組み合わせＣ型肝炎ウイルス抗原及び抗体検出法
【課題】単一アッセイにて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質及びＨＣＶコアタンパク質に対する抗体（抗コア抗体）を検出することによる、Ｃ型肝炎の検出を可能にするインビトロ法を提供する。また、本方法及び、組み合わせ法における使用のための適切な捕捉ペプチド及びモノクローナル抗体を選択するためのプロセスを遂行するための診断キットも提供する。
【解決手段】短いペプチド（これらはそれぞれ、ネイティブコアタンパク質の免疫優勢領域に対応するアミノ酸配列を有するが、本方法で使用される抗体が結合するエピトープを完全には包含しない。）を使用することにより、本方法において交差反応性が排除される。対象におけるＨＣＶの存在を検出するために、及び／又は輸血目的のためのドナー血液又は血液製剤の適切性を調べるために、本方法を使用することができる。
【解決手段】短いペプチド（これらはそれぞれ、ネイティブコアタンパク質の免疫優勢領域に対応するアミノ酸配列を有するが、本方法で使用される抗体が結合するエピトープを完全には包含しない。）を使用することにより、本方法において交差反応性が排除される。対象におけるＨＣＶの存在を検出するために、及び／又は輸血目的のためのドナー血液又は血液製剤の適切性を調べるために、本方法を使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
とりわけ、本発明は、ウイルス検出の分野、及び、特に、Ｃ型肝炎ウイルス感染の検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は現在、輸血が関与する非Ａ、非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の主要な原因として認識されている。ＨＣＶは、フラビウイルス及びペスチウイルスと同様の１本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり（Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．及びＰｕｒｃｅｌｌ Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２０５７（１９９１）；Ｗｅｉｎｅｒ Ａ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４２（１９９０））、世界中に広がっている。ＨＣＶの急性期は一般に軽症であり、黄疸を呈するのは患者のわずか２５％であるが、感染者の多く（＞５０％）は、重篤で生命を脅かす可能性のある、肝硬変及び肝細胞癌などの続発症がある慢性肝炎発症に到る（Ｊｏｖｅ Ｊ．ら、Ｌｉｖｅｒ、８：４２（１９９０）；Ｈｏｐｆ Ｕ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１０：６９（１９９０））。
【０００３】
ＨＣＶ感染は、現在、ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの直接検出により、又は抗ＨＣＶ抗体（一般にＨＣＶ構造コアタンパク質又は非構造ＮＳ３タンパク質に対するもの）の検出により、診断される。一般に、これには、個体がＨＣＶに感染した後、ウイルスに対する抗体を個体が発現できるまで最長で約７０日を要し得、従って、この７０日の間、抗体試験単独では、ＨＣＶ感染が起こっているか否かを判定することはできない。一方、ウイルスＲＮＡは、感染後約１０日で検出され得、即ち、核酸試験（ＮＡＴ）に対する「潜伏期間」は、抗体試験よりもはるかに短い。しかし、ＮＡＴは、どちらかと言うと抗体試験よりも費用効果が悪く、混入などの操作エラーが起こりやすい。さらに、ＲＮＡレベルは、ウイルスの最初のピークが消散したとき、特に、プールした試料を試験する場合、この核酸試験に対する検出限界未満に低下し得る。
【０００４】
米国特許第６，５９６，４７６号；同第６，５９２，８７１号；同第６，１８３，９４９号；同第６，２３５，２８４号；同第６，７８０，９６７号；同第５，９８１，２８６号；同第５，９１０，４０４号；同第６，６１３，５３０号；同第６，７０９，８２８号；同第６，６６７，３８７号；同第６，００７，９８２号；同第６，１６５，７３０号；同第６，６４９，７３５号及び同第６，５７６，４１７号は、コアタンパク質に基づく抗原及びＨＣＶを検出するためのその使用を記載する。
【０００５】
最近になって、抗体が検出可能になるよりも著しく早く、試料中のＨＣＶコアタンパク質抗原を検出することができることを示すＨＣＶ抗原アッセイが開発された。研究から、最初のウイルス血症血液採取から最初のＨＣＶ抗原陽性血液採取までの平均時間が、２．０日間と推定されること、及び、最初のＨＣＶ抗体陽性血液採取までの平均時間が５０．８日間と推定されることが分かった（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ Ａ．Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４０、１１９８−１２０２（２０００））。
【０００６】
従って、ＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体を検出する組み合わせアッセイは、上述の７０日間の潜伏期間内にＨＣＶ感染を検出する手段を提供し、これはまた、セロコンバージョン後のＨＣＶへの曝露も同定する。ＨＣＶのさらに早期の診断は、感染個体から他の個体へのウイルスの伝染を予防すること及び血液供給の混入リスクを最小限にすることに役立ち得る。しかし、適切な組み合わせアッセイを開発するためには、単一のアッセイにおいて抗原性タンパク質及び同じ抗原性タンパク質に対する抗体をアッセイすることに対する干渉又は交差反応の問題を処理しなければならない。干渉又は交差反応の結果、例えば、固相に結合したＨＣＶ抗原性タンパク質が試料中の抗ＨＣＶ抗体を捕捉するために使用される場合。ＨＣＶ抗原性タンパク質が、標識抗体又は試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質を検出するために使用される抗体により認識されるものと同じエピトープを有するので、標識抗体又は抗体はまた、固相上のＨＣＶ抗原性タンパク質とも結合し得、従って、試験試料の非存在下でも偽陽性反応が起こる。
【０００７】
干渉の問題を解決するために様々なストラテジーを使用する、ＨＣＶ感染を検出するための様々な組み合わせアッセイが記載されてきた。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９９５８（ＷＯ０３／００２７４９）及び米国特許第６，７２７，０９２号及び同第６，８５５，８０９号は、それぞれ、試料からのコアタンパク質及び試料からのコアタンパク質に対する抗体を捕捉するためのコアペプチド又は組み換えコアタンパク質を検出するためにモノクローナル抗体を使用する、ＨＣＶを検出するための組み合わせアッセイを記載する。モノクローナル抗体により認識されるエピトープが排除されるか又は修飾されるように、組み換えコアタンパク質が改変されている。ある例において、記載されている組み合わせアッセイは、試料からのコアタンパク質に対する抗体を捕捉するために、コアタンパク質のアミノ酸１１から２８に対応する１７アミノ酸残基長の１つのペプチドを使用する。しかし好ましい形式は、このアッセイで使用されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを欠失するように改変されているコアタンパク質配列のアミノ酸１から１００又は８から１００に対応する組み換えコアタンパク質を使用する。
【０００８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０３／０１４２９（ＷＯ０３／０９５９６８）及び米国特許出願１０／４３１，５８７（ＵＳ２００４／００７２２６７）は、抗体を捕捉するために使用される標的抗原のある種のエピトープが構造的に修飾されるか破壊されている、ＨＣＶを検出するための、別の組み合わせアッセイを記載する。次に、抗体が対応する非修飾エピトープを正確に認識し、このようにして修飾抗原（これらの同じエピトープをもはや提示しない。）に結合できないように、このアッセイにおいて使用される抗体を具体的に選択する。このアプローチに基づく組み合わせアッセイキット（ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｌｔｒａ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が開発され、これが、抗体のみに基づくアッセイを上回る改善があることが分かったが、それでもＮＡＴより感度が低い（Ａｎｓａｌｄｉ、Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、１３：５−１０（２００６）；Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４５：１９６５−１９７２（２００５）；Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４３：３８７７−３８８３（２００５））。
【０００９】
同様に、ＵＳ２００３／０１０８５６３及びＵＳ２００３／０１５２９６５は、抗原として使用されるＨＣＶコアタンパク質が、ＨＣＶコアタンパク質残基１０−４３以外のアミノ酸残基が変更されている又はこれを欠失している配列を含み、修飾ＨＣＶコアタンパク質を認識しない抗ＨＣＶコア抗体が使用される、別の組み合わせアッセイを記載する。
【００１０】
この基礎的情報は、出願者が本発明に対して関連する可能性があると考える情報を開示する目的のために提供される。上述の情報の何れも本発明に対する先行技術を構成するものではないし、そのように解釈されるべきものではない。
【００１１】
本明細書中で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，５９６，４７６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５９２，８７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１８３，９４９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２３５，２８４号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７８０，９６７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９８１，２８６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９１０，４０４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，６１３，５３０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，７０９，８２８号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６６７，３８７号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，００７，９８２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，１６５，７３０号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，６４９，７３５号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，５７６，４１７号明細書
【特許文献１５】国際公開第０３／００２７４９号
【特許文献１６】米国特許第６，７２７，０９２号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，８５５，８０９号明細書
【特許文献１８】国際公開第０３／０９５９６８号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００４／００７２２６７号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００３／０１０８５６３号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００３／０１５２９６５号明細書
【特許文献２２】欧州特許第４５６６５号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，７０５，３３０号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，０８９，４２４号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，００６，３０９号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，０６３，０８１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００４００１８５７７号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００５００５４０７８号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００６０１６０１６４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．及びＰｕｒｃｅｌｌ Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９１、８７、ｐ．２０５７
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ Ａ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０、１８０、８４２
【非特許文献３】Ｊｏｖｅ Ｊ．ら、Ｌｉｖｅｒ、１９９０、８、４２
【非特許文献４】Ｈｏｐｆ Ｕ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９０、１０、６９
【非特許文献５】Ｃｏｕｒｏｕｃｅ Ａ．Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２０００、４０、ｐ．１１９８−１２０２
【非特許文献６】Ａｎｓａｌｄｉ、Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、２００６、１３、ｐ．５−１０
【非特許文献７】Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２００５、４５、ｐ．１９６５−１９７２
【非特許文献８】Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００５、４３、ｐ．３８７７−３８８３
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．及びＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８１、１４７、ｐ．１９５−７
【非特許文献１０】Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、１９８１、ｐ．４８２−４８９
【非特許文献１１】Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｗ．Ｇｉｓｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、ｐ．４０３−１０
【非特許文献１２】Ｓｐａｔｏｌａ、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ、１９８３、第１巻、第３号
【非特許文献１３】スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ）、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｍｉｎｉｏ ａｃｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ファインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年、ｐ．２６７
【非特許文献１４】Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、１９８０、ｐ．４６３−４６８
【非特許文献１５】Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９７９、１４、ｐ．１７７−１８５
【非特許文献１６】Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、１９８６、３８、１２４３−１２４９
【非特許文献１７】Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、１９８２、ｐ．１３０７−３１４
【非特許文献１８】Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）
【非特許文献１９】Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３、ｐ．２５３３（１９８２）
【非特許文献２０】Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４、ｐ．４４０１−４４０４（１９８３）
【非特許文献２１】Ｈｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、１９８２、３１、ｐ．１８９−１９９
【非特許文献２２】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、ｐ．２１４９
【非特許文献２３】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３２、ｐ．３４１
【非特許文献２４】Ｓｔｕｙｖｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９４、９１、ｐ．１０１３４−１０１３８
【非特許文献２５】Ｂｕｋｈ、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．、１９９５、１５、ｐ．４１−６３
【非特許文献２６】ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９８年、第２版
【非特許文献２７】ハンメルリング（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、１９８１年、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、ｐ．５６３−６８１
【非特許文献２８】Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１、２０３、ｐ．４６−８８）
【非特許文献２９】Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ １９９３、９０、ｐ．７９９５−７９９９
【非特許文献３０】Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４０、ｐ．１０３８−１０４０
【非特許文献３１】Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、ｐ．４１−５０
【非特許文献３２】Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、ｐ．１７７−１８６
【非特許文献３３】Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、ｐ．９５２−９５８
【非特許文献３４】Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７、ｐ．９−１８
【非特許文献３５】Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、ｐ．１９１−２８０
【非特許文献３６】フランク・クイン（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ）、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２００１年、第二版、デビッド・ワイルド（Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ）編集、ｐ．３６３−３６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、組み合わせＣ型肝炎ウイルス抗原及び抗体検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のある態様によると、試料中のＣ型肝炎コアタンパク質及びＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の検出のための方法が提供され、この方法は、好ましくは、次の段階を含む：ａ）捕捉ペプチドとＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体との間で捕捉ペプチド：抗体複合体の形成を可能にする条件下で、約４から約３０アミノ酸残基長の間（場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間）の１以上の捕捉ペプチドと、前記試料と、を接触させる段階（ここで、各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープを含むアミノ酸配列を好ましくは有する。）；ｂ）第一の抗体とＣ型肝炎コアタンパク質との間での抗体：抗原複合体の形成を可能にする条件下で、第一の抗体と試料を接触させる段階（ここで、第一の抗体は、各１以上の捕捉ペプチドにより含まれるエピトープとは異なる第一のエピトープでＣ型肝炎コアタンパク質と特異的に結合する。）；ｃ）Ｃ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の指標として、段階（ａ）で形成される何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体を検出する段階；ｄ）Ｃ型肝炎コアタンパク質の指標として、段階（ｂ）で形成される何らかの抗体：抗原複合体を検出する段階。
【００１６】
ある実施形態において、場合によっては各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープと、配列番号１の残基１６から３０、配列番号１の残基３３から４４及び配列番号１の残基４９から６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、を含み、捕捉ペプチド中に存在する何れのその他のアミノ酸残基も、配列番号１の配列と比較して変更されている。
【００１７】
本発明の別の態様によると、試料中のＣ型肝炎コアタンパク質及びＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の検出のためのキットが提供され、このキットは、好ましくは、次のもの：約４からび約３０アミノ酸長の間（場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間）の１以上のペプチド（好ましくはこの各ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープを含むアミノ酸配列を有する。）と、１以上の抗体（好ましくは、この１以上の抗体の第一のものはＣ型肝炎コアタンパク質の第一のエピトープに特異的に結合でき、第一のエピトープは、１以上の捕捉ペプチドにより含まれるエピトープとは異なる。）と、を含む。ある実施形態において、場合によっては、各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープと、配列番号１の残基１６から３０、配列番号１の残基３３から４４及び配列番号１の残基４９から６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、を含み、捕捉ペプチドに存在する何れのその他のアミノ酸残基も配列番号１の配列と比較して変更されている。
【００１８】
本発明の別の態様によると、微生物の抗原性タンパク質及びこの抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出することができる試薬を選択するためのプロセスが提供され、この試薬は、好ましくは１以上の免疫優勢ペプチド及び１以上の特異的抗体からなり、この方法は、好ましくは、次の段階：ｉ）ペプチドのライブラリを提供する段階（各前記ペプチドは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有し、候補ペプチドのアミノ酸配列は重複する。）；ｉｉ）微生物感染対象からの血清試料とペプチドのライブラリを接触させる段階；ｉｉｉ）陰性対照血清試料と前記プチドのライブラリを接触させる段階；ｉｖ）候補ペプチドを提供するために、段階（ｉｉ）の血清試料の複数において抗体に結合し、段階（ｉｉｉ）の陰性対照試料において抗体に結合しない候補ペプチドを選択する段階；ｖ）候補ペプチドの１以上の配列を含む免疫優勢ペプチドを調製する段階；ｖｉ）１以上の候補抗体と免疫優勢ペプチドを接触させる段階、ｖｉｉ）特異的抗体を提供するために、前記免疫優勢ペプチドに結合しない１以上の抗体を選択する段階、を含む。
【００１９】
本発明の別の態様によると、試料中の微生物の抗原性タンパク質及び抗原性タンパク質に対する抗体の検出のためのキットが提供され、このキットは、好ましくは：抗原性タンパク質に特異的に結合できる１以上の特異的抗体と、抗原性タンパク質のアミノ酸配列由来の１以上の免疫優勢ペプチドと、を、特異的抗体と、本発明の試薬を選択するためのプロセスに従い選択される免疫優勢ペプチドと、を含む。
【００２０】
添付の図面を参照する次の詳細な記述において本発明のこれら及びその他の特性が明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のある実施形態に従い免疫優勢ペプチドを作製するために使用されるＨＣＶコアタンパク質［配列番号１］のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＰ＿７５１９１９）［配列番号２］から利用可能なＨＣＶコアタンパク質ｐ２１ｃのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ＨＣＶコアタンパク質［配列番号７から５３］配列由来の重複ペプチドのライブラリに対する配列を示し、免疫原性ペプチド配列番号３、４、５及び５４（青い影付き）ならびに適切な抗体に対するエピトープ（囲み付き配列：ＧＩＶＧ［配列番号６］及びＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］）の位置を示す。任意数は図面を明らかにするために適用し；配列番号３１−５３において識別される配列の付番は、規定どおり残基５６を超えて伸長する。
【図４】図４は、本発明のある実施形態に従うプロセス制御監視の手順の図式的概観を示す。
【図５】図５は、本発明のある実施形態に従う組み合わせアッセイの図式を示す。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、本発明のある実施形態による組み合わせアッセイの感度の間の比較の結果（図６Ｂ）及び別の市販の抗体／抗原アッセイの感度（図６Ａ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、とりわけ、単一アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質及びＨＣＶコアタンパク質に対する抗体（抗コア抗体）を検出することによる、Ｃ型肝炎の検出を可能にするインビトロの方法を提供する。本方法は、好ましくは、抗コア抗体を検出するために選択された免疫優勢ペプチドと組み合わせて、コアタンパク質の検出のための、コアタンパク質に特異的に結合することが可能な抗体を使用する。この方法は、交差反応の問題を最小限にするためにある種のエピトープが欠失しているか又は構造的に修飾されている、コアタンパク質の特殊化された断片の構築に依存する既に記載の方法とは異なる。本発明の方法において、短いペプチド（これらはそれぞれ、ネイティブＨＣＶコアタンパク質の免疫優勢領域に対応するアミノ酸配列を有するが、本方法において使用される抗体により結合されるエピトープを完全には包含しない。）を使用することによって、交差反応性を好ましくは制限するか又は排除する。それらが比較的短いことにより、本発明の方法で使用されるペプチドは、好ましくは、長いペプチドよりも簡単に、及び高い信頼性で（即ちエラー率が低い。）合成することができる。
【００２３】
さらに、本発明のある実施形態において、別個のペプチドの複数個（それぞれが、異なるエピトープを含む。）を使用すると、本方法に含まれる各ペプチドの相対量の調整が行われることによって、エピトープ比率を調整できるようになる。エピトープ比率の調整により、特異性に影響を及ぼさずに、本方法の感度を最適化することができる。本方法の別の実施形態において、上述の方法におけるコアタンパク質の一部に対応する短いペプチド配列を使用すると、好ましくは、コアタンパク質全体又はコアタンパク質のより長い断片を使用する方法と比較して、特異性が向上する。
【００２４】
本方法はまた、さらなる抗体及び／又は抗原性タンパク質又は、１以上のＨＣＶタンパク質又はコアタンパク質以外のＨＣＶタンパク質に対する抗体及びコアタンパク質に対する抗体の検出のための方法において使用されるべきペプチドも提供する。ある実施形態において、本発明の方法は、好ましくは、免疫優勢コアタンパク質ペプチド及びコアタンパク質に対する抗体に加えて、対応する抗体の検出のために、ＨＣＶ非構造タンパク質又はその断片を使用する。
【００２５】
本発明は、上述の方法を行うための試薬（即ち、免疫優勢コアタンパク質ペプチド及びコアタンパク質に対する抗体）を含むＨＣＶの検出のためのキットをさらに提供し、場合によっては、１以上の非コアＨＣＶタンパク質の検出のためのさらなる抗体及び／又は抗原性タンパク質又はペプチドを提供する。
【００２６】
例えば、対象においてＨＣＶの存在を検出するために、及び／又は輸血目的のためのドナー血液又は血液製剤の適合性を調べるために、本発明の方法及びキットを使用することができる。
【００２７】
上述の方法及びキットでの使用に適切な試薬は、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質のキーエピトープを含有する免疫優勢ペプチドを同定し、本方法及び／又はキットでの使用のためにこれらの免疫優勢ペプチドの１以上を選択し、免疫優勢ペプチドに存在するエピトープ以外のエピトープに結合する１以上の抗コア抗体を選択することにより、本明細書中に記載のように選択される。コアタンパク質及びこれに対する抗体以外のＨＣＶ抗原性タンパク質の検出の組み合わせ法、より一般的には、その他の微生物からの抗原性タンパク質及びこれらのタンパク質に対する抗体を検出する組み合わせ法に適切な試薬の選択に、この選択プロセスが幅広く適用できることを理解されたい。このようにして、本方法は、一般的抗原性タンパク質及びこの抗原性タンパク質に対する抗体の同時検出のための試薬をスクリーニングするための一般的プロセスを提供するが、このプロセスは、免疫優勢ペプチド（それぞれが、その微生物に感染している対象の多くに存在する抗体により認識されるキーエピトープを含有する。）を最初に同定する段階；同定された免疫優勢ペプチドの１以上を選択する段階；選択ペプチド中に含有されるもの以外のエピトープを認識する抗体を同定する段階を含む。
【００２８】
定義
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野で当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列に関連して、「に対応する」は、参照アミノ酸配列とアミノ酸配列が実質的に同一であることを指す。「実質的に同一」とは、例えば下記の方法を使用して最適に並べた場合に、アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を共有することを意味する。２つのアミノ酸配列間の％同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．及びＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７（１９８１））；「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、４８２−４８９（１９８１））；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｗ．Ｇｉｓｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））及びその変法及びアップデート；ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の技術内の様々な方法において調べられる。さらに、当業者は、比較される配列の長さにわたる最大アラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含め、アラインメントを調べるために、適切なパラメータを決定することができる。一般に、ペプチドに対して、比較配列の長さは、少なくとも１０個のアミノ酸であり、しかし、実際の長さが比較されている配列の長さ全体に依存し、少なくとも１２、１５、１７、１８、１９又は２０アミノ酸であり得る又はそれがペプチド配列の全長であり得ることを、当業者は理解する。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「潜伏期間」という用語は、Ｃ型肝炎ウイルスによる個体の感染から、アッセイによって感染が検出できるようになるまでの時間を指す。
【００３１】
「特異的に結合する」という用語は、個々の抗体が抗原に特異的に反応する能力を指す。結合特異性は、抗体が特異的抗原に差別的に結合するが、非関連抗原には結合せず、従って、２つの異なる抗原を区別する能力を基準に決定することができる、又は、あるいは、抗原における特異的エピトープに示差的に結合するが同じ抗原においてその他のエピトープに結合せず、従って、２つの異なるエピトープを区別するという能力を基準に判定される。
【００３２】
「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」という用語は、Ｃ型肝炎に関与するウイルスの、全ての株及び全てのタイプ、サブタイプ及び遺伝子型を含む。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、指示される値からおよそ±１０％変動することを指す。このような変動は、通常、本明細書中で提供される何らかのある種の値（具体的に言及されるにしろされないにしろ）に含まれると理解されたい。
【００３４】
天然のアミノ酸は、本明細書を通して、ペプチドの技術分野で一般に受容され、生化学命名法においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッションにより推奨される、下記で示す従来の３文字又は１文字略記により区別される。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本明細書中で示されるペプチド配列は、Ｎ末端アミノ酸が左にありＣ末端アミノ酸が右にある、一般に受容されている慣習に従い記述する。
【００３７】
１．ＨＣＶの検出のための組み合わせ法
本発明のある態様は、試料中のＨＣＶコアタンパク質及びコアタンパク質に対する抗体の両方を検出することによる、ＨＣＶの検出のための組み合わせ法を提供する。本方法は、好ましくは、試薬として、交差反応性を最小化又は排除するために選択された、捕捉抗体及び捕捉ペプチドを使用する。これらの試薬を選択する方法は、下記で述べるが、コアタンパク質の免疫優勢ペプチドの同定及び選択、及び選択された免疫優勢ペプチド上に存在するもの以外のエピトープを認識するモノクローナル抗体の同定及び選択に基づく。本発明は、このような試薬を選択する方法をさらに含む。
【００３８】
本発明の組み合わせ法によると、１以上の捕捉ペプチド（それぞれコアタンパク質の異なるエピトープを含む。）及び捕捉ペプチドに存在するもの以外のエピトープにおいてＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体と試験しようとする試料とを接触させる。次に、形成される何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体及び抗体：コアタンパク質複合体を検出する。
【００３９】
当技術分野で公知のように適切に標識した試薬を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体及び抗体：コアタンパク質複合体を検出することができる。例えば、標識コアペプチド（「検出ペプチド」）を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することができるが、このペプチドは、捕捉ペプチドの配列と同じ配列又は実質的に同一である配列を含み得る。あるいは、例えば標識された二次抗体（抗ヒト抗体など）を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することができる。「直接」形式での捕捉ペプチド：抗体複合体の検出（即ち適切な検出ペプチドを用いて）により、二次抗体を用いる「間接的」形式よりも特異性が向上し得る。従って、ある実施形態において、本発明の方法は、捕捉ペプチド：抗体複合体の検出のために直接形式を使用する。例えば、捕捉抗体と同じである又は異なり得る標識された二次抗コア抗体を用いて、抗体：コアタンパク質複合体を検出することができる。しかし、二次抗コア抗体は、捕捉ペプチド及び使用する場合は検出ペプチドにより含有されるもの以外のエピトープを認識すべきである。
【００４０】
