胚性幹細胞の未分化状態の維持剤
【課題】胚性幹細胞の未分化状態の維持剤及びそれを用いる方法を提供すること。
【解決手段】Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤、該維持剤を含有した胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、該維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法、樹立胚性幹細胞を、該維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法。
【解決手段】Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤、該維持剤を含有した胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、該維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法、樹立胚性幹細胞を、該維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞、特に哺乳動物の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤及びそれを用いる方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、胚性幹細胞、特に哺乳動物の胚性幹細胞の未分化状態を維持しうる未分化状態の維持剤、該胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、該胚性幹細胞の製造方法及び該胚性幹細胞の未分化状態の維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス胚性幹細胞は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下に未分化状態で培養され、増殖するが、かかる未分化状態の維持には、前記ＬＩＦのみの存在では困難であり、フィーダー細胞として、マウス胎仔の線維芽細胞をさらに必要とする。
【０００３】
したがって、マウス胚性幹細胞の未分化状態の維持には、前記フィーダー細胞を予め調製する必要があるので、例えば、ノックアウトマウスの作製等に際して、胚性幹細胞を用いる際、胚性幹細胞の調製のために、複雑な手順を行なう必要があるという欠点がある。
【０００４】
また、サル、ヒト等の霊長類動物の胚性幹細胞の未分化状態の維持にも、フィーダー細胞として、マウス胎仔の線維芽細胞が必要であるが、前記霊長類動物の胚性幹細胞は、白血病阻害因子の存在を必須成分とはしていないことが知られている。
【０００５】
しかしながら、例えば、医療目的のために、胚性幹細胞を用いる場合、マウス等の異種由来の細胞の共存下での培養は、未知のウイルス感染の可能性、遺伝子レベルでの汚染の可能性等の欠点がある。
【０００６】
一方、ＬＩＦ受容体を欠損したマウス胚性幹細胞で作用し、抗ｇｐ１３０中和抗体でブロックされず、ＳＴＡＴ３の活性化なしで作用する未分化状態の維持に役割を果たすと考えられるＥＳＲＦが存在することが開示されている〔非特許文献１参照のこと〕。
【０００７】
しかしながら、前記非特許文献１には、硫酸アンモニウム分画により得られた画分が、マウス胚性幹細胞に対して、作用することは示されているものの、前記非特許文献１からは、その構造や、他の生物由来の胚性幹細胞への影響については、不明であるのが現状である。
【非特許文献１】ダニ（Ｄａｎｉ Ｃ．）ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３、１４９−１６２、１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持すること、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造すること、胚性幹細胞を簡便に作製すること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の未分化状態の維持のための維持剤を提供することを目的とする。また、本発明は、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、胚性幹細胞を簡便に作製すること、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造、維持若しくは増殖させること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ること等を可能にする、胚性幹細胞の未分化状態を維持するための培地を提供することを目的とする。さらに、本発明は、胚性幹細胞を簡便に作製すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持すること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は、
〔１〕 Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤、
〔２〕 Ｗｎｔファミリーのタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６からなる群より選ばれた少なくとも１種である、前記〔１〕記載の維持剤、
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤を含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、
〔４〕 白血病阻害因子をさらに含有してなる、前記〔３〕記載の維持用培地、
〔５〕 哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法、
〔６〕 哺乳動物が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた１種である、前記〔５〕記載の製造方法、
〔７〕 哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養する、前記〔５〕又は〔６〕記載の製造方法、
〔８〕 樹立胚性幹細胞を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法、
〔９〕 樹立胚性幹細胞が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた哺乳動物の樹立胚性幹細胞である、前記〔８〕記載の維持方法、並びに
〔１０〕 樹立胚性幹細胞を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持する、前記〔８〕又は〔９〕記載の維持方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤は、胚性幹細胞の製造、維持、増殖等に用いることにより、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持剤によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。また、本発明の維持剤によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の維持剤によれば、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造することができ、そのため、胚性幹細胞を簡便に作製することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地は、胚性幹細胞の製造、維持、増殖等に用いることにより、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。さらに、本発明の培地によれば、胚性幹細胞の培養に際して、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造、維持若しくは増殖させることができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持用培地によれば、胚性幹細胞の製造に際して、フィーダー細胞を作製若しくは維持する工程を行なうことなく、胚性幹細胞を簡便に作製することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の維持用培地によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の胚性幹細胞の製造方法は、胚性幹細胞を簡便に作製することができ、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持方法は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の維持方法によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、哺乳動物の胚性幹細胞、例えば、マウス胚性幹細胞、サル胚性幹細胞等が、Ｗｎｔファミリーのタンパク質の存在下に維持されることにより、驚くべく、フィーダー細胞非存在下においても、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４等の未分化状態の細胞に特異的なマーカーを発現する、すなわち、未分化状態を維持するという本発明者らの知見に基づく。
【００１２】
かかるＷｎｔの機能を欠損させた場合、例えば、動物の発生過程における形成に異常が生じるため、前記Ｗｎｔは、動物における形態形成を制御することが推定されているタンパク質である。しかしながら、前記Ｗｎｔの存在下に、胚性幹細胞の培養することにより、前記Ｗｎｔは、驚くべく、未分化状態を維持するという効果を発揮する。具体的には、前記Ｗｎｔ３ａは、機能が欠失した場合、体節の欠失、神経管の過形成、尾芽の消失、海馬の欠失等の異常を引き起こすタンパク質であるが、胚性幹細胞の培地に含有せしめることにより、予想外にも、未分化状態を維持するという効果を発揮する。
【００１３】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤は、Ｗｎｔファミリーのタンパク質（以下、「Ｗｎｔ」ともいう）を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。
【００１４】
本発明の維持剤によれば、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、特に、哺乳動物、具体的には、ヒト、サル、マウス等の胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
【００１５】
また、本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、通常、未分化状態の維持にフィーダー細胞を必要とする胚性幹細胞に対して、実質的にフィーダー細胞の非存在下で、未分化状態を維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
したがって、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の製造の際、フィーダー細胞を実質的に必要としないため、より簡便に胚性幹細胞を作製することができるという優れた効果を発揮する。そのため、例えば、マウス等のトランスジェニック動物の製造に用いられる胚性幹細胞の作製に用いることにより、フィーダー細胞の調製の操作を省略することができ、トランスジェニック動物をより簡便に、かつ迅速に製造することができる。
【００１７】
また、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の未分化状態の維持に、フィーダー細胞を実質的に必要としないため、用いたフィーダー細胞に起因する他の生物からの汚染、例えば、ウイルスの異種間感染、異種遺伝子の水平伝播等が実質的に存在しない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
したがって、本発明の維持剤を用いることにより得られた胚性幹細胞は、細胞移植療法における移植用細胞の製造等に有用である。
【００１９】
さらに本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、胚性幹細胞の維持、製造又は増殖に用いることにより、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても、胚性幹細胞を未分化状態に維持すること、胚性幹細胞を得ること、又は胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができるという優れた効果を発揮する。
【００２０】
前記Ｗｎｔは、細胞外に分泌されるタンパク質であり、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質である。
【００２１】
本発明の維持剤に用いられるＷｎｔとしては、具体的には、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。前記Ｗｎｔは、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、前記Ｗｎｔのなかでも、Ｗｎｔ３ａ（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００９５２２）が好ましい。
【００２２】
本発明の維持剤に用いられうるＷｎｔは、天然に存在する野生型Ｗｎｔ及び該野生型Ｗｎｔに対する機能保存的バリアントのいずれであってもよい。
【００２３】
なお、本明細書において、「野生型Ｗｎｔに対する機能保存的バリアント」とは、下記ａ）〜ｄ）
ａ） 野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは、１又は複数個、より好ましくは、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
ｂ） 保存的アミノ酸置換により野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列とは異なるポリペプチド、
ｃ） 野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列に対して、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメント（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ５、Ｆｉｘｅｄ Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｗｉｎｄｏｗｓｉｚｅ ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｇａｐ １０の条件)により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
ｄ） 野生型Ｗｎｔの塩基配列からなる核酸の相補鎖、好ましくは完全相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）とストリンジェントな条件、好ましくは、高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドであって、かつ野生型Ｗｎｔの本来の生物学的活性を発揮するポリペプチドをいう。
【００２４】
なお、野生型Ｗｎｔの本来の生物学的活性は、例えば、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｈ．）ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ８（１２） １３４９−１３５０に記載の方法により測定されうる。具体的には、例えば、Ｗｎｔ３ａの場合、後述のように、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として測定されうる。
【００２５】
また、本明細書において、前記「高ストリンジェントな条件」としては、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、４２℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、より高ストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、より高ストリンジェントには、４２℃以上、さらに高ストリンジェントには、５０℃以上、より一層高ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件が例示されうる。
【００２６】
本発明の維持剤に用いられるＷｎｔは、例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）より供給されるＷｎｔ産生細胞から得られる。
【００２７】
本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔ産生細胞の培養上清であってもよく、該培養上清から、適切な精製手段により実質的に単離されたタンパク質であってもよい。また、本発明の維持剤は、前記実質的に単離されたタンパク質に加え、さらに、適切な緩衝液、該維持剤の適用対象となる胚性幹細胞に適した培地成分等を含有していてもよい。
【００２８】
前記Ｗｎｔは、具体的には、例えば、前記Ｗｎｔ産生細胞の培養物から培養上清を得ること、又は、任意に、該培養上清から慣用の方法により目的のＷｎｔを単離することにより製造されうる。前記Ｗｎｔ産生細胞としては、例えば、Ｌ Ｗｎｔ−３Ａ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）、シバモト（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ Ｓ．）らに記載の細胞〔Ｇｅｎｅｓ とＣｅｌｌｓ，３，６５９−６７０（１９９８）〕等が挙げられる。
【００２９】
具体的には、例えば、Ｗｎｔ３ａの場合、
（Ａ） 前記Ｌ Ｗｎｔ−３Ａ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）を、Ｗｎｔ３ａを発現するＬ細胞を、１０6細胞となるように、１０ｃｍディッシュ上、１０％ ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2 で３日間培養する工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた培養物の培地を、適切な培地に交換し、さらに３日間培養する工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られた培養物を、適切な孔径（例えば、０．２μｍ等）のフィルターでろ過して、培養上清を得る工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた培養上清に、最終濃度１重量％となるように、適切な界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００等）を添加し、得られた産物を、適切な孔径（例えば、０．２ｍｍ等）のフィルターでろ過して、ろ過産物を得る工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）で得られたろ過産物を、適切なカラムクロマトグラフィー（に供する工程
