細胞関連のＨＩＶの経上皮移動の低減及び防止、殺菌剤及び他の処方並びに方法
ｓｃＦｖ型抗体を含有する膣殺菌薬は、経上皮ＨＩＶの伝染を減少又は防止する。抗体として、（ｓｃＦｖ型の）抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１抗体を用いる。抗ＩＣＡＭ抗体も用いることが、好ましい。抗体は、乳酸菌の細菌性送達手段のような細菌性の送達システムを用いて、防御されるべき上皮に送達することができる。これによりＨＩＶの経上皮伝染は、初期感染の予防を含み、減少又は防止することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にＨＩＶ感染の性的伝染の対処に有効である方法に関する。特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が子宮頸部、膣、胃腸、直腸、結腸及び口腔の上皮を越えて感染するのを阻止するために、ＣＤ１８に対する抗体を用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１感染は、大多数のＨＩＶ−１の性的伝染が異性との接触の結果として世界的規模で生じているように、性的な接触を通して最も頻繁にもたらされている（Louria, D. B., J. H. Skurnick, P. Palumbo, J. D. Bogden, C. Rohowsky-Kochan, T. N. Denny, and C. A. Kennedy, 2000, HIV heterosexual transmission: a hypothesis about an additional potential determinant, Int J Infect Dis 4:110-6; Skurnick, J. H., C. A. Kennedy, G. Perez, J. Abrams, S. H. Vermund, T. Denny, T. Wright, M. A. Quinones, and D. B. Louria, 1998, Behavioral and demographic risk factors for transmission of human immunodeficiency virus type 1 in heterosexual couples: report from the Heterosexual HIV Transmission Study, Clin Infect Dis 26:855-64）。出産適齢期の女性が、ＨＩＶ−１に感染する危険性が最も高く（Davis, S. F., D. H. Rosen, S. Steinberg, P. M. Wortley, J. M. Karon, and M. Gwinn, 1998, Trends in HIV prevalence among childbearing women in the United States, 1989-1994, J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 19:158-64; Wortley, P. M., and P. L. Fleming, 1997, AIDS in women in the United States, Recent trends, Jama 278:911-6）、これが、世界的な女性、新生児、及び子供のＨＩＶ−１感染における、対応する増加をもたらしている。例えば、女性へのＨＩＶ−１の性的伝染の機構は、女性のＨＩＶ−１予防のための有力な標的として検討されている。更に、男性及び女性の直腸での使用に関する潜在的な取り組みは、その経路を介しての伝染を予防すると考えられている。
【０００３】
殺菌剤は、新たなＨＩＶ−１感染の罹患率を減少させるために用いることのできる、潜在的に女性が管理する予防的療法である。部分的に有効な殺菌剤でさえ、ＨＩＶの蔓延に対して大きな影響を及ぼす可能性があり、７３の低所得国のわずか２０％の女性が、６０％の有効度の殺菌剤を他に防御されていない全ての性的行為の半分に用いた場合、女性、男性及び子供において、３年間で２５０万のＨＩＶ感染を防げるであろうと推定される（Watts, C., W. Thompson, and L. Heise, 1998, Presented at the International Conference on AIDS, Geneva.）。
【０００４】
様々な可能性のある抗ＨＩＶ−１の殺菌剤は、現在開発及び臨床的試験の進行段階にある。しかし、それらの殺菌剤は、リスクのある人々の殆どが使用するには現実的ではない高い製造費用を必要としている。更に現在試験中の殺菌剤は、いくつかのＣＣＲ５利用の分離株に対する有効性の減少、泌尿生殖器の常在菌（normal flora）の破壊、生殖器上皮に対する毒性、発癌可能性、及び細胞関連のウィルスに対する実証のない効能を含む、いくつかの難点があり、「D'Cruz, O. J., and F. M. Uckun, 2004, Clinical development of microbicides for the prevention of HIV infection, Curr Pharm Des 10:315-36」に概説されている。マカク属のサルのＳＨＩＶの伝染に対する防御に用いられる抗ｇｐ１２０抗体の経膣的適用のような、抗体の殺菌剤としての使用は、多くの化学的化合物に関連する毒性の問題を回避できる（Veazey, R. S., R. J. Shattock, M. Pope, J. C. Kirijan, J. Jones, Q. Hu, T. Ketas, P. A. Marx, P. J. Klasse, D. R. Burton, and J. P. Moore, 2003, Prevention of virus transmission to macaque monkeys by a vaginally applied monoclonal antibody to HIV-1 gp120, Nat Med 9:343-6）。
【０００５】
ＨＩＶ−１の無細胞の伝染を標的とする化学的な又は抗体ベースの殺菌剤の設計における１つの難点は、ウィルスの表面エピトープの大きな可変性である。この難点は、細胞関連及び／又は無細胞の伝染に関係する、宿主細胞タンパク質のエピトープを標的とすることで回避することができる。以前には、宿主ＩＣＡＭ−１は、抗体ベースの殺菌剤の開発に関する有力な標的として認識されていた。抗ＩＣＡＭ−１は、インビトロでのモデルの子宮頸部上皮の細胞単層を越える、及びインビボでのＨＩＶ−１の伝染のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルの両方で、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止することが示されている。とりわけ、マウスモデルにおける結果は、マウスの上皮でのＩＣＡＭ−１の関与が、伝染を阻止するために必要であること、そして感染したヒトＰＢＭＣ接種材料ではＩＣＡＭ−１のみの阻止では、伝染を阻止するためには不十分であることを実証した（Ｃｈａｎｃｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｋ．Ｖ．Ｋｈａｎｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｇ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ａ．Ｌａｎｇａｎ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）に特異的な、乳酸菌に発現される単鎖の可変性断片（ｓｃＦｖ）は、子宮頸部上皮を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の感染を阻止する（J. Immunol 176:5627-36, 2006）を参照されたい）。
【０００６】
しかし、抗体産生の新しい方法にもかかわらず、抗体の消極的な投与に必然的に関係して、このような殺菌剤の費用は、高額になりやすい。
背景として、Ｍａｒｋｈａｍら（Johns Hopkins University）の米国特許第６，５６６，０９５号（２００３年５月２０日）「ＨＩＶの性的伝染を防止するための組成物及び方法」に、記載がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
経済的に及び臨床的に実現可能な方法で、広範囲のＨＩＶ−１の変異体の性的伝染を阻止することが可能な抗体を提供することは有益なことであるが、そのような抗体は、本発明の前には未だ提供されていない。ウィルス抗原を標的とする取り組みの何れもが抱える主要な問題は、ＨＩＶの場合に、大きな可変性であり、そして高頻度で変化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗ＣＤ１８抗体が上皮を越えてのＨＩＶ−１の伝染を阻止するという発明者らの発見を活用している。抗ＣＤ１８抗体は、従って子宮頸部上皮、膣上皮、胃腸上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮を越えてのＨＩＶ−１の伝染を防止する又は軽減する殺菌剤に用いることができ、それによりＨＩＶ−１感染に対する方法を提供することができる。また発明者らは、抗ＣＤ１８抗体が、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いることができることを見い出した。更にはこの効果を生み出す抗体の濃度は、臨床的状況において入手可能の十分に低いレベルである。
【０００９】
また本発明は、ＨＩＶ−１の伝染を阻止するために、抗ＣＤ１８抗体のｓｃＦｖを使用することも提供する。有利なことに、そのようなｓｃＦｖ（ここにおいて、抗原結合の重鎖及び軽鎖領域が、それらが機能的にＦａｂと似た態様に折り畳まれていることを確保する分子、に連結している単鎖の抗体である）は、例えば、遺伝子操作された乳酸菌、遺伝子操作された大腸菌等のような、遺伝子操作された細菌性送達システムにより分泌される様な範囲の大きさでありそしてそのような構造（即ち、複鎖ではない）である。従って、防御抗体（例えば、抗ＣＤ１８抗体のような）のｓｃＦｖを産生するために遺伝子操作された細菌（例えば、乳酸菌、大腸菌等のような）は、領域（例えば、子宮頸部領域、膣領域等のような）にコロニーを形成するのに用いることができ、そしてそのままで（in situ）ＨＩＶ感染に対する防御を提供することができる。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶ感染の性的伝染を防止する方法を提供する。本発明は、ＣＤ１８に特異的な抗体を用いる方法を提供する。ＣＤ１８は、２つのＩＣＡＭ−１インテグリン・リガンドであるＭａｃ−１及びＬＦＡ−１（その両者とも、移動細胞に存在する）のβ鎖である。本発明は、抗ＣＤ１８が上皮障壁を越えての細胞関連のウィルスの伝染を阻止できること、そして上皮表面に適用した場合、上皮の下部の感染しやすい細胞の無細胞のウィルスによる感染を阻止できることを、示すことができる発見に基づいている。理論にとらわれることなく、無細胞のウィルスに対する抗ＣＤ１８の有効性に関する例示的な要因は、ウィルスが感染すると細胞から抗原が出芽し、ウィルスが宿主抗原を捕捉することによるかもしれない。従って、本発明は、無細胞のウィルスのＨＩＶの場合のウィルス性抗原（ここにおける抗原は、高度に可変的であり、そして高頻度で変化する）を標的とする際に従来から観察される問題の解決に取り組んでいる。
【００１１】
好ましい一態様では、本発明は、ＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）曝露を受ける可能性のある上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１抗体又は両方に曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物のＨＩＶの初期感染を防止する方法を提供しており、ここにおいて、上皮を抗体に曝露する段階が、ＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染を防止するものであり、具体的には、上皮をＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組み合わせた抗ＩＣＡＭ抗体に曝露する段階を含む防止の方法；抗体を少なくとも１つの細菌性（例えば、乳酸菌等のような）送達システムを介して上皮に送達する段階を含む防止の方法；用いられる細菌性（例えば乳酸菌等のような）送達システムの量は、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である防止の方法；ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である防止の方法；細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する防止の方法；抗体が、産生物（細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組み合わせのような）として、細菌性の送達システムにより発現する防止の方法等である。
【００１２】
別の好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）曝露を受ける可能性のある上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又は両方に曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物へのＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）の経上皮伝染を阻止する方法を提供するものであり、具体的には、上皮を抗体に曝露する段階がＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止するような阻止方法；上皮経由のＨＩＶの伝染が減少する又は防止される阻止方法；ＨＩＶの性的伝染が減少する又は防止される阻止方法；ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せて抗ＩＣＡＭ抗体に上皮を曝露することを含む阻止方法；少なくとも１つの細菌性の送達システム（例えば、乳酸菌の送達システム等のような）を介して抗体を上皮へ送達することを含む阻止方法；用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である阻止方法；細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する阻止方法；ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である阻止方法；抗体が、産生物（例えば、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せのような）として、細菌性の送達システムにより発現する阻止方法等、である。
【００１３】
別の好ましい態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体（抗ＣＤ１１抗体の具体例は、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｄがある）又はその両方を含んでなる殺菌剤を提供するものであり、具体的には、抗体が細菌性の送達システムによりｓｃＦｖとして発現する殺菌剤（具体例には、例えば抗体を、少なくとも１つの乳酸菌の細菌性送達手段等を介して、防御されるべき上皮に送達することができる殺菌剤等）；少なくとも１つの抗ＩＣＡＭ抗体を更に含んでなる殺菌剤；抗ＩＣＡＭ抗体（単一又は複数）並びに抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体を一緒にした累積的な抗ＨＩＶの効果が、（個別の抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体の効果）＋（個別の抗ＩＣＡＭ抗体の効果）と、少なくとも等しい又はそれより大きい殺菌剤等、である。
【００１４】
別の好ましい態様では、本発明は、（Ａ）軽鎖の抗原結合性の可変領域及び重鎖の抗原結合性の可変領域を結合タンパク質（例えば、付着の重鎖及び軽鎖の可変領域をＣＤ１８が結合するような構造に折り畳んでいる、アミノ酸の配列を含んでなる結合タンパク質のような）に融合して、単鎖の抗体（ｓｃＦｖ）を形成すること、ここにおいて抗体の分子は同じである又は異なっていてもよく、そして抗ＣＤ１１及び抗ＣＤ１８の抗体より選ばれる；（Ｂ）細菌性の送達システム（例えば、乳酸菌の送達システム、大腸菌の送達システム、乳酸球菌の送達システム等のような）が、ＨＩＶの伝染から防御されるべき上皮を含有する環境において、段階（Ａ）の単鎖の抗体を発現する状態を形成すること；を含んでなる、殺菌剤を作成する方法を提供する。
【００１５】
別の好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ−１の経上皮の伝染を阻止する発現産生物（例えば、抗ＣＤ１８；抗ＣＤ１１；組み換え菌により発現するリガンド；等のような）を提供する。
本発明の方法、システム、産生物、組成物等は、女性及び男性に対して使用可能であり、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では、防御抗体（例えば、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１１抗体（例えば、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１１ｄ抗体）、抗ＣＤ１８抗体と抗ＣＤ１１抗体との組合せ）は、病原菌（例えば、ＨＩＶ）の上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、胃腸上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を越えての伝染を阻止するために用いる。
【００１７】
本明細書に記述の防御抗体に関して、多様な反復物（例えば、複鎖抗体、自然発生の単鎖抗体、又はそれらの断片等のような）が、本発明の実施において用いられてもよい。
【００１８】
本発明の防御抗体を、病原菌（ＨＩＶのような）の伝染阻止に用いるように上皮へ送達するために、例えば、乳酸菌送達システム、大腸菌送達システム等のような細菌性送達システムを用いることができる。用いられる他の好ましい細菌性システムは、生殖管、胃腸管（例えば末梢胃腸管のような）、口腔管等の常在菌（normal flora）として存在する細菌種に基づくものを含む。
【００１９】
乳酸菌の使用は、送達システムを構築するのに特に好ましいと見なされる。具体的には、抗体の送達システムは、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）として知られる短い表面結合又は分泌の異種タンパク質が持続してその場所で（in situ）産生されるために作り出された乳酸菌を用いて提供できる。これらのsｃＦｖは、特異的なＨＩＶ関連の標的に対して狙う抗体の可変領域に似るように折り畳むことができる。ＩＣＡＭ−１に対するsｃＦｖが、細胞関連のＨＩＶ−１のインビトロでの伝染を、７０±５％減少させることが実証されている。更に、ある重症の複合型免疫不全症のマウスを用いたインビボでの伝染では、ヒト末梢血単核細胞（Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス）に再構成されたＩＣＡＭ−１に対する抗体は、膣内に接種されたＨＩＶ−１感染細胞による伝染から最大９０％の防御を提供できる（Ｃｈａｎｃｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｋ．Ｖ．Ｋｈａｎｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｇ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ａ．Ｌａｎｇａｎ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）に特異的な乳酸菌発現性の単鎖の可変性断片（ｓｃＦｖ）が、子宮頸部上皮の単層を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の感染を阻止する」（J Immunol 176:5627-5636, 2006））。これらの検討は、この抗体が膣上皮細胞の表面でＩＣＡＭ−１と反応することを示している（データは示さず）。この観察されたインビボでの防御は、抗体の低い濃度（２０ｕｇ／ｍｌ）で達成された。この乳酸菌送達システムは、一例として記述したものであり、当業者は理解されるであろうが、多様な他の乳酸菌送達システムが構成されてもよい。例えば、「C. Kruger, Y. Hu, Q. Pan, H. Marcotte, A. Hultberg, D. Delwar, P. J. van Dalen, P. H. Pouwels, R. J. Leer, C. Kelly, C. Van Dollenweerd, J. Ma, and L. Hammartstrom, "In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producing single-chain antibodies," Nature Biotechnology, 20:702-706 (2002)」を参照されたい。