このようにして、ある実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、捕捉ペプチド：抗体複合体を形成させるために、試料中の抗コア抗体に捕捉ペプチドが結合することができる条件下で、１以上の捕捉ペプチドと試験試料を接触させることを含む。この試料は、好ましくは、抗体：コアタンパク質複合体を形成させるために、試料中のコアタンパク質に捕捉抗体が結合することができる条件下で、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体に同時に接触させられる。捕捉抗体により認識されるコアタンパク質のエピトープを捕捉ペプチドは含有しないので、コアタンパク質の捕捉とコアタンパク質に対する抗体の捕捉との間の交差反応性は最小限である又は排除される。本方法は、好ましくは、形成される何らかの抗体：コアタンパク質複合体及び捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することをさらに含む。別の実施形態において、捕捉ペプチド及び捕捉抗体は、固体表面上に固定化される。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本方法は、好ましくは、複数の捕捉ペプチド、例えば、２以上の捕捉ペプチド又は３以上の捕捉ペプチドを使用する。
【００４２】
本方法は、さらに、場合によっては、ＨＣＶの第二の抗原性タンパク質又はＨＣＶの第二の抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出する段階を含む。このようにして、ある実施形態において、ＨＣＶの第二の抗原性タンパク質に対する抗体又は第二の抗原性タンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体に特異的に結合できる捕捉抗原を方法中に含み得る。別の実施形態において、本方法は、第二の抗原性タンパク質：抗体複合体の抗体又は抗原性タンパク質成分に結合できる標識された検出抗原又は検出抗体を使用して、何らかの第二の抗原性タンパク質：抗体複合体を検出する段階をさらに含む。
【００４３】
本発明の方法は、場合によっては、例えば下記のものなど、当技術分野で公知の様々な形式であり得る。ある実施形態において、本方法は、免疫アッセイとして行われる。例えば、捕捉ペプチド、捕捉抗体（及び、使用する場合は捕捉抗原）を、直接又は適切な担体上での提示を介しての何れかで、固相上に固定化することができ、一方、検出ペプチド、検出抗体（及び、使用する場合は検出抗原）が液相で与えられる。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、本方法は、好ましくは、本方法が適正に行われていることを確実にするためのプロセス制御監視を含む。プロセス制御監視は、好ましくは、プロセスの完全性を確保するための試料添加制御及び色分け試薬の使用を含む。プロセス制御監視のその他の変法は、当業者にとって明白である。
【００４５】
１．１．コアタンパク質免疫優勢ペプチド
本発明の組み合わせ法で使用される捕捉ペプチドは、ＨＣＶコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合するように設計される。このペプチドは、免疫優勢コアタンパク質ペプチド、即ちＨＣＶコアタンパク質のネイティブアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ＨＣＶ感染個体の免疫系によって最もよく認識されるエピトープの１つを含有する。従って、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列を有する。
【００４６】
本発明によると、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、約４から約３０アミノ酸残基長の間である。ある実施形態において、本ペプチドは、約６から約３０アミノ酸残基長の間であり、場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間である。さらなる実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約６から約２５アミノ酸残基長の間である。さらに別の実施形態において、好ましくは、本ペプチドは、約８から約２５アミノ酸残基長の間である。その他の実施形態において、本ペプチドは、好ましくは、約１０から約２５アミノ酸残基、約１０から約２２アミノ酸残基、約１２から約２２アミノ酸残基、約１２から約２０アミノ酸残基長の間である。
【００４７】
上述のように、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質のネイティブアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含む。ＨＣＶコアタンパク質配列の例を図１で与える［配列番号１］。ＨＣＶコアタンパク質ｐ２１ｃのアミノ酸配列もまたＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＰ＿７５１９１９）から得ることができ、本明細書中で図２のように与えられる［配列番号２］。ＨＣＶの様々な遺伝子型の間でよく保存されており、ＨＣＶ感染対象の大多数からの抗体により認識されるコアタンパク質のそれらの領域を確立することによって、コアタンパク質配列から免疫優勢ペプチド配列を同定することができる。ある実施形態において、好ましくは、ペプチドにより含まれるエピトープが、感染の主要な段階からの抗体に結合するように、免疫優勢ペプチドの組み合わせを選択する。例えば本明細書中に記載のプロセスに従うことにより、適切な免疫優勢ペプチドを容易に選択することができる（例えば、下記セクション６参照）。ある実施形態において、好ましくは、各ペプチドが感染の様々な段階での抗体により認識されるエピトープを含むよう、組み合わせ法における使用のための複数の免疫優勢ペプチドを選択するが、これにより、ＨＣＶに対する免疫反応を広範にカバーできるようになる。
【００４８】
ある実施形態において、各免疫優勢ペプチドは、好ましくは、配列番号１で示される配列の、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、このペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸１−８０（即ちＮ末端領域）で示される配列の、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。その他の実施形態において、各免疫優勢ペプチドは、好ましくは、配列番号１で示される配列の、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０又は少なくとも１２の、連続アミノ酸を含む。
【００４９】
具体的な実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列：ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ［配列番号３］、ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号４］、ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５］又はＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＣ［配列番号５４］の何れか１つの、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、次のものから選択される配列を含む：ＮＲＲＰ［配列番号６０］、ＲＲＰＱ［配列番号６１］、ＲＰＱＤ［配列番号６２］、ＰＱＤＶ［配列番号６３］、ＱＤＶＫ［配列番号６４］、ＤＶＫＦ［配列番号６５］、ＶＫＦＰ［配列番号６６］、ＫＦＰＧ［配列番号６７］、ＦＰＧＧ［配列番号６８］、ＰＧＧＧ［配列番号６９］、ＧＧＧＱ［配列番号７０］、ＧＧＱＩ［配列番号７１］、ＧＶＹＬ［配列番号７２］、ＶＹＬＬ［配列番号７３］、ＹＬＬＰ［配列番号７４］、ＬＬＰＲ［配列番号７５］、ＬＰＲＲ［配列番号７６］、ＰＲＲＧ［配列番号７７］、ＲＲＧＰ［配列番号７８］、ＲＧＰＲ［配列番号７９］、ＧＰＲＬ［配列番号８０］、ＴＲＫＴ［配列番号８１］、ＲＫＴＳ［配列番号８２］、ＫＴＳＥ［配列番号８３］、ＴＳＥＲ［配列番号８４］、ＳＥＲＳ［配列番号８５］、ＥＲＳＱ［配列番号８６］、ＲＳＱＰ［配列番号８７］、ＳＱＰＲ［配列番号８８］、ＱＰＲＧ［配列番号８９］、ＰＲＧＲ［配列番号９０］、ＲＧＲＲ［配列番号９１］、ＧＲＲＱ［配列番号９２］、ＲＲＱＰ［配列番号９３］、ＲＱＰＩ［配列番号９４］、ＱＰＩＰ［配列番号９５］、ＰＩＰＫ［配列番号９６］及びＩＰＫＡ［配列番号９７］。
【００５０】
別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも６個の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも８個の連続アミノ酸を含む。その他の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも１２個の連続アミノ酸又は少なくとも１４個の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、捕捉ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つを含む。
【００５１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号３、４、５、５４、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０の何れか１つの変異配列を含む（この変異配列は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体に結合する能力を保持する。）、免疫優勢ペプチドを提供する。「変異配列」という用語は、本明細書中で使用する場合、参照ペプチド配列と比較して１以上のアミノ酸残基が、欠失、付加又は置換されているペプチド配列を指す。好ましくは、変異配列が１以上のアミノ酸置換を含有する場合、これらは、「保存的」置換である。保存的置換は、１つのアミノ酸残基の、同様の側鎖特性を有する別の残基による置換を含む。当技術分野で公知のように、２０種類の天然アミノ酸を側鎖の物理化学的特性に従いグループ化することができる。適切なグループ化には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性、非電荷側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）及びリシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が含まれる。アミノ酸の別のグループ化は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、アミノ酸の、同じグループからの別のアミノ酸での置換を含む。本発明によると、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。その他の実施形態において、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９３％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
免疫優勢ペプチドは、天然アミノ酸又は場合によっては１以上の非天然アミノ酸を含み得る。この非天然アミノ酸は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体への免疫優勢ペプチドの結合能をそれらが妨害しないように選択される。非天然アミノ酸の例には、以下に限定されないが、Ｄ−アミノ酸（即ち天然の形態とは逆のキラリティーのアミノ酸）、Ｎ−α−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−メチルアミノ酸、β−アラニン（β−Ａｌａ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン、Ｄ−又はＬ−２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、Ｄ−又はＬ−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｄ−又はＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−又はＬ−１−、２−、３−又は４−フェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルアラニンＤ−又はＬ−ｐ−メトキシビフェニルアラニン、メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）及びホモアルギニン（Ｈａｒ）が含まれる。その他の例には、Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン及びＤ−又はＬ−アルキルアラニン（この場合、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル又はイソ−ペンチルである。）及びホスホノ又は硫酸化（例えば、−ＳＯ３Ｈ）非−カルボン酸アミノ酸が含まれる。
【００５３】
免疫優勢ペプチドは、天然ペプチド結合（即ち−ＣＯＮＨ−）又は修飾ペプチド結合の何れかを含み得る。修飾ペプチド結合は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体への免疫優勢ペプチドの結合能をそれらが妨害しないように選択される。適切な修飾ペプチド結合の例は、当技術分野で周知であり、以下に限定されないが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス又はトランス）、ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＳ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−（即ち逆ペプチド結合）が含まれる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ ３、（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｍｉｎｉｏ ａｃｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ ｐｐ．４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（１９７９）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（１９８６）；Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ３０７−３１４（１９８２）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（１９８２）；Ｓｚｅｌｋｅら、ＥＰ ４５６６５（１９８２）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（１９８３）；及びＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）参照）。ある実施形態において、免疫優勢ペプチドは１以上の修飾ペプチド結合を含む。免疫優勢ペプチドが複数の修飾ペプチド結合を含む場合、修飾ペプチド結合は同じであり得又は異なり得る。
【００５４】
例えば化学合成などの当技術分野で公知の方法によって、免疫優勢ペプチドを調製することができる。このような方法には、以下に限定されないが、固相単独（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）合成、部分的固相合成、フラグメント縮合又は古典的溶液合成が含まれる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１（１９８６））。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの「９０５０ Ｐｌｕｓ Ｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅの「Ｐｉｏｎｅｅｒ」合成装置、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）の「４３３Ａ」合成装置又はＲａｉｎｉｎの「Ｓｙｍｐｈｏｎｙ」合成装置など、自動ペプチド合成も使用し得る。本ペプチドは、均一相合成によっても調製することができる。本ペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ選別カラムクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィー）、遠心、示差的溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）などの標準技術を用いて、又は当業者にとって周知のその他の技術によって、精製することができる。
【００５５】
ＨＣＶ感染の様々な段階の個体からの試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体に結合する免疫優勢ペプチドの能力は、市販のセロコンバージョンパネル及び、本明細書中に記載のもの（これに限定されない。）を含む標準的方法を用いて、熟練者により容易に判定され得る。
【００５６】
本組み合わせ法において使用される免疫優勢ペプチドは、好ましくは、適切な固相上に固定化され得ると考えられる。固相への共有又は非共有（例えば、イオン性、疎水性など）結合を用いて本ペプチドを固定化することができ、さらに、場合によっては本ペプチドは、固定化を促進するために修飾され得る。適切な修飾は当技術分野で公知であり、これには、固体支持体への本ペプチドの架橋又は連結を促進するための本ペプチドのＣ末端又はＮ末端の何れかへの官能基又は化学部分の付加が含まれる。代表的な修飾には、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸（ＳＡＭＳＡ）又はＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加又は本ペプチドのＮ又はＣ末端への１以上のシステイン残基の付加が含まれる。その他の架橋剤が当技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのカタログを参照）。例としては、以下に限定されないが、ジアミン（１，６−ジアミノヘキサンなど）；ジアルデヒド（グルタルアルデヒドなど）；ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル及びエチレングリコール−ビス（コハク酸スクシンイミジル）など）；ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートなど）；ビスオキシラン（１，４ブタンジイル ジグリシジル エーテルなど）；ジカルボン酸（スクシニルジサリチレートなど）；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられる。
【００５７】
その他の修飾には、Ｎｉ２＋誘導化面への結合を可能にするためのヒスチジン残基又はジスルフィド架橋形成又はＳｕｌｆｏｌｉｎｋＴＭアガロースへの結合を可能にするためのシステイン残基などのＮ又はＣ末端での１以上のアミノ酸の付加が含まれる。ある実施形態において、本ペプチドの１以上が、好ましくは、システイン残基の付加により修飾される。別の実施形態において、本ペプチドの１以上が、好ましくは、ＳＡＭＳＡなどの官能基の付加により修飾される。さらなる実施形態において、本ペプチドは、好ましくは、Ｎ末端修飾を含む。別の実施形態において、本ペプチドは、好ましくはＣ末端修飾を含む。
【００５８】
本発明はまた、本ペプチドが、好ましくは、固体支持体からのペプチド配列を最適に引き離すためにＮ末端又はＣ末端において１以上の化学スペーサーを含むように修飾され得ることも提供する。使用することができるスペーサーには、以下に限定されないが、６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；及び１から５アミノ酸の短いアミノ酸配列（ポリグリシン配列など）が含まれる。ある実施形態において、好ましくは本ペプチドの１以上は、１以上の６−アミノヘキサン酸スペーサーを含む。
【００５９】
代替的実施形態において、場合によっては、固相上にそれらを固定化するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はサイログロブリンなどの担体タンパク質に本ペプチドを結合させることができる。
【００６０】
本発明はまた、好ましくは、本発明の組み合わせ法において検出ペプチドとして免疫優勢ペプチドを使用することができることも提供し、この場合、検出可能標識を組み込むためにこれらを修飾することができる。本発明のある実施形態において、１以上の検出ペプチドのそれぞれは、好ましくは、捕捉ペプチドの１つのアミノ酸配列に本質的に対応するアミノ酸配列を有する。本発明によると、検出ペプチドが捕捉ペプチドとそのアミノ酸配列において同一又は実質的に同一である場合、及びまた、実質的に同等なものでの検出ペプチドにおけるアミノ酸残基の置換（例えば保存的アミノ酸置換）など、一部の配列変異が許容される場合、及び／又は結果として実質的に同等な機能性を得るために（例えば、抗体結合能）、検出ペプチドは、捕捉ペプチドの１つのアミノ酸配列に「本質的に対応」する。このような関係に従い、ある実施形態において、捕捉及び検出ペプチドは、固相及び結合に対して事実上同じアミノ酸配列であるが、それぞれの特定の役割のための提示を最適化するためにスペーサーが異なるアミノ酸配列との対で使用される。
【００６１】
本発明による検出可能標識は、好ましくは、直接又は間接的に検出することができ、検出ペプチドへの検出可能標識の結合が、好ましくは検出ペプチドに対する試験試料中の抗コア抗体の特異的結合を妨害しない、分子又は部分である。ペプチドを標識する方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、検出可能標識への検出ペプチドの連結のための二官能性クロス−リンカー（ＳＡＭＳＡなど（Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸））の使用が含まれる。当技術分野で公知のものなど、又は上述のものと同様のものなどのその他の架橋剤を使用することができる。
【００６２】
本発明のペプチドとの使用のための検出可能標識には、好ましくは、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子など、直接的に検出され得るものが含まれる。検出可能標識は、それ自身検出可能であるか、又は検出可能産物を生成させるために１以上のさらなる化合物と反応させられ得るかの何れかである。このようにして、本発明の直接的検出可能標識は、標識の検出を可能にするための、基質、トリガー試薬、光など、さらなる成分を必要とし得ることを、当業者は理解するであろう。検出可能標識の例には、以下に限定されないが、色原体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃなど）、蛍光化合物（フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジル及びランタニドキレート誘導体など）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム及びルミノールなど）、目で見える又は蛍光粒子、核酸、錯化剤又は酵素などの触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど）が含まれる。酵素の使用の場合、例えば、クロモ−、フルオロ−又はルモジェニック（ｌｕｍｏｇｅｎｉｃ）基質の添加の結果、好ましくは、検出可能シグナルが生成する。時間分解蛍光、内部反射蛍光及びラマン分光法などのその他の検出系も場合によっては有用である。
【００６３】
本発明はまた、望ましくは、間接的に検出される標識の使用も提供する。間接的に検出可能な標識は、一般に、「親和性ペア」、即ち２つの異なる分子（このペアの第一のメンバーは本発明の検出ペプチドに連結され、このペアの第二のメンバーは第一のメンバーに特異的に結合する。）の使用を含む。ペアの２つのメンバー間の結合は、通常は、化学又は物理的な性質のものである。このような結合ペアの例には、以下に限定されないが：抗原及び抗体；アビジン／ストレプトアビジン及びビオチン；ハプテン及びハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子／基質及び酵素などが含まれる。
【００６４】
ある実施形態において、好ましくは、検出可能標識は、検出ペプチドのＮ末端に結合される。別の実施形態において、好ましくは、検出可能標識は、検出ペプチドのＣ末端に結合される。ある実施形態において、場合によっては、検出可能標識は、立体障害の可能性（例えば、以下に限定されないが６−アミノヘキサン酸を含む化学的スペーサーが、検出ペプチド配列と検出可能標識との間で使用される場合など）を低下させるためにスペーサーによって連結される。
【００６５】
１．２抗コア抗体
本発明のＨＣＶ検出法において使用される抗体は、好ましくは、本方法での使用のために選択される１以上の免疫優勢ペプチドにより含有されるエピトープ以外のＨＣＶコアタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体である。この文脈において、「含有される」は、エピトープの全長配列がペプチドに存在することを意味する。当業者にとって当然のことながら、ある実施形態において、本ペプチドは、抗体が結合するエピトープの配列の一部を含み得、この抗体に結合するのに機能的であるエピトープは含まず、従って、全長エピトープに選択的に結合する抗体は、免疫優勢ペプチドと組み合わせて使用するのに依然として適切である。例えば、これらの抗体が認識するエピトープによる公知の及び／又は市販の抗コア抗体から、及び／又は、本明細書中に記載のプロセスに従うことによって、適切な抗体を選択することができる（例えば下記セクション６参照）。
【００６６】
本抗体は、好ましくは、非ヒト抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施形態において、本抗体は好ましくはヒト抗体である。
【００６７】
ある実施形態において、本抗体は、望ましくは、ＨＣＶの全て又は殆どの遺伝子型で存在する場合、コアタンパク質に結合できる。別の実施形態において、本抗体は、好ましくは、ＨＣＶの６種類の主要な遺伝子型（１、２、３、４、５及び６）及びそれらのサブタイプからの抗原性タンパク質を捕捉することができる（Ｓｔｕｙｖｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１０１３４−１０１３８（１９９４）；及びＢｕｋｈ、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．、１５：４１−６３（１９９５）に記載のように。）。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、コアタンパク質に特異的に結合できる、モノクローナル抗体及び一特異的ポリクローナル抗体及びの両インタクト分子ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含む断片など）を含む。
【００６９】
当技術分野で周知の様々な手順によって、コアタンパク質抗原に対するポリクローナル抗体を調製することができる。例えば、コア抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、インタクトなコアタンパク質又はその抗原性ポリペプチド断片（例えばアルブミンなどの担体タンパク質にこれらを結合させ得る。）をウサギ、マウス又はラットなどの適切な宿主動物に投与することができる。
【００７０】
当技術分野で公知の様々なアジュバントは、宿主の種に依存して、免疫原性反応を向上させるために使用することができ、これには、以下に限定されないが、フロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのゲル状鉱物、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び有用である可能性があるヒトアジュバント（ＢＣＧ（バチルス・カルメット−ゲラン（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）など）が含まれる。
【００７１】
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）で教示されるものなど、例えばハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を産生させることができる。しかし、本明細書中で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限らず、一般に、真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが産生される方法によって限定されない。
【００７２】
当然のことながら、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２及びその他の抗体断片を場合によっては本発明のＨＣＶ検出法において使用し得る。このような断片は、一般に、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を用いた、タンパク質分解により作製される。あるいは、組み換えＤＮＡ技術を適用することを通じて又は合成化学を通じて、コアタンパク質−結合断片を作製することができる。例えば、ハイブリドーマを用いてクローニングされた核酸の発現によって、モノクローナル抗体を産生させることができる。Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものなどの技術により、１本鎖Ｆｖｓを作製することができる。
【００７３】
ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイ技術により、モノクローナル抗体及び抗体断片を作製しスクリーニングすることもできる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）に記載のものが含まれる。本発明の抗体を作製しスクリーニングするために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６０８（ＷＯ２００７／０５６５０７）（同じ物に関するその教示に対して参照により組み込まれる。）で開示されるものが含まれる。
【００７４】
本発明のある実施形態において、組み合わせ法での使用のための抗体は、好ましくは、配列番号３、４、５又は５４により完全に含まれるもの以外のコアタンパク質のエピトープに特異的に結合するものである。別の実施形態において、本抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＧ［配列番号６］又はＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］を含むエピトープに結合できる。
【００７５】
本発明はまた、本抗体が、好ましくは固相に共有又は非共有結合され得ることも提供する。従って、本抗体は、固定化を促進するために修飾され得る。適切な修飾は当技術分野で公知であり、免疫優勢ペプチドに関して上述されている。
【００７６】
本発明のある実施形態において、本発明の組み合わせ法において抗体：コアタンパク質複合体を検出するために、抗コア抗体を好ましくは検出抗体として使用する。この実施形態によると、検出可能標識を組み込むためにこの抗コア抗体を修飾することができる。適切な検出可能標識は当技術分野で公知であり、免疫優勢ペプチドに関して上記で述べられている。捕捉及び検出抗コア抗体の両方を本方法で使用する場合、好ましくはこれらの抗体は、これらがコアタンパク質の２つの異なるエピトープを認識するように選択され、これらの何れも、使用されている免疫優勢ペプチドの配列において含まれない。
【００７７】
１．３試験試料
本発明の方法に従い試験され得る試料には、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻腔洗浄液又は組織及び細胞の水性抽出物が含まれる。適切な血漿試料には、クエン酸血漿又はＥＤＴＡ血漿試料が含まれる。好ましくは、このような試料を単離し、インビトロで試験を行う。試験試料は、あらゆる起源由来であり得るが、好ましくはヒトである。
【００７８】
試料を直接試験するか又は試験前に処理し得る。処理には、試料の溶血を防ぐ反応への成分の添加、試験前に確実に血清を凝血させるための手順又は試料からフィブリンを除去するための手順が含まれる。その他の処理には、ウイルス粒子の破壊及び／又は抗原の曝露を促進するための変性剤による処理が含まれる。様々な適切な変性剤が当技術分野で公知であり、これには、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ６３０とも呼ばれる、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤及びグアニジン、尿素又は酸性溶液などの変性剤が含まれる。これらの試薬の組み合わせも想定される。ある実施形態において、試料の前処理は必要ない。別の実施形態において、１以上の変性剤で試料を前処理する。さらなる実施形態において、グアニジン、尿素及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる群から選択される１以上の変性剤で試料を前処理する。
【００７９】
１．４その他の抗体／抗原
本発明による方法が、好ましくは、コアタンパク質以外の１以上のＨＣＶ抗原性タンパク質（例えば、非構造タンパク質、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５、ならびにＥ１及び／又はＥ２エンベロープ構造タンパク質）又はこれらのタンパク質の１以上に対する抗体の検出をさらに含み得ることが考えられる。当技術分野で公知のように、抗原性タンパク質へ特異的に結合する捕捉抗体の使用により、この抗原性タンパク質を検出することができる。同様に、当技術分野で公知のように、捕捉抗体の使用により、抗体を検出することができる。
【００８０】
本発明の適切な捕捉抗原は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はその断片に対応するアミノ酸配列を有し、試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体に特異的に結合できる。ある実施形態において、本方法は、好ましくは、試験試料中で第二の抗原性タンパク質に対する抗体を検出するために捕捉抗原を使用する。
【００８１】
上述のものを含む、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、適切な捕捉抗体を調製することができる。この捕捉抗原を標準的技術により、例えば、組み換え法により又はウイルス培養物からの精製により、調製することもできる。本発明は、タンパク質全体、タンパク質の断片又はそのタンパク質のキーエピトープに相当する１以上の免疫優勢ペプチドを含む捕捉抗原を想定する。捕捉抗体又は抗原は、場合によっては、固相上に固定化され得る。
【００８２】
下記で述べるように、標準的技術により、個々の捕捉分子を試験試料と接触させる際に形成される捕捉抗体：抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体を検出することができる。
【００８３】
ある実施形態において、好ましくは、捕捉抗原を使用し、検出抗原の使用を通じて、捕捉抗原：抗体複合体の検出を遂行する。捕捉抗原のように、検出抗原は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対応するアミノ酸配列又はその断片を有し、試料からのＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体に特異的に結合できる。検出抗原は、場合によっては、試料からの抗体の存在を調べるために、検出ペプチドに関して上記で述べたように、検出可能標識に結合させることができる。ある実施形態において、検出抗原は、好ましくは、実施例２に記載の結合法によって標識される。
【００８４】
ある実施形態において、本発明による方法は、試料中で抗ＮＳ３抗体を検出するためにＮＳ３抗原を使用する。別の実施形態において、本方法は、組み換えＮＳ３タンパク質を使用する。さらなる実施形態において、本方法は、捕捉抗原のように、及び、何らかの捕捉された抗ＮＳ３抗体の検出のために、ＮＳ３タンパク質又はその断片を使用する。具体的な実施形態において、検出ＮＳ３タンパク質は、実施例２に記載の結合法によって標識される。
【００８５】
１．５抗体：抗原複合体の検出
本発明のＨＣＶ検出法中に形成される様々な抗体：抗原複合体（即ち、捕捉ペプチド：抗体複合体、捕捉抗体：コアタンパク質複合体及び、適用できる場合、捕捉抗体：第二の抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体）は、好ましくは標準的技術により検出する。
【００８６】
例えば、捕捉された抗体に特異的に結合できる標識した二次抗体（抗ヒト抗体など）を用いて、又は捕捉ペプチドの配列と実質的に同一の配列を有する標識した検出ペプチド用いることにより、何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体の検出を行うことができる。ある実施形態において、本発明の組み合わせ法において、何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体の検出を、好ましくは、１以上の検出ペプチド（これらはそれぞれ、捕捉ペプチドの１つに本質的に対応するアミノ酸配列を有する。）の使用を通じて行う。具体的な実施形態において、捕捉ペプチド／検出ペプチドの１以上のペアを好ましくは使用するが、この場合、検出ペプチドは、その同種捕捉ペプチドの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。言うまでもなく、本発明は、配列が完全に同じように対応する捕捉ペプチド／検出ペプチドだけでなく、一部配列変異が許容されるもの（例えば、実質的に同等のアミノ酸残基及び／又は結果として実質的に同等の機能となるものによる変異）も提供する。
【００８７】