により得ることができる。
【００３０】
なお、各画分に含まれるＷｎｔ３ａは、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたイムノブロッティングを行なうことにより検出すればよい。
【００３１】
また、得られたＷｎｔ３ａの活性は、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として、測定することにより、Ｗｎｔ３ａを含む画分の活性を測定されうる。具体的には、例えば、
− ９６ウェルプレート中のマウスＬ細胞を、測定対象の試料（例えば、溶出画分等）の存在下又は非存在下に、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で５％ ＣＯ2、２〜１２時間インキュベーションするステップ、
− 各ウェル中の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄するステップ、
− 各ウェル中の細胞を、溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕を用いて溶解させるステップ、
− 得られた溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離するステップ、
− 得られたゲル上のタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、抗β−カテニン抗体を用いてイムノブロッティングを行なうステップ
を行なうことによりβ−カテニンの量を定量し、測定対象の試料非存在下の場合よりも測定対象の試料存在下の場合にβ−カテニンの量が増加することをＷｎｔ３ａの活性の指標として、測定されうる。
【００３２】
なお、Ｗｎｔ３ａの場合、前記カラムクロマトグラフィーは、例えば、
− 前記ろ過産物を、緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ｐＨ７．５〕で平衡化したＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム〔商品名、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕（総容量１００〜２００ｍｌ）に供して、緩衝液Ｂ〔組成：１．５Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５〕を用いて、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着したタンパク質を、流速２〜５ｍｌ／分、分画５〜１５ｍｌで溶出し
− 得られたＷｎｔ３ａを含む画分を、１０ｍｌまで濃縮し、商品名：ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム〔アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、流速２ｍｌ／分、分画１０ｍｌで溶出し、１８０ｍｌ〜２１０ｍｌ溶出時の画分を、Ｗｎｔ３ａを含む画分として得、
− 得られた画分を、商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラムに供し、カラムに吸着したタンパク質を、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、０〜１Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントで溶出する
ことにより行なわれうる。
【００３３】
本発明の維持剤におけるＷｎｔの含有量は、特に限定されないが、前記実質的に単離されたＷｎｔタンパク質の量として、１００重量％以下であり、１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ以上であることが望ましい。
【００３４】
本発明の維持剤による未分化状態の維持の効果は、本発明の維持剤の存在下に胚性幹細胞を培養し、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成等を指標として評価されうる。
【００３５】
前記未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーとしては、胚性幹細胞の由来の動物種により異なるが、例えば、カニクイサルの胚性幹細胞の場合、陽性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等が挙げられ、陰性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３等が挙げられる。なお、アカゲザルの場合、ＳＳＥＡ−３は、陽性対照のマーカーとなる。また、マウスの胚性幹細胞の場合、陽性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−１等が挙げられ、陰性対照として、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等が挙げられる。かかるマーカーは、例えば、該マーカーに対する抗体を用いて検出されうる。さらに、ヒトの場合、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０等が挙げられる。
【００３６】
Ｏｃｔ−３／４の発現は、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析等により評価されうる。
【００３７】
また、胚性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の発現は、慣用のアルカリホスファターゼ活性の検出方法により評価されうる。
【００３８】
前記「胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状」としては、核に対して細胞質が少なく、核小体が明瞭である形状が挙げられる。さらに具体的には、例えば、マウスの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が不明瞭であり、かつドーム状の形状を示し、サル、具体的には、カニクイザルの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が明瞭で扁平な形状を示し、ヒトの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が明瞭で扁平な形状を示す。
【００３９】
また、本発明の維持剤を胚性幹細胞の培養に用いられる培地に添加して得られた培地は、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地として用いられうる。したがって、かかる胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地も本発明に含まれる。
【００４０】
本発明の維持用培地は、本発明の維持剤を含有することを１つの大きな特徴とする。
【００４１】
本発明の維持用培地は、本発明の維持剤を含有しているため、胚性幹細胞の培養に用いることにより、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００４２】
また、本発明の維持用培地によれば、本発明の維持剤を含有しているため、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造すること、未分化状態に維持すること又は増殖させることができる。したがって、本発明の維持用培地によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００４３】
さらに、本発明の維持用培地によれば、本発明の維持剤を含有しているため、胚性幹細胞の維持、製造又は増殖に用いることにより、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても、胚性幹細胞を未分化状態に維持すること、胚性幹細胞を得ること、又は胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４４】
本発明の維持用培地における本発明の維持剤の含有量は、胚性幹細胞を未分化状態に維持する効果を発揮しうる範囲であればよく、例えば、実質的に単離されたＷｎｔタンパク質の量として、１００ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。
【００４５】
本発明の維持用培地には、本発明の維持剤に加え、胚性幹細胞の培養に用いられる慣用の培地成分を用いればよい。前記培地成分としては、適用対象となる胚性幹細胞により異なるが、例えば、サルの胚性幹細胞に用いる場合、β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と血清又は血清代替物〔例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地等が挙げられる。また、マウスの胚性幹細胞に用いる場合、前記培地成分としては、例えば、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地、１５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。さらに、ヒトの胚性幹細胞に用いる場合、前記培地成分としては、例えば、β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と血清又は血清代替物〔例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地等が挙げられる。
【００４６】
なお、胚性幹細胞を細胞移植療法のための移植用細胞の製造等に用いる場合、血清の代わりに、血清代替物を用いることが好ましい。
【００４７】
本発明の維持用培地には、ペニシリン（例えば、１０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍｌ）、ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジンを終濃度各３０μＭ前後、チミジンを終濃度１０μＭ前後）等をさらに含有してもよい。
【００４８】
本発明の維持用培地のｐＨは、適用対象となる胚性幹細胞に応じて適宜設定すればよい。マウスの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。サルの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、前記ｐＨは、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。ヒトの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、前記ｐＨは、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。
【００４９】
なお、通常、未分化状態の維持に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を必要とする胚性幹細胞に、本発明の維持用培地を用いる場合、本発明の維持用培地は、該ＬＩＦをさらに含有してもよい。この場合、本発明の維持剤の有効成分であるＷｎｔと、ＬＩＦとの相乗的な作用により、胚性幹細胞の未分化状態をより効率よく維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００５０】
また、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の製造方法が提供される。かかる胚性幹細胞の製造方法も本発明に含まれる。
【００５１】
本発明の製造方法は、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする方法である。
【００５２】
本発明の製造方法は、前記内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下に培養することに１つの大きな特徴がある。
【００５３】
本発明の製造方法は、本発明の維持剤が用いられるため、効率よく胚性幹細胞を得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５４】
前記哺乳動物としては、特に限定されないが、ヒト、サル、マウス等が挙げられる。
【００５５】
また、本発明の製造方法においては、本発明の維持剤が用いられるため、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、該維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養することにより、胚性幹細胞を得ることもできる。本発明の製造方法においては、前記維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下での内部細胞塊の培養を行なうことにより、胚性幹細胞をより簡便に得ることができるという優れた効果を発揮する。さらに、かかる製造方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５６】
本発明の製造方法としては、具体的には、
（Ａ）哺乳動物の内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の存在下に培養する工程に培養する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る工程
を含む方法（製造方法１という）、
（Ａ’）哺乳動物の内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の非存在下に培養する工程、及び
（Ｂ’）前記工程（Ａ）で得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る工程
を含む方法（製造方法２という）
が挙げられる。
【００５７】
前記製造方法１及び製造方法２は、哺乳動物の種類、得られた胚性幹細胞の使用目的等に応じて、適宜選択すればよい。胚性幹細胞を簡便かつ迅速に得る観点及び他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得る観点から、製造方法２が好ましい。
【００５８】
工程（Ａ）又は工程（Ａ’）で用いられる内部細胞塊は、特に限定されないが、例えば、
− 哺乳動物の受精卵を用いて胚盤胞期胚を発生させ、
− 該胚盤胞期胚を、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ等で処理して、透明帯が除去された胚盤胞期胚を得、
− 得られた透明帯が除去された胚盤胞期胚を、前記哺乳動物に対する適切な抗血清を用いた免疫手術に供する
ことにより得られうる。
【００５９】
前記工程（Ａ）又は（Ａ’）においては、本発明の維持用培地を用いることができる。
【００６０】
なお、前記工程（Ａ）において、フィーダー細胞は、慣用の細胞〔例えば、マウス線維芽細胞、ＳＴＯ細胞（マウス線維芽細胞由来細胞）等）を、慣用の方法、例えば、マイトマイシンＣ処理することにより得られたフィーダー細胞を用いればよい。
【００６１】
前記工程（Ａ）又は（Ａ’）に用いられる培養容器としては、培養に適したものであればよく、例えば、６ｃｍディッシュ、１０ｃｍ ディッシュ等が挙げられる。
【００６２】
前記工程（Ａ）においては、ゼラチン、コラーゲン等の細胞接着因子でコートした培養用容器を用いればよい。
一方、前記工程（Ａ’）においては、マウスの場合、ゼラチン等でコートした培養容器を用いればよく、コートサルの場合、血清又は血清代替物を含む培地でコートした培養用容器を用いればよい。
【００６３】
前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、内部細胞塊は、胚性幹細胞を得るに適した状態でもちいればよく、特に限定されないが、通常、１ｍｌの培地に対し、１つとなるようにすればよい。
【００６４】
前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、前記内部細胞塊の培養条件は、該胚性幹細胞の由来の動物種に応じて適宜選択されうるが、例えば、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2 濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、４〜５日間培養する条件が望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、４〜７日間培養する条件が望ましい。
【００６５】
ついで、前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る〔工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）〕。
【００６６】
前記工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）において、胚性幹細胞に特徴的な性質としては、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成等が挙げられ、これらの性質は、前記した方法により評価されうる。
【００６７】
得られた胚性幹細胞について、多分化能、核型等をさらに評価してもよい。
【００６８】
前記多分化能は、例えば、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ヌードマウス等の皮下、腎皮膜下等に、得られた胚性幹細胞を注射し、数週後（例えば、５〜１６週後）にテラトーマの形成の有無を調べること、レチノイン酸等の分化誘導因子の存在下に胚性幹細胞を維持して分化細胞の発生の有無を調べること、ストロマ細胞層上で胚性幹細胞を維持して分化細胞の発生の有無を調べること等により評価されうる。
【００６９】
前記核型は、胚性幹細胞における染色体数を調べ、該胚性幹細胞の由来の動物種に固有の染色体数と比較することにより評価されうる。
【００７０】
また、本発明の維持剤によれば、樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持して増殖させることができる。したがって、本発明により、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法も提供される。
