膵臓細胞培養における膵臓前駆細胞の細胞増殖促進方法
本発明は、（１）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量のカスパーゼ阻害剤、および（２）活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の成長因子と、細胞とを接触させることによって膵臓前駆細胞の増殖および生存を促進可能である発見に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、参照のために本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６０／７６０，４４５号明細書（２００６年１月２０日出願）に優先して利益を主張するものである。
【０００２】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、アポトーシスの制御および膵臓内分泌細胞の培養における増殖の要であるＡｋｔ、セリン／スレオニンキナーゼに関する。さらに、本発明の方法および組成は、（１）細胞のアポトーシスを減少させるために十分な量のカスパーゼ抑制剤、および（２）膵臓内分泌細胞の活性化Ａｋｔ量を上昇させるために十分な量の成長因子、に接触することで、膵臓細胞培養における膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進することを可能にする。
【０００３】
〔発明の背景〕
正常血糖(euglycemia)の回復の手段としてのランゲルハンス島移植の出現は、糖尿病治療において主要な画期的出来事とされる。しかし、ヒト臓器提供者の不足は、臓器提供者の臓器に対する臓器移植者の数を増加させるためにランゲルハンス島調整物からインビトロで島の増殖方法を発展させる重要性を浮き彫りにする。げっ歯類における知見では、成熟ベータ細胞は複製能を保っているが、増殖しているヒトベータ細胞は今日まで特定されていない（「Dorら (2004) Nature 429 (6897):41-46」）。ランゲルハンス島増殖の研究において主要な点は、急激に増え、成熟内分泌マーカー（特にインスリン）を発現する可能性を有する膵臓内分泌細胞の同定である。しかし、前記の前駆細胞の性質はいまだに解明されていない。
【０００４】
移植片の機能性の欠損と同様に、分離および細胞培養過程の間のランゲルハンス島の損失は、糖尿病患者の治療のために十分な数のランゲルハンス島の確保にとって大きな障害である。インビトロで培養されたヒト膵臓細胞は、内分泌細胞の顕著な損失を導くアポトーシスを起こす。そのため、移植前の多くの措置の間、移植用の島細胞を保存するための確立した方法が決定的に重要である。
【０００５】
臓器入手および細胞分離の過程の間、ランゲルハンス島は臓器提供者の脳死、臓器の分離および保存手順、膵臓の酵素学的消化、ランゲルハンス島画分の分離、並びにインビトロ細胞培養による多様な損傷にさらされる。そのため、患者一人への移植に一人以上の臓器供与者の膵臓が必要である。これら全ての手順の間における細胞死機構の活性化は、島移植の前および後に観察される機能的な島集団の大量減少の説明となるかもしれない。このことは、糖尿病治療の手順の有効性の実質的な制限である。
【０００６】
カスパーゼはアポトーシス細胞死を導く多くの段階の実行に主要な役割を担っていることが確かめられている(「Chandraら (2001) Diabetes 50(supp 1):S44-S47」)。アポトーシスの抑制は、増殖に利用できる限られた数のヒト膵臓提供者から内分泌細胞を増やすことの一因となることが示された。(例えば、米国特許第６，５６２，６２０号明細書; 「Hayek, A.ら (2002) Curr. Diab Rep. 2：371-376」を参照のこと)。特に、ある方法は、ランゲルハンス島の損失に関与する細胞死過程を阻害し、患者への島集団の移植が促進してきた（国際公開第２００３６１５５１号パンフレット）。１以上のカスパーゼ構成員の抑制により、多くの細胞種（膵臓内分泌細胞を含む）において細胞死を防ぐことができるが、カスパーゼ切断の上流の細胞死を標的とすることがより効果的であろう。
【０００７】
数々の成長因子が、膵臓細胞の生存、増殖および機能を増強することが示されてきた(「Garcia-Ocanaら (2001) J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:984-988」)。これらの成長因子は全て、多くの細胞種の生存を制御するホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル経路の上流で働く(「Stokoe, D. (2005) Expert Rev. MoL Med. 7:1-22; Linら (1999) Cancer Research 59:2891-2897」)。この経路の重要な作動体（effector）は、膜の回復およびリン酸化を介して活性化されるセリン／スレオニンキナーゼ、Ａｋｔである。多様な組織におけるインスリン反応およびグルコースの代謝におけるＡｋｔの役割は数多く発表されている（Whiteman E.L.ら (2002) Trends Endocrinol. Metab. 10:444-451）。例えば、Ａｋｔ２遺伝子の欠損を有するマウスは、発育不全を示し、インスリン抵抗性およびグルコース不寛容である。構成的に活性化したＡｋｔ１を発現するトランスジェニックマウスは、ベータ細胞の大きさ、ならびに亢進したグルコース寛容および実験的糖尿病への完全な抵抗性を導く島集団全体が増加する（「Turtleら (2001) Nat. Med. 7:1133-1137」）。さらに最近の研究では、ウイルス遺伝子の転移または薬理学的方法のどちらかによるＡｋｔ１の構成的発現は、糖尿病マウスにおいてヒト島移植片の状態を改善することが示唆された（「Contrerasら (2001) Transplantation 74:1063-1069」; 「Raoら (2005) Diabetes 54:1664-1675」）。
【０００８】
結局のところ、前記の研究のゴールは、細胞死経路を阻害することによりランゲルハンス島集団を増加することであり、さらに、ランゲルハンス島の移植を糖尿病治療の実験的手法とするために、内分泌細胞の増殖および拡張を同時に促進することである。本発明は、細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子に細胞を接触させることで、膵臓細胞培養において細胞の生存および増殖を促進する方法を提供することにより、前記のゴールに達する。さらに、カスパーゼ阻害剤および成長因子の組み合わせは、他の細胞種において見られない相乗効果を提供する。
【０００９】
〔発明の簡単な要約〕
本発明の一態様は、（１）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および（２）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子、に細胞を接触することで、膵臓細胞培養において膵臓内分泌細胞の増殖を促進する方法を提供する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、膵臓内分泌細胞はインスリンを産生する凝集体である。
【００１１】
本発明の一実施形態では、細胞は外因性のカスパーゼ抑制剤と接触する。本発明に好適に使用されるカスパーゼ抑制剤の典型的な例は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびＣＰＰ３２／アポパイン（Apopain）抑制剤を含み、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを含む。
【００１２】
本発明の一実施形態では、外因性のカスパーゼ抑制剤は、約ｌμＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭの間、およびより好ましくは約１〜約１０μＭの間の濃度で存在する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００μＭ）。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、膵臓内分泌細胞は、活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な外因性の成長因子に接触される。以下に限定されるものではないが、本発明における使用に好適な成長因子の典型例は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびヘレグリン（heregulin）を含む。一実施形態では、外因性の成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、並びにＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩのどちらかである。
【００１４】
本発明に用いられる外因性の成長因子は、通常、培養液中に約１０ ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ(例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｎｇ／ｍｌ)の濃度で存在する。
【００１５】
本発明の他の態様は、膵臓内分泌細胞を含む培養液である。前記の培養液は、培養された膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤を含む。また、前記培養液は、培養された膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加するために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子を含む。
【００１６】
本発明の一実施形態では、培養液は外因性のカスパーゼ抑制剤を含む。本発明に好適に用いられる典型的なカスパーゼ抑制剤は、Ｑ-ＶＤ-ＯＰＨ、Ｚ-ＶＡＤ（ＯＭｅ）-ＦＭＫ、Ａｃ-ＶＡＤ-ＣＨＯ、Ｂｏｃ-Ｄ-ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ-９Ｂ１２、Ａｃ-ＬＤＥＳＤ-ＣＨＯ、ＤＥＶＤ-ＣＨＯ、およびＣＰＰ３２/アポパイン抑制剤を含む。一実施形態では、外因性のカスパーゼ抑制剤はＱ-ＶＤ-ＯＰＨ、またはＺ-ＶＡＤ（ＯＭｅ）-ＦＭＫである。
【００１７】
培養液中の外因性のカスパーゼ抑制剤は、通常約ｌμＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、およびより好ましくは、約１〜約１０μＭの濃度で存在する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００μＭ）。
【００１８】
また、本発明の他の実施形態では、培養液は、培養細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子を含む。本発明の使用に好適である典型的な成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびヘレグリンである。一実施形態では、外因性成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、並びにＩＧＦ−Ｉ、および／またはＩＧＦ−ＩＩのどちらかである。
【００１９】
本発明に用いられる外因性の成長因子は、通常培養液中に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ(例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｎｇ／ｍｌ)の濃度で存在する。
【００２０】
膵臓細胞が外因性の成長因子および外因性のカスパーゼ抑制剤に接触される順番は、特に重要ではない。例えば、一実施形態では、細胞は外因性の成長因子に接触される前に外因性のカスパーゼ阻害剤に接触される。一実施形態では、細胞は外因性カスパーゼ抑制剤に接触する前に外因性の成長因子に接触される。さらに別の実施形態では、細胞は、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子に同時に接触される。
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
〔１．定義〕
単位、接頭語（Prefixes）、および記号はSysteme International de Unites (SI)に承認された形式で示される。数値域は、定義された範囲の数が含まれる。本明細書において提供される表題（heading）は、その全体が明細書に参照される本発明の多様な態様または実施形態に限定されない。従って、以下に挙げる定義された用語は、明細書の全体が参照されることでさらに定義される。本明細書において定義されない用語は、当業者により理解される通常の意味を有する。
【００２２】
本明細書において用いられる「生存培地」という用語は、アポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および細胞中の活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子を含む生理学的に条件を満たした細胞培地を表す。生存培地として用いることができる典型的な細胞培地は、ＳＭ９５、Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｅａｇｌｅｓ ＭＥＭ、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０培地、もしくはこれらの任意の組み合わせ、または他の生理学的に条件を満たす培地（市販されていても、当業者に知られていてもよい）を含む。カスパーゼ抑制剤は、カスパーゼ抑制剤、または汎カスパーゼ抑制剤を選択してよい。典型的なカスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／Ａｐｏｐａｉｎ抑制剤を含む。典型的な成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ヘレグリン、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩを含む。
【００２３】
本明細書において用いられる「コントロール培地」は、膵臓内分泌細胞において、アポトーシスを減少させるのに十分な量の添加された外因性カスパーゼ抑制剤、または活性化された全長Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の外因性の成長因子を含まない生理学的な条件を満たす細胞培養培地を表す。
【００２４】
本明細書において用いられる「分化培地」は、ＦＢＳ、または活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量のＡｋｔ刺激剤ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩＧＦを含まない生理学的な条件を満たす細胞培養培地を表す。分化培地は、膵臓前駆細胞を成熟インスリン産生細胞に分化を誘導する他の成長因子、サイトカインおよび化学物質を含まない。典型的な分化因子は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、エクセンディン−４（exendin−4）、ニコチンアミド、ベータセルリン、およびＩＮＧＡＰを含む。
【００２５】
本明細書において用いられる「細胞増殖」という用語は、細胞の生育および細胞の分化により細胞数が増加する過程に用いられる。細胞増殖は、以下に示す本明細書に記載した方法で測定される（限定されないが、Ｋｉ−６７イムノブロッティング、ＤＮＡ含有量の分析、および細胞数の計測を含む）。本明細書に用いられるように、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の存在下の細胞増殖の程度が、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の非存在下での細胞増殖の程度よりも大きければ、細胞増殖は促進される。
【００２６】
本明細書において用いられるように「膵臓内分泌細胞」という用語は、（I）分化した膵臓内分泌細胞のマーカーを発現し、膵臓ホルモン（例えば、インスリンおよびグルカゴン）を産生する成熟膵臓内分泌細胞（例えば、インスリン産生凝集体）、ならびに（II）分化した膵臓細胞のマーカーを発現しておらず、膵臓ホルモンを産生しないが、膵臓ホルモン（例えば、インスリンおよびグルカゴン）を産生および分泌する成熟膵臓細胞へ分化する能力がある膵臓前駆細胞の両方を表す。
【００２７】
本明細書において用いられるように「接触する」という用語は、例えば以下のように言い換えることができる：結合する、添加する、混合する、通り抜ける、培養する、流れる、さらされるなど。
【００２８】
本明細書において用いられるように「外因性」という用語は、組織または細胞の外部に起源を有するが、個々の組織または生細胞において存在し作用する任意の因子または物質を表す。
【００２９】
「成長因子」という用語は、細胞分化の調節、細胞成熟、および／または細胞生存を調節するように機能する、組織から作製された任意の物質、組織から取り出された細胞によって作製された任意の物質、または研究室で作製された任意の物質を表す。
【００３０】
本明細書において用いられるように「カスパーゼ抑制剤」という用語は、カスパーゼ酵素の活性を抑制または減少できる、任意の化合物、分子またはタンパク質を表す。
【００３１】
本明細書において用いられるように「アポトーシス」という用語は、「プログラムされた細胞死」と言い換えることができ、細胞死に導かれる一連の遺伝的にプログラムされた現象を含む細胞死の種類を表す。
【００３２】
「活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の外因性の成長因子」という語句は、細胞のホモジネート（homogenate）のウエスタンブロット分析、または本明細書に記載したその他の方法により確認できるように、活性化Ａｋｔ量を検出可能なまで増加させるために十分な量の外因性成長因子の量を表す。
【００３３】
本明細書において用いられるように「アポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤」という語句は、カスパーゼ活性を減少させるため、または外因性カスパーゼ抑制剤の未処理細胞に比べて処理細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な外因性のカスパーゼ抑制剤の量を表す。減少したカスパーゼ活性は、カスパーゼプロファイリング分析、もしくは本明細書に記載した他の方法、または当業者に知られたその他の好適な方法を用いて決定される。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰおよびプロピジウムヨウ化物染色、または本明細書に記載した他の方法、もしくは当業者に知られたその他の方法を用いて検出される。
【００３４】