例えば、捕捉抗体により認識されるもの以外のエピトープにおいてコアタンパク質に特異的に結合できる標識した検出抗体を用いて、何らかの抗体：コアタンパク質複合体の検出を行うことができる。検出抗体により認識されるエピトープはまた、好ましくは、１以上の捕捉ペプチドに不在であり、従って、本方法において交差反応性が起こる可能性は最小限に抑えられる。
【００８８】
適用される場合、捕捉抗体：第二の抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体の検出は、好ましくは、標識した検出抗体又は抗原性タンパク質の標識物又はその断片の個々の使用を通じて行うことができる。検出抗体を使用する場合、これらは、捕捉抗体により認識されるエピトープ以外の第二の抗原性タンパク質のエピトープを認識しなければならない。
【００８９】
使用される標識に依存して、形成された個々の複合体の存在を明らかにするために、様々な標準的検出技術（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ又はその他の検出技術）を使用することができる。形成される様々なタイプの複合体を検出するために、同じタイプ又はいくつかのタイプの標識を使用することができる。
【００９０】
必要に応じて、試験試料中の抗原の存在及び／又は抗体の存在の検出は、定量により、例えば、当業者にとって公知の標準的技術に従い、標識により放射されるシグナル（色、発光、放射能など）を測定することにより、完遂することができる。あるいは、試料からのＨＣＶコアタンパク質又はコアタンパク質に対する抗体の存在の検出を定性的に測定することができる。
【００９１】
２．組み合わせ法の性能特性
診断感度、診断特異性及び再現性などの本組み合わせ法の性能特性は、好ましくは、下記のものなどの標準的技術を用いて評価することができる。
【００９２】
本発明の組み合わせ法は、好ましくは、抗体単独アッセイを上回って感度が向上し、同時に高い特異性を維持しており、従って、最適に、抗体単独試験よりも潜伏期間が狭められる。ＨＣＶ抗原性タンパク質及び抗原性タンパク質に対する抗体（陽性対照）及びこのようなタンパク質及び抗体を欠く適切な試料（陰性対照）を含有する試料を用い標準的技術を用いて、本発明の組み合わせ法の診断感度及び特異性を評価することができる。急性Ｃ型肝炎感染又は慢性Ｃ型肝炎感染の患者から、このような検体又は試料を得ることができる。本方法はまた、市販のセロコンバージョンパネル、例えば、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．（ＢＢＩ、Ｗｅｓｔ Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＭＡ）、Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）又はＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）から入手可能なものなど、に対して試験することもできる。例えば、ＢＢＩから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルには、以下に限定されないが、ＢＢＩ（又はＰＨＶ）９０１、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７及び９１９が含まれる。Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルの例には、以下に限定されないが、ＢＣＰ６２１１、ＢＣＰ６２１３、ＢＣＰ６２２２、ＢＣＰ６２２５、ＢＣＰ６２２７、ＢＣＰ９０４１、ＢＣＰ９０５４及びＢＣＰ９０５５が含まれる。Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルの例には、以下に限定されないが、ＳＣ００１０、ＳＣ００３０、ＳＣ００４０、ＳＣ００５０、ＳＣ００６０、ＳＣ０４００、ＳＣ０４０２、ＳＣ０４０５及びＳＣ０４０６が含まれる。適切な対照陰性試料には、非感染対象からの及び／又はＣ型肝炎感染に無関係の状態の患者（妊娠、自己免疫疾患又はその他の急性ウイルス感染など）から及び通常の血液ドナーからの試料が含まれる。
【００９３】
このようにして、既にＣ型肝炎感染に罹患している患者からの試料を試験するためにこの方法を用いることにより、診断感度を測定する。診断感度は、その方法の、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を含有する試料を正しく同定する能力の尺度であり、この方法により陽性として認識される真陽性の試料の数を、参照法により陽性として同定される試料の数で除した値として計算され、％として表される。参照法は、場合によっては、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを測定するアッセイ又はＨＣＶ ＲＮＡを測定するための核酸試験（ＮＡＴ）を含む。ＮＡＴは、ＨＣＶ試験において「究極の判断基準」と考えられているので、ある実施形態において、好ましくは、参照法としてのＮＡＴに対して感度を測定する。別の実施形態において、参照法としてＮＡＴを用いて、１以上のセロコンバージョンパネルに対して感度を測定する。
【００９４】
ある実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９０％から約１００％の間の診断感度を有する。さらに別の実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９５％から約１００％の間の診断感度を有する。さらなる実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９７％から約９９％の間の診断感度を有する。
【００９５】
診断感度はまた、好ましくは、その方法の、初期ＨＣＶ感染を検出する能力を測定することによっても評価される（即ち潜伏期間を狭めるため）。ある実施形態において、好ましくは、本発明による組み換え法の、ＨＣＶ感染の初期段階を検出する能力は、市販のセロコンバージョンパネルを用いて測定され、ＨＣＶ ＲＮＡを測定する現在の「究極の判断基準」（ＮＡＴ）と比較される。検出効率を評価するために、好ましくは、本方法を用いて陽性の結果を生じる試料数を調べ、ＮＡＴにより調べた場合のＨＣＶ感染の最初の検出時と比較する。抗体単独アッセイなどのその他の方法を上回る本組み合わせ法の何らかの改善もまた、望ましくは、ＨＣＶ感染の最初の検出時に対する本組み合わせ法で得られた結果をその他の方法により得られた結果と比較することにより、評価することができる。本発明のある実施形態によると、好ましくは、本組み合わせ法は、抗体単独アッセイよりも早い感染段階でＨＣＶ感染を検出することができる。
【００９６】
ある実施形態において、本発明による組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも約５日から約４０日早くＨＣＶ感染を検出する。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１０日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。さらなる実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１２日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１５日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。代替的な実施形態において、ＮＡＴ法と比較した場合の検出の平均遅延は、好ましくは、約５日から約１日の間である。別の実施形態において、ＮＡＴ法と比較した場合の検出の平均遅延は、好ましくは、約４日から約１日の間である。平均遅延及び方法間の平均差は、１以上のセロコンバージョンパネルからの複数の異なる試料を用いることにより評価することができる。例えば、最適には１０以上の試料又は望ましくは２０以上の試料である。
【００９７】
本方法が検出できる最低ウイルス量に基づいて診断感度を評価することもできる。例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているもの（例えばＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ及びＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ）などの定量的ＮＡＴ法を用いて、試験試料のウイルス量を評価することができる。本発明のある実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約５ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約４ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。さらなる実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約３ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約２ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。
【００９８】
例えば、陽性の結果を生じる試料の数を調べるために様々な非感染血液ドナーからの試料を試験することにより、本方法の診断特異性を評価することができる。診断特異性は、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を含有しない検体を正しく同定する、本方法の能力である。ＨＣＶを試験する方法に対する特異性の必要条件の例は、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ（２００２／３６４／ＥＣ）で見出すことができるが、これは、最低５０００名のヨーロッパ人ドナー又は同等者を用いた９９．５％の特異性のスクリーニングアッセイに対する最低要件を定める。その方法により陰性として認識される真性陰性検体数を、参照法により陰性であるとして同定される検体数で除した値として、診断特異性を計算し、％で表すことができる。場合によっては、ＨＣＶ感染とは無関係の状態の患者由来の交差反応の可能性がある試料に対してその方法を試験することによって、診断特異性を評価することもできる。このような状態には、例えば、妊娠、自己免疫疾患又はその他の急性ウイルス感染が含まれる。本発明のある実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法の診断特異性は、約９５％から約１００％の間である。別の実施形態において、好ましくは、本組み合わせ法の診断特異性は、約９６％から約９９％の間である。さらなる実施形態において、好ましくは、本組み合わせ法の診断特異性は、約９７％から約９９％の間である。
【００９９】
本方法の再現性は、当技術分野で公知のように調べることができる。例えば、別個の試験での複数試料の反復物を用いて、得られた結果間の変動を調べることによって、本方法を試験することができる。場合によっては、試薬の様々な調製物を用いて、本方法を試験することもできる。当技術分野で公知のように、及び、例えば、変動係数（ＣＶ）により示されるように、標準的統計法を使用して、アッセイ内変動（同じ試料の反復物内の変動）及びアッセイ間変動（別個の場合での試験における変動）の何れか又は両方を測定することができる。ある実施形態において、好ましくは、本方法のアッセイ内変動の％ＣＶは、約１０％未満、さらにより好ましくは約０．０１％から約１０％である。別の実施形態において、好ましくは、本方法のアッセイ間変動の％ＣＶは、約１５％未満、さらにより好ましくは約０．０１％から約１５％である。
【０１００】
３．アッセイ形式
望ましくは、不均一相（固相など）又は均一相で；１段階又は２段階で；サンドイッチ型アッセイとして；競合的又は非競合的形式で、などを含む（がこれらに限定されない）、免疫アッセイに適切な当技術分野で公知の様々なアッセイ形式で、本発明による方法を行うことができる。
【０１０１】
代表的な免疫アッセイ形式には、以下に限定されないが、マイクロタイタープレートアッセイ、ミクロスフェア免疫アッセイ、デュアルアッセイストリップブロット、迅速試験、ウエスタンブロット、ならびに例えば、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｓアッセイ（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第二版、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編集、３６３−３６７頁、２００１）での常磁性粒子の使用が含まれる。このような形式は当業者にとって公知である。
【０１０２】
形式のその他の例には、試験試料中に存在する抗原を検出するために使用することができる２つの抗体（捕捉及び検出抗体）間でサンドイッチされるタイプの免疫アッセイ形式が含まれ、この場合、この抗体は、捕捉ペプチド又は捕捉抗原の何れか及び、抗体に連結する標識結合物（「間接的形式」と一般に呼ばれる形式に従う。）、例えば標識したタンパク質Ａ又は標識した抗免疫グロブリン又は抗アイソタイプ抗体を用いて明らかにされる。この抗体はまた、好ましくは、抗体に結合する、捕捉ペプチド及び標識した検出ペプチド（「抗原−抗体−抗原サンドイッチ」又は「二重抗原サンドイッチ」と呼ばれる形式に従う。）を用いて検出することもできる。免疫アッセイのその他の形式もまた想定され、当業者にとって周知である。
【０１０３】
ある実施形態において、好ましくは、サンドイッチに基づく形式を用いて本方法を行う。別の実施形態において、好ましくは、それぞれ抗体サンドイッチ及び二重抗原サンドイッチを用いて、試験試料中のコアタンパク質及び抗コア抗体を検出する。
【０１０４】
上述の免疫アッセイ形式の多くの場合、最適に、免疫優勢ペプチド及び／又は抗コア抗体を固体支持体に連結させる。適切な固体支持体の例には、多孔質及び非多孔質材、ラテックス粒子、磁気粒子、微小粒子（米国特許第５，７０５，３３０号を参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチックチューブが含まれる。固相材料の選択は、所望のアッセイ方式の性能特性に基づき行うことができ、微粒子であり得る（ペレット、ビーズなど）又は連続面（膜、メッシュ、プレート、スライド、ディスク、キャピラリー、中空糸、針、ピン、チップ、ソリッドファイバー（ｓｏｌｉｄ ｆｉｂｅｒ）、ゲルなど）の形態であり得る。ある実施形態において、好ましくは、マイクロプレート又はマイクロタイターウェルを固相として使用する。適切なマイクロプレート又はマイクロタイターウェルの例には、Ｎｕｎｃ社、Ｄｅｎｍａｒｋから市販されているものなど、ポリスチレン製のものが含まれる。別の実施形態において、好ましくは、固形粒子又はビーズ；又は常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ又はＭｅｒｃｋ−Ｅｕｒｏｌａｂ（Ｆｒａｎｃｅ）（ＥｓｔａｐｏｒＴＭ）により提供されるものなど）を固相として使用し得る。さらに別の実施形態において、好ましくは、ポリスチレン又はポリプロピレン製などの試験管を固相として使用し得る。
【０１０５】
共有結合に対する連結剤は当技術分野で公知であり、固相の一部であり得る又は、アミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物部分を介した捕捉ペプチド及び／又は抗体の連結を可能にする反応基で固相を誘導化し得る。このような様々な架橋剤が当技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、前記及びＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのカタログ参照）。例としては、以下に限定されないが、ジアミン（１，６−ジアミノヘキサンなど）；ジアルデヒド（グルタルアルデヒドなど）；ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル及びエチレングリコール−ビス（コハク酸スクシンイミジル）など）；ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートなど）；ビスオキシラン（１，４ブタンジイル ジグリシジルエーテルなど）；ジカルボン酸（スクシニルジサリチレートなど）；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられる。固体支持体上に捕捉ペプチド及び／又は抗体を固定化するために、当技術分野で公知の様々なカップリング化学を場合によっては使用することができ、これには、例えば、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフィドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミドカップリング化学に対するカルボキシル及びアミノ誘導体の使用が含まれる。
【０１０６】
あるいは、上述のように、好ましくは、適切に修飾される固体支持体への分子の連結を可能にする基で、捕捉ペプチド及び／又は抗体を修飾する。例えば、好ましくは、捕捉ペプチド及び／又は抗体は、Ｎｉ２＋イオンを含有するように修飾されている固体支持体にペプチド／タンパク質が固定化されることを可能にするＨｉｓタグを含む。同様に、好ましくは、捕捉ペプチド及び／又は抗体はビオチンで修飾され、支持体は、アビジン／ストレプトアビジンを含有するように修飾される。その他の例は、当技術分野で公知である。
【０１０７】
当業者にとって当然のことながら、試料のハイスループットスクリーニングに対して本発明による方法を容易に適合させることができる。ハイスループット法は、複数の試料を同時に処理し、大量の試料をスクリーニングするのに要する時間を大きく短縮するという有利な点がある。従って本方法は、試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質及びＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を同時に同定するためにハイスループット法の使用を想定する。
【０１０８】
ハイスループットスクリーニングの場合、好ましくは反応成分は通常はマルチ容器担体又はプラットフォーム（マルチウェルマイクロタイタープレートなど）に収容されるが、これにより、複数の反応系それぞれが様々な試験試料を含有し、それらを同時に監視できるようになる。本発明はまた、スクリーニングプロセスの効率を向上させるための高度自動化ハイスループットスクリーニングも包含する。試料及び試薬ピペッティング、液体分注、時間調節温置、マイクロアレイへの試料の形式合わせ、マイクロプレートのサーモサイクリング及び適切な検出器におけるマイクロプレート読み取りなどの多くの手順に対する自動化能力のように、多くのハイスループットスクリーニング又はアッセイ系が現在市販されており、その結果、スループット時間が非常に速くなった。
【０１０９】
４．診断キット
本発明は、本発明による組み合わせ法での使用に適切な試薬を含むＨＣＶの検出のために診断キットをさらに提供する。このような試薬には、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる１以上の捕捉抗体及び本発明によるコアタンパク質に結合できる１以上の捕捉ペプチドが含まれる。この試薬には、また、場合によっては、ＨＣＶコアタンパク質を検出するための１以上の検出ペプチド及びＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる１以上の検出抗体も含まれる。
【０１１０】
このキットは、さらに、好ましくは、第二の抗原性タンパク質に対する抗体の捕捉のための、第二の抗原性タンパク質（コア以外）もしくはその断片、又は第二の抗原性タンパク質の捕捉のための第二の抗原性タンパク質に対する抗体及びそれぞれ、標識抗原性タンパク質又は標識抗体などの、捕捉した抗体又は抗原を検出するための手段を含む。ある実施形態において、好ましくは、このキットは、ＮＳ３に対する抗体を検出するための、ＮＳ３タンパク質もしくはその断片、及び捕捉抗体を検出するための、標識ＮＳ３タンパク質又はＮＳ３タンパク質の標識断片を含む。
【０１１１】
このキット中で提供される検出試薬は、好ましくは、フルオロフォア、放射能部位、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を組み込むか、又は、このキットは、場合によっては、試薬を標識するために必要な成分を含む。この試薬は、別個の容器中で提供するか又は適切なアッセイ形式に前もって分注されるか又は固定化され得る。例えば、マイクロタイタープレート又はウェルなどの適切な固体支持体上で捕捉試薬を固定化して提供することができ、この検出試薬を適切な別個の容器中で提供できる。
【０１１２】
このキットは、場合によっては、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬、洗浄試薬など、診断アッセイを行うのに必要な試薬を含む。試験試料の単離及び／又は処理のための緩衝液及び溶液など、その他の成分もまた、このキット中に含まれ得る。このキットは、さらに１以上の対照を含み得る。このキットの成分の１以上は凍結乾燥され得、その場合、このキットは、凍結乾燥成分の再構成に適切な試薬をさらに含み得る。
【０１１３】
このキットの様々な成分は、望ましくは適切な容器中で提供される。上記で示されるように、好ましくは容器の１以上がマイクロタイタープレートであり得る。適切であれば、このキットはまた、場合によっては、反応容器、混合容器及び試薬又は試験試料の調製を促進するその他の成分も含有する。このキットはまた、シリンジ、ピペット、ピンセット、一定量用のスプーン、一定量用の容器など、試験試料を得るか又は試薬を測定／分注することを補助するための１以上の器具も含み得る。
【０１１４】
ある実施形態において、好ましくは、このキットは、例えば、試料添加コントロール及び／又は色分け試薬など、プロセス制御監視のための試薬を含む。本発明のある実施形態によるプロセス制御監視の例を図４で示す。図４で示されるように、具体的な色についてプレートを調べることにより、ウェルへのアッセイの様々な成分の添加を確認し得る。例えば、試薬が色分けされている場合、特定の段階におけるある試薬の別の試薬への添加の結果、好ましくは、混合物の色が変化し、このようにしてその段階が行われたという指標が与えられる。あるいは、この方法のその段階が行われたか否かを調べるために、ウェル中の溶液の光学密度を監視し得る。本組み合わせ法の段階の１又は複数のプロセス制御監視に対して、試薬を提供し得る。
【０１１５】
このキットはまた、場合によっては、使用説明書を含み、これは、紙の形態で又はコンピュータ可読形態（ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなど）で提供され得る。このキットはまた、本組み合わせ法により得られる結果の解釈を支援するソフトウェアを含むコンピュータ可読媒体も含み得る。このキット成分のその他の変形物は当業者にとって公知である。
【０１１６】
５．組み合わせ法及び診断キットの使用
本発明による組み合わせ法及び診断キットは、好ましくは、様々な診断目的のために使用される。このような診断目的には、以下に限定されないが、ＨＣＶの初感染の検出、患者の治療薬への反応の監視、ＨＣＶの再感染の検出、ウイルス量の測定及び感染の有無及び状態の判定（急性と慢性）が含まれる。
【０１１７】
本組み合わせ法及び診断キットはまた、好ましくは、例えば遺伝子型アッセイ又はＨＣＶ突然変異もしくは複数血清型の検出など、非診断目的のためにも使用される。本発明はまた、血液試料又は血液製剤（ドナー血液など）のプール内でのＨＣＶの検出のための、本組み合わせ法及び診断キットの使用も包含する。これに関連して、本発明の方法によるハイスループットスクリーニングは、疫学的研究のための大集団スクリーニング又はＨＣＶが混入した試料に対する血液バンクもしくは器官のスクリーニングなど、大規模スクリーニングを促進するために有用であり得る。
【０１１８】
勿論、言うまでもなく、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載のような、及び例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）から市販されているような（限定されないが、ＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームならびにその他のプラットフォームを含む。）、自動化及び半自動化系（微小粒子を含む固相があるものを含む。）での使用に対して、本明細書中の代表的形式の何れか及び本発明による何れかのアッセイ又はキットを適合させるか又は最適化することができる。
【０１１９】
さらに、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴＴＭ電気化学的免疫アッセイ系を含むポイントオブケアアッセイ系に対して、本発明のアッセイ及びキットを適合させるか又は最適化することができる。免疫センサー及び使い捨て試験装置においてこれらを製造し、操作する方法は、例えば米国特許第５，０６３，０８１号及び公開米国特許出願第２００３０１７０８８１号、同第２００４００１８５７７号、同第２００５００５４０７８号及び同第２００６０１６０１６４号（同じものに関してそれらが教示することに対して参照により組み込まれる。）に記載されている。
【０１２０】
６．組み合わせアッセイのための試薬を選択するためのプロセス
本発明はまた、本明細書中に記載のＨＣＶ検出のための組み合わせ法などの組み合わせ法での使用に適切な試薬を選択するためのプロセスも提供する。この選択プロセスによって、好ましくは、微生物（例えば、細菌、寄生虫、真菌又はウイルス）の抗原性タンパク質を捕捉及び検出するために使用される試薬と、抗原性タンパク質に対する抗体を捕捉及び検出するための試薬間で、これらの試薬を一緒に使用する場合、交差反応性が（あるとしても）あまりないように試薬を選択できるようになる。抗原性タンパク質を捕捉又は検出するために適切な試薬には抗体が含まれ、同じ抗原性タンパク質に対する抗体を捕捉又は検出するために適切な試薬には免疫優勢ペプチドが含まれる。
【０１２１】
ある実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質を検出するための試薬の選択にこのプロセスを適用する。しかし、この選択プロセスは、コアタンパク質以外のＨＣＶ抗原性タンパク質及びそれに対する抗体を検出する組み合わせ法に、より一般的には、その他の微生物由来の抗原性タンパク質及びこれらのタンパク質に対する抗体を検出する組み合わせ法に適切な試薬の選択に幅広く適用することができることを理解されたい。ある実施形態において、ウイルスタンパク質を検出するための試薬の選択にこの方法を適用する。その他の実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来の抗原性タンパク質、例えばｐ２４、を検出するための試薬の選択にこの方法を適用する。
【０１２２】
この選択プロセスは、好ましくは、関心のある微生物の抗原性タンパク質を選択し；抗原性タンパク質に対して免疫優勢ペプチドを同定し（各免疫優勢ペプチドは、一連の感染段階の微生物感染対象の大多数に存在する抗体により認識されるキーエピトープを含有する。）；同定された免疫優勢ペプチドの１以上を選択し、選択されたペプチドに含有されるもの以外のエピトープを認識する抗体を同定する、段階を含む。
【０１２３】
１以上の免疫優勢ペプチドは、好ましくは、微生物の様々な遺伝子型間でよく保存されており、様々なセロコンバージョン試料及び抗原性タンパク質に対して反応性がある後期段階の試料を含む、微生物感染個体の大多数に存在する抗体により認識される抗原性タンパク質のキーエピトープを含有する抗原性タンパク質の免疫優勢領域を確立することにより、同定される。このようにして、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、抗原性タンパク質の断片のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
本発明による１以上の免疫優勢ペプチドを選択するために、好ましくは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列を最初に得る。抗原性タンパク質のアミノ酸配列が当技術分野で公知である場合、このアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭなどの様々な公開データベース又は刊行物又は雑誌論文から得ることができる。あるいは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列が未知である場合、例えば、抗原性タンパク質が新規タンパク質である場合、抗原性タンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で公知のように得ることができる。例えば、エドマン分解又は質量分析などのタンパク質又はペプチド配列決定技術を使用し得るか又はそのタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし配列決定することができる。抗原性タンパク質のＤＮＡ配列が既知の場合、ＤＮＡ配列から抗原性タンパク質のアミノ酸配列を推定し得る。
【０１２５】
抗原性タンパク質のアミノ酸配列を得たら、好ましくは、ペプチドのライブラリを作製する。ライブラリ中の各ペプチドは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列の断片に対応するアミノ酸配列を有する。ライブラリの総サイズが扱いやすいものであるよう十分長くなるように、及び１つのペプチドに複数のエピトープが存在することが最小限になるよう十分短くなるように、ペプチドの長さを選択する。一般に、約５から約２０アミノ酸長の間のペプチドが適切である。ある実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約７から約２０アミノ酸長の間である。別の実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約８から約２０アミノ酸長である。さらなる実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約１０から約２０アミノ酸長、場合によっては、約１２から約２０アミノ酸長である。その他の実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約８から約１８アミノ酸の間、約８から約１６アミノ酸の間、約１０から約１８アミノ酸の間、約１０から約１６アミノ酸の間及び約１０から約１４アミノ酸長の間である。
【０１２６】
このペプチドはまた、そのアミノ酸配列が好ましくは少なくとも２アミノ酸重複するように設計される。約３から約１４アミノ酸の間の重複も想定される。このペプチドに対する選択される重複は、ライブラリに必要とされる分解能ならびにライブラリにより含まれるペプチドの長さに依存する。一般に、重複はそのペプチドの長さの３分の２以下である。所望のライブラリ特性を得るためのこのような重複の選択は、当業者の通常の技術及び知識の範囲内である。同じく、ペプチドのライブラリを作製する方法も当技術分野で公知である。
【０１２７】
実施例１に従い、及び実施例１で示されるように、ペプチドのライブラリから候補免疫優勢ペプチドを同定することができる。ペプチドのライブラリからの各ペプチドは、好ましくは、微生物に感染した対象からの複数の試料に対して試験され、試料（感染の様々な段階からの試料を含む。）の大多数において抗体に結合するものを同定することにより、可能性のあるペプチドを選択する。
【０１２８】
このペプチドはまた、好ましくは、非感染試料（微生物による感染に対して結果が偽陽性となることが知られている試料を含む。）に対してもスクリーニングされる。これらの偽陽性試料は、ペプチド配列における交差反応領域を同定する陰性対照試料である。陰性対照試料に反応するペプチド（即ち交差反応領域を含む。）を好ましくは回避する。微生物に感染した対象からの複数の試料において抗体に結合するが、偽陽性シグナルを生じさせる交差反応領域を含有しないペプチドを望ましくは候補免疫優勢ペプチドとして選択する。
【０１２９】
次に、上述のように同定される候補免疫優勢ペプチドの配列に基づき、免疫優勢ペプチドを調製する。この免疫優勢ペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの候補ペプチドの配列を含み、また、場合によっては、候補ペプチドのすぐ隣にある２つのペプチドの一方又は両方の配列の一部又は全てを含む（ただし、これらの隣接ペプチドは交差反応領域を含まない。）。
【０１３０】
次に、その、効率的に抗原性タンパク質を捕捉し、選択される免疫優勢ペプチドにより完全に含有されるもの以外のエピトープに結合する能力に基づき、１以上の抗体を選択する。上述のように、ある実施形態において、免疫優勢ペプチドが、選択される抗体により結合されるエピトープの配列の一部を含むことが想定されるが、これは、部分的エピトープは、抗体に結合する機能がないからである。ある実施形態において、好ましくは、その微生物の全て又は殆どの遺伝子型で生じる抗原性タンパク質の形態に結合する抗体を選択する（微生物の複数遺伝子型がある場合）。
【０１３１】
適切な抗体を市販の抗体から選択することができる、又は、あるいは、抗原性タンパク質に特異的に結合できる抗体のライブラリを作製することができる。このようなライブラリを作製する方法は当技術分野で公知である。次に、必要に応じて、既知の方法を用いて、この抗体により認識されるエピトープのマッピングを行うことができる。例えば、免疫優勢ペプチドが選択されたペプチドのライブラリに対して、この抗体をスクリーニングすることができる。一部の市販の抗体の場合、その抗体が結合するエピトープは既知であり、従って、マッピング段階を行う必要はない。適切な抗体が選択されたら、好ましくは、これらがペプチドに含まれるエピトープと交差反応しないことを確認するために、選択された免疫優勢ペプチドに対して、これらの抗体をスクリーニングする。
【０１３２】
免疫優勢ペプチドが同定され、モノクローナル抗体により認識されるエピトープが決定されたら、組み合わせアッセイでの使用に対して、免疫優勢ペプチド及び免疫優勢ペプチドに結合しないモノクローナル抗体の組み合わせを好ましくは選択する。選択された免疫優勢ペプチドを捕捉及び検出ペプチドとして使用することができ、選択されたモノクローナル抗体を好ましくは捕捉及び検出抗体として使用する。
【０１３３】
ここで、具体的な実施例を参照しながら本発明を説明する。次の実施例は本発明の実例となる実施形態を述べるものであり、本発明を何ら限定するものではないことを理解されたい。
【０１３４】
実施例
【実施例１】
【０１３５】
免疫優勢コアペプチド及び抗コア抗体の選択
コアタンパク質の重複断片に相当する一連のペプチド（配列番号７−５３）を調製した。各ペプチドは１２アミノ酸長であり、先行する（Ｎ末端）ペプチド８アミノ酸及び続く（Ｃ末端）ペプチド８アミノ酸が重複した（図３参照）。ＢＳＡにこれらのペプチドを結合させ、マイクロタイタープレートをこれらで被覆し、そのタンパク質のキーとなる抗原性領域のマッピングを行うために、抗ヒト形式で真性ヒト陽性血清に対してスクリーニングを行った。使用する、選択されたモノクローナル抗体の結合部位を同定するために、抗マウス形式で同じプレートを使用した。
【０１３６】
このスクリーニングプロセスの結果に基づき、次の免疫優勢ペプチドを調製した。
【０１３７】
コア捕捉ペプチド１：ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＣ［配列番号５４］。
【０１３８】
コア捕捉ペプチド１は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基１６から３０に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＣ末端へのシステイン残基の付加により修飾される。
【０１３９】
コア捕捉ペプチド２：ＳＡＭＳＡ−ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号５５］。
【０１４０】
コア捕捉ペプチド２は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基３３から４４に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基の付加により修飾される。
【０１４１】
コア捕捉ペプチド３：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５６］。
【０１４２】
コア捕捉ペプチド３は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４９から６８に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及び３個のアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）スペーサーの付加により修飾される。
【０１４３】
コア検出ペプチド１：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ［配列番号５７］。
【０１４４】
コア検出ペプチド１は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基１６から３０に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及びＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４５】
コア検出ペプチド２：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号５８］。
【０１４６】
コア検出ペプチド２は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基３３から４４に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及び３個のＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４７】
コア検出ペプチド３：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５９］。
【０１４８】
コア検出ペプチド３は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４９から６８に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及びＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４９】