【００２０】
継続した期間にわたり抗体を恒常的に生成できる乳酸菌のその場所での（in situ）使用に関して、病原菌（例えば、ＨＩＶ）の伝染を阻止するために、十分な抗体の濃度が必要となる。その場所での（in situ）使用に関するそのような抗体濃度は、抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体、並びに付加的に抗ＩＣＡＭ抗体の使用と組合せて用いる場合、抗伝染の効果をもたらすように、提供することができる。
【００２１】
細菌性システム（例えば、乳酸菌、大腸菌）により発現する抗体は、「従来の抗体」ではなく、抗体分子（例えば、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１１抗体）の軽及び重鎖の機能的末端を結合タンパク質と遺伝子学的に融合することにより産生される単鎖抗体（sｃＦｖ）と言われる範疇のものである。結合タンパク質の使用は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Tang, Y., N. Jiang, C. Parakh, and D. Hilvert, 1996, Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology, J. Biol Chem, 271:15682-15686」を参照されたい。加えて本発明の実施では、例えば、二量体、三量体、及びsｃＦｖ四量体のような、更に結合する部位を含むsｃＦｖの変異体である変異物及び代替物を用いてもよい。例えば、「Le Gall, F., S. M. Kipriyanov, G. Moldenhauer, and M. Little, 1999, Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding, FEBS Lett 453:164-168; Lawrence, L.J., A.A. Kortt, P. Iliades, P.A. Tulloch, and P.J. Hudson, 1998, Orientation of antigen binding sites in dimeric and trimeric single chain Fv antibody fragments, FEBS Lett 425:479-484」を参照されたい。結合タンパク質として、付着した重及び軽鎖の可変領域を、目的（例えば、ＣＤ１８）の抗原が結合するような様式で折り畳むのを確保するアミノ酸の配列の何れかが用いられてもよい。
【００２２】
細菌性送達システムは、適用に応じて選択されてもよい。具体的には、乳酸菌送達システムを用いることは、経膣的に適用できる殺菌剤の製剤化に好ましいと考えられる。別の具体例として、大腸菌送達システムを用いることは、経直腸的に適用できる製品（例えば、直腸性交を介する伝染を防止する製品のような）の製剤化に好ましいと考えられる。
【００２３】
本発明の実施に関して、有効成分は、例えば、殺菌剤、遅延放出送達システム、固相システム（structure）、子宮頸部リング、スポンジ、コンドーム、ジェル、クリーム、坐薬、カプセル剤等のような、多様な形態であってよい。殺菌剤は、本発明の有効成分に関して最も好ましい製剤であるが、殺菌剤の剤型が多様であってもよいことは理解されるであろう。具体的には、防御抗体は、送達手段（例えば、遅延放出送達システムのような）を組み込んでいる、又はそこから防御抗体が徐々に放出されるような固相構造をした（例えば、防御抗体又は断片を含ませた固相物質、子宮頸部リング等のような）システムにより送達されてもよい。あるいは、防御抗体は、工場設備で製造されてもよい。更に、精製技術が実用的使用のために改良されることにより、精製した防御抗体を調製して、細菌性送達システム無しで、ジェル、子宮頸部リング、スポンジ等による投与のような、直接的に、ヒト及び哺乳動物に投与することができる。
【００２４】
有効成分の投与は、好ましくは、男性又は女性の消費者自身によってできる。具体的には、例えば、消費者による自己投与を介して、sｃＦｖを発現する細菌が凍結乾燥された形態（例えば、坐薬、カプセル剤等のような）で送達される。別の検討では、ある特定の細菌が、坐薬又はカプセル剤の形態で、冷蔵することなく最大２年間生存可能であることが示めされ、本発明による細菌性システムに関して同様の生存能力が期待できる。細菌が、永久に生き延びるとは考えられないことは理解されるであろう、従って、例えば、数日毎又は月一回のような置き換えが望ましい。本発明は、細菌の持続性を観察するための検出システムの一部として、また細菌の次なる適用が必要とされる場合の指標として、使用できるタンパク質をコードする細菌も提供する。
【００２５】
本明細書には、例示として女性又は男性の具体例が示されているが、これは本発明を限定するものではないことは理解されるべきである。本発明の方法、製品及び製剤は、男性及び女性を経上皮のＨＩＶの伝染（性交に起因するものとは別の経上皮のＨＩＶの伝染のような）から防御することにおいて有用である。
有利なことに、本発明では、細菌は、防御抗体を産生するように設計することができ、その後に、製品の製造工程が、細菌を多量に成長させること、続いて細菌をそのままでの（in situ）送達のために凍結乾燥することを単に含み、これは比較的安価に実施することができる。従って、本発明は、抗体の精製を必要とせず、そして活性な製品を合成するための複雑な化学的工程を必要としない、初期ＨＩＶ感染を予防し、そして経上皮のＨＩＶの伝染を防止する方法を有利に提供する。
（実施例）
【実施例１】
【００２６】
本実施例では、我々は、ＩＣＡＭ−１のリガンドとして、また子宮頸部上皮を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する候補物として、役目を果たすことのできるＬＦＡ−１又はＭａｃ−１分子の一本鎖である、ＣＤ１８に対する抗体を同定する。本実施例はまた、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いた、ＣＤ１８に対する抗体が、どちらか一方の抗体単独の場合よりもＨＩＶ−１に感染された細胞の移動を大きく減少させ、臨床的状況で得られる抗体の濃度にて伝染を有効に遮断することを又実証する。
【００２７】
物質及び方法
ＨＩＶ−１調製物
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD）、ＨＩＶ−１のＣＣＲ５利用の変異体を、１．０ｍｌのアリコート（１×１０６、５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌ）で購入し、液体窒素中に保管した。
ＰＢＭＣの単離及び培養
ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ勾配（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で白血球除去の血液（leukopheresed blood）（Hemapheresis Center, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MD）の遠心分離により分離した。ＰＢＭＣは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミン（以下では、ｃＲＰＭＩと言う、培地及び全ての添加剤は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから入手）、１０％の加熱非活性化されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Atlanta Biologicals, Atlanta, GA）、及び５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Sigma, St. Louis, MO）を５％のＣＯ２、３７℃にて添加したＲＰＭＩ−１６４０中で、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで４８時間培養した。４８時間後、ＰＢＭＣは、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Roche Biochemicals, Indianapolis, IN）を添加したｃＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳに移し、そして１０４ＴＣＩＤ５０ＨＩＶＢａl と共に２４時間培養した。ウィルス接種材料を、２４時間後に取り出して、細胞を温ｃＲＰＭＩで洗浄し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新しいｃＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳに加えた。培養物は、感染後（ｐｉ）３日目及び７日目に新培地に供給した。ＰＢＭＣは、感染後７〜９日目に伝染実験に用いた。
【００２８】
ヒト子宮頸部の上皮細胞のトランスウェル（transwell）培養
ヒトの、自然に形質転換した、子宮頸部の上皮細胞株ＨＴ−３（American Type Cell Culture, Rockville, MD, ATCC#HTB-32）は、ｃＲＰＭＩに関して上記のように添加した、ＭｃＣｏｙ社の５ａ培地で１０％ＦＣＳと共に培養し、３日毎に０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Mediatech）による細胞置き換えを行う定期的な置換培養を行った。子宮頸部の上皮細胞は、３．０μｍの孔の大きさを有する直径１２ｎｍのＰＣＦトランスウェル挿入物（Millipore, Bedford, MA）につき、２×１０５ｃｅｌｌｓをｃＲＰＭＩ−１０％のＦＣＳに播腫して、そして３７℃、５％ＣＯ２の条件で保持した。培地は、２〜３日毎に交換した。細胞は、７日目に分極した完全な単層をトランスウェル挿入物上に形成し、これは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）に対する細胞単層の透過性を観察して確認した。トランスウェル挿入物上の子宮頸部の上皮単層は、培養の６〜８日目の間に使用した。
【００２９】
経上皮のＨＩＶ−１の伝染
経上皮移動アッセイは、幾らかの改良を加えて、Ｂｏｍｓｅｌ（Bomsel, M., 1997, Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier, Nat Med 3:42-7）の記述のように実施した。つまり、１×１０６のＨＩＶＢａ−Ｌ感染のＰＢＭＣを、指定された抗体で処理した子宮頸部の上皮単層の頂端部に添加し、そして２４時間移動させた。ＰＢＭＣの生存率は、それらのトランスウェルへの添加に先行して、トリパンブルー排除法（Sigma）により評価し、常に＞８５％であることを見出した。頂端部及び基底部の上澄み液中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の量は、ＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡアッセイ法（Perkin-Elmer, Boston, MA）により測定した。伝染したＰＢＭＣは、基底部のコンパートメントから収集し、遠心分離により沈殿させ、そしてトリパンブルー排除法を用いて血球計で計数し、生存率を評価した。マウス・モノクロナール抗体Ｈ５２（抗ＣＤ１８）及びＭＴ−Ｍ５（抗ＩＣＡＭ−１）は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部（Johns Hopkins University School of Medicine）のＪａｍｅｓ Ｈｉｌｄｒｅｔｈ研究室から入手した。マウス・モノクロナール抗体７Ｅ４（抗ＣＤ１８）は、ベックマン・コールター・イムノテック社（Beckman-Coulter Immunotech Miami, FL）から入手した。マウス骨髄腫ＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、Ｚｙｍｅｄ社（South San Francisco, CA）から入手した。
【００３０】
統計的分析
統計的分析は、Ｉｎｔｅｒｃｏｏｌｅｄ Ｓｔａｔａ ８（Stata Corp, College Station, TX）の統計パッケージを用いて実施した。ボンフェローニ（Bonferroni）補正法と共に一元配置分散分析法（one-way ANOVA）用いて群間の差異を比較して、０．０５に等しい又はより小さいｐ値を有意であると見なした。
【００３１】
実験結果
ＣＤ１８に対する抗体の子宮頸部上皮単層を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止におけるＣＤ１８に対する抗体の効果を、抗ＩＣＡＭ−１と相対的に比較するために、抗ＩＣＡＭ−１（クローンＭＴ−Ｍ５）、抗ＣＤ１８（クローンＨ５２）又はイソタイプ対照マウスＩｇＧ１の何れかを、子宮頸部上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加する直前の１×１０６のＨＩＶ感染のＰＢＭＣに加えた。ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００３２】
抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の両方は、未処理及びイソタイプの対照の両方と比較した場合、テストした１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の全ての濃度で、有意に（ｐ＜０．０１）細胞移動を減少させた（図１Ａ）。しかし、抗ＣＤ１８は、テストした全ての濃度で抗ＩＣＡＭ−１よりも有意に（ｐ＜０．０５）細胞移動を大きく阻止し、更に抗ＩＣＡＭ−１の対応する濃度での阻止と比較して、基底部のコンパートメントで検出された細胞の数を２．５〜４倍減少させた。同様の傾向は、基底側の上澄みで検出されたＨＩＶ−１ｐ２４の量の測定においても観察された。両方の抗体処理物は、各濃度で、有意に（ｐ＜０．０１）基底部のコンパートメントで検出されたＨＩＶ−１ｐ２４の量を減少させた（図１Ｂ）。ＨＩＶ−１ｐ２４は、対応する抗ＩＣＡＭ−１処理群よりも、抗ＣＤ１８処理群で少なく検出されたが、差異は統計的に有意ではなかった。抗体での処理は、トランスウェルの頂端側で細胞により放出されるＨＩＶ−１ｐ２４の量を変化させなかった。
【００３３】
インビトロで観察された抗ＣＡＭ−１に対する阻止レベルは、インビボでのＨＵＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを用いて、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染における高度に有意な減少と関連付けられている（Chancey et al., supra）。従って、これらの実験において観察された高い阻止力は、ＣＤ１８に対する抗体が抗ＨＩＶ殺菌剤としての開発に極めて高い可能性を有していることを実証している。
【００３４】
５０：５０の抗ＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８抗体の混合物によるＨＩＶ−１感染培養物からの細胞移動の低減
異なる接着分子に対する抗体の混合物が単一の抗体よりも大きく阻止できるかどうかを判定する目的で、５０：５０の比で混合したＣＤ１８及びＩＣＡＭ−１に対する抗体を、それらを子宮頸部上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加する直前の、１×１０６のＨＩＶ−感染ＰＢＭＣに加えた。ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００３５】
全ての抗体処理物は、未処理又はイソタイプ対照の処理トランスウェルと比較した場合、感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を全ての濃度で有意に（ｐ＜０．０５）減少した（図２Ａ）。ここでも抗ＣＤ１８は、抗ＩＣＡＭ−１よりも大きく細胞移動を減少させ、そして抗ＩＣＡＭ−１／抗ＣＤ１８を５０：５０で含む混合物での処理物は、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８の何れか単独での対応する濃度で観察された場合より優れて、細胞移動において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）をもたらした（図２Ｂ）。
【００３６】
抗体の濃度を更に減小した場合、５０：５０混合物の細胞移動を阻止することに対する増進が、５ｕｇ／ｍｌの濃度で観察されたが、１ｕｇ／ｍｌでは５０：５０混合物は抗ＣＤ１８単独の場合と同程度であった（図５）。１ｕｇ／ｍｌでの抗ＩＣＡＭ−１単独は、移動を３８％減少させただけであり、わずかに統計的に有意（ｐ＜０．０５１）であっただけである。このため、これは低い濃度での抗ＩＣＡＭ−１の寄与の低下を示しているかもしれない。
【００３７】
各々の抗体のより少ない総量でより顕著な効果が達成できることを示唆するので、この接着受容体対に対する抗体である抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物によるＨＩＶ−１感染細胞の移動を阻止することに対する増進化は、注目すべきである。低い濃度での増大した有効性は、送達システムに関係なく、殺菌剤ベースの抗体において好ましいであろう。感染細胞の伝染におけるデータは、各々の抗体の非常に低い濃度で阻止することが達成できることを明らかにしている。従って、ＣＤ１８に対する抗体の単独及びＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せたものは、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する方法を提供するはずであり、そしてこの方法は、形質転換された細菌による産生のままで（in situ）の結果で、インビボで達成可能であると現実的に期待できる濃度の抗体で実現できる。
【実施例２】
【００３８】
抗体及びＦａｂの産生
マウスＩｇＧ１抗ヒトモノクロナール抗体Ｈ５２（抗ＣＤ１８）及びＭＴ−Ｍ５（抗ＩＣＡＭ−１）は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部（Johns Hopkins University School of Medicine）のＪａｍｅｓ Ｈｉｌｄｒｅｔｈ研究室から入手した。マウスＩｇＧ１抗ヒトモノクロナール抗体７Ｅ４（抗ＣＤ１８）は、ベックマン・コールター・イムノテック社（Beckman-Coulter Immunotech Miami, FL）から入手した。マウス骨髄腫ＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、Ｚｙｍｅｄ社（South San Francisco, CA）から入手した。ハムスター抗マウスＩＣＡＭ−１及びハムスターＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（San Diego, CA）から入手した。Ｆａｂの検討のために、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４及びマウスＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、フィシンベースのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ）’２消化キット（Pｉerce, Rockford IL）を用いて消化及び精製した。
【００３９】
膣伝染のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデル
ＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、以前に記述されている（Ｋｈａｎｎａ，Ｋ．Ｖ．，Ｋ．Ｊ．Ｗｈａｌｅｙ，Ｌ．Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｔ．Ｒ．Ｍｏｅｎｃｈ，Ｋ．Ｍｅｈｒａｚａｒ，Ｒ．Ａ．Ｃｏｎｅ，Ｚ．Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｅ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ｔ．Ｅ．Ｈｏｅｎ，Ｌ．Ｓｈｕｌｔｚ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「マウスにおける細胞関連のＨＩＶ−１の膣伝染は、局所の膜修飾剤により阻止される。」（J Clin Invest 109:205-211, 2002））。即ち、重症の複合型免疫不全症を有する雌マウス（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ）（Bosma, G. C., R. P. Custer, and M. J. Bosma. 1983, A sever combined immunodeficiency mutation in the mouse, Nature 301:527-530）は、ＳＣＩＤマウス・コロニー（Ｊａｃｋｓｏｎ研究室（Bar Harbor,Maine）由来のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスを用いて確立した）から入手した。マウスは、１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０７の未刺激、未感染のＨｕＰＢＭＣを腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与し、次いで７日後に２．５ｍｇのプロゲスチン（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ（登録商標）、Upjohn Pharmaceuticals, Kalamazoo, Michigan）で皮下（ｓ．ｃ．）処理した。プロゲスチン処理から７日間、マウスは、Ｖａｐｏｒｓｔｉｃｋ麻酔装置（SurgiVet Inc., Waukesha, WI）により供給される３０〜５０％のＯ２混合中で、イソフルラン（IsoFlo, Abbott Laboratories, Chicago IL）で麻酔をかけて、そして、ＰＢＳ−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Sigma）に懸濁した１×１０６のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ−感染ＨｕＰＢＭＣを受ける５分前に、抗ＩＣＡＭ−１（ＭＴ−Ｍ５）、抗ＣＤ１８（Ｈ５２）、若しくは指定のような抗ＩＣＡＭ−１：抗ＣＤ１８の５０：５０混合物、又はイソタイプの対照抗体の適切な混合物の何れかを、１０μｌ中の総量０．４μｇで膣内に投与した。マウスは５分間麻酔をかけたままにし、次いでピペットにて膣内接種を行い、接種物の漏出は観察されなかった。膣組織への外傷性障害を避けるために細心の注意を払った。２週間後、マウスを安楽死させて、腹膜細胞を冷ＰＢＳで洗浄して回収した。洗浄により回収された（マウス及びヒト由来の両方の）細胞は、ＤＮＡ−ＰＣＲによりヒトβグロビンに関してアッセイを行い、マウスにおけるヒト細胞の移植が成功したことを確認した。ヒト細胞を有さないマウスは、実験群の通常は０〜３０％の間であり、分析から除外した。
【００４０】
検討のマウスの腹膜腔から採取した細胞からのウィルスの回収を評価するために、未感染のＨｕＰＢＭＣは、ＰＨＡで刺激して、そしてＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスから回収した腹膜細胞と共培養するために、調製のＩＬ−２添加培地（１マウス当たり１×１０６）に保持した。陽性マウスは、ＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡにより共培養細胞からの上澄みで判定したが、これは我々の実験において、感染したマウスを検出する最も感度の高い方法である。全ての場合に、細胞は、マウスの腹膜腔に通常移植するために得た細胞の提供者以外の提供者から入手した。
【００４１】
膣接種に用いるＨｕＰＢＭＣは、上記のように分離して、ｃＲＰＭＩ−１６４０中に保持した。ＰＢＭＣは、２日間ＰＨＡで刺激して、その後細胞は、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）と共にｃＲＰＭＩ中で１０４ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌに曝した。感染細胞培養物は、１０日間ＩＬ−２を添加したｃＲＰＭＩに保持して、マウスに接種した。
【実施例３】
【００４２】
ＣＤ１８に対する抗体による細胞関連のＨＩＶ−１の子宮頸部の上皮単層を越えての伝染の阻止
細胞移動の減少（実施例１に上述のように）は、単一のハイブリドーマ由来の抗ＣＤ１８に限定されるものではなく、ＣＤ１８に対する第２の阻止抗体であるクローン７Ｅ４を５０及び１０μｇ／ｍｌでテストした場合、感染培養物からの細胞移動は、各々６３％及び５５％減少した（図９Ａ）。伝染の指標として基底部のＨＩＶ−１ｐ２４を用いると、感染のより大きな減少が観察され、５０及び１０μｇ／ｍｌの７Ｅ４では、ｐ２４の伝染は各々８１％及び６２％減少した（図９Ｂ）。抗ＣＤ１８クローンＨ５２で観察される移動及び伝染の減少より低いレベルではあるが、両方の基準で測定された阻止力は統計的に非常に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【実施例４】
【００４３】
抗ＣＤ１８Ｆａｂのインビトロでの細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
分子当たり同じ数の抗原結合部位を有しているが抗体分子のＦｃ領域が欠如している一価の抗体の断片が、完全な抗体と同様に阻止するかどうか判定する目的で、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４のＦａｂ断片を、インビトロでのＨＩＶ−１ｐ２４の伝染及び感染細胞の移動を阻止するそれらの能力に関してテストした。完全な抗ＣＤ１８、イソタイプの対照抗体、抗ＣＤ１８Ｆａｂ、又はイソタイプの対照Ｆａｂは、ＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣと共にＨＴ−３子宮頸部の上皮単層の頂端側に添加され、そして細胞は２４時間移動するようにした。Ｆａｂの濃度は、抗ＣＤ１８結合部位の数と等しくなるように調節した。
【００４４】
３４μｇ／ｍｌの濃度では、抗ＣＤ１８Ｆａｂは、未処理及びイソタイプの対照の両方と比べて、有意に（ｐ＜０．０５）、ＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの移動及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染の両方を減少させた（図１０Ａ〜Ｂ）。濃度を６．７μｇ／ｍｌに下げた場合、イソタイプの対照Ｆａｂと比較して、細胞移動は統計的に有意ではない減少を示したが（図１０Ａ）、ＨＩＶ−１ｐ２４の伝染は有意に減少した（図１０Ｂ）。しかし、テストした両方の濃度では、抗ＣＤ１８Ｆａｂは、完全な抗ＣＤ１８の対応する濃度の効果よりも劣るレベルで伝染を阻止した。３４μｇ／ｍｌのＦａｂ及び５０μｇ／ｍｌの完全な抗ＣＤ１８において、伝染は、細胞移動に関して各々４５．５±６．８％及び６２．５±６．３％減少し、ｐ２４に関して各々６３．８±２．６％及び７１．３±０．２％減少した。
【実施例５】
【００４５】
抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８抗体の５０：５０混合物による細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の減少
インテグリン接着分子の相互作用に含まれる受容体リガンド対の各構成要素に対する抗体の混合物が、同じ総濃度の単一の抗体よりも有効に阻止できるかどうか判定するために、ＣＤ１８及びＩＣＡＭ−１に対する抗体の５０：５０の比の混合物は、１×１０６のＰＢＭＣに加えて、直ちに子宮頸部の上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加した。ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００４６】
テストした全ての濃度での抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の処理物は、未処理及びイソタイプ対照の処理培養物と比べて、有意に（ｐ＜０．０５）、感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を減少させた（図１１Ａ）。ここでも抗ＣＤ１８は、抗ＩＣＡＭ−１よりも大きく細胞移動を減少させ、そして抗ＩＣＡＭ−１：抗ＣＤ１８の５０：５０混合物での処理は、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８クローンＨ５２の何れか単独での対応する濃度で観察された場合より、細胞移動において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）をもたらした（図１１Ｂ）。抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物を対応する濃度の抗ＩＣＡＭ−１と比較した場合に、伝染したＨＩＶ−１ｐ２４において有意な減少が観察されたが、抗ＩＣＡＭ−１／抗ＣＤ１８混合物を単独使用の抗ＣＤ１８と比較した場合に観察される減少はわずかであり、統計的に有意なものではなかった（図１１Ｃ）。抗体の濃度を更に下げた場合、細胞移動を阻止することに対する５０：５０混合物の増進化が、５ｕｇ／ｍｌの濃度で観察された（図５）。
【実施例６】
【００４７】
抗ＩＣＡＭ−１を伴う抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４
単独で用いる場合にＨ５２よりも低い効果での阻止を示す、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４を抗ＩＣＡＭ−１と混合した場合、劇的な効果が観察された。テストした全ての濃度で、抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、何れかの抗体の単独での対応する濃度の効果よりも有意に、ＨＩＶ−１感染細胞の細胞移動を減少させた（図１２Ａ〜Ｂ）。同様の効果は、ＨＩＶ−１ｐ２４を指標として用いた観察でも見られ、５０：５０の混合物が、１０ｕｇ／ｍｌ及び２０ｕｇ／ｍｌの濃度で、対応する単独抗体の効果よりも有意に伝染を減少させた（図１２Ｃ〜Ｄ）。とりわけ、５ｕｇ／ｍｌの濃度の５０：５０の混合物は、未処理のサンプルと比較して、細胞移動を９０±２．０％減少させ、２０μｇ／ｍｌでは、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の何れよりも（各々、７８±３．６及び６２±３．０％（図１２Ｂ））極めて有意に減少させた。
【実施例７】
【００４８】
抗ＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物によるインビボでの細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
子宮頸部上皮におけるＩＣＡＭ−１に対する抗体は、Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ処理のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを用いるインビボのモデルで、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を減少させることが観察されている。移動細胞におけるＣＤ１８の阻止物質の単独、又はマウスの子宮頸部上皮におけるＩＣＡＭ−１の阻止物質との組み合わせが、インビボでの同じモデルにおいてＨＩＶ−１の伝染を阻止できるかどうか評価するために、抗マウスＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８、抗マウスＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物、又はイソタイプの対照抗体の混合物の何れか（１０μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中の０．４μｇの単一抗体又は各々０．２μｇの各抗体の混合物）は、膣内に投与され、次いで５分後に１×１０６のＨＩＶ−１感染ヒトＰＢＭＣの膣内接種を実施した。抗マウスＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８及び抗マウスＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８の混合物の全ては、対照群と比較して、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させた（表１）。用いた抗体の濃度では、単一抗体で処理した群において完全な防御がもたらされた。
【００４９】
【表１】
【実施例８】
【００５０】
上皮に適用した抗ＣＤ１８による感染しやすい表皮下細胞の遊離ウィルスの初期感染の防止
性的伝染における無細胞及び細胞関連のウィルスの相対的な重要性は公知ではないため、無細胞のウィルスの伝染における抗ＣＤ１８及び抗ＩＣＡＭ−１の有効性を評価した。無細胞のウィルスは、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスシステムに伝染できない、そこでこの検討の有効性を、ヒト血清を用いてインビトロのトランスウェルモデルで評価した。検討は、上部チェンバーに添加した抗体が、下部チェンバーに置かれ、次いで上部チェンバーに無細胞のウィルス及び異なる濃度のＭａｂを接種する、感染しやすいＰＢＭＣ（ＰＨＡ及びＩＬ−２に活性化される）の遊離ウィルスによる感染を減少できるかどうかにより実施した。２４時間後、トランスウェル、細胞は、下部チェンバーから取り出し、洗浄し、そして培養培地を含有するＩＬ−２に再懸濁した。培養上澄み液中のｐ２４の濃度を７日間にわたり測定した。図１３のデータは、ｐ２４の濃度が、抗ＣＤ１８を上部チェンバーに添加しているトランスウェル中で有意に低いことを示す。更に、抗ＩＣＡＭ−１抗体は、無意味な対照の抗体を有するトランスウェルでの結果と比較して感染を減少させた。
【００５１】
これらの検討は、インビトロの子宮頸部上皮を越えてのＨＩＶ−１感染細胞の伝染におけるβ−インテグリンＣＤ１８の役割を実証する。抗ＩＣＡＭ−１のインビトロで観察される阻止のレベルは、インビボのＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを用いる細胞関連のＨＩＶ−１の伝染における高度に有意な減少と以前に関連付けられている。よって、本発明の実施例１〜２の実験において観察される高い程度の阻止力は、ＣＤ１８に対する抗体の抗ＨＩＶ−１殺菌剤としての有用性を実証する。
【００５２】
ＣＤ１８は、白血球に発現する細胞接着受容体のＬｅｕ−ｃａｍ系の共通のβ２サブユニットであり、これには、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、α１β２）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、αＭβ２）、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８、αｘβ２）及びＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８（αＤβ２）が含まれる（Sanchez-Madrid, F., J. A. Nagy, E. Robbins, P. Simon, and T. A. Springer, 1983, A human leukocyte differentiation antigen family with distinct alpha-subunits and a common beta-subunit:the lymphocyte function-associated antigen (LFA-1), the C3bi complement receptor (OKM1/Mac-1), and the p150,95 molecule, J Exp Med 158:1785-1803）。ＣＤ１８に対する抗体が細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する（例えば図１及び２）という観察は、単球及びリンパ球の接着並びに経内皮移動におけるＣＤ１８の確立された役割と一致するものである（Greenwood, j., Y. Wang, and V. L. Calder, 1995, Lymphocyte adhesion and transendothelial migration in the central nervous system:the role of LFA-1, ICAM-1, VLA-4 and VCAM-1. off, Immunology 86:408-15; Hakkert, B. C., T. W. Kuijpers, J. F. Leeuwenberg, J. A. van Mourik, and D. Roos, 1991, Neutrophil and monocyte adherence to and migration across monolayers of cytokine-activated endothelial cells: the contribution of CD18, ELAM-1, and VLA-4, Blood 78:2721-6; Meerschaert, J., and M. B. Furie, 1995, The adhesion molecules used by monocytes for migration across endothelium include CD11a/CD18, CD11b/CD18, and VLA-4 on monocytes and ICAM-1, VCAM-1, and other ligands on endothelium, J Immunol 154:4099-112; Meerschaert,J., and M. B. Furie, 1994, Monocytes use either CD11/CD18 or VLA-4 to migrate across human endothelium in vitro, J Immunol 152:1915-26; Muller, W. A., and S. A. Weigl, 1992, Monocyte-selective transendothelial migration; dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay, J Exp Med 176:819-28; Parkos, C. A., C. Delp, M. A. Arnaout, and J. L. Madara, 1991, Neutrophil migration across a cltured intestinal epithelium, Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction, J Clin Invest 88:1605-12; Schenkel, A. R., Z. Mamdouh, and W. A. Muller, 2004, Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation, Nat Immunol 5:393-400; te Velde, A. A., G. D. Keizer, and C. G. Figdor, 1987, Differential function of LFA-1 family molecules (CD11 and CD18) in adhesion of human monocytes to melanoma and endothelial cells, Immunology 61:261-7）。
【００５３】
他方、ＩＣＡＭ−１及びそのリガンドの接着の阻止を示した、異なる抗ＩＣＡＭ−１抗体が、ｐ２４ ＥＬＩＳＡによって示されるように、広く変化する範囲の程度にＨＩＶ−１の伝染を減少させることが観察されている。これらの実施例では、テストした接着阻止の抗ＣＤ１８クローンであるＨ５２（Hildreth, J. E., V. Holt, J. T. August, and M. D. Pescovitz, 1989, Monoclonal antibodies against porcine LFA-1: species cross-reactivity and functional effects of beta-subunit-specific antibodies, Mol Immunol 26:883-95）及び７Ｅ４（Nortamo, P., M. Patarroyo, C. Kantor, J. Suopanki, and C. G. Gahmberg, 1988, Immunological mapping of the human leukocyte adhesion glycoprotein gp90 (CD18) by monoclonal antibodies, Scand J Immunol 28:537-46）の両方は、ＨＩＶ−１の伝染及びＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの移動の両方を、有意に阻止できることが実証されている（図２）。テストした全ての濃度で、クローンＨ５２由来の抗体は、クローン７Ｅ４由来の抗体よりも有効に阻止した。
【００５４】
観察されたように、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４のＦａｂは、その効果は完全な７Ｅ４抗体よりわずかに劣っているが、ＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させ、そして子宮頸部の上皮単層を越えるＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの数を減少させた（図１０）。先に用いた完全な抗体と比較して、Ｆａｂは、一価であり、そして作り出された乳酸菌により産生されるであろうsｃＦｖとより近い大きさである。観察された阻止レベルにおけるわずかな減少は、Ｆａｂを産生するために用いた酵素消化に起因する、結合能力の低下によるものかもしれない。これらの結果は、一価の、分泌された抗ＣＤ１８ｓｃＦｖが、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を減少させるのに用いることができると示唆している。
