン状に配置されたパターンが形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチフォトマスクを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。７５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１４１】
（細胞培養および細胞転写）
ＨＵＶＥＣを用い実施例２と同様に実験を行った。細胞パターン密度が高くても、実施例２と同様に３０分でＨＵＶＥＣがマトリゲルに転写されることを確認した。
【０１４２】
（実施例１２）
（親水性薄膜が形成された基板）
実施例１で作製した基板を用いた。
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、１００μｍ角の開口部が１００μｍ間隔で配置されたパターンが形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチフォトマスクを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。２５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１４３】
（細胞培養および細胞転写）
ｂＥＣを用い実施例１と同様に実験を行った。１００μｍ角の桝目状の細胞パターンでも実施例１と同様に２時間でｂＥＣがマトリゲルに転写されることを確認した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着培養させた細胞を細胞シート、臓器、タンパク質シートなどに対して生きたまま転写することができる、細胞の加工や再生医療などに用いるための、細胞培養用基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。さらに、近年、生体外で細胞を培養する工程を経て患者に培養細胞や培養組織を移植する再生医療の研究が盛んに行われている。
【０００３】
一部の細胞（特に多くの動物細胞）は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にし、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
【０００４】
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
【０００６】
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００７】
しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
【０００８】
さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ Ｍ，ホワイトサイズ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。
【０００９】
最近、細胞をパターンで培養した後に、その細胞を生きたまま組織や臓器などに転写する技術ならびにその技術を用いた組織体が報告された（特許文献８、特許文献９）。しかしながら、この技術では、細胞を転写するのに時間がかかるため、細胞の活性を落とさないための操作が煩雑であるなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平２−２４５１８１号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献４】米国特許第５，５１２，１３１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９００，１６０号明細書
【特許文献６】特開平９−２４０１２５号公報
【特許文献７】特開平１０−１２５４５号公報
【特許文献８】特開２００５−３４２１１２号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００５／０３８０１１パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞シート、まばらな接着細胞、細胞コロニー、細胞ネットワーク、細胞パターン等を、細胞シート、組織、臓器、器官、タンパク質シート等に高速で転写することを可能にする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
（２）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されており、
細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
（３）分解処理が酸化または紫外線照射による分解処理である（１）または（２）記載の細胞培養用基板。
【００１３】
（４）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低いことを特徴とする細胞培養用基板。
（５）基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞接着阻害性領域における前記有機化合物の密度と比較して低いことを特徴とする細胞培養用基板。
（６）細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることを特徴とする（２）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
【００１４】
（７）細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることを特徴とする（２）〜（６）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
（８）炭素酸素結合を有する有機化合物がアルキレングリコール系材料である（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞培養用基板。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板。
【００１５】
（１０）（９）記載の細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む、組織体の作成方法。
（１１）前記工程が複数回行われることを特徴とする（１０）記載の方法。
（１２）（１０）または（１１）記載の方法により作成された組織体。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、細胞シート、まばらな接着細胞、細胞コロニー、細胞ネットワーク、細胞パターン等を、細胞シート、組織、臓器、器官、タンパク質シート等に高速で転写することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は細胞接着基板の作成手順を示す。
【図２】図２は細胞接着基板から対象材料への細胞の転写および培養の手順を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の細胞培養用基板は、基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備えることを特徴とする。
【００１９】
基材表面には、細胞接着性領域だけでなく、細胞接着阻害性領域も形成されていることが好ましい。そして、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。
【００２０】
本発明において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。細胞接着性領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味し、細胞接着阻害性領域とは、細胞の接着性が悪い領域を意味する。従って、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、細胞培養用基板表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
【００２１】
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性が良好とは、ある種の細胞に対する細胞接着性が良好であることを意味する。従って、細胞培養用基板上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。
【００２２】
本発明の細胞培養用基板は、細胞接着性領域の構造に特徴を有する。本発明において、細胞接着性領域の構造は２つの形態に大別することができる。
【００２３】
第一の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されている形態である。この形態では、基材の表面全体に炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理および／または分解処理を施すことにより当該領域に細胞接着性を付与して細胞接着性領域に改変する。前記処理を施さない部分は細胞接着阻害性領域である。細胞接着阻害性の親水性膜の表面の全体に対して酸化処理および／または分解処理を施せば、表面に細胞接着性領域のみを有する細胞培養用基板となる。
【００２４】