【００７１】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持方法は、樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下に維持することを１つの大きな特徴とする。
【００７２】
本発明の維持方法によれば、本発明の維持剤が用いられるため、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても胚性幹細胞を未分化状態に維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００７３】
また、本発明の維持方法においては、本発明の維持剤が用いられるため、樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持することにより、該樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持することもできる。本発明の維持方法においては、本発明の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持することにより、簡便に樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持できる。また、本発明の維持方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。さらに、本発明の維持方法によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。
【００７４】
本発明の維持方法としては、具体的には、
樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の存在下に培養する工程に培養する方法（維持方法１）、及び
樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の非存在下に培養する方法（維持方法２）
が挙げられる。
【００７５】
前記維持方法１及び維持方法２は、哺乳動物の種類、得られた胚性幹細胞の使用目的等に応じて、適宜選択すればよい。簡便な操作を可能にする観点及び他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得る観点から、維持方法２が好ましい。
【００７６】
本発明の維持方法においては、樹立胚性幹細胞の培養の際、本発明の維持用培地を用いればよい。
【００７７】
前記維持方法１におけるフィーダー細胞としては、前記製造方法の場合と同様の細胞が挙げられる。
【００７８】
本発明の維持方法において、樹立胚性幹細胞の培養の際に用いられる培養用容器としては、培養に適したものであればよく、例えば、６ｃｍディッシュ、１０ｃｍ ディッシュ等が挙げられる。
【００７９】
前記維持方法１の場合、ゼラチン、コラーゲン等の細胞接着因子でコートした培養用容器を用いればよい。
【００８０】
一方、前記維持方法２の場合、マウスの場合、ゼラチン等でコートした培養用容器を用いればよく、サルの場合、血清又は血清代替物を含む培地でコートした培養用容器を用いればよい。
【００８１】
本発明の維持方法において、樹立胚性幹細胞を培養する際、未分化状態をより効率よく維持する観点から、細胞密度が、２×１０4細胞／３５ｍｍ ディッシュ以上であり、２×１０5／３５ ｍｍ ディッシュ以下であることが望ましい。
【００８２】
樹立胚性幹細胞の培養条件は、該樹立胚性幹細胞の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2 濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、２〜３日間培養する条件が望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、２〜３日間培養する条件が望ましい。
【００８３】
また、本発明の維持方法により得られる胚性幹細胞の評価は、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価すればよく、例えば、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成、多分化能、核型等を前記と同様に評価すればよい。
【００８４】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００８５】
細胞間のシグナル伝達を司るＷｎｔタンパク質の１つであるＷｎｔ３ａをコードする核酸〔ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００９５２２）を有するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）を、１０6細胞となるように、１０ｃｍディッシュ上、１０％ ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2 で３日間培養した。なお、モックベクターを有するＬ細胞も同様に培養した。その後、培地を交換し、さらに３日間培養した。なお、培地交換の際、Ｄ３細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ 血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に交換し、Ｅ１４．１細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ ＫＳＲを含むダルベッコ改変イーグル培地に交換し、サル胚性幹細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ ＫＳＲを含むダルベッコ改変イーグル培地に交換した。
【００８６】
得られた培養物を０．２μｍ孔のフィルター（ミリポア社製、商品名：Ｍｉｌｌｅｘ-ＧＶ）でろ過して、培養上清 １００ｍｌを得た。マウス胚性幹細胞に対して、上清を用いる場合、前記培養上清を、さらに、適切な培地で、３倍希釈して用い、サル胚性幹細胞に対して、上清を用いる場合、希釈せずそのまま用いた。なお、以下、Ｗｎｔ３ａを含む上清を、「Ｗｎｔ３ａ上清」という。
【００８７】
また、前記Ｗｎｔ３ａ上清に、最終濃度１重量％となるように、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００を添加し、得られた産物 １００ｍｌを、０．２ｍｍ孔のフィルター（ミリポア社製、商品名：Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）でろ過して、ろ過産物を得た。
【００８８】
アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、商品名：Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたクロマトグラフィー（総容量 ５ｍｌ）を、予め、緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ｐＨ７．５〕で平衡化させた。ついで、前記ろ過産物を、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに供し、カラム容量の４倍容量の前記結合緩衝液で洗浄した。その後、緩衝液Ｂ〔組成：１．５Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５〕を用いて、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着したタンパク質を溶出した。なお、タンパク質の溶出において、流速１−２ｍｌ／分、分画１ｍｌとした。
【００８９】
溶出された各画分について、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたイムノブロッティングを行ない、Ｗｎｔ３ａを含む画分を選別した。
【００９０】
また、以下のように、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として、測定することにより、Ｗｎｔ３ａを含む画分の活性を測定した。具体的には、マウスＬ細胞を９６ウェルプレートに播種し、ついで、ウェルに、溶出された各画分をそれぞれ添加し、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、各ウェルから、液体成分を吸引して除去し、ついで、各ウェル中の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ついで、各ウェルからリン酸緩衝化生理食塩水を吸引して除去し、ついで、各ウェルに溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕 ３０μｌを添加して、各ウェル中の細胞を溶解させた。得られた溶解物にラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）らのＳＤＳ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｓｉ-ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２重量％ ＳＤＳ、１体積％ ２−メルカプトエタノール、８Ｍ 尿素〕を添加し、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を得た。その後、各２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。得られたゲルから、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、その後、得られたニトロセルロース膜と、マウス抗β−カテニン抗体〔サンタクルズバイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製又はトランスダクション ラボラトリー（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕とを用いてイムノブロッティングを行なった。
【００９１】
ついで、得られたＷｎｔ３ａを含む画分を、１０ｍｌまで濃縮し、商品名：ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム〔アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、流速２ｍｌ／分、分画５ｍｌで溶出し、前記と同様にＷｎｔ３ａの活性を調べた。その結果、６５ｍｌ〜８０ｍｌ溶出時の画分を、Ｗｎｔ３ａを含む画分として得た。
【００９２】
得られた画分を、商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラムに供し、カラムに吸着したタンパク質を、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、０〜１Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出した。
【００９３】
前記と同様にして、Ｗｎｔ３ａを含む画分を得た。かかる画分を、Ｗｎｔ３ａ標品として、以下の実験に用いた。
【実施例２】
【００９４】
フィーダー細胞非依存性のマウス胚性幹細胞であるＤ３細胞におけるＷｎｔ（Ｗｎｔ３ａ）の影響を調べた。なお、対照として、前記実施例１の組換えベクターの代わりに、モックベクターを用いて得られた培養上清（以下、モック上清ともいう）を用いた。
【００９５】
Ｄ３細胞の培養は、ゼラチンコートしたプレート上、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／１ｍｌを３倍希釈）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【００９６】
その後、得られた各細胞について、未分化胚性幹細胞のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）活性の発現、未分化状態のマーカーの１つであるＳＳＥＡ−１の発現、及びマウス胚性幹細胞の維持に必須であり、かつ分化に際して迅速にダウンレギュレートされるＯｃｔ−３／４の発現を調べた。
【００９７】
Ａｌｐ活性の発現の検出は、商品名：アルカリホスファターゼキット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔ）〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を用い、該キットに添付の説明書に記載の方法に準じて、Ａｌｐ染色により行なった。結果を図１のパネルＡに示す。
【００９８】
その結果、図１のパネルＡに示すように、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合、ＬＩＦ存在下において、Ｄ３細胞は、コンパクトなコロニー形態を示し、Ａｌｐ活性を発現していることがわかった。さらに、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合、ＬＩＦの非存在下でさえ、Ｄ３細胞は、未分化形態、すなわち、コンパクトなコロニー形態を示し、Ａｌｐ活性を発現していることがわかった。
【００９９】
対照的に、図１のパネルＡに示すように、モック上清を、ＬＩＦ存在下のフィーダー非依存性胚性幹細胞に添加した場合、胚性幹細胞のコロニーは、平板化し、Ａｌｐ染色による染色強度が減少した。したがって、Ｌ細胞上清が、胚性幹細胞の分化を強く誘導する因子（分化誘導因子）を含むことが示唆された。また、Ｗｎｔ３ａは、Ｌ細胞上清に本質的に含まれることが示唆された分化誘導因子による分化誘導活性を妨げることが示された。
【０１００】
また、ＳＳＥＡ−１の発現の検出は、ＳＳＥＡ−１抗体（協和発酵株式会社製）と、ＰＥ結合抗マウスＩｇＭ抗体とを用い、ＦＡＣＳ解析により行なった。結果を図１のパネルＢに示す。
【０１０１】
その結果、図１のパネルＢの右パネルに示されるようにＷｎｔ３ａとともに維持されたＤ３細胞は、未分化状態のマーカーであるＳＳＥＡ−１に対して陽性であることがわかった。
【０１０２】
さらに、Ｏｃｔ−３／４の発現は、各細胞から、商品名：Ｔｒｉｚｏｌ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用いて、ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡについて、Ｏｃｔ−３／４を検出するためのプローブを用いたノーザンブロット解析を行なうことにより検出した。結果を、図１のパネルＣに示す。
【０１０３】
その結果、図１のパネルＣのレーン３に示されるように。Ｏｃｔ３／４発現は、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合にＬＩＦ存在下（レーン１）の場合と同様に維持されることがわかった。
【０１０４】
したがって、Ｗｎｔ３ａにより、ＬＩＦ存在下及び非存在下のいずれにおいても、フィーダー細胞非依存性マウス胚性幹細胞Ｄ３細胞を未分化状態に維持できることがわかった。また、上清に共存する分化誘導因子にもかかわらず、Ｗｎｔ３ａ上清を用いることにより、ＬＩＦ非存在下で、長期（１０継代以上）にわたってＤ３細胞を維持できることがわかった。
【実施例３】
【０１０５】
Ｗｎｔ活性が、胚性幹細胞に直接作用しているかどうかを調べた。
【０１０６】
レニラルシフェラーゼとともに商品名：ＴＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕を用いて、Ｄ３細胞にトランスフェクトした。また、陰性対照として、商品名：ＦＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を用いた。
【０１０７】
得られたトランスフェクタントを、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、２４時間維持した。
【０１０８】
その後、Ｄ３細胞の培地に、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ上清〔培養液量の１／３量（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２０ｎｇ／ｍｌ）〕又はモック上清〔培養液量の１／３量（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）を添加して、該Ｄ３細胞を刺激した。
【０１０９】
前記刺激から２４時間後、商品名：Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図２のパネルＡに示す。
【０１１０】
図２のパネルＡに示されるように、ＴＯＰｆｌａｓｈは、モック上清には応答せず、Ｗｎｔ３ａ上清によく応答したが、陰性対照レポーター（ＦＯＰｆｌａｓｈ）は、いずれの上清にも応答しなかった。
【０１１１】
また、上清が、ＬＩＦ関連サイトカインを含む可能性を調べた。
【０１１２】
レニラルシフェラーゼとともに、ＳＴＡＴ３応答性レポーターである商品名：ＡＰＲＦ−Ｌｕｃ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕を用いて、Ｄ３細胞にトランスフェクトした。また、陰性対照として、商品名：ＦＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を用いた。
【０１１３】
得られたトランスフェクタントを、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、２４時間維持した。
【０１１４】
その後、Ｄ３細胞の培地に、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ上清〔培養液量の１／３量（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２０ｎｇ／ｍｌ）〕又はモック上清〔培養液量の１／３量（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）を添加して、該Ｄ３細胞を刺激した。
【０１１５】
前記刺激から２４時間後、商品名：Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、図２のパネルＢに示す。
【０１１６】
その結果、図２のパネルＢに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清は、わずかにＤ３細胞内でルシフェラーゼ活性を活性化した。したがって、前記Ｗｎｔ３ａ上清は、胚性幹細胞のＳＴＡＴ３を活性化しうる少量のサイトカインを含む可能性が示唆された。
【０１１７】