【００５５】
抗体による阻止のレベルが、２つの異なる抗体の組合せにより改良できるかどうかを判定するために、抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の混合による到達の阻止レベルを、各抗体単独での同じ濃度で観察された効果と比較した。抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８クローンＨ５２又は７Ｅ４のどちらかとの混合物は、どちらか一方の抗体が単独の対応する濃度の効果と比較して、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を有意に減少させ（図１１Ａ〜Ｂ、５及び図１２Ａ〜Ｂ）、そしてＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させた（図１２Ｃ〜Ｄ）。これは、ＩＣＡＭ−１とＣＤ１８の両方が、子宮頸部上皮を越えてのＨＩＶ−１感染細胞の移動に対する寄与が小さい他方の結合パートナーを結合しているかもしれない、しかし単一抗体では阻止が不十分な抗体濃度で最大の便益が観察されるので、抗体の組合せがＩＣＡＭ−１／ＣＤ１８の相互作用をより有効に阻止する可能性が高い、ということを示唆している。より顕著な効果が、抗体のより低い総量で達成できるので、この接着受容体対に対する抗体である抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物によって、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止が増強されることは、注目に値する。より低い濃度（例えば、約１〜５マイクログラム範囲の濃度）での増大した有効性は、送達システムに関係なく抗体ベースの殺菌剤において好ましいであろう。他の検討では、発明者らの研究は、乳酸菌により分泌され、インビトロのアッセイでの使用の前に精製した抗ＩＣＡＭ−１ ｓｃＦｖが、６７μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合に、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の経上皮移動及びＨＩＶ−１の伝染の両方を阻止できることを実証した。液体培養において５μｇ／ｍｌまでの濃度でも効果が得られている（データは示さず）。
【００５６】
特に、ＣＤ１８に対する抗体は、４０μｇ／ｍｌでＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を完全に阻止した（表１）。
２つのチェンバーシステムでは、両方の抗体、特に抗ＣＤ１８は、下部チェンバーに置かれた表皮下のＰＢＭＣの伝染を明確に減少させた。抗体の濃度は、上部チェンバーで観察される濃度（データは示さず）の約１０％で、トランスウェルの下部チェンバーにおいて検出することができた。伝染の阻止は、トランスウェルアッセイにおいて完全ではなかったが、細胞関連の伝染におけるそのような減少レベルは、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける１００％の防御につながる。よって、抗ＣＤ１８は、細胞関連及び無細胞のウィルスの両方の伝染を阻止することに有効であろう。
【００５７】
これらの実験的な実施例の結果は、ＨＩＶ−１の性的伝染におけるＣＤ１８の重要性を実証している。ＣＤ１８に対する抗体は、乳酸菌ベースの送達システムを用いる抗ＨＩＶ−１殺菌剤としての有用性を示す。更には、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いるＣＤ１８に対する抗体は、女性泌尿生殖器において乳酸菌産生ｓｃＦｖをそのまま（in situ）で用いて提供することが可能な抗体濃度で、経上皮ＨＩＶの伝染を阻止することを示している。
【００５８】
女性へのＨＩＶ−１の伝染を防止するための殺菌剤は、世界的規模のＨＩＶの蔓延を阻止することにおいて重要な役割を果たすことができる。本明細書における実験に基づき、本発明者らは、本明細書の宿主細胞接着分子に対する抗体が、抗ＨＩＶ−１殺菌剤として有用であると考えている。これらの実験的実施例は、βインテグリンＣＤ１８に対する抗体の２つの異なるクローンが、ＨＩＶ−１の伝染と感染培養物からの細胞の移動の両方を減少させる（ｐ＜０．０１）ことを実証している。更には、抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８のクローンのどちらか一方との５０：５０混合物が、どちらかの抗体を単独で同じ総濃度で用いた場合よりも、有意に（ｐ＜０．０５）ＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を減少させた。インビボでは、抗ＣＤ１８及び抗ＣＤ１８と抗ＩＣＡＭ−１の５０：５０の混合物の両方が、ＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおける細胞関連のＨＩＶ−１の膣内伝染を、有意に減少させた。これらの結果は、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染におけるＣＤ１８の重要性を実証するものである。更には、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いるＣＤ１８に対する抗体は、乳酸菌産生のｓｃＦｖを用いてインビボで達成することが可能な濃度で、阻止することを示している。
【実施例９】
【００５９】
組み換え菌
また、防御抗体の別の態様として、組み換え菌（例えば、ｒＣＤ５４のような）は、機能性（アゴニスト）または欠損性（アンタゴニスト）リガンドを発現するのに用いることができる。具体的には、感染したリンパ球又はマクロファージの表面のＬＦＡ−１又はＭａｃ−１による上皮細胞の表面のＩＣＡＭ−１の結合は、可溶性リガンドがＩＣＡＭ−１受容体を架橋することができない１価の形態である限り、可溶性形態のＬＦＡ−１又はＭａｃ−１リガンドによるＩＣＡＭ−１受容体の占有により阻止され得る。そのような架橋では、上皮が崩壊することになる。同様に、可溶性ＩＣＡＭ−１は、上皮細胞の表面のＩＣＡＭ−１受容体によって、ＬＦＡ−１又はＭａｃ−１との結合が阻止され得る。
【００６０】
本発明はその好ましい態様に関して記述しているが、当業者は、本発明が添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内の変更を実施できることを理解されるであろう。従って、本発明は、上述のような態様に限定されるべきものではなく、本明細書に提供する記述の精神及び範囲内の全ての変更及びその均等物をさらに含むべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、ＣＤ１８に対する抗体が、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と同様に又はより優れて、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を（図１Ａ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を（図１Ｂ）阻止することを示す棒グラフである。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１００、５０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８Ｈ５２又はイソタイプ対照）と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。図１Ａ〜５において、エラーバーは、±一標準偏差を示す。図１Ａに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０１であり、そして対応する濃度での抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８群の間は、ｐ＜０．０５である。図１Ｂに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０１である。
【図２】図２Ａは、棒グラフであり、そして図２Ｂは折れ線グラフである。抗ＩＣＡＭ及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動をどちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。図１Ａに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。図１Ｂに関して、同じ濃度での各処理物の間は、ｐ＜０．０５である。
【図３】図３は、棒グラフである。抗ＣＤ１８単独、又は抗ＩＣＡＭ−１と組合せて用いた場合は、ＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を抗ＩＣＡＭ−１単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり；抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図４】図４は、棒グラフである。抗ＣＤ１８によって阻止すること、及び抗ＩＣＡＭ−１との混合物によって増強することは、１つの抗体クローンに限定されるものではない。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。
【図５】図５は、棒グラフである。抗ＣＤ１８単独、及び抗ＩＣＡＭ−１と組合せた場合は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動を減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。
【図６】図６は、折れ線グラフである（ｙ＝０．００７３ｘ−０．０４７３；Ｒ＝０．９８１８）。
【図７】図７は、折れ線グラフであり、抗ＩＣＡＭ、抗ＣＤ１８及び５０／５０混合物に関するデータを有する。図７Ａは、図７に関する棒グラフである。
【図８】図８は、棒グラフであり、未処理物、イソタイプ対照、抗ＩＣＡＭ、抗ＣＤ１８及び５０／５０混合物の実験のデータに関する。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、棒グラフである。抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４は、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を（図９Ａ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を（図９Ｂ）阻止する。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＣＤ１８ Ｈ５２、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、各群につき３回繰り返して、基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度又は生存ＰＢＭＣ数の平均±ＳＤとして示す。両方のグラフに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、棒グラフである。抗ＣＤ１８Ｆａｂは、ＨＴ−３細胞単層を越えてのＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣ（図１０Ａ）及びｐ２４（図１０Ｂ）の伝染を阻止する。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、指定の抗体と共に浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。全ての未処理の抗体は、５０又は１０μｇ／ｍｌの濃度で用い、そして全てのＦａｂは結合可能な部位と等しくなるよう３４又は６．７μｇ／ｍｌで用いる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１０Ａ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１０Ｂ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。Ａに関して、未処理及び対応するイソタイプ対照と比較した処理物は、ｐ＜０．０５であり；Ｂに関して、未処理及び対応するイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１３】図１３は、子宮頸部上皮下での標的細胞の感染を減少させるかどうか判定するための、ＩＣＡＭ−１及びＣＤ１８に対する抗体を単独及び組合せの両方で用いる実験に関するデータを示すグラフである。総量２０ｕｇ／ｍｌの指定の抗体又は混合物は、１×１０３のＴＣＩＤ５０ＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦに添加して、直後にＭＥ−１８０トランスウェル培養物の頂端側に基底部のコンパートメント中の１×１０６ＰＨＡブラストを添加して、そして３７℃にて２４時間培養した。次いでトランスウェルを取り除いて、ＰＢＭＣの上澄みを４８時間間隔でサンプリングした。基底部のコンパートメント中の細胞の感染は、培養した細胞由来の上澄み中のＨＩＶ−１ｐ２４の増加レベルにより測定した。データは、単一ウェルである抗ＣＤ１８を除いて、３つのウェルの平均±ＳＤとして示す。白抜きの記号は、未処理細胞との有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。抗ＣＤ１８及び抗ＩＣＡＭ−１における組合せの効果が見られ、ここにおいて組合せの効果の殆どは、抗ＣＤ１８に起因すると見なされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にＨＩＶ感染の性的伝染の対処に有効である方法に関する。特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が子宮頸部、膣、胃腸、直腸、結腸及び口腔の上皮を越えて感染するのを阻止するために、ＣＤ１８に対する抗体を用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１感染は、大多数のＨＩＶ−１の性的伝染が異性との接触の結果として世界的規模で生じているように、性的な接触を通して最も頻繁にもたらされている（Louria, D. B., J. H. Skurnick, P. Palumbo, J. D. Bogden, C. Rohowsky-Kochan, T. N. Denny, and C. A. Kennedy, 2000, HIV heterosexual transmission: a hypothesis about an additional potential determinant, Int J Infect Dis 4:110-6; Skurnick, J. H., C. A. Kennedy, G. Perez, J. Abrams, S. H. Vermund, T. Denny, T. Wright, M. A. Quinones, and D. B. Louria, 1998, Behavioral and demographic risk factors for transmission of human immunodeficiency virus type 1 in heterosexual couples: report from the Heterosexual HIV Transmission Study, Clin Infect Dis 26:855-64）。出産適齢期の女性が、ＨＩＶ−１に感染する危険性が最も高く（Davis, S. F., D. H. Rosen, S. Steinberg, P. M. Wortley, J. M. Karon, and M. Gwinn, 1998, Trends in HIV prevalence among childbearing women in the United States, 1989-1994, J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 19:158-64; Wortley, P. M., and P. L. Fleming, 1997, AIDS in women in the United States, Recent trends, Jama 278:911-6）、これが、世界的な女性、新生児、及び子供のＨＩＶ−１感染における、対応する増加をもたらしている。例えば、女性へのＨＩＶ−１の性的伝染の機構は、女性のＨＩＶ−１予防のための有力な標的として検討されている。更に、男性及び女性の直腸での使用に関する潜在的な取り組みは、その経路を介しての伝染を予防すると考えられている。
【０００３】
殺菌剤は、新たなＨＩＶ−１感染の罹患率を減少させるために用いることのできる、潜在的に女性が管理する予防的療法である。部分的に有効な殺菌剤でさえ、ＨＩＶの蔓延に対して大きな影響を及ぼす可能性があり、７３の低所得国のわずか２０％の女性が、６０％の有効度の殺菌剤を他に防御されていない全ての性的行為の半分に用いた場合、女性、男性及び子供において、３年間で２５０万のＨＩＶ感染を防げるであろうと推定される（Watts, C., W. Thompson, and L. Heise, 1998, Presented at the International Conference on AIDS, Geneva.）。
【０００４】
様々な可能性のある抗ＨＩＶ−１の殺菌剤は、現在開発及び臨床的試験の進行段階にある。しかし、それらの殺菌剤は、リスクのある人々の殆どが使用するには現実的ではない高い製造費用を必要としている。更に現在試験中の殺菌剤は、いくつかのＣＣＲ５利用の分離株に対する有効性の減少、泌尿生殖器の常在菌（normal flora）の破壊、生殖器上皮に対する毒性、発癌可能性、及び細胞関連のウィルスに対する実証のない効能を含む、いくつかの難点があり、「D'Cruz, O. J., and F. M. Uckun, 2004, Clinical development of microbicides for the prevention of HIV infection, Curr Pharm Des 10:315-36」に概説されている。マカク属のサルのＳＨＩＶの伝染に対する防御に用いられる抗ｇｐ１２０抗体の経膣的適用のような、抗体の殺菌剤としての使用は、多くの化学的化合物に関連する毒性の問題を回避できる（Veazey, R. S., R. J. Shattock, M. Pope, J. C. Kirijan, J. Jones, Q. Hu, T. Ketas, P. A. Marx, P. J. Klasse, D. R. Burton, and J. P. Moore, 2003, Prevention of virus transmission to macaque monkeys by a vaginally applied monoclonal antibody to HIV-1 gp120, Nat Med 9:343-6）。
【０００５】
ＨＩＶ−１の無細胞の伝染を標的とする化学的な又は抗体ベースの殺菌剤の設計における１つの難点は、ウィルスの表面エピトープの大きな可変性である。この難点は、細胞関連及び／又は無細胞の伝染に関係する、宿主細胞タンパク質のエピトープを標的とすることで回避することができる。以前には、宿主ＩＣＡＭ−１は、抗体ベースの殺菌剤の開発に関する有力な標的として認識されていた。抗ＩＣＡＭ−１は、インビトロでのモデルの子宮頸部上皮の細胞単層を越える、及びインビボでのＨＩＶ−１の伝染のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルの両方で、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止することが示されている。とりわけ、マウスモデルにおける結果は、マウスの上皮でのＩＣＡＭ−１の関与が、伝染を阻止するために必要であること、そして感染したヒトＰＢＭＣ接種材料ではＩＣＡＭ−１のみの阻止では、伝染を阻止するためには不十分であることを実証した（Ｃｈａｎｃｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｋ．Ｖ．Ｋｈａｎｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｇ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ａ．Ｌａｎｇａｎ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）に特異的な、乳酸菌に発現される単鎖の可変性断片（ｓｃＦｖ）は、子宮頸部上皮を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の感染を阻止する（J. Immunol 176:5627-36, 2006）を参照されたい）。
【０００６】
しかし、抗体産生の新しい方法にもかかわらず、抗体の消極的な投与に必然的に関係して、このような殺菌剤の費用は、高額になりやすい。
背景として、Ｍａｒｋｈａｍら（Johns Hopkins University）の米国特許第６，５６６，０９５号（２００３年５月２０日）「ＨＩＶの性的伝染を防止するための組成物及び方法」に、記載がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