３種類の検出ペプチドは全て、ＳＡＭＳＡ部分を介してホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた。
【０１５０】
上記捕捉及び検出ペプチドにより完全に含まれるもの以外のエピトープに結合する、上記捕捉及び検出ペプチドと組み合わせて使用しようとするモノクローナル抗体を選択した。
【０１５１】
モノクローナル＃１（ＫＴＭ１６３）：図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基２９から３２により定められるエピトープＱＩＶＧ［配列番号６］に結合する。
【０１５２】
モノクローナル＃２（ＫＴＭ１４５）：図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４１から４８により定められるエピトープＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］に結合する。
【０１５３】
モノクローナル抗体＃１（ＫＴＭ１６３）をホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させ、検出抗体として使用し、モノクローナル抗体＃２（ＫＴＭ１４５）を捕捉抗体として使用した。
【０１５４】
協和発酵工業（日本）からモノクローナル抗体ＫＴＭ１６３及びＫＴＭ１４５を得た。（ＫＴＭ１４５及びＫＴＭ１６３の結合特性を有するその他のモノクローナル抗体も本発明の目的のために使用し得る。）。
【実施例２】
【０１５５】
組み換えＮＳ３抗原の調製及び標識
組み換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質ＮＳ３及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合物を次のように調製した。この方法は、米国特許出願第６０／８４１，８０１号の特許出願「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｅｉｎｇ Ｓａｍｅ」（２００６年９月１日提出）の対象である（同じ物に関するその教示に対して参照により組み込まれる。）。
【０１５６】
標準的タンパク質発現法に従い、組み換えＮＳ３（ｒＮＳ３）を調製し、ＮＳ３のネイティブ配列をこのネイティブ配列に対するＮ末端位置のベクター由来のリーダー配列とともに含有させた。
【０１５７】
ＨＲＰ−マレイミド溶液を次のように調製した。スルホ−ＳＭＣＣの２倍モル過剰濃度をＤＭＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８中で溶解させた１００ｍｇ／ｍＬ ＨＲＰを添加した。この溶液を穏やかに旋回撹拌し、室温で４５分間静置した。ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にこの溶液（２．５ｍＬ）を添加し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８（３．２ｍＬ）で溶出することによって、ゲルろ過によりＨＲＰ−マレイミドを精製した。
【０１５８】
ＴＣＥＰの１０倍過剰量を含有するＴＣＥＰ（Ｐｅｒｂｉｏ又はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の水溶液中で、６．８のｐＨで２時間、室温にてｒＮＳ３を還元し、還元ｒＮＳ３を得た。上述のようにして調製したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドの１０モル当量を、還元ｒＮＳ３及びＴＣＥＰの溶液に添加し、得られた混合物を旋回撹拌し、２−８℃で１６−２４時間静置し、ｒＮＳ３−ＨＲＰを得た。次に、室温で３時間、ヨード酢酸の過剰量との反応させることにより、未反応スルフィドリル基を全て封鎖した。各カラムに生成物２．５ｍＬを添加し、３ｍＬ中で溶出することにより、ＰＤ１０カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ−２５メディウム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上でのゲルろ過によって、得られた封鎖済みｒＮＳ３−ＨＲＰを精製し、最終ｒＮＳ３−ＨＲＰ生成物を得た。最終ｒＮＳ３−ＨＲＰ生成物を調製するためのこの４段階の手順を行うのに必要な時間は全部で１ １／２日であった。一方、従来法により調製されるｒＮＳ３−ＨＲＰは９段階（中間体生成物の精製を含む。）を要し、全部で３日間かかった。
【０１５９】
上記「インシトゥ」法により調製されたｒＮＳ３結合物及び９段階の従来法により調製されたｒＮＳ３結合物が抗ＨＣＶ抗体を検出する能力を比較することにより、従来のｒＮＳ３−ＨＲＰよりもインシトゥｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物を高いタイター（即ち低濃度）で使用することができ、シグナルがより高く、陰性でより低くなることが分かった。さらに、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ非存在下でｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物を使用することができ、一方、従来法に従い調製されたｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物の場合、６ｍＭ ＤＴＴを結合物希釈液に添加しなければならなかった。従来のｒＮＳ３−ＨＲＰをＤＴＴ又はＴＣＥＰなしで使用した場合、陽性シグナルが大幅に低下した。これらの結果から、インシトゥ法は、タンパク質構造をオープンコンファメーション（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）に保持し、予想され得るように、嵩張るＨＲＰ部分がキーエピトープを覆い隠さずに、安定してそれらが露呈されることが示唆される。
【実施例３】
【０１６０】
Ｃ型肝炎ウイルス検出のための免疫アッセイキット
この実施例は、本発明の組み合わせ法での使用に適切な試薬を含有する代表的な免疫アッセイキット及び使用のためのその調製について述べる。この免疫アッセイキットは、実施例１に記載の免疫優勢ペプチド及びモノクローナル抗体及び実施例２に記載の組み換えＮＳ３抗原を含む。このキットを用いて行われるアッセイの形式を図５で図示する。図５で示される「ポリコアペプチド結合物」は、固体表面上でのペプチドの結合及び提示を向上させるためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された３つのコアペプチドを含む。全試薬に対する適切な保管条件は、別段の断りがない限り、２から８℃である。
【０１６１】
１．被覆ウェル
本キットは、ホイルバッグ中に保管された被覆ウェル（例えば、マイクロタイタープレート）を含む。１枚のプレート又は５枚のプレート（各プレート９６ウェル）が、精製組み換えＨＣＶ ＮＳ３抗原、ペプチド（配列番号）及び抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体で被覆される。プレートをバッグから取り出す前に、このウェルを１８から３０℃にする。エンドシール付近のホイルバッグを切らないように注意する。そのプレートの全てを使用していない場合は、未使用ウェルを乾燥剤とともにホイルバッグに入れ、慎重にテープで封止し、２−８℃に戻した（３ヶ月以内）。
【０１６２】
２．試料希釈剤
本キットは、表２で示される化学組成を有する試料希釈剤１８ｍＬを含有する瓶１本又は瓶２本を含む。
【０１６３】
【表２】
【０１６４】
液体のｐＨは６．２であり、液体密度は１．０８ｇ／ｍＬであった。液体の色は、緑／青色であった。
【０１６５】
３．陰性対照
本キットは、表３で示される化学組成を有する陰性対照溶液の２．８ｍＬを含有する瓶１本を含む。
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
溶液のｐＨは７．６であり、溶液密度は１．０８ｇ／ｍＬであった。溶液の色は青色であった。
【０１６８】
４．抗体陽性対照
本キットは、表４で示される化学組成を有する抗体陽性対照１．８ｍＬを含有するを含む。
【０１６９】
【表４】
【０１７０】
溶液のｐＨは７．６であり、溶液密度は１．０８ｇ／ｍＬである。溶液の色は黄色であった。
【０１７１】
５．抗原陽性対照
本キットは、表５で示される化学組成を有する抗原陽性対照１．８ｍＬを含有する瓶１本を含む。
【０１７２】
【表５】
【０１７３】
溶液のｐＨは１０．８から１１．２であった。溶液密度は１．００ｇ／ｍＬであり、溶液の色は赤色であった。
【０１７４】
６．結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
本キットの結合物は、抗コアモノクローナル抗体とともに抗原性組み換えＮＳ３及びコアタンパク質ペプチドを含有する凍結乾燥ホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識結合物１．２５ｍＬを含有する瓶１本又は瓶３本で提供される。再構成された各瓶は最大で２枚のプレートに対して十分である。
【０１７５】
７．結合物希釈剤
本キットの結合物希釈剤は、表６で示される化学組成を有する希釈剤２５ｍＬ（結合物の瓶１本を再構成するのに十分である。）をそれぞれ含有する瓶１本又は瓶３本として提供される。
【０１７６】
【表６】
【０１７７】
溶液のｐＨは６．８であり、溶液の密度は１．０６ｇ／ｍＬであった。溶液の色は黄色であった。
【０１７８】
結合物の再構成
ストッパーに付着している物質を除去するために結合物の瓶の固体表面を軽く叩くこと（タッピング）により結合物の再構成を行う。結合物希釈剤の瓶の全内容物を結合物の瓶に注ぎ、結合物の瓶に蓋をして穏やかに反転させることにより混合する。時折旋回撹拌しながら少なくとも１５分間、この結合物を再水和する。再構成された結合物の色は赤色である。
【０１７９】
再構成後、２−８℃で２４時間まで結合物を保管するか又は分注して５ヶ月間まで凍結（−１５℃以下）し得る。再構成された結合物を３回まで凍結融解し得る。
【０１８０】
８．基質希釈剤
基質希釈剤は、無色溶液３５ｍＬを含有する瓶１本として提供される。基質希釈剤は、０．０４８％過酸化水素水、４．２３３％クエン酸トリナトリウム及び９５．７１９％蒸留水を含有する。％は全て、重量／重量％として計算される。希釈剤のｐＨは７．５から８．５であり、希釈剤の密度は１．０３ｇ／ｍＬである。
【０１８１】
９．基質濃縮液
基質濃縮液は、表７で示される化学組成を有する基質濃縮液３５ｍＬを含有する瓶１本として提供される。
【０１８２】
【表７】
【０１８３】
溶液のｐＨは２．０±０．３であり、溶液の密度は１．０２ｇ／ｍＬである。溶液の色は橙色である。
【０１８４】
基質溶液
基質溶液を調製するために、汚れていないプラスチック容器中で、下記表８で示されるように、無色基質希釈剤の体積を橙色の基質濃縮液の等体積に添加する。
【０１８５】
【表８】
【０１８６】
あるいは、基質希釈剤の瓶の内容物全てを基質濃縮液の瓶に注ぐことにより、基質溶液を調製し得る。基質希釈剤の添加において、基質濃縮液の色が橙色から黄色に変化する。
【０１８７】
調製済み基質溶液は冷蔵（２から８℃）又は１５から２５℃で２日間まで安定であるが、結晶が形成されたら廃棄しなければならない。
【０１８８】
１０．洗浄液
本キットは、２０倍の作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）のＴｗｅｅｎ／食塩水洗浄液１２５ｍＬを含有する瓶１本又は瓶２本を含む。この２０倍作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）溶液は、１．７１４％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（Ｒ）（１０％溶液）、１．５４１％プロパン−１，２−ジオール、０．１７３％５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、１４．２６６％塩化ナトリウム、０．８５７％Ｔｗｅｅｎ２０及び８３．１３６％水を含有する。％は全て、重量／重量％である。この溶液のｐＨは７であり、希釈剤の密度は１．１１ｇ／ｍＬである。必要な体積を得るために、蒸留水又は脱イオン水の何れかでこの洗浄液を２０分の１に希釈するか、又は、洗浄液の瓶１本の全内容物を２５００ｍＬの最終体積に希釈する。希釈されると、この洗浄液は０．０１％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（Ｒ）保存料を含有する。
【０１８９】
密封容器において１８℃から３０℃で作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）洗浄液を保管する（この状態で、１ヶ月間活性を保持する。）。
【実施例４】
【０１９０】
試料調製及び保管
次の実施例は、実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて試験しようとする試料の調製及び保管について述べる。本方法において、血清、ＥＤＴＡ血漿又はクエン酸血漿試料を使用し得る。血清試料は、完全に凝血し、目に見える特定の物質を遠心により試料から除去するべきである。セロコンバージョンパネルからの試料をアッセイするために本キットを使用する場合、何らかのさらなる処理なしで供給者により提供されるような試料を使用し得る。
【０１９１】
２から８℃でこの試料を保管する。７２時間以内のアッセイに必要とされない試料を血餅又は細胞ペレットから取り出し、凍結保存する（−１５℃未満）。凍結融解サイクルを複数回繰り返すことは避ける。抗原のみの試料をわずか５回凍結融解することで最大で２５％シグナルを低下させ得るので、特に重要である。融解後、試験前に試料を完全に混合するようにする。
【実施例５】
【０１９２】
半自動化マイクロプレート処理装置に対する方法
次は、半自動化マイクロプレート処理装置を用いて使用することができる代表的方法について述べる。本方法は、実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて行うことができる。全ての試薬及び試料は、使用前に１８から３０℃にする。使用直後、全ての試薬を推奨される保管温度に戻す。試薬とともに使用しようとするガラス器具を２Ｍ塩酸でよく洗浄し、次いで蒸留水又は高品質脱イオン水ですすぐ。
【０１９３】
本方法により、下記で述べるように、プロセス制御監視が可能になる。このアッセイの様々な成分のウェルへの添加は、次の色についてプレートを調べることにより目で見て確認することができる。試料希釈剤の色は緑色である。試料又は対照を添加すると、希釈剤は青色に変色する。この変色は、試料により様々であるが、いくらかの変化が必ず目で見られるはずである。再構成された結合物の色は赤色である。基質溶液は、最初、黄色であり、何らかの反応性のあるウェルは青／緑色になる。停止溶液添加時、反応物の青色／緑色は橙色に変色し、一方、未反応ウェルはピンクに変色する。次のようにマイクロプレートリーダーを使用して、試料又は試薬の添加を確認することができる：試料希釈剤＋試料を５７０又は６２０ｎｍで読み（参照を６９０ｎｍ）、結合物は４９０ｎｍで読み（参照を６９０ｎｍ）、基質溶液は４５０ｎｍで読む（参照なし）。
【０１９４】
本方法は次の段階を含む：
１．洗浄液を調製し、結合物を再構成する。
２．試料希釈剤５０μＬを各ウェルに添加する。
３．試料５０μＬ又は対照５０μＬをウェルに添加する。白色背景の使用により、試料
４．ウェルに蓋をして、３７℃±１℃で６０分間温置する（第一の温置時間）。
５．温置時間の終了時、下記の洗浄手順のようにプレートを洗浄する。洗浄終了後、プレートを裏返し、残存した洗浄液を吸収紙上に軽く叩き出す。
６．各ウェルに結合物１２０μＬをすぐに添加する。
７．ウェルに蓋をして、１５−２８℃で６０分間温置する（第二の温置時間）。
８．基質溶液を調製する。
９．段階５を繰り返す。
１０．プレート洗浄直後に、各ウェルに基質溶液８０μＬを添加する。
１１．ウェルに蓋をして、３７℃±１℃で３０分間温置する（第三の温置時間）。直射日光を避ける。
１２．停止溶液５０μＬを添加する。適切な停止溶液は、０．５Ｍから２Ｍ硫酸を含む。
１３．適用可能な場合は参照波長として６２０ｎｍから６９０ｎｍを用いて、１５分以内に４５０ｎｍで吸収を読む。装置が空の状態でブランクをとる（台部にプレートなし）。
【０１９５】
洗浄手順
推奨される洗浄装置に対する当技術分野で公知のプロトコール及び洗浄装置及び分析装置を検証するための手順を使用することができるか又は次の代表的プロトコールを使用することができる：
自動ストリップ洗浄装置に対するプロトコール
作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）洗浄液を用いて５回の洗浄サイクルを行う。可能な場合、次のことを確認する：
（ｉ）５００μＬ／ウェルの充填体積の貫流洗浄を使用し、及び／又はウェルを完全に満たす。
（ｉｉ）溢れ出さないように、僅かに正のメニスカスとなりウェルを完全に満たすように分注液の高さを設定する。
（ｉｉｉ）１回の吸引／洗浄／浸漬サイクルを完遂するのにかかる時間はおよそ３０秒である。
（ｉｖ）ウェルに液体を残さない（可能であれば最終サイクルで二重吸引段階を使用することにより。）。
（ｖ）洗浄完了後、プレートを裏返し、残った洗浄液を吸収紙上に軽く叩き出す。
（ｖｉ）アッセイ手順中、ウェルを乾燥させない。
【実施例６】
【０１９６】
完全自動化マイクロプレート処理装置のための方法
実施例３に記載の免疫アッセイキット及び実施例５に記載の一般的方法を用いて、完全自動化マイクロプレート処理装置のための温置時間を次のように調整すべきである：
第一及び第二の温置に対して、６０から７０分の間（６５±５分）の温置時間をプログラムし得る。第三の温置に対して、３０及び３５分の間（３２．５±２．５分）の温置時間をプログラムし得る。
【０１９７】
段階４開始前に、試料希釈剤を含有するウェルを最長６０分まで、１８から３０℃に置き得る。
【実施例７】
【０１９８】
結果の解析
実施例３に記載のキット及び実施例５又は６の方法を用いた免疫アッセイの結果を次のように解析することができる。アッセイ結果を計算し、解釈する際、各プレートは別個に考えなければならない。結果の計算及び解釈のために、認可されたソフトウェアを使用し得る。
【０１９９】
陰性対照
陰性対照の平均吸収を計算する。
【０２００】
陰性対照ウェルの１つの吸収が０．２５よりも大きい場合、その値は廃棄し、残りの陰性対照の値を基にカットオフを計算する。
【０２０１】
両方の陰性対照の値が０．２５よりも大きい場合、その測定は無効である。
【０２０２】
カットオフ値
陰性対照の平均吸収に０．２を加えることにより、カットオフ値を計算する。例えば：
陰性対照吸収：ウェル１＝０．１８２
ウェル２＝０．１７２
平均陰性対照＝（０．１８２＋０．１７２）／２＝０．１７７
カットオフ値＝０．１７７＋０．２＝０．３７７
品質管理
対照に対する次の基準に合致する場合、アッセイの結果は有効である：
陰性対照：平均吸収が０．２５未満である。
陽性対照：吸収が陰性対照の平均吸収よりも０．８を上回り高い。
これらの基準に合致しないアッセイは繰り返すべきである。
【０２０３】
結果の解釈
カットオフ値より低い吸収となった試料は、そのアッセイで無反応であるとみなす。
【０２０４】
吸収がカットオフ値以上となった試料は、そのアッセイにおいて初めに反応性があったとみなす。手順について別段の断りがない限り、このような試料は、元の試料を用いて二重に再試験すべきである。二重の再試験の少なくとも１つにおいて反応性がある試料は、ＨＣＶに対して反応性がある。このような試料は、さらに調べ、このアッセイからの結果は、何らかのその他の臨床的及び／又は補足的な試験情報とともに考慮する。再試験において両ウェルで無反応である試料は、このアッセイにおいて無反応とみなすべきである。
【実施例８】
【０２０５】
診断感度の決定
実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）、Ｃ型肝炎感染に罹患している患者からの全部で５０９検体を試験した。
【０２０６】
試験した試料は全て、反応性があることが分かった。この検体集団における本方法の診断感度は１００％（５０９／５０９）（二項分布により９９．２８％の下側９５％信頼限界であると推定。）であることが分かった。
【０２０７】
全部で２６５検体を含む、３０種類の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ及びＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）での性能を評価することにより、抗体単独アッセイと比較したＨＣＶ感染の初期段階での検出効率についても、本方法の性能を試験した。結果を表９で示す。これらの試験において、本方法は、１９６検体を陽性として検出し、一方、抗ＨＣＶ抗体に対する確立されたアッセイによって９４検体が陽性として検出された。最初の検出までの時間については、これは、本方法において、抗体単独アッセイよりも平均２０．５７日早く検出することと同等である（０日から７２日早い）。
【０２０８】
この研究において、３０種類のセロコンバージョンパネルのうち１０種類が、核酸検出及び血清学的アッセイの両方により陰性となった初期検体を含んでいた。これらの１０種類のパネルにおいて性能を比較した場合、本方法は、ＨＣＶ抗体アッセイよりも平均３３．２日早く、核酸試験（ＮＡＴ）よりも平均でわずか１．０日遅いだけで感染を検出した。
【０２０９】
【表９】
【実施例９】
【０２１０】
診断特異性の判定＃１
血液ドナー集団における特異性＞９９．５％のＣｏｍｍｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００２／３６４／ＥＣ）の必要条件に合致させるために、実施例３に記載の免疫アッセイ及び実施例５及び６で全般的に述べる方法を設計したが、この方法は、主要な血液ドナーセンターでの実地試験においてこの必要条件を超えていた。実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて（実施例６で全般的に述べる完全自動化法を用いて）、所定のドナー検体からの全部で８２９２検体を２ヶ所の血液ドナーセンターでスクリーニングした。
【０２１１】
この試験において、検体の９９．８２％（８２７７／８２９２）が無反応であった（二項分布により、９９．７０％の下方９５％信頼限界）。陰性であると予想される全部で１５／８２９２の検体が、この方法を用いて繰り返し反応性があった（０．１８％）。この試験の２つのその他の検体が本発明による方法を用いて陽性であると同定され、ＰＣＲで陽性であったが、ＨＣＶ抗体は陰性であった。
【０２１２】
ＨＣＶ感染とは無関係な状態の患者からの全部で３７６検体の、交差反応性の可能性がある検体も試験した。これらには、妊娠女性、自己免疫疾患及びその他の急性ウイルス感染罹患患者からの検体が含まれていた。これらの検体の１つが、本発明による方法を用いて反応性があることが分かり、これにより、この特定の集団において、９９．７３％の診断特異性（９８．５３％の下方９５％信頼限界）となった。本組み合わせアッセイ及びＰＣＲを用いて陽性と同定されたがＨＣＶ抗体アッセイで陰性となった１検体は真陽性として排除された。
【実施例１０】
【０２１３】
再現性の判定
４回の別個の機会において５種類のパネルメンバーを１０回反復して試験することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例６で全般的に述べる完全自動化法を用いて）の再現性を評価した。この試験からの結果を表１０及び１１でまとめる。
【０２１４】
【表１０】
【０２１５】
【表１１】
【実施例１１】
【０２１６】
ＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０７に対する感度の評価
市販のセロコンバージョンパネル（ＢＢＩ ＰＨＶ９０７、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ）を用いて、ＰＣＲによりＨＣＶを検出する方法（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））又は抗ＨＣＶ抗体を検出することによりＨＣＶを検出する方法（Ｍｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ３．０抗体及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０抗体）と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。ＰＣＲ及び抗ＨＣＶ抗体データを供給業者のパネルデータシートから得た。比較の結果を表１２で示す（抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイに対して１．０より大きい値は陽性であるとみなす。）。
【０２１７】
【表１２】
【０２１８】
この結果から、本組み合わせアッセイは、抗ＨＣＶ抗体のみを検出するＭｕｒｅｘ Ｖ３及びＭｕｒｅｘ Ｖ４アッセイよりも１３日早くＨＣＶ感染を検出することができることが示された。この結果から、また、市販のセロコンバージョンパネルの全てがＰＣＲ陰性の初回血液を有する訳ではないことも示される。
【実施例１２】
【０２１９】
Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓセロコンバージョンパネル６２２２に対する感度の評価
ＰＣＲにより又は抗ＨＣＶ抗体を検出することにより（Ｍｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ ｖ３．０（ＶＫ４７／４８）及びＭｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ ｖ４．０（０７Ｆ５１））ＨＣＶを検出する方法と比較して、別の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、セロコンバージョンパネル６２２２）に対する実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。この比較の結果を表１３で示す（抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイに対して１．０よりも大きい及びＰＣＲアッセイに対して０よりも大きいこの表の値を陽性であるとみなす。）。
【０２２０】
【表１３】
【０２２１】
この結果から、本組み合わせアッセイが、抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用されるアッセイよりも２３日早くＨＣＶ感染を検出することができることが示された。
【実施例１３】
【０２２２】
Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓセロコンバージョンパネル６２１１に対する検出時間の評価
ＰＣＲによりＨＣＶを、抗ＨＣＶ抗体（オルト３）又はＨＣＶ抗原（オルトＨＣＶ抗原）を検出する方法を用いた検出時間と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）を用いた検出時間を評価した。別の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、セロコンバージョンパネル６２１１）に対して、検出時間を測定した。この比較の結果を表１４で示す（抗体（Ａｂ）、抗原及び組み合わせアッセイに対して１．０よりも大きい値及びＰＣＲアッセイに対して０よりも大きい値を陽性であるとみなす。）。
【０２２３】
【表１４】
【０２２４】
この結果から、本組み合わせアッセイが、試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用されるアッセイよりも４６日早くＨＣＶ感染を検出できることが示された。この結果から、また、検出時間の改善が本方法を試験するために使用されたパネルにより変動することも示される。
【実施例１４】
【０２２５】
ＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９１７に対する感度の評価
ＰＣＲによりＨＣＶ（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））又は抗ＨＣＶ抗体（オルト）を検出する方法の感度と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。市販のＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９１７に対して、感度を測定した。この比較の結果を表１５で示す。Ｏ．Ｄ．は光学密度を指し、Ｓ／ＣＯは、試料／カットオフ値を指す。表１４において、抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイ（Ｓ／ＣＯ）に対して１．０よりも大きい値は陽性であるとみなす。
【０２２６】
【表１５】
【０２２７】
ＰＨＶ９１７は、初期抗原ピークを示すセロコンバージョンパネルの一例であり、この結果から、本組み合わせアッセイが、抗体単独アッセイよりも７２日早く陽性の結果を与えたことが示される。ＮＡＴ（Ｒｏｃｈｅ ＰＣＲアッセイ）は、本組み合わせアッセイと同じ血液を陽性であるとして検出したが、後の血液では検出レベルを下回った（これは、おそらく、患者が血流から循環ウイルスを排除するためである。）。このようにして、これらの結果から、また、ＨＣＶ ＲＮＡ及び抗原ピークが一過性であり得ることも示された。
【実施例１５】
【０２２８】
全体的な感度
実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の診断感度の代表例として、３４種類の市販のセロコンバージョンパネルに対してこのキットを評価し、これらの結果をＭｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ バージョン４．０（０７Ｆ５１）、オルト抗ＨＣＶ３（ＳＡＶｅ）抗体アッセイ及び核酸試験（ＮＡＴ）データ（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））に対する公開データと比較した。
【０２２９】
３４種類のセロコンバージョンパネルからの陽性の血液数を評価した。ＮＡＴの場合に陽性である血液の数は２３１であった。本組み合わせアッセイの場合、陽性である血液の数は２１３であり、抗体単独アッセイの場合、陽性である血液の数は１０３であった。従って、試験した３４種類のセロコンバージョンパネルのうち、本組み合わせアッセイは、ＮＡＴ陽性試料の８４．８６％を検出した（２１３／２５１）。さらに、３４種類のパネルのうち２４種類において（７３．５％一致）、本組み合わせアッセイは、核酸試験（ＮＡＴ）を用いる方法と同じ血液又は時間点で感染を検出した。一方、抗ＨＣＶ抗体単独検出を使用する方法は、ＮＡＴを用いた方法と同じく陽性血液を検出することができたのは、３４パネルのうち３パネルであった（８．８％一致）。
【０２３０】
さらに、いくつかの市販のアッセイ（「オルト３」、「Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｌｕｓ」、「ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）」及び「ＡＸＳＹＭ（Ｒ）３．０」）及び本組み合わせアッセイを用いた最初の検出までの平均時間を、クラス抗体アッセイにおける理論上最善のものと比較した。第０日は、単一のセロコンバージョンパネルに対して測定した場合の何らかの市販抗体単独アッセイからの利用可能な最善データから生成される。試験した３２／３４セロコンバージョンパネルにおいて、本組み合わせアッセイは、最も感度が高い酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）である。本組み合わせアッセイによって、クラス抗体アッセイ中で理論的に最善のものよりも平均で１２．７日早くなり、オルト抗ＨＣＶ ３（ＳＡＶｅ）よりも平均で１４．３５日早くなる。本明細書中に記載のものを含むさらなる実験からの結果とともに、これらの結果から、本組み合わせアッセイが、少なくとも２週間、抗体単独アッセイに対して感染潜伏期間を狭めることが分かる。
【実施例１６】
【０２３１】
診断特異性の判定＃２
全部で３２１７検体のＵＫドナー検体に対して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、の診断特異性を試験した。この結果を表１６で示す。
【０２３２】
【表１６】
【０２３３】
様々な臨床状態の２０２検体における診断特異性が９９．５％であることが分かった。本組み合わせアッセイ及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０Ａｂの両方で全試料が一致して陽性であった。
【実施例１７】
【０２３４】
ＨＣＶ感染の早期検出
本組み合わせアッセイ及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０Ａｂアッセイを用いたスクリーニング３０／３２セロコンバージョンパネルからの結果（表１６参照）を比較することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、に対する最初の検出時間の平均改善度を評価した。単離された初期血液が抗原陽性である一方、これらのパネルは最初の検出後本組み合わせアッセイにおいて変わらずに陽性のままではなく、それ故に、改善した日数を真に反映したものではないので、２／３２パネル（６２２８及びＳＣ−Ｔ０４０２）を排除した。
【０２３５】
ＨＣＶ抗体アッセイと比較した、本組み合わせアッセイに対する最初の検出時間の観察平均改善日数は、２０．５７日であった（表１７参照）。
【０２３６】
【表１７】
【実施例１８】
【０２３７】
別の市販ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイ感度に対する比較
実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、の性能を市販のＢｉｏＲａｄ ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ Ａｇ−Ａｂ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔの性能と比較した。製造者の説明書に従いＢｉｏＲａｄキットを使用した。
【０２３８】
比較のために、次の２８のセロコンバージョンパネルを使用した：ＰＨＶ９０７、ＰＨＶ９０１、ＰＨＶ９１５、ＰＨＶ９０８、ＰＨＶ９０５、ＰＨＶ９１１、ＰＨＶ９０９、ＰＨＶ９１２、ＰＨＶ９１０、ＰＨＶ９１４、ＰＨＶ９１３、ＮＡＢＩ Ａ、ＰＨＶ９１６、ＳＣ−４０２、ＳＣ−４００、ＳＣ−４０６、ＢＣＰ６２１２、ＢＣＰ６２２４、ＢＣＰ６２１１、ＢＣＰ６２２６、ＢＣＰ６２１３、ＢＣＰ６２１４、ＢＣＰ６２１５、ＢＣＰ６２２２、ＢＣＰ６２２４、ＢＣＰ６２２５、ＢＣＰ６２２７及びＢＣＰ６２２８。試験した２５／２８パネルにおいて、本組み合わせアッセイは、ＨＣＶ抗体単独アッセイよりも早く感染を検出し、１７／２８パネルにおいて、本組み合わせアッセイは、競合物Ａｇ／Ａｂアッセイよりも早く感染を検出した。競合物Ａｇ／Ａｂは、２／２８のアッセイでは先んじており、８パネルでは同等であった。この試験において、本組み合わせアッセイにより、ＨＣＶ抗体アッセイと比較して、検出までの平均時間が１４．４日短縮され、競合物ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイよりも４．６日早くなった。
【０２３９】
２８パネルのうち９パネルにおいては、これらのパネルでの初期試料がＰＣＲ陰性なので、潜伏期間全体に相当する。これらのパネルにおける性能を表１８でまとめる。
【０２４０】
【表１８】
【実施例１９】
【０２４１】
別の市販ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイとの比較−検出の限界
Ｌａｐｅｒｃｈｅら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４５：１９６５−１９７２（２００５））に記載の方法に従い、コピー／ｍＬ核酸の点での検出限界の理論的限界について、市販のセロコンバージョンパネルからのＰＣＲ陽性／抗体陰性試料の集団におけるウイルス量に対してＳ／ＣＯ比を比較することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）を評価した。元の論文からの４３／４４試料がこの試験に対して利用可能であった（表１９参照）。この方法によって、市販のＢｉｏＲａｄ ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ Ａｇ−Ａｂ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔもまた、評価した。製造者の説明書に従い、ＢｉｏＲａｄのキットを使用した。
【０２４２】
この結果を表１９及び図６Ａ及びＢで示し、表２０でまとめる。
【０２４３】
Ｌｎ Ｓ／ＣＯに対してｌｏｇ１０ウイルス量をプロットし、Ｌｎ Ｓ／ＣＯ＝０で切片をとる（即ちＳ／ＣＯ＝１である点）ことによって、ウイルス量の終点を予想した。この結果から、本発明による組み合わせアッセイは、競合物Ａｇ／ＡｂアッセイよりもＨＣＶを早く高感度に検出することが分かる。
【０２４４】
【表１９】
【０２４５】
【表２０】
【０２４６】
ある一定の具体的な実施形態に関して本発明を説明してきたが、本明細書に添付の特許請求の範囲で概説されるような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その様々な変更が当業者にとって明らかであろう。
【０２４７】
この明細書において参照される、公開特許出願を含む、全ての特許、刊行物及びデータベースエントリーの開示は、かかる個々の特許、刊行物及びデータベースエントリーのそれぞれが、具体的かつ個々に、参照により組み込まれることが示されるように、その全体において具体的に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
