肝臓中の脂質代謝促進剤、肝臓中の脂質代謝促進健康食品及びその有効成分であるペプチド混合物の製造法
本発明は肝臓での脂質代謝を促進し、肝臓での脂質代謝異常と関連する生活習慣病などを改善あるいは予防すべく、そのための有効な肝臓内脂質代謝促進剤或いは健康食品を提供することを目的とした。 そして、親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進剤または健康食品を完成した。 また、蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により分解し、疎水性樹脂で処理することを特徴とするペプチド混合物の製造法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓中の脂質代謝促進剤、肝臓中の脂質代謝促進健康食品及びその有効成分であるペプチド混合物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓はヒトの臓器の中で最大のものであり、体重の約５０分の１に相当する。その生理機能の内容は極めて多岐に渡り、糖質、タンパク質代謝、脂質・エネルギー代謝の中心的役割を演じ、更に物質の貯蔵、解毒、造血、血液凝固など生体の生命維持に必要不可欠なものが多い。
【０００３】
肝臓細胞が担当する脂質代謝機能は体内の脂質代謝機能と深く連動しており、肝臓の脂質代謝機能低下、更に機能不全が原因の一つとなり、高脂血症、高血圧、動脈硬化、肥満、脂肪肝、糖尿病および高血圧などの疾患がもたらされる。この肝臓での脂質代謝機能不全を改善するためには、脂質代謝を促進し、細胞内に蓄積される脂質濃度を低下させることが重要であると考えられている。
【０００４】
近年、食品中に含有される成分の疾病予防および治療効果が注目されており、前記の循環器系の疾患に対しても、食品成分による予防および治療効果を得られるものの開発が期待されている。
【０００５】
いくつかの蛋白質やその加水分解物（ペプチド）を由来とする脂質代謝改善剤はすでに知られている。蛋白質の脂質代謝改善効果においては動物性蛋白質より植物性蛋白質、特に大豆蛋白が優れていることが知られている。これらたんぱく質の加水分解物（ペプチド）に関しては、以下のようにいろいろな蛋白由来の物が知られているし、その作用効果もさまざまである。
【０００６】
まず、大豆蛋白質の加水分解物以外の脂質改善剤として、例えば、特開昭５２−８３８１６号公報（新規ポリペプチド）、特開平０４−１４９１３７号公報（ダイエツト剤）、特開平０６−２１１６９０号公報（カゼイン由来の血中脂質抑制用摂食物）、特開平１１−８０００６号公報（脂質吸収抑制剤）、特開２０００−２６４８４５号公報（魚由来のコレステロール降下剤）、特開２０００−２２８９６７号公報（脂質代謝加工食品）、特開２００１−２５７７号公報（ローヤルゼリー由来の脂質代謝改善剤）、特開２００１−５７８６８号公報（畜産加工廃液由来の脂質代謝改善用素材）、特開２００１−５７８６９号公報（肥満改善及びダイエツト食用素材）、特開２００１−５８９５５号公報（生理活性ペプチド放性製剤）、特開平０８−１５７３８９号公報（高トリグリセリド血症治療剤）、特開平０９−１５７２９０号公報（コレステロール低減化ペプチド）、特開平０９−２５５６９８号公報（血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド）、特開平０７−１８８２８４号公報（血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド）などが知られている。
【０００７】
一方蛋白質を加水分解したペプチドにも脂質代謝を改善する効果に関してはいろいろと知られている。例えば、特開平５−８７０５２号公報では、脂質代謝改善剤において肝臓中の脂肪含量および脂肪小滴量を低下させる効果があるとしているが、これは有効成分である低分子ペプチドがリパーゼ活性を抑えるため吸収される脂肪含量が低下し、血清中の脂肪含量が低下するために生じるためであり、肝臓内での脂質代謝活性自体を変化させる効果ではない。
また、蛋白加水分解した低分子ペプチドでは、例えば、特開平０４−１４９１３７号公報（ダイエツト剤）が知られているが、これはジペプチド及びトリペプチドを主成分とするもので脂肪蓄積抑制作用、体重増加抑制作用に関して述べられているが肝臓の脂質代謝改善効果については述べられていない。
また生理活性用組成物として特開平１０−２０３９９４号公報の中で大豆蛋白分解物由来の分子量５００〜５０００のペプチドに血液中の中性脂肪ならびにＨＤＬ−コレスレロールを増加させる効果のあることを述べているが、肝臓中の脂肪酸代謝を促進するペプチドについては知られていない。
【０００８】
大豆蛋白質は植物性蛋白質の中で栄養性が優れているだけでなく、近年では様々な生理活性が見出され、生理機能剤としても注目される食品素材である。大豆蛋白質に関しては肥満を抑制する効果があることは知られているが、その体脂肪率を下げるメカニズムに関しては肝臓での脂肪酸生合成酵素の活性が抑えるためであると知られている（入谷らＪ．Ｎｕｔｒ．，１２６，３８０，１９９６）、しかし、大豆蛋白質中のどの成分が有効成分であるかは知られていない。
【０００９】
本出願人は継続して大豆蛋白加水分解物（ペプチド混合物）の生理作用、特に脂質代謝に関する研究を行ってきた。例えば、特公平７−０２５７９６号公報に開示するように大豆蛋白加水分解物（オリゴペプチド混合物）が血中コレステロールの上昇を抑制すること、特開平１−２６９４５６号公報や特開平３−２７２６９４号公報に開示するようにコレステロールや中性脂肪の代謝に関与することを開示してきた。しかし、体内の脂質代謝のなかでも肝臓内の脂質代謝を促進し、肝臓内の脂質濃度を改善するペプチドに関しては明らかではなかった。また、大豆蛋白酵素分解物に関して肝臓内のトリグリセリド含量が低下することは特開平４−５１８７２において引用データで述べられているにとどまっている。大豆蛋白質およびその酵素分解物中には肝臓の脂肪酸生合成酵素の活性を抑える成分が含まれていることは類推されるが、どのような成分が効果を発揮するか特定するには至っていなかった。
【００１０】
近年、加水分解したペプチドをさらに精製し機能成分を分画する試みがなされている。たとえば、特開平０７−１８８２８４号公報ではイオン交換樹脂−限外ろ過、さらには逆相クロマトにより分画された疎水性アミノ酸含量の高い画分に血中ＴＧ上昇抑制作用示すことが知られている。特開２００２−２１２０９７号公報において乳由来の塩基性ペプチド画分の脂質代謝改善剤が知られているが陽イオン交換体を用いて製造されており、またグルタミン酸＋アスパラギン酸含量も３０％以下と本発明とは異なるものである。