経済的に及び臨床的に実現可能な方法で、広範囲のＨＩＶ−１の変異体の性的伝染を阻止することが可能な抗体を提供することは有益なことであるが、そのような抗体は、本発明の前には未だ提供されていない。ウィルス抗原を標的とする取り組みの何れもが抱える主要な問題は、ＨＩＶの場合に、大きな可変性であり、そして高頻度で変化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗ＣＤ１８抗体が上皮を越えてのＨＩＶ−１の伝染を阻止するという発明者らの発見を活用している。抗ＣＤ１８抗体は、従って子宮頸部上皮、膣上皮、胃腸上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮を越えてのＨＩＶ−１の伝染を防止する又は軽減する殺菌剤に用いることができ、それによりＨＩＶ−１感染に対する方法を提供することができる。また発明者らは、抗ＣＤ１８抗体が、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いることができることを見い出した。更にはこの効果を生み出す抗体の濃度は、臨床的状況において入手可能の十分に低いレベルである。
【０００９】
また本発明は、ＨＩＶ−１の伝染を阻止するために、抗ＣＤ１８抗体のｓｃＦｖを使用することも提供する。有利なことに、そのようなｓｃＦｖ（ここにおいて、抗原結合の重鎖及び軽鎖領域が、それらが機能的にＦａｂと似た態様に折り畳まれていることを確保する分子、に連結している単鎖の抗体である）は、例えば、遺伝子操作された乳酸菌、遺伝子操作された大腸菌等のような、遺伝子操作された細菌性送達システムにより分泌される様な範囲の大きさでありそしてそのような構造（即ち、複鎖ではない）である。従って、防御抗体（例えば、抗ＣＤ１８抗体のような）のｓｃＦｖを産生するために遺伝子操作された細菌（例えば、乳酸菌、大腸菌等のような）は、領域（例えば、子宮頸部領域、膣領域等のような）にコロニーを形成するのに用いることができ、そしてそのままで（in situ）ＨＩＶ感染に対する防御を提供することができる。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶ感染の性的伝染を防止する方法を提供する。本発明は、ＣＤ１８に特異的な抗体を用いる方法を提供する。ＣＤ１８は、２つのＩＣＡＭ−１インテグリン・リガンドであるＭａｃ−１及びＬＦＡ−１（その両者とも、移動細胞に存在する）のβ鎖である。本発明は、抗ＣＤ１８が上皮障壁を越えての細胞関連のウィルスの伝染を阻止できること、そして上皮表面に適用した場合、上皮の下部の感染しやすい細胞の無細胞のウィルスによる感染を阻止できることを、示すことができる発見に基づいている。理論にとらわれることなく、無細胞のウィルスに対する抗ＣＤ１８の有効性に関する例示的な要因は、ウィルスが感染すると細胞から抗原が出芽し、ウィルスが宿主抗原を捕捉することによるかもしれない。従って、本発明は、無細胞のウィルスのＨＩＶの場合のウィルス性抗原（ここにおける抗原は、高度に可変的であり、そして高頻度で変化する）を標的とする際に従来から観察される問題の解決に取り組んでいる。
【００１１】
好ましい一態様では、本発明は、ＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）曝露を受ける可能性のある上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１抗体又は両方に曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物のＨＩＶの初期感染を防止する方法を提供しており、ここにおいて、上皮を抗体に曝露する段階が、ＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染を防止するものであり、具体的には、上皮をＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組み合わせた抗ＩＣＡＭ抗体に曝露する段階を含む防止の方法；抗体を少なくとも１つの細菌性（例えば、乳酸菌等のような）送達システムを介して上皮に送達する段階を含む防止の方法；用いられる細菌性（例えば乳酸菌等のような）送達システムの量は、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である防止の方法；ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である防止の方法；細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する防止の方法；抗体が、産生物（細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組み合わせのような）として、細菌性の送達システムにより発現する防止の方法等である。
【００１２】
別の好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）曝露を受ける可能性のある上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又は両方に曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物へのＨＩＶ（例えば、無細胞のＨＩＶ、細胞関連のＨＩＶのような）の経上皮伝染を阻止する方法を提供するものであり、具体的には、上皮を抗体に曝露する段階がＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止するような阻止方法；上皮経由のＨＩＶの伝染が減少する又は防止される阻止方法；ＨＩＶの性的伝染が減少する又は防止される阻止方法；ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せて抗ＩＣＡＭ抗体に上皮を曝露することを含む阻止方法；少なくとも１つの細菌性の送達システム（例えば、乳酸菌の送達システム等のような）を介して抗体を上皮へ送達することを含む阻止方法；用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である阻止方法；細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する阻止方法；ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である阻止方法；抗体が、産生物（例えば、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せのような）として、細菌性の送達システムにより発現する阻止方法等、である。
【００１３】
別の好ましい態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体（抗ＣＤ１１抗体の具体例は、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｄがある）又はその両方を含んでなる殺菌剤を提供するものであり、具体的には、抗体が細菌性の送達システムによりｓｃＦｖとして発現する殺菌剤（具体例には、例えば抗体を、少なくとも１つの乳酸菌の細菌性送達手段等を介して、防御されるべき上皮に送達することができる殺菌剤等）；少なくとも１つの抗ＩＣＡＭ抗体を更に含んでなる殺菌剤；抗ＩＣＡＭ抗体（単一又は複数）並びに抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体を一緒にした累積的な抗ＨＩＶの効果が、（個別の抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体の効果）＋（個別の抗ＩＣＡＭ抗体の効果）と、少なくとも等しい又はそれより大きい殺菌剤等、である。
【００１４】
別の好ましい態様では、本発明は、（Ａ）軽鎖の抗原結合性の可変領域及び重鎖の抗原結合性の可変領域を結合タンパク質（例えば、付着の重鎖及び軽鎖の可変領域をＣＤ１８が結合するような構造に折り畳んでいる、アミノ酸の配列を含んでなる結合タンパク質のような）に融合して、単鎖の抗体（ｓｃＦｖ）を形成すること、ここにおいて抗体の分子は同じである又は異なっていてもよく、そして抗ＣＤ１１及び抗ＣＤ１８の抗体より選ばれる；（Ｂ）細菌性の送達システム（例えば、乳酸菌の送達システム、大腸菌の送達システム、乳酸球菌の送達システム等のような）が、ＨＩＶの伝染から防御されるべき上皮を含有する環境において、段階（Ａ）の単鎖の抗体を発現する状態を形成すること；を含んでなる、殺菌剤を作成する方法を提供する。
【００１５】
別の好ましい態様では、本発明は、ＨＩＶ−１の経上皮の伝染を阻止する発現産生物（例えば、抗ＣＤ１８；抗ＣＤ１１；組み換え菌により発現するリガンド；等のような）を提供する。
本発明の方法、システム、産生物、組成物等は、女性及び男性に対して使用可能であり、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では、防御抗体（例えば、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１１抗体（例えば、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１１ｄ抗体）、抗ＣＤ１８抗体と抗ＣＤ１１抗体との組合せ）は、病原菌（例えば、ＨＩＶ）の上皮（例えば、子宮頸部上皮、膣上皮、胃腸上皮、直腸上皮、結腸上皮、口腔上皮のような）を越えての伝染を阻止するために用いる。
【００１７】
本明細書に記述の防御抗体に関して、多様な反復物（例えば、複鎖抗体、自然発生の単鎖抗体、又はそれらの断片等のような）が、本発明の実施において用いられてもよい。
【００１８】
本発明の防御抗体を、病原菌（ＨＩＶのような）の伝染阻止に用いるように上皮へ送達するために、例えば、乳酸菌送達システム、大腸菌送達システム等のような細菌性送達システムを用いることができる。用いられる他の好ましい細菌性システムは、生殖管、胃腸管（例えば末梢胃腸管のような）、口腔管等の常在菌（normal flora）として存在する細菌種に基づくものを含む。
【００１９】
乳酸菌の使用は、送達システムを構築するのに特に好ましいと見なされる。具体的には、抗体の送達システムは、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）として知られる短い表面結合又は分泌の異種タンパク質が持続してその場所で（in situ）産生されるために作り出された乳酸菌を用いて提供できる。これらのsｃＦｖは、特異的なＨＩＶ関連の標的に対して狙う抗体の可変領域に似るように折り畳むことができる。ＩＣＡＭ−１に対するsｃＦｖが、細胞関連のＨＩＶ−１のインビトロでの伝染を、７０±５％減少させることが実証されている。更に、ある重症の複合型免疫不全症のマウスを用いたインビボでの伝染では、ヒト末梢血単核細胞（Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス）に再構成されたＩＣＡＭ−１に対する抗体は、膣内に接種されたＨＩＶ−１感染細胞による伝染から最大９０％の防御を提供できる（Ｃｈａｎｃｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｋ．Ｖ．Ｋｈａｎｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｇ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ａ．Ｌａｎｇａｎ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）に特異的な乳酸菌発現性の単鎖の可変性断片（ｓｃＦｖ）が、子宮頸部上皮の単層を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の感染を阻止する」（J Immunol 176:5627-5636, 2006））。これらの検討は、この抗体が膣上皮細胞の表面でＩＣＡＭ−１と反応することを示している（データは示さず）。この観察されたインビボでの防御は、抗体の低い濃度（２０ｕｇ／ｍｌ）で達成された。この乳酸菌送達システムは、一例として記述したものであり、当業者は理解されるであろうが、多様な他の乳酸菌送達システムが構成されてもよい。例えば、「C. Kruger, Y. Hu, Q. Pan, H. Marcotte, A. Hultberg, D. Delwar, P. J. van Dalen, P. H. Pouwels, R. J. Leer, C. Kelly, C. Van Dollenweerd, J. Ma, and L. Hammartstrom, "In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producing single-chain antibodies," Nature Biotechnology, 20:702-706 (2002)」を参照されたい。
【００２０】
継続した期間にわたり抗体を恒常的に生成できる乳酸菌のその場所での（in situ）使用に関して、病原菌（例えば、ＨＩＶ）の伝染を阻止するために、十分な抗体の濃度が必要となる。その場所での（in situ）使用に関するそのような抗体濃度は、抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体、並びに付加的に抗ＩＣＡＭ抗体の使用と組合せて用いる場合、抗伝染の効果をもたらすように、提供することができる。
【００２１】
細菌性システム（例えば、乳酸菌、大腸菌）により発現する抗体は、「従来の抗体」ではなく、抗体分子（例えば、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１１抗体）の軽及び重鎖の機能的末端を結合タンパク質と遺伝子学的に融合することにより産生される単鎖抗体（sｃＦｖ）と言われる範疇のものである。結合タンパク質の使用は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Tang, Y., N. Jiang, C. Parakh, and D. Hilvert, 1996, Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology, J. Biol Chem, 271:15682-15686」を参照されたい。加えて本発明の実施では、例えば、二量体、三量体、及びsｃＦｖ四量体のような、更に結合する部位を含むsｃＦｖの変異体である変異物及び代替物を用いてもよい。例えば、「Le Gall, F., S. M. Kipriyanov, G. Moldenhauer, and M. Little, 1999, Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding, FEBS Lett 453:164-168; Lawrence, L.J., A.A. Kortt, P. Iliades, P.A. Tulloch, and P.J. Hudson, 1998, Orientation of antigen binding sites in dimeric and trimeric single chain Fv antibody fragments, FEBS Lett 425:479-484」を参照されたい。結合タンパク質として、付着した重及び軽鎖の可変領域を、目的（例えば、ＣＤ１８）の抗原が結合するような様式で折り畳むのを確保するアミノ酸の配列の何れかが用いられてもよい。
【００２２】
細菌性送達システムは、適用に応じて選択されてもよい。具体的には、乳酸菌送達システムを用いることは、経膣的に適用できる殺菌剤の製剤化に好ましいと考えられる。別の具体例として、大腸菌送達システムを用いることは、経直腸的に適用できる製品（例えば、直腸性交を介する伝染を防止する製品のような）の製剤化に好ましいと考えられる。
【００２３】
本発明の実施に関して、有効成分は、例えば、殺菌剤、遅延放出送達システム、固相システム（structure）、子宮頸部リング、スポンジ、コンドーム、ジェル、クリーム、坐薬、カプセル剤等のような、多様な形態であってよい。殺菌剤は、本発明の有効成分に関して最も好ましい製剤であるが、殺菌剤の剤型が多様であってもよいことは理解されるであろう。具体的には、防御抗体は、送達手段（例えば、遅延放出送達システムのような）を組み込んでいる、又はそこから防御抗体が徐々に放出されるような固相構造をした（例えば、防御抗体又は断片を含ませた固相物質、子宮頸部リング等のような）システムにより送達されてもよい。あるいは、防御抗体は、工場設備で製造されてもよい。更に、精製技術が実用的使用のために改良されることにより、精製した防御抗体を調製して、細菌性送達システム無しで、ジェル、子宮頸部リング、スポンジ等による投与のような、直接的に、ヒト及び哺乳動物に投与することができる。
【００２４】
有効成分の投与は、好ましくは、男性又は女性の消費者自身によってできる。具体的には、例えば、消費者による自己投与を介して、sｃＦｖを発現する細菌が凍結乾燥された形態（例えば、坐薬、カプセル剤等のような）で送達される。別の検討では、ある特定の細菌が、坐薬又はカプセル剤の形態で、冷蔵することなく最大２年間生存可能であることが示めされ、本発明による細菌性システムに関して同様の生存能力が期待できる。細菌が、永久に生き延びるとは考えられないことは理解されるであろう、従って、例えば、数日毎又は月一回のような置き換えが望ましい。本発明は、細菌の持続性を観察するための検出システムの一部として、また細菌の次なる適用が必要とされる場合の指標として、使用できるタンパク質をコードする細菌も提供する。
【００２５】
本明細書には、例示として女性又は男性の具体例が示されているが、これは本発明を限定するものではないことは理解されるべきである。本発明の方法、製品及び製剤は、男性及び女性を経上皮のＨＩＶの伝染（性交に起因するものとは別の経上皮のＨＩＶの伝染のような）から防御することにおいて有用である。
有利なことに、本発明では、細菌は、防御抗体を産生するように設計することができ、その後に、製品の製造工程が、細菌を多量に成長させること、続いて細菌をそのままでの（in situ）送達のために凍結乾燥することを単に含み、これは比較的安価に実施することができる。従って、本発明は、抗体の精製を必要とせず、そして活性な製品を合成するための複雑な化学的工程を必要としない、初期ＨＩＶ感染を予防し、そして経上皮のＨＩＶの伝染を防止する方法を有利に提供する。
（実施例）
【実施例１】
【００２６】
本実施例では、我々は、ＩＣＡＭ−１のリガンドとして、また子宮頸部上皮を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する候補物として、役目を果たすことのできるＬＦＡ−１又はＭａｃ−１分子の一本鎖である、ＣＤ１８に対する抗体を同定する。本実施例はまた、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いた、ＣＤ１８に対する抗体が、どちらか一方の抗体単独の場合よりもＨＩＶ−１に感染された細胞の移動を大きく減少させ、臨床的状況で得られる抗体の濃度にて伝染を有効に遮断することを又実証する。
【００２７】
物質及び方法
ＨＩＶ−１調製物
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD）、ＨＩＶ−１のＣＣＲ５利用の変異体を、１．０ｍｌのアリコート（１×１０６、５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌ）で購入し、液体窒素中に保管した。
ＰＢＭＣの単離及び培養
ヒトＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ勾配（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上で白血球除去の血液（leukopheresed blood）（Hemapheresis Center, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MD）の遠心分離により分離した。ＰＢＭＣは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミン（以下では、ｃＲＰＭＩと言う、培地及び全ての添加剤は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから入手）、１０％の加熱非活性化されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Atlanta Biologicals, Atlanta, GA）、及び５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Sigma, St. Louis, MO）を５％のＣＯ２、３７℃にて添加したＲＰＭＩ−１６４０中で、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで４８時間培養した。４８時間後、ＰＢＭＣは、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Roche Biochemicals, Indianapolis, IN）を添加したｃＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳに移し、そして１０４ＴＣＩＤ５０ＨＩＶＢａl と共に２４時間培養した。ウィルス接種材料を、２４時間後に取り出して、細胞を温ｃＲＰＭＩで洗浄し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新しいｃＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳに加えた。培養物は、感染後（ｐｉ）３日目及び７日目に新培地に供給した。ＰＢＭＣは、感染後７〜９日目に伝染実験に用いた。