とりわけ、本発明は、ウイルス検出の分野、及び、特に、Ｃ型肝炎ウイルス感染の検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は現在、輸血が関与する非Ａ、非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の主要な原因として認識されている。ＨＣＶは、フラビウイルス及びペスチウイルスと同様の１本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり（Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．及びＰｕｒｃｅｌｌ Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２０５７（１９９１）；Ｗｅｉｎｅｒ Ａ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４２（１９９０））、世界中に広がっている。ＨＣＶの急性期は一般に軽症であり、黄疸を呈するのは患者のわずか２５％であるが、感染者の多く（＞５０％）は、重篤で生命を脅かす可能性のある、肝硬変及び肝細胞癌などの続発症がある慢性肝炎発症に到る（Ｊｏｖｅ Ｊ．ら、Ｌｉｖｅｒ、８：４２（１９９０）；Ｈｏｐｆ Ｕ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１０：６９（１９９０））。
【０００３】
ＨＣＶ感染は、現在、ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの直接検出により、又は抗ＨＣＶ抗体（一般にＨＣＶ構造コアタンパク質又は非構造ＮＳ３タンパク質に対するもの）の検出により、診断される。一般に、これには、個体がＨＣＶに感染した後、ウイルスに対する抗体を個体が発現できるまで最長で約７０日を要し得、従って、この７０日の間、抗体試験単独では、ＨＣＶ感染が起こっているか否かを判定することはできない。一方、ウイルスＲＮＡは、感染後約１０日で検出され得、即ち、核酸試験（ＮＡＴ）に対する「潜伏期間」は、抗体試験よりもはるかに短い。しかし、ＮＡＴは、どちらかと言うと抗体試験よりも費用効果が悪く、混入などの操作エラーが起こりやすい。さらに、ＲＮＡレベルは、ウイルスの最初のピークが消散したとき、特に、プールした試料を試験する場合、この核酸試験に対する検出限界未満に低下し得る。
【０００４】
米国特許第６，５９６，４７６号；同第６，５９２，８７１号；同第６，１８３，９４９号；同第６，２３５，２８４号；同第６，７８０，９６７号；同第５，９８１，２８６号；同第５，９１０，４０４号；同第６，６１３，５３０号；同第６，７０９，８２８号；同第６，６６７，３８７号；同第６，００７，９８２号；同第６，１６５，７３０号；同第６，６４９，７３５号及び同第６，５７６，４１７号は、コアタンパク質に基づく抗原及びＨＣＶを検出するためのその使用を記載する。
【０００５】
最近になって、抗体が検出可能になるよりも著しく早く、試料中のＨＣＶコアタンパク質抗原を検出することができることを示すＨＣＶ抗原アッセイが開発された。研究から、最初のウイルス血症血液採取から最初のＨＣＶ抗原陽性血液採取までの平均時間が、２．０日間と推定されること、及び、最初のＨＣＶ抗体陽性血液採取までの平均時間が５０．８日間と推定されることが分かった（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ Ａ．Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４０、１１９８−１２０２（２０００））。
【０００６】
従って、ＨＣＶ抗原及び抗ＨＣＶ抗体を検出する組み合わせアッセイは、上述の７０日間の潜伏期間内にＨＣＶ感染を検出する手段を提供し、これはまた、セロコンバージョン後のＨＣＶへの曝露も同定する。ＨＣＶのさらに早期の診断は、感染個体から他の個体へのウイルスの伝染を予防すること及び血液供給の混入リスクを最小限にすることに役立ち得る。しかし、適切な組み合わせアッセイを開発するためには、単一のアッセイにおいて抗原性タンパク質及び同じ抗原性タンパク質に対する抗体をアッセイすることに対する干渉又は交差反応の問題を処理しなければならない。干渉又は交差反応の結果、例えば、固相に結合したＨＣＶ抗原性タンパク質が試料中の抗ＨＣＶ抗体を捕捉するために使用される場合。ＨＣＶ抗原性タンパク質が、標識抗体又は試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質を検出するために使用される抗体により認識されるものと同じエピトープを有するので、標識抗体又は抗体はまた、固相上のＨＣＶ抗原性タンパク質とも結合し得、従って、試験試料の非存在下でも偽陽性反応が起こる。
【０００７】
干渉の問題を解決するために様々なストラテジーを使用する、ＨＣＶ感染を検出するための様々な組み合わせアッセイが記載されてきた。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９９５８（ＷＯ０３／００２７４９）及び米国特許第６，７２７，０９２号及び同第６，８５５，８０９号は、それぞれ、試料からのコアタンパク質及び試料からのコアタンパク質に対する抗体を捕捉するためのコアペプチド又は組み換えコアタンパク質を検出するためにモノクローナル抗体を使用する、ＨＣＶを検出するための組み合わせアッセイを記載する。モノクローナル抗体により認識されるエピトープが排除されるか又は修飾されるように、組み換えコアタンパク質が改変されている。ある例において、記載されている組み合わせアッセイは、試料からのコアタンパク質に対する抗体を捕捉するために、コアタンパク質のアミノ酸１１から２８に対応する１７アミノ酸残基長の１つのペプチドを使用する。しかし好ましい形式は、このアッセイで使用されるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを欠失するように改変されているコアタンパク質配列のアミノ酸１から１００又は８から１００に対応する組み換えコアタンパク質を使用する。
【０００８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０３／０１４２９（ＷＯ０３／０９５９６８）及び米国特許出願１０／４３１，５８７（ＵＳ２００４／００７２２６７）は、抗体を捕捉するために使用される標的抗原のある種のエピトープが構造的に修飾されるか破壊されている、ＨＣＶを検出するための、別の組み合わせアッセイを記載する。次に、抗体が対応する非修飾エピトープを正確に認識し、このようにして修飾抗原（これらの同じエピトープをもはや提示しない。）に結合できないように、このアッセイにおいて使用される抗体を具体的に選択する。このアプローチに基づく組み合わせアッセイキット（ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｌｔｒａ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が開発され、これが、抗体のみに基づくアッセイを上回る改善があることが分かったが、それでもＮＡＴより感度が低い（Ａｎｓａｌｄｉ、Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、１３：５−１０（２００６）；Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４５：１９６５−１９７２（２００５）；Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４３：３８７７−３８８３（２００５））。
【０００９】
同様に、ＵＳ２００３／０１０８５６３及びＵＳ２００３／０１５２９６５は、抗原として使用されるＨＣＶコアタンパク質が、ＨＣＶコアタンパク質残基１０−４３以外のアミノ酸残基が変更されている又はこれを欠失している配列を含み、修飾ＨＣＶコアタンパク質を認識しない抗ＨＣＶコア抗体が使用される、別の組み合わせアッセイを記載する。
【００１０】
この基礎的情報は、出願者が本発明に対して関連する可能性があると考える情報を開示する目的のために提供される。上述の情報の何れも本発明に対する先行技術を構成するものではないし、そのように解釈されるべきものではない。
【００１１】
本明細書中で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，５９６，４７６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５９２，８７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１８３，９４９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２３５，２８４号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７８０，９６７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９８１，２８６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９１０，４０４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，６１３，５３０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，７０９，８２８号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６６７，３８７号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，００７，９８２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，１６５，７３０号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，６４９，７３５号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，５７６，４１７号明細書
【特許文献１５】国際公開第０３／００２７４９号
【特許文献１６】米国特許第６，７２７，０９２号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，８５５，８０９号明細書
【特許文献１８】国際公開第０３／０９５９６８号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００４／００７２２６７号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００３／０１０８５６３号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００３／０１５２９６５号明細書
【特許文献２２】欧州特許第４５６６５号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，７０５，３３０号明細書
【特許文献２４】米国特許第５，０８９，４２４号明細書
【特許文献２５】米国特許第５，００６，３０９号明細書
【特許文献２６】米国特許第５，０６３，０８１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００４００１８５７７号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００５００５４０７８号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００６０１６０１６４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．及びＰｕｒｃｅｌｌ Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９１、８７、ｐ．２０５７
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ Ａ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０、１８０、８４２
【非特許文献３】Ｊｏｖｅ Ｊ．ら、Ｌｉｖｅｒ、１９９０、８、４２
【非特許文献４】Ｈｏｐｆ Ｕ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９０、１０、６９
【非特許文献５】Ｃｏｕｒｏｕｃｅ Ａ．Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２０００、４０、ｐ．１１９８−１２０２
【非特許文献６】Ａｎｓａｌｄｉ、Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、２００６、１３、ｐ．５−１０
【非特許文献７】Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２００５、４５、ｐ．１９６５−１９７２
【非特許文献８】Ｌａｐｅｒｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００５、４３、ｐ．３８７７−３８８３
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．及びＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８１、１４７、ｐ．１９５−７
【非特許文献１０】Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、１９８１、ｐ．４８２−４８９
【非特許文献１１】Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｗ．Ｇｉｓｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、ｐ．４０３−１０
【非特許文献１２】Ｓｐａｔｏｌａ、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ、１９８３、第１巻、第３号
【非特許文献１３】スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ）、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｍｉｎｉｏ ａｃｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ファインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年、ｐ．２６７
【非特許文献１４】Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、１９８０、ｐ．４６３−４６８
【非特許文献１５】Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９７９、１４、ｐ．１７７−１８５
【非特許文献１６】Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、１９８６、３８、１２４３−１２４９
【非特許文献１７】Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、１９８２、ｐ．１３０７−３１４
【非特許文献１８】Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）
【非特許文献１９】Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３、ｐ．２５３３（１９８２）
【非特許文献２０】Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４、ｐ．４４０１−４４０４（１９８３）
【非特許文献２１】Ｈｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、１９８２、３１、ｐ．１８９−１９９
【非特許文献２２】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８５、ｐ．２１４９
【非特許文献２３】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３２、ｐ．３４１
【非特許文献２４】Ｓｔｕｙｖｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９４、９１、ｐ．１０１３４−１０１３８
【非特許文献２５】Ｂｕｋｈ、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．、１９９５、１５、ｐ．４１−６３
【非特許文献２６】ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９８年、第２版
【非特許文献２７】ハンメルリング（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、１９８１年、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、ｐ．５６３−６８１
【非特許文献２８】Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１、２０３、ｐ．４６−８８）
【非特許文献２９】Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ １９９３、９０、ｐ．７９９５−７９９９
【非特許文献３０】Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４０、ｐ．１０３８−１０４０
【非特許文献３１】Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、ｐ．４１−５０
【非特許文献３２】Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、ｐ．１７７−１８６
【非特許文献３３】Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、ｐ．９５２−９５８
【非特許文献３４】Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７、ｐ．９−１８
【非特許文献３５】Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、ｐ．１９１−２８０
【非特許文献３６】フランク・クイン（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ）、「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２００１年、第二版、デビッド・ワイルド（Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ）編集、ｐ．３６３−３６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、組み合わせＣ型肝炎ウイルス抗原及び抗体検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のある態様によると、試料中のＣ型肝炎コアタンパク質及びＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の検出のための方法が提供され、この方法は、好ましくは、次の段階を含む：ａ）捕捉ペプチドとＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体との間で捕捉ペプチド：抗体複合体の形成を可能にする条件下で、約４から約３０アミノ酸残基長の間（場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間）の１以上の捕捉ペプチドと、前記試料と、を接触させる段階（ここで、各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープを含むアミノ酸配列を好ましくは有する。）；ｂ）第一の抗体とＣ型肝炎コアタンパク質との間での抗体：抗原複合体の形成を可能にする条件下で、第一の抗体と試料を接触させる段階（ここで、第一の抗体は、各１以上の捕捉ペプチドにより含まれるエピトープとは異なる第一のエピトープでＣ型肝炎コアタンパク質と特異的に結合する。）；ｃ）Ｃ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の指標として、段階（ａ）で形成される何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体を検出する段階；ｄ）Ｃ型肝炎コアタンパク質の指標として、段階（ｂ）で形成される何らかの抗体：抗原複合体を検出する段階。
【００１６】
ある実施形態において、場合によっては各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープと、配列番号１の残基１６から３０、配列番号１の残基３３から４４及び配列番号１の残基４９から６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、を含み、捕捉ペプチド中に存在する何れのその他のアミノ酸残基も、配列番号１の配列と比較して変更されている。
【００１７】
本発明の別の態様によると、試料中のＣ型肝炎コアタンパク質及びＣ型肝炎コアタンパク質に対する抗体の検出のためのキットが提供され、このキットは、好ましくは、次のもの：約４からび約３０アミノ酸長の間（場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間）の１以上のペプチド（好ましくはこの各ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープを含むアミノ酸配列を有する。）と、１以上の抗体（好ましくは、この１以上の抗体の第一のものはＣ型肝炎コアタンパク質の第一のエピトープに特異的に結合でき、第一のエピトープは、１以上の捕捉ペプチドにより含まれるエピトープとは異なる。）と、を含む。ある実施形態において、場合によっては、各捕捉ペプチドは、Ｃ型肝炎コアタンパク質のエピトープと、配列番号１の残基１６から３０、配列番号１の残基３３から４４及び配列番号１の残基４９から６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、を含み、捕捉ペプチドに存在する何れのその他のアミノ酸残基も配列番号１の配列と比較して変更されている。
【００１８】
本発明の別の態様によると、微生物の抗原性タンパク質及びこの抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出することができる試薬を選択するためのプロセスが提供され、この試薬は、好ましくは１以上の免疫優勢ペプチド及び１以上の特異的抗体からなり、この方法は、好ましくは、次の段階：ｉ）ペプチドのライブラリを提供する段階（各前記ペプチドは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有し、候補ペプチドのアミノ酸配列は重複する。）；ｉｉ）微生物感染対象からの血清試料とペプチドのライブラリを接触させる段階；ｉｉｉ）陰性対照血清試料と前記プチドのライブラリを接触させる段階；ｉｖ）候補ペプチドを提供するために、段階（ｉｉ）の血清試料の複数において抗体に結合し、段階（ｉｉｉ）の陰性対照試料において抗体に結合しない候補ペプチドを選択する段階；ｖ）候補ペプチドの１以上の配列を含む免疫優勢ペプチドを調製する段階；ｖｉ）１以上の候補抗体と免疫優勢ペプチドを接触させる段階、ｖｉｉ）特異的抗体を提供するために、前記免疫優勢ペプチドに結合しない１以上の抗体を選択する段階、を含む。
【００１９】
本発明の別の態様によると、試料中の微生物の抗原性タンパク質及び抗原性タンパク質に対する抗体の検出のためのキットが提供され、このキットは、好ましくは：抗原性タンパク質に特異的に結合できる１以上の特異的抗体と、抗原性タンパク質のアミノ酸配列由来の１以上の免疫優勢ペプチドと、を、特異的抗体と、本発明の試薬を選択するためのプロセスに従い選択される免疫優勢ペプチドと、を含む。
【００２０】
添付の図面を参照する次の詳細な記述において本発明のこれら及びその他の特性が明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のある実施形態に従い免疫優勢ペプチドを作製するために使用されるＨＣＶコアタンパク質［配列番号１］のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＰ＿７５１９１９）［配列番号２］から利用可能なＨＣＶコアタンパク質ｐ２１ｃのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ＨＣＶコアタンパク質［配列番号７から５３］配列由来の重複ペプチドのライブラリに対する配列を示し、免疫原性ペプチド配列番号３、４、５及び５４（青い影付き）ならびに適切な抗体に対するエピトープ（囲み付き配列：ＧＩＶＧ［配列番号６］及びＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］）の位置を示す。任意数は図面を明らかにするために適用し；配列番号３１−５３において識別される配列の付番は、規定どおり残基５６を超えて伸長する。
【図４】図４は、本発明のある実施形態に従うプロセス制御監視の手順の図式的概観を示す。
【図５】図５は、本発明のある実施形態に従う組み合わせアッセイの図式を示す。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、本発明のある実施形態による組み合わせアッセイの感度の間の比較の結果（図６Ｂ）及び別の市販の抗体／抗原アッセイの感度（図６Ａ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、とりわけ、単一アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質及びＨＣＶコアタンパク質に対する抗体（抗コア抗体）を検出することによる、Ｃ型肝炎の検出を可能にするインビトロの方法を提供する。本方法は、好ましくは、抗コア抗体を検出するために選択された免疫優勢ペプチドと組み合わせて、コアタンパク質の検出のための、コアタンパク質に特異的に結合することが可能な抗体を使用する。この方法は、交差反応の問題を最小限にするためにある種のエピトープが欠失しているか又は構造的に修飾されている、コアタンパク質の特殊化された断片の構築に依存する既に記載の方法とは異なる。本発明の方法において、短いペプチド（これらはそれぞれ、ネイティブＨＣＶコアタンパク質の免疫優勢領域に対応するアミノ酸配列を有するが、本方法において使用される抗体により結合されるエピトープを完全には包含しない。）を使用することによって、交差反応性を好ましくは制限するか又は排除する。それらが比較的短いことにより、本発明の方法で使用されるペプチドは、好ましくは、長いペプチドよりも簡単に、及び高い信頼性で（即ちエラー率が低い。）合成することができる。
【００２３】
さらに、本発明のある実施形態において、別個のペプチドの複数個（それぞれが、異なるエピトープを含む。）を使用すると、本方法に含まれる各ペプチドの相対量の調整が行われることによって、エピトープ比率を調整できるようになる。エピトープ比率の調整により、特異性に影響を及ぼさずに、本方法の感度を最適化することができる。本方法の別の実施形態において、上述の方法におけるコアタンパク質の一部に対応する短いペプチド配列を使用すると、好ましくは、コアタンパク質全体又はコアタンパク質のより長い断片を使用する方法と比較して、特異性が向上する。
【００２４】
本方法はまた、さらなる抗体及び／又は抗原性タンパク質又は、１以上のＨＣＶタンパク質又はコアタンパク質以外のＨＣＶタンパク質に対する抗体及びコアタンパク質に対する抗体の検出のための方法において使用されるべきペプチドも提供する。ある実施形態において、本発明の方法は、好ましくは、免疫優勢コアタンパク質ペプチド及びコアタンパク質に対する抗体に加えて、対応する抗体の検出のために、ＨＣＶ非構造タンパク質又はその断片を使用する。
【００２５】
本発明は、上述の方法を行うための試薬（即ち、免疫優勢コアタンパク質ペプチド及びコアタンパク質に対する抗体）を含むＨＣＶの検出のためのキットをさらに提供し、場合によっては、１以上の非コアＨＣＶタンパク質の検出のためのさらなる抗体及び／又は抗原性タンパク質又はペプチドを提供する。
【００２６】
例えば、対象においてＨＣＶの存在を検出するために、及び／又は輸血目的のためのドナー血液又は血液製剤の適合性を調べるために、本発明の方法及びキットを使用することができる。
【００２７】
上述の方法及びキットでの使用に適切な試薬は、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質のキーエピトープを含有する免疫優勢ペプチドを同定し、本方法及び／又はキットでの使用のためにこれらの免疫優勢ペプチドの１以上を選択し、免疫優勢ペプチドに存在するエピトープ以外のエピトープに結合する１以上の抗コア抗体を選択することにより、本明細書中に記載のように選択される。コアタンパク質及びこれに対する抗体以外のＨＣＶ抗原性タンパク質の検出の組み合わせ法、より一般的には、その他の微生物からの抗原性タンパク質及びこれらのタンパク質に対する抗体を検出する組み合わせ法に適切な試薬の選択に、この選択プロセスが幅広く適用できることを理解されたい。このようにして、本方法は、一般的抗原性タンパク質及びこの抗原性タンパク質に対する抗体の同時検出のための試薬をスクリーニングするための一般的プロセスを提供するが、このプロセスは、免疫優勢ペプチド（それぞれが、その微生物に感染している対象の多くに存在する抗体により認識されるキーエピトープを含有する。）を最初に同定する段階；同定された免疫優勢ペプチドの１以上を選択する段階；選択ペプチド中に含有されるもの以外のエピトープを認識する抗体を同定する段階を含む。
【００２８】
定義
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野で当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列に関連して、「に対応する」は、参照アミノ酸配列とアミノ酸配列が実質的に同一であることを指す。「実質的に同一」とは、例えば下記の方法を使用して最適に並べた場合に、アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を共有することを意味する。２つのアミノ酸配列間の％同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．及びＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７（１９８１））；「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、４８２−４８９（１９８１））；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｗ．Ｇｉｓｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））及びその変法及びアップデート；ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の技術内の様々な方法において調べられる。さらに、当業者は、比較される配列の長さにわたる最大アラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含め、アラインメントを調べるために、適切なパラメータを決定することができる。一般に、ペプチドに対して、比較配列の長さは、少なくとも１０個のアミノ酸であり、しかし、実際の長さが比較されている配列の長さ全体に依存し、少なくとも１２、１５、１７、１８、１９又は２０アミノ酸であり得る又はそれがペプチド配列の全長であり得ることを、当業者は理解する。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「潜伏期間」という用語は、Ｃ型肝炎ウイルスによる個体の感染から、アッセイによって感染が検出できるようになるまでの時間を指す。
【００３１】
「特異的に結合する」という用語は、個々の抗体が抗原に特異的に反応する能力を指す。結合特異性は、抗体が特異的抗原に差別的に結合するが、非関連抗原には結合せず、従って、２つの異なる抗原を区別する能力を基準に決定することができる、又は、あるいは、抗原における特異的エピトープに示差的に結合するが同じ抗原においてその他のエピトープに結合せず、従って、２つの異なるエピトープを区別するという能力を基準に判定される。
【００３２】
「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」という用語は、Ｃ型肝炎に関与するウイルスの、全ての株及び全てのタイプ、サブタイプ及び遺伝子型を含む。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、指示される値からおよそ±１０％変動することを指す。このような変動は、通常、本明細書中で提供される何らかのある種の値（具体的に言及されるにしろされないにしろ）に含まれると理解されたい。
【００３４】
天然のアミノ酸は、本明細書を通して、ペプチドの技術分野で一般に受容され、生化学命名法においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッションにより推奨される、下記で示す従来の３文字又は１文字略記により区別される。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本明細書中で示されるペプチド配列は、Ｎ末端アミノ酸が左にありＣ末端アミノ酸が右にある、一般に受容されている慣習に従い記述する。
【００３７】
１．ＨＣＶの検出のための組み合わせ法
本発明のある態様は、試料中のＨＣＶコアタンパク質及びコアタンパク質に対する抗体の両方を検出することによる、ＨＣＶの検出のための組み合わせ法を提供する。本方法は、好ましくは、試薬として、交差反応性を最小化又は排除するために選択された、捕捉抗体及び捕捉ペプチドを使用する。これらの試薬を選択する方法は、下記で述べるが、コアタンパク質の免疫優勢ペプチドの同定及び選択、及び選択された免疫優勢ペプチド上に存在するもの以外のエピトープを認識するモノクローナル抗体の同定及び選択に基づく。本発明は、このような試薬を選択する方法をさらに含む。
【００３８】
本発明の組み合わせ法によると、１以上の捕捉ペプチド（それぞれコアタンパク質の異なるエピトープを含む。）及び捕捉ペプチドに存在するもの以外のエピトープにおいてＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体と試験しようとする試料とを接触させる。次に、形成される何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体及び抗体：コアタンパク質複合体を検出する。
【００３９】
当技術分野で公知のように適切に標識した試薬を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体及び抗体：コアタンパク質複合体を検出することができる。例えば、標識コアペプチド（「検出ペプチド」）を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することができるが、このペプチドは、捕捉ペプチドの配列と同じ配列又は実質的に同一である配列を含み得る。あるいは、例えば標識された二次抗体（抗ヒト抗体など）を用いて、捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することができる。「直接」形式での捕捉ペプチド：抗体複合体の検出（即ち適切な検出ペプチドを用いて）により、二次抗体を用いる「間接的」形式よりも特異性が向上し得る。従って、ある実施形態において、本発明の方法は、捕捉ペプチド：抗体複合体の検出のために直接形式を使用する。例えば、捕捉抗体と同じである又は異なり得る標識された二次抗コア抗体を用いて、抗体：コアタンパク質複合体を検出することができる。しかし、二次抗コア抗体は、捕捉ペプチド及び使用する場合は検出ペプチドにより含有されるもの以外のエピトープを認識すべきである。
【００４０】
このようにして、ある実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、捕捉ペプチド：抗体複合体を形成させるために、試料中の抗コア抗体に捕捉ペプチドが結合することができる条件下で、１以上の捕捉ペプチドと試験試料を接触させることを含む。この試料は、好ましくは、抗体：コアタンパク質複合体を形成させるために、試料中のコアタンパク質に捕捉抗体が結合することができる条件下で、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体に同時に接触させられる。捕捉抗体により認識されるコアタンパク質のエピトープを捕捉ペプチドは含有しないので、コアタンパク質の捕捉とコアタンパク質に対する抗体の捕捉との間の交差反応性は最小限である又は排除される。本方法は、好ましくは、形成される何らかの抗体：コアタンパク質複合体及び捕捉ペプチド：抗体複合体を検出することをさらに含む。別の実施形態において、捕捉ペプチド及び捕捉抗体は、固体表面上に固定化される。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本方法は、好ましくは、複数の捕捉ペプチド、例えば、２以上の捕捉ペプチド又は３以上の捕捉ペプチドを使用する。
【００４２】
本方法は、さらに、場合によっては、ＨＣＶの第二の抗原性タンパク質又はＨＣＶの第二の抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出する段階を含む。このようにして、ある実施形態において、ＨＣＶの第二の抗原性タンパク質に対する抗体又は第二の抗原性タンパク質に特異的に結合できる捕捉抗体に特異的に結合できる捕捉抗原を方法中に含み得る。別の実施形態において、本方法は、第二の抗原性タンパク質：抗体複合体の抗体又は抗原性タンパク質成分に結合できる標識された検出抗原又は検出抗体を使用して、何らかの第二の抗原性タンパク質：抗体複合体を検出する段階をさらに含む。
【００４３】
本発明の方法は、場合によっては、例えば下記のものなど、当技術分野で公知の様々な形式であり得る。ある実施形態において、本方法は、免疫アッセイとして行われる。例えば、捕捉ペプチド、捕捉抗体（及び、使用する場合は捕捉抗原）を、直接又は適切な担体上での提示を介しての何れかで、固相上に固定化することができ、一方、検出ペプチド、検出抗体（及び、使用する場合は検出抗原）が液相で与えられる。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、本方法は、好ましくは、本方法が適正に行われていることを確実にするためのプロセス制御監視を含む。プロセス制御監視は、好ましくは、プロセスの完全性を確保するための試料添加制御及び色分け試薬の使用を含む。プロセス制御監視のその他の変法は、当業者にとって明白である。