本発明のように苦味を感じず、酸性アミノ酸含量が高い肝臓中の脂質代謝促進剤は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は肝臓での脂質代謝を促進し、肝臓での脂質代謝異常と関連する生活習慣病などを改善あるいは予防すべく、そのための有効な肝臓内脂質代謝促進剤或いは健康食品を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究するなかで酸性アミノ酸（グルタミン酸やアスパラギン酸）が豊富でその割合の大きいペプチド混合物が肝臓内の脂質代謝を促進する知見を得て本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進剤である。親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下が好ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進剤が好ましい。また、本発明は、蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により分解し、疎水性樹脂で処理することを特徴とするペプチド混合物の製造法である。蛋白質は大豆蛋白質が好ましい。疎水性樹脂はスチレンジビニルベンゼン系の樹脂が好ましい。
また、本発明は、親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進健康食品である。親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下が好ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進健康食品が好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により肝臓の脂質代謝を促進するオリゴペプチド混合物が得られ、肝臓での脂肪酸の生合成を抑制することから、肝臓でのトリグリセリド濃度異常が原因され肥満、高トリグリセリド血症、脂肪肝、糖尿病または高血圧症に代表される生活習慣病、冠動脈疾患、脳動脈疾患、慢性腎炎、ネフローゼ、肝硬変、閉塞性黄疸等を予防・改善することが期待され、食品、健康食品、および医薬品への応用が可能になったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、本発明の肝臓中の脂質代謝促進剤について説明する。この肝臓中の脂質代謝促進剤は、親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とするものである。ここで、重要なことはこの肝臓中の脂質代謝促進ペプチド混合物が水不溶画分を含まず親水性アミノ酸から成ることであり、かつ酸性アミノ酸の割合が多いことである。親水性アミノ酸としてはグリシニン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、シスチン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（酸）（Ａｓｐ）、グルタミン（酸）（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）があげられるが、この親水性ペプチドの構成アミノ酸中で酸性アミノ酸の割合が３０〜７０重量％（以下単に％と記載する）、好ましくは３５〜５５％が適当である。尚、酸性アミノ酸としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等が挙げられるが、グルタミンとグルタミン酸が好ましい。グルタミン酸あるいはグルタミンの割合が多いほど肝臓内の脂質代謝促進効果に優れる傾向にある。グルタミン酸あるいはグルタミンの割合が３０％未満では公知の大豆ペプチド混合物より優れた肝臓内の脂質代謝促進効果を奏しない。
【００１５】
また、構成アミノ酸の中で特にプロリン含量が５％以下、好ましくは３％以下、特に１％以下であることが脂肪酸の合成抑制の点から望ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１０．５％以下、芳香族アミノ酸が８．０％以下、プロリンが５％％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進剤が適当である。このペプチド混合物の平均分子量が肝臓内の脂質代謝促進効果に寄与するかは定かでないが、消化管吸収速度は小さいほど早いので酵素分解の態様により通常２００〜２００００とすることが出来、酵素分解の方法によっては５００〜３０００とすることが出来る。遊離アミノ酸含量は肝臓内の脂質代謝促進に関与する効果は定かではないが、ペプチド混合物としては少ないほうが好ましく、通常３５％以下、好ましくは１０％以下が適当である。肝臓内の脂質代謝促進効果は定かでないが、本発明において、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下であることが望ましい。本発明の肝臓内の脂質代謝促進剤や健康食品の風味やその安定性の点で、疎水性アミノ酸の含量は少なければ少ない程好ましく、分岐鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸などは前記範囲が好ましい。
【００１６】
尚、本発明の肝臓内の脂質代謝促進は肝臓中の脂肪酸の生合成を抑制することである。すなわち肝臓中で、アセチル−ＣｏＡから脂肪酸を合成する一連の酵素であるＡｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＴＰｃｉｔｒａｔｅ−ｌｙａｓｅ、Ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの酵素活性を抑制し、並びに
Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅおよびＦａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅなどのｍＲＮＡの発現を抑制する脂質代謝促進であり、肝臓中に蓄積されるトリグリセリドおよびコレステロール含量を低下させる効果がある。
【００１７】
従って、本発明の肝臓内脂質代謝改善ペプチド混合物は脂肪酸の合成抑制を基礎とする疾患の予防・治療用の医薬品や健康食品として用いることができる。医薬品として用いる肝臓内の脂質代謝促進剤は、オリゴペプチド混合物として剤中に０．０１％以上、好ましくは０．１％以上含有することが出来る。０．０１％未満では、実質的な効果を認めるのが困難である。また、１日摂取又は投与量は、オリゴペプチド混合物として、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／日以上、更に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ／日以上が適当である。０．１ｍｇ／ｋｇ／日未満では効果が認められない場合がある。また、健康食品としての肝臓内の脂質代謝促進健康食品も同様のペプチド混合物の含有量と摂取量で同様の効果を奏する。この様にして本発明の肝臓内の脂質代謝促進剤及び肝臓内の脂質代謝促進健康食品は、肝臓での脂質代謝を顕著に促進することより、肝臓での脂質代謝異常、具体的にはトリグリセリドの濃度異常により引き起こされる、肥満、高トリグリセリド血症、脂肪肝、糖尿病または高血圧症の予防・改善を目的とする剤または食品として利用することが出来る。食品として利用する場合、経口栄養食、経管栄養食等の使用形態に応じ、溶液のままや濃縮液・凍結乾燥物・噴霧乾燥物の原材料として使用することができる。摂食物としては広く各種の食品が含まれ、例えば飲料、冷菓、タブレット、菓子等を挙げることができる。また、通常の食品の形態でないカプセルとか錠剤として健康食品として用いることも出来る。