本明細書において用いられるように「活性化Ａｋｔ」という用語は、野生型全長Ａｋｔタンパク質ファミリー構成員、それらの活性化断片、またはそれらの活性化変異体（Ａｋｔ活性を保っている融合タンパク質）を表す。Ａｋｔタンパク質ファミリーは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３を含む。野生型全長Ａｋｔタンパク質は、ＰＫＡおよびＰＫＣの両者と密接に関連する触媒ドメインを有するセリン／スレオニンキナーゼである。Ａｋｔという用語は、ＲＡＣタンパクキナーゼ（ＡおよびＣキナーゼに関連する）、およびＰＫＢ（プロテインキナーゼＢ）と言い換えられる。Ａｋｔファミリー構成員は、アミノ末端のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、およびカルボキシ末端のタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ触媒ドメインを特徴としている。
【００３５】
本明細書において用いられる「インスリン産生凝集体」という用語は、インスリンを産生および分泌する膵臓内分泌細胞、または膵臓内分泌細胞の集まりを表す。
【００３６】
本明細書において用いられる「分化する」または「分化」という用語は、細胞が未分化状態から分化状態、または未成熟状態から成熟状態へ進む過程を表す。例えば、分化していない膵臓細胞は、ＰＤＸ−１のような特徴的なマーカーを増殖および発現することができる。成熟または分化した膵臓細胞は増殖しないが、大量の膵臓内分泌ホルモンを分泌する（例えば、成熟β細胞はインスリンを大量に分泌する）。細胞の相互作用および成熟の変化は、未分化細胞の欠失するマーカーまたは分化した細胞の獲得するマーカーとして生じる。あるマーカーの欠失または獲得は、細胞が「成熟したか分化したか」を示すことができる。
【００３７】
本明細書において用いられる「分化因子」という用語は、成熟インスリン産生β細胞への分化を促進するために膵臓細胞に添加される化合物を表す。典型的な分化因子は、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エクセンディン−４、塩基性繊維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子−Ｉ、神経成長因子、上皮細胞成長因子、および血小板由来成長因子を含む。
【００３８】
本明細書において用いられる「細胞生存」という用語は、集団内で始原細胞の数と比べて、回収、分離、および無傷臓器に由来する細胞の初代培養のような処理の後に生存している細胞の数を表す。本明細書で用いられるように、仮に外因性カスパーゼ抑制剤および外因性成長因子の存在下における細胞生存の程度が、外因性カスパーゼ抑制剤および外因性成長因子の非存在下における細胞生存の程度と比べて増加していれば、細胞生存は促進される。
【００３９】
本明細書において用いられる「生理学的条件を満たす培養培地」という語句は、細胞の摂取および細胞の維持に必要な栄養素および栄養補助剤を含む、培養皿において細胞を覆う培養液を表す。
【００４０】
本明細書において用いられる「相乗効果」とは、膵臓前駆細胞の増殖および生存を促進する、外因性成長因子および外因性カスパーゼ抑制剤の複合効果を表す。相乗効果は、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の両者に接触された場合に、各要素を単独で接触させた場合の膵臓前駆細胞の生存および／または増殖と比べて、生存および／または増殖を増加することにより示される。相乗効果は、単独で使用した場合と同じまたは近い効果に達するために必要な外因性の成長因子および／または外因性のカスパーゼ抑制剤の量と比べた場合に、少ない量の外因性成長因子または外因性のカスパーゼ抑制剤が膵臓前駆細胞の生存および／または増殖を同じまたは近い増加に達するために要求されることでも示される。
【００４１】
〔２．序文〕
正常血糖の回復の手法としてのランゲルハンス島移植の出現は、糖尿病の治療において大きな画期的事件として表現される。しかし、ヒト臓器提供者は不足しており、臓器提供者の臓器に対する臓器移植者の数を増加するため、限られた数のランゲルハンス島調製物からインビトロでランゲルハンス島を増殖する方法の発展が重要であることを浮き彫りにする。従って、当業者は、培養中において内分泌細胞の増殖および拡張を促進することが糖移植が糖尿病治療のための実際的な手段となるために必要であることを認識する。
【００４２】
通常の方法論を用いる成人ヒト膵臓細胞の生体外での細胞培養の間、細胞の大部分の画分は非接触性である。これらの大部分の非接触細胞および多くの接着細胞は、技術的に通常の培養方法を用いると、アポトーシスのため失われる。多くのこれらの細胞（接着性および非接着性の両者）は、成熟内分泌細胞または内分泌前駆細胞の特徴を有する遺伝子を発現する。しかし、前記の細胞には、インビトロでのカスパーゼ抑制により回復させることができる細胞も存在する。これらの所見は、Ａｋｔ経路を含むカスパーゼ活性化の上流シグナル経路の関与の調査に本発明者らの注意を向けた。膵臓内分泌細胞に現されたようにＡｋｔ経路とカスパーゼ経路との間の有効な相互作用が発見されつつある。膵臓内分泌細胞の培養中にカスパーゼ活性を阻害すると、細胞内でアポトーシスの減少に寄与する全長Ａｋｔ量が細胞内で増加し、さらにアポトーシスが減少する。驚くべきことに、外因性のカスパーゼ抑制剤の添加に加えて、外因性の成長因子の特定の組み合わせを添加すると、培養膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する相乗効果を有することが発見された。
【００４３】
しかしながら、この驚くべき相乗効果は、膵臓内分泌細胞に特異的であることが明らかになった。外因性のカスパーゼ抑制剤と少なくとも１つの外因性Ａｋｔ活性化成長因子（すなわち生存培地）との組み合わせは、本明細書に記載した方法を用いて培養した肝細胞の増殖および生存に相乗効果を示さない。
【００４４】
また、本明細書に開示した方法を用いた成人ヒト膵臓細胞の生体外での培養は、従来の培養方法と比べて非接着性の細胞の数が減少することが明らかとなった。さらに、本明細書において教示された方法により培養された膵臓内分泌細胞は、通常の膵臓内分泌細胞の機能性を保っている。当業者に知られた標準的な方法と比較して本明細書において教示した方法を用いて培養した膵臓内分泌細胞の集団において膵臓の遺伝子発現（例えば、インスリン）の増加は、本明細書に記載した培養方法による膵臓内分泌細胞の増殖および生存を増加する直接的な効果である。従って、本明細書に記載した方法は、膵島細胞の移植をI型糖尿病の治療の実験的な代案および実行可能な代案とするため、限られた数の膵臓内分泌細胞を生体外に拡張するために用いられる。
【００４５】
〔３．膵臓内分泌細胞の分離〕
本発明の実践における第１の段階は、膵臓内分泌細胞を分離することである。当業者は、膵臓内分泌細胞を分離するために用いることができる多様な情報および方法を認識する。本明細書に記載した方法は、膵臓の提供者の年齢に依存しない。従って、胚から成人までの臓器提供者から分離された膵臓素材が使用できる。臓器入手および細胞の分離の典型的な手法は、実施例１に詳細に記載している。
【００４６】
〔３−Ａ．膵臓からの膵臓内分泌細胞の分離〕
一度膵臓が臓器提供者から採取されれば、通常、多様な方法を用いて個々の培養細胞または細胞の小集団を産じるために継代される。米国特許第５，８３０，７４１号明細書、および米国特許第５，７５３，４８５号明細書を参照のこと。前記の一方法では、採取した膵臓組織の洗浄、および酵素消化を必要とする。採取した組織の柔組織を膵臓細胞物質の小さな画分に引き離すために、結合している組織の消化に酵素処理が用いられる。採取された臓器の全体構造から膵臓細胞物質、基礎構造、および個々の膵臓細胞を分離するために、採取された組織は１以上の酵素で処理される。商業的供給者（シグマ−アルドリッチ、St.Lois、MO；ロシュ、インディアナポリス、ＩＮ）から容易に入手できるコラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、リベラーゼ（liberase）沈殿物、およびその他の酵素は、本明細書において開示した方法に使用できる。
【００４７】
しかし、培養のために一度引き離した膵臓組織は、さらなる分離をすることなく本発明の培養方法に直接使用することもできる。また、分離された原料物質は、１以上の所望の細胞集団を濃縮するためにさらに処理できる。臓器提供者に由来する採取された細胞混合物は、通常、異質である。従って、前記の細胞混合物は、α-細胞、β-細胞、δ-細胞、導管細胞、腺房細胞、任意の前駆細胞、および他の種類の膵臓細胞を含む。一実施形態では、分離された膵臓細胞物質は、密度勾配遠心分離により精製される。例えば、米国特許第５，７３９，０３３号明細書に開示された方法が使用できる。ＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）、またはＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）を含む多様な密度勾配培地が本発明に使用できる。前記の培地は商業的供給者（例えば、シグマアルドリッチ、St.Louis、MO）から容易に入手できる。
【００４８】
典型的な精製手順により、細胞物質が、多くの層または界面中に分離される。典型的には２つの界面が形成される。上部の界面は、ランゲルハンス島細胞が豊富であり、通常１０〜１００％のランゲルハンス島細胞を懸濁液中に含む。第２の界面は、通常、ランゲルハンス島、腺房細胞、および導管細胞を含有する混合した細胞の集合体である。沈殿は、濃度勾配の底に形成される。前記沈殿は、通常、主に（＞８０％）腺房細胞、いくらかの沈殿したランゲルハンス島細胞、およびいくらかの導管細胞を含む。
【００４９】
さらなる操作から選択された画分の細胞構成要素は、各分離によって変化し、さらなる継代に選択された濃度勾配画分の部分に依存する。例えば、ランゲルハンス島細胞の豊富な集合体は、少なくとも１０％〜１００％のランゲルハンス島細胞を含む分離された画分から得ることができる。当業者は、本明細書に記載した培養方法が、使用した精製濃度勾配に依存する第２界面、沈殿、または他の画分もしくは界面からの細胞の分離に使用できることを理解する。
【００５０】
〔４．細胞培養および膵臓内分泌細胞の培養およびそれらの子孫細胞〕
〔４−Ａ．一般的な細胞培養手順〕
一度膵臓細胞が分離されれば、膵臓細胞は「Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique 4th ed., John Wiley & Sons (2000)」に記載されているような一般的な細胞培養方法論を用いて培養される。通常、膵臓細胞は他の哺乳類細胞に好適な条件下で培養される（例えば、加湿培養機で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下）。膵臓細胞は、技術的に公知の多様な基質上で培養できる。前記基質としては、例えば、ホウケイ酸ガラスチューブ、ボトル、ディシュ、表面の変化しないクローニングリング、プラスチック組織培養ディシュ、チューブ、フラスコ、マルチ−ウェルプレート、増加させた生育表面領域（ＧＳＡ）を備える容器、ドプラ食道モニタ（ＥＤＭ）、ＧＳＡを増加させるための複合内部シートを有するフラスコ、フェンウォールバッグ（fenwal bags）、および他の従来公知の培養容器が挙げられる。細胞は、細胞の生育および分化を促進するための細胞外マトリクス構成要素で予めコートされた培養表面で生育させてもよい。前記構成要素は、例えば、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、エンゲルブレス−ホルム−スワームマトリックス（Engelberth-Holm-Swarm matrix）、および好ましくはコラーゲンＩＶまたはラミニンが挙げられる。本発明に好適に用いられるこれらの培養条件およびその他の培養条件は当業者に公知である。
【００５１】
膵臓細胞の培養において他の重要な要素は、回収された細胞の播種密度、または密集した状態となり新しい担体に移し変える際の細胞数である。播種密度は、培養膵臓細胞の生存可能性に影響を与える。特定の培養条件における適した播種密度は、異なる密度範囲での細胞の播種、ならびに細胞の生存および増殖率の観察により経験的に決定されてよい。ある播種密度は、ホルモンを産生し、培養液中に分泌する細胞に効果的であることが示された。通常、細胞の濃度は、１００ｍｍの培養皿あたり約１０２〜１０８個の細胞数の範囲に及ぶ（例えば、１００ｍｍ培養皿あたり１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８個の細胞数）。他の培養容器における細胞濃度は、相対的な担体の表面領域および／または培養ガス交換表面領域を計算することで調節されてよい（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｓｕｐｒａを参照のこと）。培養容器表面領域に対する細胞濃度は、培養表面領域あたりの適した培地容量を用いた培地容量に対する細胞濃度と相関していてもよい（０．２−０．５ｍｌ／ｃｍ２が静置培養の通常の範囲である）。
【００５２】
通常の細胞培養増殖技術が本発明の実施に好適である。簡潔に説明すると、Ｐ０細胞は、１００ｍｍプラスチック組織培養皿に１×１０６細胞の密度でまかれる。培地は、３日毎に交換し、前記細胞は、９０％以上の密度に達すると０．０５％トリプシン(トリプシン／ＥＤＴＡ、Invitrogen，Carsbad，CA)を用いてＰ１に継代培養される。分割比は、通常、１：３であるが、生存培地中で増やした細胞では１：６でもよい。Ｐ１培養物は、通常、約３〜５日で９０％の密度に到達する。この時点で、コントロール培地中で増やす細胞は１：３、生存培地中で増やす細胞は１：６の割合でＰ２に継代培養される。この後に続く全ての継代は、Ｐ１培養に記載したように行った。培養培地は、通常、３日毎、または培養液のｐＨが新しい培養液が必要であると示した場合に交換される。
【００５３】
〔４−Ｂ．細胞培養培地〕
本発明の膵臓細胞は多様な培養液中で培養されてよい。本明細書に記載したように、培地は特定の成分を含むか、または特定の成分を欠いている（例えば、分離および増殖手順の特定の処置に好ましい血清など）。例えば、膵臓から新しく分離された細胞は、細胞を分離手順から回復させるために高濃度の血清培地で維持してもよい。逆に、中期段階の細胞集団の選択および増殖には低血清培地が好ましい。従って、多くの培地の組成が本発明の実施に用いられてよい。本明細書において開示した培地の組成は典型例を示すためであり、培養液の決定的に重要でない成分は、本明細書に記載した分析を用いて細胞の集団の複製または分化の変化への効果を試験することで除外、代用、変更、または追加されてよい。例えば、「Stephanら Endocrinology 140:5841-54 (1999)」を参照のこと。
【００５４】
〔４−Ｂ−１．コントロール培地〕
培養液は通常基礎培地からなる。前記の基礎培地は、生理学的な条件を満たした培地であり、無機塩類、緩衝液、アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、ならびにある場合では、有機中間体および前駆体の形態でタンパク質、核酸、炭水化物、または脂質代謝を含む追加の栄養素を含む。通常、本発明に好適に用いられる基礎培地は、限定されないが、Ｆ１２、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥＭ （ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、ＣＭＲＬ １０６６、ＳＭ９５（組成は表１に示す）、１：１でＦｌ２とＤＭＥＭとを混合した培地、および当業者に知られた培地またはこれらの組み合わせを含んでよい。細胞の生育を補助するために、基礎培地は、通常、成長因子、他のタンパク質、ホルモン、および痕跡元素を補われる。これらの補助栄養物質は、細胞の生育、維持、および／または分化を促進し、他の培養液成分の不純物または毒素を補償し、基礎培地中に欠けている微量元素を提供する。多くの培地において、血清はこれらの補助栄養物質の源である。血清は、多様な哺乳類の供給源（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマなど、および成体、幼体、または胎仔）から補われてよい。「Freshney、supra」を参照のこと。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、通常、補助栄養物質として用いられる。血清の濃度は、培養液の総容量に対する血清の容量の割合として表され、通常、約０．１〜２５％（例えば、約０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５％）の範囲である。一実施形態では、血清の濃度は低いが完全に排除されず、定義済み（defined）、または半分定義(semi-defined)された補助栄養物質の混合物が基礎培地に添加される。一用途において、基礎培地は、血清の代わりに添加できる成長因子、ホルモン、および微量栄養素の定義済み（defined）、または半分定義(semi-defined)された混合物を補われる。前記のような定義された培地の調整物は本明細書に開示される；その他の培地は、当業者に知られているか、または商業的供給源から入手可能である（「Freshney、supra」を参照のこと）。
【００５５】
一般的に、本明細書に記載した培地に添加する補助成分は、同一の生物学的特性を有する天然または合成産物により交換されてよい。例えば、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾン、およびプロゲステロンは、同一の細胞内受容体（甲状腺受容体、グルココルチコイド受容体、およびプロゲステロン受容体）を活性化することが知られている天然ホルモンまたは合成ホルモンにより全て置換され得る。インスリンおよびＥＧＦは、通常、組換えＤＮＡ方法論により作製されたヒトタンパク質であるが、天然源から精製されたポリペプチド、他の生物種に由来するポリペプチド、またはインスリンおよびＥＧＦ受容体の他のアゴニストと置換されてよい。ＥｒｂＢ３受容体のリガンドであるヘレグリンは、ヘレグリン異性体ならびに他のＥｒｂＢ３アゴニスト（ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４、感覚ニューロン由来因子、運動ニューロン由来因子、ニューレスチン（neurestin）、ならびにＥｂｐ−１、ヘレグリンα、ヘレグリンβ、ヘレグリンγ、ニューレグリン（neuregulin）−１、およびニューレグリン−２(ＮＲＧ−Ｉ アルファ、ＮＲＧ−Ｉ ベータ、ＮＲＧ−２ アルファ、およびＮＲＧ−２ ベータ)により置換されてよい。
【００５６】
【表１】
【００５７】
〔４−Ｂ−２．生存培地〕
分離された膵臓細胞の培養は、膵臓内分泌細胞の生存および増殖を促進する選択培地において行われる。本明細書において、「生存培地」と記載する前記の選択培地は、膵臓内分泌ホルモンの分泌能力を保持している細胞、または膵臓内分泌ホルモンを大量に分泌する分化した細胞へ成熟する可能性を有する細胞の増殖および生存に有利に働く。一般的に生存培地は、繊維芽細胞および間葉細胞を犠牲にする内分泌細胞または内分泌細胞様細胞の増殖および生存に有利に働く。