【００４５】
１．１．コアタンパク質免疫優勢ペプチド
本発明の組み合わせ法で使用される捕捉ペプチドは、ＨＣＶコアタンパク質に対する抗体に特異的に結合するように設計される。このペプチドは、免疫優勢コアタンパク質ペプチド、即ちＨＣＶコアタンパク質のネイティブアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ＨＣＶ感染個体の免疫系によって最もよく認識されるエピトープの１つを含有する。従って、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列を有する。
【００４６】
本発明によると、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、約４から約３０アミノ酸残基長の間である。ある実施形態において、本ペプチドは、約６から約３０アミノ酸残基長の間であり、場合によっては約１２から約３０アミノ酸残基長の間である。さらなる実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約６から約２５アミノ酸残基長の間である。さらに別の実施形態において、好ましくは、本ペプチドは、約８から約２５アミノ酸残基長の間である。その他の実施形態において、本ペプチドは、好ましくは、約１０から約２５アミノ酸残基、約１０から約２２アミノ酸残基、約１２から約２２アミノ酸残基、約１２から約２０アミノ酸残基長の間である。
【００４７】
上述のように、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質のネイティブアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含む。ＨＣＶコアタンパク質配列の例を図１で与える［配列番号１］。ＨＣＶコアタンパク質ｐ２１ｃのアミノ酸配列もまたＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＰ＿７５１９１９）から得ることができ、本明細書中で図２のように与えられる［配列番号２］。ＨＣＶの様々な遺伝子型の間でよく保存されており、ＨＣＶ感染対象の大多数からの抗体により認識されるコアタンパク質のそれらの領域を確立することによって、コアタンパク質配列から免疫優勢ペプチド配列を同定することができる。ある実施形態において、好ましくは、ペプチドにより含まれるエピトープが、感染の主要な段階からの抗体に結合するように、免疫優勢ペプチドの組み合わせを選択する。例えば本明細書中に記載のプロセスに従うことにより、適切な免疫優勢ペプチドを容易に選択することができる（例えば、下記セクション６参照）。ある実施形態において、好ましくは、各ペプチドが感染の様々な段階での抗体により認識されるエピトープを含むよう、組み合わせ法における使用のための複数の免疫優勢ペプチドを選択するが、これにより、ＨＣＶに対する免疫反応を広範にカバーできるようになる。
【００４８】
ある実施形態において、各免疫優勢ペプチドは、好ましくは、配列番号１で示される配列の、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、このペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸１−８０（即ちＮ末端領域）で示される配列の、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。その他の実施形態において、各免疫優勢ペプチドは、好ましくは、配列番号１で示される配列の、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０又は少なくとも１２の、連続アミノ酸を含む。
【００４９】
具体的な実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列：ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ［配列番号３］、ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号４］、ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５］又はＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＣ［配列番号５４］の何れか１つの、少なくとも４又は少なくとも５の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、次のものから選択される配列を含む：ＮＲＲＰ［配列番号６０］、ＲＲＰＱ［配列番号６１］、ＲＰＱＤ［配列番号６２］、ＰＱＤＶ［配列番号６３］、ＱＤＶＫ［配列番号６４］、ＤＶＫＦ［配列番号６５］、ＶＫＦＰ［配列番号６６］、ＫＦＰＧ［配列番号６７］、ＦＰＧＧ［配列番号６８］、ＰＧＧＧ［配列番号６９］、ＧＧＧＱ［配列番号７０］、ＧＧＱＩ［配列番号７１］、ＧＶＹＬ［配列番号７２］、ＶＹＬＬ［配列番号７３］、ＹＬＬＰ［配列番号７４］、ＬＬＰＲ［配列番号７５］、ＬＰＲＲ［配列番号７６］、ＰＲＲＧ［配列番号７７］、ＲＲＧＰ［配列番号７８］、ＲＧＰＲ［配列番号７９］、ＧＰＲＬ［配列番号８０］、ＴＲＫＴ［配列番号８１］、ＲＫＴＳ［配列番号８２］、ＫＴＳＥ［配列番号８３］、ＴＳＥＲ［配列番号８４］、ＳＥＲＳ［配列番号８５］、ＥＲＳＱ［配列番号８６］、ＲＳＱＰ［配列番号８７］、ＳＱＰＲ［配列番号８８］、ＱＰＲＧ［配列番号８９］、ＰＲＧＲ［配列番号９０］、ＲＧＲＲ［配列番号９１］、ＧＲＲＱ［配列番号９２］、ＲＲＱＰ［配列番号９３］、ＲＱＰＩ［配列番号９４］、ＱＰＩＰ［配列番号９５］、ＰＩＰＫ［配列番号９６］及びＩＰＫＡ［配列番号９７］。
【００５０】
別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも６個の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも８個の連続アミノ酸を含む。その他の実施形態において、本ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つの、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも１２個の連続アミノ酸又は少なくとも１４個の連続アミノ酸を含む。別の実施形態において、捕捉ペプチドのそれぞれは、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号５４で示される配列の何れか１つを含む。
【００５１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号３、４、５、５４、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０の何れか１つの変異配列を含む（この変異配列は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体に結合する能力を保持する。）、免疫優勢ペプチドを提供する。「変異配列」という用語は、本明細書中で使用する場合、参照ペプチド配列と比較して１以上のアミノ酸残基が、欠失、付加又は置換されているペプチド配列を指す。好ましくは、変異配列が１以上のアミノ酸置換を含有する場合、これらは、「保存的」置換である。保存的置換は、１つのアミノ酸残基の、同様の側鎖特性を有する別の残基による置換を含む。当技術分野で公知のように、２０種類の天然アミノ酸を側鎖の物理化学的特性に従いグループ化することができる。適切なグループ化には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性、非電荷側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）及びリシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が含まれる。アミノ酸の別のグループ化は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、アミノ酸の、同じグループからの別のアミノ酸での置換を含む。本発明によると、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。その他の実施形態において、変異ペプチドは、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９３％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
免疫優勢ペプチドは、天然アミノ酸又は場合によっては１以上の非天然アミノ酸を含み得る。この非天然アミノ酸は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体への免疫優勢ペプチドの結合能をそれらが妨害しないように選択される。非天然アミノ酸の例には、以下に限定されないが、Ｄ−アミノ酸（即ち天然の形態とは逆のキラリティーのアミノ酸）、Ｎ−α−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−メチルアミノ酸、β−アラニン（β−Ａｌａ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン、Ｄ−又はＬ−２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、Ｄ−又はＬ−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｄ−又はＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−又はＬ−１−、２−、３−又は４−フェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルアラニンＤ−又はＬ−ｐ−メトキシビフェニルアラニン、メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）及びホモアルギニン（Ｈａｒ）が含まれる。その他の例には、Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン及びＤ−又はＬ−アルキルアラニン（この場合、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル又はイソ−ペンチルである。）及びホスホノ又は硫酸化（例えば、−ＳＯ３Ｈ）非−カルボン酸アミノ酸が含まれる。
【００５３】
免疫優勢ペプチドは、天然ペプチド結合（即ち−ＣＯＮＨ−）又は修飾ペプチド結合の何れかを含み得る。修飾ペプチド結合は、ＨＣＶ感染の様々な段階の個体由来の試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体への免疫優勢ペプチドの結合能をそれらが妨害しないように選択される。適切な修飾ペプチド結合の例は、当技術分野で周知であり、以下に限定されないが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス又はトランス）、ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＳ−ＮＨ−及び−ＮＨ−ＣＯ−（即ち逆ペプチド結合）が含まれる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ ３、（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｍｉｎｉｏ ａｃｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ ｐｐ．４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（１９７９）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（１９８６）；Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ３０７−３１４（１９８２）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（１９８２）；Ｓｚｅｌｋｅら、ＥＰ ４５６６５（１９８２）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（１９８３）；及びＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）参照）。ある実施形態において、免疫優勢ペプチドは１以上の修飾ペプチド結合を含む。免疫優勢ペプチドが複数の修飾ペプチド結合を含む場合、修飾ペプチド結合は同じであり得又は異なり得る。
【００５４】
例えば化学合成などの当技術分野で公知の方法によって、免疫優勢ペプチドを調製することができる。このような方法には、以下に限定されないが、固相単独（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）合成、部分的固相合成、フラグメント縮合又は古典的溶液合成が含まれる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１（１９８６））。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの「９０５０ Ｐｌｕｓ Ｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅの「Ｐｉｏｎｅｅｒ」合成装置、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）の「４３３Ａ」合成装置又はＲａｉｎｉｎの「Ｓｙｍｐｈｏｎｙ」合成装置など、自動ペプチド合成も使用し得る。本ペプチドは、均一相合成によっても調製することができる。本ペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ選別カラムクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィー）、遠心、示差的溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）などの標準技術を用いて、又は当業者にとって周知のその他の技術によって、精製することができる。
【００５５】
ＨＣＶ感染の様々な段階の個体からの試料中で見出されるコアタンパク質に対する抗体に結合する免疫優勢ペプチドの能力は、市販のセロコンバージョンパネル及び、本明細書中に記載のもの（これに限定されない。）を含む標準的方法を用いて、熟練者により容易に判定され得る。
【００５６】
本組み合わせ法において使用される免疫優勢ペプチドは、好ましくは、適切な固相上に固定化され得ると考えられる。固相への共有又は非共有（例えば、イオン性、疎水性など）結合を用いて本ペプチドを固定化することができ、さらに、場合によっては本ペプチドは、固定化を促進するために修飾され得る。適切な修飾は当技術分野で公知であり、これには、固体支持体への本ペプチドの架橋又は連結を促進するための本ペプチドのＣ末端又はＮ末端の何れかへの官能基又は化学部分の付加が含まれる。代表的な修飾には、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸（ＳＡＭＳＡ）又はＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加又は本ペプチドのＮ又はＣ末端への１以上のシステイン残基の付加が含まれる。その他の架橋剤が当技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのカタログを参照）。例としては、以下に限定されないが、ジアミン（１，６−ジアミノヘキサンなど）；ジアルデヒド（グルタルアルデヒドなど）；ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル及びエチレングリコール−ビス（コハク酸スクシンイミジル）など）；ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートなど）；ビスオキシラン（１，４ブタンジイル ジグリシジル エーテルなど）；ジカルボン酸（スクシニルジサリチレートなど）；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられる。
【００５７】
その他の修飾には、Ｎｉ２＋誘導化面への結合を可能にするためのヒスチジン残基又はジスルフィド架橋形成又はＳｕｌｆｏｌｉｎｋＴＭアガロースへの結合を可能にするためのシステイン残基などのＮ又はＣ末端での１以上のアミノ酸の付加が含まれる。ある実施形態において、本ペプチドの１以上が、好ましくは、システイン残基の付加により修飾される。別の実施形態において、本ペプチドの１以上が、好ましくは、ＳＡＭＳＡなどの官能基の付加により修飾される。さらなる実施形態において、本ペプチドは、好ましくは、Ｎ末端修飾を含む。別の実施形態において、本ペプチドは、好ましくはＣ末端修飾を含む。
【００５８】
本発明はまた、本ペプチドが、好ましくは、固体支持体からのペプチド配列を最適に引き離すためにＮ末端又はＣ末端において１以上の化学スペーサーを含むように修飾され得ることも提供する。使用することができるスペーサーには、以下に限定されないが、６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；及び１から５アミノ酸の短いアミノ酸配列（ポリグリシン配列など）が含まれる。ある実施形態において、好ましくは本ペプチドの１以上は、１以上の６−アミノヘキサン酸スペーサーを含む。
【００５９】
代替的実施形態において、場合によっては、固相上にそれらを固定化するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はサイログロブリンなどの担体タンパク質に本ペプチドを結合させることができる。
【００６０】
本発明はまた、好ましくは、本発明の組み合わせ法において検出ペプチドとして免疫優勢ペプチドを使用することができることも提供し、この場合、検出可能標識を組み込むためにこれらを修飾することができる。本発明のある実施形態において、１以上の検出ペプチドのそれぞれは、好ましくは、捕捉ペプチドの１つのアミノ酸配列に本質的に対応するアミノ酸配列を有する。本発明によると、検出ペプチドが捕捉ペプチドとそのアミノ酸配列において同一又は実質的に同一である場合、及びまた、実質的に同等なものでの検出ペプチドにおけるアミノ酸残基の置換（例えば保存的アミノ酸置換）など、一部の配列変異が許容される場合、及び／又は結果として実質的に同等な機能性を得るために（例えば、抗体結合能）、検出ペプチドは、捕捉ペプチドの１つのアミノ酸配列に「本質的に対応」する。このような関係に従い、ある実施形態において、捕捉及び検出ペプチドは、固相及び結合に対して事実上同じアミノ酸配列であるが、それぞれの特定の役割のための提示を最適化するためにスペーサーが異なるアミノ酸配列との対で使用される。
【００６１】
本発明による検出可能標識は、好ましくは、直接又は間接的に検出することができ、検出ペプチドへの検出可能標識の結合が、好ましくは検出ペプチドに対する試験試料中の抗コア抗体の特異的結合を妨害しない、分子又は部分である。ペプチドを標識する方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、検出可能標識への検出ペプチドの連結のための二官能性クロス−リンカー（ＳＡＭＳＡなど（Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸））の使用が含まれる。当技術分野で公知のものなど、又は上述のものと同様のものなどのその他の架橋剤を使用することができる。
【００６２】
本発明のペプチドとの使用のための検出可能標識には、好ましくは、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子など、直接的に検出され得るものが含まれる。検出可能標識は、それ自身検出可能であるか、又は検出可能産物を生成させるために１以上のさらなる化合物と反応させられ得るかの何れかである。このようにして、本発明の直接的検出可能標識は、標識の検出を可能にするための、基質、トリガー試薬、光など、さらなる成分を必要とし得ることを、当業者は理解するであろう。検出可能標識の例には、以下に限定されないが、色原体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃなど）、蛍光化合物（フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジル及びランタニドキレート誘導体など）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム及びルミノールなど）、目で見える又は蛍光粒子、核酸、錯化剤又は酵素などの触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど）が含まれる。酵素の使用の場合、例えば、クロモ−、フルオロ−又はルモジェニック（ｌｕｍｏｇｅｎｉｃ）基質の添加の結果、好ましくは、検出可能シグナルが生成する。時間分解蛍光、内部反射蛍光及びラマン分光法などのその他の検出系も場合によっては有用である。
【００６３】
本発明はまた、望ましくは、間接的に検出される標識の使用も提供する。間接的に検出可能な標識は、一般に、「親和性ペア」、即ち２つの異なる分子（このペアの第一のメンバーは本発明の検出ペプチドに連結され、このペアの第二のメンバーは第一のメンバーに特異的に結合する。）の使用を含む。ペアの２つのメンバー間の結合は、通常は、化学又は物理的な性質のものである。このような結合ペアの例には、以下に限定されないが：抗原及び抗体；アビジン／ストレプトアビジン及びビオチン；ハプテン及びハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子／基質及び酵素などが含まれる。
【００６４】
ある実施形態において、好ましくは、検出可能標識は、検出ペプチドのＮ末端に結合される。別の実施形態において、好ましくは、検出可能標識は、検出ペプチドのＣ末端に結合される。ある実施形態において、場合によっては、検出可能標識は、立体障害の可能性（例えば、以下に限定されないが６−アミノヘキサン酸を含む化学的スペーサーが、検出ペプチド配列と検出可能標識との間で使用される場合など）を低下させるためにスペーサーによって連結される。
【００６５】
１．２抗コア抗体
本発明のＨＣＶ検出法において使用される抗体は、好ましくは、本方法での使用のために選択される１以上の免疫優勢ペプチドにより含有されるエピトープ以外のＨＣＶコアタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体である。この文脈において、「含有される」は、エピトープの全長配列がペプチドに存在することを意味する。当業者にとって当然のことながら、ある実施形態において、本ペプチドは、抗体が結合するエピトープの配列の一部を含み得、この抗体に結合するのに機能的であるエピトープは含まず、従って、全長エピトープに選択的に結合する抗体は、免疫優勢ペプチドと組み合わせて使用するのに依然として適切である。例えば、これらの抗体が認識するエピトープによる公知の及び／又は市販の抗コア抗体から、及び／又は、本明細書中に記載のプロセスに従うことによって、適切な抗体を選択することができる（例えば下記セクション６参照）。
【００６６】
本抗体は、好ましくは、非ヒト抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施形態において、本抗体は好ましくはヒト抗体である。
【００６７】
ある実施形態において、本抗体は、望ましくは、ＨＣＶの全て又は殆どの遺伝子型で存在する場合、コアタンパク質に結合できる。別の実施形態において、本抗体は、好ましくは、ＨＣＶの６種類の主要な遺伝子型（１、２、３、４、５及び６）及びそれらのサブタイプからの抗原性タンパク質を捕捉することができる（Ｓｔｕｙｖｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１０１３４−１０１３８（１９９４）；及びＢｕｋｈ、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．、１５：４１−６３（１９９５）に記載のように。）。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、コアタンパク質に特異的に結合できる、モノクローナル抗体及び一特異的ポリクローナル抗体及びの両インタクト分子ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含む断片など）を含む。
【００６９】
当技術分野で周知の様々な手順によって、コアタンパク質抗原に対するポリクローナル抗体を調製することができる。例えば、コア抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、インタクトなコアタンパク質又はその抗原性ポリペプチド断片（例えばアルブミンなどの担体タンパク質にこれらを結合させ得る。）をウサギ、マウス又はラットなどの適切な宿主動物に投与することができる。
【００７０】
当技術分野で公知の様々なアジュバントは、宿主の種に依存して、免疫原性反応を向上させるために使用することができ、これには、以下に限定されないが、フロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのゲル状鉱物、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び有用である可能性があるヒトアジュバント（ＢＣＧ（バチルス・カルメット−ゲラン（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）など）が含まれる。
【００７１】
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）で教示されるものなど、例えばハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を産生させることができる。しかし、本明細書中で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限らず、一般に、真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが産生される方法によって限定されない。
【００７２】
当然のことながら、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２及びその他の抗体断片を場合によっては本発明のＨＣＶ検出法において使用し得る。このような断片は、一般に、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を用いた、タンパク質分解により作製される。あるいは、組み換えＤＮＡ技術を適用することを通じて又は合成化学を通じて、コアタンパク質−結合断片を作製することができる。例えば、ハイブリドーマを用いてクローニングされた核酸の発現によって、モノクローナル抗体を産生させることができる。Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものなどの技術により、１本鎖Ｆｖｓを作製することができる。
【００７３】
ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイ技術により、モノクローナル抗体及び抗体断片を作製しスクリーニングすることもできる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）に記載のものが含まれる。本発明の抗体を作製しスクリーニングするために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６０８（ＷＯ２００７／０５６５０７）（同じ物に関するその教示に対して参照により組み込まれる。）で開示されるものが含まれる。
【００７４】
本発明のある実施形態において、組み合わせ法での使用のための抗体は、好ましくは、配列番号３、４、５又は５４により完全に含まれるもの以外のコアタンパク質のエピトープに特異的に結合するものである。別の実施形態において、本抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＧ［配列番号６］又はＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］を含むエピトープに結合できる。
【００７５】
本発明はまた、本抗体が、好ましくは固相に共有又は非共有結合され得ることも提供する。従って、本抗体は、固定化を促進するために修飾され得る。適切な修飾は当技術分野で公知であり、免疫優勢ペプチドに関して上述されている。
【００７６】
本発明のある実施形態において、本発明の組み合わせ法において抗体：コアタンパク質複合体を検出するために、抗コア抗体を好ましくは検出抗体として使用する。この実施形態によると、検出可能標識を組み込むためにこの抗コア抗体を修飾することができる。適切な検出可能標識は当技術分野で公知であり、免疫優勢ペプチドに関して上記で述べられている。捕捉及び検出抗コア抗体の両方を本方法で使用する場合、好ましくはこれらの抗体は、これらがコアタンパク質の２つの異なるエピトープを認識するように選択され、これらの何れも、使用されている免疫優勢ペプチドの配列において含まれない。
【００７７】
１．３試験試料
本発明の方法に従い試験され得る試料には、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻腔洗浄液又は組織及び細胞の水性抽出物が含まれる。適切な血漿試料には、クエン酸血漿又はＥＤＴＡ血漿試料が含まれる。好ましくは、このような試料を単離し、インビトロで試験を行う。試験試料は、あらゆる起源由来であり得るが、好ましくはヒトである。
【００７８】
試料を直接試験するか又は試験前に処理し得る。処理には、試料の溶血を防ぐ反応への成分の添加、試験前に確実に血清を凝血させるための手順又は試料からフィブリンを除去するための手順が含まれる。その他の処理には、ウイルス粒子の破壊及び／又は抗原の曝露を促進するための変性剤による処理が含まれる。様々な適切な変性剤が当技術分野で公知であり、これには、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０）（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ６３０とも呼ばれる、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤及びグアニジン、尿素又は酸性溶液などの変性剤が含まれる。これらの試薬の組み合わせも想定される。ある実施形態において、試料の前処理は必要ない。別の実施形態において、１以上の変性剤で試料を前処理する。さらなる実施形態において、グアニジン、尿素及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる群から選択される１以上の変性剤で試料を前処理する。
【００７９】
１．４その他の抗体／抗原
本発明による方法が、好ましくは、コアタンパク質以外の１以上のＨＣＶ抗原性タンパク質（例えば、非構造タンパク質、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５、ならびにＥ１及び／又はＥ２エンベロープ構造タンパク質）又はこれらのタンパク質の１以上に対する抗体の検出をさらに含み得ることが考えられる。当技術分野で公知のように、抗原性タンパク質へ特異的に結合する捕捉抗体の使用により、この抗原性タンパク質を検出することができる。同様に、当技術分野で公知のように、捕捉抗体の使用により、抗体を検出することができる。
【００８０】
本発明の適切な捕捉抗原は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はその断片に対応するアミノ酸配列を有し、試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体に特異的に結合できる。ある実施形態において、本方法は、好ましくは、試験試料中で第二の抗原性タンパク質に対する抗体を検出するために捕捉抗原を使用する。
【００８１】
上述のものを含む、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、適切な捕捉抗体を調製することができる。この捕捉抗原を標準的技術により、例えば、組み換え法により又はウイルス培養物からの精製により、調製することもできる。本発明は、タンパク質全体、タンパク質の断片又はそのタンパク質のキーエピトープに相当する１以上の免疫優勢ペプチドを含む捕捉抗原を想定する。捕捉抗体又は抗原は、場合によっては、固相上に固定化され得る。
【００８２】
下記で述べるように、標準的技術により、個々の捕捉分子を試験試料と接触させる際に形成される捕捉抗体：抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体を検出することができる。
【００８３】
ある実施形態において、好ましくは、捕捉抗原を使用し、検出抗原の使用を通じて、捕捉抗原：抗体複合体の検出を遂行する。捕捉抗原のように、検出抗原は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対応するアミノ酸配列又はその断片を有し、試料からのＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体に特異的に結合できる。検出抗原は、場合によっては、試料からの抗体の存在を調べるために、検出ペプチドに関して上記で述べたように、検出可能標識に結合させることができる。ある実施形態において、検出抗原は、好ましくは、実施例２に記載の結合法によって標識される。
【００８４】
ある実施形態において、本発明による方法は、試料中で抗ＮＳ３抗体を検出するためにＮＳ３抗原を使用する。別の実施形態において、本方法は、組み換えＮＳ３タンパク質を使用する。さらなる実施形態において、本方法は、捕捉抗原のように、及び、何らかの捕捉された抗ＮＳ３抗体の検出のために、ＮＳ３タンパク質又はその断片を使用する。具体的な実施形態において、検出ＮＳ３タンパク質は、実施例２に記載の結合法によって標識される。
【００８５】
１．５抗体：抗原複合体の検出
本発明のＨＣＶ検出法中に形成される様々な抗体：抗原複合体（即ち、捕捉ペプチド：抗体複合体、捕捉抗体：コアタンパク質複合体及び、適用できる場合、捕捉抗体：第二の抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体）は、好ましくは標準的技術により検出する。
【００８６】
例えば、捕捉された抗体に特異的に結合できる標識した二次抗体（抗ヒト抗体など）を用いて、又は捕捉ペプチドの配列と実質的に同一の配列を有する標識した検出ペプチド用いることにより、何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体の検出を行うことができる。ある実施形態において、本発明の組み合わせ法において、何らかの捕捉ペプチド：抗体複合体の検出を、好ましくは、１以上の検出ペプチド（これらはそれぞれ、捕捉ペプチドの１つに本質的に対応するアミノ酸配列を有する。）の使用を通じて行う。具体的な実施形態において、捕捉ペプチド／検出ペプチドの１以上のペアを好ましくは使用するが、この場合、検出ペプチドは、その同種捕捉ペプチドの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。言うまでもなく、本発明は、配列が完全に同じように対応する捕捉ペプチド／検出ペプチドだけでなく、一部配列変異が許容されるもの（例えば、実質的に同等のアミノ酸残基及び／又は結果として実質的に同等の機能となるものによる変異）も提供する。
【００８７】
例えば、捕捉抗体により認識されるもの以外のエピトープにおいてコアタンパク質に特異的に結合できる標識した検出抗体を用いて、何らかの抗体：コアタンパク質複合体の検出を行うことができる。検出抗体により認識されるエピトープはまた、好ましくは、１以上の捕捉ペプチドに不在であり、従って、本方法において交差反応性が起こる可能性は最小限に抑えられる。
【００８８】
適用される場合、捕捉抗体：第二の抗原性タンパク質又は捕捉抗原：抗体複合体の検出は、好ましくは、標識した検出抗体又は抗原性タンパク質の標識物又はその断片の個々の使用を通じて行うことができる。検出抗体を使用する場合、これらは、捕捉抗体により認識されるエピトープ以外の第二の抗原性タンパク質のエピトープを認識しなければならない。
【００８９】
使用される標識に依存して、形成された個々の複合体の存在を明らかにするために、様々な標準的検出技術（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ又はその他の検出技術）を使用することができる。形成される様々なタイプの複合体を検出するために、同じタイプ又はいくつかのタイプの標識を使用することができる。
【００９０】
必要に応じて、試験試料中の抗原の存在及び／又は抗体の存在の検出は、定量により、例えば、当業者にとって公知の標準的技術に従い、標識により放射されるシグナル（色、発光、放射能など）を測定することにより、完遂することができる。あるいは、試料からのＨＣＶコアタンパク質又はコアタンパク質に対する抗体の存在の検出を定性的に測定することができる。
【００９１】
２．組み合わせ法の性能特性
診断感度、診断特異性及び再現性などの本組み合わせ法の性能特性は、好ましくは、下記のものなどの標準的技術を用いて評価することができる。
【００９２】