第二の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜で形成されている形態である。この形態は、炭素酸素結合を有する有機化合物を高密度で含む親水性膜が細胞接着阻害性を有するのに対して、前記化合物を低密度で含む親水性膜は細胞接着性を有することを利用したものである。基材表面に前記化合物が結合しやすい第一領域と結合しにくい第二領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第一領域は細胞接着阻害性領域となり、第二領域は細胞接着性領域となる。
【００２５】
以下の説明は、特に断りのない限り上記２つの形態のいずれにも適用される。
（基材）
本発明の細胞培養用基板に用いられる基材としては、その表面に炭素酸素結合を有する有機化合物の皮膜を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではない。具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
【００２６】
（細胞接着阻害性領域）
細胞接着阻害性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化および／または分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。
【００２７】
本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。
【００２８】
主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材と物理的または化学的に結合することにより親水性薄膜となる。
【００２９】
具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリメタクリル酸およびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類、等を挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Pluronic F108、Pluronic F127、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体、デキストラン、およびヘパリンが挙げられるがこれらには限定されない。
【００３０】
具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、アクリルアミドオリゴマーおよびその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物およびその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミドおよびその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−〔メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピルトリメトキシシラン、およびトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオールが挙げられるがこれらには限定されない。
【００３１】
親水性膜は、処理前は高い細胞接着阻害性を有し、酸化処理および／または分解処理後は弱い細胞接着性を示すものであることが望ましい。
【００３２】
親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基板表面の親水性薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。
【００３３】
基材表面への親水性膜の形成方法としては、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材への密着性を高めるために多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、基板表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。
【００３４】
上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、並びに、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、親水性有機化合物の基材へ密着性を高めることが容易だからである。本明細書では「結合層」という用語を用いる。結合層とは、多段階式に親水性有機化合物の薄膜を形成する場合には最表面の親水性薄膜層と基板との間に存在する層を意味し、基材表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性薄膜層を形成する場合には当該下地層を意味する。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれがリンカーであっても良い。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、基板上にリンカーを有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を例にとると、エポキシシランを付加した基板表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上であれば、次に酸触媒存在下エチレングリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する基板を作ることができる。
【００３５】
（親水性膜の酸化処理および／または分解処理による細胞接着性領域の形成）
本発明の第一の形態では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜により形成される。こうして形成された細胞接着性領域は細胞を接着する能力が比較的弱いために、当該領域上に接着した細胞は、タンパク質シート、細胞シート、組織、臓器などの細胞と相互作用が比較的強い材料に対して高速に転写することが可能である。
【００３６】
本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。
【００３７】
本発明において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。
【００３８】
紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。
【００３９】
以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理および／または分解処理」という用語を使用する。
【００４０】
酸化処理および／または分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。親水性膜全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に酸化処理および／または分解処理してもよい。部分的に酸化処理および／または分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。
【００４１】
紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプなどのＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いると良い。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度などの諸条件に応じて適宜決定することができる。
【００４２】
（親水性膜の低密度化による細胞接着性領域の形成）
本発明の第二の形態では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜により形成される。こうして形成された細胞接着性領域もまた細胞を接着する能力が比較的弱いために、当該領域上に接着した細胞は、タンパク質シート、細胞シート、組織、臓器などの細胞と相互作用が比較的強い材料に対して高速に転写することが可能である。
【００４３】
本発明のこの形態では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とは、ともに炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている。２つの領域は前記有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。一方、細胞接着阻害性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できない程度に高い。
【００４４】
親水性有機化合物の密度を制御する方法としては、親水性有機化合物の薄膜と基材表面との間に結合層を設け、当該結合層の親水性有機化合物との結合力を調整する方法が挙げられる。ここで「結合層」とは上記で定義した通りであり、上記で説明した好ましい材料から構成され得る。結合層の結合力は、結合層におけるリンカーを有する材料の密度が高いほど強くなり、同密度が低いほど弱くなる。結合層におけるリンカーを有する材料の密度は、上述の通り、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。
【００４５】
