腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤
【課題】 効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供すること。
【解決手段】 インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とするものである。
【解決手段】 インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法や、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法など、腫瘍細胞に壊死を誘導する治療方法は、ある種の癌に対して効果があることは疑いのない事実である。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものではなく、臨床患者においては、腫瘍壊死誘導療法だけでは癌の原発巣ならびに転移を完全に抑制することは困難な場合が多い。そこで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強するために、ある種のサイトカインを腫瘍壊死誘導療法に併用する治療方法が提案されている。この治療方法は、サイトカインによって宿主の免疫系を活性化することで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強しようとするものである。例えば、非特許文献１には、ＴＮＦ−αとＩＬ−２を全身温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献２や非特許文献３や非特許文献４には、ＩＬ−２を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献５には、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γと抗癌剤であるメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。
【非特許文献１】Fritz, K.L. et al. J. Surg. Res. 60, 55-60(1996)
【非特許文献２】Geeham, D.M. et al. J. Surg. Oncol. 59, 35-39(1995)
【非特許文献３】Nakayama, J. et al. Br. J. Dermatol. 130, 717-724(1994)
【非特許文献４】Shen, R.-N. et al. Cancer Res. 50, 5027-5030(1990)
【非特許文献５】Lienard, D. et al. J. Clin. Oncol. 10, 52-60(1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これまでに提案されている上記の方法は、サイトカインによる宿主の免疫系活性化作用が必ずしも十分ではなく、また、サイトカインを多量に投与しなければならないために重篤な有害事象を招く恐れがあるので、一般的な癌の治療方法にはなり得なかった。
【０００４】
そこで本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これまで、癌の免疫療法としては、癌ワクチン療法や、樹状細胞（ＤＣ）療法、サイトカイン遺伝子などを用いた遺伝子治療など、多くの臨床試験が試行されてきたが、癌患者のひどい免疫抑制状態による様々なバリアーを克服することは非常に困難である。腫瘍細胞は宿主の免疫防御に打ち勝って増殖しているので、免疫療法のみで癌を退縮させることは難しいかもしれない。免疫療法の抗腫瘍効果を改良するためには、腫瘍細胞に壊死を誘導できる温熱療法や放射線療法などの他の治療方法を併用することが重要かもしれない。免疫療法以外の方法により腫瘍細胞に壊死を誘導した後で、十分な樹状細胞の活性化および細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やナチュラルキラー細胞（ＮＫ）などのキラーリンパ球の効果的な誘導の可否が免疫療法の重要な鍵となる。一方で、感染と華氏１０２から１０５度（３８．８〜４０．６℃）の高熱の後に様々な種類の癌が自然退縮することが知られていて、コーリィ毒素（感染すると高熱を生じる２種類の細菌を熱で不活性化したもの）は、癌患者においてある程度の治療効果を得ている。これらの場合、癌患者にサイトカインストーム（多種多様のサイトカインが嵐のイメージのように同時に誘導されること）が誘導され、免疫抑制状況に打ち勝つ強力な抗腫瘍免疫が確立された可能性がある。そこで、本発明者は、腫瘍壊死誘導療法の１つである温熱療法に対し、多種多様のサイトカインを使用して人工的にサイトカインストームを誘導するサイトカインカクテル療法を試みたところ、その抗腫瘍効果が増強されることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１記載の通り、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
また、請求項２記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１記載の抗腫瘍効果増強剤において、インターフェロンが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項３記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１または２記載の抗腫瘍効果増強剤において、Ｔｈ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項４記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４であることを特徴とする。
また、請求項５記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至４のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、炎症誘導サイトカインが、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項６記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至５のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、樹状細胞誘導サイトカンインが、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項７記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、サイトカインカクテルが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする。
また、請求項８記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至７のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、腫瘍壊死誘導療法が、物理療法であることを特徴とする。
また、本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項９記載の通り、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
また、本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１０記載の通り、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とするものである。
【０００９】
本発明において、インターフェロンとは、脊椎動物の細胞に抗ウィルス活性を誘導したり、単球やマクロファージやナチュラルキラー細胞の活性を増強したりする作用などを有する低分子量の蛋白質を意味し、具体的には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどを挙げることができる。ここで、ＩＦＮ−αとは、主に白血球が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−βとは、主に繊維芽細胞が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−γとは、ＩＬ−１２により主にＴ細胞やナチュラルキラー細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の機能と増殖を阻害する作用を有するインターフェロンを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１０】
本発明において、Ｔｈ１サイトカインとは、Ｔｈ１細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ１）が産生またはＴｈ１細胞を誘導・増殖し、その結果、細胞性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−２とは、Ｔｈ１細胞が産生し、リンパ球の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１２とは、樹状細胞や単球やマクロファージなどが産生し、ナイーブＴｈ細胞からのＴｈ１細胞への分化を促進したり、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１５とは、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、Ｔ細胞の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１８とは、単球やマクロファージなどが産生し、Ｔ細胞を増殖したり、ＩＬ−１２とは別の経路によりＴｈ１細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１１】
本発明において、Ｔｈ２サイトカインとは、Ｔｈ２細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ２）が産生し、液性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−４などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−４とは、Ｔｈ２細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の誘導とＴｈ１細胞の誘導抑制作用や、Ｂ細胞の増殖や活性化などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１２】
本発明において、炎症誘導サイトカインとは、感染症などに対する宿主反応として生じる発熱、発赤、腫脹、疼痛などを伴う炎症反応を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−１αとは、単球やマクロファージ、Ｔｈ２細胞などが産生し、Ｔｈ２細胞やＢ細胞の増殖・分化促進、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの産生の誘導、発熱などの作用を有するサイトカインのうち、等電点が５．０のものを意味する。ＴＮＦ−αとは、Ｔｈ１細胞、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、単球やマクロファージや血管内皮細胞などからのＩＬ−１、ＩＬ−６などの産生誘導、好中球機能の増強、発熱活性などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１３】
本発明において、樹状細胞誘導サイトカンインとは、樹状細胞を誘導する作用を有するサイトカンインを意味し、具体的には、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−３とは、Ｔ細胞や胸腺上皮細胞が産生し、造血幹細胞や造血前駆細胞の分化、樹状細胞や好酸球の分化などの作用を有するサイトカインを意味する。ＧＭ−ＣＳＦとは、骨髄支持細胞やマクロファージやＴ細胞が産生し、骨髄前駆細胞からの樹状細胞やマクロファージ、好中球、好酸球の分化増殖などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１４】
インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、好適には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦの１２種類のサイトカインからなる。各々のサイトカインは、自体公知の方法で製剤化されたものであってよく、これらは、静脈内投与や筋肉内投与や皮下投与などの方法によって非経口的に投与される。各々のサイトカインは、ある閾値以下の投与量では、いくら複数のサイトカインを併用しても各々のサイトカインの効果が生じない可能性がある。抗腫瘍効果を得るためには、必要十分な免疫応答を誘導するための最低投与量以上を併用することが望ましいが、その具体的な投与量は、患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定すべきものである。一般的には１〜１００００万単位／日の範囲内である。腫瘍壊死誘導療法により壊死した腫瘍細胞が存在することが、その後の抗腫瘍免疫応答を誘導するサイトカインカクテル療法には重要である。サイトカインカクテルの投与時期は、例えば、１週間に１〜２度行う腫瘍壊死誘導療法の直前、同時、直後のいずれでもよい。しかしながら、いずれにしても、有効な腫瘍免疫応答を誘導するために、壊死した腫瘍細胞とサイトカインが生体内で少なくても数日程度は同時に存在していることが望ましいと考えられる。サイトカインは生体内での半減期が短いために、反復投与することが重要であるが、例えば、上記の１２種類のサイトカインを連日全て投与することは、患者への負荷が大きすぎることが推測されるので、数種類のサイトカインは数日おきに投与することを検討することが望ましい。
【００１５】
本発明の抗腫瘍効果増強剤が併用される腫瘍壊死誘導療法は、可能な限り広義に解釈されるべきものであり、腫瘍細胞に壊死を誘導することで癌の治療効果をあげることができる方法であればどのような治療方法であってもよい。具体的には、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法が好適に例示される。ここで、物理療法とは、物理的なエネルギーを人体に外部から適用したり、カテーテルなどを介して各種の塞栓物質を血管内に注入することで腫瘍血管を物理的に閉塞させたりするなど、薬剤の直接的な効果だけにはよらない物理的な手技を用いる癌の治療方法を意味する。温熱療法は、物理的なエネルギーとして熱を利用した方法である。具体的には、電磁波、放射線、超音波、温水、機能性磁性微粒子の交流磁場下での発熱などによる熱の力により、表在や深部にある腫瘍細胞を直接壊死させたり、担癌宿主の免疫システムを活性化させて抗腫瘍効果を発揮させたりする方法であって、腫瘍局所を加温する局所加温法と全身加温法に大別される。主にＴｈｅｍｏｔｒｏｎ−ＲＦなどのｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＲＦ）波を用いた誘電型加温装置やマイクロ波加温装置が使用されているが、放射型深部加温装置、ｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ方式による加温装置、血液の体外循環による加温装置、超音波を用いて深部腫瘍を焼くＨｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＨＩＦＵ）による装置などもある。凍結療法は、液体窒素などにより腫瘍組織を凍結融解して破壊する方法である。放射線療法は、物理的なエネルギーとして放射線を利用した方法である。放射線とは、物質を通過するときに衝突によって直接または間接に電離を起こしたり、核変換を起こすのに十分な運動エネルギーをもったりした粒子である。癌治療に用いられる放射線には、ライナックやベータートロンなどの照射装置から発生する高エネルギーＸ線や高エネルギー電子線、コバルト６０遠隔照射装置や高線量率腔内照射装置で使用する60Ｃｏや192Ｉｒなどから発生するγ線、Ｘ線やγ線に比較して線量分布が優れている陽子線、生物学的効果が優れている中性子線、線量分布と生物学的効果の両方が優れている重粒子線などがある。光凝固法と光線力学的治療法は、物理的なエネルギーとして光を利用した方法である。前者は、レーザー光線で腫瘍組織を焼いたり蒸散させたりする方法であり、後者は、腫瘍組織や腫瘍の新生血管に特異的に集積するＰｈｏｔｏｆｒｉｎ、ＢＰＤ−ＭＡ、ＮＰｅ６、ＡＴＸ−Ｓ１０、ＳｎＥＴ２、ＡＬＡ、Ｌｕｔｅｘなどの光センシタイザーを投与してからレーザーを照射し、光の励起により発生する一重項酸素によって腫瘍を破壊する方法である。腫瘍血管塞栓療法は、カテーテルなどを介して血管内にＬｉｐｉｏｄｏｌ、ゼラチンスポンジ、澱粉粒子で作成したＤＳＭ、エタノール、シアノアクリレート、金属コイルなどの塞栓物質を投与して腫瘍血管内を塞ぐことで、腫瘍細胞への栄養や酸素供給を途絶させて抗腫瘍効果を生じさせる方法である。なお、腫瘍壊死誘導療法は、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法であってもよい。抗癌剤とは、塩基と結合してＤＮＡ鎖内やＤＮＡ鎖間にｃｒｏｓｓｌｉｎｋを形成したり、ＤＮＡ鎖を切断したり、ＤＮＡやＲＮＡの合成阻害をしたり、ＲＮＡに機能障害を生じさせたり、ＤＮＡ複製に必要なトポイソメラーゼを阻害したり、細胞分裂装置である微小管の重合・脱重合を阻害したりすることなどによって抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、ｔｈｉｏｐｅｔａ，ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ，ｂｕｓｕｌｆａｎ，ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ（ＢＣＮＵ），ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ（ＣＣＮＵ），ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＭＣＮＵ），ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＡＣＮＵ），ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ｎｅｄａｐｌａｔｉｎなどのアルキル化剤、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ，ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ），ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ），ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ，ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ，ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ，ａｍｒｕｂｉｃｉｎなどの抗癌性抗生物質、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ，ｎａｖｅｌｂｉｎｅ，ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ｎｏｇｉｔｅｃａｎ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｄｏｃｅｔａｘｅｌなどの植物アルカロイド、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｂｅｈｅｎｏｙｌ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｔｅｇａｆｕｒ，ＵＦＴ，ｃａｒｍｏｆｕｒ，ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ，Ｓ1，ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ，ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ，ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ，ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅなどの代謝拮抗剤、その他、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓ，ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ，亜砒酸などがある。ホルモン剤とは、ホルモン依存性の癌に対してそのホルモンの効果を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、女性ホルモン（エストロゲン）依存性の乳癌に対しては、抗エストロゲン作用を有する、ｔａｍｏｘｉｆｅｎ，ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ，ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｆａｄｒｏｚｏｌｅ，ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ，ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅなどが、男性ホルモン（アンドロゲン）依存性の前立腺癌に対しては、抗アンドロゲン作用を有する、ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ，ｆｌｕｔａｍｉｄｅ，ｆｏｓｆｅｓｔｒｏｌ，ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ，ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ，ｇｏｓｅｒｅｌｉｎなどがある。血管新生阻害剤とは、腫瘍に栄養や酸素を供給する腫瘍血管の新生を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、血管新生に関与する遺伝子産物を標的としたＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）阻害薬や、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害薬、血管内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のチロシンキナーゼ阻害薬などがある。分子標的薬とは、癌細胞の分子生物学的特徴に注目し、正常細胞には影響の少ない新しい治療薬として開発され、腫瘍細胞の増殖、分裂、浸潤や転移に関与する遺伝子産物の機能を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、慢性骨髄性白血病や胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に対するＫＩＴチロシンキナーゼ阻害薬のｉｍａｔｉｎｉｂ、非小細胞肺癌に対する上皮増殖因子受容体阻害薬のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、乳癌に対するレセプター型チロシンキナーゼＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）に対するモノクローナル抗体のｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対するＣＤ２０を標的としたモノクローナル抗体のｒｉｔｕｘｉｍａｂや抗ＣＤ２０抗体に放射性同位元素を抱合させた90Ｙ ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病に対するＣＤ３３抗体と抗癌性抗生物質のｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎとの結合体であるｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎなどがある。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１７】
実施例１：ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。ＬＬＣ細胞は理研細胞開発銀行から取り寄せた。ＬＬＣ細胞の培養には日水２のＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＬＬＣ細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。
【００１８】
ＬＬＣ細胞を接種したマウスは次の７つのグループに分け、腫瘍接種後９日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．５℃±０．２℃×９０分を１０、１７、２４日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：ＩＦＮ投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）＋局所温熱療法群（同上）
ｅ）グループ５：Ｔｈ１サイトカイン投与群（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）＋局所温熱療法群（同上）
ｆ）グループ６：Ｔｈ１サイトカイン投与群（同上）＋ＩＦＮ投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
ｇ）グループ７：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