【００１８】
次に、本発明の肝臓中の脂質代謝促進に有効なペプチド混合物の製造法について説明する。本発明の肝臓中の脂質代謝促進ペプチド混合物は大豆蛋白を酵素で分解することにより得ることが出来る。本発明に用いる大豆蛋白は安価に手に入る材料として、豆乳、濃縮大豆蛋白、あるいは分離大豆蛋白、脱脂大豆、大豆ホエー蛋白などを使用し得るが、その中で分離大豆蛋白が好ましい。酵素処理に供する大豆蛋白溶液の濃度は１重量％〜３０重量％、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％が適当である。この濃度が低くても酵素分解に支障はないが、生産性が落ちて好ましくない。大豆蛋白溶液の濃度が高すぎると一旦分解された蛋白加水分解物どうしの重合が強くなるためか、十分分解するのに多量の酵素量を必要とし好ましくない。
【００１９】
酵素分解は大豆蛋白を水系下（大豆蛋白スラリーもしくは溶液）に酵素を用いて加水分解することが適当である。本発明に用いる蛋白分解酵素（プロテアーゼ）は、エキソプロテアーゼ又はエンドプロテアーゼを単独又は併用することができ、動物起源、植物起源あるいは微生物起源は問わない。具体的には、セリンプロテアーゼ（動物由来のトリプシン、キモトリプシン、微生物由来のズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ等）、チオールプロテアーゼ（植物由来のパパイン、フィシン、ブロメライン等）、カルボキシプロテアーゼ（動物由来のペプシン等）を用いることができる。更に、具体的にはアスペルギルス・オリゼ起源の「プロチンＦＮ」（大和化成（株）製）、ストレプトマイセス・グリセウス起源の「アクチナーゼ」（科研製薬（株）製）、バチルス・リケホルミス由来の「アルカラーゼ」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．製）、バチルス・ズブチルス由来の「プロチンＡ」（大和化成（株）製）等を例示できる。また、エンドプロテアーゼを含有する酵素としては、「プロテアーゼＳ」（天野製薬（株）製）や「プロチンＡＣ−１０」（大和化成（株）製）が、エキソプロテアーゼおよびエンドプロテアーゼを含有する蛋白分解酵素として「プロテアーゼＭ」（天野製薬（株）製）が例示できる。
【００２０】
本発明の加水分解の条件は用いる蛋白分解酵素の種類により多少異なるが、概してその蛋白分解酵素の作用ｐＨ域、作用温度域で、大豆蛋白を加水分解するに充分な量を用いることが好ましい。本発明の肝臓内脂質代謝促進ペプチド混合物を塩分制限食（例えば、経管栄養食等）に用いることを考慮すると、ｐＨが５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９であれば中和による塩の生成を軽減できて好ましい。
【００２１】
大豆蛋白酵素分解物から不溶性の分解物を除く方が後で行なう樹脂処理を容易に行なうことができ好ましい。大豆蛋白酵素分解溶液から不溶性の分解物を分離除去する手段としてはフィルタープレス、膜分離などろか手段によってもよいが、最も通常には遠心分離と膜分離を併用する方法が望ましい。酸性下で酵素分解した場合、例えば大豆蛋白の酵素分解液のｐＨが３〜８の範囲にある場合、この分離の際の分離性を高めるには不溶性物の凝集性を高める目的でｐＨを４〜６．２好ましくは４．５〜５．５とすることが適当である。これは、未分解物を含む不溶解物は大豆蛋白の等電点付近で凝集しやすくなる傾向にあることによる。或いはまた、分解液中にカルシウムやマグネシウムの塩化物、硫酸塩などの塩類や水酸化物といったアルカリ土類金属化合物又はポリアクリル酸Ｎａ、アルギン酸、キチンキトサンなどといった蛋白凝集剤を加えても分離性を高めることができる。
【００２２】
以上のように大豆蛋白酵素分解溶液から不溶性の分解物を分離除去した後、ポリスチレンビーズのような疎水性吸着材に疎水性成分を吸着させることにより、親水性成分を回収する。適当な疎水性吸着樹脂材としては、例えばオルガノ社製のアンバーライトＸＡＤ（登録商標）やバイエル社製のレバチットＯＣ（登録商標）、三菱化成社製のダイヤイオン（登録商標）等が挙げられる。より具体的には、芳香族系としてスチレンジビニルベンゼン系の樹脂（例えば、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＳＰ−８２５、ＳＰ−２０６、ＳＰ−２０７、ＳＰ−８００（いずれも登録商標、三菱化成（株）製）等）、アクリル系の樹脂（ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（いずれも登録商標、三菱化成株製）等）、フェノール系の樹脂（Ｓ８７４、Ｓ８６１（いずれも登録商標、住友化学工業（株）製）等）が適当である。
【００２３】
樹脂で処理して疎水性成分を吸着除去する態様としては樹脂と大豆蛋白酵素分解溶液を接触させることが出来る。この接触方法は、バッチ式の処理或いは連続カラムによる処理でもかまわない。例えば、バッチ式で処理する場合には、使用する疎水性吸着材の量を大豆蛋白加水分解物乾燥物重量の０．５から１００倍重量程度、より好ましくは２〜６０倍重量程度である。吸着剤の量が少ないと疎水性アミノ酸を十分吸着できず多すぎると他のオリゴペプチト混合物の収率が下がる。５分〜２時間程度、１〜４０℃の温度範囲内で攪拌した後、水不溶の高分子成分は通過できるが樹脂は通過出来ない程度のフィルターでろ過することが出来る。
【００２４】
又、連続カラムによる方法では、大豆蛋白質加水分解物の乾燥物重量１部に対して疎水性吸着材として２〜２００重量部、より好ましくは２５〜１００重量程度となる量の大豆蛋白加水分解物液を通液し、疎水性吸着材との接触時間が５分以上取れる線速度とすることが出来る。この時の大豆蛋白加水分解物の濃度は２〜５０％、より好ましくは１０〜３０％であることが好ましい。疎水性吸着材の再生は、０．５〜３Ｎの水酸化ナトリウム或いは１０〜９０％程度の有機溶剤を用いることが出来、有機溶剤として、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等を、疎水性吸着材量の１〜２０倍容量程度用いることが出来る。
【００２５】
以上のようにして得られた大豆蛋白ペプチド混合物液は、用途によりそのまま或いは濃縮して用いることも出来るが、通常、殺菌して粉霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用することができる。
【００２６】