本発明の組み合わせ法は、好ましくは、抗体単独アッセイを上回って感度が向上し、同時に高い特異性を維持しており、従って、最適に、抗体単独試験よりも潜伏期間が狭められる。ＨＣＶ抗原性タンパク質及び抗原性タンパク質に対する抗体（陽性対照）及びこのようなタンパク質及び抗体を欠く適切な試料（陰性対照）を含有する試料を用い標準的技術を用いて、本発明の組み合わせ法の診断感度及び特異性を評価することができる。急性Ｃ型肝炎感染又は慢性Ｃ型肝炎感染の患者から、このような検体又は試料を得ることができる。本方法はまた、市販のセロコンバージョンパネル、例えば、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．（ＢＢＩ、Ｗｅｓｔ Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＭＡ）、Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）又はＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）から入手可能なものなど、に対して試験することもできる。例えば、ＢＢＩから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルには、以下に限定されないが、ＢＢＩ（又はＰＨＶ）９０１、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７及び９１９が含まれる。Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルの例には、以下に限定されないが、ＢＣＰ６２１１、ＢＣＰ６２１３、ＢＣＰ６２２２、ＢＣＰ６２２５、ＢＣＰ６２２７、ＢＣＰ９０４１、ＢＣＰ９０５４及びＢＣＰ９０５５が含まれる。Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手可能な適切なセロコンバージョンパネルの例には、以下に限定されないが、ＳＣ００１０、ＳＣ００３０、ＳＣ００４０、ＳＣ００５０、ＳＣ００６０、ＳＣ０４００、ＳＣ０４０２、ＳＣ０４０５及びＳＣ０４０６が含まれる。適切な対照陰性試料には、非感染対象からの及び／又はＣ型肝炎感染に無関係の状態の患者（妊娠、自己免疫疾患又はその他の急性ウイルス感染など）から及び通常の血液ドナーからの試料が含まれる。
【００９３】
このようにして、既にＣ型肝炎感染に罹患している患者からの試料を試験するためにこの方法を用いることにより、診断感度を測定する。診断感度は、その方法の、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を含有する試料を正しく同定する能力の尺度であり、この方法により陽性として認識される真陽性の試料の数を、参照法により陽性として同定される試料の数で除した値として計算され、％として表される。参照法は、場合によっては、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを測定するアッセイ又はＨＣＶ ＲＮＡを測定するための核酸試験（ＮＡＴ）を含む。ＮＡＴは、ＨＣＶ試験において「究極の判断基準」と考えられているので、ある実施形態において、好ましくは、参照法としてのＮＡＴに対して感度を測定する。別の実施形態において、参照法としてＮＡＴを用いて、１以上のセロコンバージョンパネルに対して感度を測定する。
【００９４】
ある実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９０％から約１００％の間の診断感度を有する。さらに別の実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９５％から約１００％の間の診断感度を有する。さらなる実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法は、参照法としてＮＡＴを使用して、既に起こっているＣ型肝炎感染に対して約９７％から約９９％の間の診断感度を有する。
【００９５】
診断感度はまた、好ましくは、その方法の、初期ＨＣＶ感染を検出する能力を測定することによっても評価される（即ち潜伏期間を狭めるため）。ある実施形態において、好ましくは、本発明による組み換え法の、ＨＣＶ感染の初期段階を検出する能力は、市販のセロコンバージョンパネルを用いて測定され、ＨＣＶ ＲＮＡを測定する現在の「究極の判断基準」（ＮＡＴ）と比較される。検出効率を評価するために、好ましくは、本方法を用いて陽性の結果を生じる試料数を調べ、ＮＡＴにより調べた場合のＨＣＶ感染の最初の検出時と比較する。抗体単独アッセイなどのその他の方法を上回る本組み合わせ法の何らかの改善もまた、望ましくは、ＨＣＶ感染の最初の検出時に対する本組み合わせ法で得られた結果をその他の方法により得られた結果と比較することにより、評価することができる。本発明のある実施形態によると、好ましくは、本組み合わせ法は、抗体単独アッセイよりも早い感染段階でＨＣＶ感染を検出することができる。
【００９６】
ある実施形態において、本発明による組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも約５日から約４０日早くＨＣＶ感染を検出する。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１０日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。さらなる実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１２日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、ＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体のみを検出する方法よりも平均で約１５日から約３０日早く、ＨＣＶ感染を検出する。代替的な実施形態において、ＮＡＴ法と比較した場合の検出の平均遅延は、好ましくは、約５日から約１日の間である。別の実施形態において、ＮＡＴ法と比較した場合の検出の平均遅延は、好ましくは、約４日から約１日の間である。平均遅延及び方法間の平均差は、１以上のセロコンバージョンパネルからの複数の異なる試料を用いることにより評価することができる。例えば、最適には１０以上の試料又は望ましくは２０以上の試料である。
【００９７】
本方法が検出できる最低ウイルス量に基づいて診断感度を評価することもできる。例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているもの（例えばＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ及びＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｔｅｓｔ）などの定量的ＮＡＴ法を用いて、試験試料のウイルス量を評価することができる。本発明のある実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約５ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約４ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。さらなる実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約３ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。別の実施形態において、本組み合わせ法は、好ましくは、約２ｘ１０４コピー／ｍＬ以上のウイルス量を検出することができる。
【００９８】
例えば、陽性の結果を生じる試料の数を調べるために様々な非感染血液ドナーからの試料を試験することにより、本方法の診断特異性を評価することができる。診断特異性は、ＨＣＶ抗原性タンパク質又はＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を含有しない検体を正しく同定する、本方法の能力である。ＨＣＶを試験する方法に対する特異性の必要条件の例は、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ（２００２／３６４／ＥＣ）で見出すことができるが、これは、最低５０００名のヨーロッパ人ドナー又は同等者を用いた９９．５％の特異性のスクリーニングアッセイに対する最低要件を定める。その方法により陰性として認識される真性陰性検体数を、参照法により陰性であるとして同定される検体数で除した値として、診断特異性を計算し、％で表すことができる。場合によっては、ＨＣＶ感染とは無関係の状態の患者由来の交差反応の可能性がある試料に対してその方法を試験することによって、診断特異性を評価することもできる。このような状態には、例えば、妊娠、自己免疫疾患又はその他の急性ウイルス感染が含まれる。本発明のある実施形態において、好ましくは、本発明による組み合わせ法の診断特異性は、約９５％から約１００％の間である。別の実施形態において、好ましくは、本組み合わせ法の診断特異性は、約９６％から約９９％の間である。さらなる実施形態において、好ましくは、本組み合わせ法の診断特異性は、約９７％から約９９％の間である。
【００９９】
本方法の再現性は、当技術分野で公知のように調べることができる。例えば、別個の試験での複数試料の反復物を用いて、得られた結果間の変動を調べることによって、本方法を試験することができる。場合によっては、試薬の様々な調製物を用いて、本方法を試験することもできる。当技術分野で公知のように、及び、例えば、変動係数（ＣＶ）により示されるように、標準的統計法を使用して、アッセイ内変動（同じ試料の反復物内の変動）及びアッセイ間変動（別個の場合での試験における変動）の何れか又は両方を測定することができる。ある実施形態において、好ましくは、本方法のアッセイ内変動の％ＣＶは、約１０％未満、さらにより好ましくは約０．０１％から約１０％である。別の実施形態において、好ましくは、本方法のアッセイ間変動の％ＣＶは、約１５％未満、さらにより好ましくは約０．０１％から約１５％である。
【０１００】
３．アッセイ形式
望ましくは、不均一相（固相など）又は均一相で；１段階又は２段階で；サンドイッチ型アッセイとして；競合的又は非競合的形式で、などを含む（がこれらに限定されない）、免疫アッセイに適切な当技術分野で公知の様々なアッセイ形式で、本発明による方法を行うことができる。
【０１０１】
代表的な免疫アッセイ形式には、以下に限定されないが、マイクロタイタープレートアッセイ、ミクロスフェア免疫アッセイ、デュアルアッセイストリップブロット、迅速試験、ウエスタンブロット、ならびに例えば、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｓアッセイ（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第二版、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編集、３６３−３６７頁、２００１）での常磁性粒子の使用が含まれる。このような形式は当業者にとって公知である。
【０１０２】
形式のその他の例には、試験試料中に存在する抗原を検出するために使用することができる２つの抗体（捕捉及び検出抗体）間でサンドイッチされるタイプの免疫アッセイ形式が含まれ、この場合、この抗体は、捕捉ペプチド又は捕捉抗原の何れか及び、抗体に連結する標識結合物（「間接的形式」と一般に呼ばれる形式に従う。）、例えば標識したタンパク質Ａ又は標識した抗免疫グロブリン又は抗アイソタイプ抗体を用いて明らかにされる。この抗体はまた、好ましくは、抗体に結合する、捕捉ペプチド及び標識した検出ペプチド（「抗原−抗体−抗原サンドイッチ」又は「二重抗原サンドイッチ」と呼ばれる形式に従う。）を用いて検出することもできる。免疫アッセイのその他の形式もまた想定され、当業者にとって周知である。
【０１０３】
ある実施形態において、好ましくは、サンドイッチに基づく形式を用いて本方法を行う。別の実施形態において、好ましくは、それぞれ抗体サンドイッチ及び二重抗原サンドイッチを用いて、試験試料中のコアタンパク質及び抗コア抗体を検出する。
【０１０４】
上述の免疫アッセイ形式の多くの場合、最適に、免疫優勢ペプチド及び／又は抗コア抗体を固体支持体に連結させる。適切な固体支持体の例には、多孔質及び非多孔質材、ラテックス粒子、磁気粒子、微小粒子（米国特許第５，７０５，３３０号を参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチックチューブが含まれる。固相材料の選択は、所望のアッセイ方式の性能特性に基づき行うことができ、微粒子であり得る（ペレット、ビーズなど）又は連続面（膜、メッシュ、プレート、スライド、ディスク、キャピラリー、中空糸、針、ピン、チップ、ソリッドファイバー（ｓｏｌｉｄ ｆｉｂｅｒ）、ゲルなど）の形態であり得る。ある実施形態において、好ましくは、マイクロプレート又はマイクロタイターウェルを固相として使用する。適切なマイクロプレート又はマイクロタイターウェルの例には、Ｎｕｎｃ社、Ｄｅｎｍａｒｋから市販されているものなど、ポリスチレン製のものが含まれる。別の実施形態において、好ましくは、固形粒子又はビーズ；又は常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ又はＭｅｒｃｋ−Ｅｕｒｏｌａｂ（Ｆｒａｎｃｅ）（ＥｓｔａｐｏｒＴＭ）により提供されるものなど）を固相として使用し得る。さらに別の実施形態において、好ましくは、ポリスチレン又はポリプロピレン製などの試験管を固相として使用し得る。
【０１０５】
共有結合に対する連結剤は当技術分野で公知であり、固相の一部であり得る又は、アミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物部分を介した捕捉ペプチド及び／又は抗体の連結を可能にする反応基で固相を誘導化し得る。このような様々な架橋剤が当技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、前記及びＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのカタログ参照）。例としては、以下に限定されないが、ジアミン（１，６−ジアミノヘキサンなど）；ジアルデヒド（グルタルアルデヒドなど）；ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル及びエチレングリコール−ビス（コハク酸スクシンイミジル）など）；ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートなど）；ビスオキシラン（１，４ブタンジイル ジグリシジルエーテルなど）；ジカルボン酸（スクシニルジサリチレートなど）；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが挙げられる。固体支持体上に捕捉ペプチド及び／又は抗体を固定化するために、当技術分野で公知の様々なカップリング化学を場合によっては使用することができ、これには、例えば、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフィドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミドカップリング化学に対するカルボキシル及びアミノ誘導体の使用が含まれる。
【０１０６】
あるいは、上述のように、好ましくは、適切に修飾される固体支持体への分子の連結を可能にする基で、捕捉ペプチド及び／又は抗体を修飾する。例えば、好ましくは、捕捉ペプチド及び／又は抗体は、Ｎｉ２＋イオンを含有するように修飾されている固体支持体にペプチド／タンパク質が固定化されることを可能にするＨｉｓタグを含む。同様に、好ましくは、捕捉ペプチド及び／又は抗体はビオチンで修飾され、支持体は、アビジン／ストレプトアビジンを含有するように修飾される。その他の例は、当技術分野で公知である。
【０１０７】
当業者にとって当然のことながら、試料のハイスループットスクリーニングに対して本発明による方法を容易に適合させることができる。ハイスループット法は、複数の試料を同時に処理し、大量の試料をスクリーニングするのに要する時間を大きく短縮するという有利な点がある。従って本方法は、試料中のＨＣＶ抗原性タンパク質及びＨＣＶ抗原性タンパク質に対する抗体を同時に同定するためにハイスループット法の使用を想定する。
【０１０８】
ハイスループットスクリーニングの場合、好ましくは反応成分は通常はマルチ容器担体又はプラットフォーム（マルチウェルマイクロタイタープレートなど）に収容されるが、これにより、複数の反応系それぞれが様々な試験試料を含有し、それらを同時に監視できるようになる。本発明はまた、スクリーニングプロセスの効率を向上させるための高度自動化ハイスループットスクリーニングも包含する。試料及び試薬ピペッティング、液体分注、時間調節温置、マイクロアレイへの試料の形式合わせ、マイクロプレートのサーモサイクリング及び適切な検出器におけるマイクロプレート読み取りなどの多くの手順に対する自動化能力のように、多くのハイスループットスクリーニング又はアッセイ系が現在市販されており、その結果、スループット時間が非常に速くなった。
【０１０９】
４．診断キット
本発明は、本発明による組み合わせ法での使用に適切な試薬を含むＨＣＶの検出のために診断キットをさらに提供する。このような試薬には、好ましくは、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる１以上の捕捉抗体及び本発明によるコアタンパク質に結合できる１以上の捕捉ペプチドが含まれる。この試薬には、また、場合によっては、ＨＣＶコアタンパク質を検出するための１以上の検出ペプチド及びＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合できる１以上の検出抗体も含まれる。
【０１１０】
このキットは、さらに、好ましくは、第二の抗原性タンパク質に対する抗体の捕捉のための、第二の抗原性タンパク質（コア以外）もしくはその断片、又は第二の抗原性タンパク質の捕捉のための第二の抗原性タンパク質に対する抗体及びそれぞれ、標識抗原性タンパク質又は標識抗体などの、捕捉した抗体又は抗原を検出するための手段を含む。ある実施形態において、好ましくは、このキットは、ＮＳ３に対する抗体を検出するための、ＮＳ３タンパク質もしくはその断片、及び捕捉抗体を検出するための、標識ＮＳ３タンパク質又はＮＳ３タンパク質の標識断片を含む。
【０１１１】
このキット中で提供される検出試薬は、好ましくは、フルオロフォア、放射能部位、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能標識を組み込むか、又は、このキットは、場合によっては、試薬を標識するために必要な成分を含む。この試薬は、別個の容器中で提供するか又は適切なアッセイ形式に前もって分注されるか又は固定化され得る。例えば、マイクロタイタープレート又はウェルなどの適切な固体支持体上で捕捉試薬を固定化して提供することができ、この検出試薬を適切な別個の容器中で提供できる。
【０１１２】
このキットは、場合によっては、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬、洗浄試薬など、診断アッセイを行うのに必要な試薬を含む。試験試料の単離及び／又は処理のための緩衝液及び溶液など、その他の成分もまた、このキット中に含まれ得る。このキットは、さらに１以上の対照を含み得る。このキットの成分の１以上は凍結乾燥され得、その場合、このキットは、凍結乾燥成分の再構成に適切な試薬をさらに含み得る。
【０１１３】
このキットの様々な成分は、望ましくは適切な容器中で提供される。上記で示されるように、好ましくは容器の１以上がマイクロタイタープレートであり得る。適切であれば、このキットはまた、場合によっては、反応容器、混合容器及び試薬又は試験試料の調製を促進するその他の成分も含有する。このキットはまた、シリンジ、ピペット、ピンセット、一定量用のスプーン、一定量用の容器など、試験試料を得るか又は試薬を測定／分注することを補助するための１以上の器具も含み得る。
【０１１４】
ある実施形態において、好ましくは、このキットは、例えば、試料添加コントロール及び／又は色分け試薬など、プロセス制御監視のための試薬を含む。本発明のある実施形態によるプロセス制御監視の例を図４で示す。図４で示されるように、具体的な色についてプレートを調べることにより、ウェルへのアッセイの様々な成分の添加を確認し得る。例えば、試薬が色分けされている場合、特定の段階におけるある試薬の別の試薬への添加の結果、好ましくは、混合物の色が変化し、このようにしてその段階が行われたという指標が与えられる。あるいは、この方法のその段階が行われたか否かを調べるために、ウェル中の溶液の光学密度を監視し得る。本組み合わせ法の段階の１又は複数のプロセス制御監視に対して、試薬を提供し得る。
【０１１５】
このキットはまた、場合によっては、使用説明書を含み、これは、紙の形態で又はコンピュータ可読形態（ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなど）で提供され得る。このキットはまた、本組み合わせ法により得られる結果の解釈を支援するソフトウェアを含むコンピュータ可読媒体も含み得る。このキット成分のその他の変形物は当業者にとって公知である。
【０１１６】
５．組み合わせ法及び診断キットの使用
本発明による組み合わせ法及び診断キットは、好ましくは、様々な診断目的のために使用される。このような診断目的には、以下に限定されないが、ＨＣＶの初感染の検出、患者の治療薬への反応の監視、ＨＣＶの再感染の検出、ウイルス量の測定及び感染の有無及び状態の判定（急性と慢性）が含まれる。
【０１１７】
本組み合わせ法及び診断キットはまた、好ましくは、例えば遺伝子型アッセイ又はＨＣＶ突然変異もしくは複数血清型の検出など、非診断目的のためにも使用される。本発明はまた、血液試料又は血液製剤（ドナー血液など）のプール内でのＨＣＶの検出のための、本組み合わせ法及び診断キットの使用も包含する。これに関連して、本発明の方法によるハイスループットスクリーニングは、疫学的研究のための大集団スクリーニング又はＨＣＶが混入した試料に対する血液バンクもしくは器官のスクリーニングなど、大規模スクリーニングを促進するために有用であり得る。
【０１１８】
勿論、言うまでもなく、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載のような、及び例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）から市販されているような（限定されないが、ＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ及びＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームならびにその他のプラットフォームを含む。）、自動化及び半自動化系（微小粒子を含む固相があるものを含む。）での使用に対して、本明細書中の代表的形式の何れか及び本発明による何れかのアッセイ又はキットを適合させるか又は最適化することができる。
【０１１９】
さらに、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴＴＭ電気化学的免疫アッセイ系を含むポイントオブケアアッセイ系に対して、本発明のアッセイ及びキットを適合させるか又は最適化することができる。免疫センサー及び使い捨て試験装置においてこれらを製造し、操作する方法は、例えば米国特許第５，０６３，０８１号及び公開米国特許出願第２００３０１７０８８１号、同第２００４００１８５７７号、同第２００５００５４０７８号及び同第２００６０１６０１６４号（同じものに関してそれらが教示することに対して参照により組み込まれる。）に記載されている。
【０１２０】
６．組み合わせアッセイのための試薬を選択するためのプロセス
本発明はまた、本明細書中に記載のＨＣＶ検出のための組み合わせ法などの組み合わせ法での使用に適切な試薬を選択するためのプロセスも提供する。この選択プロセスによって、好ましくは、微生物（例えば、細菌、寄生虫、真菌又はウイルス）の抗原性タンパク質を捕捉及び検出するために使用される試薬と、抗原性タンパク質に対する抗体を捕捉及び検出するための試薬間で、これらの試薬を一緒に使用する場合、交差反応性が（あるとしても）あまりないように試薬を選択できるようになる。抗原性タンパク質を捕捉又は検出するために適切な試薬には抗体が含まれ、同じ抗原性タンパク質に対する抗体を捕捉又は検出するために適切な試薬には免疫優勢ペプチドが含まれる。
【０１２１】
ある実施形態において、ＨＣＶコアタンパク質を検出するための試薬の選択にこのプロセスを適用する。しかし、この選択プロセスは、コアタンパク質以外のＨＣＶ抗原性タンパク質及びそれに対する抗体を検出する組み合わせ法に、より一般的には、その他の微生物由来の抗原性タンパク質及びこれらのタンパク質に対する抗体を検出する組み合わせ法に適切な試薬の選択に幅広く適用することができることを理解されたい。ある実施形態において、ウイルスタンパク質を検出するための試薬の選択にこの方法を適用する。その他の実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来の抗原性タンパク質、例えばｐ２４、を検出するための試薬の選択にこの方法を適用する。
【０１２２】
この選択プロセスは、好ましくは、関心のある微生物の抗原性タンパク質を選択し；抗原性タンパク質に対して免疫優勢ペプチドを同定し（各免疫優勢ペプチドは、一連の感染段階の微生物感染対象の大多数に存在する抗体により認識されるキーエピトープを含有する。）；同定された免疫優勢ペプチドの１以上を選択し、選択されたペプチドに含有されるもの以外のエピトープを認識する抗体を同定する、段階を含む。
【０１２３】
１以上の免疫優勢ペプチドは、好ましくは、微生物の様々な遺伝子型間でよく保存されており、様々なセロコンバージョン試料及び抗原性タンパク質に対して反応性がある後期段階の試料を含む、微生物感染個体の大多数に存在する抗体により認識される抗原性タンパク質のキーエピトープを含有する抗原性タンパク質の免疫優勢領域を確立することにより、同定される。このようにして、免疫優勢ペプチドは、好ましくは、抗原性タンパク質の断片のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
本発明による１以上の免疫優勢ペプチドを選択するために、好ましくは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列を最初に得る。抗原性タンパク質のアミノ酸配列が当技術分野で公知である場合、このアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭなどの様々な公開データベース又は刊行物又は雑誌論文から得ることができる。あるいは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列が未知である場合、例えば、抗原性タンパク質が新規タンパク質である場合、抗原性タンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で公知のように得ることができる。例えば、エドマン分解又は質量分析などのタンパク質又はペプチド配列決定技術を使用し得るか又はそのタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし配列決定することができる。抗原性タンパク質のＤＮＡ配列が既知の場合、ＤＮＡ配列から抗原性タンパク質のアミノ酸配列を推定し得る。
【０１２５】
抗原性タンパク質のアミノ酸配列を得たら、好ましくは、ペプチドのライブラリを作製する。ライブラリ中の各ペプチドは、抗原性タンパク質のアミノ酸配列の断片に対応するアミノ酸配列を有する。ライブラリの総サイズが扱いやすいものであるよう十分長くなるように、及び１つのペプチドに複数のエピトープが存在することが最小限になるよう十分短くなるように、ペプチドの長さを選択する。一般に、約５から約２０アミノ酸長の間のペプチドが適切である。ある実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約７から約２０アミノ酸長の間である。別の実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約８から約２０アミノ酸長である。さらなる実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約１０から約２０アミノ酸長、場合によっては、約１２から約２０アミノ酸長である。その他の実施形態において、好ましくは、ペプチドは、約８から約１８アミノ酸の間、約８から約１６アミノ酸の間、約１０から約１８アミノ酸の間、約１０から約１６アミノ酸の間及び約１０から約１４アミノ酸長の間である。
【０１２６】
このペプチドはまた、そのアミノ酸配列が好ましくは少なくとも２アミノ酸重複するように設計される。約３から約１４アミノ酸の間の重複も想定される。このペプチドに対する選択される重複は、ライブラリに必要とされる分解能ならびにライブラリにより含まれるペプチドの長さに依存する。一般に、重複はそのペプチドの長さの３分の２以下である。所望のライブラリ特性を得るためのこのような重複の選択は、当業者の通常の技術及び知識の範囲内である。同じく、ペプチドのライブラリを作製する方法も当技術分野で公知である。
【０１２７】
実施例１に従い、及び実施例１で示されるように、ペプチドのライブラリから候補免疫優勢ペプチドを同定することができる。ペプチドのライブラリからの各ペプチドは、好ましくは、微生物に感染した対象からの複数の試料に対して試験され、試料（感染の様々な段階からの試料を含む。）の大多数において抗体に結合するものを同定することにより、可能性のあるペプチドを選択する。
【０１２８】
このペプチドはまた、好ましくは、非感染試料（微生物による感染に対して結果が偽陽性となることが知られている試料を含む。）に対してもスクリーニングされる。これらの偽陽性試料は、ペプチド配列における交差反応領域を同定する陰性対照試料である。陰性対照試料に反応するペプチド（即ち交差反応領域を含む。）を好ましくは回避する。微生物に感染した対象からの複数の試料において抗体に結合するが、偽陽性シグナルを生じさせる交差反応領域を含有しないペプチドを望ましくは候補免疫優勢ペプチドとして選択する。
【０１２９】
次に、上述のように同定される候補免疫優勢ペプチドの配列に基づき、免疫優勢ペプチドを調製する。この免疫優勢ペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの候補ペプチドの配列を含み、また、場合によっては、候補ペプチドのすぐ隣にある２つのペプチドの一方又は両方の配列の一部又は全てを含む（ただし、これらの隣接ペプチドは交差反応領域を含まない。）。
【０１３０】
次に、その、効率的に抗原性タンパク質を捕捉し、選択される免疫優勢ペプチドにより完全に含有されるもの以外のエピトープに結合する能力に基づき、１以上の抗体を選択する。上述のように、ある実施形態において、免疫優勢ペプチドが、選択される抗体により結合されるエピトープの配列の一部を含むことが想定されるが、これは、部分的エピトープは、抗体に結合する機能がないからである。ある実施形態において、好ましくは、その微生物の全て又は殆どの遺伝子型で生じる抗原性タンパク質の形態に結合する抗体を選択する（微生物の複数遺伝子型がある場合）。
【０１３１】
適切な抗体を市販の抗体から選択することができる、又は、あるいは、抗原性タンパク質に特異的に結合できる抗体のライブラリを作製することができる。このようなライブラリを作製する方法は当技術分野で公知である。次に、必要に応じて、既知の方法を用いて、この抗体により認識されるエピトープのマッピングを行うことができる。例えば、免疫優勢ペプチドが選択されたペプチドのライブラリに対して、この抗体をスクリーニングすることができる。一部の市販の抗体の場合、その抗体が結合するエピトープは既知であり、従って、マッピング段階を行う必要はない。適切な抗体が選択されたら、好ましくは、これらがペプチドに含まれるエピトープと交差反応しないことを確認するために、選択された免疫優勢ペプチドに対して、これらの抗体をスクリーニングする。
【０１３２】
免疫優勢ペプチドが同定され、モノクローナル抗体により認識されるエピトープが決定されたら、組み合わせアッセイでの使用に対して、免疫優勢ペプチド及び免疫優勢ペプチドに結合しないモノクローナル抗体の組み合わせを好ましくは選択する。選択された免疫優勢ペプチドを捕捉及び検出ペプチドとして使用することができ、選択されたモノクローナル抗体を好ましくは捕捉及び検出抗体として使用する。
【０１３３】
ここで、具体的な実施例を参照しながら本発明を説明する。次の実施例は本発明の実例となる実施形態を述べるものであり、本発明を何ら限定するものではないことを理解されたい。
【０１３４】
実施例
【実施例１】
【０１３５】
免疫優勢コアペプチド及び抗コア抗体の選択
コアタンパク質の重複断片に相当する一連のペプチド（配列番号７−５３）を調製した。各ペプチドは１２アミノ酸長であり、先行する（Ｎ末端）ペプチド８アミノ酸及び続く（Ｃ末端）ペプチド８アミノ酸が重複した（図３参照）。ＢＳＡにこれらのペプチドを結合させ、マイクロタイタープレートをこれらで被覆し、そのタンパク質のキーとなる抗原性領域のマッピングを行うために、抗ヒト形式で真性ヒト陽性血清に対してスクリーニングを行った。使用する、選択されたモノクローナル抗体の結合部位を同定するために、抗マウス形式で同じプレートを使用した。
【０１３６】
このスクリーニングプロセスの結果に基づき、次の免疫優勢ペプチドを調製した。
【０１３７】
コア捕捉ペプチド１：ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＣ［配列番号５４］。
【０１３８】
コア捕捉ペプチド１は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基１６から３０に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＣ末端へのシステイン残基の付加により修飾される。
【０１３９】
コア捕捉ペプチド２：ＳＡＭＳＡ−ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号５５］。
【０１４０】
コア捕捉ペプチド２は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基３３から４４に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基の付加により修飾される。
【０１４１】
コア捕捉ペプチド３：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５６］。
【０１４２】
コア捕捉ペプチド３は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４９から６８に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及び３個のアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）スペーサーの付加により修飾される。
【０１４３】
コア検出ペプチド１：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−ＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ［配列番号５７］。
【０１４４】
コア検出ペプチド１は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基１６から３０に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及びＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４５】
コア検出ペプチド２：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ［配列番号５８］。
【０１４６】
コア検出ペプチド２は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基３３から４４に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及び３個のＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４７】
コア検出ペプチド３：ＳＡＭＳＡ−Ａｈｘ−ＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡ［配列番号５９］。
【０１４８】
コア検出ペプチド３は、図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４９から６８に対応するアミノ酸配列を有し、ペプチドのＮ末端へのＳＡＭＳＡ官能基及びＡｈｘスペーサーの付加により修飾される。
【０１４９】
３種類の検出ペプチドは全て、ＳＡＭＳＡ部分を介してホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた。
【０１５０】
上記捕捉及び検出ペプチドにより完全に含まれるもの以外のエピトープに結合する、上記捕捉及び検出ペプチドと組み合わせて使用しようとするモノクローナル抗体を選択した。
【０１５１】
モノクローナル＃１（ＫＴＭ１６３）：図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基２９から３２により定められるエピトープＱＩＶＧ［配列番号６］に結合する。
【０１５２】
モノクローナル＃２（ＫＴＭ１４５）：図１で示されるコアタンパク質配列［配列番号１］の残基４１から４８により定められるエピトープＧＰＲＬＧＶＲＡ［配列番号９８］に結合する。
【０１５３】
モノクローナル抗体＃１（ＫＴＭ１６３）をホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させ、検出抗体として使用し、モノクローナル抗体＃２（ＫＴＭ１４５）を捕捉抗体として使用した。
【０１５４】
協和発酵工業（日本）からモノクローナル抗体ＫＴＭ１６３及びＫＴＭ１４５を得た。（ＫＴＭ１４５及びＫＴＭ１６３の結合特性を有するその他のモノクローナル抗体も本発明の目的のために使用し得る。）。
【実施例２】
【０１５５】
組み換えＮＳ３抗原の調製及び標識
組み換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質ＮＳ３及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合物を次のように調製した。この方法は、米国特許出願第６０／８４１，８０１号の特許出願「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｅｉｎｇ Ｓａｍｅ」（２００６年９月１日提出）の対象である（同じ物に関するその教示に対して参照により組み込まれる。）。
【０１５６】
標準的タンパク質発現法に従い、組み換えＮＳ３（ｒＮＳ３）を調製し、ＮＳ３のネイティブ配列をこのネイティブ配列に対するＮ末端位置のベクター由来のリーダー配列とともに含有させた。
【０１５７】