本発明のこの実施形態では、細胞接着性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は低い。細胞接着性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、リンカーを有する材料の被膜（結合層）を基材表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理および／または分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理および／または分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理および／または分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いることにより行うことができる。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化処理および／または分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理および／または分解処理による細胞接着性領域の形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着性領域が形成できる。
【００４６】
本発明のこの実施形態では、細胞接着阻害性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は高い。細胞接着阻害性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、リンカーを有する材料の被膜を基材表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理および／または分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着阻害性領域が形成できる。
【００４７】
（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域との比較）
以下の説明は上記の２つの形態のどちらにも適用される。
細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（atomic concentration、 ％）」は下記に定義する通りである。
【００４８】
また、細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（atomic concentration、％）」は下記に定義する通りである。
【００４９】
（親水性薄膜の評価方法）
本発明の親水性薄膜（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（atomic concentration、％）で算出される。以下、本発明におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
【００５０】
（親水性薄膜の炭素量の算出方法、および酸素と結合している炭素の割合の算出方法）
本発明において親水性薄膜の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本発明において親水性薄膜の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。以下に具体的な測定方法を２つ記載する。なお、本発明は、これらの測定方法に限定されるものではない。
【００５１】
（測定方法１）
Ｘ線光電子分光装置：サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probe。
Ｘ線源：単色化アルミニウムＫα線（15kV-6.67mA=100W）。
測定面積：400μｍφ
試料と検出器の位置関係：試料法線から53°の位置に光電子取り込みレンズが存在。
炭素量：基材や親水性薄膜を構成する元素を想定し、測定する光電子のセットを決める。測定したトータルの光電子を１００％とした時の各光電子由来の元素濃度（atomic concentration）を算出する。Ｃ１ｓピークの元素濃度（atomic concentration ％）を炭素量とする。
Ｃ１ｓピークのフィッティング方法：Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合、Ｃ−Ｃ結合でフィッティングする。
酸素と結合している炭素の割合の算出式：{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕}÷{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ−Ｃ結合の炭素の割合〕＋〔（必要の場合）その他の結合の炭素の割合〕}×１００（％）。
なお、必要の場合は、その他の結合も加えてフィッティングする。このデータを基にＣ１ｓピークの各結合状態の炭素の濃度（atomic concentration ％）を算出する。
【００５２】
（測定方法２）
Ｘ線光電子分光装置：KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)。
Ｘ線源：非単色化マグネシウムＫα線（10kV-20mA＝200W）。
測定面積：6mmφ
試料と検出器の位置関係：試料法線上に光電子取り込みレンズが存在。
炭素量：基材や親水性薄膜を構成する元素を想定し、測定する光電子のセットを決める。測定したトータルの光電子を１００％とした時の各光電子由来の元素濃度（atomic concentration）を算出する。Ｃ１ｓピークの元素濃度（atomic concentration ％）を炭素量とする。
Ｃ１ｓピークのフィッティング方法：Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合、Ｃ−Ｃ結合でフィッティングする。
酸素と結合している炭素の割合の算出式：{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕}÷{〔Ｃ−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ＝Ｏ結合の炭素の割合〕＋〔Ｃ−Ｃ結合の炭素の割合〕＋〔（必要の場合）その他の結合の炭素の割合〕}×１００（％）。
【００５３】
なお、必要の場合は、その他の結合も加えてフィッティングする。このデータを基にＣ１ｓピークの各結合状態の炭素の濃度（atomic concentration ％）を算出する。
【００５４】
（パターンの形状）
本発明の細胞培養用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の内部がすべて細胞接着性領域または細胞接着阻害性領域となっているパターンなどを形成することができる。血管内皮細胞または神経細胞を培養して組織を形成する場合は、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状の形状で細胞が接着するようなパターンを形成することが好ましい。これを被転写材料に転写して培養すると、血管内皮細胞の場合は、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状に配列されることにより組織化が促進され、血管の形成が促される。ライン状、ツリー状（樹状）、網目状または格子状のパターンを形成する場合、パターンにおける線幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは３０〜１００μｍである。特に、血管内皮細胞をライン状に配置して培養することにより毛細血管を形成する場合は、ライン状の細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを形成し、血管内皮細胞をライン状に接着させることが好ましい。このような態様においては、細胞が１〜１０個、好ましくは１〜６個収まる程度のライン幅で細胞が接着されるようなパターンを形成するのが好ましい。具体的には、細胞接着性領域のライン幅は、通常２０〜２００μｍ、好ましくは３０〜８０μｍであり、ラインとラインの間にあたる細胞接着阻害性領域のスペース幅は通常８０〜１０００μｍ、好ましくは１００〜８００μｍである。ライン幅を上記の数値範囲とすることにより、血管内皮細胞が効率的に管組織化することができる。このような細胞接着性変化パターンを形成することにより、ライン状に接着され転写された血管内皮細胞は、組織化してライン状の毛細血管を効率的に形成する。複数のラインが交わることなく並ぶような細胞パターンを形成したい場合は、細胞が接着したラインとラインの間のスペース幅を上記のように一定の値以上とすることにより、細胞が組織化する際にラインとライン間で細胞から擬足が伸びてラインにゆがみが生じるのを防ぐことができる。
【００５５】
（細胞）
細胞培養用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
【００５６】
（細胞接着基板）
本発明は、細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板を提供する。当該細胞接着基板はそれ自体製品として流通され得る。
【００５７】
細胞接着基板の作成方法を、図１を参照して説明する。図１では、基材上に細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板を使用した場合を一例として説明するが、これは説明のためのものであり、基材表面の全体が細胞接着性領域である細胞培養用基板を使用する場合もまた本発明の範囲内である。
【００５８】