また、特異的なＷｎｔアンタゴニストである可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（Ｆｚ8-Ｆｃ） １μｇ／ｍｌ又はＬＩＦに対する抗体 １μｇ／ｍｌを、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）かつＬＩＦの非存在下に維持したＤ３細胞及びＬＩＦの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）に維持したＤ３細胞のそれぞれの培地に添加した。その結果を図２のパネルＣに示す。また、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルディオトロフィン（ＣＴ−１）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）それぞれに対する抗体を、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）かつＬＩＦの非存在下に維持したＤ３細胞及びＬＩＦの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）に維持したＤ３細胞のそれぞれの培地に添加した。
【０１１８】
図２のパネルＣに示されるように、Ｆｚ８−Ｆｃは、Ｗｎｔ３ａ上清で維持したＤ３細胞におけるＡｌｐの発現及びコンパクトなコロニー形態の維持を阻害した。したがって、Ｗｎｔ３ａ上清の活性は、Ｗｎｔタンパク質に由来するものであり、二次的に活性化された分子に由来するものではないことがわかった。
【０１１９】
また、図２のパネルＣに示されるように、Ｆｚ８−Ｆｃは、ＬＩＦで維持された胚性幹細胞に影響しなかった。すなわち、ＬＩＦが、二次的にＷｎｔを誘導しないことを意味する。
【０１２０】
さらに、図２のパネルＣに示されるように、抗ＬＩＦ抗体は、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを完全に阻害できた濃度で、Ａｌｐ染色及びコンパクトなコロニー形成を部分的に阻害した。しかしながら、抗ＬＩＦ抗体とＦｚ８-Ｆｃとの組合せは、Ａｌｐ染色及びコンパクトなコロニーは、明らかでなかった。一方、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルディオトロフィン（ＣＴ−１）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）それぞれに対する抗体は、Ｗｎｔ３ａ上清で維持したＤ３細胞に明らかな影響を与えなかった。
【０１２１】
なお、Ｗｎｔ３ａ上清について、商品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ：ｍｏｕｓｅ ＬＩＦ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）を用い、ＬＩＦ濃度を測定したところ、５９．４ｐｇ／ｍｌのＬＩＦを含み、希釈後、１９．８ｐｇ／ｍｌを含んでいた。かかる低濃度のＬＩＦでは、Ｄ３細胞の未分化状態の維持をほんのわずかしかサポートしないが、Ｗｎｔは、この濃度のＬＩＦとともに、上清における分化誘導活性にもかかわらず、Ｄ３細胞を維持する。
【０１２２】
したがって、Ｗｎｔは、胚性幹細胞の未分化状態の維持には不十分である低用量のＬＩＦとの相乗的な活性により、胚性幹細胞に活性を発揮することが示唆される。
【実施例４】
【０１２３】
ＬＩＦの存在下に、マウス胎仔の線維芽細胞上で通常維持されるフィーダー細胞依存胚性幹細胞（Ｅ１４．１細胞）におけるＷｎｔの影響を調べた。
【０１２４】
Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３ａ）の影響を調べた。なお、対照として、前記実施例１の組換えベクターの代わりに、モックベクターを用いて得られた培養上清（以下、モック上清ともいう）を用いた。
【０１２５】
Ｅ１４．１細胞の培養は、マイトマイシンＣで処理したマウス胎仔の線維芽細胞上、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１２６】
その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べ、実施例３と同様の手法により、Ｆｚ８−Ｆｃ及び抗ＬＩＦ抗体のそれぞれを用いて、Ｗｎｔ３ａ及びＬＩＦそれぞれの胚性幹細胞への影響を調べた。その結果を、図３のパネルＡ及びパネルＢにそれぞれ示す。
【０１２７】
図３のパネルＡに示されるように、Ｅ１４．１細胞を、ＬＩＦとＷｎｔ３ａとの存在下に培養した場合、コロニーは、ＬＩＦ単独での使用の場合に比べ、Ａｌｐに対してより陽性に染色された。また、Ｗｎｔ３ａ上清単独で用いた場合、マウス胎仔の線維芽細胞上、Ａｌｐ陽性コロニーを維持できた。
【０１２８】
マウス胎仔の線維芽細胞は、ＬＩＦを分泌し、そのため、胚性幹細胞は、外因的なＬＩＦの非存在下であってもある程度までは維持される。実際、図３のパネルＢに示されるように、抗ＬＩＦ抗体により、マウス胎仔の線維芽細胞上の多数のＡｌｐ陽性コロニーの形成が顕著に阻害された。また、Ｆｚ８−Ｆｃにより、Ａｌｐ陽性コロニー形成が阻害され、抗ＬＩＦ抗体とＦｚ８−Ｆｃとの組合せにより、Ａｌｐ陽性コロニーの形成が、ほぼ完全に阻害された。
【０１２９】
これらのデータから、マウス胎仔の線維芽細胞は、ＬＩＦとＷｎｔとを分泌し、該ＬＩＦ及びＷｎｔの両方が、マウス胎仔の線維芽細胞上のフィーダー依存胚性幹細胞を維持することが示唆される。
【０１３０】
ついで、Ｗｎｔが、フィーダー細胞フリーの状態でＥ１４．１細胞を維持するかどうかを調べた。具体的には、Ｅ１４．１細胞を、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間培養した。その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べた。結果を図３のパネルＣに示す。
【０１３１】
その結果、図３のパネルＡに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清により、外因性ＬＩＦの存在又は非存在の場合ともに、Ｅ１４．１細胞のＡｌｐ陽性コロニー形成を維持できた。
【０１３２】
また、Ｗｎｔ３ａ上清単独で２週間培養された胚性幹細胞を、ｍｉｘｅｄ−ｃｏａｔｅｄキメラマウスから生成された胚盤胞に注入した。
【０１３３】
その結果、図３のパネルＤに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清単独で２週間培養された胚性幹細胞を胚盤胞に注入することによってキメラマウスを形成し、さらに生殖細胞に分化することによって胚性幹細胞由来の遺伝子（外皮色）が子孫に伝達された。
【０１３４】
これらのデータにより、Ｗｎｔで維持された胚性幹細胞は、わずかな量のＬＩＦの助けにより、インビボで試験された多分化能を維持していることが示唆される。
【実施例５】
【０１３５】
Ｗｎｔ活性が、系統発生的に保存されるかどうかを試験するため、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）から樹立されたサル胚性幹細胞であるＣＭＫ６．４細胞におけるＷｎｔの影響を調べた。
【０１３６】
ＣＭＫ６．４細胞の培養は、マイトマイシンＣで処理したマウス胎仔の線維芽細胞上、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ−１、ＣＮＴＦ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＩＬ−６可溶性レセプターいずれか 終濃度１０ｎｇ／ｍｌの存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〔商品名、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地、
２） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１３７】
前記ＣＭＫ６．４細胞をフィーダーフリー条件で培養する場合、組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）を、１０重量％ 血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃一晩コートし、かかる組織培養ディッシュ上、
１） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
２） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
のいずれかを用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１３８】
その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べた。また、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養して得られた各細胞について、ＳＳＥＡ−４の発現を、ＳＳＥＡ−４抗体〔アイオワ大学、ディベロップメンタル スタディーズ ハイブリドーマ バンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）供給〕と、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体とを用いて検出した。それぞれの結果を図４に示す。
【０１３９】
その結果、図４のパネルＡに示されるように、ＣＭＫ６．４細胞を、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養した場合、Ｗｎｔ３ａは、Ａｌｐ活性及びＳＳＥＡ−４発現の両方を増加させた。
【０１４０】
また、ＬＩＦ又は他のＬＩＦ関連サイトカイン〔ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＯＳＭ及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６可溶性レセプター〕の存在は、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたサル胚性幹細胞又はマウス胎仔の線維芽細胞非存在下で培養されたサル胚性幹細胞の未分化状態の維持には、明確な影響を与えなかった。
【０１４１】
このことより、Ｗｎｔ３ａが、ＬＩＦ関連サイトカイン非依存的にサル胚性幹細胞の未分化状態の維持を促進することが示唆される。
【０１４２】
また、図４のパネルＢで示されるように、フィーダー細胞フリーの条件で、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞は、限られた数の継代において、Ａｌｐ陽性であり、この活性は、Ｆｚ８−Ｆｃにより阻害された。
【０１４３】
また、フィーダー細胞フリーの条件で、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞 約１０6細胞を、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの後脚に皮下注射した。
【０１４４】
その結果、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞を移植した８匹のマウスのうち５匹のマウスにおいて、テラトーマを形成した。
【０１４５】
したがって、胚性幹細胞におけるＷｎｔ活性は、ＬＩＦ関連サイトカインとは対照的に、種を超えて保存されることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、トランスジェニック動物の作製の効率を改善することができ、疾患のモデル動物等の開発への応用が可能になる。また、本発明により、より効率よく、細胞移植療法に適した品質及び性質を有する胚性幹細胞を供給することができ、ヒトに対する細胞移植療法のための手段等の開発への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、Ｗｎｔ３ａによるフィーダー非依存的なマウス胚性幹細胞Ｄ３細胞の維持を示す。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ３ａ又はモック上清とともに培養されたＤ３細胞のアルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）染色の結果を示す。上部カラムは、ＬＩＦ存在下、下部カラムは、ＬＩＦ非存在下を示す。また、左カラムは、胚性幹細胞の培地（図中、ｍｅｄｉｕｍ）、中央カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清（図中、Ｗｎｔ３ａ）、右カラムは、モック上清（図中、ｍｏｃｋ）を示す。Ａｌｐ陽性（赤）及びコンパクトなコロニーは、Ｗｎｔ３ａの存在下で維持された。パネルＢは、ＳＳＥＡ-１染色の結果を示す図である。図中、左パネルは、ＬＩＦの存在下、中央パネルは、ＬＩＦの非存在下、右カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下での結果を示す。パネルＣは、Ｏｃｔ−３／４発現のノーザンブロット解析の結果を示す。図中、レーン１は、ＬＩＦ存在下、レーン２は、ＬＩＦ非存在下、レーン３は、Ｗｎｔ３ａ上清存在下の結果を示す。
【図２】図２は、ＷｎｔとＬＩＦ／ｇｐ１３０との間の相乗作用を示す図である。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ応答性レポーター（ＴＯＰｆｌａｓｈ）又は変異レポーター（ＦＯＰｆｌａｓｈ）を用いたＤ３細胞のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。パネルＢは、ＳＴＡＴ応答性レポーター（ＡＰＲＥ−ｌｕｃ）を用いたＤ３細胞のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。パネルＣは、Ｗｎｔに対するアンタゴニスト（マウスＦｚ８−Ｆｃ：１μｇ／ｍｌ）及び／又はＬＩＦに対するアンタゴニスト（抗ＬＩＦ抗体：１μｇ／ｍｌ）の影響を調べた結果を示す。上部カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清存在下、下部カラムは、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下での結果を示す。
【図３】図３は、Ｗｎｔ３ａによるフィーダー細胞依存性マウス胚性幹細胞（Ｅ１４．１）の未分化状態の維持を示す図である。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ３ａ又はモック上清の存在下、マウス胎仔の線維芽細胞上のＥ１４．１細胞のＡｌｐ染色の結果を示す。上部カラムは、外因的なＬＩＦ存在下、下部パネルは、外因的ＬＩＦ非存在下の結果を示す。パネルＢは、マウス胎仔の線維芽細胞上の胚性幹細胞に対するＬＩＦ及び／又はＷｎｔアンタゴニストの影響を調べた結果を示す。抗ＬＩＦ抗体（１μｇ／ｍｌ）若しくはマウスＦｚ８−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）又は両方を、外因的ＬＩＦの非存在下、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたＥ１４．１細胞に添加した。３００コロニー中のＡｌｐ陽性コロニーの割合を示す。実験は、３回繰り返し、代表的なデータを示す。パネルCは、フィーダーと無関係のＥ１４．１細胞のＡｌｐ染色を示す。パネルＤは、Ｗｎｔ３ａ上清と共に１４日間培養されたフィーダーフリーのＥ１４．１細胞キメラマウスから作製されたキメラマウスを示す。
【図４】図４は、Ｗｎｔ３ａによるサル胚性幹細胞の維持を示す図である。パネルＡは、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたサル胚性幹細胞に対するＷｎｔ３ａ上清の影響を示す図である。上部カラムは、Ａｌｐ染色、下部カラムは、ＳＳＥＡ−４染色を示す。パネルＢは、マウス胎仔の線維芽細胞なしで培養されたサル胚性幹細胞を示す。Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合のＡｌｐ染色（左）は、マウスＦｚ８−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）により阻害された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞、特に哺乳動物の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤及びそれを用いる方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、胚性幹細胞、特に哺乳動物の胚性幹細胞の未分化状態を維持しうる未分化状態の維持剤、該胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、該胚性幹細胞の製造方法及び該胚性幹細胞の未分化状態の維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス胚性幹細胞は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下に未分化状態で培養され、増殖するが、かかる未分化状態の維持には、前記ＬＩＦのみの存在では困難であり、フィーダー細胞として、マウス胎仔の線維芽細胞をさらに必要とする。
【０００３】
したがって、マウス胚性幹細胞の未分化状態の維持には、前記フィーダー細胞を予め調製する必要があるので、例えば、ノックアウトマウスの作製等に際して、胚性幹細胞を用いる際、胚性幹細胞の調製のために、複雑な手順を行なう必要があるという欠点がある。
【０００４】
また、サル、ヒト等の霊長類動物の胚性幹細胞の未分化状態の維持にも、フィーダー細胞として、マウス胎仔の線維芽細胞が必要であるが、前記霊長類動物の胚性幹細胞は、白血病阻害因子の存在を必須成分とはしていないことが知られている。
【０００５】
しかしながら、例えば、医療目的のために、胚性幹細胞を用いる場合、マウス等の異種由来の細胞の共存下での培養は、未知のウイルス感染の可能性、遺伝子レベルでの汚染の可能性等の欠点がある。
【０００６】
一方、ＬＩＦ受容体を欠損したマウス胚性幹細胞で作用し、抗ｇｐ１３０中和抗体でブロックされず、ＳＴＡＴ３の活性化なしで作用する未分化状態の維持に役割を果たすと考えられるＥＳＲＦが存在することが開示されている〔非特許文献１参照のこと〕。
【０００７】
しかしながら、前記非特許文献１には、硫酸アンモニウム分画により得られた画分が、マウス胚性幹細胞に対して、作用することは示されているものの、前記非特許文献１からは、その構造や、他の生物由来の胚性幹細胞への影響については、不明であるのが現状である。