【００５８】
本明細書で使用される生存培地は、生理学的な条件を満たした０．５〜１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％）（通常は５％）を含む培地からなる。生存培地は、培養細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤、および培養膵臓細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子をも含む。当業者は、任意の濃度または特定の補助栄養物質の必要性について単一製剤の濃度変化、ならびに細胞の増殖、生存、および培養細胞中での活性化Ａｋｔ量の効果を本明細書に開示した方法を用いて観察することにより経験的に決定してよいことを理解する。
【００５９】
生存培地に添加される外因性のカスパーゼ抑制剤は、汎カスパーゼ抑制剤またはカスパーゼ特異的抑制剤のどちらかであってよい。両者は商業的供給者から広く入手できる（例えば、MP Biomedicals、Solon、OH）。カスパーゼ抑制剤は、通常、約１μＭ〜約１００μＭの濃度で添加される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＭ）。本明細書において好適に用いられるカスパーゼ抑制剤の限定されない典型例は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／アポパイン抑制剤を含んでよい。
【００６０】
少なくとも１つの外因性成長因子は、培養細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量を生存培地に添加される。通常、成長因子は、培地に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加される（例えば、培地中に１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｇ／ｍｌ）。本発明に好適に用いられる成長因子の限定されない典型例は、ＩＧＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦファミリーの構成員を含んでよい。ただし、特定のファミリーの全ての構成員が作用するわけではない。例えば、ＰＤＧＦファミリーの構成員であるＶＥＧＦは、本発明において作用しない。しかし、当業者は、活性化Ａｋｔ量を増加する成長因子は、本明細書に提供した分析を用いて容易に同定できることを認識する。
【００６１】
本発明によると、膵臓細胞は、分離に続いて生存培地に直接移されるか、または高濃度の血清培地から低濃度の血清培地へ移された後、生存培地へ移されてよい。膵臓内分泌細胞の培養の生存培地への移動は、繊維芽細胞および間葉細胞を犠牲にして膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する。生存培地中で培養された膵臓内分泌細胞の集団は、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ−１）の高い発現量を維持し、コントロール培地中で培養された細胞と比べて生存培地で継代した場合、細胞の増殖および生存の程度が増加することを示し続ける。生存培地中で増殖する細胞は、本明細書に記載したような分化培地での細胞培養により比較的少ない量の膵臓内分泌ホルモン（例えば、インスリン）を分泌する。成熟分化膵臓細胞は増殖の促進を示さない。そのため、コントロール培地での培養と比較して、分化培地において発現するインスリン量は、細胞の数の増加が直接反映される。膵臓内分泌細胞の分離、培養、および分化に関する詳細は実施例に記載する。
【００６２】
〔５．細胞の増殖と生存の測定法〕
細胞の増殖および細胞の生存を測定するための多様な方法が利用可能であり、当業者に知られている。膵臓内分泌細胞培養において細胞の増殖および生存を測定する好適な方法の限定されない典型例は、成体染色色素を用いた細胞数の測定、または自動細胞計数機、増殖マーカー（例えば、Ｋｉ−６７）を用いた免疫標識、およびトリプシン処理した細胞のＤＮＡ含有量の測定を含んでよい。これらの方法は、実施例２にさらに詳細に記載されている。本発明に好適に使用されるその他の方法は当業者に公知である。
【００６３】
一実施形態では、細胞の増殖および生存は、生体染色色素トリパンブルーを用いて測定される（例えば、図２Ａを参照のこと）。簡潔に説明すると、単一の膵臓細胞懸濁液は、９０％の密度に達した培養細胞から０．０５％のトリプシンを用いて作製される。トリプシン処理された細胞の希釈液は、生体染色色素トリパンブルーと結合される。生きている細胞は、生体色素を排除し、血球計測器を備えた顕微鏡下で数えられる。この手順は当業者に公知であり、Feshneyらにより報告されている。
【００６４】
他の実施形態では、トリプシン処理されたＤＮＡ含有物は、メーカーの使用説明書（Molecular Probes Inc., Eugene OR）に従って、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖試験を用いて測定される。ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖試験の基礎は、細胞の核酸に結合した場合強い蛍光を示す独自の蛍光色素ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲである。前記の試験は、単一の色素濃度を用いて、２００μｌ中に５０個以下〜少なくとも５０，０００個の範囲の細胞の直線検波を有する（例えば、図３Ｃを参照のこと）。
【００６５】
さらに、他の実施形態では、細胞増殖は、細胞増殖のマーカーＫｉ−６７（Neomarkers, Fremont, CA）に対する抗体で培養した膵臓細胞を免疫学的に標識することで評価される。例えば、図３ＡおよびＢを参照のこと。免疫標識は、当業者に公知の一般的な免疫手順に従って行われる。より詳細には実施例２の記載を参照のこと。
【００６６】
〔６．アポトーシスの検出方法と測定方法〕
本発明は、培養中におけるアポトーシスを減少させるためにカスパーゼ抑制剤を用いることで膵臓内分泌細胞の生存を促進する。当業者は、膵臓内分泌細胞培養中のアポトーシスの程度の観察が膵臓細胞培養においてアポトーシスを減少させるために十分な量のカスパーゼ抑制剤が存在する場合のアポトーシスの測定方法だと認識する。以下に記載する方法、および実施例３により詳細に記載した方法が、本発明に好適に使用できる、細胞培養中のアポトーシスの存在を検出するために用いられる方法の限定されない例である。本発明に好適に用いられるその他の方法も当業者に公知である。
【００６７】
一実施形態では、カスパーゼ３および７の存在および細胞死の範囲は、メーカーの使用説明書(Promega Inc., Madison, WI)に従って、ＡＰＯ−ＯＮＥ（登録商標）カスパーゼ試験（例えば、図１を参照のこと）を用いて測定される。
【００６８】
膵臓細胞培養においてアポトーシスを起こした早期の細胞および後期の細胞の検出は、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰおよびプロピジウムヨウ化物(US Biological,Swampscott,MA)を用いて検出することができる。アポトーシスを起こした早期の細胞において、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰは、細胞の外膜のホスファチジルセリンに結合する（例えば、図２Ｂを参照のこと）。一方、アポトーシスを起こした後期の細胞は、プロピジウムヨウ化物を取り込み、保持する。アポトーシスを起こした早期の細胞および後期の細胞は、続いて蛍光顕微鏡を用いて定量できる。
【００６９】
〔７．増加した活性化全長Ａｋｔタンパク質量の測定法〕
Ａｋｔは、膵臓内分泌細胞における多様なインスリン媒介性の現象（細胞増殖および生存を含む）の重要な制御因子である。我々の培養において細胞の増殖を促進するために、Ａｋｔ活性を刺激することが知られている成長因子が用いられる。そのため、当業者は、活性化Ａｋｔ量が増加するために要求される成長因子の十分な量が存在する場合の指標として、Ａｋｔ活性の程度を観察することの重要性を認識する。
【００７０】
膵臓内分泌細胞における活性化Ａｋｔタンパク質量は、当業者に公知の多様な方法を用いて評価できる。活性化Ａｋｔ量を観察する好適な方法には、免疫細胞化学、またはタンパク質のゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングが含まれてよい。例えば、図４および実施例４の記載を参照のこと。活性化Ａｋｔ量を観察するための方法は、活性化Ａｋｔ量を定量する目的で濃度測定試験、または当業者に知られた他の好適な方法と組み合わせることができる。
【００７１】
〔８．インスリン産生凝集体の分化誘導〕
未成熟膵臓内分泌細胞は、ＰＤＸ−１のようなマーカーを増殖および発現する。一方、成熟膵臓細胞は、増殖せず、インスリンのような内分泌ホルモンを大量に分泌する。従って、生存培地における膵臓内分泌細胞の拡張に続いて、ランゲルハンス島移植に使用するために、未成熟膵臓内分泌細胞から成熟インスリン分泌細胞に分化することが必要である。技術的に公知の多様な方法および分化因子が、以下に記載したような成熟インスリン分泌細胞への膵臓内分泌細胞の分化を促進するために本発明に好適に使用される。
【００７２】
細胞の凝集を誘導することで、膵臓内分泌細胞の分化が誘導できる。細胞の凝集は多用な方法で誘導可能である。例えば、凝集および分化は、ならし培養皿で生育する細胞により誘導できる。例えば、一実施形態では、コラーゲンコートされたプレートは、膵臓内分泌細胞の凝集および分化を誘導するために用いられる。
【００７３】
また、凝集および分化は、細胞を密集した状態に増やすこと、または細胞を分化培地（ＤＭ）で処理することにより誘導できる。分化培地は、生理学的条件を満たしたＦＢＳを含まない培地、およびＰＤＧＦ−ＢＢまたはＩＧＦのようなＡｋｔ刺激因子を含まない培地である。しかしながら、分化培地は、Ａｋｔを刺激しないか、またはＡｋｔを活性化するために十分ではない濃度で存在する多様な他の成長因子および分化因子を含んでいる。分化因子の限定されない典型的な例として、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エクセンディン−４、ニコチンアミド、ベータセルリン、ＩＮＧＡＰ、ｂ−ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびＰＤＧＦを含んでよい。肝細胞成長因子は、培養および遺伝子導入動物において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Mashima, Hら Endocrinology, 137:3969-3976 (1996)」;「Garcia-Ocana, A.らJ. Biol. Chem. 275:1226-1232 (2000)」; および「Gahr, S.らJ. MoI. Endocrinol. 28:99-110 (2002)」を参照のこと。ケラチノサイト成長因子は、遺伝子導入動物において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Krakowski, M. L.,らAm. J. Path. 154:683-691 (1999)」および「Krakowski, M. L.,らJ. Endocrinol 162:167-175 (1999)」を参照のこと。エクセンディン−４は、培養中において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Doyle M. E.およびEgan J. M., Recent Prog. Horm. Res. 56:377-399 (2001) 」ならびに「Goke, R.,らJ. Biol. Chem. 268:19650- 19655 (1993) 」を参照のこと。塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は、マイクロカプセルに入れられた膵臓ランゲルハンス島においてインスリン分泌を増加することを示してきた。例えば、「Wang W.,らCell Transplant 10(4-5): 465- 471 (2001)」を参照のこと。ＩＧＦ−Ｉは、膵管細胞の分化に影響を与える。また、ＩＧＦ−Ｉ代償療法は、Ｉ型糖尿病の治療に用いられる。例えば、「Smith FE.,らProc. Natl Acad. Sd. USA. 15;88(14): 6152-6156 (1991)」、「Thrailkill KM.らDiabetes Technol. Ther. 2(1): 69-80 (2000)」を参照のこと。文献によると、ＮＧＦは膵臓ベータ細胞機能において重要な自動制御の役割を担っていることが示さされてきた。例えば、「Rosenbaum T.らDiabetes 50(8): 1755-1762 (2001)」、「Vidaltamayo R.らFASEB 16(8): 891-892 (2002)」、および「Pierucci D.らDiabetologia 44(10): 1281-1295 (2001)」を参照のこと。 ＥＧＦは、ランゲルハンス島の生育を促進し、インスリン分泌を刺激することが示されてきた。例えば、「Chatterjee AK.らHorm. Metab. Res. 18(12): 873-874 (1986) 」を参照のこと。本発明に公的に使用できるこれ以外の分化因子は当業者に公知である。
【００７４】
〔９．膵臓内分泌細胞の特徴およびその継代〕
当業者は、成熟膵臓内分泌細胞が存在かどうか決定するために、膵臓内分泌細胞およびその子孫細胞の分化段階を決定することは有用であると認識する。膵臓細胞の分化段階は、タンパク質およびｍＲＮＡマーカー（例えば、ＰＤＸ−１またはインスリン）の測定、ならびに機能試験（例えば、グルコース刺激に応じたインスリン分泌能力）を含む多様な方法で確認できる。例えば、図６および図８を参照のこと。
【００７５】
〔９−Ａ．表現型分析〕
どの時点で膵臓細胞が存在するかを知るためには、培養の特定の段階で膵臓内分泌細胞の表現型を分析することが有用である。特定のタンパク質の発現は、細胞の特性または分化状態と関連するため、細胞は、自身の特性または分化状態を評価するためにマーカー遺伝子またはタンパク質の発現を分析されてよい。例えば、新たに分離された膵臓組織において、細胞はアミラーゼの発現により外分泌腺房細胞として同定される。一方、細胞は、インスリンの発現によりランゲルハンス島内分泌細胞として同定される。同様に、分化早期の段階のランゲルハンス島細胞は、通常、サイトケラチンＣＫ−１９に陽性である。一方、成熟ランゲルハンス島細胞では、ＣＫ−１９の発現は低い。
【００７６】
表現型の特性は、細胞対細胞を基準として分析されてもよく、または細胞集団の平均として分析されてよい。分析法は、分析技術の特定の要求および方法論に依存する。従って、固定された切片、またはＦＡＣＳ解析により浮遊細胞で行われる免疫組織化学的手法によるマーカー発現の分析では、個々の細胞が発現する所定のマーカーの頻度および強度を測定する。他方、細胞の全集団のインスリン対アクチンのｍＲＮＡ発現比率の平均のような特性を測定することが望ましい場合もある。そのような場合、通常、前記の分析は、細胞プール（cell pool）からのｍＲＮＡの収集、およびインスリンおよびアクチンのｍＲＮＡの全存在量の測定により行われる（例えば、図６および図８Ｂを参照のこと）。多くの表現型特性は、細胞または細胞集団に基づいて分析され得る。例えば、インスリンの発現は、分泌顆粒におけるインスリンの存在を個々の細胞を染色することにより分析されてもよく、または細胞プールを溶解し、総インスリンタンパク質の分析をすることにより分析されてもよい。同様に、ｍＲＮＡ量は、細胞の溶解およびｍＲＮＡの収集によって細胞集団について測定されてよく、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって個々の細胞について測定されてよい。
【００７７】
前記したように、成熟した膵臓内分泌細胞は増殖しないため、成熟マーカー（例えば、インスリン）量の増加は、内分泌細胞集団の増殖および／または生存の増加を反映する成熟インスリン分泌細胞数の増加の指標となる。インスリン発現の相乗効果による成熟膵臓内分泌細胞の集団の増殖および生存は、生存培地に存在するカスパーゼ抑制剤およびＡｋｔ活性化成長因子の組み合わせ処理において観察される。この相乗効果は、図７において明確に示されている。図に示されているように、Ａｋｔを活性化する成長因子の単独での添加は、コントロール培地のみで生育した細胞と比べてインスリン／βアクチンｍＲＮＡ比率は増加しない。このことは、外因性の成長因子単独では、内分泌細胞集団の増殖および／または生存を増加するために十分ではないことを示唆する。しかし、コントロール培地へのカスパーゼ抑制剤（例えば、ＯＰＨ−１０９）の添加は、コントロール培地のみで増殖させた細胞に対してインスリン／βアクチンの比率を１０倍増加する。このことは、通常、コントロール培地中においてアポトーシスを起こすことを運命付けられた内分泌細胞が、カスパーゼ抑制剤の添加により救出され、生存することを示唆する。驚くべきことに、コントロール培地へのＡｋｔを活性化する成長因子およびカスパーゼ抑制剤の両者の添加（すなわち生存培地）は、コントロール培地のみよりもインスリン／βアクチンの割合を１６倍増加するという相乗効果を生じる。この相乗効果は、カスパーゼ抑制剤によりアポトーシスから救出された内分泌細胞集団の増殖によるものである。
【００７８】
〔９−Ａ−１．細胞分化マーカー〕
多様な内分泌細胞の集団および分化の異なる段階は、当業者に公知の多様な細胞マーカーの発現に基づき同定できる。分離および培養において、臓器提供者の膵臓内分泌細胞は、分化した膵臓内分泌細胞の多様な表現型および遺伝子型の兆候を示し始める。多様な細胞集団および分化の段階の表現型および遺伝子型の兆候は、培養過程間に調節（例えば、増加または減少の調節）される任意の前駆細胞において存在する膨大な数の分子マーカーを含む。
【００７９】
発生段階は、発生中の細胞における特定のマーカーの存在または非存在を同定することにより決定できる。ヒト内分泌細胞は、似たような法則で発生するため、多様なマーカーが、膵臓内分泌前駆細胞から成熟インスリン産生凝集体の表現型に移行する細胞の同定に使用できる。
【００８０】
本発明の方法によって増殖または分化を誘導された細胞でのマーカーの発現は、正常ヒト膵臓発生において発現するマーカーの順序に対して類似性を有する。目的のマーカーは、膵臓において一時的および組織特異的なパターンで発現する分子である（例えば、「Hollingsworth, Ann N Y Acad Sci 880:38-49 (1999)」を参照のこと）。これらの分子マーカーは、３種の一般的なカテゴリーに分けられる。前記のカテゴリーとは、転写因子、ｎｏｔｃｈ経路マーカー、および中間フィラメントマーカーである。転写因子の例は、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ−６．１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＨＥＳ−１を含む。ｎｏｔｃｈ経路マーカーは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１およびＲＢＰｊｋを含む。中間フィラメントマーカーの例は、ＣＫ１９およびネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）を含む。膵臓β細胞の前駆細胞のマーカーの例は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＨｂ９を含む。成熟した膵臓β細胞のマーカーの例は、インスリン、ソマトスタチン、ｇｌｐ−９、およびグルカゴンを含む。