【００１９】
なお、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。ＩＬ−２は塩野義製薬社から購入した。ＩＬ−１８はＭＢＬ社から購入した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。ＩＬ−２とＩＬ−１５はヒト由来のものを用いた（ヒト由来のものでもマウス由来のものでも同じ活性を示す）。他のサイトカインはマウス由来のものを用いた。各々のサイトカインは０．０５ｍｌのＰＢＳに懸濁してマウスの後肢か臀部に皮下投与した。各々のサイトカインの１回投与量は、ＩＬ−１α：５００００ＩＵ、ＩＬ−２：３５００ＩＵ、ＩＬ−３とＩＬ−４とＩＬ−１２：１０００ＩＵ、ＩＬ−１５：５００ＩＵ、ＩＬ−１８：２２７ＩＵ（０．２５μｇ）、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β：２５００ＩＵ、ＩＦＮ−γ：１００００ＩＵ、ＴＮＦ−α：２０００ＩＵ、ＧＭ−ＣＳＦ：２５００ＩＵとした。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは２〜３日毎に計１０回投与した（腫瘍接種後９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０日目）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは週１回計４回投与した（腫瘍接種後９、１６、２３、３０日目）。
【００２０】
局所温熱療法はタイテック社製のＴｈｅｒｍｏｍｉｎｄｅｒ ＳＸ−１０Ｒで循環させた温水中にマウスの両後肢の膝下をつけることにより施行した。マウスの中心体温としてＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の温度測定器ＢＡＴ−１０Ｒに接続したＲＥＴ−３プローブにて直腸温を５〜１０分間隔でモニターした。０．２〜０．２５ｍｌのペントバルビタール（大日本製薬社製ネンブタール）の腹腔内投与による麻酔と７０％エタノールの背中への散布下（直腸温の上昇を防ぐために使用）で局所温熱療法中のマウスの中心体温は３４℃から３８℃の間に維持した。各グループ間でマウスの中心体温に有意差はなかった。腫瘍表面の温度は、局所温熱療法５分後には設定した水温と同じになることを確認した。２匹の別のマウスで腫瘍中心の温度も設定した水温と同じになっていることをＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の２９ゲージのプローブにて確認した（腫瘍中心部の温度測定のためには細くても針をさすために腫瘍から出血を起こすので、当該実験のマウスでは行えない）。
【００２１】
（実験結果）
図１に示す。図１において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図１から明らかなように、腫瘍接種後３５日目の時点で、グループ７（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）だけが全てのマウスが生存していた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にてグループ７の生存率が有意に最も高く、グループ１（ＰＢＳ）、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ＩＦＮ）に対してはｐ＜０．０１で、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してはｐ＜０．０５で、グループ５（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対してはｐ＝０．０５であった。なお、グループ６（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ／ＩＦＮ）は、５匹中２匹のマウスが２回目の温熱療法中に腫瘍からの出血のために死亡したので、解析から除いた。
原発腫瘍（各癌腫瘍接種部位に生じた腫瘍）に対し、ノギスを用いて２方向の直径を測定した。腫瘍体積をＶ＝０．５（ａｂ2）(ａ、ｂは腫瘍の直径で、ｂが短径)で計算したところ、足背に形成された原発腫瘍の増殖は、グループ５、グループ６、グループ７において抑制された。腫瘍接種後９日目に治療を開始したが、その時の各グループでの腫瘍の平均径には一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。腫瘍接種２１日目以後になると、原発腫瘍の増大やそこからの出血、肺転移により数匹のマウスが死亡したので、２１日目の原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果、温熱治療のみのグループ２（６９３ｍｍ3）では、コントロール群であるグループ１（２１６２ｍｍ3）に比較して統計学的に有意な腫瘍抑制効果が認められなかった。しかし、グループ５（５６０ｍｍ3）、グループ６（３６９ｍｍ3）、グループ７（２５５ｍｍ3）では、有意に抑制された（スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定でｐ＜０．０１）。原発腫瘍の増殖はグループ６とグループ７で最も抑制され、両方のグループとも５匹中２匹のマウスで腫瘍の一時的な縮小が認められた。実験を終了した腫瘍接種後３５日目までの時点で統計学的な解析が可能であったグループは２、５、７の３群であった。治療を開始した９日目から３５日目のグループ７の腫瘍増殖曲線は、グループ２と５のそれに比較して、統計学的に有意に抑制された（多重比較検定法でｐ＜０．０１）。腫瘍接種後２３日目以後に解剖したマウスにおいて肉眼的な肺転移の有無を解析した。その結果、グループ７では、肺転移は５匹中１匹だけに認められた。グループ１と５では５匹中４匹に、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６では５匹中５匹のマウスに肺転移が認められた。グループ７では、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６と比較して有意に肺転移が抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。
【００２２】
実施例２：Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞はテキサス大学アンダーソン癌センターのＦｉｄｌｅｒ博士から分与していただいた。Ｂ１６−ＢＬ６細胞の培養にはＧｉｂｃｏ社製のＤＭＥＭ培地に７．５％ＦＢＳ・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＢ１６−ＢＬ６細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。
【００２３】
Ｂ１６−ＢＬ６細胞を接種したマウスは次の４つのグループに分け、腫瘍接種後１１日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．０℃±０．２℃×１２０分を１２、１９日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
【００２４】
なお、各々のサイトカインに関する詳細と投与量は実施例１と同じである。各々のサイトカインの投与方法はＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは毎日計１０回投与した（腫瘍接種後１１日目から２０日目まで）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは３日毎に計４回投与した（腫瘍接種後１１、１４、１７、２０日目）。
【００２５】
局所温熱療法は実施例１と同様にして行った。
【００２６】
（実験結果）
図２に示す。図２において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図２から明らかなように、腫瘍接種後２４５日目の時点で、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）の生存率が最も高く、５匹中３匹のマウスが生存しており、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にて、グループ１（ＰＢＳ）、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してｐ＜０．０１であった。
原発腫瘍の増殖抑制効果を実施例１と同様にして測定した。その結果、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ３、グループ４において原発腫瘍の増殖は抑制された。腫瘍接種後１１日目に治療を開始した時点での各グループの腫瘍の平均径は、一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。治療が終了した腫瘍接種後２１日目の時点で原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果は、グループ１で９８８ｍｍ3、グループ２で３９４ｍｍ3、グループ３で２３１ｍｍ3、グループ４で３１ｍｍ3であった。治療群では、コントロール群のグループ１に対して、スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定で有意に腫瘍の増大が抑制された（グループ３、グループ４対グループ１はｐ＜０．０１、グループ４対グループ３はｐ＜０．０１、グループ２対グループ１はｐ＜０．０５）。全てのグループで最後に統計学的な解析が可能であった腫瘍接種後２５日目の時点で、原発腫瘍径の平均値は、グループ１で１４５６ｍｍ3、グループ２で１０３１ｍｍ3、グループ３で４００ｍｍ3、グループ４で７ｍｍ3となり、グループ４ではグループ２に比較しても有意に腫瘍の増大が抑制された（ウェルチのｔ検定でｐ＜０．０５）。グループ４では５匹中３匹のマウスで原発腫瘍が完全に消失し、腫瘍接種後２４５日間の観察期間中に再発は認められなかった。残りの２匹のマウスにおいても、１匹では原発腫瘍は一時的に完全に消失し、他の１匹でも腫瘍からの出血死をするまでの間に原発腫瘍は徐々に縮小を続けた。肉眼的に認められた肺転移数の平均値は、グループ１で２３．６個、グループ２で７．５個、グループ３で３個であった。一方、グループ４では、全てのマウスで肺転移は認められなかった。グループ４ではグループ１、グループ２と比較して肺転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。腫瘍形成をした左後肢の膝リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で１００％（４／４）、グループ３で６０％（３／５）、グループ４で２０％（１／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して膝リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。左鼠径（左後肢の付け根）リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で５０％（２／４）、グループ３で４０％（２／５）、グループ４で０％（０／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して左鼠径リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。また、治癒したマウス３匹の病理組織学的な解析で、リンパ節や胸腺・脾臓などのリンパ系組織の過形成が観察された。また、腫瘍細胞移植後２４５日も経過した時点で、肺においてのみリンパ球の集積が複数箇所において認められた。他の治療群では観察された肺転移像は全く認められなかった。これらの治癒マウスにおいては、一度生じた肺転移が、本治療方法によって誘導されたキラーリンパ球によって消滅した可能性も考えられる。
【００２７】
実施例１と実施例２のまとめ：