図１（ａ）に示すように、細胞培養用基板の表面に細胞を均一に播き、図１（ｂ）に示すように、一定時間細胞を培養し、細胞接着阻害性領域にある余分な細胞を除去するために洗浄すると、図１（ｃ）に示すように、細胞接着性領域には細胞が接着しているが細胞接着阻害性領域には細胞が接着していない細胞パターンが形成された細胞接着基板が得られる。
【００５９】
目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。
【００６０】
細胞培養用基板への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲンおよびゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシートおよびプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。
【００６１】
予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。
【００６２】
上記のように予備培養した細胞を、図１（ａ）に示すように、培養液中の細胞培養用基板上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞培養用基板上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基板１ｃｍ２当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。細胞が凝集すると細胞の組織化が阻害され、対象材料に転写して培養しても機能が低下するからである。具体的には、４００ｍｍ２あたり２×１０５個程度で播種する。
【００６３】
細胞を播種した細胞培養用基板を培養液中で培養することにより、細胞を細胞接着性領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。
【００６４】
図１（ｂ）に示すように、細胞を培養する工程は、細胞培養用基板の細胞接着性領域に細胞を接着することを目的とする。培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。適度な時間で培養することによって、洗い流したときに細胞培養用基板の細胞接着阻害性領域の細胞が流されるとともに、細胞接着性領域の細胞は適切な接着力で細胞培養用基板上に残るため、残った細胞を対象材料に容易に転写することが可能になる。
【００６５】
培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞培養用基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着性領域に細胞が接着した本発明の細胞接着基板を作成することができる。
【００６６】
（細胞接着基板の使用方法）
上記の手順で作成された細胞接着基板を用いた対象材料への細胞の転写および転写後の細胞の培養方法について説明する。図２では、転写の対象材料として、表面に細胞培養層が設けられた基材を用い、細胞として血管内皮細胞を用いた場合について図示するが、これは例示のためであり、本発明はこの態様には限定されない。
【００６７】
図２（ａ）に示すように、細胞培養用基板の細胞接着性領域に細胞が接着している細胞接着基板を対象材料の細胞培養層に密着させる。次いで、図２（ｂ）に示すように、細胞を培養することで対象材料の細胞培養層に細胞を接着させる。さらに、細胞の細胞接着性領域への接着力は、細胞培養層への接着力に比べて小さいことから、図２（ｃ）に示すように、細胞培養用基板を対象材料から剥離すると、対象材料に細胞が転写される。この転写された細胞をさらに培養すると、図２（ｄ）に示すように細胞が機能化され、血管内皮細胞であれば環状構造が再現される。
【００６８】
細胞が転写される対象材料としては、細胞を接着可能かつ培養可能なものであれば特に制限されないが、細胞培養用基板の細胞接着性領域よりも細胞に対する接着性が強い表面を有するものが好ましい。例えば、細胞の組織化を安定的に行う為には対象材料の表面が柔らかく、また細胞被接着性が高すぎないものが望ましいことが次の参考文献に示されている。Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: Role of extracellular matrix. Donald E. Ingber 他、J. of cell biol. (1989) p.317。特に好ましくは、以下に詳述するとおり、細胞シート、組織、器官、臓器、タンパク質シート、生体由来ゲル、タンパク質コーティング等を対象材料とすることができる。
【００６９】
好適な対象材料としては、コラーゲンシート、フィブリンシート、エラスチンシート、羊膜などを用いることができる。また、基材上に、後述の細胞培養層を設ける場合は、基材の材料は、細胞培養層上の細胞の培養を阻害しない材料であればよく、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ（グリセロール−セバケート）などを用いることができる。細胞培養用基板に用いられる基材について例示したものを使用することもできる。
【００７０】
細胞培養層は、その表面に細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質や細胞接着因子を含むことが好ましい。具体的には、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、ペプチドおよびインテグリン等の細胞外基質を挙げることができ、これらは1種のみを用いても、２種以上併用してもよい。細胞接着性が高いという点で、各種コラーゲンを用いることがより好ましく、各種コラーゲンの中でも、タイプIコラーゲンやタイプIVコラーゲンを用いることが特に好ましい。骨芽細胞などの細胞外基質産生細胞を培養して細胞外基質を生成させることにより細胞培養層を形成することもできる。
【００７１】
対象材料の形状は、特に限定されるわけではなく、細胞を転写できる表面を備えていればよい。例えば、ペトリ皿やマルチデッシュなどの培養皿を用いることができる。また、ガラスや上述のプラスチックからなる培養プレートを用いることもできる。
【００７２】
細胞接着基板から対象材料への細胞の転写は、細胞接着基板の細胞接着面と対象材料の表面、例えば細胞培養層とを接触させることにより実施できる。このように細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で、培養することにより細胞を転写することができる。培養は、用いる基板や細胞によって適当な条件を選択することができるが、通常、ＣＯ２濃度５％、３７℃で、１５分〜９６時間、好ましくは３０分〜３６時間行う。
【００７３】
その後、培養液中で細胞培養を行うが、細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で細胞培養を行ってもよいし、細胞接着基板を取り除いて対象材料のみで細胞培養を行ってもよい。細胞接着基板と対象材料とを接触させた状態で一定時間細胞培養を行った後、細胞接着基板を取り除いてさらに細胞培養を行うのが好ましい。培養条件としては、特に制限はなく、培養する細胞種によって選択することができる。培養液としては、上記と同様のものを使用することができる。
【００７４】
本発明の細胞接着基板は、パターン状に接着している細胞を対象材料にパターン化された状態で容易に転写することができるとともに、転写した後は洗浄して再び細胞を播種する細胞培養用基板とすることができるため、再度細胞パターンを形成し、これを転写して培養することができる。従って、細胞パターンを安価かつ効率的に作成することができる。また、対象材料には、特別のパターンを形成させる必要がないので、細胞培養のために通常用いられるものを使用でき、材料選択の幅も広がるとともに、現像液などの細胞にとって有害な物質の影響を受けることもない。
【００７５】
対象材料には、生体材料も含まれる。生体材料とは生体由来の材料を意味し、例えば生体由来の組織、器官等が含まれる。具体的には、肺、心臓、肝臓、腎臓、脳、胃、小腸、大腸等の臓器、骨、軟骨、皮膚、筋肉、眼球、舌、腹膜等の組織などが挙げられる。また、細胞シートやスフェロイドなどの細胞集合体もまた対象材料として使用することができる。細胞集合体を構成する細胞としては、細胞外基質を産生する細胞、例えば、間質系細胞、上皮細胞、実質細胞などが挙げられる。具体的には、骨芽細胞、線維芽細胞、肝実質細胞、フィーダー細胞等の集合体を好ましく使用できる。
【００７６】
細胞培養用基板上の細胞をこれらの生体材料に直接転写することにより、組織または器官上で直接細胞をパターン状に培養することができる。細胞が転写される生体材料と該生体材料に転写されて培養される細胞との組合せとしては、例えば、肝臓と血管内皮細胞、真皮と血管内皮細胞、骨芽細胞層と血管内皮細胞、線維芽細胞層と肝実質細胞、内皮細胞層と肝実質細胞、フィーダー細胞層と角膜上皮細胞が挙げられる。
【００７７】
このような態様においては、器官等の生体材料に直接細胞を転写して培養できることから、細胞培養用の担体から細胞を酵素処理等により剥がして回収する必要がなく、細胞の損傷を防ぐことができる。
【００７８】