【００８１】
〔９−Ａ−２．膵臓細胞の表現型の評価の一般法〕
培養細胞または分離された細胞におけるタンパク質および核酸の発現を評価する方法は、一般的な技術である。また、前記方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら eds. 2001 supplement)」を参照のこと）、ならびに切片にされた材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、およびフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）において無傷細胞に到達できるマーカーのような免疫学的検定を含む（例えば、「Harlow およびLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)」を参照のこと）。内分泌細胞分化に対する組織化学的な従来マーカーも採用されてよい。免疫組織化学または免疫蛍光分析により試験される細胞は、顕微鏡観察のためガラススライド上で培養されてよい。例えば、「Harlowおよび Lane, supra」を参照のこと。また、従来の組織培養皿中で生育する細胞は、手で培養液から移動され、切片にするためにパラフィンで包埋される。ＰＤＸ−１抗体は、「Leonard J.ら MoI. Endocrinol., 10:1275-1283 (1993)」の技術により作製できるか、またはIncstar,Inc.(Stillwater,MN)のような商業的供給者から購入できる。膵臓内分泌細胞の表現型の具体的な分析方法は、実施例５により詳細に記載する。
【００８２】
〔９−Ｂ．機能分析〕
本明細書に記載した方法による増殖および拡張したベータ細胞の重要な機能の１つは、グルコース量によって細胞自身のインスリン分泌を調整することである。通常、静的グルコース刺激（ＳＧＳ）分析は、異なるグルコース量に反応してインスリンを分泌可能か否かを同定するために、増殖している接着性の膵臓細胞に対して行うことができる。一般的に、細胞は密集度が限界近くになるまで好適な基質上で培養される。ＳＧＳ試験の１〜３日前に、培養液はインスリンを含まず、１ｇ／Ｌのグルコースを含む同じ性質の培地に交換される。前記の培地は毎日交換される。また、実施例６に記載したように、ＳＧＳ試験は４日目に行われる。
【００８３】
〔１０．カプセル化および移植〕
膵臓内分泌細胞のカプセル化は、カプセル中に細胞の凝集体を形成する。カプセル化は、膵臓細胞を糖尿病の患者に移植することを可能にする。さらに、対象動物の免疫反応を最小限にする。３次元環境中において膵臓前駆細胞のさらなる成熟をも可能にする。カプセル膜の気孔率は、カプセルから分泌する生体材料（例えば、インスリン）により選択できる。さらに、外来細胞を宿主動物の免疫系から保護する。
【００８４】
当業者に公知のカプセル化方法は、例えば以下の文献に開示されている：「van Schelfgaardeおよびde Vos, J. MoI. Med. 77:199-205 (1999)」、「Uludagら. Adv. Drug Del Rev. 42:29-64 (2000) 」 および米国特許第５，７６２，９５９号明細書、米国特許第５，５５０，１７８号明細書、および米国特許第５，５７８，３１４号明細書。カプセル化方法は、international application PCT/US02/41616にさらに詳細に記載されており、本明細書に引用して援用する。
【００８５】
哺乳類への埋め込みまたは移植、およびそれに続く内分泌細胞機能の観察は、通常、ランゲルハンス島移植に用いられる方法に従って実行されてよい。例えば、「Ryanら Diabetes 50:710-19 (2001)」、「Peckら Ann Med 33:186-92 (2001)」、「Shapiroら N Engl J Med 343(4):230-8 (2000)」、「Carlssonら Ups J Med Sd 105(2): 107-23 (2000)」、および「Kuhtreiber, WM, Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Birkhauser, Boston, 1999」を参照のこと。限定されない典型例として、埋め込む部位は、皮下、および大網袋（omental pouch）のような腹腔内を含む。
【００８６】
当業者は、所定の臓器移植者に応じてマイクロカプセルの好適な用量を決定することができる。また、前記の用量は臓器移植者のインスリン要求に依存する。マイクロカプセルから分泌するインスリンの量は、技術的に公知の多くの方法（例えば、免疫学的に、または生物学的活性量により）により決定される。移植者の体重も、前記用量を決定する際に考慮される。もし必要ならば、１以上の埋め込みが実行でき、カプセル化細胞への移植者の反応が観察される。従って、埋め込みへの反応は、カプセル化細胞の用量の指針として用いることができる(例えば、「Ryanら Diabetes 50:710-19 (2001)」を参照のこと)。
【００８７】
臓器移植者におけるカプセル化細胞の機能は、グルコースへの移植者の反応を観察することにより決定できる。カプセル化細胞の埋め込みは、血中グルコース量を制御できる。加えて、Ｃ−ペプチドまたは膵臓内分泌細胞ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン）量の増加は、移植されたカプセル化細胞機能の指標ともなる。
【００８８】
当業者は、血中グルコースの制御は、異なる方法で観察できることを認識する。例えば、体重およびインスリン要求性として血中グルコースは直接測定できる。経口的ブドウ糖負荷試験も実施できる。また、腎機能は他の代謝パラメータとして決定できる（「Soon-Shiong, Pら PNAS USA 90:5843-5847 (1993)」、「Soon-Shiong, Pら Lancet 343:950-951 (1994)」）。
【００８９】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、および他の出版物は、その全体を本明細書に引用して援用する。
【００９０】
〔実施例〕
以下の実施例は、具体例を提供する目的を含み、いかなる方法においても本発明を限定することが目的とは解釈されない。当業者により実施例に開示した技術（以下に示された技術）は、本発明の実験において発明者によりその機能が明らかとされ、従って、本発明の実施に好ましい形態で表現できる。しかし、当業者は、本発明の開示の観点から見て、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施例において同様の結果を得たまま、多くの変更ができる。
【００９１】
〔実施例１．膵臓内分泌細胞の培養〕
〔１−Ａ．臓器入手〕
膵臓細胞は、死体の膵臓から分離した。臓器の採取は、United Network for Organ Sharing（「UNOS」）および地方の臓器移植団体が取りまとめている。移植者の研究の同意書へのサインのみが使用される。
【００９２】
膵臓の採取のために、腹大動脈を腎動脈の結合部の下部に挿入し、門脈の灌流のために下腸間膜動脈を介してカニューレを挿入した。前記のカニューレを脾静脈（ＳＶ）が門脈（ＰＶ）に結合している上部の門脈に挿入した。緩い２−０結索部は、門脈の結合部でＳＶの周辺に配置し、他の緩い２−０結索部は脾動脈（ＳＡ）の周辺に配置した。ＳＶの結索部を脾臓側に連結し、灌流を開始する前に直ちに切開した。このことは、ランゲルハンス島に損傷を与える大動脈／門脈の二重終末圧を無くし、膵臓の灌流をより効率的にする。また、全ての門脈の灌流液を肝臓に流入させ、脾臓および膵臓から肝臓に入る灌流液の脱水を避けることも可能にする。続いて、網嚢を切開し、正常生理食塩水（ＮＳ）の流出を膵臓全体に観察した。１Ｌの大動脈灌流の後、ＳＡを連結した。膵臓は、肝臓および腎臓が採取された場合、より厳重に保護されるべきである。前記の膵臓を膵臓移植手術において公知で技術的に使用されている手段で取り出した。
【００９３】
前記の臓器を臓器保存のための冷却保存溶液である「ベルザー溶液（Belzer solution）」で満たされたプラスチックの袋に保存した。例えば、「UhlmannらJ Surg Res. 105(2)」: 173-80 (2002)」を参照のこと。ベルザーＵＷ溶液（Belzer UW solution）は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）(Barr Laboratories，Inc．，Pomona，NY)という名称でも商業的供給者から入手できる。
【００９４】
〔１−Ｂ．膵臓の消化〕
ランゲルハンス島は、酵素学的な膵臓の消化により分離した。リベラーゼ（Liberase）（１バイアル瓶、０．５ｇ、Roche）は、３３３ｍｌのＨＢＳＳ（１．５ｍｇ／ｍｌ、３７℃）に溶解し、腺管へのカニューレ挿入により膵臓に注入した。前記の臓器は、８００ｍｌの焼き戻しビーカーで、１０〜２０分の間３７℃で組織が溶け始めるまで培養した。
【００９５】
前記の半消化された組織の塊を金属の消化チャンバーに移し、自動環状消化(automaticcirculating digestion)を開始した。組織は消化チャンバーの攪拌により分離した。
【００９６】
大部分のランゲルハンス島が周辺の組織から離れた時点で消化薬を回収し、Ａ１０培地（ＲＰＭＩ中１０％ウシ胎仔血清）で希釈した。前記の消化手順を約３０分続けた。細胞をＡ１０培地で４℃、１，０００ｒｐｍ、２分間で３回洗浄し、続いて細胞を分離した。
【００９７】
〔１−Ｃ．膵臓細胞の分離〕
前節に記載した洗浄および遠心分離手順から得られた沈殿を３２０ｍｌの膵臓ランゲルハンス島精製溶液（「ＰＩＰＳ」）（１３．７％溶液のＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）ＡＧ（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）と混合した。前記のＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）は、合成名５−（Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピルアセトアミド）−２，４，６−トリ−ヨード−Ｎ，Ｎ’−ビス(２，３ジヒドロキシプロピル)イソフタルアミド）で、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）ベルザーＵＷ溶液（密度１．１１４）中で調整され、氷上で１０分間静置された遠心分離密度勾配溶液である。
【００９８】
８本の各２５０ｍｌの平底遠心チューブを７０ｍｌのＰＩＰＳで満たした（密度１．０９０）。４０ｍｌの細胞／ＰＩＰＳ懸濁液は、各チューブの下層に移動する。一方、６０ｍｌの２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０は、ＰＩＰＳの上層に移動する。前記のチューブを１，５００ｒｐｍで０５ＡＲＣロータを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３ＣＰｌｕｓを用いて継続的に６分間遠心した。
【００９９】
上層の界面（Ａ層、精製されたランゲルハンス島細胞）、下層の界面（Ｂ層、取り込まれたランゲルハンス島細胞、断片化したランゲルハンス島細胞、腺房細胞および導管細胞）および沈殿（主に腺房細胞および導管細胞）が分離して集められる。細胞は、Ａ１０培地でさらに２回洗浄され、所望のように用いられる。
【０１００】
〔１−Ｄ．膵臓細胞培養〕
膵臓細胞は、５％ＦＢＳを含む１０ｍｌ ＳＭ９５／ＲＰＭＩ１６４０（１：１の比率）（コントロール培地として指定）、または以下の補助栄養物質を含み５％のＦＢＳを含むＳＭ９５／ＲＰＭＩ１６４０（１：１の比率）培地のどちらかに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で１００ｍｍプラスチック組織培養皿（BD Biosciences, San Jose, CA）に撒かれる。前記の補助栄養物質は、外因性成長因子ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（７０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／ｍｌ）（全てR&D Systems Inc.）、および外因性カスパーゼ抑制剤である非Ｏ−メチル化ＶＤ−ＯＰＨ（１００μＭ）（MP Biomedical, Solon, OH）（生存培地として指定）。培養液は３日毎に交換した。細胞が９０％の密集度に到達すれば、０．０５％トリプシン（トリプシン／ＥＤＴＡ、Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてＰ１に継代した。前記の細胞の分離比率は、コントロール培地においては１：４、生存培地においては１：６である。Ｐ１培養は、約５日で９０％の密集度に到達した。この時点で分離比率１：３でＰ２に継代した。以降の全ての継代はＰ１培養に記載したように行った。
【０１０１】
〔実施例２．生存培地における膵臓前駆細胞の増殖〕
〔２−Ａ．トリパンブルーを用いた生細胞数の測定〕
生存培地で培養した膵臓前駆細胞の増殖および生存をコントロール培地での培養と比べて評価するために、培養過程の異なる段階の間で細胞数および増殖を評価した。９０％以上の密集度に達した前記の細胞から０．０５％トリプシンを用いて単一膵臓細胞懸濁液を作製した。細胞の生存を評価するためトリパンブルーを用いて、血球計数機により生存細胞数を数えた。その結果、生存培地で培養すると生存細胞の数がコントロール培地での培養に比べて増加した。
【０１０２】
〔２−Ｂ．細胞増殖マーカー（Ｋｉ−６７）に対する抗体を用いた免疫標識〕
生存培地において生育および拡大された膵臓内分泌細胞は、コントロール培地において生育および拡張した膵臓内分泌細胞よりも高い割合で増殖および生存する。このことを確認するために、細胞を４ウェルチャンバースライドで生育し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。細胞をブロック液（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／１％正常ヤギ血清）中で１時間培養した後、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸを用いて５分間透過化した。続いて細胞をブロッキング液で洗浄した。次に、モルモット抗ヒトＣ−ペプチド抗体（DAKO Inc.,Carpinteria, CA）またはウサギ抗Ｋｉ−６７抗体（Neomarkers, Fremont, CA）と１時間室温で培養した。細胞をそれぞれ１５分間ＰＢＳ／１％ トリトンＸ／１％ＢＳＡで３回洗浄し、二次抗体としてアレクサ４８８抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）と１時間培養した。次に、細胞を３回、各１５分間洗浄し、再び４％のパラホルムアルデヒドで固定した。次に、細胞をＰＢＳ／ＲＮＡｓｅで５分間洗浄し、ＤＡＰＩ核染色（Vector Labs, Burlingame, CA）を含むベクターシールド（Vectashield）で包埋した。図３Ａは、前記のＫｉ−６７で免疫標識されたコントロール培地または生存培地のどちらかで生育した膵臓細胞を示す。この結果は、生存培地で生育した細胞では、コントロール培地中で生育した細胞と比較して細胞のＫｉ−６７標識が約５倍増加することを示す（図３Ｂを参照のこと）。
【０１０３】
〔２−Ｃ．細胞増殖の指標としてのＤＮＡ含有量〕
Ｋｉ−６７標識により示された細胞数の増加は、メーカーの使用説明書に従ってＣＹＱＵＡＮＴ細胞増殖試験（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いてトリプシン処理細胞数を測定することにより確認した。細胞は、ＣＹＱＵＡＮＴ ＧＲ色素を含有する緩衝液の添加により溶解した。蛍光マイクロプレートリーダーは、続いて試料の蛍光の直接測定に用いた。前記の分析は、単一色素濃度を用いて２００μｌの容量あたり５０〜５０，０００個の細胞範囲に及ぶ直線的検出範囲（linear detection range）を有する。対数期にない細胞は、高いＤＮＡ含有量を示し、コントロール培地での生育と比較して生存培地中で生育した場合では細胞数が約３０％増加する（図３Ｃを参照のこと）。
【０１０４】
〔実施例３．膵臓細胞および繊維芽細胞培養中のアポトーシスおよび活性化カスパーゼの検出〕
〔３−Ａ．膵臓細胞および繊維芽細胞におけるアポトーシス〕
アポトーシスの最初の兆候の１つは、原形質膜の内部から外葉への膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位である。一度ＰＳが細胞外環境にさらされると、その結合部位がアネキシンＶ（ＰＳに高親和性を有する、３５〜３６ｋＤａ、Ｃａ２＋依存性、リン脂質結合タンパク質）に利用可能となる。初期のアポトーシスを起こす細胞を検出するために、Ｐ０膵臓細胞、または正常ヒト繊維芽細胞を４−ウェルチャンバースライドに静置し、本明細書に記載された条件下で生育した。継代の前に、メーカーの使用説明書に従って前記の細胞をアネキシンＶ、アネキシンＶ−ＥＧＦＰの蛍光共役体と５分間、５００μｌの結合緩衝液中で培養した（U.S. Biological, Swampscott, MA）。アポトーシスを起こした細胞をそれぞれＦＩＴＣおよびローダミンの二重フィルターを用いて蛍光顕微鏡を利用して可視化し数を数えた。次に、アネキシンＶに陽性の染色された膵臓細胞と、染色されない正常環状繊維芽細胞とを比較した。我々は、アネキシンＶによる染色はＰ０膵臓細胞に特異的だと確認した。アネキシンＶの結合は、カルシウム依存的であり、コントロールとしてカルシウムのキレート剤である１μＭのＥＧＴＡ（Sigma,St Louis,MI）をＰ０膵臓培養へ添加すると染色が阻害されるためである。失われる細胞は、接着性および非接着性細胞集団のＰＤＸ−１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ、およびインスリンｍＲＮＡの特長により示されたようなベータ細胞および内分泌細胞と推定される細胞であった。加えて、１：１０００希釈での抗ヒトＣ−ペプチド(DAKO, Carpinteria, CA)およびアネキシンＶを用いた二重免疫蛍光染色は、多くのベータ細胞（抗ヒトＣ−ペプチド陽性）が、アネキシンＶ陽性であることを明らかにした（図２を参照のこと）。これらの結果は、インビトロでのヒト膵臓細胞の培養は、有用な内分泌系統細胞がアポトーシスを起こし減少すること示す。
【０１０５】