【非特許文献１】ダニ（Ｄａｎｉ Ｃ．）ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３、１４９−１６２、１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持すること、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造すること、胚性幹細胞を簡便に作製すること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の未分化状態の維持のための維持剤を提供することを目的とする。また、本発明は、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、胚性幹細胞を簡便に作製すること、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造、維持若しくは増殖させること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ること等を可能にする、胚性幹細胞の未分化状態を維持するための培地を提供することを目的とする。さらに、本発明は、胚性幹細胞を簡便に作製すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持すること、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持すること等の少なくとも１つを可能にする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は、
〔１〕 Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤、
〔２〕 Ｗｎｔファミリーのタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６からなる群より選ばれた少なくとも１種である、前記〔１〕記載の維持剤、
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤を含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地、
〔４〕 白血病阻害因子をさらに含有してなる、前記〔３〕記載の維持用培地、
〔５〕 哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法、
〔６〕 哺乳動物が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた１種である、前記〔５〕記載の製造方法、
〔７〕 哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養する、前記〔５〕又は〔６〕記載の製造方法、
〔８〕 樹立胚性幹細胞を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法、
〔９〕 樹立胚性幹細胞が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた哺乳動物の樹立胚性幹細胞である、前記〔８〕記載の維持方法、並びに
〔１０〕 樹立胚性幹細胞を、前記〔１〕又は〔２〕記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持する、前記〔８〕又は〔９〕記載の維持方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤は、胚性幹細胞の製造、維持、増殖等に用いることにより、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持剤によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。また、本発明の維持剤によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の維持剤によれば、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造することができ、そのため、胚性幹細胞を簡便に作製することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地は、胚性幹細胞の製造、維持、増殖等に用いることにより、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。さらに、本発明の培地によれば、胚性幹細胞の培養に際して、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造、維持若しくは増殖させることができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持用培地によれば、胚性幹細胞の製造に際して、フィーダー細胞を作製若しくは維持する工程を行なうことなく、胚性幹細胞を簡便に作製することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の維持用培地によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の胚性幹細胞の製造方法は、胚性幹細胞を簡便に作製することができ、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持方法は、他の生物に由来するフィーダー細胞を実質的に用いずに、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の維持方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の維持方法によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、哺乳動物の胚性幹細胞、例えば、マウス胚性幹細胞、サル胚性幹細胞等が、Ｗｎｔファミリーのタンパク質の存在下に維持されることにより、驚くべく、フィーダー細胞非存在下においても、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４等の未分化状態の細胞に特異的なマーカーを発現する、すなわち、未分化状態を維持するという本発明者らの知見に基づく。
【００１２】
かかるＷｎｔの機能を欠損させた場合、例えば、動物の発生過程における形成に異常が生じるため、前記Ｗｎｔは、動物における形態形成を制御することが推定されているタンパク質である。しかしながら、前記Ｗｎｔの存在下に、胚性幹細胞の培養することにより、前記Ｗｎｔは、驚くべく、未分化状態を維持するという効果を発揮する。具体的には、前記Ｗｎｔ３ａは、機能が欠失した場合、体節の欠失、神経管の過形成、尾芽の消失、海馬の欠失等の異常を引き起こすタンパク質であるが、胚性幹細胞の培地に含有せしめることにより、予想外にも、未分化状態を維持するという効果を発揮する。
【００１３】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持剤は、Ｗｎｔファミリーのタンパク質（以下、「Ｗｎｔ」ともいう）を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。
【００１４】
本発明の維持剤によれば、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、特に、哺乳動物、具体的には、ヒト、サル、マウス等の胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
【００１５】
また、本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、通常、未分化状態の維持にフィーダー細胞を必要とする胚性幹細胞に対して、実質的にフィーダー細胞の非存在下で、未分化状態を維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
したがって、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の製造の際、フィーダー細胞を実質的に必要としないため、より簡便に胚性幹細胞を作製することができるという優れた効果を発揮する。そのため、例えば、マウス等のトランスジェニック動物の製造に用いられる胚性幹細胞の作製に用いることにより、フィーダー細胞の調製の操作を省略することができ、トランスジェニック動物をより簡便に、かつ迅速に製造することができる。
【００１７】
また、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の未分化状態の維持に、フィーダー細胞を実質的に必要としないため、用いたフィーダー細胞に起因する他の生物からの汚染、例えば、ウイルスの異種間感染、異種遺伝子の水平伝播等が実質的に存在しない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
したがって、本発明の維持剤を用いることにより得られた胚性幹細胞は、細胞移植療法における移植用細胞の製造等に有用である。
【００１９】
さらに本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔを有効成分として含有しているため、胚性幹細胞の維持、製造又は増殖に用いることにより、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても、胚性幹細胞を未分化状態に維持すること、胚性幹細胞を得ること、又は胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができるという優れた効果を発揮する。
【００２０】
前記Ｗｎｔは、細胞外に分泌されるタンパク質であり、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質である。
【００２１】
本発明の維持剤に用いられるＷｎｔとしては、具体的には、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。前記Ｗｎｔは、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、前記Ｗｎｔのなかでも、Ｗｎｔ３ａ（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００９５２２）が好ましい。
【００２２】
本発明の維持剤に用いられうるＷｎｔは、天然に存在する野生型Ｗｎｔ及び該野生型Ｗｎｔに対する機能保存的バリアントのいずれであってもよい。
【００２３】
なお、本明細書において、「野生型Ｗｎｔに対する機能保存的バリアント」とは、下記ａ）〜ｄ）
ａ） 野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは、１又は複数個、より好ましくは、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
ｂ） 保存的アミノ酸置換により野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列とは異なるポリペプチド、
ｃ） 野生型Ｗｎｔのアミノ酸配列に対して、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメント（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ５、Ｆｉｘｅｄ Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｗｉｎｄｏｗｓｉｚｅ ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｇａｐ １０の条件)により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び
ｄ） 野生型Ｗｎｔの塩基配列からなる核酸の相補鎖、好ましくは完全相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）とストリンジェントな条件、好ましくは、高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドであって、かつ野生型Ｗｎｔの本来の生物学的活性を発揮するポリペプチドをいう。
【００２４】
なお、野生型Ｗｎｔの本来の生物学的活性は、例えば、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｈ．）ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ８（１２） １３４９−１３５０に記載の方法により測定されうる。具体的には、例えば、Ｗｎｔ３ａの場合、後述のように、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として測定されうる。
【００２５】
また、本明細書において、前記「高ストリンジェントな条件」としては、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、４２℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、より高ストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、より高ストリンジェントには、４２℃以上、さらに高ストリンジェントには、５０℃以上、より一層高ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件が例示されうる。
【００２６】
本発明の維持剤に用いられるＷｎｔは、例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）より供給されるＷｎｔ産生細胞から得られる。
【００２７】
本発明の維持剤は、前記Ｗｎｔ産生細胞の培養上清であってもよく、該培養上清から、適切な精製手段により実質的に単離されたタンパク質であってもよい。また、本発明の維持剤は、前記実質的に単離されたタンパク質に加え、さらに、適切な緩衝液、該維持剤の適用対象となる胚性幹細胞に適した培地成分等を含有していてもよい。
【００２８】
前記Ｗｎｔは、具体的には、例えば、前記Ｗｎｔ産生細胞の培養物から培養上清を得ること、又は、任意に、該培養上清から慣用の方法により目的のＷｎｔを単離することにより製造されうる。前記Ｗｎｔ産生細胞としては、例えば、Ｌ Ｗｎｔ−３Ａ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）、シバモト（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ Ｓ．）らに記載の細胞〔Ｇｅｎｅｓ とＣｅｌｌｓ，３，６５９−６７０（１９９８）〕等が挙げられる。
【００２９】
具体的には、例えば、Ｗｎｔ３ａの場合、
（Ａ） 前記Ｌ Ｗｎｔ−３Ａ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）を、Ｗｎｔ３ａを発現するＬ細胞を、１０6細胞となるように、１０ｃｍディッシュ上、１０％ ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2 で３日間培養する工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた培養物の培地を、適切な培地に交換し、さらに３日間培養する工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られた培養物を、適切な孔径（例えば、０．２μｍ等）のフィルターでろ過して、培養上清を得る工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた培養上清に、最終濃度１重量％となるように、適切な界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００等）を添加し、得られた産物を、適切な孔径（例えば、０．２ｍｍ等）のフィルターでろ過して、ろ過産物を得る工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）で得られたろ過産物を、適切なカラムクロマトグラフィー（に供する工程
により得ることができる。
【００３０】
なお、各画分に含まれるＷｎｔ３ａは、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたイムノブロッティングを行なうことにより検出すればよい。
【００３１】
また、得られたＷｎｔ３ａの活性は、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として、測定することにより、Ｗｎｔ３ａを含む画分の活性を測定されうる。具体的には、例えば、
− ９６ウェルプレート中のマウスＬ細胞を、測定対象の試料（例えば、溶出画分等）の存在下又は非存在下に、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で５％ ＣＯ2、２〜１２時間インキュベーションするステップ、
− 各ウェル中の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄するステップ、
− 各ウェル中の細胞を、溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕を用いて溶解させるステップ、
− 得られた溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離するステップ、
− 得られたゲル上のタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、抗β−カテニン抗体を用いてイムノブロッティングを行なうステップ
を行なうことによりβ−カテニンの量を定量し、測定対象の試料非存在下の場合よりも測定対象の試料存在下の場合にβ−カテニンの量が増加することをＷｎｔ３ａの活性の指標として、測定されうる。
【００３２】
なお、Ｗｎｔ３ａの場合、前記カラムクロマトグラフィーは、例えば、
− 前記ろ過産物を、緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ｐＨ７．５〕で平衡化したＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム〔商品名、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕（総容量１００〜２００ｍｌ）に供して、緩衝液Ｂ〔組成：１．５Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５〕を用いて、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着したタンパク質を、流速２〜５ｍｌ／分、分画５〜１５ｍｌで溶出し