臓器移植においては、移植後、当該臓器の表面に毛細血管が形成されるが、この毛細血管を移植する臓器の表面に予め形成させてから移植することにより、移植を効果的に行う技術が知られている。しかし、移植前に毛細血管を形成しこれを臓器表面に付着させる従来技術の方法では、毛細血管の作成に時間がかかり迅速な移植が不可能である。さらに、培養用基材等で予め形成した血管を基材から剥がして臓器表面に移す際に組織が損傷する。本発明の方法では、細胞接着基板にパターン状に配置された細胞を臓器表面に転写した後、毛細血管が完全に形成されるのを待たずに移植を行うことができるので、迅速な移植が可能になる。臓器表面に線状または網目状に転写された血管内皮細胞は組織化されやすいので、体内における毛細血管の形成が促進される。さらに、本発明では、細胞を移す際に、細胞培養用基板から細胞を剥がすための処理が不要であるため、組織の損傷が問題となることもない。さらに、本発明では、転写が迅速に行われるため組織または器官への悪影響が少ない。
【００７９】
転写した細胞の培養においては、必要に応じて、細胞刺激因子を添加することにより、細胞活性を高めたり、細胞が本来有する機能を発現させ組織化を促進することができる。細胞刺激因子としては、細胞の組織化を促進する活性を有する物質であればいずれも使用でき、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）等が挙げられる。
【００８０】
細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程は複数回行い、多層構造の組織体を作成することが可能である。
【００８１】
本発明はまた、上述の手順により、細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む方法により作成された組織体に関する。転写工程が複数回行われる場合、作成される組織体は多層構造を有する。転写の対象材料が生体組織または器官である場合は、これらの組織または器官上に形成された組織体もまた本発明の範囲に包含される。
【００８２】
本発明はまた、被検体由来の細胞を本発明の細胞培養用基板にパターン状に接着した後、これを被検体の生体組織、例えば上記のような臓器、皮膚および骨等の表面にパターン化された状態で転写し、該細胞を増殖させることにより被検体の組織を再生する方法に関する。被検体としては、特に限定されないが、例えば哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。例えば、本発明の方法により真皮繊維芽細胞や上皮細胞を生体における皮膚損傷部分に直接転写して細胞を増殖させることにより、被検体において皮膚組織を再生することができる。また、被検体において皮膚が損傷した部分に、血管内皮細胞をパターン状に転写して増殖させることにより毛細血管を形成させて、皮膚の再生を促すことも可能である。さらに、神経細胞をパターン状に配列して培養することにより、神経回路や神経細胞コンピューターを作成することも可能になる。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、この混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。あらかじめＵＶ洗浄した１０ｃｍ角のガラス基板を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１２時間室温で放置した。その後、下地処理されたガラス基板をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。成膜後の基板表面の水の接触角の平均値は５０．２°であった。
【００８４】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール５０ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ処理された基板を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【００８５】
（酸化処理）
酸化チタン系光触媒を塗布した石英板を作製した。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記光触媒付き石英板を、親水性薄膜と石英板の光触媒層が対向するように配置し、石英板の裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。２５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【００８６】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、酸化処理前の親水性薄膜、酸化処理後の親水性薄膜を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした酸化処理後の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理前の親水性薄膜の炭素量の９２．２％であった。酸化処理前の親水性薄膜における酸素と結合している炭素の割合は６０．８％、酸化処理後の親水性薄膜における酸素と結合している炭素の割合は５９．２％であった。
【００８７】
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、基板一枚あたり２．６×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。５％血清を含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはコンフルエントの状態で接着していた。
【００８８】
（細胞転写）
氷上に培養容器を配置し、培養容器内に成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）を２００μｌ添加し、４℃に冷やしたセルスクレイパーで細胞接着基板と同程度の大きさにマトリゲルを広げた。その後、培養容器を室温で約５分放置し、マトリゲルをゲル化させた。ゲル化させたマトリゲルの上に細胞接着基板を細胞接着面がマトリゲルと対向するように静かに配置した。ｂＥＣがマトリゲルに接触している状態で数分保持した。その後、０．３％血清を含むＭＥＭ培地を培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。２時間後、細胞培養用基板のみを簡単に剥がすことができた。ｂＥＣがほぼ１００％マトリゲルに転写されたことを位相差顕微鏡観察で確認した。
【００８９】
（比較例１）
（細胞培養用基板の作製）
実施例１で用いたガラスをＵＶ洗浄し、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、実施例１と同条件で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはコンフルエントの状態で接着していた。
【００９０】
（細胞転写）
実施例１と同様に、ｂＥＣがマトリゲルに接触している状態で数分保持し、次いで０．３％血清を含むＭＥＭ培地を培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。２時間後、細胞培養用基板を剥がす操作をしたところ、ｂＥＣは転写されなかった。別の試料をさらに２．５時間、合計４．５時間培養した後に細胞培養用基板を剥がす操作をしたところ、細胞転写率は２０％であった。
【００９１】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、ＵＶ洗浄し高圧水蒸気滅菌した後のガラス基板を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした。酸素と結合している炭素の割合は３２．０％であった。
【００９２】
（実施例２）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン１９．５ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）６．８ｇを混合し、この混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。あらかじめＵＶ洗浄した１０ｃｍ角のガラス基板を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１４時間室温で放置した。次いで、このエポキシ化ガラス基板をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は、５１．４°であった。
【００９３】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）２５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ化基板をＴＥＧに浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【００９４】
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、幅６０μｍの開口部が３００μｍピッチで形成されたラインパターンに２．５ｃｍ間隔で左記ラインパターンに直交する幅６０μｍのライン状の開口部が形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。７５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【００９５】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、ベースのガラス基板、酸化処理前の親水性薄膜、酸化処理後の親水性薄膜の領域（上記フォトマスク周囲の幅約１．５ｃｍの開口部の領域）を測定した。Ｃ１ｓピークをＣ−Ｃ結合の炭素、Ｃ−Ｏ結合の炭素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合の炭素でフィッティングした。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の８９．９％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は親水性薄膜の酸化処理されていない領域では７１．９％、親水性薄膜の酸化処理された領域では４７．６％であった。なお基材として用いたガラスを測定したところ、酸素に結合した炭素の割合は、３０．２％であった。