〔Ｂ．膵臓内分泌細胞および繊維芽細胞培養中のカスパーゼ活性化におけるカスパーゼ抑制剤の効果〕
アポトーシスの顕著な特徴の１つはカスパーゼの活性化である。カスパーゼ３および７はその下流に共通配列ＤＥＶＤを有する。培養におけるアポトーシスの程度を決定するため、我々は、メーカーの使用説明書に従ってＡｐｏ−ＯＮＥ分析システム（Promega）を用いた（図１）。細胞を９６ウェルプレートに移し、細胞溶解液をカスパーゼ活性を支持する緩衝液（Promega,Madison,WI）中で調製した。また、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍでＡｐｏ−ＯＮＥカスパーゼ３／７蛍光分析（Promega, Madison, WI）を用いて蛍光プレートリーダーで分析した。我々の分析により、アポトーシスおよびカスパーゼ活性の潜在的誘導剤であるスタウロスポリンで処理した繊維芽細胞培養量に相当する量の接着細胞由来のＰ０培養の内分泌細胞においてカスパーゼが活性化されたことが示された。広い範囲のカスパーゼ抑制剤であるＶＤ−ＯＰＨ−１９（MP Biomedicals, Solon, OH）を１μＭの濃度で添加するとカスパーゼの活性化が完全に消滅した（図１を参照のこと）。
【０１０６】
〔実施例４．ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを用いた活性化Ａｋｔ量の決定〕
Ａｋｔ量について我々の膵臓細胞培養条件の効果を評価するために、ウエスタンブロット分析により定常状態でのＡｋｔタンパク質量を測定した（図４Ａおよび４Ｂ）。培養３日後および１回の培地の交換後、ゲル電気泳動および免疫ブロット分析のため膵臓細胞培養に由来する接着性画分および非接着性画分の両者を採取した。陽性コントロールとしてスタウロスポリン（アポトーシスおよびカスパーゼ活性の潜在的誘導剤）で処理した細胞、または陰性コントロールとしてスタウロスポリン未処理の細胞のどちらかをコントロールとしてヒト初代繊維芽細胞を調べた。細胞単層および細胞懸濁液は、冷やしたＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ抑制剤のカクテル（Roche,Palo Alto）を含むＲＩＰＡ緩衝液中において４℃で溶解した。前記のＲＩＰＡ緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、および１ｍＭ ＮａＦを含む。不純物を除くために細胞溶解液を４℃で遠心した。タンパク質の濃度をメーカーの使用説明書に従ってＢＩＯＲＡＤタンパク質分析試薬（Biorad）を用いて各上清について決定した。等量の２×レムリ（Laemmli）ＳＤＳサンプル緩衝液を各試料に添加した。試料を加熱し、等量のタンパク質をゲルにのせた。前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いてＰＤＶＦ膜に転写した。前記のＰＤＶＦ膜を３％無脂肪粉ミルクを含むＰＢＳ中で室温で２時間ブロッキングし、ウエスタンブロット分析を行った。ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを前記のように行い、リン酸化特異的抗体で標識された膜の場合を除いて、ブロッキング緩衝液は３％ＢＳＡを含むＰＢＳとした。タンパク質のブロットを１：１００に希釈された抗体（抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化セリン４７３−Ａｋｔ抗体）(Cell Signaling, Beverly, MA)で標識した。コントロールとしてＧＡＰＤＨに対する抗体（Santa Cruz）を１：５００希釈で使用した。続いてブロットを１：１５，０００で希釈したＨＲＰ共役抗体（二次抗体）（Pierce）中で培養した。タンパク質の検出は、化学蛍光促進剤（ＥＣＬ）（Pierce）を用いて行った。非接触細胞において全長Ａｋｔの切断、および多くのタンパク質分解断片の存在を明らかにした抗Ａｋｔ抗体による免疫ブロット法分析は、接着性細胞画分では前記の切断および断片は少ないことも明らかにした。この現象は、スタウロスポリン（アポトーシスの潜在的誘導剤）で処理した初代繊維芽細胞においては観察されないが、Ａｋｔ不活性化の新しい機構を表す。さらに、接着性細胞においてもＡｋｔが切断されることは、前記の細胞がアポトーシスを運命付けられていることを示す。このことは、多くの接着性の細胞がアネキシンＶに陽性に染色された先の知見と一致する。Ａｋｔ活性化成長因子の添加は、細胞の定常状態のＡｋｔ量を上昇させ（図４Ｃ）、細胞の生存とＡｋｔタンパク質の増加との間の相関関係を証明するものである。
【０１０７】
抗リン酸化セリン−４７３抗体を用いた免疫ブロット法は、全長Ａｋｔがリン酸化されており、おそらく接着性の膵臓細胞において活性であることを明らかにした（図４Ｂ）。リン酸化された断片は、非接着性細胞において顕著であり、接着性細胞集団においては少量であった。培地へのＰＤＧＦ−ＢＢの添加（R &D Systems, Minneapolis, MN）（５０ｎｇ／ｍｌ）は、全長リン酸化Ａｋｔの増加を生じる（図４を参照のこと）。これらの結果は、Ａｋｔの脱リン酸化は、Ａｋｔのカスパーゼ不活性化を必要としないことを示し、その上、リン酸化され活性化したＡｋｔ断片はアポトーシスの間に機能可能であることを示している。
【０１０８】
〔実施例５．生存培地において処理および拡張された細胞の表現型分析〕
〔５−Ａ．免疫蛍光法〕
膵臓細胞の増殖における生存培地の効果を測定するために、増殖細胞のマーカーであるＫｉ−６７の発現を調べた（図３）。免疫蛍光法のため、細胞は４ウェルチャンバースライドで生育し、対数期の細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。細胞は、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／１％の正常ヤギ血清）で１時間培養した。続いて、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸで５分間透過化した。次に、洗浄し、モルモット抗ヒトＣ−ペプチド抗体（ポリクローナル抗体）（ＤＡＫＯ）、または１：５００に希釈したＫｉ６７に対する抗体（Neomarkers, Fremont, CA）と１時間培養した。細胞をＰＢＳ／１％トリトンＸ／１％ＢＳＡで３回各１５分洗浄し、アレクサ４８８共役抗体（１：２００）（二次抗体）（Molecular Probes, Carlsbad, CA）と１時間培養した。次に、細胞を１５分間洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで再び固定した。５分間のＰＢＳ／ＲＮＡｓｅでの洗浄後、細胞を核染色ＤＡＰＩを含むベクターシールドを用いて封入した（Vector Labs, Burlingame, CA）。その結果、Ｋｉ６７陽性細胞は劇的な増加を示し、生存培地において拡張された細胞の増殖率をさらに増大する。従って、生存培地の使用は、内分泌細胞系統集団の迅速な拡張により、少ない臓器提供者から培養を開始する細胞集団を最大化する方法を示す。
【０１０９】
〔５−Ｂ．免疫組織化学〕
内分泌細胞系統集団における生存培地の効果をさらに測定するために、これらの細胞において発現しているインスリンおよびＰＤＸタンパク質の量を測定した（図５）。膵臓細胞は、ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、Ｂｏｕｉｎ ｆｌｕｉｄで１時間固定し、等級アルコールにおいて脱水し、パラフィン包埋した。４μｍの薄さのパラフィン切片を切断し、ガラスプレート上に静置した。スライドは、通常の組織学的方法を用いて処理し、続いて外因性のぺロキシダーゼ活性を止めるために０．３％Ｈ２Ｏ２中で培養した。全てのスライドを１０％の好適な種の正常血清を用いてブロックした。一次抗体は以下に挙げる希釈倍率で、組織に室温で６０分間反応させた。用いた抗体は、モルモット抗Ｃ−ペプチド抗体（1 :2000; DAKO, Carpinteria, CA）、ウサギ抗ＰＤＸ−１（1 :1000; Incstar, Stillwater, MN）である（図５）。抗体の結合の特異性は、類似した正常血清または非特異的ＩｇＧで希釈した一次抗体を置換することで調節した。続いて、スライドは、メーカーの使用説明書に従って好適なビオチン化された二次抗体と培養した(Vector Lab, Burlingame, CA)。抗体は、ＡＢＣ／ＤＡＢキット（ＤＡＫＯ）を用いて可視化した。また、組織切片はヘマトキシリンで対比染色した。その結果、生存培地で拡充した細胞集団では、より多くの細胞がＣ−ペプチドおよびＰＤＸ−１に陽性に染色された。これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光染色により示したように、より多くの内分泌細胞が生存培地で処理した細胞に存在するという我々の最初の発見を裏付けるものである。
【０１１０】
〔５−Ｃ．リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ〕
内分泌系統細胞における生存培地の効果を測定するために、我々は、例えば図６に示したように定量的ＲＴ−ＰＣＲにより拡充した内分泌細胞の遺伝子発現を調べた。細胞のＲＮＡは、Nucleospin RNA IIキット(BD Biosciences, Inc.)を用いて細胞から分離した。逆転写は、５μｇの全ＲＮＡ ＭＭＬＶ逆転写酵素（Invitorogen）を用い、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Sigma, St. Louis, MO）、２５ｎｇ／μｌのオリゴ（ｄｔ）１２−１８プライマー（Sigma）、ＲＮａｓｅ抑制剤（Sigma）および１×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ緩衝液（Invitrogen）を用いて行った。前記の混合物を６５℃で５分間加熱した。その後、逆転写酵素を加え、６０分間、３７℃で培養した。反応を終了し、リアルタイム定量ＰＣＲを５倍希釈したｃＤＮＡ０．５ｍｌの存在下で、Light Cycler machines１．０および２．０（Roche）を用いてメーカーの使用説明書に従って行った。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＤＸ−１、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ１、ＣＫ−１９、アミラーゼ、ＨＮＦ３ベータ、およびベータアクチンのプライマー配列を公表されたヒトｍＲＮＡ配列に基づいて設計した。ｍＲＮＡデータは、絶対的定量法を用いた予測に従って表されるか、コントロールに対する増加率として表される。異なる遺伝子の全ての発現量をベータアクチンに対して標準化した。生存培地で拡張した細胞での内分泌細胞および前駆細胞マーカーの遺伝子発現の増加は、内分泌細胞系統集団が保護され、拡張されることを示唆する（例えば、図６を参照のこと）。従って、膵臓内分泌細胞は、コントロール培地における増殖および生存に比べて生存培地において増殖および生存率が増加する。
【０１１１】
〔実施例６．生存培地において処理および拡充された細胞の機能分析〕
〔６−Ａ．細胞のマイクロカプセル封入〕
細胞の拡張において、最終的に分化したベータ細胞の機能を評価するために細胞を分化させる必要がある。細胞のアルギン酸塩マイクロカプセルへの封入は、分化の典型例を提供する。ここで、マイクロカプセル化された単細胞は凝集し、ＤＭ（分化培地）の存在下で最終的に分化する。採取した細胞は、１．６％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム溶液に浮遊した状態で、以下に記載された空気ジェットを用いてアルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）−アルギン酸塩マイクロカプセルにカプセル化した（Soon-Shiongら Transplantation 54:769-74, (1992)）。細胞の凝集を促進するために、初期のカプセル内でゲル化したアルギン酸塩の中心部は、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２ ２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中でカプセルを培養することで液化する。前記のカプセル化した細胞凝集体は、ＳＭ９５培地を含む組織培養フラスコ中に静置した。細胞を回復させた後、培地をＤＭに交換した（分化培地）。その後、一週間に二度完全な培地交換を行った。培養１〜３週間後、カプセル化細胞凝集体を静的グルコース刺激に用いた（例えば、図８を参照のこと）。
【０１１２】
〔６−Ｂ．静的グルコース刺激（ＳＧＳ）分析〕
ベータ細胞の機能について生存培地の効果を調べるために、カプセル化した細胞（２００−２５０マイクロカプセル（mics））を５ｍｌの低グルコース（１００ｍｇ／ｄｌ）と一晩（３７℃、５％ＣＯ２）インスリン欠損培地で培養した。カプセル化細胞は、Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ溶液中で６０分間連続培養（３７℃、５％ＣＯ２）することにより機能性を試験した。前記のＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ溶液は、６０ｍｇ／ｄｌグルコース（低濃度１）、４５０ｍｇ／ｄｌグルコース（Sigma）（高濃度）、および６０ｍｇ／ｄｌグルコース（低濃度２）を含む。各段階の後、溶液を回収し、以降の試験のために保存した。最終段階の後、解剖用顕微鏡下でカプセルの数を数えた。各溶液のヒトＣ−ペプチド含有量は、超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡ（Mercodia, Uppsala, Sweden）を用いてメーカーの使用説明書に従って定量した。Ｃ−ペプチドの放出は、緩衝液１ｍｌあたりに凝集体として発現する（各培養段階の後に回収した）か、または低濃度グルコース（低濃度１）によって得られるインスリンの分泌により区別される高濃度グルコース溶液（高濃度）において得られるインスリンの分泌である相対的な刺激指数（ＳＩ）として発現する。前記の値は、カプセルあたりに同数の細胞を含むカプセル数に対して標準化した。図８Ａおよび８Ｂに示した結果は、より高い内分泌細胞遺伝子発現と同様に生存培地中で拡張された細胞においてグルコース刺激への高い反応性を示し、我々の内分泌系統細胞の濃縮の知見を支えるものである。加えて、前記の拡張は細胞の機能を失わない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、ヒト膵臓細胞培養においてカスパーゼが活性化されていることを示す。培養した膵臓細胞の細胞溶解液中でのカスパーゼ活性の量を測定することでアポトーシスの程度を決定するために、カスパーゼ３／７比色実験を行った。陰性および陽性コントロールとして、カスパーゼ活性を、カスパーゼ依存性のアポトーシスを誘導するために１ｎＭのスタウロスポリンで１２時間処理した培養ヒト繊維芽細胞、または無処理の培養ヒト繊維芽細胞において測定した。カスパーゼ阻害剤、非Ｏ−メチル化Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ（ＯＰＨ−１０９）は、濃度依存的にカスパーゼ抑制を示した。これらの値は独立した３つの実験の代表値である。
【図２】図２（２Ａおよび２Ｂ）は生存培地（Survival Medium）がヒト膵臓細胞をアポトーシスから救うことを示す。図２Ａは、トリパンブルー排除染色により決定された継代前の膵臓細胞の生存の定量的評価（総細胞数に対する生存細胞の割合）を示す。図２Ｂは、コントロール培地または生存培地中で生育したヒト膵臓細胞のＣ−ペプチドとアネキシンＶ−ＥＧＦＰとの共染色を示す。中央のパネルは、正常ウサギＩｇＧを用いた抗体染色の特異性を調べるためのコントロールを示す。
【図３】図３（Ａ−Ｃ）は、生存培地中で培養された膵臓細胞の増殖を表す。図３Ａは、ＤＡＰＩ（左列）でラベルされたヒト膵臓細胞、またはウサギ抗Ｋｉ６７抗体（右列）で免疫染色されたヒト膵臓細胞の密集度８０％の対数期培養を示す。細胞は、コントロール培地（上段パネル）または生存培地（中段パネル）のどちらかで生育した。正常ウサギＩｇＧを抗体染色の特異性を調べるためのコントロールとして用いた（下段パネル）。図３Ｂは、総ＤＡＰＩ陽性細胞の割合として表したＫｉ−６７陽性細胞の数の定量分析を示す。図３Ｃの細胞数は、細胞数を数えることで算出した細胞数、およびコントロール培地または生存培地のどちらかで増殖させた密集培養中のＤＮＡ含量を測定することで算出した細胞数である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、培養膵臓細胞から調製され（継代後３日）、抗Ａｋｔ抗体（図４Ａ）または抗ＡｋｔＳｅｒ４７３リン酸化特異的抗体（図４Ｂ）で標識された全細胞溶解液をイムノブロット分析したものを示す。未処理の繊維芽細胞（図Ａおよび図Ｂレーン１）、スタウロスポリンで処理された繊維芽細胞（図Ａおよび図Ｂレーン２）、並びに培養膵臓細胞の接着性画分（図Ａおよび図Ｂレーン３）、および非接着性（図Ａおよび図Ｂレーン４）画分の免疫ブロットを示す。１００ｎＭＰＤＧＦで処理した膵臓細胞培養のコントロール溶解物をコントロール（図Ｂレーン５）として示した。図４Ｃは、生存培地で処理した細胞の定常状態のＡｋｔ発現量を示す。コントロール培地または生存培地のどちらかにおいて生育した接着性細胞および非接着性細胞の全細胞溶解液を抗Ａｋｔ抗体で標識し、免疫ブロッティングを行った。
【図５】図５（Ａ−Ｆ）は、生存培地で処理した後、Ｃ−ペプチドおよびＰＤＸ−１で免疫標識した膵臓細胞を示す。図Ａ−Ｄは、コントロール培地（パネルＡおよびＤ）または生存培地（パネルＢおよびＥ）のどちらかで生育した細胞に由来する膵臓細胞凝集体のパラフィン包埋切片について行った免疫細胞化学の結果を示す。抗Ｃ−ペプチド抗体染色を上段のパネル、抗ＰＤＸ−１抗体染色を下段に示す。Ｃ−ペプチド（＋）細胞の割合（パネルＣ）およびＰＤＸ−１（＋）細胞の割合（パネルＦ）を示す。実験は３回行い、４つの独立した領域の平均を定量化した。
【図６】図６（Ａ−Ｄ）は、生存培地において生育した膵臓細胞は、内分泌細胞および前駆細胞のマーカーの発現が増加することを示す。コントロール培地（各パネルの左の棒グラフ）または生存培地（各パネルの右の棒グラフ）のどちらかにおいて３回継代され、維持されたヒト膵臓細胞のＲＮＡ溶解物について、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてインスリン、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＤＸ−１およびＨＮＦ３−βの発現を調べた。遺伝子の発現は、βアクチンｍＲＮＡに対する遺伝子の比率として示した。データは、コントロールと比べて生存培地において各遺伝子の比率が何倍も上昇することも表す。例えば、インスリンは、コントロール培地中で生育した細胞と比べて生存培地中で生育した細胞では２８倍増加した。同様に、コントロール培地で生育した細胞と比べて生存培地で生育した細胞ではＮｅｕｒｏＤは１５倍、ＰＤＸ−１は２７５倍増加し、ＨＮＦ３−βは８８倍増加した。