実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、Ｔｈ１サイトカイン類（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）は温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。Ｔｈ１サイトカイン類の温熱療法との併用により、原発腫瘍の増大がコントロール群に比較して有意に抑制された。この知見は、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５は細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することが報告されている。ＩＬ−１８は樹状細胞（ＤＣ）からのＩＦＮ−γの強力な誘導剤であり、ＩＬ−１２との併用により数種類のマウス腫瘍の増殖を抑制することが報告されている。また、ＩＦＮ類（ＩＦＮ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−γ）をＴｈ１サイトカイン類（同上）と組み合わせて併用すると、原発腫瘍径の平均値はＴｈ１サイトカイン類単独併用時よりも小さくなった。この知見も、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＦＮ−γは細胞障害性Ｔ細胞を誘導したり、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）やマクロファージを活性化したり、樹状細胞などの抗原提示細胞や腫瘍細胞において腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩの発現を増強することが報告されている。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−γと同様にナチュラルキラー細胞やマクロファージを活性化したり、腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩの発現を増強したり、また抗ウィルス効果を誘導したりすることが報告されている。しかし、ＩＦＮ類だけの併用では温熱療法の抗腫瘍効果を増強できなかった。その増強には、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類の併用が重要である。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは細胞膜上の受容体以後の細胞内情報伝達経路は共通であると考えられているので、温熱療法などの腫瘍壊死誘導療法とサイトカイン類の併用時にはどちらか一方でもよいのかもしれない。
【００２８】
実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、本発明の１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。この１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の原発腫瘍の増大も抑制した。実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類と温熱療法との併用よりも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法の方が、腫瘍接種後２１日目の原発腫瘍の平均径をより小さくした（３６９ｍｍ3対２５５ｍｍ3）。さらに、実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の肺転移も強力に抑制した。他の治療法はいずれの細胞の肺転移も抑制しなかった。最終的な生存率も、この治療方法で最も長い結果が得られた。特に実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、この治療方法により６０％のマウスで腫瘍が消失し、それらのマウスでは２４５日の観察期間中に局所再発も肺・リンパ節への転移も生じなかった。ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞を誘導・分化させることが報告されている。樹状細胞（ＤＣ）は腫瘍関連抗原をその細胞膜上に提示して細胞障害性Ｔ細胞を誘導することで、腫瘍特異的な免疫応答を生じさせるのに重要である。ＴＮＦ−αはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を活性化したり、リンパ球を増殖させたり、マクロファージから炎症誘導サイトカインであるＩＬ−１やＩＬ−６を誘導したり、血管内皮細胞を活性化させたり、発熱反応を生じさせることが報告されている。ＩＬ−１αは、リンパ球や血管内皮細胞を活性化させたり、炎症部位で局所組織を破壊することによりエフェクター細胞の侵入を容易にしたり、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの炎症誘導サイトカインの産生を誘導したり、発熱反応を生じさせることが報告されている。
【００２９】
Ｔｈ２リンパ球とＴｈ１リンパ球はお互いに制御してバランスを取り合っている。Ｔｈ１リンパ球から産生されるＩＦＮ−γはＴｈ２リンパ球の分化と増殖を抑制し、Ｔｈ２リンパ球から産生されるＩＬ−４やＩＬ−１０はＴｈ１リンパ球の分化と増殖を抑制する。１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルにより、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果が増強されたことは、担癌状態では従来言われているＴｈ１リンパ球だけでなく、Ｔｈ２リンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、多核白血球など、全ての免疫関連細胞が抑制されている可能性がある。実際に、卵白アルブミンを人工的に遺伝子導入したマウス腫瘍細胞の系を用いた免疫療法実験では、治癒機転としてＴｈ１リンパ球が誘導される場合とＴｈ２リンパ球が誘導される場合があることが報告されている。また、細胞障害性Ｔ細胞の増殖と活性化に必要なＩＬ−２が、逆に一度活性化されたＴリンパ球の機能を抑制するＣＴＬＡ−４という分子を誘導するという知見もある。一種類のサイトカインだけを使用すると、担癌状態といえども生体内でその経路に対する抑制経路が生じて、十分な抗腫瘍効果が得られない可能性も考えられる。これまでの多くの知見より、強い免疫抑制状況にある担癌状態においては１〜２種類のサイトカインを用いても、抗腫瘍効果に関与する免疫系全体を活性化することは極めて困難なことであると考えられる。培養細胞や正常のマウスを使用して得られたサイトカインの免疫活性化作用の実験結果は、担癌状態では機能していない可能性もある。実際に、ペプチドワクチンを用いた臨床試験では、せっかく細胞障害性Ｔ細胞が誘導されていても免疫抑制環境の強い腫瘍内では腫瘍細胞に対して障害活性を示さないという報告もされている。多種類のサイトカインを併用することにより、担癌状態での多種類の免疫抑制機序に対処し、多種類の免疫細胞を同時に活性化して有効な腫瘍免疫応答を誘導できる可能性がある。サイトカインストームを人工的に起こすことにより、自己免疫疾患を引き起こす可能性も否定できないので、その点は治療対象の選択と長期間の観察などの注意が必要である。今回の実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験で、２４５日間の経過観察をした３匹の治癒マウスでは、治療終了後は体重減少、脱毛、神経麻痺などの症状は見られなかった。逆に、Ｔｈ１サイトカイン類とＴｈ２サイトカイン類の併用により、どちらか一方だけが活性化されることを防ぎ、生体内で免疫応答のバランスが適切にとれる可能性も期待できる。また、多種類のサイトカインを併用することで、一つ一つのサイトカインの投与量を減らせる可能性があり、有害事象を減らせる可能性も期待できる。
【００３０】
温熱療法に併用した１２種類のサイトカインカクテル療法の抗腫瘍効果は、Ｂ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の方がＬＬＣ細胞を用いた実施例１よりも強かった。前者では６０％（３／５）のマウスで足背の原発腫瘍が消失し、また全てのマウスで肺転移が認められなかった。しかし、治癒マウス３匹のうち２匹のマウスでは、治療中に腫瘍形成した左足が壊死により欠失し、また全てのマウスで後肢に一時的な脱毛が生じた。一方で、後者では足の欠失や脱毛は見られなかったが、原発腫瘍は完全には消失せず、肺転移も認められた。これらの理由としては、ＬＬＣ細胞の増殖速度がＢ１６−ＢＬ６細胞よりも速かったこと、治療開始時点の腫瘍径の平均値の違い（ＬＬＣ細胞群：７２．６ｍｍ3、Ｂ１６−ＢＬ６細胞群：４０．６ｍｍ3）が考えられる。また、２つの実験では、温熱療法の温度と処理時間（前者は４３．５℃±０．２℃×９０分、後者は４３．０℃±０．２℃×１２０分）、サイトカイン類の投与間隔（前者は２〜３日毎か１週間毎、後者は連日か３日毎）が異なっていた点もある。
【００３１】
ＬＬＣ細胞を用いた実施例１とＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の２つの実験結果より、十分な抗腫瘍効果を得るためには１２種類のサイトカインの投与は１週間に２回以上必要であることが推測される。抗腫瘍効果を高めて有害事象を減らすためには、腫瘍壊死誘導療法の最適化、例えば、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の場合には、その強度や処理時間や処理間隔の最適化、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法の場合には、その投与量や投与間隔の最適化などに加え、サイトカイン類の投与量や投与間隔や投与量の最適化などを検討して、個々の患者に対する最適な方法を確立しなければいけない。また、各サイトカインの併用時における作用機序やその有用性についても検討しなければいけない。過去に施行した別のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、温熱療法のみで腫瘍形成させた足が欠失した場合には、１週間前後で必ずその断端への局所再発や膝リンパ節への転移が生じ、腫瘍の根治は決してできなかった。しかし、今回の温熱療法に１２種類のサイトカインカクテル療法を併用した場合には、局所再発や膝リンパ節への転移が認められたのは２０％（１／５）のみであった。サイトカインが免疫応答の調節を担っていること、治癒マウスにおいてリンパ系組織の過形成と腫瘍の転移先である肺においてのみリンパ球の集積が認められたことより、温熱療法とサイトカインカクテル療法により、何らかの抗腫瘍免疫学的なメカニズムが作用した可能性が示唆される。
【００３２】
温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の他、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法を含め、腫瘍に壊死を誘導する様々な治療方法が施行されている。それらの腫瘍壊死誘導療法においては、いかに効率よく多くの腫瘍細胞を壊死させられるかという点が重要である。腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強する目的で、前述の通り、いくつかの種類のサイトカインとの併用が試行されてきた。腫瘍壊死誘導療法とサイトカインの併用による癌治療は、壊死した腫瘍細胞をもとに、担癌宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導して腫瘍の縮小や再発・転移予防を行うことを目的としている。その際、腫瘍壊死誘導療法の種類によって、抗腫瘍効果の点で併用するサイトカインの種類が変わるという報告はこれまでのところ存在しない。むしろ、メラノーマにはＩＦＮ−γが、肝臓癌にはＩＦＮ−αやＩＦＮ−βが、腎臓癌にはＩＬ−２が効くなど、腫瘍の種類や個々の腫瘍の性質によって抗腫瘍効果のあるサイトカインの種類が規定されていて、サイトカインと併用する腫瘍壊死誘導療法は様々な種類が試みられている。以上の点に鑑みれば、今回の知見で得られたサイトカインカクテルは、腫瘍に壊死を誘導できる方法であれば、物理療法に限らず薬物療法に対しても、その抗腫瘍効果を増強できるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１における各試験群についての生存率を示す図である。
【図２】実施例２における各試験群についての生存率を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法や、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法など、腫瘍細胞に壊死を誘導する治療方法は、ある種の癌に対して効果があることは疑いのない事実である。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものではなく、臨床患者においては、腫瘍壊死誘導療法だけでは癌の原発巣ならびに転移を完全に抑制することは困難な場合が多い。そこで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強するために、ある種のサイトカインを腫瘍壊死誘導療法に併用する治療方法が提案されている。この治療方法は、サイトカインによって宿主の免疫系を活性化することで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強しようとするものである。例えば、非特許文献１には、ＴＮＦ−αとＩＬ−２を全身温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献２や非特許文献３や非特許文献４には、ＩＬ−２を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献５には、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γと抗癌剤であるメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。