【００２８】
ヒト子宮頸部の上皮細胞のトランスウェル（transwell）培養
ヒトの、自然に形質転換した、子宮頸部の上皮細胞株ＨＴ−３（American Type Cell Culture, Rockville, MD, ATCC#HTB-32）は、ｃＲＰＭＩに関して上記のように添加した、ＭｃＣｏｙ社の５ａ培地で１０％ＦＣＳと共に培養し、３日毎に０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Mediatech）による細胞置き換えを行う定期的な置換培養を行った。子宮頸部の上皮細胞は、３．０μｍの孔の大きさを有する直径１２ｎｍのＰＣＦトランスウェル挿入物（Millipore, Bedford, MA）につき、２×１０５ｃｅｌｌｓをｃＲＰＭＩ−１０％のＦＣＳに播腫して、そして３７℃、５％ＣＯ２の条件で保持した。培地は、２〜３日毎に交換した。細胞は、７日目に分極した完全な単層をトランスウェル挿入物上に形成し、これは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）に対する細胞単層の透過性を観察して確認した。トランスウェル挿入物上の子宮頸部の上皮単層は、培養の６〜８日目の間に使用した。
【００２９】
経上皮のＨＩＶ−１の伝染
経上皮移動アッセイは、幾らかの改良を加えて、Ｂｏｍｓｅｌ（Bomsel, M., 1997, Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier, Nat Med 3:42-7）の記述のように実施した。つまり、１×１０６のＨＩＶＢａ−Ｌ感染のＰＢＭＣを、指定された抗体で処理した子宮頸部の上皮単層の頂端部に添加し、そして２４時間移動させた。ＰＢＭＣの生存率は、それらのトランスウェルへの添加に先行して、トリパンブルー排除法（Sigma）により評価し、常に＞８５％であることを見出した。頂端部及び基底部の上澄み液中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の量は、ＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡアッセイ法（Perkin-Elmer, Boston, MA）により測定した。伝染したＰＢＭＣは、基底部のコンパートメントから収集し、遠心分離により沈殿させ、そしてトリパンブルー排除法を用いて血球計で計数し、生存率を評価した。マウス・モノクロナール抗体Ｈ５２（抗ＣＤ１８）及びＭＴ−Ｍ５（抗ＩＣＡＭ−１）は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部（Johns Hopkins University School of Medicine）のＪａｍｅｓ Ｈｉｌｄｒｅｔｈ研究室から入手した。マウス・モノクロナール抗体７Ｅ４（抗ＣＤ１８）は、ベックマン・コールター・イムノテック社（Beckman-Coulter Immunotech Miami, FL）から入手した。マウス骨髄腫ＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、Ｚｙｍｅｄ社（South San Francisco, CA）から入手した。
【００３０】
統計的分析
統計的分析は、Ｉｎｔｅｒｃｏｏｌｅｄ Ｓｔａｔａ ８（Stata Corp, College Station, TX）の統計パッケージを用いて実施した。ボンフェローニ（Bonferroni）補正法と共に一元配置分散分析法（one-way ANOVA）用いて群間の差異を比較して、０．０５に等しい又はより小さいｐ値を有意であると見なした。
【００３１】
実験結果
ＣＤ１８に対する抗体の子宮頸部上皮単層を越えての細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止におけるＣＤ１８に対する抗体の効果を、抗ＩＣＡＭ−１と相対的に比較するために、抗ＩＣＡＭ−１（クローンＭＴ−Ｍ５）、抗ＣＤ１８（クローンＨ５２）又はイソタイプ対照マウスＩｇＧ１の何れかを、子宮頸部上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加する直前の１×１０６のＨＩＶ感染のＰＢＭＣに加えた。ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００３２】
抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の両方は、未処理及びイソタイプの対照の両方と比較した場合、テストした１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の全ての濃度で、有意に（ｐ＜０．０１）細胞移動を減少させた（図１Ａ）。しかし、抗ＣＤ１８は、テストした全ての濃度で抗ＩＣＡＭ−１よりも有意に（ｐ＜０．０５）細胞移動を大きく阻止し、更に抗ＩＣＡＭ−１の対応する濃度での阻止と比較して、基底部のコンパートメントで検出された細胞の数を２．５〜４倍減少させた。同様の傾向は、基底側の上澄みで検出されたＨＩＶ−１ｐ２４の量の測定においても観察された。両方の抗体処理物は、各濃度で、有意に（ｐ＜０．０１）基底部のコンパートメントで検出されたＨＩＶ−１ｐ２４の量を減少させた（図１Ｂ）。ＨＩＶ−１ｐ２４は、対応する抗ＩＣＡＭ−１処理群よりも、抗ＣＤ１８処理群で少なく検出されたが、差異は統計的に有意ではなかった。抗体での処理は、トランスウェルの頂端側で細胞により放出されるＨＩＶ−１ｐ２４の量を変化させなかった。
【００３３】
インビトロで観察された抗ＣＡＭ−１に対する阻止レベルは、インビボでのＨＵＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを用いて、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染における高度に有意な減少と関連付けられている（Chancey et al., supra）。従って、これらの実験において観察された高い阻止力は、ＣＤ１８に対する抗体が抗ＨＩＶ殺菌剤としての開発に極めて高い可能性を有していることを実証している。
【００３４】
５０：５０の抗ＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８抗体の混合物によるＨＩＶ−１感染培養物からの細胞移動の低減
異なる接着分子に対する抗体の混合物が単一の抗体よりも大きく阻止できるかどうかを判定する目的で、５０：５０の比で混合したＣＤ１８及びＩＣＡＭ−１に対する抗体を、それらを子宮頸部上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加する直前の、１×１０６のＨＩＶ−感染ＰＢＭＣに加えた。ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００３５】
全ての抗体処理物は、未処理又はイソタイプ対照の処理トランスウェルと比較した場合、感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を全ての濃度で有意に（ｐ＜０．０５）減少した（図２Ａ）。ここでも抗ＣＤ１８は、抗ＩＣＡＭ−１よりも大きく細胞移動を減少させ、そして抗ＩＣＡＭ−１／抗ＣＤ１８を５０：５０で含む混合物での処理物は、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８の何れか単独での対応する濃度で観察された場合より優れて、細胞移動において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）をもたらした（図２Ｂ）。
【００３６】
抗体の濃度を更に減小した場合、５０：５０混合物の細胞移動を阻止することに対する増進が、５ｕｇ／ｍｌの濃度で観察されたが、１ｕｇ／ｍｌでは５０：５０混合物は抗ＣＤ１８単独の場合と同程度であった（図５）。１ｕｇ／ｍｌでの抗ＩＣＡＭ−１単独は、移動を３８％減少させただけであり、わずかに統計的に有意（ｐ＜０．０５１）であっただけである。このため、これは低い濃度での抗ＩＣＡＭ−１の寄与の低下を示しているかもしれない。
【００３７】
各々の抗体のより少ない総量でより顕著な効果が達成できることを示唆するので、この接着受容体対に対する抗体である抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物によるＨＩＶ−１感染細胞の移動を阻止することに対する増進化は、注目すべきである。低い濃度での増大した有効性は、送達システムに関係なく、殺菌剤ベースの抗体において好ましいであろう。感染細胞の伝染におけるデータは、各々の抗体の非常に低い濃度で阻止することが達成できることを明らかにしている。従って、ＣＤ１８に対する抗体の単独及びＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せたものは、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する方法を提供するはずであり、そしてこの方法は、形質転換された細菌による産生のままで（in situ）の結果で、インビボで達成可能であると現実的に期待できる濃度の抗体で実現できる。
【実施例２】
【００３８】
抗体及びＦａｂの産生
マウスＩｇＧ１抗ヒトモノクロナール抗体Ｈ５２（抗ＣＤ１８）及びＭＴ−Ｍ５（抗ＩＣＡＭ−１）は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部（Johns Hopkins University School of Medicine）のＪａｍｅｓ Ｈｉｌｄｒｅｔｈ研究室から入手した。マウスＩｇＧ１抗ヒトモノクロナール抗体７Ｅ４（抗ＣＤ１８）は、ベックマン・コールター・イムノテック社（Beckman-Coulter Immunotech Miami, FL）から入手した。マウス骨髄腫ＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、Ｚｙｍｅｄ社（South San Francisco, CA）から入手した。ハムスター抗マウスＩＣＡＭ−１及びハムスターＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（San Diego, CA）から入手した。Ｆａｂの検討のために、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４及びマウスＩｇＧ１イソタイプ（対照）は、フィシンベースのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ）’２消化キット（Pｉerce, Rockford IL）を用いて消化及び精製した。
【００３９】
膣伝染のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデル
ＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、以前に記述されている（Ｋｈａｎｎａ，Ｋ．Ｖ．，Ｋ．Ｊ．Ｗｈａｌｅｙ，Ｌ．Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｔ．Ｒ．Ｍｏｅｎｃｈ，Ｋ．Ｍｅｈｒａｚａｒ，Ｒ．Ａ．Ｃｏｎｅ，Ｚ．Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｅ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ｔ．Ｅ．Ｈｏｅｎ，Ｌ．Ｓｈｕｌｔｚ及びＲ．Ｂ．Ｍａｒｋｈａｍの「マウスにおける細胞関連のＨＩＶ−１の膣伝染は、局所の膜修飾剤により阻止される。」（J Clin Invest 109:205-211, 2002））。即ち、重症の複合型免疫不全症を有する雌マウス（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ）（Bosma, G. C., R. P. Custer, and M. J. Bosma. 1983, A sever combined immunodeficiency mutation in the mouse, Nature 301:527-530）は、ＳＣＩＤマウス・コロニー（Ｊａｃｋｓｏｎ研究室（Bar Harbor,Maine）由来のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスを用いて確立した）から入手した。マウスは、１ｍｌのＰＢＳ中の５×１０７の未刺激、未感染のＨｕＰＢＭＣを腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与し、次いで７日後に２．５ｍｇのプロゲスチン（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ（登録商標）、Upjohn Pharmaceuticals, Kalamazoo, Michigan）で皮下（ｓ．ｃ．）処理した。プロゲスチン処理から７日間、マウスは、Ｖａｐｏｒｓｔｉｃｋ麻酔装置（SurgiVet Inc., Waukesha, WI）により供給される３０〜５０％のＯ２混合中で、イソフルラン（IsoFlo, Abbott Laboratories, Chicago IL）で麻酔をかけて、そして、ＰＢＳ−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Sigma）に懸濁した１×１０６のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ−感染ＨｕＰＢＭＣを受ける５分前に、抗ＩＣＡＭ−１（ＭＴ−Ｍ５）、抗ＣＤ１８（Ｈ５２）、若しくは指定のような抗ＩＣＡＭ−１：抗ＣＤ１８の５０：５０混合物、又はイソタイプの対照抗体の適切な混合物の何れかを、１０μｌ中の総量０．４μｇで膣内に投与した。マウスは５分間麻酔をかけたままにし、次いでピペットにて膣内接種を行い、接種物の漏出は観察されなかった。膣組織への外傷性障害を避けるために細心の注意を払った。２週間後、マウスを安楽死させて、腹膜細胞を冷ＰＢＳで洗浄して回収した。洗浄により回収された（マウス及びヒト由来の両方の）細胞は、ＤＮＡ−ＰＣＲによりヒトβグロビンに関してアッセイを行い、マウスにおけるヒト細胞の移植が成功したことを確認した。ヒト細胞を有さないマウスは、実験群の通常は０〜３０％の間であり、分析から除外した。
【００４０】
検討のマウスの腹膜腔から採取した細胞からのウィルスの回収を評価するために、未感染のＨｕＰＢＭＣは、ＰＨＡで刺激して、そしてＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスから回収した腹膜細胞と共培養するために、調製のＩＬ−２添加培地（１マウス当たり１×１０６）に保持した。陽性マウスは、ＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡにより共培養細胞からの上澄みで判定したが、これは我々の実験において、感染したマウスを検出する最も感度の高い方法である。全ての場合に、細胞は、マウスの腹膜腔に通常移植するために得た細胞の提供者以外の提供者から入手した。
【００４１】
膣接種に用いるＨｕＰＢＭＣは、上記のように分離して、ｃＲＰＭＩ−１６４０中に保持した。ＰＢＭＣは、２日間ＰＨＡで刺激して、その後細胞は、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）と共にｃＲＰＭＩ中で１０４ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌに曝した。感染細胞培養物は、１０日間ＩＬ−２を添加したｃＲＰＭＩに保持して、マウスに接種した。
【実施例３】
【００４２】
ＣＤ１８に対する抗体による細胞関連のＨＩＶ−１の子宮頸部の上皮単層を越えての伝染の阻止
細胞移動の減少（実施例１に上述のように）は、単一のハイブリドーマ由来の抗ＣＤ１８に限定されるものではなく、ＣＤ１８に対する第２の阻止抗体であるクローン７Ｅ４を５０及び１０μｇ／ｍｌでテストした場合、感染培養物からの細胞移動は、各々６３％及び５５％減少した（図９Ａ）。伝染の指標として基底部のＨＩＶ−１ｐ２４を用いると、感染のより大きな減少が観察され、５０及び１０μｇ／ｍｌの７Ｅ４では、ｐ２４の伝染は各々８１％及び６２％減少した（図９Ｂ）。抗ＣＤ１８クローンＨ５２で観察される移動及び伝染の減少より低いレベルではあるが、両方の基準で測定された阻止力は統計的に非常に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【実施例４】
【００４３】
抗ＣＤ１８Ｆａｂのインビトロでの細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
分子当たり同じ数の抗原結合部位を有しているが抗体分子のＦｃ領域が欠如している一価の抗体の断片が、完全な抗体と同様に阻止するかどうか判定する目的で、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４のＦａｂ断片を、インビトロでのＨＩＶ−１ｐ２４の伝染及び感染細胞の移動を阻止するそれらの能力に関してテストした。完全な抗ＣＤ１８、イソタイプの対照抗体、抗ＣＤ１８Ｆａｂ、又はイソタイプの対照Ｆａｂは、ＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣと共にＨＴ−３子宮頸部の上皮単層の頂端側に添加され、そして細胞は２４時間移動するようにした。Ｆａｂの濃度は、抗ＣＤ１８結合部位の数と等しくなるように調節した。
【００４４】
３４μｇ／ｍｌの濃度では、抗ＣＤ１８Ｆａｂは、未処理及びイソタイプの対照の両方と比べて、有意に（ｐ＜０．０５）、ＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの移動及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染の両方を減少させた（図１０Ａ〜Ｂ）。濃度を６．７μｇ／ｍｌに下げた場合、イソタイプの対照Ｆａｂと比較して、細胞移動は統計的に有意ではない減少を示したが（図１０Ａ）、ＨＩＶ−１ｐ２４の伝染は有意に減少した（図１０Ｂ）。しかし、テストした両方の濃度では、抗ＣＤ１８Ｆａｂは、完全な抗ＣＤ１８の対応する濃度の効果よりも劣るレベルで伝染を阻止した。３４μｇ／ｍｌのＦａｂ及び５０μｇ／ｍｌの完全な抗ＣＤ１８において、伝染は、細胞移動に関して各々４５．５±６．８％及び６２．５±６．３％減少し、ｐ２４に関して各々６３．８±２．６％及び７１．３±０．２％減少した。
【実施例５】
【００４５】
抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８抗体の５０：５０混合物による細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の減少
インテグリン接着分子の相互作用に含まれる受容体リガンド対の各構成要素に対する抗体の混合物が、同じ総濃度の単一の抗体よりも有効に阻止できるかどうか判定するために、ＣＤ１８及びＩＣＡＭ−１に対する抗体の５０：５０の比の混合物は、１×１０６のＰＢＭＣに加えて、直ちに子宮頸部の上皮トランスウェル培養物の頂端のチェンバーに添加した。ＰＢＭＣは２４時間移動させ、そして抗体はアッセイを実施する間存在させておいた。
【００４６】
テストした全ての濃度での抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の処理物は、未処理及びイソタイプ対照の処理培養物と比べて、有意に（ｐ＜０．０５）、感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を減少させた（図１１Ａ）。ここでも抗ＣＤ１８は、抗ＩＣＡＭ−１よりも大きく細胞移動を減少させ、そして抗ＩＣＡＭ−１：抗ＣＤ１８の５０：５０混合物での処理は、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８クローンＨ５２の何れか単独での対応する濃度で観察された場合より、細胞移動において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）をもたらした（図１１Ｂ）。抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物を対応する濃度の抗ＩＣＡＭ−１と比較した場合に、伝染したＨＩＶ−１ｐ２４において有意な減少が観察されたが、抗ＩＣＡＭ−１／抗ＣＤ１８混合物を単独使用の抗ＣＤ１８と比較した場合に観察される減少はわずかであり、統計的に有意なものではなかった（図１１Ｃ）。抗体の濃度を更に下げた場合、細胞移動を阻止することに対する５０：５０混合物の増進化が、５ｕｇ／ｍｌの濃度で観察された（図５）。
【実施例６】
【００４７】
抗ＩＣＡＭ−１を伴う抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４