【図７】図７は、膵臓内分泌細胞培養中のインスリン遺伝子発現においてＡｋｔ活性化成長因子とカスパーゼ抑制剤との間の相乗効果を示す。このデータは、コントロール培地単独での細胞の生育から得られた比率の何倍もの増加を示すβアクチンｍＲＮＡで標準化したインスリンｍＲＮＡの比率であるこの結果は、Ａｋｔ活性化成長因子のコントロール培地への添加は、コントロール培地のみで生育した細胞に比べてインスリン遺伝子発現を増加する効果はないことを示す。このことは、成長因子は、内分泌細胞集団の増殖または生存を増加させないことを示す。しかし、カスパーゼ抑制剤（ＯＰＨ−１０９）を添加すると、コントロール培地のみで生育した細胞に比べてインスリン遺伝子発現が１０倍増加する。このことは、内分泌細胞集団においてアポトーシスが減少し、生存する細胞が増加したことを示す。驚くべきことに、コントロール培地におけるＡｋｔ活性化成長因子とカスパーゼ抑制剤との複合効果は、相乗的に働きコントロール培地のみで生育した細胞よりもインスリン遺伝子発現が１６倍増加する。この相乗効果は、成長因子またはカスパーゼ抑制剤のどちらか単独でコントロール培地に加えて生育した細胞と比べて、内分泌細胞集団の増殖および生存が増加することを示す。
【図８】図８（Ａ−Ｂ）は、コントロール培地または生存培地において生育し、分化因子で処理したカプセル化細胞の静的刺激および遺伝子発現分析を示す。図８Ａにおいて、６０ｍｇ／ｄｌのグルコースおよび４５０ｍｇ／ｄｌのグルコースを添加したクレブス溶液（Ｋｒｅｂｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中での連続培養によってカプセル化細胞の機能性を評価した。ヒトＣ−ペプチド含有量は、超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡを用いて定量した。Ｃ−ペプチド分泌は緩衝液（Ａ）の１ｍｌあたりの累積として表した。細胞は、カプセルから回収され、溶解、およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、βアクチンｍＲＮＡに対する遺伝子の比率として図８Ｂに示したように遺伝子発現を決定した。実験は３回行い、独立した２つの実験の平均を表した。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、参照のために本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６０／７６０，４４５号明細書（２００６年１月２０日出願）に優先して利益を主張するものである。
【０００２】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、アポトーシスの制御および膵臓内分泌細胞の培養における増殖の要であるＡｋｔ、セリン／スレオニンキナーゼに関する。さらに、本発明の方法および組成は、（１）細胞のアポトーシスを減少させるために十分な量のカスパーゼ抑制剤、および（２）膵臓内分泌細胞の活性化Ａｋｔ量を上昇させるために十分な量の成長因子、に接触することで、膵臓細胞培養における膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進することを可能にする。
【０００３】
〔発明の背景〕
正常血糖(euglycemia)の回復の手段としてのランゲルハンス島移植の出現は、糖尿病治療において主要な画期的出来事とされる。しかし、ヒト臓器提供者の不足は、臓器提供者の臓器に対する臓器移植者の数を増加させるためにランゲルハンス島調整物からインビトロで島の増殖方法を発展させる重要性を浮き彫りにする。げっ歯類における知見では、成熟ベータ細胞は複製能を保っているが、増殖しているヒトベータ細胞は今日まで特定されていない（「Dorら (2004) Nature 429 (6897):41-46」）。ランゲルハンス島増殖の研究において主要な点は、急激に増え、成熟内分泌マーカー（特にインスリン）を発現する可能性を有する膵臓内分泌細胞の同定である。しかし、前記の前駆細胞の性質はいまだに解明されていない。
【０００４】
移植片の機能性の欠損と同様に、分離および細胞培養過程の間のランゲルハンス島の損失は、糖尿病患者の治療のために十分な数のランゲルハンス島の確保にとって大きな障害である。インビトロで培養されたヒト膵臓細胞は、内分泌細胞の顕著な損失を導くアポトーシスを起こす。そのため、移植前の多くの措置の間、移植用の島細胞を保存するための確立した方法が決定的に重要である。
【０００５】
臓器入手および細胞分離の過程の間、ランゲルハンス島は臓器提供者の脳死、臓器の分離および保存手順、膵臓の酵素学的消化、ランゲルハンス島画分の分離、並びにインビトロ細胞培養による多様な損傷にさらされる。そのため、患者一人への移植に一人以上の臓器供与者の膵臓が必要である。これら全ての手順の間における細胞死機構の活性化は、島移植の前および後に観察される機能的な島集団の大量減少の説明となるかもしれない。このことは、糖尿病治療の手順の有効性の実質的な制限である。
【０００６】
カスパーゼはアポトーシス細胞死を導く多くの段階の実行に主要な役割を担っていることが確かめられている(「Chandraら (2001) Diabetes 50(supp 1):S44-S47」)。アポトーシスの抑制は、増殖に利用できる限られた数のヒト膵臓提供者から内分泌細胞を増やすことの一因となることが示された。(例えば、米国特許第６，５６２，６２０号明細書; 「Hayek, A.ら (2002) Curr. Diab Rep. 2：371-376」を参照のこと)。特に、ある方法は、ランゲルハンス島の損失に関与する細胞死過程を阻害し、患者への島集団の移植が促進してきた（国際公開第２００３６１５５１号パンフレット）。１以上のカスパーゼ構成員の抑制により、多くの細胞種（膵臓内分泌細胞を含む）において細胞死を防ぐことができるが、カスパーゼ切断の上流の細胞死を標的とすることがより効果的であろう。
【０００７】
数々の成長因子が、膵臓細胞の生存、増殖および機能を増強することが示されてきた(「Garcia-Ocanaら (2001) J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:984-988」)。これらの成長因子は全て、多くの細胞種の生存を制御するホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル経路の上流で働く(「Stokoe, D. (2005) Expert Rev. MoL Med. 7:1-22; Linら (1999) Cancer Research 59:2891-2897」)。この経路の重要な作動体（effector）は、膜の回復およびリン酸化を介して活性化されるセリン／スレオニンキナーゼ、Ａｋｔである。多様な組織におけるインスリン反応およびグルコースの代謝におけるＡｋｔの役割は数多く発表されている（Whiteman E.L.ら (2002) Trends Endocrinol. Metab. 10:444-451）。例えば、Ａｋｔ２遺伝子の欠損を有するマウスは、発育不全を示し、インスリン抵抗性およびグルコース不寛容である。構成的に活性化したＡｋｔ１を発現するトランスジェニックマウスは、ベータ細胞の大きさ、ならびに亢進したグルコース寛容および実験的糖尿病への完全な抵抗性を導く島集団全体が増加する（「Turtleら (2001) Nat. Med. 7:1133-1137」）。さらに最近の研究では、ウイルス遺伝子の転移または薬理学的方法のどちらかによるＡｋｔ１の構成的発現は、糖尿病マウスにおいてヒト島移植片の状態を改善することが示唆された（「Contrerasら (2001) Transplantation 74:1063-1069」; 「Raoら (2005) Diabetes 54:1664-1675」）。
【０００８】
結局のところ、前記の研究のゴールは、細胞死経路を阻害することによりランゲルハンス島集団を増加することであり、さらに、ランゲルハンス島の移植を糖尿病治療の実験的手法とするために、内分泌細胞の増殖および拡張を同時に促進することである。本発明は、細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子に細胞を接触させることで、膵臓細胞培養において細胞の生存および増殖を促進する方法を提供することにより、前記のゴールに達する。さらに、カスパーゼ阻害剤および成長因子の組み合わせは、他の細胞種において見られない相乗効果を提供する。
【０００９】
〔発明の簡単な要約〕
本発明の一態様は、（１）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および（２）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子、に細胞を接触することで、膵臓細胞培養において膵臓内分泌細胞の増殖を促進する方法を提供する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、膵臓内分泌細胞はインスリンを産生する凝集体である。
【００１１】
本発明の一実施形態では、細胞は外因性のカスパーゼ抑制剤と接触する。本発明に好適に使用されるカスパーゼ抑制剤の典型的な例は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびＣＰＰ３２／アポパイン（Apopain）抑制剤を含み、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを含む。
【００１２】
本発明の一実施形態では、外因性のカスパーゼ抑制剤は、約ｌμＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭの間、およびより好ましくは約１〜約１０μＭの間の濃度で存在する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００μＭ）。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、膵臓内分泌細胞は、活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な外因性の成長因子に接触される。以下に限定されるものではないが、本発明における使用に好適な成長因子の典型例は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびヘレグリン（heregulin）を含む。一実施形態では、外因性の成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、並びにＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩのどちらかである。
【００１４】
本発明に用いられる外因性の成長因子は、通常、培養液中に約１０ ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ(例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｎｇ／ｍｌ)の濃度で存在する。
【００１５】
本発明の他の態様は、膵臓内分泌細胞を含む培養液である。前記の培養液は、培養された膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤を含む。また、前記培養液は、培養された膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔ量を増加するために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子を含む。
【００１６】
本発明の一実施形態では、培養液は外因性のカスパーゼ抑制剤を含む。本発明に好適に用いられる典型的なカスパーゼ抑制剤は、Ｑ-ＶＤ-ＯＰＨ、Ｚ-ＶＡＤ（ＯＭｅ）-ＦＭＫ、Ａｃ-ＶＡＤ-ＣＨＯ、Ｂｏｃ-Ｄ-ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ-９Ｂ１２、Ａｃ-ＬＤＥＳＤ-ＣＨＯ、ＤＥＶＤ-ＣＨＯ、およびＣＰＰ３２/アポパイン抑制剤を含む。一実施形態では、外因性のカスパーゼ抑制剤はＱ-ＶＤ-ＯＰＨ、またはＺ-ＶＡＤ（ＯＭｅ）-ＦＭＫである。
【００１７】
培養液中の外因性のカスパーゼ抑制剤は、通常約ｌμＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、およびより好ましくは、約１〜約１０μＭの濃度で存在する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００μＭ）。
【００１８】
また、本発明の他の実施形態では、培養液は、培養細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子を含む。本発明の使用に好適である典型的な成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびヘレグリンである。一実施形態では、外因性成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、並びにＩＧＦ−Ｉ、および／またはＩＧＦ−ＩＩのどちらかである。
【００１９】
本発明に用いられる外因性の成長因子は、通常培養液中に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ(例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｎｇ／ｍｌ)の濃度で存在する。
【００２０】
膵臓細胞が外因性の成長因子および外因性のカスパーゼ抑制剤に接触される順番は、特に重要ではない。例えば、一実施形態では、細胞は外因性の成長因子に接触される前に外因性のカスパーゼ阻害剤に接触される。一実施形態では、細胞は外因性カスパーゼ抑制剤に接触する前に外因性の成長因子に接触される。さらに別の実施形態では、細胞は、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子に同時に接触される。
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
〔１．定義〕
単位、接頭語（Prefixes）、および記号はSysteme International de Unites (SI)に承認された形式で示される。数値域は、定義された範囲の数が含まれる。本明細書において提供される表題（heading）は、その全体が明細書に参照される本発明の多様な態様または実施形態に限定されない。従って、以下に挙げる定義された用語は、明細書の全体が参照されることでさらに定義される。本明細書において定義されない用語は、当業者により理解される通常の意味を有する。
【００２２】
本明細書において用いられる「生存培地」という用語は、アポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤、および細胞中の活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性の成長因子を含む生理学的に条件を満たした細胞培地を表す。生存培地として用いることができる典型的な細胞培地は、ＳＭ９５、Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｅａｇｌｅｓ ＭＥＭ、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０培地、もしくはこれらの任意の組み合わせ、または他の生理学的に条件を満たす培地（市販されていても、当業者に知られていてもよい）を含む。カスパーゼ抑制剤は、カスパーゼ抑制剤、または汎カスパーゼ抑制剤を選択してよい。典型的なカスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／Ａｐｏｐａｉｎ抑制剤を含む。典型的な成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ヘレグリン、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩを含む。
【００２３】
本明細書において用いられる「コントロール培地」は、膵臓内分泌細胞において、アポトーシスを減少させるのに十分な量の添加された外因性カスパーゼ抑制剤、または活性化された全長Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の外因性の成長因子を含まない生理学的な条件を満たす細胞培養培地を表す。
【００２４】
本明細書において用いられる「分化培地」は、ＦＢＳ、または活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量のＡｋｔ刺激剤ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩＧＦを含まない生理学的な条件を満たす細胞培養培地を表す。分化培地は、膵臓前駆細胞を成熟インスリン産生細胞に分化を誘導する他の成長因子、サイトカインおよび化学物質を含まない。典型的な分化因子は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、エクセンディン−４（exendin−4）、ニコチンアミド、ベータセルリン、およびＩＮＧＡＰを含む。
【００２５】
本明細書において用いられる「細胞増殖」という用語は、細胞の生育および細胞の分化により細胞数が増加する過程に用いられる。細胞増殖は、以下に示す本明細書に記載した方法で測定される（限定されないが、Ｋｉ−６７イムノブロッティング、ＤＮＡ含有量の分析、および細胞数の計測を含む）。本明細書に用いられるように、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の存在下の細胞増殖の程度が、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の非存在下での細胞増殖の程度よりも大きければ、細胞増殖は促進される。
【００２６】
本明細書において用いられるように「膵臓内分泌細胞」という用語は、（I）分化した膵臓内分泌細胞のマーカーを発現し、膵臓ホルモン（例えば、インスリンおよびグルカゴン）を産生する成熟膵臓内分泌細胞（例えば、インスリン産生凝集体）、ならびに（II）分化した膵臓細胞のマーカーを発現しておらず、膵臓ホルモンを産生しないが、膵臓ホルモン（例えば、インスリンおよびグルカゴン）を産生および分泌する成熟膵臓細胞へ分化する能力がある膵臓前駆細胞の両方を表す。
【００２７】
本明細書において用いられるように「接触する」という用語は、例えば以下のように言い換えることができる：結合する、添加する、混合する、通り抜ける、培養する、流れる、さらされるなど。
【００２８】
本明細書において用いられるように「外因性」という用語は、組織または細胞の外部に起源を有するが、個々の組織または生細胞において存在し作用する任意の因子または物質を表す。
【００２９】
「成長因子」という用語は、細胞分化の調節、細胞成熟、および／または細胞生存を調節するように機能する、組織から作製された任意の物質、組織から取り出された細胞によって作製された任意の物質、または研究室で作製された任意の物質を表す。