【００９６】
（細胞培養）
上記のように切断した基板をオートクレーブで高圧水蒸気滅菌した。この基板を培養容器に配置し、基板一枚あたり１．５×１０５個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を播種した。正常ヒト血管内皮細胞増殖用低血清培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を用い、最終細胞濃度が１．２×１０５個／ｍｌになるようにした。３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣは酸化処理された部分にのみコンフルエントな状態で接着していた。
【００９７】
（細胞転写）
氷上に培養容器を配置し、培養容器内に成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）を２００μｌ添加し、４℃に冷やしたセルスクレイパーで細胞接着基板と同程度の大きさにマトリゲルを広げた。その後、培養容器を室温で約５分放置し、マトリゲルをゲル化させた。ゲル化させたマトリゲルの上に細胞接着基板を細胞接着面がマトリゲルと対向するように静かに配置した。細胞パターンがマトリゲルに接触している状態で数分保持した。その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に加えた。３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で保持した。３０分後、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを位相差顕微鏡観察で確認した。細胞培養用基板のみを簡単に剥がすことができた。ＨＵＶＥＣは、ほぼ１００％マトリゲルに転写され、そのチューブ状の形態もほとんど乱れなかったことを位相差顕微鏡観察で確認した。
【００９８】
（実施例３）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４８．９°であった。
【００９９】
（二段階目の反応）
５０ｇのＴＥＧを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１００】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１０１】
（表面分析）
KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)を用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の６３．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、親水性薄膜の酸化処理されていない領域では７１．９％および親水性薄膜の酸化処理された領域では６２．６％であった。
【０１０２】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４０時間培養し、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１０３】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを培養容器上に広げ、室温で約１分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置し、完全にゲル化させた後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。２時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンの幅が数十％程度減少していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。インキュベーターに戻しさらに１時間培養すると、ｂＥＣはゲル内でチューブ上の構造体へと分化していた。
【０１０４】
（実施例４）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４７．２°であった。
【０１０５】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の有機薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで２５秒間露光し、基板表面の有機薄膜を部分的に酸化分解した。酸化処理後における、マスクの周囲の１．５ｃｍ幅の開口部に相対していた領域の基板表面の水接触角の値は３９．７°であった。
【０１０６】
（二段階目の反応）
５０ｇのテトラエチレングリコールを攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌した後、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、炭素濃度が相対的に異なる２種類の領域からなる親水性薄膜がガラス基板表面に形成された。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１０７】
（表面分析）
KRATOS Analytical社製のESCA-3400 (Amicus)を用いて、酸化分解されなかった領域に形成された親水性薄膜と酸化分解された領域に形成された親水性薄膜の元素分析を行った。酸化処理された領域、すなわち親水性材料密度が低い領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域、すなわち親水性材料密度が高い領域の親水性薄膜の炭素量の９１．２％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域、すなわち親水性材料密度が高い領域では７５．１％、酸化処理された領域、すなわち親水性材料密度が低い領域では７０．１％であった。
【０１０８】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４０時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１０９】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを培養容器上に広げ、室温で約１分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置し、完全にゲル化させた後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。１時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンの幅が数十％程度減少していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。インキュベーターに戻しさらに１時間培養すると、ｂＥＣはゲル内でチューブ上の構造体へ分化していた。
【０１１０】
（実施例５）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は４９．８°であった。
【０１１１】
（二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１１２】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。
【０１１３】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の８４．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域では７２．５％、酸化処理された領域では７７．１％であった。
【０１１４】
（細胞培養）
オートクレーブ滅菌した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、基板一枚あたり２．０×１０５個のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で２４時間培養し、位相差顕微鏡で観察ところ、ｂＥＣは相対的に炭素濃度の低い領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１１５】
（実施例６）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は５２．０°であった。
【０１１６】
（二段階目の反応）
５０ｇのＴＥＧを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌を続けた後、全量をガラス皿に移した。ここに上記のシラン処理された基板を浸漬し、８０℃で１５分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