【非特許文献１】Fritz, K.L. et al. J. Surg. Res. 60, 55-60(1996)
【非特許文献２】Geeham, D.M. et al. J. Surg. Oncol. 59, 35-39(1995)
【非特許文献３】Nakayama, J. et al. Br. J. Dermatol. 130, 717-724(1994)
【非特許文献４】Shen, R.-N. et al. Cancer Res. 50, 5027-5030(1990)
【非特許文献５】Lienard, D. et al. J. Clin. Oncol. 10, 52-60(1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これまでに提案されている上記の方法は、サイトカインによる宿主の免疫系活性化作用が必ずしも十分ではなく、また、サイトカインを多量に投与しなければならないために重篤な有害事象を招く恐れがあるので、一般的な癌の治療方法にはなり得なかった。
【０００４】
そこで本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これまで、癌の免疫療法としては、癌ワクチン療法や、樹状細胞（ＤＣ）療法、サイトカイン遺伝子などを用いた遺伝子治療など、多くの臨床試験が試行されてきたが、癌患者のひどい免疫抑制状態による様々なバリアーを克服することは非常に困難である。腫瘍細胞は宿主の免疫防御に打ち勝って増殖しているので、免疫療法のみで癌を退縮させることは難しいかもしれない。免疫療法の抗腫瘍効果を改良するためには、腫瘍細胞に壊死を誘導できる温熱療法や放射線療法などの他の治療方法を併用することが重要かもしれない。免疫療法以外の方法により腫瘍細胞に壊死を誘導した後で、十分な樹状細胞の活性化および細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やナチュラルキラー細胞（ＮＫ）などのキラーリンパ球の効果的な誘導の可否が免疫療法の重要な鍵となる。一方で、感染と華氏１０２から１０５度（３８．８〜４０．６℃）の高熱の後に様々な種類の癌が自然退縮することが知られていて、コーリィ毒素（感染すると高熱を生じる２種類の細菌を熱で不活性化したもの）は、癌患者においてある程度の治療効果を得ている。これらの場合、癌患者にサイトカインストーム（多種多様のサイトカインが嵐のイメージのように同時に誘導されること）が誘導され、免疫抑制状況に打ち勝つ強力な抗腫瘍免疫が確立された可能性がある。そこで、本発明者は、腫瘍壊死誘導療法の１つである温熱療法に対し、多種多様のサイトカインを使用して人工的にサイトカインストームを誘導するサイトカインカクテル療法を試みたところ、その抗腫瘍効果が増強されることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１記載の通り、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
また、請求項２記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１記載の抗腫瘍効果増強剤において、インターフェロンが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項３記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１または２記載の抗腫瘍効果増強剤において、Ｔｈ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項４記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４であることを特徴とする。
また、請求項５記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至４のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、炎症誘導サイトカインが、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項６記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至５のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、樹状細胞誘導サイトカンインが、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする。
また、請求項７記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至６のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、サイトカインカクテルが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする。
また、請求項８記載の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１乃至７のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤において、腫瘍壊死誘導療法が、物理療法であることを特徴とする。
また、本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項９記載の通り、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
また、本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１０記載の通り、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とするものである。
【０００９】
本発明において、インターフェロンとは、脊椎動物の細胞に抗ウィルス活性を誘導したり、単球やマクロファージやナチュラルキラー細胞の活性を増強したりする作用などを有する低分子量の蛋白質を意味し、具体的には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどを挙げることができる。ここで、ＩＦＮ−αとは、主に白血球が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−βとは、主に繊維芽細胞が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−γとは、ＩＬ−１２により主にＴ細胞やナチュラルキラー細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の機能と増殖を阻害する作用を有するインターフェロンを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１０】
本発明において、Ｔｈ１サイトカインとは、Ｔｈ１細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ１）が産生またはＴｈ１細胞を誘導・増殖し、その結果、細胞性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−２とは、Ｔｈ１細胞が産生し、リンパ球の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１２とは、樹状細胞や単球やマクロファージなどが産生し、ナイーブＴｈ細胞からのＴｈ１細胞への分化を促進したり、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１５とは、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、Ｔ細胞の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１８とは、単球やマクロファージなどが産生し、Ｔ細胞を増殖したり、ＩＬ−１２とは別の経路によりＴｈ１細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１１】
本発明において、Ｔｈ２サイトカインとは、Ｔｈ２細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ２）が産生し、液性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−４などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−４とは、Ｔｈ２細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の誘導とＴｈ１細胞の誘導抑制作用や、Ｂ細胞の増殖や活性化などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１２】
本発明において、炎症誘導サイトカインとは、感染症などに対する宿主反応として生じる発熱、発赤、腫脹、疼痛などを伴う炎症反応を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−１αとは、単球やマクロファージ、Ｔｈ２細胞などが産生し、Ｔｈ２細胞やＢ細胞の増殖・分化促進、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの産生の誘導、発熱などの作用を有するサイトカインのうち、等電点が５．０のものを意味する。ＴＮＦ−αとは、Ｔｈ１細胞、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、単球やマクロファージや血管内皮細胞などからのＩＬ−１、ＩＬ−６などの産生誘導、好中球機能の増強、発熱活性などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１３】
本発明において、樹状細胞誘導サイトカンインとは、樹状細胞を誘導する作用を有するサイトカンインを意味し、具体的には、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−３とは、Ｔ細胞や胸腺上皮細胞が産生し、造血幹細胞や造血前駆細胞の分化、樹状細胞や好酸球の分化などの作用を有するサイトカインを意味する。ＧＭ−ＣＳＦとは、骨髄支持細胞やマクロファージやＴ細胞が産生し、骨髄前駆細胞からの樹状細胞やマクロファージ、好中球、好酸球の分化増殖などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。
【００１４】
インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、好適には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦの１２種類のサイトカインからなる。各々のサイトカインは、自体公知の方法で製剤化されたものであってよく、これらは、静脈内投与や筋肉内投与や皮下投与などの方法によって非経口的に投与される。各々のサイトカインは、ある閾値以下の投与量では、いくら複数のサイトカインを併用しても各々のサイトカインの効果が生じない可能性がある。抗腫瘍効果を得るためには、必要十分な免疫応答を誘導するための最低投与量以上を併用することが望ましいが、その具体的な投与量は、患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定すべきものである。一般的には１〜１００００万単位／日の範囲内である。腫瘍壊死誘導療法により壊死した腫瘍細胞が存在することが、その後の抗腫瘍免疫応答を誘導するサイトカインカクテル療法には重要である。サイトカインカクテルの投与時期は、例えば、１週間に１〜２度行う腫瘍壊死誘導療法の直前、同時、直後のいずれでもよい。しかしながら、いずれにしても、有効な腫瘍免疫応答を誘導するために、壊死した腫瘍細胞とサイトカインが生体内で少なくても数日程度は同時に存在していることが望ましいと考えられる。サイトカインは生体内での半減期が短いために、反復投与することが重要であるが、例えば、上記の１２種類のサイトカインを連日全て投与することは、患者への負荷が大きすぎることが推測されるので、数種類のサイトカインは数日おきに投与することを検討することが望ましい。
【００１５】
