組換え微生物
【課題】タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供。
【解決手段】枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【解決手段】枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの製造に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
しかしながら、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するために多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地と安定な培養条件が用いられる工業的生産においては、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不必要な遺伝子発現も多く、上記のような取り組みにも関わらず、必ずしも生産効率が高いとは言えない状況であった。
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要或いは有害な働きをする遺伝子群について、検討したところ、枯草菌等の微生物の特定の遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物は、目的タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要、或いは有害な遺伝子が欠失、又は不活性化されているため、エネルギーロス、炭素源、窒素源といった培地成分の浪費を抑え、また、不必要な遺伝子が機能しなくなることでタンパク質又はポリペプチドの生産期間を長期化することによって効率よく目的物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１１】
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要な遺伝子、具体的には枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、枯草菌などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもBacillus属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１２】
本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。
【００１３】
本発明において欠失、又は不活性化の対象となる遺伝子は、枯草菌ゲノム上に存在する枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子である。yvyD遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなり、機能未知遺伝子として公開されている（J Bacteriol. 1998 180(24) 6674-6680）。斯かる遺伝子は、目的タンパク質又はポリペプチドの生産には直接関与しておらず、通常の工業的生産培地における微生物の生育にも不要であることが本発明者らにより見出されている。
【００１４】
また、配列番号１に示す枯草菌遺伝子yvyDと塩基配列において80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、枯草菌遺伝子yvyDに相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。尚、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
斯かる遺伝子を欠失又は不活性化することにより、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要な、或いは有害な遺伝子の発現が生じないため、当該タンパク質又はポリペプチドの生産において、当該タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上が達成されると考えられる。
【００１６】
本発明の微生物の構築には、yvyD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子以外の遺伝子群の欠失又は不活性化や上記以外の遺伝子の発現及び機能の強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。また、本発明は目的遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても目的遺伝子を不活性化することができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方法がより望ましい。
【００１７】
遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、yvyD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００１８】
標的とする遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２箇所（好ましくは、上流側、下流側それぞれ1箇所）で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００１９】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２０】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２１】
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２２】
本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片と、同じく下流に隣接する約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２３】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２４】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、標的遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００２５】
かくして得られた欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。即ち、表１に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。
【００２６】
次に、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物変異株に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００２７】
目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号573〜3044によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号610〜3075によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００２８】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号162〜1664によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００２９】
また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号２で示される塩基配列の塩基番号1〜659、または、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号1〜696、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関る機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３０】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３１】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３２】
以上より、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物変異株、及び当該変異株を用いて組換え微生物を構築することができ、これを用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。また、上記遺伝子の欠失と、その他の遺伝子群の欠失又は不活性化を組合せることや、上記遺伝子の欠失と、その他の遺伝子の発現或いは機能の強化を組合せることにより、有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することが可能な組換え微生物を構築することができる。
【００３３】
以下に、当該発明の組換え微生物の構築方法と及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼ及びアミラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３４】
実施例１
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したyvyD FW1とyvyD/Sp R、及びyvyD/Sp FとyvyD RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のyvyD遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片（A）、及び下流に隣接する1.0kbp断片（B）をそれぞれ調製した。また、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpDG1727[Gene, 167, 335, (1995)]を鋳型とし、表１に示したSp F及びSp Rのプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子領域（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）３断片を混合して鋳型とし、yvyD FW2とyvyD RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、３断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いて、コンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってyvyD遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換され、結果として目的とする遺伝子欠失株となっていることを確認した。以上のようにしてyvyD欠失株（168ΔyvyD）を作製した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
実施例２（セルラーゼ生産性評価）
実施例１にて得られた168ΔyvyD株、及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で30℃で15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6ｍLを30ｍLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った（この際、測定誤差を算出する目的で培養を３回行っている）。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとし、生産性比較は、野生株である枯草菌168株の生産性を100%とする相対値により比較した（表２）。この結果、宿主として168ΔyvyD株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【００３７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの製造に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
しかしながら、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するために多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地と安定な培養条件が用いられる工業的生産においては、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不必要な遺伝子発現も多く、上記のような取り組みにも関わらず、必ずしも生産効率が高いとは言えない状況であった。
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要或いは有害な働きをする遺伝子群について、検討したところ、枯草菌等の微生物の特定の遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物は、目的タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要、或いは有害な遺伝子が欠失、又は不活性化されているため、エネルギーロス、炭素源、窒素源といった培地成分の浪費を抑え、また、不必要な遺伝子が機能しなくなることでタンパク質又はポリペプチドの生産期間を長期化することによって効率よく目的物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１１】