上記した方法によって得られたペプチド混合物を加水分解しアミノ酸組成を分析するもとの大豆蛋白質加水分解物にくらべ、親水性アミノ酸の組成が高く、疎水性アミノ酸の組成が低くなる。親水アミノ酸の中では特に酸性アミノ酸であるグルタミン酸の含量が高く、次ぎにアスパラギン酸が高くなる傾向にあるが、塩基性アミノ酸およびその他の親水性アミノ酸含量はさほど増減しない。疎水性アミノ酸含量はいづれも低下するが中でも特にプロリン、低下が高く、ついでフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシンが低下する。また、このようにして調製されたペプチドは風味が良好で、長期間保存しても褐変が少ない特徴がある。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明の実施態様を説明する。
（実施例１）ペプチド混合物の製造法
分離大豆蛋白（不二製油（株）製、「ニューフジプロ−Ｒ」）３ｋｇを水を添加して１０％水溶液とし、蛋白分解酵素（大和化成（株）製、「プロチンＡＣ−１０」）１２０ｇを作用させ５０℃で５時間加水分解（１５％ＴＣＡ可溶率８５％）した後、生じた沈殿成分を高速遠心分離機で分離除去した。得られた上清液８ｋｇ／ｃｍ２圧の蒸気を吹き込んで１４０℃で７秒間殺菌後、さらにこの液を０．２２ミクロン（キュノー（株）製）のフィルターでろ過しスプレードライで粉末乾燥させた。
【００２８】
上記で得られたペプチド粉末を１０％の水溶液に調製し、７℃の雰囲気下で約１時間、バッチ式で生合成吸着剤ＨＰ−２０（三菱化成（株）製）で処理を行ない、１ミクロンのろ紙を通過させて樹脂の除き、処理液を凍結乾燥した。尚、ペプチド乾燥物重量の１、２，４、８，１６，３２倍重量にふらして樹脂で処理を行った。前記方法で得られたペプチド混合物の平均分子量は７００（ＨＰＬＣでのゲルろ過法）で、分画後のペプチドの平均分子量は７００〜８００で、樹脂の比率が高くなるほどやや分子量が大きくなる傾向にあった。
【００２９】
実施例１で得られた凍結乾燥品について、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した後、アミノ酸分析装置（Ｌ−８５００型、日立製作所製）でそのアミノ酸組成を分析した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【００３１】
（実施例２）培養細胞での試験 その１／脂肪酸合成系酵素のｍＲＮＡ量の測定
コラゲナーゼ法で得たラットの肝細胞をＷＥ培地（２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，１０−７Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で５時間ｐｌａｔｉｎｇした後、サンプルを添加した。朝と夕方に培地を交換し、２４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出してｍＲＮＡ量を測定した。ＷＥ培地はアミノ酸として２．０４ｇ／Ｌ，スタート、×１、×４、×８は０．２ｇ／Ｌ。
【００３２】
【００３３】
（実施例３）培養細胞での試験 その２
コラゲナーゼ法で得たラットの肝細胞をＷＥ培地（２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，１０−７Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で５時間ｐｌａｔｉｎｇした後、サンプルを添加した。朝と夕方に培地を交換し、４８時間調整後にｈａｒｖｅｓｔした。肝細胞をホモジネイトした後、１０５，０００×ｇ上清後の酵素活性を測定した。ＷＥ培地はアミノ酸として２．０４ｇ／Ｌ，スタート、×１、×４、×８は０．２ｇ／Ｌ。
【００３４】
【００３５】
（実施例４）動物での試験（肝臓の脂質濃度の試験）
ラットは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄ラット（４週令、体重７０〜８０ｇ）を九動（株）（熊本）から購入した。６〜１０日の予備飼育の後、カゼイン群、大豆蛋白群、大豆蛋白酵素分解（スタート原料）および大豆蛋白酵素分解物の樹脂分画品（上記×３２）の４群に分け下記に示すような飼料を４週間摂食させた。飼育室の温度は２２〜２４℃に維持し、７：００〜１９：００までを明期とした。なお、飼料および脱イオン水は自由に与えた。２週間摂食終了後、ラットは断頭屠殺し、肝臓および脂肪組織を摂取した。尚、脂肪組織は腎臓周辺および副睾丸周辺脂肪を摂取した。ラットは初体重１３０〜１４０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄ラットにＡＩＮ７６に準じて調製した飼料を２週間自由に摂取させた。尚、大豆蛋白酵素分解物ではラットの摂食性に問題ないが、その分画品（上記×３２）を配合した飼料では強い摂食抑制を示したことから、蛋白量の５０％をカゼインに代替して試験を行なった。試料組成は、タンパク質量は窒素換算で、カゼイン２０％、カゼイン１０％−大豆蛋白（「フジプロ−Ｒ」不二製油（株）製）９．７５％、カゼイン１０％＋大豆蛋白分解物スタート９．６４％及びカゼイン１０％−大豆蛋白酵素分解物の樹脂分画品（上記×３２）１２．２６％を添加した。その他、β−コーンスターチ１５％、ＤＬ−メチオニン０．３％、セルロース５％、コーン油５％、ミネラル混合３．５％、ビタミン混合１％、重酒石酸コリン０．２％を添加し、シュクロースを添加して１００％になるように調製した。
【００３６】
【実施例５】
【００３７】
下記表５に示す組成の脂質代謝改善飲料を製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温１年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。
【００３８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓中の脂質代謝促進剤、肝臓中の脂質代謝促進健康食品及びその有効成分であるペプチド混合物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓はヒトの臓器の中で最大のものであり、体重の約５０分の１に相当する。その生理機能の内容は極めて多岐に渡り、糖質、タンパク質代謝、脂質・エネルギー代謝の中心的役割を演じ、更に物質の貯蔵、解毒、造血、血液凝固など生体の生命維持に必要不可欠なものが多い。
【０００３】
肝臓細胞が担当する脂質代謝機能は体内の脂質代謝機能と深く連動しており、肝臓の脂質代謝機能低下、更に機能不全が原因の一つとなり、高脂血症、高血圧、動脈硬化、肥満、脂肪肝、糖尿病および高血圧などの疾患がもたらされる。この肝臓での脂質代謝機能不全を改善するためには、脂質代謝を促進し、細胞内に蓄積される脂質濃度を低下させることが重要であると考えられている。
【０００４】
近年、食品中に含有される成分の疾病予防および治療効果が注目されており、前記の循環器系の疾患に対しても、食品成分による予防および治療効果を得られるものの開発が期待されている。
【０００５】
いくつかの蛋白質やその加水分解物（ペプチド）を由来とする脂質代謝改善剤はすでに知られている。蛋白質の脂質代謝改善効果においては動物性蛋白質より植物性蛋白質、特に大豆蛋白が優れていることが知られている。これらたんぱく質の加水分解物（ペプチド）に関しては、以下のようにいろいろな蛋白由来の物が知られているし、その作用効果もさまざまである。