【０１１７】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで１００秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１１８】
（表面分析）
サーモエレクトロン社製のVG_Theta Probeを用いて、光触媒リソグラフィによって酸化分解された領域とされなかった領域の元素分析を行った。酸化処理された領域の親水性薄膜の炭素量は、酸化処理されていない領域の親水性薄膜の炭素量の６１．８％であった。また、酸素に結合した炭素の割合は、酸化処理されていない親水性薄膜の領域では７１．９％、酸化処理された領域では４４．５％であった。
【０１１９】
（ＢＳＡ−ＦＩＴＣのパターン吸着）
ＰＢＳバッファーを用いて２０μｇ/ｍｌ ＢＳＡ−ＦＩＴＣを２ｍｌ調製し、３５ｍｍディッシュに移した。ここに上記の基板を親水性薄膜が上向きとなるように浸漬し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で一晩放置した。基板をＰＢＳで２回洗浄した後、蛍光顕微鏡で基板表面を観察したところ、明瞭な蛍光パターンが観察された。これは、酸化処理された領域にのみＢＳＡ−ＦＩＴＣが吸着したためである。
【０１２０】
（実施例７）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。
【０１２１】
（二段階目の反応）
ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ、アルドリッチ製）１０ｇに重合開始剤２，２’−ジメトキシ−２−フェニル−アセトフェノン（ＤＭＰＡ、アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。平均乾燥膜厚は、０．３３μｍであった。
【０１２２】
（酸化処理）
実施例２で用いたフォトマスクと同じパターンを有する光触媒化されていない一般的なフォトマスクを用いた。マスクをＰＥＧｄＡ化基板のＰＥＧｄＡ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。基板を２．５ｃｍ角に切断し細胞培養に用いた。
【０１２３】
（細胞培養）
７０％エタノールで滅菌処理した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、８．３×１０４個／ｃｍ２のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４３時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはＰＥＧｄＡ膜の酸化処理された領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１２４】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）４００μｌをセルスクレイパーを用いて培養容器上に広げ、室温で約３分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置した後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。５時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。
【０１２５】
（実施例８）
（細胞培養用基板の作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．９６ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。
【０１２６】
（二段階目の反応）
ＰＥＧｄＡ（アルドリッチ製）８ｇと１−ビニル２−ピロリドン（ＶＰ、東京化成製）２ｇの混合物に重合開始剤ＤＭＰＡ（アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ−ＶＰ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。平均乾燥膜厚は、０．２８μｍであった。
【０１２７】
（酸化処理）
実施例２で用いたフォトマスクと同じパターンを有する光触媒化されていない一般的なフォトマスクを用いた。マスクをＰＥＧｄＡ−ＶＰ化基板のＰＥＧｄＡ−ＶＰ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ−ＶＰ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。基板を２．５ｃｍ角に切断し細胞培養に用いた。
【０１２８】
（細胞培養）
７０％エタノールで滅菌処理した基板を培養容器内に配置し、５％ウシ血清入りＭＥＭ培地を適量添加した。ここに、８．３×１０４個／ｃｍ２のウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４３時間培養した後、位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣはＰＥＧｄＡ−ＶＰ膜の酸化処理された領域にのみ接着し、細胞パターンを形成していた。
【０１２９】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）４００μｌをセルスクレイパーを用いて培養容器上に広げ、室温で約３分間放置した後、上記の基板を細胞接着面を下にしてマトリゲルの上に静かに置いた。この状態で約５分間放置した後、ＭＥＭ培地を加えて基板を浸漬させた。培養容器をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に移し、基板とマトリゲルに挟まれた状態でｂＥＣの培養を行った。５時間後に位相差顕微鏡でｂＥＣを観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このとき基板を剥がしてみると、ｂＥＣはすべてゲル側に移っていた。
【０１３０】
（実施例９）
（細胞培養用ディッシュの作製）
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを２２５μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角、厚さ０．１ｍｍのガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。成膜後の基板表面の水接触角の平均値は、４９．８°であった。
【０１３１】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール２５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシ処理された基板を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、８０℃で６０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成されたガラス基板を作ることが出来た。
【０１３２】
（酸化処理）
実施例２で用いた光触媒付きフォトマスクを用いた。フォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が１８．６ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで１８８秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２１ｍｍ×２１ｍｍの大きさに切断した。
【０１３３】
（パターン培養用ディッシュ）
底の中央部に直径１４ｍｍの穴があいた直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（コーニング製）を用いた。上記の厚さ０．１ｍｍの細胞培養用基板をディッシュの底の穴を塞ぐように、接着剤ＫＥ４５Ｔ（信越シリコーン製）を用いて貼りつけた。３５℃で４時間乾燥させ、さらに室温で二日間乾燥させた。７０％エタノールで滅菌し、リン酸緩衝液で洗浄した。
【０１３４】
（細胞培養）
２×１０５個のｂＥＣを２．５ｍｌの５％ウシ血清入りＭＥＭ培地に懸濁し上記パターン培養用ディッシュに播種した。これをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で６８時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ｂＥＣは基板の酸化処理された部分にのみ接着していた。
【０１３５】
（細胞転写）
氷冷した成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）２００μｌを直径２３ｍｍの組織培養用プラスチックシート（和光純薬製）上に直径１５ｍｍ程度に広げ、室温で約１０分間放置した。ディッシュ内の培地を吸引除去し、マトリゲルが載ったプラスチックシートをマトリゲルがディッシュ底面上のパターン培養された細胞と相対するように静かに置いた。ディッシュの蓋をし、約５分間室温で放置した後、０．３％ウシ血清入りＭＥＭ培地を２．５ｍｌ加え、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３時間培養を行った。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞パターンは管腔状に形態変化していた。このときプラスチックシートを剥がしてみると、ｂＥＣはすべてプラスチックシート上のマトリゲルに移っていた。
【０１３６】
（実施例１０）
（線維芽細胞の培養）