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要な遺伝子、具体的には枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、枯草菌などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもBacillus属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１２】
本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。
【００１３】
本発明において欠失、又は不活性化の対象となる遺伝子は、枯草菌ゲノム上に存在する枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子である。yvyD遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなり、機能未知遺伝子として公開されている（J Bacteriol. 1998 180(24) 6674-6680）。斯かる遺伝子は、目的タンパク質又はポリペプチドの生産には直接関与しておらず、通常の工業的生産培地における微生物の生育にも不要であることが本発明者らにより見出されている。
【００１４】
また、配列番号１に示す枯草菌遺伝子yvyDと塩基配列において80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上100％未満の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、枯草菌遺伝子yvyDに相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。尚、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
斯かる遺伝子を欠失又は不活性化することにより、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要な、或いは有害な遺伝子の発現が生じないため、当該タンパク質又はポリペプチドの生産において、当該タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上が達成されると考えられる。
【００１６】
本発明の微生物の構築には、yvyD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子以外の遺伝子群の欠失又は不活性化や上記以外の遺伝子の発現及び機能の強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。また、本発明は目的遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても目的遺伝子を不活性化することができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方法がより望ましい。
【００１７】
遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、yvyD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００１８】
標的とする遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２箇所（好ましくは、上流側、下流側それぞれ1箇所）で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００１９】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２０】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２１】
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２２】
本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片と、同じく下流に隣接する約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２３】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２４】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、標的遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００２５】
かくして得られた欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。即ち、表１に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。
【００２６】
次に、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物変異株に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００２７】
目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号573〜3044によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号610〜3075によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００２８】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号162〜1664によりコードされるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００２９】
また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号２で示される塩基配列の塩基番号1〜659、または、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号1〜696、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関る機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３０】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３１】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３２】
以上より、枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した宿主微生物変異株、及び当該変異株を用いて組換え微生物を構築することができ、これを用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。また、上記遺伝子の欠失と、その他の遺伝子群の欠失又は不活性化を組合せることや、上記遺伝子の欠失と、その他の遺伝子の発現或いは機能の強化を組合せることにより、有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することが可能な組換え微生物を構築することができる。
【００３３】
以下に、当該発明の組換え微生物の構築方法と及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼ及びアミラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３４】
実施例１
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したyvyD FW1とyvyD/Sp R、及びyvyD/Sp FとyvyD RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のyvyD遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片（A）、及び下流に隣接する1.0kbp断片（B）をそれぞれ調製した。また、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpDG1727[Gene, 167, 335, (1995)]を鋳型とし、表１に示したSp F及びSp Rのプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子領域（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）３断片を混合して鋳型とし、yvyD FW2とyvyD RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、３断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いて、コンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってyvyD遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換され、結果として目的とする遺伝子欠失株となっていることを確認した。以上のようにしてyvyD欠失株（168ΔyvyD）を作製した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
実施例２（セルラーゼ生産性評価）
実施例１にて得られた168ΔyvyD株、及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で30℃で15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6ｍLを30ｍLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った（この際、測定誤差を算出する目的で培養を３回行っている）。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとし、生産性比較は、野生株である枯草菌168株の生産性を100%とする相対値により比較した（表２）。この結果、宿主として168ΔyvyD株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【００３７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項２】
枯草菌遺伝子yvyDに相当する遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子である請求項１記載の組み換え微生物。
【請求項３】
微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項１又は２記載の組換え微生物。
【請求項４】
異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項５】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したものである請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項４又は５記載の組換え微生物。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項５記載の組換え微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
枯草菌遺伝子yvyD又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項２】
枯草菌遺伝子yvyDに相当する遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子である請求項１記載の組み換え微生物。
【請求項３】
微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項１又は２記載の組換え微生物。
【請求項４】
異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項５】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したものである請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである請求項４又は５記載の組換え微生物。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項５記載の組換え微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２２５７１１（Ｐ２００９−２２５７１１Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７４２５２（Ｐ２００８−７４２５２）
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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