− 得られたＷｎｔ３ａを含む画分を、１０ｍｌまで濃縮し、商品名：ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム〔アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、流速２ｍｌ／分、分画１０ｍｌで溶出し、１８０ｍｌ〜２１０ｍｌ溶出時の画分を、Ｗｎｔ３ａを含む画分として得、
− 得られた画分を、商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラムに供し、カラムに吸着したタンパク質を、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、０〜１Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントで溶出する
ことにより行なわれうる。
【００３３】
本発明の維持剤におけるＷｎｔの含有量は、特に限定されないが、前記実質的に単離されたＷｎｔタンパク質の量として、１００重量％以下であり、１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ以上であることが望ましい。
【００３４】
本発明の維持剤による未分化状態の維持の効果は、本発明の維持剤の存在下に胚性幹細胞を培養し、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成等を指標として評価されうる。
【００３５】
前記未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーとしては、胚性幹細胞の由来の動物種により異なるが、例えば、カニクイサルの胚性幹細胞の場合、陽性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等が挙げられ、陰性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３等が挙げられる。なお、アカゲザルの場合、ＳＳＥＡ−３は、陽性対照のマーカーとなる。また、マウスの胚性幹細胞の場合、陽性対照のマーカーとして、ＳＳＥＡ−１等が挙げられ、陰性対照として、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等が挙げられる。かかるマーカーは、例えば、該マーカーに対する抗体を用いて検出されうる。さらに、ヒトの場合、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０等が挙げられる。
【００３６】
Ｏｃｔ−３／４の発現は、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析等により評価されうる。
【００３７】
また、胚性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の発現は、慣用のアルカリホスファターゼ活性の検出方法により評価されうる。
【００３８】
前記「胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状」としては、核に対して細胞質が少なく、核小体が明瞭である形状が挙げられる。さらに具体的には、例えば、マウスの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が不明瞭であり、かつドーム状の形状を示し、サル、具体的には、カニクイザルの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が明瞭で扁平な形状を示し、ヒトの胚性幹細胞の場合、細胞間の境界が明瞭で扁平な形状を示す。
【００３９】
また、本発明の維持剤を胚性幹細胞の培養に用いられる培地に添加して得られた培地は、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地として用いられうる。したがって、かかる胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地も本発明に含まれる。
【００４０】
本発明の維持用培地は、本発明の維持剤を含有することを１つの大きな特徴とする。
【００４１】
本発明の維持用培地は、本発明の維持剤を含有しているため、胚性幹細胞の培養に用いることにより、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００４２】
また、本発明の維持用培地によれば、本発明の維持剤を含有しているため、フィーダー細胞の非存在下に胚性幹細胞を製造すること、未分化状態に維持すること又は増殖させることができる。したがって、本発明の維持用培地によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００４３】
さらに、本発明の維持用培地によれば、本発明の維持剤を含有しているため、胚性幹細胞の維持、製造又は増殖に用いることにより、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても、胚性幹細胞を未分化状態に維持すること、胚性幹細胞を得ること、又は胚性幹細胞を未分化状態で増殖させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４４】
本発明の維持用培地における本発明の維持剤の含有量は、胚性幹細胞を未分化状態に維持する効果を発揮しうる範囲であればよく、例えば、実質的に単離されたＷｎｔタンパク質の量として、１００ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。
【００４５】
本発明の維持用培地には、本発明の維持剤に加え、胚性幹細胞の培養に用いられる慣用の培地成分を用いればよい。前記培地成分としては、適用対象となる胚性幹細胞により異なるが、例えば、サルの胚性幹細胞に用いる場合、β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と血清又は血清代替物〔例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地等が挙げられる。また、マウスの胚性幹細胞に用いる場合、前記培地成分としては、例えば、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地、１５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。さらに、ヒトの胚性幹細胞に用いる場合、前記培地成分としては、例えば、β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と血清又は血清代替物〔例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地等が挙げられる。
【００４６】
なお、胚性幹細胞を細胞移植療法のための移植用細胞の製造等に用いる場合、血清の代わりに、血清代替物を用いることが好ましい。
【００４７】
本発明の維持用培地には、ペニシリン（例えば、１０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍｌ）、ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジンを終濃度各３０μＭ前後、チミジンを終濃度１０μＭ前後）等をさらに含有してもよい。
【００４８】
本発明の維持用培地のｐＨは、適用対象となる胚性幹細胞に応じて適宜設定すればよい。マウスの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。サルの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、前記ｐＨは、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。ヒトの胚性幹細胞に用いる場合、胚性幹細胞を良好に製造、維持又は増殖させる観点から、前記ｐＨは、例えば、７．０以上、好ましくは、７．３以上であることが望ましく、８．０以下、好ましくは、７．５以下であることが望ましい。
【００４９】
なお、通常、未分化状態の維持に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を必要とする胚性幹細胞に、本発明の維持用培地を用いる場合、本発明の維持用培地は、該ＬＩＦをさらに含有してもよい。この場合、本発明の維持剤の有効成分であるＷｎｔと、ＬＩＦとの相乗的な作用により、胚性幹細胞の未分化状態をより効率よく維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００５０】
また、本発明の維持剤によれば、胚性幹細胞の製造方法が提供される。かかる胚性幹細胞の製造方法も本発明に含まれる。
【００５１】
本発明の製造方法は、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする方法である。
【００５２】
本発明の製造方法は、前記内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下に培養することに１つの大きな特徴がある。
【００５３】
本発明の製造方法は、本発明の維持剤が用いられるため、効率よく胚性幹細胞を得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、通常、未分化状態の維持に際して、ＬＩＦを必要とする胚性幹細胞であっても、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５４】
前記哺乳動物としては、特に限定されないが、ヒト、サル、マウス等が挙げられる。
【００５５】
また、本発明の製造方法においては、本発明の維持剤が用いられるため、哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、該維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養することにより、胚性幹細胞を得ることもできる。本発明の製造方法においては、前記維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下での内部細胞塊の培養を行なうことにより、胚性幹細胞をより簡便に得ることができるという優れた効果を発揮する。さらに、かかる製造方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５６】
本発明の製造方法としては、具体的には、
（Ａ）哺乳動物の内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の存在下に培養する工程に培養する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る工程
を含む方法（製造方法１という）、
（Ａ’）哺乳動物の内部細胞塊を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の非存在下に培養する工程、及び
（Ｂ’）前記工程（Ａ）で得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る工程
を含む方法（製造方法２という）
が挙げられる。
【００５７】
前記製造方法１及び製造方法２は、哺乳動物の種類、得られた胚性幹細胞の使用目的等に応じて、適宜選択すればよい。胚性幹細胞を簡便かつ迅速に得る観点及び他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得る観点から、製造方法２が好ましい。
【００５８】
工程（Ａ）又は工程（Ａ’）で用いられる内部細胞塊は、特に限定されないが、例えば、
− 哺乳動物の受精卵を用いて胚盤胞期胚を発生させ、
− 該胚盤胞期胚を、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ等で処理して、透明帯が除去された胚盤胞期胚を得、
− 得られた透明帯が除去された胚盤胞期胚を、前記哺乳動物に対する適切な抗血清を用いた免疫手術に供する
ことにより得られうる。
【００５９】
前記工程（Ａ）又は（Ａ’）においては、本発明の維持用培地を用いることができる。
【００６０】
なお、前記工程（Ａ）において、フィーダー細胞は、慣用の細胞〔例えば、マウス線維芽細胞、ＳＴＯ細胞（マウス線維芽細胞由来細胞）等）を、慣用の方法、例えば、マイトマイシンＣ処理することにより得られたフィーダー細胞を用いればよい。
【００６１】
前記工程（Ａ）又は（Ａ’）に用いられる培養容器としては、培養に適したものであればよく、例えば、６ｃｍディッシュ、１０ｃｍ ディッシュ等が挙げられる。
【００６２】
前記工程（Ａ）においては、ゼラチン、コラーゲン等の細胞接着因子でコートした培養用容器を用いればよい。
一方、前記工程（Ａ’）においては、マウスの場合、ゼラチン等でコートした培養容器を用いればよく、コートサルの場合、血清又は血清代替物を含む培地でコートした培養用容器を用いればよい。
【００６３】
前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、内部細胞塊は、胚性幹細胞を得るに適した状態でもちいればよく、特に限定されないが、通常、１ｍｌの培地に対し、１つとなるようにすればよい。
【００６４】
前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、前記内部細胞塊の培養条件は、該胚性幹細胞の由来の動物種に応じて適宜選択されうるが、例えば、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2 濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、４〜５日間培養する条件が望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、４〜７日間培養する条件が望ましい。
【００６５】
ついで、前記工程（Ａ）又は工程（Ａ’）において、得られた細胞について、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価して、胚性幹細胞を得る〔工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）〕。
【００６６】
前記工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）において、胚性幹細胞に特徴的な性質としては、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成等が挙げられ、これらの性質は、前記した方法により評価されうる。
【００６７】
得られた胚性幹細胞について、多分化能、核型等をさらに評価してもよい。
【００６８】
前記多分化能は、例えば、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ヌードマウス等の皮下、腎皮膜下等に、得られた胚性幹細胞を注射し、数週後（例えば、５〜１６週後）にテラトーマの形成の有無を調べること、レチノイン酸等の分化誘導因子の存在下に胚性幹細胞を維持して分化細胞の発生の有無を調べること、ストロマ細胞層上で胚性幹細胞を維持して分化細胞の発生の有無を調べること等により評価されうる。
【００６９】
前記核型は、胚性幹細胞における染色体数を調べ、該胚性幹細胞の由来の動物種に固有の染色体数と比較することにより評価されうる。
【００７０】
また、本発明の維持剤によれば、樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持して増殖させることができる。したがって、本発明により、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法も提供される。
【００７１】
本発明の胚性幹細胞の未分化状態の維持方法は、樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下に維持することを１つの大きな特徴とする。
【００７２】
本発明の維持方法によれば、本発明の維持剤が用いられるため、外因的なＬＩＦを添加した場合及び添加しない場合のいずれにおいても胚性幹細胞を未分化状態に維持することができるという優れた効果を発揮する。
【００７３】
また、本発明の維持方法においては、本発明の維持剤が用いられるため、樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持することにより、該樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持することもできる。本発明の維持方法においては、本発明の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持することにより、簡便に樹立胚性幹細胞を未分化状態に維持できる。また、本発明の維持方法によれば、他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に生じない状態で、胚性幹細胞の未分化状態を維持することができる。さらに、本発明の維持方法によれば、哺乳動物、特に、霊長類動物、さらに具体的には、サル、ヒト等の胚性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に維持することができるという優れた効果を奏する。
【００７４】
本発明の維持方法としては、具体的には、
樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の存在下に培養する工程に培養する方法（維持方法１）、及び
樹立胚性幹細胞を、本発明の維持剤の存在下かつフィーダー細胞の非存在下に培養する方法（維持方法２）
が挙げられる。
【００７５】
前記維持方法１及び維持方法２は、哺乳動物の種類、得られた胚性幹細胞の使用目的等に応じて、適宜選択すればよい。簡便な操作を可能にする観点及び他の生物からの汚染、例えば、ウイルス感染、遺伝子の水平伝播等を実質的に有さない胚性幹細胞を得る観点から、維持方法２が好ましい。
【００７６】
本発明の維持方法においては、樹立胚性幹細胞の培養の際、本発明の維持用培地を用いればよい。
【００７７】
前記維持方法１におけるフィーダー細胞としては、前記製造方法の場合と同様の細胞が挙げられる。
【００７８】
本発明の維持方法において、樹立胚性幹細胞の培養の際に用いられる培養用容器としては、培養に適したものであればよく、例えば、６ｃｍディッシュ、１０ｃｍ ディッシュ等が挙げられる。
【００７９】
前記維持方法１の場合、ゼラチン、コラーゲン等の細胞接着因子でコートした培養用容器を用いればよい。
【００８０】
一方、前記維持方法２の場合、マウスの場合、ゼラチン等でコートした培養用容器を用いればよく、サルの場合、血清又は血清代替物を含む培地でコートした培養用容器を用いればよい。
【００８１】
本発明の維持方法において、樹立胚性幹細胞を培養する際、未分化状態をより効率よく維持する観点から、細胞密度が、２×１０4細胞／３５ｍｍ ディッシュ以上であり、２×１０5／３５ ｍｍ ディッシュ以下であることが望ましい。
【００８２】