単独で用いる場合にＨ５２よりも低い効果での阻止を示す、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４を抗ＩＣＡＭ−１と混合した場合、劇的な効果が観察された。テストした全ての濃度で、抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、何れかの抗体の単独での対応する濃度の効果よりも有意に、ＨＩＶ−１感染細胞の細胞移動を減少させた（図１２Ａ〜Ｂ）。同様の効果は、ＨＩＶ−１ｐ２４を指標として用いた観察でも見られ、５０：５０の混合物が、１０ｕｇ／ｍｌ及び２０ｕｇ／ｍｌの濃度で、対応する単独抗体の効果よりも有意に伝染を減少させた（図１２Ｃ〜Ｄ）。とりわけ、５ｕｇ／ｍｌの濃度の５０：５０の混合物は、未処理のサンプルと比較して、細胞移動を９０±２．０％減少させ、２０μｇ／ｍｌでは、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の何れよりも（各々、７８±３．６及び６２±３．０％（図１２Ｂ））極めて有意に減少させた。
【実施例７】
【００４８】
抗ＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物によるインビボでの細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止
子宮頸部上皮におけるＩＣＡＭ−１に対する抗体は、Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ処理のＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを用いるインビボのモデルで、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を減少させることが観察されている。移動細胞におけるＣＤ１８の阻止物質の単独、又はマウスの子宮頸部上皮におけるＩＣＡＭ−１の阻止物質との組み合わせが、インビボでの同じモデルにおいてＨＩＶ−１の伝染を阻止できるかどうか評価するために、抗マウスＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８、抗マウスＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物、又はイソタイプの対照抗体の混合物の何れか（１０μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中の０．４μｇの単一抗体又は各々０．２μｇの各抗体の混合物）は、膣内に投与され、次いで５分後に１×１０６のＨＩＶ−１感染ヒトＰＢＭＣの膣内接種を実施した。抗マウスＩＣＡＭ−１、抗ＣＤ１８及び抗マウスＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８の混合物の全ては、対照群と比較して、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させた（表１）。用いた抗体の濃度では、単一抗体で処理した群において完全な防御がもたらされた。
【００４９】
【表１】
【実施例８】
【００５０】
上皮に適用した抗ＣＤ１８による感染しやすい表皮下細胞の遊離ウィルスの初期感染の防止
性的伝染における無細胞及び細胞関連のウィルスの相対的な重要性は公知ではないため、無細胞のウィルスの伝染における抗ＣＤ１８及び抗ＩＣＡＭ−１の有効性を評価した。無細胞のウィルスは、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスシステムに伝染できない、そこでこの検討の有効性を、ヒト血清を用いてインビトロのトランスウェルモデルで評価した。検討は、上部チェンバーに添加した抗体が、下部チェンバーに置かれ、次いで上部チェンバーに無細胞のウィルス及び異なる濃度のＭａｂを接種する、感染しやすいＰＢＭＣ（ＰＨＡ及びＩＬ−２に活性化される）の遊離ウィルスによる感染を減少できるかどうかにより実施した。２４時間後、トランスウェル、細胞は、下部チェンバーから取り出し、洗浄し、そして培養培地を含有するＩＬ−２に再懸濁した。培養上澄み液中のｐ２４の濃度を７日間にわたり測定した。図１３のデータは、ｐ２４の濃度が、抗ＣＤ１８を上部チェンバーに添加しているトランスウェル中で有意に低いことを示す。更に、抗ＩＣＡＭ−１抗体は、無意味な対照の抗体を有するトランスウェルでの結果と比較して感染を減少させた。
【００５１】
これらの検討は、インビトロの子宮頸部上皮を越えてのＨＩＶ−１感染細胞の伝染におけるβ−インテグリンＣＤ１８の役割を実証する。抗ＩＣＡＭ−１のインビトロで観察される阻止のレベルは、インビボのＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを用いる細胞関連のＨＩＶ−１の伝染における高度に有意な減少と以前に関連付けられている。よって、本発明の実施例１〜２の実験において観察される高い程度の阻止力は、ＣＤ１８に対する抗体の抗ＨＩＶ−１殺菌剤としての有用性を実証する。
【００５２】
ＣＤ１８は、白血球に発現する細胞接着受容体のＬｅｕ−ｃａｍ系の共通のβ２サブユニットであり、これには、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、α１β２）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、αＭβ２）、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８、αｘβ２）及びＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８（αＤβ２）が含まれる（Sanchez-Madrid, F., J. A. Nagy, E. Robbins, P. Simon, and T. A. Springer, 1983, A human leukocyte differentiation antigen family with distinct alpha-subunits and a common beta-subunit:the lymphocyte function-associated antigen (LFA-1), the C3bi complement receptor (OKM1/Mac-1), and the p150,95 molecule, J Exp Med 158:1785-1803）。ＣＤ１８に対する抗体が細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を阻止する（例えば図１及び２）という観察は、単球及びリンパ球の接着並びに経内皮移動におけるＣＤ１８の確立された役割と一致するものである（Greenwood, j., Y. Wang, and V. L. Calder, 1995, Lymphocyte adhesion and transendothelial migration in the central nervous system:the role of LFA-1, ICAM-1, VLA-4 and VCAM-1. off, Immunology 86:408-15; Hakkert, B. C., T. W. Kuijpers, J. F. Leeuwenberg, J. A. van Mourik, and D. Roos, 1991, Neutrophil and monocyte adherence to and migration across monolayers of cytokine-activated endothelial cells: the contribution of CD18, ELAM-1, and VLA-4, Blood 78:2721-6; Meerschaert, J., and M. B. Furie, 1995, The adhesion molecules used by monocytes for migration across endothelium include CD11a/CD18, CD11b/CD18, and VLA-4 on monocytes and ICAM-1, VCAM-1, and other ligands on endothelium, J Immunol 154:4099-112; Meerschaert,J., and M. B. Furie, 1994, Monocytes use either CD11/CD18 or VLA-4 to migrate across human endothelium in vitro, J Immunol 152:1915-26; Muller, W. A., and S. A. Weigl, 1992, Monocyte-selective transendothelial migration; dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay, J Exp Med 176:819-28; Parkos, C. A., C. Delp, M. A. Arnaout, and J. L. Madara, 1991, Neutrophil migration across a cltured intestinal epithelium, Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction, J Clin Invest 88:1605-12; Schenkel, A. R., Z. Mamdouh, and W. A. Muller, 2004, Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation, Nat Immunol 5:393-400; te Velde, A. A., G. D. Keizer, and C. G. Figdor, 1987, Differential function of LFA-1 family molecules (CD11 and CD18) in adhesion of human monocytes to melanoma and endothelial cells, Immunology 61:261-7）。
【００５３】
他方、ＩＣＡＭ−１及びそのリガンドの接着の阻止を示した、異なる抗ＩＣＡＭ−１抗体が、ｐ２４ ＥＬＩＳＡによって示されるように、広く変化する範囲の程度にＨＩＶ−１の伝染を減少させることが観察されている。これらの実施例では、テストした接着阻止の抗ＣＤ１８クローンであるＨ５２（Hildreth, J. E., V. Holt, J. T. August, and M. D. Pescovitz, 1989, Monoclonal antibodies against porcine LFA-1: species cross-reactivity and functional effects of beta-subunit-specific antibodies, Mol Immunol 26:883-95）及び７Ｅ４（Nortamo, P., M. Patarroyo, C. Kantor, J. Suopanki, and C. G. Gahmberg, 1988, Immunological mapping of the human leukocyte adhesion glycoprotein gp90 (CD18) by monoclonal antibodies, Scand J Immunol 28:537-46）の両方は、ＨＩＶ−１の伝染及びＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの移動の両方を、有意に阻止できることが実証されている（図２）。テストした全ての濃度で、クローンＨ５２由来の抗体は、クローン７Ｅ４由来の抗体よりも有効に阻止した。
【００５４】
観察されたように、抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４のＦａｂは、その効果は完全な７Ｅ４抗体よりわずかに劣っているが、ＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させ、そして子宮頸部の上皮単層を越えるＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの数を減少させた（図１０）。先に用いた完全な抗体と比較して、Ｆａｂは、一価であり、そして作り出された乳酸菌により産生されるであろうsｃＦｖとより近い大きさである。観察された阻止レベルにおけるわずかな減少は、Ｆａｂを産生するために用いた酵素消化に起因する、結合能力の低下によるものかもしれない。これらの結果は、一価の、分泌された抗ＣＤ１８ｓｃＦｖが、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を減少させるのに用いることができると示唆している。
【００５５】
抗体による阻止のレベルが、２つの異なる抗体の組合せにより改良できるかどうかを判定するために、抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の混合による到達の阻止レベルを、各抗体単独での同じ濃度で観察された効果と比較した。抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８クローンＨ５２又は７Ｅ４のどちらかとの混合物は、どちらか一方の抗体が単独の対応する濃度の効果と比較して、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を有意に減少させ（図１１Ａ〜Ｂ、５及び図１２Ａ〜Ｂ）、そしてＨＩＶ−１の伝染を有意に減少させた（図１２Ｃ〜Ｄ）。これは、ＩＣＡＭ−１とＣＤ１８の両方が、子宮頸部上皮を越えてのＨＩＶ−１感染細胞の移動に対する寄与が小さい他方の結合パートナーを結合しているかもしれない、しかし単一抗体では阻止が不十分な抗体濃度で最大の便益が観察されるので、抗体の組合せがＩＣＡＭ−１／ＣＤ１８の相互作用をより有効に阻止する可能性が高い、ということを示唆している。より顕著な効果が、抗体のより低い総量で達成できるので、この接着受容体対に対する抗体である抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物によって、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染の阻止が増強されることは、注目に値する。より低い濃度（例えば、約１〜５マイクログラム範囲の濃度）での増大した有効性は、送達システムに関係なく抗体ベースの殺菌剤において好ましいであろう。他の検討では、発明者らの研究は、乳酸菌により分泌され、インビトロのアッセイでの使用の前に精製した抗ＩＣＡＭ−１ ｓｃＦｖが、６７μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合に、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の経上皮移動及びＨＩＶ−１の伝染の両方を阻止できることを実証した。液体培養において５μｇ／ｍｌまでの濃度でも効果が得られている（データは示さず）。
【００５６】
特に、ＣＤ１８に対する抗体は、４０μｇ／ｍｌでＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける細胞関連のＨＩＶ−１の伝染を完全に阻止した（表１）。
２つのチェンバーシステムでは、両方の抗体、特に抗ＣＤ１８は、下部チェンバーに置かれた表皮下のＰＢＭＣの伝染を明確に減少させた。抗体の濃度は、上部チェンバーで観察される濃度（データは示さず）の約１０％で、トランスウェルの下部チェンバーにおいて検出することができた。伝染の阻止は、トランスウェルアッセイにおいて完全ではなかったが、細胞関連の伝染におけるそのような減少レベルは、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける１００％の防御につながる。よって、抗ＣＤ１８は、細胞関連及び無細胞のウィルスの両方の伝染を阻止することに有効であろう。
【００５７】
これらの実験的な実施例の結果は、ＨＩＶ−１の性的伝染におけるＣＤ１８の重要性を実証している。ＣＤ１８に対する抗体は、乳酸菌ベースの送達システムを用いる抗ＨＩＶ−１殺菌剤としての有用性を示す。更には、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いるＣＤ１８に対する抗体は、女性泌尿生殖器において乳酸菌産生ｓｃＦｖをそのまま（in situ）で用いて提供することが可能な抗体濃度で、経上皮ＨＩＶの伝染を阻止することを示している。
【００５８】
女性へのＨＩＶ−１の伝染を防止するための殺菌剤は、世界的規模のＨＩＶの蔓延を阻止することにおいて重要な役割を果たすことができる。本明細書における実験に基づき、本発明者らは、本明細書の宿主細胞接着分子に対する抗体が、抗ＨＩＶ−１殺菌剤として有用であると考えている。これらの実験的実施例は、βインテグリンＣＤ１８に対する抗体の２つの異なるクローンが、ＨＩＶ−１の伝染と感染培養物からの細胞の移動の両方を減少させる（ｐ＜０．０１）ことを実証している。更には、抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８のクローンのどちらか一方との５０：５０混合物が、どちらかの抗体を単独で同じ総濃度で用いた場合よりも、有意に（ｐ＜０．０５）ＨＩＶ−１感染培養物からのＰＢＭＣの伝染を減少させた。インビボでは、抗ＣＤ１８及び抗ＣＤ１８と抗ＩＣＡＭ−１の５０：５０の混合物の両方が、ＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおける細胞関連のＨＩＶ−１の膣内伝染を、有意に減少させた。これらの結果は、細胞関連のＨＩＶ−１の伝染におけるＣＤ１８の重要性を実証するものである。更には、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と組合せて用いるＣＤ１８に対する抗体は、乳酸菌産生のｓｃＦｖを用いてインビボで達成することが可能な濃度で、阻止することを示している。
【実施例９】
【００５９】
組み換え菌
また、防御抗体の別の態様として、組み換え菌（例えば、ｒＣＤ５４のような）は、機能性（アゴニスト）または欠損性（アンタゴニスト）リガンドを発現するのに用いることができる。具体的には、感染したリンパ球又はマクロファージの表面のＬＦＡ−１又はＭａｃ−１による上皮細胞の表面のＩＣＡＭ−１の結合は、可溶性リガンドがＩＣＡＭ−１受容体を架橋することができない１価の形態である限り、可溶性形態のＬＦＡ−１又はＭａｃ−１リガンドによるＩＣＡＭ−１受容体の占有により阻止され得る。そのような架橋では、上皮が崩壊することになる。同様に、可溶性ＩＣＡＭ−１は、上皮細胞の表面のＩＣＡＭ−１受容体によって、ＬＦＡ−１又はＭａｃ−１との結合が阻止され得る。
【００６０】
本発明はその好ましい態様に関して記述しているが、当業者は、本発明が添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内の変更を実施できることを理解されるであろう。従って、本発明は、上述のような態様に限定されるべきものではなく、本明細書に提供する記述の精神及び範囲内の全ての変更及びその均等物をさらに含むべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、ＣＤ１８に対する抗体が、ＩＣＡＭ−１に対する抗体と同様に又はより優れて、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を（図１Ａ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を（図１Ｂ）阻止することを示す棒グラフである。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１００、５０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８Ｈ５２又はイソタイプ対照）と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。図１Ａ〜５において、エラーバーは、±一標準偏差を示す。図１Ａに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０１であり、そして対応する濃度での抗ＩＣＡＭ−１と抗ＣＤ１８群の間は、ｐ＜０．０５である。図１Ｂに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０１である。
【図２】図２Ａは、棒グラフであり、そして図２Ｂは折れ線グラフである。抗ＩＣＡＭ及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動をどちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。図１Ａに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。図１Ｂに関して、同じ濃度での各処理物の間は、ｐ＜０．０５である。
【図３】図３は、棒グラフである。抗ＣＤ１８単独、又は抗ＩＣＡＭ−１と組合せて用いた場合は、ＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を抗ＩＣＡＭ−１単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌで、指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり；抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図４】図４は、棒グラフである。抗ＣＤ１８によって阻止すること、及び抗ＩＣＡＭ−１との混合物によって増強することは、１つの抗体クローンに限定されるものではない。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。