本発明の抗腫瘍効果増強剤が併用される腫瘍壊死誘導療法は、可能な限り広義に解釈されるべきものであり、腫瘍細胞に壊死を誘導することで癌の治療効果をあげることができる方法であればどのような治療方法であってもよい。具体的には、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法が好適に例示される。ここで、物理療法とは、物理的なエネルギーを人体に外部から適用したり、カテーテルなどを介して各種の塞栓物質を血管内に注入することで腫瘍血管を物理的に閉塞させたりするなど、薬剤の直接的な効果だけにはよらない物理的な手技を用いる癌の治療方法を意味する。温熱療法は、物理的なエネルギーとして熱を利用した方法である。具体的には、電磁波、放射線、超音波、温水、機能性磁性微粒子の交流磁場下での発熱などによる熱の力により、表在や深部にある腫瘍細胞を直接壊死させたり、担癌宿主の免疫システムを活性化させて抗腫瘍効果を発揮させたりする方法であって、腫瘍局所を加温する局所加温法と全身加温法に大別される。主にＴｈｅｍｏｔｒｏｎ−ＲＦなどのｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＲＦ）波を用いた誘電型加温装置やマイクロ波加温装置が使用されているが、放射型深部加温装置、ｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ方式による加温装置、血液の体外循環による加温装置、超音波を用いて深部腫瘍を焼くＨｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＨＩＦＵ）による装置などもある。凍結療法は、液体窒素などにより腫瘍組織を凍結融解して破壊する方法である。放射線療法は、物理的なエネルギーとして放射線を利用した方法である。放射線とは、物質を通過するときに衝突によって直接または間接に電離を起こしたり、核変換を起こすのに十分な運動エネルギーをもったりした粒子である。癌治療に用いられる放射線には、ライナックやベータートロンなどの照射装置から発生する高エネルギーＸ線や高エネルギー電子線、コバルト６０遠隔照射装置や高線量率腔内照射装置で使用する60Ｃｏや192Ｉｒなどから発生するγ線、Ｘ線やγ線に比較して線量分布が優れている陽子線、生物学的効果が優れている中性子線、線量分布と生物学的効果の両方が優れている重粒子線などがある。光凝固法と光線力学的治療法は、物理的なエネルギーとして光を利用した方法である。前者は、レーザー光線で腫瘍組織を焼いたり蒸散させたりする方法であり、後者は、腫瘍組織や腫瘍の新生血管に特異的に集積するＰｈｏｔｏｆｒｉｎ、ＢＰＤ−ＭＡ、ＮＰｅ６、ＡＴＸ−Ｓ１０、ＳｎＥＴ２、ＡＬＡ、Ｌｕｔｅｘなどの光センシタイザーを投与してからレーザーを照射し、光の励起により発生する一重項酸素によって腫瘍を破壊する方法である。腫瘍血管塞栓療法は、カテーテルなどを介して血管内にＬｉｐｉｏｄｏｌ、ゼラチンスポンジ、澱粉粒子で作成したＤＳＭ、エタノール、シアノアクリレート、金属コイルなどの塞栓物質を投与して腫瘍血管内を塞ぐことで、腫瘍細胞への栄養や酸素供給を途絶させて抗腫瘍効果を生じさせる方法である。なお、腫瘍壊死誘導療法は、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法であってもよい。抗癌剤とは、塩基と結合してＤＮＡ鎖内やＤＮＡ鎖間にｃｒｏｓｓｌｉｎｋを形成したり、ＤＮＡ鎖を切断したり、ＤＮＡやＲＮＡの合成阻害をしたり、ＲＮＡに機能障害を生じさせたり、ＤＮＡ複製に必要なトポイソメラーゼを阻害したり、細胞分裂装置である微小管の重合・脱重合を阻害したりすることなどによって抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、ｔｈｉｏｐｅｔａ，ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ，ｂｕｓｕｌｆａｎ，ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ（ＢＣＮＵ），ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ（ＣＣＮＵ），ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＭＣＮＵ），ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＡＣＮＵ），ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ｎｅｄａｐｌａｔｉｎなどのアルキル化剤、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ，ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ），ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ），ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ，ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ，ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ，ａｍｒｕｂｉｃｉｎなどの抗癌性抗生物質、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ，ｎａｖｅｌｂｉｎｅ，ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ｎｏｇｉｔｅｃａｎ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｄｏｃｅｔａｘｅｌなどの植物アルカロイド、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｂｅｈｅｎｏｙｌ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｔｅｇａｆｕｒ，ＵＦＴ，ｃａｒｍｏｆｕｒ，ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ，Ｓ1，ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ，ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ，ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ，ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅなどの代謝拮抗剤、その他、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓ，ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ，亜砒酸などがある。ホルモン剤とは、ホルモン依存性の癌に対してそのホルモンの効果を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、女性ホルモン（エストロゲン）依存性の乳癌に対しては、抗エストロゲン作用を有する、ｔａｍｏｘｉｆｅｎ，ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ，ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｆａｄｒｏｚｏｌｅ，ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ，ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅなどが、男性ホルモン（アンドロゲン）依存性の前立腺癌に対しては、抗アンドロゲン作用を有する、ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ，ｆｌｕｔａｍｉｄｅ，ｆｏｓｆｅｓｔｒｏｌ，ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ，ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ，ｇｏｓｅｒｅｌｉｎなどがある。血管新生阻害剤とは、腫瘍に栄養や酸素を供給する腫瘍血管の新生を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、血管新生に関与する遺伝子産物を標的としたＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）阻害薬や、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害薬、血管内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のチロシンキナーゼ阻害薬などがある。分子標的薬とは、癌細胞の分子生物学的特徴に注目し、正常細胞には影響の少ない新しい治療薬として開発され、腫瘍細胞の増殖、分裂、浸潤や転移に関与する遺伝子産物の機能を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、慢性骨髄性白血病や胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に対するＫＩＴチロシンキナーゼ阻害薬のｉｍａｔｉｎｉｂ、非小細胞肺癌に対する上皮増殖因子受容体阻害薬のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、乳癌に対するレセプター型チロシンキナーゼＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）に対するモノクローナル抗体のｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対するＣＤ２０を標的としたモノクローナル抗体のｒｉｔｕｘｉｍａｂや抗ＣＤ２０抗体に放射性同位元素を抱合させた90Ｙ ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病に対するＣＤ３３抗体と抗癌性抗生物質のｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎとの結合体であるｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎなどがある。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１７】
実施例１：ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。ＬＬＣ細胞は理研細胞開発銀行から取り寄せた。ＬＬＣ細胞の培養には日水２のＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＬＬＣ細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。
【００１８】
ＬＬＣ細胞を接種したマウスは次の７つのグループに分け、腫瘍接種後９日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．５℃±０．２℃×９０分を１０、１７、２４日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：ＩＦＮ投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）＋局所温熱療法群（同上）
ｅ）グループ５：Ｔｈ１サイトカイン投与群（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）＋局所温熱療法群（同上）
ｆ）グループ６：Ｔｈ１サイトカイン投与群（同上）＋ＩＦＮ投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
ｇ）グループ７：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
【００１９】
なお、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。ＩＬ−２は塩野義製薬社から購入した。ＩＬ−１８はＭＢＬ社から購入した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。ＩＬ−２とＩＬ−１５はヒト由来のものを用いた（ヒト由来のものでもマウス由来のものでも同じ活性を示す）。他のサイトカインはマウス由来のものを用いた。各々のサイトカインは０．０５ｍｌのＰＢＳに懸濁してマウスの後肢か臀部に皮下投与した。各々のサイトカインの１回投与量は、ＩＬ−１α：５００００ＩＵ、ＩＬ−２：３５００ＩＵ、ＩＬ−３とＩＬ−４とＩＬ−１２：１０００ＩＵ、ＩＬ−１５：５００ＩＵ、ＩＬ−１８：２２７ＩＵ（０．２５μｇ）、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β：２５００ＩＵ、ＩＦＮ−γ：１００００ＩＵ、ＴＮＦ−α：２０００ＩＵ、ＧＭ−ＣＳＦ：２５００ＩＵとした。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは２〜３日毎に計１０回投与した（腫瘍接種後９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０日目）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは週１回計４回投与した（腫瘍接種後９、１６、２３、３０日目）。
【００２０】