【０００６】
まず、大豆蛋白質の加水分解物以外の脂質改善剤として、例えば、特開昭５２−８３８１６号公報（新規ポリペプチド）、特開平０４−１４９１３７号公報（ダイエツト剤）、特開平０６−２１１６９０号公報（カゼイン由来の血中脂質抑制用摂食物）、特開平１１−８０００６号公報（脂質吸収抑制剤）、特開２０００−２６４８４５号公報（魚由来のコレステロール降下剤）、特開２０００−２２８９６７号公報（脂質代謝加工食品）、特開２００１−２５７７号公報（ローヤルゼリー由来の脂質代謝改善剤）、特開２００１−５７８６８号公報（畜産加工廃液由来の脂質代謝改善用素材）、特開２００１−５７８６９号公報（肥満改善及びダイエツト食用素材）、特開２００１−５８９５５号公報（生理活性ペプチド放性製剤）、特開平０８−１５７３８９号公報（高トリグリセリド血症治療剤）、特開平０９−１５７２９０号公報（コレステロール低減化ペプチド）、特開平０９−２５５６９８号公報（血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド）、特開平０７−１８８２８４号公報（血中トリグリセリド濃度上昇抑制ペプチド）などが知られている。
【０００７】
一方蛋白質を加水分解したペプチドにも脂質代謝を改善する効果に関してはいろいろと知られている。例えば、特開平５−８７０５２号公報では、脂質代謝改善剤において肝臓中の脂肪含量および脂肪小滴量を低下させる効果があるとしているが、これは有効成分である低分子ペプチドがリパーゼ活性を抑えるため吸収される脂肪含量が低下し、血清中の脂肪含量が低下するために生じるためであり、肝臓内での脂質代謝活性自体を変化させる効果ではない。
また、蛋白加水分解した低分子ペプチドでは、例えば、特開平０４−１４９１３７号公報（ダイエツト剤）が知られているが、これはジペプチド及びトリペプチドを主成分とするもので脂肪蓄積抑制作用、体重増加抑制作用に関して述べられているが肝臓の脂質代謝改善効果については述べられていない。
また生理活性用組成物として特開平１０−２０３９９４号公報の中で大豆蛋白分解物由来の分子量５００〜５０００のペプチドに血液中の中性脂肪ならびにＨＤＬ−コレスレロールを増加させる効果のあることを述べているが、肝臓中の脂肪酸代謝を促進するペプチドについては知られていない。
【０００８】
大豆蛋白質は植物性蛋白質の中で栄養性が優れているだけでなく、近年では様々な生理活性が見出され、生理機能剤としても注目される食品素材である。大豆蛋白質に関しては肥満を抑制する効果があることは知られているが、その体脂肪率を下げるメカニズムに関しては肝臓での脂肪酸生合成酵素の活性が抑えるためであると知られている（入谷らＪ．Ｎｕｔｒ．，１２６，３８０，１９９６）、しかし、大豆蛋白質中のどの成分が有効成分であるかは知られていない。
【０００９】
本出願人は継続して大豆蛋白加水分解物（ペプチド混合物）の生理作用、特に脂質代謝に関する研究を行ってきた。例えば、特公平７−０２５７９６号公報に開示するように大豆蛋白加水分解物（オリゴペプチド混合物）が血中コレステロールの上昇を抑制すること、特開平１−２６９４５６号公報や特開平３−２７２６９４号公報に開示するようにコレステロールや中性脂肪の代謝に関与することを開示してきた。しかし、体内の脂質代謝のなかでも肝臓内の脂質代謝を促進し、肝臓内の脂質濃度を改善するペプチドに関しては明らかではなかった。また、大豆蛋白酵素分解物に関して肝臓内のトリグリセリド含量が低下することは特開平４−５１８７２において引用データで述べられているにとどまっている。大豆蛋白質およびその酵素分解物中には肝臓の脂肪酸生合成酵素の活性を抑える成分が含まれていることは類推されるが、どのような成分が効果を発揮するか特定するには至っていなかった。
【００１０】
近年、加水分解したペプチドをさらに精製し機能成分を分画する試みがなされている。たとえば、特開平０７−１８８２８４号公報ではイオン交換樹脂−限外ろ過、さらには逆相クロマトにより分画された疎水性アミノ酸含量の高い画分に血中ＴＧ上昇抑制作用示すことが知られている。特開２００２−２１２０９７号公報において乳由来の塩基性ペプチド画分の脂質代謝改善剤が知られているが陽イオン交換体を用いて製造されており、またグルタミン酸＋アスパラギン酸含量も３０％以下と本発明とは異なるものである。
本発明のように苦味を感じず、酸性アミノ酸含量が高い肝臓中の脂質代謝促進剤は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は肝臓での脂質代謝を促進し、肝臓での脂質代謝異常と関連する生活習慣病などを改善あるいは予防すべく、そのための有効な肝臓内脂質代謝促進剤或いは健康食品を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究するなかで酸性アミノ酸（グルタミン酸やアスパラギン酸）が豊富でその割合の大きいペプチド混合物が肝臓内の脂質代謝を促進する知見を得て本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進剤である。親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下が好ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進剤が好ましい。また、本発明は、蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により分解し、疎水性樹脂で処理することを特徴とするペプチド混合物の製造法である。蛋白質は大豆蛋白質が好ましい。疎水性樹脂はスチレンジビニルベンゼン系の樹脂が好ましい。
また、本発明は、親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進健康食品である。親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下が好ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進健康食品が好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により肝臓の脂質代謝を促進するオリゴペプチド混合物が得られ、肝臓での脂肪酸の生合成を抑制することから、肝臓でのトリグリセリド濃度異常が原因され肥満、高トリグリセリド血症、脂肪肝、糖尿病または高血圧症に代表される生活習慣病、冠動脈疾患、脳動脈疾患、慢性腎炎、ネフローゼ、肝硬変、閉塞性黄疸等を予防・改善することが期待され、食品、健康食品、および医薬品への応用が可能になったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、本発明の肝臓中の脂質代謝促進剤について説明する。この肝臓中の脂質代謝促進剤は、親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とするものである。ここで、重要なことはこの肝臓中の脂質代謝促進ペプチド混合物が水不溶画分を含まず親水性アミノ酸から成ることであり、かつ酸性アミノ酸の割合が多いことである。