樹立胚性幹細胞の培養条件は、該樹立胚性幹細胞の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2 濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、２〜３日間培養する条件が望ましく、サルの場合、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、好ましくは、３７℃、ＣＯ2濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、好ましくは、５％、好ましくは、２〜３日間培養する条件が望ましい。
【００８３】
また、本発明の維持方法により得られる胚性幹細胞の評価は、胚性幹細胞に特徴的な性質を評価すればよく、例えば、未分化状態の胚性幹細胞に特異的なマーカーの発現の有無、アルカリホスファターゼ活性の発現、Ｏｃｔ−３／４の発現、胚性幹細胞の由来の動物種に固有の形状のコロニーの形成、多分化能、核型等を前記と同様に評価すればよい。
【００８４】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００８５】
細胞間のシグナル伝達を司るＷｎｔタンパク質の１つであるＷｎｔ３ａをコードする核酸〔ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００９５２２）を有するＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７）を、１０6細胞となるように、１０ｃｍディッシュ上、１０％ ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2 で３日間培養した。なお、モックベクターを有するＬ細胞も同様に培養した。その後、培地を交換し、さらに３日間培養した。なお、培地交換の際、Ｄ３細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ 血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に交換し、Ｅ１４．１細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ ＫＳＲを含むダルベッコ改変イーグル培地に交換し、サル胚性幹細胞に対して上清を用いる場合、培地を、１０重量％ ＫＳＲを含むダルベッコ改変イーグル培地に交換した。
【００８６】
得られた培養物を０．２μｍ孔のフィルター（ミリポア社製、商品名：Ｍｉｌｌｅｘ-ＧＶ）でろ過して、培養上清 １００ｍｌを得た。マウス胚性幹細胞に対して、上清を用いる場合、前記培養上清を、さらに、適切な培地で、３倍希釈して用い、サル胚性幹細胞に対して、上清を用いる場合、希釈せずそのまま用いた。なお、以下、Ｗｎｔ３ａを含む上清を、「Ｗｎｔ３ａ上清」という。
【００８７】
また、前記Ｗｎｔ３ａ上清に、最終濃度１重量％となるように、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００を添加し、得られた産物 １００ｍｌを、０．２ｍｍ孔のフィルター（ミリポア社製、商品名：Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）でろ過して、ろ過産物を得た。
【００８８】
アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、商品名：Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたクロマトグラフィー（総容量 ５ｍｌ）を、予め、緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ｐＨ７．５〕で平衡化させた。ついで、前記ろ過産物を、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに供し、カラム容量の４倍容量の前記結合緩衝液で洗浄した。その後、緩衝液Ｂ〔組成：１．５Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１重量％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５〕を用いて、前記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着したタンパク質を溶出した。なお、タンパク質の溶出において、流速１−２ｍｌ／分、分画１ｍｌとした。
【００８９】
溶出された各画分について、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたイムノブロッティングを行ない、Ｗｎｔ３ａを含む画分を選別した。
【００９０】
また、以下のように、Ｌ細胞におけるβ−カテニンの増加を指標として、測定することにより、Ｗｎｔ３ａを含む画分の活性を測定した。具体的には、マウスＬ細胞を９６ウェルプレートに播種し、ついで、ウェルに、溶出された各画分をそれぞれ添加し、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、各ウェルから、液体成分を吸引して除去し、ついで、各ウェル中の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ついで、各ウェルからリン酸緩衝化生理食塩水を吸引して除去し、ついで、各ウェルに溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕 ３０μｌを添加して、各ウェル中の細胞を溶解させた。得られた溶解物にラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）らのＳＤＳ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｓｉ-ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２重量％ ＳＤＳ、１体積％ ２−メルカプトエタノール、８Ｍ 尿素〕を添加し、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を得た。その後、各２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。得られたゲルから、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、その後、得られたニトロセルロース膜と、マウス抗β−カテニン抗体〔サンタクルズバイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製又はトランスダクション ラボラトリー（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕とを用いてイムノブロッティングを行なった。
【００９１】
ついで、得られたＷｎｔ３ａを含む画分を、１０ｍｌまで濃縮し、商品名：ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム〔アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、流速２ｍｌ／分、分画５ｍｌで溶出し、前記と同様にＷｎｔ３ａの活性を調べた。その結果、６５ｍｌ〜８０ｍｌ溶出時の画分を、Ｗｎｔ３ａを含む画分として得た。
【００９２】
得られた画分を、商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラムに供し、カラムに吸着したタンパク質を、１重量％ ＣＨＡＰＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）を用い、０〜１Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出した。
【００９３】
前記と同様にして、Ｗｎｔ３ａを含む画分を得た。かかる画分を、Ｗｎｔ３ａ標品として、以下の実験に用いた。
【実施例２】
【００９４】
フィーダー細胞非依存性のマウス胚性幹細胞であるＤ３細胞におけるＷｎｔ（Ｗｎｔ３ａ）の影響を調べた。なお、対照として、前記実施例１の組換えベクターの代わりに、モックベクターを用いて得られた培養上清（以下、モック上清ともいう）を用いた。
【００９５】
Ｄ３細胞の培養は、ゼラチンコートしたプレート上、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／１ｍｌを３倍希釈）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【００９６】
その後、得られた各細胞について、未分化胚性幹細胞のマーカーの１つであるアルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）活性の発現、未分化状態のマーカーの１つであるＳＳＥＡ−１の発現、及びマウス胚性幹細胞の維持に必須であり、かつ分化に際して迅速にダウンレギュレートされるＯｃｔ−３／４の発現を調べた。
【００９７】
Ａｌｐ活性の発現の検出は、商品名：アルカリホスファターゼキット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔ）〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を用い、該キットに添付の説明書に記載の方法に準じて、Ａｌｐ染色により行なった。結果を図１のパネルＡに示す。
【００９８】
その結果、図１のパネルＡに示すように、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合、ＬＩＦ存在下において、Ｄ３細胞は、コンパクトなコロニー形態を示し、Ａｌｐ活性を発現していることがわかった。さらに、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合、ＬＩＦの非存在下でさえ、Ｄ３細胞は、未分化形態、すなわち、コンパクトなコロニー形態を示し、Ａｌｐ活性を発現していることがわかった。
【００９９】
対照的に、図１のパネルＡに示すように、モック上清を、ＬＩＦ存在下のフィーダー非依存性胚性幹細胞に添加した場合、胚性幹細胞のコロニーは、平板化し、Ａｌｐ染色による染色強度が減少した。したがって、Ｌ細胞上清が、胚性幹細胞の分化を強く誘導する因子（分化誘導因子）を含むことが示唆された。また、Ｗｎｔ３ａは、Ｌ細胞上清に本質的に含まれることが示唆された分化誘導因子による分化誘導活性を妨げることが示された。
【０１００】
また、ＳＳＥＡ−１の発現の検出は、ＳＳＥＡ−１抗体（協和発酵株式会社製）と、ＰＥ結合抗マウスＩｇＭ抗体とを用い、ＦＡＣＳ解析により行なった。結果を図１のパネルＢに示す。
【０１０１】
その結果、図１のパネルＢの右パネルに示されるようにＷｎｔ３ａとともに維持されたＤ３細胞は、未分化状態のマーカーであるＳＳＥＡ−１に対して陽性であることがわかった。
【０１０２】
さらに、Ｏｃｔ−３／４の発現は、各細胞から、商品名：Ｔｒｉｚｏｌ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用いて、ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡについて、Ｏｃｔ−３／４を検出するためのプローブを用いたノーザンブロット解析を行なうことにより検出した。結果を、図１のパネルＣに示す。
【０１０３】
その結果、図１のパネルＣのレーン３に示されるように。Ｏｃｔ３／４発現は、Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合にＬＩＦ存在下（レーン１）の場合と同様に維持されることがわかった。
【０１０４】
したがって、Ｗｎｔ３ａにより、ＬＩＦ存在下及び非存在下のいずれにおいても、フィーダー細胞非依存性マウス胚性幹細胞Ｄ３細胞を未分化状態に維持できることがわかった。また、上清に共存する分化誘導因子にもかかわらず、Ｗｎｔ３ａ上清を用いることにより、ＬＩＦ非存在下で、長期（１０継代以上）にわたってＤ３細胞を維持できることがわかった。
【実施例３】
【０１０５】
Ｗｎｔ活性が、胚性幹細胞に直接作用しているかどうかを調べた。
【０１０６】
レニラルシフェラーゼとともに商品名：ＴＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕を用いて、Ｄ３細胞にトランスフェクトした。また、陰性対照として、商品名：ＦＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を用いた。
【０１０７】
得られたトランスフェクタントを、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、２４時間維持した。
【０１０８】
その後、Ｄ３細胞の培地に、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ上清〔培養液量の１／３量（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２０ｎｇ／ｍｌ）〕又はモック上清〔培養液量の１／３量（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）を添加して、該Ｄ３細胞を刺激した。
【０１０９】
前記刺激から２４時間後、商品名：Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図２のパネルＡに示す。
【０１１０】
図２のパネルＡに示されるように、ＴＯＰｆｌａｓｈは、モック上清には応答せず、Ｗｎｔ３ａ上清によく応答したが、陰性対照レポーター（ＦＯＰｆｌａｓｈ）は、いずれの上清にも応答しなかった。
【０１１１】
また、上清が、ＬＩＦ関連サイトカインを含む可能性を調べた。
【０１１２】
レニラルシフェラーゼとともに、ＳＴＡＴ３応答性レポーターである商品名：ＡＰＲＦ−Ｌｕｃ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕を用いて、Ｄ３細胞にトランスフェクトした。また、陰性対照として、商品名：ＦＯＰｆｌａｓｈ〔アップステート バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕を用いた。
【０１１３】
得られたトランスフェクタントを、１５重量％ ウシ胎仔血清と他の成分（β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸）とを含むダルベッコ改変イーグル培地を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、２４時間維持した。
【０１１４】
その後、Ｄ３細胞の培地に、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ上清〔培養液量の１／３量（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２０ｎｇ／ｍｌ）〕又はモック上清〔培養液量の１／３量（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）を添加して、該Ｄ３細胞を刺激した。
【０１１５】
前記刺激から２４時間後、商品名：Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、図２のパネルＢに示す。
【０１１６】
その結果、図２のパネルＢに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清は、わずかにＤ３細胞内でルシフェラーゼ活性を活性化した。したがって、前記Ｗｎｔ３ａ上清は、胚性幹細胞のＳＴＡＴ３を活性化しうる少量のサイトカインを含む可能性が示唆された。
【０１１７】
また、特異的なＷｎｔアンタゴニストである可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（Ｆｚ8-Ｆｃ） １μｇ／ｍｌ又はＬＩＦに対する抗体 １μｇ／ｍｌを、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）かつＬＩＦの非存在下に維持したＤ３細胞及びＬＩＦの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）に維持したＤ３細胞のそれぞれの培地に添加した。その結果を図２のパネルＣに示す。また、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルディオトロフィン（ＣＴ−１）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）それぞれに対する抗体を、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）かつＬＩＦの非存在下に維持したＤ３細胞及びＬＩＦの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）に維持したＤ３細胞のそれぞれの培地に添加した。
【０１１８】
図２のパネルＣに示されるように、Ｆｚ８−Ｆｃは、Ｗｎｔ３ａ上清で維持したＤ３細胞におけるＡｌｐの発現及びコンパクトなコロニー形態の維持を阻害した。したがって、Ｗｎｔ３ａ上清の活性は、Ｗｎｔタンパク質に由来するものであり、二次的に活性化された分子に由来するものではないことがわかった。
【０１１９】
また、図２のパネルＣに示されるように、Ｆｚ８−Ｆｃは、ＬＩＦで維持された胚性幹細胞に影響しなかった。すなわち、ＬＩＦが、二次的にＷｎｔを誘導しないことを意味する。
【０１２０】
さらに、図２のパネルＣに示されるように、抗ＬＩＦ抗体は、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを完全に阻害できた濃度で、Ａｌｐ染色及びコンパクトなコロニー形成を部分的に阻害した。しかしながら、抗ＬＩＦ抗体とＦｚ８-Ｆｃとの組合せは、Ａｌｐ染色及びコンパクトなコロニーは、明らかでなかった。一方、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルディオトロフィン（ＣＴ−１）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）それぞれに対する抗体は、Ｗｎｔ３ａ上清で維持したＤ３細胞に明らかな影響を与えなかった。
【０１２１】
なお、Ｗｎｔ３ａ上清について、商品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ：ｍｏｕｓｅ ＬＩＦ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）を用い、ＬＩＦ濃度を測定したところ、５９．４ｐｇ／ｍｌのＬＩＦを含み、希釈後、１９．８ｐｇ／ｍｌを含んでいた。かかる低濃度のＬＩＦでは、Ｄ３細胞の未分化状態の維持をほんのわずかしかサポートしないが、Ｗｎｔは、この濃度のＬＩＦとともに、上清における分化誘導活性にもかかわらず、Ｄ３細胞を維持する。