局所温熱療法はタイテック社製のＴｈｅｒｍｏｍｉｎｄｅｒ ＳＸ−１０Ｒで循環させた温水中にマウスの両後肢の膝下をつけることにより施行した。マウスの中心体温としてＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の温度測定器ＢＡＴ−１０Ｒに接続したＲＥＴ−３プローブにて直腸温を５〜１０分間隔でモニターした。０．２〜０．２５ｍｌのペントバルビタール（大日本製薬社製ネンブタール）の腹腔内投与による麻酔と７０％エタノールの背中への散布下（直腸温の上昇を防ぐために使用）で局所温熱療法中のマウスの中心体温は３４℃から３８℃の間に維持した。各グループ間でマウスの中心体温に有意差はなかった。腫瘍表面の温度は、局所温熱療法５分後には設定した水温と同じになることを確認した。２匹の別のマウスで腫瘍中心の温度も設定した水温と同じになっていることをＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の２９ゲージのプローブにて確認した（腫瘍中心部の温度測定のためには細くても針をさすために腫瘍から出血を起こすので、当該実験のマウスでは行えない）。
【００２１】
（実験結果）
図１に示す。図１において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図１から明らかなように、腫瘍接種後３５日目の時点で、グループ７（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）だけが全てのマウスが生存していた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にてグループ７の生存率が有意に最も高く、グループ１（ＰＢＳ）、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ＩＦＮ）に対してはｐ＜０．０１で、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してはｐ＜０．０５で、グループ５（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対してはｐ＝０．０５であった。なお、グループ６（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ ｃｙｔｏｋｉｎｅ／ＩＦＮ）は、５匹中２匹のマウスが２回目の温熱療法中に腫瘍からの出血のために死亡したので、解析から除いた。
原発腫瘍（各癌腫瘍接種部位に生じた腫瘍）に対し、ノギスを用いて２方向の直径を測定した。腫瘍体積をＶ＝０．５（ａｂ2）(ａ、ｂは腫瘍の直径で、ｂが短径)で計算したところ、足背に形成された原発腫瘍の増殖は、グループ５、グループ６、グループ７において抑制された。腫瘍接種後９日目に治療を開始したが、その時の各グループでの腫瘍の平均径には一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。腫瘍接種２１日目以後になると、原発腫瘍の増大やそこからの出血、肺転移により数匹のマウスが死亡したので、２１日目の原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果、温熱治療のみのグループ２（６９３ｍｍ3）では、コントロール群であるグループ１（２１６２ｍｍ3）に比較して統計学的に有意な腫瘍抑制効果が認められなかった。しかし、グループ５（５６０ｍｍ3）、グループ６（３６９ｍｍ3）、グループ７（２５５ｍｍ3）では、有意に抑制された（スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定でｐ＜０．０１）。原発腫瘍の増殖はグループ６とグループ７で最も抑制され、両方のグループとも５匹中２匹のマウスで腫瘍の一時的な縮小が認められた。実験を終了した腫瘍接種後３５日目までの時点で統計学的な解析が可能であったグループは２、５、７の３群であった。治療を開始した９日目から３５日目のグループ７の腫瘍増殖曲線は、グループ２と５のそれに比較して、統計学的に有意に抑制された（多重比較検定法でｐ＜０．０１）。腫瘍接種後２３日目以後に解剖したマウスにおいて肉眼的な肺転移の有無を解析した。その結果、グループ７では、肺転移は５匹中１匹だけに認められた。グループ１と５では５匹中４匹に、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６では５匹中５匹のマウスに肺転移が認められた。グループ７では、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６と比較して有意に肺転移が抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。
【００２２】
実施例２：Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞はテキサス大学アンダーソン癌センターのＦｉｄｌｅｒ博士から分与していただいた。Ｂ１６−ＢＬ６細胞の培養にはＧｉｂｃｏ社製のＤＭＥＭ培地に７．５％ＦＢＳ・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＢ１６−ＢＬ６細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。
【００２３】
Ｂ１６−ＢＬ６細胞を接種したマウスは次の４つのグループに分け、腫瘍接種後１１日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．０℃±０．２℃×１２０分を１２、１９日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
【００２４】
なお、各々のサイトカインに関する詳細と投与量は実施例１と同じである。各々のサイトカインの投与方法はＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは毎日計１０回投与した（腫瘍接種後１１日目から２０日目まで）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは３日毎に計４回投与した（腫瘍接種後１１、１４、１７、２０日目）。
【００２５】
局所温熱療法は実施例１と同様にして行った。
【００２６】
（実験結果）
図２に示す。図２において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図２から明らかなように、腫瘍接種後２４５日目の時点で、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）の生存率が最も高く、５匹中３匹のマウスが生存しており、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にて、グループ１（ＰＢＳ）、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してｐ＜０．０１であった。
原発腫瘍の増殖抑制効果を実施例１と同様にして測定した。その結果、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ３、グループ４において原発腫瘍の増殖は抑制された。腫瘍接種後１１日目に治療を開始した時点での各グループの腫瘍の平均径は、一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。治療が終了した腫瘍接種後２１日目の時点で原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果は、グループ１で９８８ｍｍ3、グループ２で３９４ｍｍ3、グループ３で２３１ｍｍ3、グループ４で３１ｍｍ3であった。治療群では、コントロール群のグループ１に対して、スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定で有意に腫瘍の増大が抑制された（グループ３、グループ４対グループ１はｐ＜０．０１、グループ４対グループ３はｐ＜０．０１、グループ２対グループ１はｐ＜０．０５）。全てのグループで最後に統計学的な解析が可能であった腫瘍接種後２５日目の時点で、原発腫瘍径の平均値は、グループ１で１４５６ｍｍ3、グループ２で１０３１ｍｍ3、グループ３で４００ｍｍ3、グループ４で７ｍｍ3となり、グループ４ではグループ２に比較しても有意に腫瘍の増大が抑制された（ウェルチのｔ検定でｐ＜０．０５）。グループ４では５匹中３匹のマウスで原発腫瘍が完全に消失し、腫瘍接種後２４５日間の観察期間中に再発は認められなかった。残りの２匹のマウスにおいても、１匹では原発腫瘍は一時的に完全に消失し、他の１匹でも腫瘍からの出血死をするまでの間に原発腫瘍は徐々に縮小を続けた。肉眼的に認められた肺転移数の平均値は、グループ１で２３．６個、グループ２で７．５個、グループ３で３個であった。一方、グループ４では、全てのマウスで肺転移は認められなかった。グループ４ではグループ１、グループ２と比較して肺転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。腫瘍形成をした左後肢の膝リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で１００％（４／４）、グループ３で６０％（３／５）、グループ４で２０％（１／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して膝リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。左鼠径（左後肢の付け根）リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で５０％（２／４）、グループ３で４０％（２／５）、グループ４で０％（０／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して左鼠径リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。また、治癒したマウス３匹の病理組織学的な解析で、リンパ節や胸腺・脾臓などのリンパ系組織の過形成が観察された。また、腫瘍細胞移植後２４５日も経過した時点で、肺においてのみリンパ球の集積が複数箇所において認められた。他の治療群では観察された肺転移像は全く認められなかった。これらの治癒マウスにおいては、一度生じた肺転移が、本治療方法によって誘導されたキラーリンパ球によって消滅した可能性も考えられる。
【００２７】
実施例１と実施例２のまとめ：
実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、Ｔｈ１サイトカイン類（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）は温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。Ｔｈ１サイトカイン類の温熱療法との併用により、原発腫瘍の増大がコントロール群に比較して有意に抑制された。この知見は、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５は細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することが報告されている。ＩＬ−１８は樹状細胞（ＤＣ）からのＩＦＮ−γの強力な誘導剤であり、ＩＬ−１２との併用により数種類のマウス腫瘍の増殖を抑制することが報告されている。また、ＩＦＮ類（ＩＦＮ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−γ）をＴｈ１サイトカイン類（同上）と組み合わせて併用すると、原発腫瘍径の平均値はＴｈ１サイトカイン類単独併用時よりも小さくなった。この知見も、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＦＮ−γは細胞障害性Ｔ細胞を誘導したり、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）やマクロファージを活性化したり、樹状細胞などの抗原提示細胞や腫瘍細胞において腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩの発現を増強することが報告されている。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−γと同様にナチュラルキラー細胞やマクロファージを活性化したり、腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩの発現を増強したり、また抗ウィルス効果を誘導したりすることが報告されている。しかし、ＩＦＮ類だけの併用では温熱療法の抗腫瘍効果を増強できなかった。その増強には、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類の併用が重要である。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは細胞膜上の受容体以後の細胞内情報伝達経路は共通であると考えられているので、温熱療法などの腫瘍壊死誘導療法とサイトカイン類の併用時にはどちらか一方でもよいのかもしれない。
【００２８】