親水性アミノ酸としてはグリシニン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、シスチン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（酸）（Ａｓｐ）、グルタミン（酸）（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）があげられるが、この親水性ペプチドの構成アミノ酸中で酸性アミノ酸の割合が３０〜７０重量％（以下単に％と記載する）、好ましくは３５〜５５％が適当である。尚、酸性アミノ酸としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等が挙げられるが、グルタミンとグルタミン酸が好ましい。グルタミン酸あるいはグルタミンの割合が多いほど肝臓内の脂質代謝促進効果に優れる傾向にある。グルタミン酸あるいはグルタミンの割合が３０％未満では公知の大豆ペプチド混合物より優れた肝臓内の脂質代謝促進効果を奏しない。
【００１５】
また、構成アミノ酸の中で特にプロリン含量が５％以下、好ましくは３％以下、特に１％以下であることが脂肪酸の合成抑制の点から望ましい。より具体的には、蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１０．５％以下、芳香族アミノ酸が８．０％以下、プロリンが５％％以下であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓中の脂質代謝促進剤が適当である。このペプチド混合物の平均分子量が肝臓内の脂質代謝促進効果に寄与するかは定かでないが、消化管吸収速度は小さいほど早いので酵素分解の態様により通常２００〜２００００とすることが出来、酵素分解の方法によっては５００〜３０００とすることが出来る。遊離アミノ酸含量は肝臓内の脂質代謝促進に関与する効果は定かではないが、ペプチド混合物としては少ないほうが好ましく、通常３５％以下、好ましくは１０％以下が適当である。肝臓内の脂質代謝促進効果は定かでないが、本発明において、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下であることが望ましい。本発明の肝臓内の脂質代謝促進剤や健康食品の風味やその安定性の点で、疎水性アミノ酸の含量は少なければ少ない程好ましく、分岐鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸などは前記範囲が好ましい。
【００１６】
尚、本発明の肝臓内の脂質代謝促進は肝臓中の脂肪酸の生合成を抑制することである。すなわち肝臓中で、アセチル−ＣｏＡから脂肪酸を合成する一連の酵素であるＡｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＴＰｃｉｔｒａｔｅ−ｌｙａｓｅ、Ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの酵素活性を抑制し、並びに
Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅおよびＦａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅなどのｍＲＮＡの発現を抑制する脂質代謝促進であり、肝臓中に蓄積されるトリグリセリドおよびコレステロール含量を低下させる効果がある。
【００１７】
従って、本発明の肝臓内脂質代謝改善ペプチド混合物は脂肪酸の合成抑制を基礎とする疾患の予防・治療用の医薬品や健康食品として用いることができる。医薬品として用いる肝臓内の脂質代謝促進剤は、オリゴペプチド混合物として剤中に０．０１％以上、好ましくは０．１％以上含有することが出来る。０．０１％未満では、実質的な効果を認めるのが困難である。また、１日摂取又は投与量は、オリゴペプチド混合物として、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／日以上、更に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ／日以上が適当である。０．１ｍｇ／ｋｇ／日未満では効果が認められない場合がある。また、健康食品としての肝臓内の脂質代謝促進健康食品も同様のペプチド混合物の含有量と摂取量で同様の効果を奏する。この様にして本発明の肝臓内の脂質代謝促進剤及び肝臓内の脂質代謝促進健康食品は、肝臓での脂質代謝を顕著に促進することより、肝臓での脂質代謝異常、具体的にはトリグリセリドの濃度異常により引き起こされる、肥満、高トリグリセリド血症、脂肪肝、糖尿病または高血圧症の予防・改善を目的とする剤または食品として利用することが出来る。食品として利用する場合、経口栄養食、経管栄養食等の使用形態に応じ、溶液のままや濃縮液・凍結乾燥物・噴霧乾燥物の原材料として使用することができる。摂食物としては広く各種の食品が含まれ、例えば飲料、冷菓、タブレット、菓子等を挙げることができる。また、通常の食品の形態でないカプセルとか錠剤として健康食品として用いることも出来る。
【００１８】
次に、本発明の肝臓中の脂質代謝促進に有効なペプチド混合物の製造法について説明する。本発明の肝臓中の脂質代謝促進ペプチド混合物は大豆蛋白を酵素で分解することにより得ることが出来る。本発明に用いる大豆蛋白は安価に手に入る材料として、豆乳、濃縮大豆蛋白、あるいは分離大豆蛋白、脱脂大豆、大豆ホエー蛋白などを使用し得るが、その中で分離大豆蛋白が好ましい。酵素処理に供する大豆蛋白溶液の濃度は１重量％〜３０重量％、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％が適当である。この濃度が低くても酵素分解に支障はないが、生産性が落ちて好ましくない。大豆蛋白溶液の濃度が高すぎると一旦分解された蛋白加水分解物どうしの重合が強くなるためか、十分分解するのに多量の酵素量を必要とし好ましくない。
【００１９】
酵素分解は大豆蛋白を水系下（大豆蛋白スラリーもしくは溶液）に酵素を用いて加水分解することが適当である。本発明に用いる蛋白分解酵素（プロテアーゼ）は、エキソプロテアーゼ又はエンドプロテアーゼを単独又は併用することができ、動物起源、植物起源あるいは微生物起源は問わない。具体的には、セリンプロテアーゼ（動物由来のトリプシン、キモトリプシン、微生物由来のズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ等）、チオールプロテアーゼ（植物由来のパパイン、フィシン、ブロメライン等）、カルボキシプロテアーゼ（動物由来のペプシン等）を用いることができる。更に、具体的にはアスペルギルス・オリゼ起源の「プロチンＦＮ」（大和化成（株）製）、ストレプトマイセス・グリセウス起源の「アクチナーゼ」（科研製薬（株）製）、バチルス・リケホルミス由来の「アルカラーゼ」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．製）、バチルス・ズブチルス由来の「プロチンＡ」（大和化成（株）製）等を例示できる。また、エンドプロテアーゼを含有する酵素としては、「プロテアーゼＳ」（天野製薬（株）製）や「プロチンＡＣ−１０」（大和化成（株）製）が、エキソプロテアーゼおよびエンドプロテアーゼを含有する蛋白分解酵素として「プロテアーゼＭ」（天野製薬（株）製）が例示できる。