【０１２２】
したがって、Ｗｎｔは、胚性幹細胞の未分化状態の維持には不十分である低用量のＬＩＦとの相乗的な活性により、胚性幹細胞に活性を発揮することが示唆される。
【実施例４】
【０１２３】
ＬＩＦの存在下に、マウス胎仔の線維芽細胞上で通常維持されるフィーダー細胞依存胚性幹細胞（Ｅ１４．１細胞）におけるＷｎｔの影響を調べた。
【０１２４】
Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３ａ）の影響を調べた。なお、対照として、前記実施例１の組換えベクターの代わりに、モックベクターを用いて得られた培養上清（以下、モック上清ともいう）を用いた。
【０１２５】
Ｅ１４．１細胞の培養は、マイトマイシンＣで処理したマウス胎仔の線維芽細胞上、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１２６】
その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べ、実施例３と同様の手法により、Ｆｚ８−Ｆｃ及び抗ＬＩＦ抗体のそれぞれを用いて、Ｗｎｔ３ａ及びＬＩＦそれぞれの胚性幹細胞への影響を調べた。その結果を、図３のパネルＡ及びパネルＢにそれぞれ示す。
【０１２７】
図３のパネルＡに示されるように、Ｅ１４．１細胞を、ＬＩＦとＷｎｔ３ａとの存在下に培養した場合、コロニーは、ＬＩＦ単独での使用の場合に比べ、Ａｌｐに対してより陽性に染色された。また、Ｗｎｔ３ａ上清単独で用いた場合、マウス胎仔の線維芽細胞上、Ａｌｐ陽性コロニーを維持できた。
【０１２８】
マウス胎仔の線維芽細胞は、ＬＩＦを分泌し、そのため、胚性幹細胞は、外因的なＬＩＦの非存在下であってもある程度までは維持される。実際、図３のパネルＢに示されるように、抗ＬＩＦ抗体により、マウス胎仔の線維芽細胞上の多数のＡｌｐ陽性コロニーの形成が顕著に阻害された。また、Ｆｚ８−Ｆｃにより、Ａｌｐ陽性コロニー形成が阻害され、抗ＬＩＦ抗体とＦｚ８−Ｆｃとの組合せにより、Ａｌｐ陽性コロニーの形成が、ほぼ完全に阻害された。
【０１２９】
これらのデータから、マウス胎仔の線維芽細胞は、ＬＩＦとＷｎｔとを分泌し、該ＬＩＦ及びＷｎｔの両方が、マウス胎仔の線維芽細胞上のフィーダー依存胚性幹細胞を維持することが示唆される。
【０１３０】
ついで、Ｗｎｔが、フィーダー細胞フリーの状態でＥ１４．１細胞を維持するかどうかを調べた。具体的には、Ｅ１４．１細胞を、終濃度１０ｎｇ／ｍｌのマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ社製）の存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地、
２） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） １５重量％ 血清とβ−メルカプトエタノールとピルビン酸ナトリウムとを含むダルベッコ改変イーグル培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間培養した。その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べた。結果を図３のパネルＣに示す。
【０１３１】
その結果、図３のパネルＡに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清により、外因性ＬＩＦの存在又は非存在の場合ともに、Ｅ１４．１細胞のＡｌｐ陽性コロニー形成を維持できた。
【０１３２】
また、Ｗｎｔ３ａ上清単独で２週間培養された胚性幹細胞を、ｍｉｘｅｄ−ｃｏａｔｅｄキメラマウスから生成された胚盤胞に注入した。
【０１３３】
その結果、図３のパネルＤに示されるように、Ｗｎｔ３ａ上清単独で２週間培養された胚性幹細胞を胚盤胞に注入することによってキメラマウスを形成し、さらに生殖細胞に分化することによって胚性幹細胞由来の遺伝子（外皮色）が子孫に伝達された。
【０１３４】
これらのデータにより、Ｗｎｔで維持された胚性幹細胞は、わずかな量のＬＩＦの助けにより、インビボで試験された多分化能を維持していることが示唆される。
【実施例５】
【０１３５】
Ｗｎｔ活性が、系統発生的に保存されるかどうかを試験するため、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）から樹立されたサル胚性幹細胞であるＣＭＫ６．４細胞におけるＷｎｔの影響を調べた。
【０１３６】
ＣＭＫ６．４細胞の培養は、マイトマイシンＣで処理したマウス胎仔の線維芽細胞上、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ−１、ＣＮＴＦ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＩＬ−６可溶性レセプターいずれか 終濃度１０ｎｇ／ｍｌの存在下又は非存在下に、下記１）〜３）のいずれかの培地
１） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ〔商品名、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕とを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地、
２） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
３） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
を用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１３７】
前記ＣＭＫ６．４細胞をフィーダーフリー条件で培養する場合、組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）を、１０重量％ 血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃一晩コートし、かかる組織培養ディッシュ上、
１） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、実施例１で得られたＷｎｔ３ａ上清（Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む培地、及び
２） β−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸と２０重量％ ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔとを含むダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地に、モック上清（上記Ｗｎｔ３ａ上清において、Ｗｎｔ３ａ濃度として、１００〜２００ｎｇ／ｍｌである場合に対応する液量）をさらに含む培地
のいずれかを用い、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下に、３日間行なった。
【０１３８】
その後、得られた各細胞について、Ａｌｐ活性の発現を前記実施例２と同様の手法により調べた。また、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養して得られた各細胞について、ＳＳＥＡ−４の発現を、ＳＳＥＡ−４抗体〔アイオワ大学、ディベロップメンタル スタディーズ ハイブリドーマ バンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）供給〕と、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体とを用いて検出した。それぞれの結果を図４に示す。
【０１３９】
その結果、図４のパネルＡに示されるように、ＣＭＫ６．４細胞を、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養した場合、Ｗｎｔ３ａは、Ａｌｐ活性及びＳＳＥＡ−４発現の両方を増加させた。
【０１４０】
また、ＬＩＦ又は他のＬＩＦ関連サイトカイン〔ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＯＳＭ及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６可溶性レセプター〕の存在は、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたサル胚性幹細胞又はマウス胎仔の線維芽細胞非存在下で培養されたサル胚性幹細胞の未分化状態の維持には、明確な影響を与えなかった。
【０１４１】
このことより、Ｗｎｔ３ａが、ＬＩＦ関連サイトカイン非依存的にサル胚性幹細胞の未分化状態の維持を促進することが示唆される。
【０１４２】
また、図４のパネルＢで示されるように、フィーダー細胞フリーの条件で、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞は、限られた数の継代において、Ａｌｐ陽性であり、この活性は、Ｆｚ８−Ｆｃにより阻害された。
【０１４３】
また、フィーダー細胞フリーの条件で、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞 約１０6細胞を、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの後脚に皮下注射した。
【０１４４】
その結果、Ｗｎｔ３ａ上清で培養されたＣＭＫ６．４細胞を移植した８匹のマウスのうち５匹のマウスにおいて、テラトーマを形成した。
【０１４５】
したがって、胚性幹細胞におけるＷｎｔ活性は、ＬＩＦ関連サイトカインとは対照的に、種を超えて保存されることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、トランスジェニック動物の作製の効率を改善することができ、疾患のモデル動物等の開発への応用が可能になる。また、本発明により、より効率よく、細胞移植療法に適した品質及び性質を有する胚性幹細胞を供給することができ、ヒトに対する細胞移植療法のための手段等の開発への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、Ｗｎｔ３ａによるフィーダー非依存的なマウス胚性幹細胞Ｄ３細胞の維持を示す。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ３ａ又はモック上清とともに培養されたＤ３細胞のアルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）染色の結果を示す。上部カラムは、ＬＩＦ存在下、下部カラムは、ＬＩＦ非存在下を示す。また、左カラムは、胚性幹細胞の培地（図中、ｍｅｄｉｕｍ）、中央カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清（図中、Ｗｎｔ３ａ）、右カラムは、モック上清（図中、ｍｏｃｋ）を示す。Ａｌｐ陽性（赤）及びコンパクトなコロニーは、Ｗｎｔ３ａの存在下で維持された。パネルＢは、ＳＳＥＡ-１染色の結果を示す図である。図中、左パネルは、ＬＩＦの存在下、中央パネルは、ＬＩＦの非存在下、右カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清の存在下での結果を示す。パネルＣは、Ｏｃｔ−３／４発現のノーザンブロット解析の結果を示す。図中、レーン１は、ＬＩＦ存在下、レーン２は、ＬＩＦ非存在下、レーン３は、Ｗｎｔ３ａ上清存在下の結果を示す。
【図２】図２は、ＷｎｔとＬＩＦ／ｇｐ１３０との間の相乗作用を示す図である。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ応答性レポーター（ＴＯＰｆｌａｓｈ）又は変異レポーター（ＦＯＰｆｌａｓｈ）を用いたＤ３細胞のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。パネルＢは、ＳＴＡＴ応答性レポーター（ＡＰＲＥ−ｌｕｃ）を用いたＤ３細胞のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。パネルＣは、Ｗｎｔに対するアンタゴニスト（マウスＦｚ８−Ｆｃ：１μｇ／ｍｌ）及び／又はＬＩＦに対するアンタゴニスト（抗ＬＩＦ抗体：１μｇ／ｍｌ）の影響を調べた結果を示す。上部カラムは、Ｗｎｔ３ａ上清存在下、下部カラムは、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下での結果を示す。
【図３】図３は、Ｗｎｔ３ａによるフィーダー細胞依存性マウス胚性幹細胞（Ｅ１４．１）の未分化状態の維持を示す図である。図中、パネルＡは、Ｗｎｔ３ａ又はモック上清の存在下、マウス胎仔の線維芽細胞上のＥ１４．１細胞のＡｌｐ染色の結果を示す。上部カラムは、外因的なＬＩＦ存在下、下部パネルは、外因的ＬＩＦ非存在下の結果を示す。パネルＢは、マウス胎仔の線維芽細胞上の胚性幹細胞に対するＬＩＦ及び／又はＷｎｔアンタゴニストの影響を調べた結果を示す。抗ＬＩＦ抗体（１μｇ／ｍｌ）若しくはマウスＦｚ８−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）又は両方を、外因的ＬＩＦの非存在下、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたＥ１４．１細胞に添加した。３００コロニー中のＡｌｐ陽性コロニーの割合を示す。実験は、３回繰り返し、代表的なデータを示す。パネルCは、フィーダーと無関係のＥ１４．１細胞のＡｌｐ染色を示す。パネルＤは、Ｗｎｔ３ａ上清と共に１４日間培養されたフィーダーフリーのＥ１４．１細胞キメラマウスから作製されたキメラマウスを示す。
【図４】図４は、Ｗｎｔ３ａによるサル胚性幹細胞の維持を示す図である。パネルＡは、マウス胎仔の線維芽細胞上で培養されたサル胚性幹細胞に対するＷｎｔ３ａ上清の影響を示す図である。上部カラムは、Ａｌｐ染色、下部カラムは、ＳＳＥＡ−４染色を示す。パネルＢは、マウス胎仔の線維芽細胞なしで培養されたサル胚性幹細胞を示す。Ｗｎｔ３ａ上清を用いた場合のＡｌｐ染色（左）は、マウスＦｚ８−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）により阻害された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤。
【請求項２】
Ｗｎｔファミリーのタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１記載の維持剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の維持剤を含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地。
【請求項４】
白血病阻害因子をさらに含有してなる、請求項３記載の維持用培地。
【請求項５】
哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
哺乳動物が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた１種である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養する、請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
樹立胚性幹細胞を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法。
【請求項９】
樹立胚性幹細胞が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた哺乳動物の樹立胚性幹細胞である、請求項８記載の維持方法。
【請求項１０】
樹立胚性幹細胞を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持する、請求項８又は９記載の維持方法。
【請求項１】
Ｗｎｔファミリーのタンパク質を有効成分として含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持剤。
【請求項２】
Ｗｎｔファミリーのタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１記載の維持剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の維持剤を含有してなる、胚性幹細胞の未分化状態の維持用培地。
【請求項４】
白血病阻害因子をさらに含有してなる、請求項３記載の維持用培地。
【請求項５】
哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下に培養して、胚性幹細胞を得ることを特徴とする、胚性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
哺乳動物が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた１種である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
哺乳動物の胚盤胞期胚から得られた内部細胞塊を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に培養する、請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
樹立胚性幹細胞を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下に維持することを特徴とする、胚性幹細胞の未分化状態の維持方法。
【請求項９】
樹立胚性幹細胞が、ヒト、サル及びマウスからなる群より選ばれた哺乳動物の樹立胚性幹細胞である、請求項８記載の維持方法。
【請求項１０】
樹立胚性幹細胞を、請求項１又は２記載の維持剤の存在下、かつフィーダー細胞の非存在下に維持する、請求項８又は９記載の維持方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−３４５７０２（Ｐ２００６−３４５７０２Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−２８７２０７（Ｐ２００３−２８７２０７）
【出願日】平成１５年８月５日（２００３．８．５）
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
【出願人】（３９１０１２３２７）東京大学長 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月５日（２００３．８．５）
【出願人】（０００００２９５６）田辺製薬株式会社 (225)
【出願人】（３９１０１２３２７）東京大学長 (4)
【Ｆターム（参考）】
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