実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、本発明の１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。この１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の原発腫瘍の増大も抑制した。実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類と温熱療法との併用よりも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法の方が、腫瘍接種後２１日目の原発腫瘍の平均径をより小さくした（３６９ｍｍ3対２５５ｍｍ3）。さらに、実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の肺転移も強力に抑制した。他の治療法はいずれの細胞の肺転移も抑制しなかった。最終的な生存率も、この治療方法で最も長い結果が得られた。特に実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、この治療方法により６０％のマウスで腫瘍が消失し、それらのマウスでは２４５日の観察期間中に局所再発も肺・リンパ節への転移も生じなかった。ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞を誘導・分化させることが報告されている。樹状細胞（ＤＣ）は腫瘍関連抗原をその細胞膜上に提示して細胞障害性Ｔ細胞を誘導することで、腫瘍特異的な免疫応答を生じさせるのに重要である。ＴＮＦ−αはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を活性化したり、リンパ球を増殖させたり、マクロファージから炎症誘導サイトカインであるＩＬ−１やＩＬ−６を誘導したり、血管内皮細胞を活性化させたり、発熱反応を生じさせることが報告されている。ＩＬ−１αは、リンパ球や血管内皮細胞を活性化させたり、炎症部位で局所組織を破壊することによりエフェクター細胞の侵入を容易にしたり、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの炎症誘導サイトカインの産生を誘導したり、発熱反応を生じさせることが報告されている。
【００２９】
Ｔｈ２リンパ球とＴｈ１リンパ球はお互いに制御してバランスを取り合っている。Ｔｈ１リンパ球から産生されるＩＦＮ−γはＴｈ２リンパ球の分化と増殖を抑制し、Ｔｈ２リンパ球から産生されるＩＬ−４やＩＬ−１０はＴｈ１リンパ球の分化と増殖を抑制する。１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルにより、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果が増強されたことは、担癌状態では従来言われているＴｈ１リンパ球だけでなく、Ｔｈ２リンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、多核白血球など、全ての免疫関連細胞が抑制されている可能性がある。実際に、卵白アルブミンを人工的に遺伝子導入したマウス腫瘍細胞の系を用いた免疫療法実験では、治癒機転としてＴｈ１リンパ球が誘導される場合とＴｈ２リンパ球が誘導される場合があることが報告されている。また、細胞障害性Ｔ細胞の増殖と活性化に必要なＩＬ−２が、逆に一度活性化されたＴリンパ球の機能を抑制するＣＴＬＡ−４という分子を誘導するという知見もある。一種類のサイトカインだけを使用すると、担癌状態といえども生体内でその経路に対する抑制経路が生じて、十分な抗腫瘍効果が得られない可能性も考えられる。これまでの多くの知見より、強い免疫抑制状況にある担癌状態においては１〜２種類のサイトカインを用いても、抗腫瘍効果に関与する免疫系全体を活性化することは極めて困難なことであると考えられる。培養細胞や正常のマウスを使用して得られたサイトカインの免疫活性化作用の実験結果は、担癌状態では機能していない可能性もある。実際に、ペプチドワクチンを用いた臨床試験では、せっかく細胞障害性Ｔ細胞が誘導されていても免疫抑制環境の強い腫瘍内では腫瘍細胞に対して障害活性を示さないという報告もされている。多種類のサイトカインを併用することにより、担癌状態での多種類の免疫抑制機序に対処し、多種類の免疫細胞を同時に活性化して有効な腫瘍免疫応答を誘導できる可能性がある。サイトカインストームを人工的に起こすことにより、自己免疫疾患を引き起こす可能性も否定できないので、その点は治療対象の選択と長期間の観察などの注意が必要である。今回の実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験で、２４５日間の経過観察をした３匹の治癒マウスでは、治療終了後は体重減少、脱毛、神経麻痺などの症状は見られなかった。逆に、Ｔｈ１サイトカイン類とＴｈ２サイトカイン類の併用により、どちらか一方だけが活性化されることを防ぎ、生体内で免疫応答のバランスが適切にとれる可能性も期待できる。また、多種類のサイトカインを併用することで、一つ一つのサイトカインの投与量を減らせる可能性があり、有害事象を減らせる可能性も期待できる。
【００３０】
温熱療法に併用した１２種類のサイトカインカクテル療法の抗腫瘍効果は、Ｂ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の方がＬＬＣ細胞を用いた実施例１よりも強かった。前者では６０％（３／５）のマウスで足背の原発腫瘍が消失し、また全てのマウスで肺転移が認められなかった。しかし、治癒マウス３匹のうち２匹のマウスでは、治療中に腫瘍形成した左足が壊死により欠失し、また全てのマウスで後肢に一時的な脱毛が生じた。一方で、後者では足の欠失や脱毛は見られなかったが、原発腫瘍は完全には消失せず、肺転移も認められた。これらの理由としては、ＬＬＣ細胞の増殖速度がＢ１６−ＢＬ６細胞よりも速かったこと、治療開始時点の腫瘍径の平均値の違い（ＬＬＣ細胞群：７２．６ｍｍ3、Ｂ１６−ＢＬ６細胞群：４０．６ｍｍ3）が考えられる。また、２つの実験では、温熱療法の温度と処理時間（前者は４３．５℃±０．２℃×９０分、後者は４３．０℃±０．２℃×１２０分）、サイトカイン類の投与間隔（前者は２〜３日毎か１週間毎、後者は連日か３日毎）が異なっていた点もある。
【００３１】
ＬＬＣ細胞を用いた実施例１とＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の２つの実験結果より、十分な抗腫瘍効果を得るためには１２種類のサイトカインの投与は１週間に２回以上必要であることが推測される。抗腫瘍効果を高めて有害事象を減らすためには、腫瘍壊死誘導療法の最適化、例えば、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の場合には、その強度や処理時間や処理間隔の最適化、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法の場合には、その投与量や投与間隔の最適化などに加え、サイトカイン類の投与量や投与間隔や投与量の最適化などを検討して、個々の患者に対する最適な方法を確立しなければいけない。また、各サイトカインの併用時における作用機序やその有用性についても検討しなければいけない。過去に施行した別のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、温熱療法のみで腫瘍形成させた足が欠失した場合には、１週間前後で必ずその断端への局所再発や膝リンパ節への転移が生じ、腫瘍の根治は決してできなかった。しかし、今回の温熱療法に１２種類のサイトカインカクテル療法を併用した場合には、局所再発や膝リンパ節への転移が認められたのは２０％（１／５）のみであった。サイトカインが免疫応答の調節を担っていること、治癒マウスにおいてリンパ系組織の過形成と腫瘍の転移先である肺においてのみリンパ球の集積が認められたことより、温熱療法とサイトカインカクテル療法により、何らかの抗腫瘍免疫学的なメカニズムが作用した可能性が示唆される。
【００３２】
温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の他、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法を含め、腫瘍に壊死を誘導する様々な治療方法が施行されている。それらの腫瘍壊死誘導療法においては、いかに効率よく多くの腫瘍細胞を壊死させられるかという点が重要である。腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強する目的で、前述の通り、いくつかの種類のサイトカインとの併用が試行されてきた。腫瘍壊死誘導療法とサイトカインの併用による癌治療は、壊死した腫瘍細胞をもとに、担癌宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導して腫瘍の縮小や再発・転移予防を行うことを目的としている。その際、腫瘍壊死誘導療法の種類によって、抗腫瘍効果の点で併用するサイトカインの種類が変わるという報告はこれまでのところ存在しない。むしろ、メラノーマにはＩＦＮ−γが、肝臓癌にはＩＦＮ−αやＩＦＮ−βが、腎臓癌にはＩＬ−２が効くなど、腫瘍の種類や個々の腫瘍の性質によって抗腫瘍効果のあるサイトカインの種類が規定されていて、サイトカインと併用する腫瘍壊死誘導療法は様々な種類が試みられている。以上の点に鑑みれば、今回の知見で得られたサイトカインカクテルは、腫瘍に壊死を誘導できる方法であれば、物理療法に限らず薬物療法に対しても、その抗腫瘍効果を増強できるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１における各試験群についての生存率を示す図である。
【図２】実施例２における各試験群についての生存率を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
インターフェロンが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
Ｔｈ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１または２記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項５】
炎症誘導サイトカインが、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
樹状細胞誘導サイトカンインが、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項７】
サイトカインカクテルが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項８】
腫瘍壊死誘導療法が、物理療法であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項９】
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１０】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１】
インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
インターフェロンが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
Ｔｈ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１または２記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
Ｔｈ２サイトカインが、ＩＬ−４であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項５】
炎症誘導サイトカインが、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
樹状細胞誘導サイトカンインが、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項７】
サイトカインカクテルが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項８】
腫瘍壊死誘導療法が、物理療法であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項９】
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１０】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８を組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３０６８２４（Ｐ２００６−３０６８２４Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５９４９２（Ｐ２００５−１５９４９２）
【出願日】平成１７年５月３１日（２００５．５．３１）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３１日（２００５．５．３１）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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