６ｃｍディッシュを使い、マウス胚の線維芽細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて培養した。１００％コンフルエントになってから、さらに２４時間培養を続けた。
【０１３７】
（ウシ血管内皮細胞の蛍光染色）
ウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を蛍光色素ＰＫＨ２６（アルドリッチ製）を使って染色した。染色方法はメーカーのプロトコルシートに則って行った。
【０１３８】
（蛍光染色したｂＥＣのパターン培養）
実施例９で作製した厚さ０．１ｍｍの細胞培養用基板を用いて、蛍光染色したｂＥＣを５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を用いてインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４８時間パターン培養した。位相差顕微鏡観察により細胞パターンが良好であることを確認した。また、蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣが良く染まっていることを確認した。
【０１３９】
（細胞転写）
上記線維芽細胞を培養しているディッシュから培地を吸引除去し、上記蛍光染色ｂＥＣをパターン培養した基板を、線維芽細胞シートとパターン培養されたｂＥＣが相対するように配置し、ディッシュの蓋をし、インキュベータ内で１０分間保持した。その後、ディッシュ内に、基板を動かさないよう注意して静かに０．３％ウシ血清含有ＭＥＭ培地を加え、さらにインキュベータ内で６時間培養した。蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣパターンの幅が５０％程度細くなっていることを確認した。また、細胞培養用基板を注意深く剥離したところ、細胞培養用基板にはｂＥＣは残っておらず、ｂＥＣパターンは線維芽細胞シート上に転写されたことを顕微鏡観察により確認した。
【０１４０】
（実施例１１）
（親水性薄膜が形成された基板）
実施例２で作製した基板を用いた。
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、幅６０μｍの開口部が１４０μｍ間隔でライン状に配置されたパターンが形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチフォトマスクを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。７５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１４１】
（細胞培養および細胞転写）
ＨＵＶＥＣを用い実施例２と同様に実験を行った。細胞パターン密度が高くても、実施例２と同様に３０分でＨＵＶＥＣがマトリゲルに転写されることを確認した。
【０１４２】
（実施例１２）
（親水性薄膜が形成された基板）
実施例１で作製した基板を用いた。
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、１００μｍ角の開口部が１００μｍ間隔で配置されたパターンが形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチフォトマスクを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２０ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたガラス基板と上記触媒付きフォトマスクを、親水性薄膜とフォトマスクの触媒層が対向するように配置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。２５秒間露光し、酸化処理を行った。その後、培養に使いやすいように、２４ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断した。
【０１４３】
（細胞培養および細胞転写）
ｂＥＣを用い実施例１と同様に実験を行った。１００μｍ角の桝目状の細胞パターンでも実施例１と同様に２時間でｂＥＣがマトリゲルに転写されることを確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項２】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されており、
細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項３】
分解処理が酸化または紫外線照射による分解処理である請求項１または２記載の細胞培養用基板。
【請求項４】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
前記有機化合物は、その密度が高いほど細胞が接着しにくくなる傾向を有する、高い密度では細胞接着阻害性領域を形成可能な有機化合物であり、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低いことを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項５】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞接着阻害性領域における前記有機化合物の密度と比較して低いことを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項６】
細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項記載の細胞培養用基板。
【請求項７】
細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項記載の細胞培養用基板。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板。
【請求項９】
請求項８記載の細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む、組織体の作成方法。
【請求項１０】
前記工程が複数回行われることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項２】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および／または分解処理を施して細胞接着性とした膜で形成されており、
細胞接着阻害性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されていることを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項３】
分解処理が酸化または紫外線照射による分解処理である請求項１または２記載の細胞培養用基板。
【請求項４】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
前記有機化合物は、その密度が高いほど細胞が接着しにくくなる傾向を有する、高い密度では細胞接着阻害性領域を形成可能な有機化合物であり、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低いことを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項５】
基材と、基材表面に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とを備える細胞培養用基板であって、
細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
細胞接着性領域における前記有機化合物の密度が、細胞接着阻害性領域における前記有機化合物の密度と比較して低いことを特徴とする細胞培養用基板。
【請求項６】
細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項記載の細胞培養用基板。
【請求項７】
細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項記載の細胞培養用基板。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞培養用基板と、該細胞培養用基板の細胞接着性領域に接着された細胞とを含む細胞接着基板。
【請求項９】
請求項８記載の細胞接着基板上の細胞を対象材料に転写する工程を含む、組織体の作成方法。
【請求項１０】
前記工程が複数回行われることを特徴とする請求項９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１７５９８３（Ｐ２０１２−１７５９８３Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３７６８３（Ｐ２０１２−１３７６８３）
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００６−１４８５５２（Ｐ２００６−１４８５５２）の分割
【原出願日】平成１８年５月２９日（２００６．５．２９）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００６−１４８５５２（Ｐ２００６−１４８５５２）の分割
【原出願日】平成１８年５月２９日（２００６．５．２９）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]