【００２０】
本発明の加水分解の条件は用いる蛋白分解酵素の種類により多少異なるが、概してその蛋白分解酵素の作用ｐＨ域、作用温度域で、大豆蛋白を加水分解するに充分な量を用いることが好ましい。本発明の肝臓内脂質代謝促進ペプチド混合物を塩分制限食（例えば、経管栄養食等）に用いることを考慮すると、ｐＨが５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９であれば中和による塩の生成を軽減できて好ましい。
【００２１】
大豆蛋白酵素分解物から不溶性の分解物を除く方が後で行なう樹脂処理を容易に行なうことができ好ましい。大豆蛋白酵素分解溶液から不溶性の分解物を分離除去する手段としてはフィルタープレス、膜分離などろか手段によってもよいが、最も通常には遠心分離と膜分離を併用する方法が望ましい。酸性下で酵素分解した場合、例えば大豆蛋白の酵素分解液のｐＨが３〜８の範囲にある場合、この分離の際の分離性を高めるには不溶性物の凝集性を高める目的でｐＨを４〜６．２好ましくは４．５〜５．５とすることが適当である。これは、未分解物を含む不溶解物は大豆蛋白の等電点付近で凝集しやすくなる傾向にあることによる。或いはまた、分解液中にカルシウムやマグネシウムの塩化物、硫酸塩などの塩類や水酸化物といったアルカリ土類金属化合物又はポリアクリル酸Ｎａ、アルギン酸、キチンキトサンなどといった蛋白凝集剤を加えても分離性を高めることができる。
【００２２】
以上のように大豆蛋白酵素分解溶液から不溶性の分解物を分離除去した後、ポリスチレンビーズのような疎水性吸着材に疎水性成分を吸着させることにより、親水性成分を回収する。適当な疎水性吸着樹脂材としては、例えばオルガノ社製のアンバーライトＸＡＤ（登録商標）やバイエル社製のレバチットＯＣ（登録商標）、三菱化成社製のダイヤイオン（登録商標）等が挙げられる。より具体的には、芳香族系としてスチレンジビニルベンゼン系の樹脂（例えば、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＳＰ−８２５、ＳＰ−２０６、ＳＰ−２０７、ＳＰ−８００（いずれも登録商標、三菱化成（株）製）等）、アクリル系の樹脂（ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ（いずれも登録商標、三菱化成株製）等）、フェノール系の樹脂（Ｓ８７４、Ｓ８６１（いずれも登録商標、住友化学工業（株）製）等）が適当である。
【００２３】
樹脂で処理して疎水性成分を吸着除去する態様としては樹脂と大豆蛋白酵素分解溶液を接触させることが出来る。この接触方法は、バッチ式の処理或いは連続カラムによる処理でもかまわない。例えば、バッチ式で処理する場合には、使用する疎水性吸着材の量を大豆蛋白加水分解物乾燥物重量の０．５から１００倍重量程度、より好ましくは２〜６０倍重量程度である。吸着剤の量が少ないと疎水性アミノ酸を十分吸着できず多すぎると他のオリゴペプチト混合物の収率が下がる。５分〜２時間程度、１〜４０℃の温度範囲内で攪拌した後、水不溶の高分子成分は通過できるが樹脂は通過出来ない程度のフィルターでろ過することが出来る。
【００２４】
又、連続カラムによる方法では、大豆蛋白質加水分解物の乾燥物重量１部に対して疎水性吸着材として２〜２００重量部、より好ましくは２５〜１００重量程度となる量の大豆蛋白加水分解物液を通液し、疎水性吸着材との接触時間が５分以上取れる線速度とすることが出来る。この時の大豆蛋白加水分解物の濃度は２〜５０％、より好ましくは１０〜３０％であることが好ましい。疎水性吸着材の再生は、０．５〜３Ｎの水酸化ナトリウム或いは１０〜９０％程度の有機溶剤を用いることが出来、有機溶剤として、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等を、疎水性吸着材量の１〜２０倍容量程度用いることが出来る。
【００２５】
以上のようにして得られた大豆蛋白ペプチド混合物液は、用途によりそのまま或いは濃縮して用いることも出来るが、通常、殺菌して粉霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用することができる。
【００２６】
上記した方法によって得られたペプチド混合物を加水分解しアミノ酸組成を分析するもとの大豆蛋白質加水分解物にくらべ、親水性アミノ酸の組成が高く、疎水性アミノ酸の組成が低くなる。親水アミノ酸の中では特に酸性アミノ酸であるグルタミン酸の含量が高く、次ぎにアスパラギン酸が高くなる傾向にあるが、塩基性アミノ酸およびその他の親水性アミノ酸含量はさほど増減しない。疎水性アミノ酸含量はいづれも低下するが中でも特にプロリン、低下が高く、ついでフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシンが低下する。また、このようにして調製されたペプチドは風味が良好で、長期間保存しても褐変が少ない特徴がある。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明の実施態様を説明する。
（実施例１）ペプチド混合物の製造法
分離大豆蛋白（不二製油（株）製、「ニューフジプロ−Ｒ」）３ｋｇを水を添加して１０％水溶液とし、蛋白分解酵素（大和化成（株）製、「プロチンＡＣ−１０」）１２０ｇを作用させ５０℃で５時間加水分解（１５％ＴＣＡ可溶率８５％）した後、生じた沈殿成分を高速遠心分離機で分離除去した。得られた上清液８ｋｇ／ｃｍ２圧の蒸気を吹き込んで１４０℃で７秒間殺菌後、さらにこの液を０．２２ミクロン（キュノー（株）製）のフィルターでろ過しスプレードライで粉末乾燥させた。
【００２８】
上記で得られたペプチド粉末を１０％の水溶液に調製し、７℃の雰囲気下で約１時間、バッチ式で生合成吸着剤ＨＰ−２０（三菱化成（株）製）で処理を行ない、１ミクロンのろ紙を通過させて樹脂の除き、処理液を凍結乾燥した。尚、ペプチド乾燥物重量の１、２，４、８，１６，３２倍重量にふらして樹脂で処理を行った。前記方法で得られたペプチド混合物の平均分子量は７００（ＨＰＬＣでのゲルろ過法）で、分画後のペプチドの平均分子量は７００〜８００で、樹脂の比率が高くなるほどやや分子量が大きくなる傾向にあった。
【００２９】
実施例１で得られた凍結乾燥品について、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した後、アミノ酸分析装置（Ｌ−８５００型、日立製作所製）でそのアミノ酸組成を分析した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【００３１】
（実施例２）培養細胞での試験 その１／脂肪酸合成系酵素のｍＲＮＡ量の測定