【図５】図５は、棒グラフである。抗ＣＤ１８単独、及び抗ＩＣＡＭ−１と組合せた場合は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動を減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、１又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。
【図６】図６は、折れ線グラフである（ｙ＝０．００７３ｘ−０．０４７３；Ｒ＝０．９８１８）。
【図７】図７は、折れ線グラフであり、抗ＩＣＡＭ、抗ＣＤ１８及び５０／５０混合物に関するデータを有する。図７Ａは、図７に関する棒グラフである。
【図８】図８は、棒グラフであり、未処理物、イソタイプ対照、抗ＩＣＡＭ、抗ＣＤ１８及び５０／５０混合物の実験のデータに関する。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、棒グラフである。抗ＣＤ１８クローン７Ｅ４は、ＨＩＶ−１感染細胞の移動を（図９Ａ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染を（図９Ｂ）阻止する。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＣＤ１８ Ｈ５２、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、各群につき３回繰り返して、基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度又は生存ＰＢＭＣ数の平均±ＳＤとして示す。両方のグラフに関して、未処理及びイソタイプ対照と比較した各抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、棒グラフである。抗ＣＤ１８Ｆａｂは、ＨＴ−３細胞単層を越えてのＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣ（図１０Ａ）及びｐ２４（図１０Ｂ）の伝染を阻止する。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、指定の抗体と共に浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。全ての未処理の抗体は、５０又は１０μｇ／ｍｌの濃度で用い、そして全てのＦａｂは結合可能な部位と等しくなるよう３４又は６．７μｇ／ｍｌで用いる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１０Ａ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１０Ｂ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。Ａに関して、未処理及び対応するイソタイプ対照と比較した処理物は、ｐ＜０．０５であり；Ｂに関して、未処理及び対応するイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１１Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１１Ｃ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣは、５０、２０又は１０μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ Ｈ５２又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数（図１１Ａ、Ｂ）又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度（図１１Ｃ）の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１１Ａ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１１Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての処理物は、ｐ＜０．０５であり、抗ＩＣＡＭ−１と比較した抗ＣＤ１８及び５０：５０混合物は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、グラフである。抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＣＤ１８ ７Ｅ４の５０：５０混合物は、ＨＩＶ−１感染培養物からの細胞の移動（図１２Ａ、Ｂ）及びＨＩＶ−１ｐ２４の伝染（図１２Ｃ、Ｄ）を、どちらか一方の抗体単独の場合よりも、大きく減少させる。１×１０６のＨＩＶ−１感染のＰＢＭＣは、総量２０、１０又は５μｇ／ｍｌでの指定の抗体（抗ＩＣＡＭ−１ ＭＴ−Ｍ５、抗ＣＤ１８ ７Ｅ４又はイソタイプ対照）又は混合物と共に、浸透性のトランスウェル支持体で成長したＨＴ−３単層の頂端側に添加されて、そして２４時間移動させられる。データは、生存ＰＢＭＣ数又は基底部のＨＩＶ−１ｐ２４の濃度の平均±ＳＤとして示し、そして各処理群につき３回繰り返した、２つの別の実験を表す。（図１２Ａ、Ｃ）未処理及びイソタイプ対照と比較した全ての抗体処理物は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｂ）同じ濃度での各処理物間は、ｐ＜０．０５である。（図１２Ｄ）混合物及び１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度の処理物間は、ｐ＜０．０５である。
【図１３】図１３は、子宮頸部上皮下での標的細胞の感染を減少させるかどうか判定するための、ＩＣＡＭ−１及びＣＤ１８に対する抗体を単独及び組合せの両方で用いる実験に関するデータを示すグラフである。総量２０ｕｇ／ｍｌの指定の抗体又は混合物は、１×１０３のＴＣＩＤ５０ＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦに添加して、直後にＭＥ−１８０トランスウェル培養物の頂端側に基底部のコンパートメント中の１×１０６ＰＨＡブラストを添加して、そして３７℃にて２４時間培養した。次いでトランスウェルを取り除いて、ＰＢＭＣの上澄みを４８時間間隔でサンプリングした。基底部のコンパートメント中の細胞の感染は、培養した細胞由来の上澄み中のＨＩＶ−１ｐ２４の増加レベルにより測定した。データは、単一ウェルである抗ＣＤ１８を除いて、３つのウェルの平均±ＳＤとして示す。白抜きの記号は、未処理細胞との有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。抗ＣＤ１８及び抗ＩＣＡＭ−１における組合せの効果が見られ、ここにおいて組合せの効果の殆どは、抗ＣＤ１８に起因すると見なされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染を受ける可能性のある上皮を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方に対して曝露することを含んでなる、ここにおいて上皮を抗体に曝露する段階がＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止する、ヒト又は哺乳動物でのＨＩＶの初期感染を防止する方法。
【請求項２】
上記ＨＩＶが、無細胞のＨＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＨＩＶが、細胞関連のＨＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せた抗ＩＣＡＭ抗体に上皮を曝露することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの細菌性の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの乳酸菌の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上皮が、膣上皮、子宮頸部上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せからなる群より選ばれる産生物として、細菌性の送達システムにより発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ曝露を受ける可能性のある上皮を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方に対して曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物へのＨＩＶの経上皮伝染を阻止する方法。
【請求項１４】
上皮を抗体に曝露する段階が、ＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＨＩＶが、無細胞のＨＩＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＨＩＶが、細胞関連のＨＩＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上皮を越えてのＨＩＶの伝染が減少する又は防止される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＶの性的伝染が減少する又は防止される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せて抗ＩＣＡＭ抗体に、上皮を曝露することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの細菌性の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの乳酸菌の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトが女性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトが男性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上皮が、膣上皮、子宮頸部上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮からなる群より選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せからなる群より選ばれる産生物として、細菌性の送達システムにより発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方を含んでなる、殺菌剤。
【請求項３１】
抗体が、細菌性の送達システムによりｓｃＦｖとして発現する、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３２】
抗体を、少なくとも１つの乳酸菌の細菌性送達手段を介して、防御されるべき上皮に送達することができる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３３】
少なくとも１つの抗ＩＣＡＭ抗体を更に含んでなる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３４】
抗ＩＣＡＭ抗体（単一又は複数）並びに抗ＣＤ１８及び／又は抗１１抗体を一緒にした累積的な抗ＨＩＶの効果が、（１）個別の抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体の効果、及び（２）個別の抗ＩＣＡＭ抗体の効果を足した効果と、少なくとも等しい又はそれより大きい、請求項３３に記載の殺菌剤。
【請求項３５】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３６】
（Ａ）軽鎖の抗原結合性の可変領域及び重鎖の抗原結合性の可変領域を結合タンパク質に融合して、単鎖の抗体（ｓｃＦｖ）を形成すること（ここにおける抗体分子は、同じであるか又は異なっていてもよく、そして抗ＣＤ１１及び抗ＣＤ１８より選ばれる）、
（Ｂ）細菌性の送達システムが、ＨＩＶの伝染から防御されるべき上皮を含有する環境において、段階（Ａ）の単鎖抗体を発現する状態を形成すること、
を含んでなる、殺菌剤を作成する方法。
【請求項３７】
細菌性の送達システムが、乳酸菌、大腸菌及び乳酸球菌からなる群より選ばれる少なくとも１つの細菌を含んでなる、請求項３６に記載の作成方法。
【請求項３８】
結合タンパク質が、付着の重鎖及び軽鎖の可変領域をＣＤ１８が結合するような構造に折り畳んでいる、アミノ酸の配列を含んでなる、請求項３６に記載の作成方法。
【請求項３９】
発現産生物が、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１、及び組み換え菌により発現するリガンドからなる群より選ばれる、ＨＩＶ−１の経上皮伝染を阻止する発現産生物。
【請求項１】
ＨＩＶ感染を受ける可能性のある上皮を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方に対して曝露することを含んでなる、ここにおいて上皮を抗体に曝露する段階がＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止する、ヒト又は哺乳動物でのＨＩＶの初期感染を防止する方法。
【請求項２】
上記ＨＩＶが、無細胞のＨＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＨＩＶが、細胞関連のＨＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せた抗ＩＣＡＭ抗体に上皮を曝露することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの細菌性の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの乳酸菌の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上皮が、膣上皮、子宮頸部上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せからなる群より選ばれる産生物として、細菌性の送達システムにより発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ曝露を受ける可能性のある上皮を、１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方に対して曝露することを含んでなる、ヒト又は哺乳動物へのＨＩＶの経上皮伝染を阻止する方法。
【請求項１４】
上皮を抗体に曝露する段階が、ＨＩＶ感染の何れの確立よりも先行し、そしてＨＩＶ感染の確立を防止する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＨＩＶが、無細胞のＨＩＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＨＩＶが、細胞関連のＨＩＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上皮を越えてのＨＩＶの伝染が減少する又は防止される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＶの性的伝染が減少する又は防止される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ１８及び／又はＣＤ１１の抗体と組合せて抗ＩＣＡＭ抗体に、上皮を曝露することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの細菌性の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの乳酸菌の送達システムを介して、抗体を上皮へ送達することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトが女性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトが男性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
用いられる乳酸菌の送達システムの量が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体を０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲の濃度で、発現するのに十分な量である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
細菌性の送達システムが、ｓｃＦｖを発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体及び／又はｓｃＦｖ様分子の四量体の濃度が、約０．５〜１００マイクログラム／ｍｌの範囲である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上皮が、膣上皮、子宮頸部上皮、直腸上皮、結腸上皮及び口腔上皮からなる群より選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、細菌により産生可能なｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの二量体、ｓｃＦｖの三量体、ｓｃＦｖ様分子の四量体及びそれらの組合せからなる群より選ばれる産生物として、細菌性の送達システムにより発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又はそれ以上の抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１の抗体又はその両方を含んでなる、殺菌剤。
【請求項３１】
抗体が、細菌性の送達システムによりｓｃＦｖとして発現する、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３２】
抗体を、少なくとも１つの乳酸菌の細菌性送達手段を介して、防御されるべき上皮に送達することができる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３３】
少なくとも１つの抗ＩＣＡＭ抗体を更に含んでなる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３４】
抗ＩＣＡＭ抗体（単一又は複数）並びに抗ＣＤ１８及び／又は抗１１抗体を一緒にした累積的な抗ＨＩＶの効果が、（１）個別の抗ＣＤ１８及び／又は抗ＣＤ１１の抗体の効果、及び（２）個別の抗ＩＣＡＭ抗体の効果を足した効果と、少なくとも等しい又はそれより大きい、請求項３３に記載の殺菌剤。
【請求項３５】
抗ＣＤ１１抗体が、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ１１ｄからなる群より選ばれる、請求項３０に記載の殺菌剤。
【請求項３６】
（Ａ）軽鎖の抗原結合性の可変領域及び重鎖の抗原結合性の可変領域を結合タンパク質に融合して、単鎖の抗体（ｓｃＦｖ）を形成すること（ここにおける抗体分子は、同じであるか又は異なっていてもよく、そして抗ＣＤ１１及び抗ＣＤ１８より選ばれる）、
（Ｂ）細菌性の送達システムが、ＨＩＶの伝染から防御されるべき上皮を含有する環境において、段階（Ａ）の単鎖抗体を発現する状態を形成すること、
を含んでなる、殺菌剤を作成する方法。
【請求項３７】
細菌性の送達システムが、乳酸菌、大腸菌及び乳酸球菌からなる群より選ばれる少なくとも１つの細菌を含んでなる、請求項３６に記載の作成方法。
【請求項３８】
結合タンパク質が、付着の重鎖及び軽鎖の可変領域をＣＤ１８が結合するような構造に折り畳んでいる、アミノ酸の配列を含んでなる、請求項３６に記載の作成方法。
【請求項３９】
発現産生物が、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１１、及び組み換え菌により発現するリガンドからなる群より選ばれる、ＨＩＶ−１の経上皮伝染を阻止する発現産生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５１１６０１（Ｐ２００９−５１１６０１Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５７６８（Ｐ２００８−５３５７６８）
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４７５７３
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１１３４１３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４７５７３
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１１３４１３）
【Ｆターム（参考）】
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