【００３０】
本明細書において用いられるように「カスパーゼ抑制剤」という用語は、カスパーゼ酵素の活性を抑制または減少できる、任意の化合物、分子またはタンパク質を表す。
【００３１】
本明細書において用いられるように「アポトーシス」という用語は、「プログラムされた細胞死」と言い換えることができ、細胞死に導かれる一連の遺伝的にプログラムされた現象を含む細胞死の種類を表す。
【００３２】
「活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の外因性の成長因子」という語句は、細胞のホモジネート（homogenate）のウエスタンブロット分析、または本明細書に記載したその他の方法により確認できるように、活性化Ａｋｔ量を検出可能なまで増加させるために十分な量の外因性成長因子の量を表す。
【００３３】
本明細書において用いられるように「アポトーシスを減少させるために十分な量の外因性のカスパーゼ抑制剤」という語句は、カスパーゼ活性を減少させるため、または外因性カスパーゼ抑制剤の未処理細胞に比べて処理細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な外因性のカスパーゼ抑制剤の量を表す。減少したカスパーゼ活性は、カスパーゼプロファイリング分析、もしくは本明細書に記載した他の方法、または当業者に知られたその他の好適な方法を用いて決定される。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰおよびプロピジウムヨウ化物染色、または本明細書に記載した他の方法、もしくは当業者に知られたその他の方法を用いて検出される。
【００３４】
本明細書において用いられるように「活性化Ａｋｔ」という用語は、野生型全長Ａｋｔタンパク質ファミリー構成員、それらの活性化断片、またはそれらの活性化変異体（Ａｋｔ活性を保っている融合タンパク質）を表す。Ａｋｔタンパク質ファミリーは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３を含む。野生型全長Ａｋｔタンパク質は、ＰＫＡおよびＰＫＣの両者と密接に関連する触媒ドメインを有するセリン／スレオニンキナーゼである。Ａｋｔという用語は、ＲＡＣタンパクキナーゼ（ＡおよびＣキナーゼに関連する）、およびＰＫＢ（プロテインキナーゼＢ）と言い換えられる。Ａｋｔファミリー構成員は、アミノ末端のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、およびカルボキシ末端のタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ触媒ドメインを特徴としている。
【００３５】
本明細書において用いられる「インスリン産生凝集体」という用語は、インスリンを産生および分泌する膵臓内分泌細胞、または膵臓内分泌細胞の集まりを表す。
【００３６】
本明細書において用いられる「分化する」または「分化」という用語は、細胞が未分化状態から分化状態、または未成熟状態から成熟状態へ進む過程を表す。例えば、分化していない膵臓細胞は、ＰＤＸ−１のような特徴的なマーカーを増殖および発現することができる。成熟または分化した膵臓細胞は増殖しないが、大量の膵臓内分泌ホルモンを分泌する（例えば、成熟β細胞はインスリンを大量に分泌する）。細胞の相互作用および成熟の変化は、未分化細胞の欠失するマーカーまたは分化した細胞の獲得するマーカーとして生じる。あるマーカーの欠失または獲得は、細胞が「成熟したか分化したか」を示すことができる。
【００３７】
本明細書において用いられる「分化因子」という用語は、成熟インスリン産生β細胞への分化を促進するために膵臓細胞に添加される化合物を表す。典型的な分化因子は、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エクセンディン−４、塩基性繊維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子−Ｉ、神経成長因子、上皮細胞成長因子、および血小板由来成長因子を含む。
【００３８】
本明細書において用いられる「細胞生存」という用語は、集団内で始原細胞の数と比べて、回収、分離、および無傷臓器に由来する細胞の初代培養のような処理の後に生存している細胞の数を表す。本明細書で用いられるように、仮に外因性カスパーゼ抑制剤および外因性成長因子の存在下における細胞生存の程度が、外因性カスパーゼ抑制剤および外因性成長因子の非存在下における細胞生存の程度と比べて増加していれば、細胞生存は促進される。
【００３９】
本明細書において用いられる「生理学的条件を満たす培養培地」という語句は、細胞の摂取および細胞の維持に必要な栄養素および栄養補助剤を含む、培養皿において細胞を覆う培養液を表す。
【００４０】
本明細書において用いられる「相乗効果」とは、膵臓前駆細胞の増殖および生存を促進する、外因性成長因子および外因性カスパーゼ抑制剤の複合効果を表す。相乗効果は、外因性のカスパーゼ抑制剤および外因性の成長因子の両者に接触された場合に、各要素を単独で接触させた場合の膵臓前駆細胞の生存および／または増殖と比べて、生存および／または増殖を増加することにより示される。相乗効果は、単独で使用した場合と同じまたは近い効果に達するために必要な外因性の成長因子および／または外因性のカスパーゼ抑制剤の量と比べた場合に、少ない量の外因性成長因子または外因性のカスパーゼ抑制剤が膵臓前駆細胞の生存および／または増殖を同じまたは近い増加に達するために要求されることでも示される。
【００４１】
〔２．序文〕
正常血糖の回復の手法としてのランゲルハンス島移植の出現は、糖尿病の治療において大きな画期的事件として表現される。しかし、ヒト臓器提供者は不足しており、臓器提供者の臓器に対する臓器移植者の数を増加するため、限られた数のランゲルハンス島調製物からインビトロでランゲルハンス島を増殖する方法の発展が重要であることを浮き彫りにする。従って、当業者は、培養中において内分泌細胞の増殖および拡張を促進することが糖移植が糖尿病治療のための実際的な手段となるために必要であることを認識する。
【００４２】
通常の方法論を用いる成人ヒト膵臓細胞の生体外での細胞培養の間、細胞の大部分の画分は非接触性である。これらの大部分の非接触細胞および多くの接着細胞は、技術的に通常の培養方法を用いると、アポトーシスのため失われる。多くのこれらの細胞（接着性および非接着性の両者）は、成熟内分泌細胞または内分泌前駆細胞の特徴を有する遺伝子を発現する。しかし、前記の細胞には、インビトロでのカスパーゼ抑制により回復させることができる細胞も存在する。これらの所見は、Ａｋｔ経路を含むカスパーゼ活性化の上流シグナル経路の関与の調査に本発明者らの注意を向けた。膵臓内分泌細胞に現されたようにＡｋｔ経路とカスパーゼ経路との間の有効な相互作用が発見されつつある。膵臓内分泌細胞の培養中にカスパーゼ活性を阻害すると、細胞内でアポトーシスの減少に寄与する全長Ａｋｔ量が細胞内で増加し、さらにアポトーシスが減少する。驚くべきことに、外因性のカスパーゼ抑制剤の添加に加えて、外因性の成長因子の特定の組み合わせを添加すると、培養膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する相乗効果を有することが発見された。
【００４３】
しかしながら、この驚くべき相乗効果は、膵臓内分泌細胞に特異的であることが明らかになった。外因性のカスパーゼ抑制剤と少なくとも１つの外因性Ａｋｔ活性化成長因子（すなわち生存培地）との組み合わせは、本明細書に記載した方法を用いて培養した肝細胞の増殖および生存に相乗効果を示さない。
【００４４】
また、本明細書に開示した方法を用いた成人ヒト膵臓細胞の生体外での培養は、従来の培養方法と比べて非接着性の細胞の数が減少することが明らかとなった。さらに、本明細書において教示された方法により培養された膵臓内分泌細胞は、通常の膵臓内分泌細胞の機能性を保っている。当業者に知られた標準的な方法と比較して本明細書において教示した方法を用いて培養した膵臓内分泌細胞の集団において膵臓の遺伝子発現（例えば、インスリン）の増加は、本明細書に記載した培養方法による膵臓内分泌細胞の増殖および生存を増加する直接的な効果である。従って、本明細書に記載した方法は、膵島細胞の移植をI型糖尿病の治療の実験的な代案および実行可能な代案とするため、限られた数の膵臓内分泌細胞を生体外に拡張するために用いられる。
【００４５】
〔３．膵臓内分泌細胞の分離〕
本発明の実践における第１の段階は、膵臓内分泌細胞を分離することである。当業者は、膵臓内分泌細胞を分離するために用いることができる多様な情報および方法を認識する。本明細書に記載した方法は、膵臓の提供者の年齢に依存しない。従って、胚から成人までの臓器提供者から分離された膵臓素材が使用できる。臓器入手および細胞の分離の典型的な手法は、実施例１に詳細に記載している。
【００４６】
〔３−Ａ．膵臓からの膵臓内分泌細胞の分離〕
一度膵臓が臓器提供者から採取されれば、通常、多様な方法を用いて個々の培養細胞または細胞の小集団を産じるために継代される。米国特許第５，８３０，７４１号明細書、および米国特許第５，７５３，４８５号明細書を参照のこと。前記の一方法では、採取した膵臓組織の洗浄、および酵素消化を必要とする。採取した組織の柔組織を膵臓細胞物質の小さな画分に引き離すために、結合している組織の消化に酵素処理が用いられる。採取された臓器の全体構造から膵臓細胞物質、基礎構造、および個々の膵臓細胞を分離するために、採取された組織は１以上の酵素で処理される。商業的供給者（シグマ−アルドリッチ、St.Lois、MO；ロシュ、インディアナポリス、ＩＮ）から容易に入手できるコラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、リベラーゼ（liberase）沈殿物、およびその他の酵素は、本明細書において開示した方法に使用できる。
【００４７】
しかし、培養のために一度引き離した膵臓組織は、さらなる分離をすることなく本発明の培養方法に直接使用することもできる。また、分離された原料物質は、１以上の所望の細胞集団を濃縮するためにさらに処理できる。臓器提供者に由来する採取された細胞混合物は、通常、異質である。従って、前記の細胞混合物は、α-細胞、β-細胞、δ-細胞、導管細胞、腺房細胞、任意の前駆細胞、および他の種類の膵臓細胞を含む。一実施形態では、分離された膵臓細胞物質は、密度勾配遠心分離により精製される。例えば、米国特許第５，７３９，０３３号明細書に開示された方法が使用できる。ＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）、またはＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）を含む多様な密度勾配培地が本発明に使用できる。前記の培地は商業的供給者（例えば、シグマアルドリッチ、St.Louis、MO）から容易に入手できる。
【００４８】
典型的な精製手順により、細胞物質が、多くの層または界面中に分離される。典型的には２つの界面が形成される。上部の界面は、ランゲルハンス島細胞が豊富であり、通常１０〜１００％のランゲルハンス島細胞を懸濁液中に含む。第２の界面は、通常、ランゲルハンス島、腺房細胞、および導管細胞を含有する混合した細胞の集合体である。沈殿は、濃度勾配の底に形成される。前記沈殿は、通常、主に（＞８０％）腺房細胞、いくらかの沈殿したランゲルハンス島細胞、およびいくらかの導管細胞を含む。
【００４９】
さらなる操作から選択された画分の細胞構成要素は、各分離によって変化し、さらなる継代に選択された濃度勾配画分の部分に依存する。例えば、ランゲルハンス島細胞の豊富な集合体は、少なくとも１０％〜１００％のランゲルハンス島細胞を含む分離された画分から得ることができる。当業者は、本明細書に記載した培養方法が、使用した精製濃度勾配に依存する第２界面、沈殿、または他の画分もしくは界面からの細胞の分離に使用できることを理解する。
【００５０】
〔４．細胞培養および膵臓内分泌細胞の培養およびそれらの子孫細胞〕
〔４−Ａ．一般的な細胞培養手順〕
一度膵臓細胞が分離されれば、膵臓細胞は「Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique 4th ed., John Wiley & Sons (2000)」に記載されているような一般的な細胞培養方法論を用いて培養される。通常、膵臓細胞は他の哺乳類細胞に好適な条件下で培養される（例えば、加湿培養機で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下）。膵臓細胞は、技術的に公知の多様な基質上で培養できる。前記基質としては、例えば、ホウケイ酸ガラスチューブ、ボトル、ディシュ、表面の変化しないクローニングリング、プラスチック組織培養ディシュ、チューブ、フラスコ、マルチ−ウェルプレート、増加させた生育表面領域（ＧＳＡ）を備える容器、ドプラ食道モニタ（ＥＤＭ）、ＧＳＡを増加させるための複合内部シートを有するフラスコ、フェンウォールバッグ（fenwal bags）、および他の従来公知の培養容器が挙げられる。細胞は、細胞の生育および分化を促進するための細胞外マトリクス構成要素で予めコートされた培養表面で生育させてもよい。前記構成要素は、例えば、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、エンゲルブレス−ホルム−スワームマトリックス（Engelberth-Holm-Swarm matrix）、および好ましくはコラーゲンＩＶまたはラミニンが挙げられる。本発明に好適に用いられるこれらの培養条件およびその他の培養条件は当業者に公知である。
【００５１】
膵臓細胞の培養において他の重要な要素は、回収された細胞の播種密度、または密集した状態となり新しい担体に移し変える際の細胞数である。播種密度は、培養膵臓細胞の生存可能性に影響を与える。特定の培養条件における適した播種密度は、異なる密度範囲での細胞の播種、ならびに細胞の生存および増殖率の観察により経験的に決定されてよい。ある播種密度は、ホルモンを産生し、培養液中に分泌する細胞に効果的であることが示された。通常、細胞の濃度は、１００ｍｍの培養皿あたり約１０２〜１０８個の細胞数の範囲に及ぶ（例えば、１００ｍｍ培養皿あたり１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８個の細胞数）。他の培養容器における細胞濃度は、相対的な担体の表面領域および／または培養ガス交換表面領域を計算することで調節されてよい（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｓｕｐｒａを参照のこと）。培養容器表面領域に対する細胞濃度は、培養表面領域あたりの適した培地容量を用いた培地容量に対する細胞濃度と相関していてもよい（０．２−０．５ｍｌ／ｃｍ２が静置培養の通常の範囲である）。
【００５２】
通常の細胞培養増殖技術が本発明の実施に好適である。簡潔に説明すると、Ｐ０細胞は、１００ｍｍプラスチック組織培養皿に１×１０６細胞の密度でまかれる。培地は、３日毎に交換し、前記細胞は、９０％以上の密度に達すると０．０５％トリプシン(トリプシン／ＥＤＴＡ、Invitrogen，Carsbad，CA)を用いてＰ１に継代培養される。分割比は、通常、１：３であるが、生存培地中で増やした細胞では１：６でもよい。Ｐ１培養物は、通常、約３〜５日で９０％の密度に到達する。この時点で、コントロール培地中で増やす細胞は１：３、生存培地中で増やす細胞は１：６の割合でＰ２に継代培養される。この後に続く全ての継代は、Ｐ１培養に記載したように行った。培養培地は、通常、３日毎、または培養液のｐＨが新しい培養液が必要であると示した場合に交換される。
【００５３】
〔４−Ｂ．細胞培養培地〕
本発明の膵臓細胞は多様な培養液中で培養されてよい。本明細書に記載したように、培地は特定の成分を含むか、または特定の成分を欠いている（例えば、分離および増殖手順の特定の処置に好ましい血清など）。例えば、膵臓から新しく分離された細胞は、細胞を分離手順から回復させるために高濃度の血清培地で維持してもよい。逆に、中期段階の細胞集団の選択および増殖には低血清培地が好ましい。従って、多くの培地の組成が本発明の実施に用いられてよい。本明細書において開示した培地の組成は典型例を示すためであり、培養液の決定的に重要でない成分は、本明細書に記載した分析を用いて細胞の集団の複製または分化の変化への効果を試験することで除外、代用、変更、または追加されてよい。例えば、「Stephanら Endocrinology 140:5841-54 (1999)」を参照のこと。
【００５４】
〔４−Ｂ−１．コントロール培地〕
培養液は通常基礎培地からなる。前記の基礎培地は、生理学的な条件を満たした培地であり、無機塩類、緩衝液、アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、ならびにある場合では、有機中間体および前駆体の形態でタンパク質、核酸、炭水化物、または脂質代謝を含む追加の栄養素を含む。通常、本発明に好適に用いられる基礎培地は、限定されないが、Ｆ１２、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥＭ （ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、ＣＭＲＬ １０６６、ＳＭ９５（組成は表１に示す）、１：１でＦｌ２とＤＭＥＭとを混合した培地、および当業者に知られた培地またはこれらの組み合わせを含んでよい。細胞の生育を補助するために、基礎培地は、通常、成長因子、他のタンパク質、ホルモン、および痕跡元素を補われる。これらの補助栄養物質は、細胞の生育、維持、および／または分化を促進し、他の培養液成分の不純物または毒素を補償し、基礎培地中に欠けている微量元素を提供する。多くの培地において、血清はこれらの補助栄養物質の源である。血清は、多様な哺乳類の供給源（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマなど、および成体、幼体、または胎仔）から補われてよい。「Freshney、supra」を参照のこと。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、通常、補助栄養物質として用いられる。血清の濃度は、培養液の総容量に対する血清の容量の割合として表され、通常、約０．１〜２５％（例えば、約０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５％）の範囲である。一実施形態では、血清の濃度は低いが完全に排除されず、定義済み（defined）、または半分定義(semi-defined)された補助栄養物質の混合物が基礎培地に添加される。一用途において、基礎培地は、血清の代わりに添加できる成長因子、ホルモン、および微量栄養素の定義済み（defined）、または半分定義(semi-defined)された混合物を補われる。前記のような定義された培地の調整物は本明細書に開示される；その他の培地は、当業者に知られているか、または商業的供給源から入手可能である（「Freshney、supra」を参照のこと）。
【００５５】