ＨＲＰ−マレイミド溶液を次のように調製した。スルホ−ＳＭＣＣの２倍モル過剰濃度をＤＭＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８中で溶解させた１００ｍｇ／ｍＬ ＨＲＰを添加した。この溶液を穏やかに旋回撹拌し、室温で４５分間静置した。ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にこの溶液（２．５ｍＬ）を添加し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８（３．２ｍＬ）で溶出することによって、ゲルろ過によりＨＲＰ−マレイミドを精製した。
【０１５８】
ＴＣＥＰの１０倍過剰量を含有するＴＣＥＰ（Ｐｅｒｂｉｏ又はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の水溶液中で、６．８のｐＨで２時間、室温にてｒＮＳ３を還元し、還元ｒＮＳ３を得た。上述のようにして調製したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドの１０モル当量を、還元ｒＮＳ３及びＴＣＥＰの溶液に添加し、得られた混合物を旋回撹拌し、２−８℃で１６−２４時間静置し、ｒＮＳ３−ＨＲＰを得た。次に、室温で３時間、ヨード酢酸の過剰量との反応させることにより、未反応スルフィドリル基を全て封鎖した。各カラムに生成物２．５ｍＬを添加し、３ｍＬ中で溶出することにより、ＰＤ１０カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ−２５メディウム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上でのゲルろ過によって、得られた封鎖済みｒＮＳ３−ＨＲＰを精製し、最終ｒＮＳ３−ＨＲＰ生成物を得た。最終ｒＮＳ３−ＨＲＰ生成物を調製するためのこの４段階の手順を行うのに必要な時間は全部で１ １／２日であった。一方、従来法により調製されるｒＮＳ３−ＨＲＰは９段階（中間体生成物の精製を含む。）を要し、全部で３日間かかった。
【０１５９】
上記「インシトゥ」法により調製されたｒＮＳ３結合物及び９段階の従来法により調製されたｒＮＳ３結合物が抗ＨＣＶ抗体を検出する能力を比較することにより、従来のｒＮＳ３−ＨＲＰよりもインシトゥｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物を高いタイター（即ち低濃度）で使用することができ、シグナルがより高く、陰性でより低くなることが分かった。さらに、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ非存在下でｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物を使用することができ、一方、従来法に従い調製されたｒＮＳ３−ＨＲＰ結合物の場合、６ｍＭ ＤＴＴを結合物希釈液に添加しなければならなかった。従来のｒＮＳ３−ＨＲＰをＤＴＴ又はＴＣＥＰなしで使用した場合、陽性シグナルが大幅に低下した。これらの結果から、インシトゥ法は、タンパク質構造をオープンコンファメーション（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）に保持し、予想され得るように、嵩張るＨＲＰ部分がキーエピトープを覆い隠さずに、安定してそれらが露呈されることが示唆される。
【実施例３】
【０１６０】
Ｃ型肝炎ウイルス検出のための免疫アッセイキット
この実施例は、本発明の組み合わせ法での使用に適切な試薬を含有する代表的な免疫アッセイキット及び使用のためのその調製について述べる。この免疫アッセイキットは、実施例１に記載の免疫優勢ペプチド及びモノクローナル抗体及び実施例２に記載の組み換えＮＳ３抗原を含む。このキットを用いて行われるアッセイの形式を図５で図示する。図５で示される「ポリコアペプチド結合物」は、固体表面上でのペプチドの結合及び提示を向上させるためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された３つのコアペプチドを含む。全試薬に対する適切な保管条件は、別段の断りがない限り、２から８℃である。
【０１６１】
１．被覆ウェル
本キットは、ホイルバッグ中に保管された被覆ウェル（例えば、マイクロタイタープレート）を含む。１枚のプレート又は５枚のプレート（各プレート９６ウェル）が、精製組み換えＨＣＶ ＮＳ３抗原、ペプチド（配列番号）及び抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体で被覆される。プレートをバッグから取り出す前に、このウェルを１８から３０℃にする。エンドシール付近のホイルバッグを切らないように注意する。そのプレートの全てを使用していない場合は、未使用ウェルを乾燥剤とともにホイルバッグに入れ、慎重にテープで封止し、２−８℃に戻した（３ヶ月以内）。
【０１６２】
２．試料希釈剤
本キットは、表２で示される化学組成を有する試料希釈剤１８ｍＬを含有する瓶１本又は瓶２本を含む。
【０１６３】
【表２】
【０１６４】
液体のｐＨは６．２であり、液体密度は１．０８ｇ／ｍＬであった。液体の色は、緑／青色であった。
【０１６５】
３．陰性対照
本キットは、表３で示される化学組成を有する陰性対照溶液の２．８ｍＬを含有する瓶１本を含む。
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
溶液のｐＨは７．６であり、溶液密度は１．０８ｇ／ｍＬであった。溶液の色は青色であった。
【０１６８】
４．抗体陽性対照
本キットは、表４で示される化学組成を有する抗体陽性対照１．８ｍＬを含有するを含む。
【０１６９】
【表４】
【０１７０】
溶液のｐＨは７．６であり、溶液密度は１．０８ｇ／ｍＬである。溶液の色は黄色であった。
【０１７１】
５．抗原陽性対照
本キットは、表５で示される化学組成を有する抗原陽性対照１．８ｍＬを含有する瓶１本を含む。
【０１７２】
【表５】
【０１７３】
溶液のｐＨは１０．８から１１．２であった。溶液密度は１．００ｇ／ｍＬであり、溶液の色は赤色であった。
【０１７４】
６．結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
本キットの結合物は、抗コアモノクローナル抗体とともに抗原性組み換えＮＳ３及びコアタンパク質ペプチドを含有する凍結乾燥ホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識結合物１．２５ｍＬを含有する瓶１本又は瓶３本で提供される。再構成された各瓶は最大で２枚のプレートに対して十分である。
【０１７５】
７．結合物希釈剤
本キットの結合物希釈剤は、表６で示される化学組成を有する希釈剤２５ｍＬ（結合物の瓶１本を再構成するのに十分である。）をそれぞれ含有する瓶１本又は瓶３本として提供される。
【０１７６】
【表６】
【０１７７】
溶液のｐＨは６．８であり、溶液の密度は１．０６ｇ／ｍＬであった。溶液の色は黄色であった。
【０１７８】
結合物の再構成
ストッパーに付着している物質を除去するために結合物の瓶の固体表面を軽く叩くこと（タッピング）により結合物の再構成を行う。結合物希釈剤の瓶の全内容物を結合物の瓶に注ぎ、結合物の瓶に蓋をして穏やかに反転させることにより混合する。時折旋回撹拌しながら少なくとも１５分間、この結合物を再水和する。再構成された結合物の色は赤色である。
【０１７９】
再構成後、２−８℃で２４時間まで結合物を保管するか又は分注して５ヶ月間まで凍結（−１５℃以下）し得る。再構成された結合物を３回まで凍結融解し得る。
【０１８０】
８．基質希釈剤
基質希釈剤は、無色溶液３５ｍＬを含有する瓶１本として提供される。基質希釈剤は、０．０４８％過酸化水素水、４．２３３％クエン酸トリナトリウム及び９５．７１９％蒸留水を含有する。％は全て、重量／重量％として計算される。希釈剤のｐＨは７．５から８．５であり、希釈剤の密度は１．０３ｇ／ｍＬである。
【０１８１】
９．基質濃縮液
基質濃縮液は、表７で示される化学組成を有する基質濃縮液３５ｍＬを含有する瓶１本として提供される。
【０１８２】
【表７】
【０１８３】
溶液のｐＨは２．０±０．３であり、溶液の密度は１．０２ｇ／ｍＬである。溶液の色は橙色である。
【０１８４】
基質溶液
基質溶液を調製するために、汚れていないプラスチック容器中で、下記表８で示されるように、無色基質希釈剤の体積を橙色の基質濃縮液の等体積に添加する。
【０１８５】
【表８】
【０１８６】
あるいは、基質希釈剤の瓶の内容物全てを基質濃縮液の瓶に注ぐことにより、基質溶液を調製し得る。基質希釈剤の添加において、基質濃縮液の色が橙色から黄色に変化する。
【０１８７】
調製済み基質溶液は冷蔵（２から８℃）又は１５から２５℃で２日間まで安定であるが、結晶が形成されたら廃棄しなければならない。
【０１８８】
１０．洗浄液
本キットは、２０倍の作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）のＴｗｅｅｎ／食塩水洗浄液１２５ｍＬを含有する瓶１本又は瓶２本を含む。この２０倍作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）溶液は、１．７１４％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（Ｒ）（１０％溶液）、１．５４１％プロパン−１，２−ジオール、０．１７３％５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、１４．２６６％塩化ナトリウム、０．８５７％Ｔｗｅｅｎ２０及び８３．１３６％水を含有する。％は全て、重量／重量％である。この溶液のｐＨは７であり、希釈剤の密度は１．１１ｇ／ｍＬである。必要な体積を得るために、蒸留水又は脱イオン水の何れかでこの洗浄液を２０分の１に希釈するか、又は、洗浄液の瓶１本の全内容物を２５００ｍＬの最終体積に希釈する。希釈されると、この洗浄液は０．０１％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（Ｒ）保存料を含有する。
【０１８９】
密封容器において１８℃から３０℃で作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）洗浄液を保管する（この状態で、１ヶ月間活性を保持する。）。
【実施例４】
【０１９０】
試料調製及び保管
次の実施例は、実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて試験しようとする試料の調製及び保管について述べる。本方法において、血清、ＥＤＴＡ血漿又はクエン酸血漿試料を使用し得る。血清試料は、完全に凝血し、目に見える特定の物質を遠心により試料から除去するべきである。セロコンバージョンパネルからの試料をアッセイするために本キットを使用する場合、何らかのさらなる処理なしで供給者により提供されるような試料を使用し得る。
【０１９１】
２から８℃でこの試料を保管する。７２時間以内のアッセイに必要とされない試料を血餅又は細胞ペレットから取り出し、凍結保存する（−１５℃未満）。凍結融解サイクルを複数回繰り返すことは避ける。抗原のみの試料をわずか５回凍結融解することで最大で２５％シグナルを低下させ得るので、特に重要である。融解後、試験前に試料を完全に混合するようにする。
【実施例５】
【０１９２】
半自動化マイクロプレート処理装置に対する方法
次は、半自動化マイクロプレート処理装置を用いて使用することができる代表的方法について述べる。本方法は、実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて行うことができる。全ての試薬及び試料は、使用前に１８から３０℃にする。使用直後、全ての試薬を推奨される保管温度に戻す。試薬とともに使用しようとするガラス器具を２Ｍ塩酸でよく洗浄し、次いで蒸留水又は高品質脱イオン水ですすぐ。
【０１９３】
本方法により、下記で述べるように、プロセス制御監視が可能になる。このアッセイの様々な成分のウェルへの添加は、次の色についてプレートを調べることにより目で見て確認することができる。試料希釈剤の色は緑色である。試料又は対照を添加すると、希釈剤は青色に変色する。この変色は、試料により様々であるが、いくらかの変化が必ず目で見られるはずである。再構成された結合物の色は赤色である。基質溶液は、最初、黄色であり、何らかの反応性のあるウェルは青／緑色になる。停止溶液添加時、反応物の青色／緑色は橙色に変色し、一方、未反応ウェルはピンクに変色する。次のようにマイクロプレートリーダーを使用して、試料又は試薬の添加を確認することができる：試料希釈剤＋試料を５７０又は６２０ｎｍで読み（参照を６９０ｎｍ）、結合物は４９０ｎｍで読み（参照を６９０ｎｍ）、基質溶液は４５０ｎｍで読む（参照なし）。
【０１９４】
本方法は次の段階を含む：
１．洗浄液を調製し、結合物を再構成する。
２．試料希釈剤５０μＬを各ウェルに添加する。
３．試料５０μＬ又は対照５０μＬをウェルに添加する。白色背景の使用により、試料
４．ウェルに蓋をして、３７℃±１℃で６０分間温置する（第一の温置時間）。
５．温置時間の終了時、下記の洗浄手順のようにプレートを洗浄する。洗浄終了後、プレートを裏返し、残存した洗浄液を吸収紙上に軽く叩き出す。
６．各ウェルに結合物１２０μＬをすぐに添加する。
７．ウェルに蓋をして、１５−２８℃で６０分間温置する（第二の温置時間）。
８．基質溶液を調製する。
９．段階５を繰り返す。
１０．プレート洗浄直後に、各ウェルに基質溶液８０μＬを添加する。
１１．ウェルに蓋をして、３７℃±１℃で３０分間温置する（第三の温置時間）。直射日光を避ける。
１２．停止溶液５０μＬを添加する。適切な停止溶液は、０．５Ｍから２Ｍ硫酸を含む。
１３．適用可能な場合は参照波長として６２０ｎｍから６９０ｎｍを用いて、１５分以内に４５０ｎｍで吸収を読む。装置が空の状態でブランクをとる（台部にプレートなし）。
【０１９５】
洗浄手順
推奨される洗浄装置に対する当技術分野で公知のプロトコール及び洗浄装置及び分析装置を検証するための手順を使用することができるか又は次の代表的プロトコールを使用することができる：
自動ストリップ洗浄装置に対するプロトコール
作用強度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）洗浄液を用いて５回の洗浄サイクルを行う。可能な場合、次のことを確認する：
（ｉ）５００μＬ／ウェルの充填体積の貫流洗浄を使用し、及び／又はウェルを完全に満たす。
（ｉｉ）溢れ出さないように、僅かに正のメニスカスとなりウェルを完全に満たすように分注液の高さを設定する。
（ｉｉｉ）１回の吸引／洗浄／浸漬サイクルを完遂するのにかかる時間はおよそ３０秒である。
（ｉｖ）ウェルに液体を残さない（可能であれば最終サイクルで二重吸引段階を使用することにより。）。
（ｖ）洗浄完了後、プレートを裏返し、残った洗浄液を吸収紙上に軽く叩き出す。
（ｖｉ）アッセイ手順中、ウェルを乾燥させない。
【実施例６】
【０１９６】
完全自動化マイクロプレート処理装置のための方法
実施例３に記載の免疫アッセイキット及び実施例５に記載の一般的方法を用いて、完全自動化マイクロプレート処理装置のための温置時間を次のように調整すべきである：
第一及び第二の温置に対して、６０から７０分の間（６５±５分）の温置時間をプログラムし得る。第三の温置に対して、３０及び３５分の間（３２．５±２．５分）の温置時間をプログラムし得る。
【０１９７】
段階４開始前に、試料希釈剤を含有するウェルを最長６０分まで、１８から３０℃に置き得る。
【実施例７】
【０１９８】
結果の解析
実施例３に記載のキット及び実施例５又は６の方法を用いた免疫アッセイの結果を次のように解析することができる。アッセイ結果を計算し、解釈する際、各プレートは別個に考えなければならない。結果の計算及び解釈のために、認可されたソフトウェアを使用し得る。
【０１９９】
陰性対照
陰性対照の平均吸収を計算する。
【０２００】
陰性対照ウェルの１つの吸収が０．２５よりも大きい場合、その値は廃棄し、残りの陰性対照の値を基にカットオフを計算する。
【０２０１】
両方の陰性対照の値が０．２５よりも大きい場合、その測定は無効である。
【０２０２】
カットオフ値
陰性対照の平均吸収に０．２を加えることにより、カットオフ値を計算する。例えば：
陰性対照吸収：ウェル１＝０．１８２
ウェル２＝０．１７２
平均陰性対照＝（０．１８２＋０．１７２）／２＝０．１７７
カットオフ値＝０．１７７＋０．２＝０．３７７
品質管理
対照に対する次の基準に合致する場合、アッセイの結果は有効である：
陰性対照：平均吸収が０．２５未満である。
陽性対照：吸収が陰性対照の平均吸収よりも０．８を上回り高い。
これらの基準に合致しないアッセイは繰り返すべきである。
【０２０３】
結果の解釈
カットオフ値より低い吸収となった試料は、そのアッセイで無反応であるとみなす。
【０２０４】
吸収がカットオフ値以上となった試料は、そのアッセイにおいて初めに反応性があったとみなす。手順について別段の断りがない限り、このような試料は、元の試料を用いて二重に再試験すべきである。二重の再試験の少なくとも１つにおいて反応性がある試料は、ＨＣＶに対して反応性がある。このような試料は、さらに調べ、このアッセイからの結果は、何らかのその他の臨床的及び／又は補足的な試験情報とともに考慮する。再試験において両ウェルで無反応である試料は、このアッセイにおいて無反応とみなすべきである。
【実施例８】
【０２０５】
診断感度の決定
実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）、Ｃ型肝炎感染に罹患している患者からの全部で５０９検体を試験した。
【０２０６】
試験した試料は全て、反応性があることが分かった。この検体集団における本方法の診断感度は１００％（５０９／５０９）（二項分布により９９．２８％の下側９５％信頼限界であると推定。）であることが分かった。
【０２０７】
全部で２６５検体を含む、３０種類の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ及びＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）での性能を評価することにより、抗体単独アッセイと比較したＨＣＶ感染の初期段階での検出効率についても、本方法の性能を試験した。結果を表９で示す。これらの試験において、本方法は、１９６検体を陽性として検出し、一方、抗ＨＣＶ抗体に対する確立されたアッセイによって９４検体が陽性として検出された。最初の検出までの時間については、これは、本方法において、抗体単独アッセイよりも平均２０．５７日早く検出することと同等である（０日から７２日早い）。
【０２０８】
この研究において、３０種類のセロコンバージョンパネルのうち１０種類が、核酸検出及び血清学的アッセイの両方により陰性となった初期検体を含んでいた。これらの１０種類のパネルにおいて性能を比較した場合、本方法は、ＨＣＶ抗体アッセイよりも平均３３．２日早く、核酸試験（ＮＡＴ）よりも平均でわずか１．０日遅いだけで感染を検出した。
【０２０９】
【表９】
【実施例９】
【０２１０】
診断特異性の判定＃１
血液ドナー集団における特異性＞９９．５％のＣｏｍｍｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００２／３６４／ＥＣ）の必要条件に合致させるために、実施例３に記載の免疫アッセイ及び実施例５及び６で全般的に述べる方法を設計したが、この方法は、主要な血液ドナーセンターでの実地試験においてこの必要条件を超えていた。実施例３に記載の免疫アッセイキットを用いて（実施例６で全般的に述べる完全自動化法を用いて）、所定のドナー検体からの全部で８２９２検体を２ヶ所の血液ドナーセンターでスクリーニングした。
【０２１１】
この試験において、検体の９９．８２％（８２７７／８２９２）が無反応であった（二項分布により、９９．７０％の下方９５％信頼限界）。陰性であると予想される全部で１５／８２９２の検体が、この方法を用いて繰り返し反応性があった（０．１８％）。この試験の２つのその他の検体が本発明による方法を用いて陽性であると同定され、ＰＣＲで陽性であったが、ＨＣＶ抗体は陰性であった。
【０２１２】
ＨＣＶ感染とは無関係な状態の患者からの全部で３７６検体の、交差反応性の可能性がある検体も試験した。これらには、妊娠女性、自己免疫疾患及びその他の急性ウイルス感染罹患患者からの検体が含まれていた。これらの検体の１つが、本発明による方法を用いて反応性があることが分かり、これにより、この特定の集団において、９９．７３％の診断特異性（９８．５３％の下方９５％信頼限界）となった。本組み合わせアッセイ及びＰＣＲを用いて陽性と同定されたがＨＣＶ抗体アッセイで陰性となった１検体は真陽性として排除された。
【実施例１０】
【０２１３】
再現性の判定
４回の別個の機会において５種類のパネルメンバーを１０回反復して試験することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例６で全般的に述べる完全自動化法を用いて）の再現性を評価した。この試験からの結果を表１０及び１１でまとめる。
【０２１４】
【表１０】
【０２１５】
【表１１】
【実施例１１】
【０２１６】
ＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０７に対する感度の評価
市販のセロコンバージョンパネル（ＢＢＩ ＰＨＶ９０７、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ）を用いて、ＰＣＲによりＨＣＶを検出する方法（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））又は抗ＨＣＶ抗体を検出することによりＨＣＶを検出する方法（Ｍｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ３．０抗体及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０抗体）と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。ＰＣＲ及び抗ＨＣＶ抗体データを供給業者のパネルデータシートから得た。比較の結果を表１２で示す（抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイに対して１．０より大きい値は陽性であるとみなす。）。
【０２１７】
【表１２】
【０２１８】
この結果から、本組み合わせアッセイは、抗ＨＣＶ抗体のみを検出するＭｕｒｅｘ Ｖ３及びＭｕｒｅｘ Ｖ４アッセイよりも１３日早くＨＣＶ感染を検出することができることが示された。この結果から、また、市販のセロコンバージョンパネルの全てがＰＣＲ陰性の初回血液を有する訳ではないことも示される。
【実施例１２】
【０２１９】
Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓセロコンバージョンパネル６２２２に対する感度の評価
ＰＣＲにより又は抗ＨＣＶ抗体を検出することにより（Ｍｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ ｖ３．０（ＶＫ４７／４８）及びＭｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ ｖ４．０（０７Ｆ５１））ＨＣＶを検出する方法と比較して、別の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、セロコンバージョンパネル６２２２）に対する実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。この比較の結果を表１３で示す（抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイに対して１．０よりも大きい及びＰＣＲアッセイに対して０よりも大きいこの表の値を陽性であるとみなす。）。
【０２２０】
【表１３】
【０２２１】
この結果から、本組み合わせアッセイが、抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用されるアッセイよりも２３日早くＨＣＶ感染を検出することができることが示された。
【実施例１３】
【０２２２】
Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓセロコンバージョンパネル６２１１に対する検出時間の評価
ＰＣＲによりＨＣＶを、抗ＨＣＶ抗体（オルト３）又はＨＣＶ抗原（オルトＨＣＶ抗原）を検出する方法を用いた検出時間と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）を用いた検出時間を評価した。別の市販のセロコンバージョンパネル（Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、セロコンバージョンパネル６２１１）に対して、検出時間を測定した。この比較の結果を表１４で示す（抗体（Ａｂ）、抗原及び組み合わせアッセイに対して１．０よりも大きい値及びＰＣＲアッセイに対して０よりも大きい値を陽性であるとみなす。）。
【０２２３】
【表１４】
【０２２４】
この結果から、本組み合わせアッセイが、試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用されるアッセイよりも４６日早くＨＣＶ感染を検出できることが示された。この結果から、また、検出時間の改善が本方法を試験するために使用されたパネルにより変動することも示される。
【実施例１４】
【０２２５】
ＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９１７に対する感度の評価
ＰＣＲによりＨＣＶ（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））又は抗ＨＣＶ抗体（オルト）を検出する方法の感度と比較して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の感度を評価した。市販のＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９１７に対して、感度を測定した。この比較の結果を表１５で示す。Ｏ．Ｄ．は光学密度を指し、Ｓ／ＣＯは、試料／カットオフ値を指す。表１４において、抗体（Ａｂ）及び組み合わせアッセイ（Ｓ／ＣＯ）に対して１．０よりも大きい値は陽性であるとみなす。
【０２２６】
【表１５】
【０２２７】
ＰＨＶ９１７は、初期抗原ピークを示すセロコンバージョンパネルの一例であり、この結果から、本組み合わせアッセイが、抗体単独アッセイよりも７２日早く陽性の結果を与えたことが示される。ＮＡＴ（Ｒｏｃｈｅ ＰＣＲアッセイ）は、本組み合わせアッセイと同じ血液を陽性であるとして検出したが、後の血液では検出レベルを下回った（これは、おそらく、患者が血流から循環ウイルスを排除するためである。）。このようにして、これらの結果から、また、ＨＣＶ ＲＮＡ及び抗原ピークが一過性であり得ることも示された。
【実施例１５】
【０２２８】
全体的な感度
実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５で全般的に述べる半自動化法を用いて）の診断感度の代表例として、３４種類の市販のセロコンバージョンパネルに対してこのキットを評価し、これらの結果をＭｕｒｅｘ 抗ＨＣＶ バージョン４．０（０７Ｆ５１）、オルト抗ＨＣＶ３（ＳＡＶｅ）抗体アッセイ及び核酸試験（ＮＡＴ）データ（Ｒｏｃｈｅ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（Ｒ））に対する公開データと比較した。
【０２２９】
３４種類のセロコンバージョンパネルからの陽性の血液数を評価した。ＮＡＴの場合に陽性である血液の数は２３１であった。本組み合わせアッセイの場合、陽性である血液の数は２１３であり、抗体単独アッセイの場合、陽性である血液の数は１０３であった。従って、試験した３４種類のセロコンバージョンパネルのうち、本組み合わせアッセイは、ＮＡＴ陽性試料の８４．８６％を検出した（２１３／２５１）。さらに、３４種類のパネルのうち２４種類において（７３．５％一致）、本組み合わせアッセイは、核酸試験（ＮＡＴ）を用いる方法と同じ血液又は時間点で感染を検出した。一方、抗ＨＣＶ抗体単独検出を使用する方法は、ＮＡＴを用いた方法と同じく陽性血液を検出することができたのは、３４パネルのうち３パネルであった（８．８％一致）。
【０２３０】
さらに、いくつかの市販のアッセイ（「オルト３」、「Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｌｕｓ」、「ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）」及び「ＡＸＳＹＭ（Ｒ）３．０」）及び本組み合わせアッセイを用いた最初の検出までの平均時間を、クラス抗体アッセイにおける理論上最善のものと比較した。第０日は、単一のセロコンバージョンパネルに対して測定した場合の何らかの市販抗体単独アッセイからの利用可能な最善データから生成される。試験した３２／３４セロコンバージョンパネルにおいて、本組み合わせアッセイは、最も感度が高い酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）である。本組み合わせアッセイによって、クラス抗体アッセイ中で理論的に最善のものよりも平均で１２．７日早くなり、オルト抗ＨＣＶ ３（ＳＡＶｅ）よりも平均で１４．３５日早くなる。本明細書中に記載のものを含むさらなる実験からの結果とともに、これらの結果から、本組み合わせアッセイが、少なくとも２週間、抗体単独アッセイに対して感染潜伏期間を狭めることが分かる。
【実施例１６】
【０２３１】
診断特異性の判定＃２
全部で３２１７検体のＵＫドナー検体に対して、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、の診断特異性を試験した。この結果を表１６で示す。
【０２３２】
【表１６】
【０２３３】
様々な臨床状態の２０２検体における診断特異性が９９．５％であることが分かった。本組み合わせアッセイ及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０Ａｂの両方で全試料が一致して陽性であった。
【実施例１７】
【０２３４】
ＨＣＶ感染の早期検出
本組み合わせアッセイ及びＭｕｒｅｘ ＨＣＶ ｖ４．０Ａｂアッセイを用いたスクリーニング３０／３２セロコンバージョンパネルからの結果（表１６参照）を比較することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、に対する最初の検出時間の平均改善度を評価した。単離された初期血液が抗原陽性である一方、これらのパネルは最初の検出後本組み合わせアッセイにおいて変わらずに陽性のままではなく、それ故に、改善した日数を真に反映したものではないので、２／３２パネル（６２２８及びＳＣ−Ｔ０４０２）を排除した。
【０２３５】
ＨＣＶ抗体アッセイと比較した、本組み合わせアッセイに対する最初の検出時間の観察平均改善日数は、２０．５７日であった（表１７参照）。
【０２３６】
【表１７】
【実施例１８】
【０２３７】
別の市販ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイ感度に対する比較
実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）、本「組み合わせアッセイ」、の性能を市販のＢｉｏＲａｄ ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ Ａｇ−Ａｂ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔの性能と比較した。製造者の説明書に従いＢｉｏＲａｄキットを使用した。
【０２３８】
比較のために、次の２８のセロコンバージョンパネルを使用した：ＰＨＶ９０７、ＰＨＶ９０１、ＰＨＶ９１５、ＰＨＶ９０８、ＰＨＶ９０５、ＰＨＶ９１１、ＰＨＶ９０９、ＰＨＶ９１２、ＰＨＶ９１０、ＰＨＶ９１４、ＰＨＶ９１３、ＮＡＢＩ Ａ、ＰＨＶ９１６、ＳＣ−４０２、ＳＣ−４００、ＳＣ−４０６、ＢＣＰ６２１２、ＢＣＰ６２２４、ＢＣＰ６２１１、ＢＣＰ６２２６、ＢＣＰ６２１３、ＢＣＰ６２１４、ＢＣＰ６２１５、ＢＣＰ６２２２、ＢＣＰ６２２４、ＢＣＰ６２２５、ＢＣＰ６２２７及びＢＣＰ６２２８。試験した２５／２８パネルにおいて、本組み合わせアッセイは、ＨＣＶ抗体単独アッセイよりも早く感染を検出し、１７／２８パネルにおいて、本組み合わせアッセイは、競合物Ａｇ／Ａｂアッセイよりも早く感染を検出した。競合物Ａｇ／Ａｂは、２／２８のアッセイでは先んじており、８パネルでは同等であった。この試験において、本組み合わせアッセイにより、ＨＣＶ抗体アッセイと比較して、検出までの平均時間が１４．４日短縮され、競合物ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイよりも４．６日早くなった。
【０２３９】
２８パネルのうち９パネルにおいては、これらのパネルでの初期試料がＰＣＲ陰性なので、潜伏期間全体に相当する。これらのパネルにおける性能を表１８でまとめる。
【０２４０】
【表１８】
【実施例１９】
【０２４１】
別の市販ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂアッセイとの比較−検出の限界
Ｌａｐｅｒｃｈｅら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４５：１９６５−１９７２（２００５））に記載の方法に従い、コピー／ｍＬ核酸の点での検出限界の理論的限界について、市販のセロコンバージョンパネルからのＰＣＲ陽性／抗体陰性試料の集団におけるウイルス量に対してＳ／ＣＯ比を比較することにより、実施例３に記載の免疫アッセイキット（実施例５及び６で全般的に述べる方法を用いて）を評価した。元の論文からの４３／４４試料がこの試験に対して利用可能であった（表１９参照）。この方法によって、市販のＢｉｏＲａｄ ＭｏｎｏＬｉｓａ（Ｒ）ＨＣＶ Ａｇ−Ａｂ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔもまた、評価した。製造者の説明書に従い、ＢｉｏＲａｄのキットを使用した。
【０２４２】
この結果を表１９及び図６Ａ及びＢで示し、表２０でまとめる。
【０２４３】
Ｌｎ Ｓ／ＣＯに対してｌｏｇ１０ウイルス量をプロットし、Ｌｎ Ｓ／ＣＯ＝０で切片をとる（即ちＳ／ＣＯ＝１である点）ことによって、ウイルス量の終点を予想した。この結果から、本発明による組み合わせアッセイは、競合物Ａｇ／ＡｂアッセイよりもＨＣＶを早く高感度に検出することが分かる。
【０２４４】
【表１９】
【０２４５】
【表２０】
【０２４６】
ある一定の具体的な実施形態に関して本発明を説明してきたが、本明細書に添付の特許請求の範囲で概説されるような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その様々な変更が当業者にとって明らかであろう。
【０２４７】
この明細書において参照される、公開特許出願を含む、全ての特許、刊行物及びデータベースエントリーの開示は、かかる個々の特許、刊行物及びデータベースエントリーのそれぞれが、具体的かつ個々に、参照により組み込まれることが示されるように、その全体において具体的に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の抗原性タンパク質及び前記抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出し、１以上の免疫優勢ペプチド及び１以上の特異的抗体からなる試薬を選択するための方法であって、
ｉ）ペプチドのライブラリを提供する段階、ここで、各前記ペプチドは前記抗原性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有し、前記候補ペプチドの前記アミノ酸配列は重複する；
ｉｉ）前記微生物に感染した対象からの血清試料とペプチドの前記ライブラリを接触させる段階；
ｉｉｉ）陰性対照血清試料とペプチドの前記ライブラリを接触させる段階；
ｉｖ）段階（ｉｉ）の前記血清試料の複数において抗体に結合し、段階（ｉｉｉ）の前記陰性対照血清試料において抗体に結合しない候補ペプチドを選択して、候補ペプチドを提供する段階；
ｖ）前記候補ペプチドの１以上の配列を含む免疫優勢ペプチドを調製する段階；
ｖｉ）１以上の候補抗体と前記免疫優勢ペプチドを接触させる段階；及び
ｖｉｉ）前記特異的抗体を提供するために、前記免疫優勢ペプチドに結合しない１以上の抗体を選択する段階
を含む方法。
【請求項２】
前記抗原性タンパク質がＣ型肝炎ウイルスコアタンパク質である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１】
微生物の抗原性タンパク質及び前記抗原性タンパク質に対する抗体を同時に検出し、１以上の免疫優勢ペプチド及び１以上の特異的抗体からなる試薬を選択するための方法であって、
ｉ）ペプチドのライブラリを提供する段階、ここで、各前記ペプチドは前記抗原性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有し、前記候補ペプチドの前記アミノ酸配列は重複する；
ｉｉ）前記微生物に感染した対象からの血清試料とペプチドの前記ライブラリを接触させる段階；
ｉｉｉ）陰性対照血清試料とペプチドの前記ライブラリを接触させる段階；
ｉｖ）段階（ｉｉ）の前記血清試料の複数において抗体に結合し、段階（ｉｉｉ）の前記陰性対照血清試料において抗体に結合しない候補ペプチドを選択して、候補ペプチドを提供する段階；
ｖ）前記候補ペプチドの１以上の配列を含む免疫優勢ペプチドを調製する段階；
ｖｉ）１以上の候補抗体と前記免疫優勢ペプチドを接触させる段階；及び
ｖｉｉ）前記特異的抗体を提供するために、前記免疫優勢ペプチドに結合しない１以上の抗体を選択する段階
を含む方法。
【請求項２】
前記抗原性タンパク質がＣ型肝炎ウイルスコアタンパク質である、請求項１に記載のプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１８５１６５（Ｐ２０１２−１８５１６５Ａ）
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−８０２０９（Ｐ２０１２−８０２０９）
【出願日】平成２４年３月３０日（２０１２．３．３０）
【分割の表示】特願２００９−５２６８８２（Ｐ２００９−５２６８８２）の分割
【原出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−８０２０９（Ｐ２０１２−８０２０９）
【出願日】平成２４年３月３０日（２０１２．３．３０）
【分割の表示】特願２００９−５２６８８２（Ｐ２００９−５２６８８２）の分割
【原出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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