コラゲナーゼ法で得たラットの肝細胞をＷＥ培地（２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，１０−７Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で５時間ｐｌａｔｉｎｇした後、サンプルを添加した。朝と夕方に培地を交換し、２４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出してｍＲＮＡ量を測定した。ＷＥ培地はアミノ酸として２．０４ｇ／Ｌ，スタート、×１、×４、×８は０．２ｇ／Ｌ。
【００３２】
【００３３】
（実施例３）培養細胞での試験 その２
コラゲナーゼ法で得たラットの肝細胞をＷＥ培地（２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，１０−７Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で５時間ｐｌａｔｉｎｇした後、サンプルを添加した。朝と夕方に培地を交換し、４８時間調整後にｈａｒｖｅｓｔした。肝細胞をホモジネイトした後、１０５，０００×ｇ上清後の酵素活性を測定した。ＷＥ培地はアミノ酸として２．０４ｇ／Ｌ，スタート、×１、×４、×８は０．２ｇ／Ｌ。
【００３４】
【００３５】
（実施例４）動物での試験（肝臓の脂質濃度の試験）
ラットは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄ラット（４週令、体重７０〜８０ｇ）を九動（株）（熊本）から購入した。６〜１０日の予備飼育の後、カゼイン群、大豆蛋白群、大豆蛋白酵素分解（スタート原料）および大豆蛋白酵素分解物の樹脂分画品（上記×３２）の４群に分け下記に示すような飼料を４週間摂食させた。飼育室の温度は２２〜２４℃に維持し、７：００〜１９：００までを明期とした。なお、飼料および脱イオン水は自由に与えた。２週間摂食終了後、ラットは断頭屠殺し、肝臓および脂肪組織を摂取した。尚、脂肪組織は腎臓周辺および副睾丸周辺脂肪を摂取した。ラットは初体重１３０〜１４０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄ラットにＡＩＮ７６に準じて調製した飼料を２週間自由に摂取させた。尚、大豆蛋白酵素分解物ではラットの摂食性に問題ないが、その分画品（上記×３２）を配合した飼料では強い摂食抑制を示したことから、蛋白量の５０％をカゼインに代替して試験を行なった。試料組成は、タンパク質量は窒素換算で、カゼイン２０％、カゼイン１０％−大豆蛋白（「フジプロ−Ｒ」不二製油（株）製）９．７５％、カゼイン１０％＋大豆蛋白分解物スタート９．６４％及びカゼイン１０％−大豆蛋白酵素分解物の樹脂分画品（上記×３２）１２．２６％を添加した。その他、β−コーンスターチ１５％、ＤＬ−メチオニン０．３％、セルロース５％、コーン油５％、ミネラル混合３．５％、ビタミン混合１％、重酒石酸コリン０．２％を添加し、シュクロースを添加して１００％になるように調製した。
【００３６】
【実施例５】
【００３７】
下記表５に示す組成の脂質代謝改善飲料を製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温１年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。
【００３８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進剤。
【請求項２】
親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下である請求項１記載の肝臓内の脂質代謝促進剤。
【請求項３】
蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする請求項１又は２の肝臓中の脂質代謝促進剤。
【請求項４】
蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により分解し、疎水性樹脂で処理することを特徴とするペプチド混合物の製造法。
【請求項５】
蛋白質が大豆蛋白質である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
疎水性樹脂がスチレンジビニルベンゼン系の樹脂である請求項４または５の製造法。
【請求項７】
親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進健康食品。
【請求項８】
親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下である請求項１記載の肝臓内の脂質代謝促進健康食品。
【請求項９】
蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする請求項７又は８の肝臓中の脂質代謝促進健康食品。
【請求項１】
親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進剤。
【請求項２】
親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下である請求項１記載の肝臓内の脂質代謝促進剤。
【請求項３】
蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする請求項１又は２の肝臓中の脂質代謝促進剤。
【請求項４】
蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により分解し、疎水性樹脂で処理することを特徴とするペプチド混合物の製造法。
【請求項５】
蛋白質が大豆蛋白質である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
疎水性樹脂がスチレンジビニルベンゼン系の樹脂である請求項４または５の製造法。
【請求項７】
親水性ペプチドからなり、この親水性ペプチドの構成アミノ酸の３０〜７０重量％が酸性アミノ酸であるペプチド混合物を有効成分とする肝臓内の脂質代謝促進健康食品。
【請求項８】
親水性ペプチドの構成アミノ酸中のプロリンが全アミノ酸中５％以下である請求項１記載の肝臓内の脂質代謝促進健康食品。
【請求項９】
蛋白の酵素分解物であって、平均分子量２００〜１００００、全アミノ酸組成中酸性アミノ酸が３０〜７０重量％（以下％）、塩基性アミノ酸が１０％〜３０％、分岐鎖アミノ酸が１５．０％以下、芳香族アミノ酸が９．０％以下、プロリンが５．３％以下であるペプチド混合物を有効成分とする請求項７又は８の肝臓中の脂質代謝促進健康食品。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０３３９１
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６３２６（Ｐ２００５−５０６３２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５２５
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５２５
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]