一般的に、本明細書に記載した培地に添加する補助成分は、同一の生物学的特性を有する天然または合成産物により交換されてよい。例えば、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾン、およびプロゲステロンは、同一の細胞内受容体（甲状腺受容体、グルココルチコイド受容体、およびプロゲステロン受容体）を活性化することが知られている天然ホルモンまたは合成ホルモンにより全て置換され得る。インスリンおよびＥＧＦは、通常、組換えＤＮＡ方法論により作製されたヒトタンパク質であるが、天然源から精製されたポリペプチド、他の生物種に由来するポリペプチド、またはインスリンおよびＥＧＦ受容体の他のアゴニストと置換されてよい。ＥｒｂＢ３受容体のリガンドであるヘレグリンは、ヘレグリン異性体ならびに他のＥｒｂＢ３アゴニスト（ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４、感覚ニューロン由来因子、運動ニューロン由来因子、ニューレスチン（neurestin）、ならびにＥｂｐ−１、ヘレグリンα、ヘレグリンβ、ヘレグリンγ、ニューレグリン（neuregulin）−１、およびニューレグリン−２(ＮＲＧ−Ｉ アルファ、ＮＲＧ−Ｉ ベータ、ＮＲＧ−２ アルファ、およびＮＲＧ−２ ベータ)により置換されてよい。
【００５６】
【表１】
【００５７】
〔４−Ｂ−２．生存培地〕
分離された膵臓細胞の培養は、膵臓内分泌細胞の生存および増殖を促進する選択培地において行われる。本明細書において、「生存培地」と記載する前記の選択培地は、膵臓内分泌ホルモンの分泌能力を保持している細胞、または膵臓内分泌ホルモンを大量に分泌する分化した細胞へ成熟する可能性を有する細胞の増殖および生存に有利に働く。一般的に生存培地は、繊維芽細胞および間葉細胞を犠牲にする内分泌細胞または内分泌細胞様細胞の増殖および生存に有利に働く。
【００５８】
本明細書で使用される生存培地は、生理学的な条件を満たした０．５〜１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％）（通常は５％）を含む培地からなる。生存培地は、培養細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤、および培養膵臓細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子をも含む。当業者は、任意の濃度または特定の補助栄養物質の必要性について単一製剤の濃度変化、ならびに細胞の増殖、生存、および培養細胞中での活性化Ａｋｔ量の効果を本明細書に開示した方法を用いて観察することにより経験的に決定してよいことを理解する。
【００５９】
生存培地に添加される外因性のカスパーゼ抑制剤は、汎カスパーゼ抑制剤またはカスパーゼ特異的抑制剤のどちらかであってよい。両者は商業的供給者から広く入手できる（例えば、MP Biomedicals、Solon、OH）。カスパーゼ抑制剤は、通常、約１μＭ〜約１００μＭの濃度で添加される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＭ）。本明細書において好適に用いられるカスパーゼ抑制剤の限定されない典型例は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、ＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／アポパイン抑制剤を含んでよい。
【００６０】
少なくとも１つの外因性成長因子は、培養細胞において活性化Ａｋｔ量を増加させるために十分な量を生存培地に添加される。通常、成長因子は、培地に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加される（例えば、培地中に１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｇ／ｍｌ）。本発明に好適に用いられる成長因子の限定されない典型例は、ＩＧＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦファミリーの構成員を含んでよい。ただし、特定のファミリーの全ての構成員が作用するわけではない。例えば、ＰＤＧＦファミリーの構成員であるＶＥＧＦは、本発明において作用しない。しかし、当業者は、活性化Ａｋｔ量を増加する成長因子は、本明細書に提供した分析を用いて容易に同定できることを認識する。
【００６１】
本発明によると、膵臓細胞は、分離に続いて生存培地に直接移されるか、または高濃度の血清培地から低濃度の血清培地へ移された後、生存培地へ移されてよい。膵臓内分泌細胞の培養の生存培地への移動は、繊維芽細胞および間葉細胞を犠牲にして膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する。生存培地中で培養された膵臓内分泌細胞の集団は、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ−１）の高い発現量を維持し、コントロール培地中で培養された細胞と比べて生存培地で継代した場合、細胞の増殖および生存の程度が増加することを示し続ける。生存培地中で増殖する細胞は、本明細書に記載したような分化培地での細胞培養により比較的少ない量の膵臓内分泌ホルモン（例えば、インスリン）を分泌する。成熟分化膵臓細胞は増殖の促進を示さない。そのため、コントロール培地での培養と比較して、分化培地において発現するインスリン量は、細胞の数の増加が直接反映される。膵臓内分泌細胞の分離、培養、および分化に関する詳細は実施例に記載する。
【００６２】
〔５．細胞の増殖と生存の測定法〕
細胞の増殖および細胞の生存を測定するための多様な方法が利用可能であり、当業者に知られている。膵臓内分泌細胞培養において細胞の増殖および生存を測定する好適な方法の限定されない典型例は、成体染色色素を用いた細胞数の測定、または自動細胞計数機、増殖マーカー（例えば、Ｋｉ−６７）を用いた免疫標識、およびトリプシン処理した細胞のＤＮＡ含有量の測定を含んでよい。これらの方法は、実施例２にさらに詳細に記載されている。本発明に好適に使用されるその他の方法は当業者に公知である。
【００６３】
一実施形態では、細胞の増殖および生存は、生体染色色素トリパンブルーを用いて測定される（例えば、図２Ａを参照のこと）。簡潔に説明すると、単一の膵臓細胞懸濁液は、９０％の密度に達した培養細胞から０．０５％のトリプシンを用いて作製される。トリプシン処理された細胞の希釈液は、生体染色色素トリパンブルーと結合される。生きている細胞は、生体色素を排除し、血球計測器を備えた顕微鏡下で数えられる。この手順は当業者に公知であり、Feshneyらにより報告されている。
【００６４】
他の実施形態では、トリプシン処理されたＤＮＡ含有物は、メーカーの使用説明書（Molecular Probes Inc., Eugene OR）に従って、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖試験を用いて測定される。ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖試験の基礎は、細胞の核酸に結合した場合強い蛍光を示す独自の蛍光色素ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲである。前記の試験は、単一の色素濃度を用いて、２００μｌ中に５０個以下〜少なくとも５０，０００個の範囲の細胞の直線検波を有する（例えば、図３Ｃを参照のこと）。
【００６５】
さらに、他の実施形態では、細胞増殖は、細胞増殖のマーカーＫｉ−６７（Neomarkers, Fremont, CA）に対する抗体で培養した膵臓細胞を免疫学的に標識することで評価される。例えば、図３ＡおよびＢを参照のこと。免疫標識は、当業者に公知の一般的な免疫手順に従って行われる。より詳細には実施例２の記載を参照のこと。
【００６６】
〔６．アポトーシスの検出方法と測定方法〕
本発明は、培養中におけるアポトーシスを減少させるためにカスパーゼ抑制剤を用いることで膵臓内分泌細胞の生存を促進する。当業者は、膵臓内分泌細胞培養中のアポトーシスの程度の観察が膵臓細胞培養においてアポトーシスを減少させるために十分な量のカスパーゼ抑制剤が存在する場合のアポトーシスの測定方法だと認識する。以下に記載する方法、および実施例３により詳細に記載した方法が、本発明に好適に使用できる、細胞培養中のアポトーシスの存在を検出するために用いられる方法の限定されない例である。本発明に好適に用いられるその他の方法も当業者に公知である。
【００６７】
一実施形態では、カスパーゼ３および７の存在および細胞死の範囲は、メーカーの使用説明書(Promega Inc., Madison, WI)に従って、ＡＰＯ−ＯＮＥ（登録商標）カスパーゼ試験（例えば、図１を参照のこと）を用いて測定される。
【００６８】
膵臓細胞培養においてアポトーシスを起こした早期の細胞および後期の細胞の検出は、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰおよびプロピジウムヨウ化物(US Biological,Swampscott,MA)を用いて検出することができる。アポトーシスを起こした早期の細胞において、アネキシン−Ｖ−ＥＧＦＰは、細胞の外膜のホスファチジルセリンに結合する（例えば、図２Ｂを参照のこと）。一方、アポトーシスを起こした後期の細胞は、プロピジウムヨウ化物を取り込み、保持する。アポトーシスを起こした早期の細胞および後期の細胞は、続いて蛍光顕微鏡を用いて定量できる。
【００６９】
〔７．増加した活性化全長Ａｋｔタンパク質量の測定法〕
Ａｋｔは、膵臓内分泌細胞における多様なインスリン媒介性の現象（細胞増殖および生存を含む）の重要な制御因子である。我々の培養において細胞の増殖を促進するために、Ａｋｔ活性を刺激することが知られている成長因子が用いられる。そのため、当業者は、活性化Ａｋｔ量が増加するために要求される成長因子の十分な量が存在する場合の指標として、Ａｋｔ活性の程度を観察することの重要性を認識する。
【００７０】
膵臓内分泌細胞における活性化Ａｋｔタンパク質量は、当業者に公知の多様な方法を用いて評価できる。活性化Ａｋｔ量を観察する好適な方法には、免疫細胞化学、またはタンパク質のゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングが含まれてよい。例えば、図４および実施例４の記載を参照のこと。活性化Ａｋｔ量を観察するための方法は、活性化Ａｋｔ量を定量する目的で濃度測定試験、または当業者に知られた他の好適な方法と組み合わせることができる。
【００７１】
〔８．インスリン産生凝集体の分化誘導〕
未成熟膵臓内分泌細胞は、ＰＤＸ−１のようなマーカーを増殖および発現する。一方、成熟膵臓細胞は、増殖せず、インスリンのような内分泌ホルモンを大量に分泌する。従って、生存培地における膵臓内分泌細胞の拡張に続いて、ランゲルハンス島移植に使用するために、未成熟膵臓内分泌細胞から成熟インスリン分泌細胞に分化することが必要である。技術的に公知の多様な方法および分化因子が、以下に記載したような成熟インスリン分泌細胞への膵臓内分泌細胞の分化を促進するために本発明に好適に使用される。
【００７２】
細胞の凝集を誘導することで、膵臓内分泌細胞の分化が誘導できる。細胞の凝集は多用な方法で誘導可能である。例えば、凝集および分化は、ならし培養皿で生育する細胞により誘導できる。例えば、一実施形態では、コラーゲンコートされたプレートは、膵臓内分泌細胞の凝集および分化を誘導するために用いられる。
【００７３】
また、凝集および分化は、細胞を密集した状態に増やすこと、または細胞を分化培地（ＤＭ）で処理することにより誘導できる。分化培地は、生理学的条件を満たしたＦＢＳを含まない培地、およびＰＤＧＦ−ＢＢまたはＩＧＦのようなＡｋｔ刺激因子を含まない培地である。しかしながら、分化培地は、Ａｋｔを刺激しないか、またはＡｋｔを活性化するために十分ではない濃度で存在する多様な他の成長因子および分化因子を含んでいる。分化因子の限定されない典型的な例として、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エクセンディン−４、ニコチンアミド、ベータセルリン、ＩＮＧＡＰ、ｂ−ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびＰＤＧＦを含んでよい。肝細胞成長因子は、培養および遺伝子導入動物において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Mashima, Hら Endocrinology, 137:3969-3976 (1996)」;「Garcia-Ocana, A.らJ. Biol. Chem. 275:1226-1232 (2000)」; および「Gahr, S.らJ. MoI. Endocrinol. 28:99-110 (2002)」を参照のこと。ケラチノサイト成長因子は、遺伝子導入動物において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Krakowski, M. L.,らAm. J. Path. 154:683-691 (1999)」および「Krakowski, M. L.,らJ. Endocrinol 162:167-175 (1999)」を参照のこと。エクセンディン−４は、培養中において膵臓細胞の分化に影響を与えることが示されてきた。例えば、「Doyle M. E.およびEgan J. M., Recent Prog. Horm. Res. 56:377-399 (2001) 」ならびに「Goke, R.,らJ. Biol. Chem. 268:19650- 19655 (1993) 」を参照のこと。塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は、マイクロカプセルに入れられた膵臓ランゲルハンス島においてインスリン分泌を増加することを示してきた。例えば、「Wang W.,らCell Transplant 10(4-5): 465- 471 (2001)」を参照のこと。ＩＧＦ−Ｉは、膵管細胞の分化に影響を与える。また、ＩＧＦ−Ｉ代償療法は、Ｉ型糖尿病の治療に用いられる。例えば、「Smith FE.,らProc. Natl Acad. Sd. USA. 15;88(14): 6152-6156 (1991)」、「Thrailkill KM.らDiabetes Technol. Ther. 2(1): 69-80 (2000)」を参照のこと。文献によると、ＮＧＦは膵臓ベータ細胞機能において重要な自動制御の役割を担っていることが示さされてきた。例えば、「Rosenbaum T.らDiabetes 50(8): 1755-1762 (2001)」、「Vidaltamayo R.らFASEB 16(8): 891-892 (2002)」、および「Pierucci D.らDiabetologia 44(10): 1281-1295 (2001)」を参照のこと。 ＥＧＦは、ランゲルハンス島の生育を促進し、インスリン分泌を刺激することが示されてきた。例えば、「Chatterjee AK.らHorm. Metab. Res. 18(12): 873-874 (1986) 」を参照のこと。本発明に公的に使用できるこれ以外の分化因子は当業者に公知である。
【００７４】
〔９．膵臓内分泌細胞の特徴およびその継代〕
当業者は、成熟膵臓内分泌細胞が存在かどうか決定するために、膵臓内分泌細胞およびその子孫細胞の分化段階を決定することは有用であると認識する。膵臓細胞の分化段階は、タンパク質およびｍＲＮＡマーカー（例えば、ＰＤＸ−１またはインスリン）の測定、ならびに機能試験（例えば、グルコース刺激に応じたインスリン分泌能力）を含む多様な方法で確認できる。例えば、図６および図８を参照のこと。
【００７５】
〔９−Ａ．表現型分析〕
どの時点で膵臓細胞が存在するかを知るためには、培養の特定の段階で膵臓内分泌細胞の表現型を分析することが有用である。特定のタンパク質の発現は、細胞の特性または分化状態と関連するため、細胞は、自身の特性または分化状態を評価するためにマーカー遺伝子またはタンパク質の発現を分析されてよい。例えば、新たに分離された膵臓組織において、細胞はアミラーゼの発現により外分泌腺房細胞として同定される。一方、細胞は、インスリンの発現によりランゲルハンス島内分泌細胞として同定される。同様に、分化早期の段階のランゲルハンス島細胞は、通常、サイトケラチンＣＫ−１９に陽性である。一方、成熟ランゲルハンス島細胞では、ＣＫ−１９の発現は低い。
【００７６】
表現型の特性は、細胞対細胞を基準として分析されてもよく、または細胞集団の平均として分析されてよい。分析法は、分析技術の特定の要求および方法論に依存する。従って、固定された切片、またはＦＡＣＳ解析により浮遊細胞で行われる免疫組織化学的手法によるマーカー発現の分析では、個々の細胞が発現する所定のマーカーの頻度および強度を測定する。他方、細胞の全集団のインスリン対アクチンのｍＲＮＡ発現比率の平均のような特性を測定することが望ましい場合もある。そのような場合、通常、前記の分析は、細胞プール（cell pool）からのｍＲＮＡの収集、およびインスリンおよびアクチンのｍＲＮＡの全存在量の測定により行われる（例えば、図６および図８Ｂを参照のこと）。多くの表現型特性は、細胞または細胞集団に基づいて分析され得る。例えば、インスリンの発現は、分泌顆粒におけるインスリンの存在を個々の細胞を染色することにより分析されてもよく、または細胞プールを溶解し、総インスリンタンパク質の分析をすることにより分析されてもよい。同様に、ｍＲＮＡ量は、細胞の溶解およびｍＲＮＡの収集によって細胞集団について測定されてよく、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって個々の細胞について測定されてよい。
【００７７】
前記したように、成熟した膵臓内分泌細胞は増殖しないため、成熟マーカー（例えば、インスリン）量の増加は、内分泌細胞集団の増殖および／または生存の増加を反映する成熟インスリン分泌細胞数の増加の指標となる。インスリン発現の相乗効果による成熟膵臓内分泌細胞の集団の増殖および生存は、生存培地に存在するカスパーゼ抑制剤およびＡｋｔ活性化成長因子の組み合わせ処理において観察される。この相乗効果は、図７において明確に示されている。図に示されているように、Ａｋｔを活性化する成長因子の単独での添加は、コントロール培地のみで生育した細胞と比べてインスリン／βアクチンｍＲＮＡ比率は増加しない。このことは、外因性の成長因子単独では、内分泌細胞集団の増殖および／または生存を増加するために十分ではないことを示唆する。しかし、コントロール培地へのカスパーゼ抑制剤（例えば、ＯＰＨ−１０９）の添加は、コントロール培地のみで増殖させた細胞に対してインスリン／βアクチンの比率を１０倍増加する。このことは、通常、コントロール培地中においてアポトーシスを起こすことを運命付けられた内分泌細胞が、カスパーゼ抑制剤の添加により救出され、生存することを示唆する。驚くべきことに、コントロール培地へのＡｋｔを活性化する成長因子およびカスパーゼ抑制剤の両者の添加（すなわち生存培地）は、コントロール培地のみよりもインスリン／βアクチンの割合を１６倍増加するという相乗効果を生じる。この相乗効果は、カスパーゼ抑制剤によりアポトーシスから救出された内分泌細胞集団の増殖によるものである。
【００７８】
〔９−Ａ−１．細胞分化マーカー〕
多様な内分泌細胞の集団および分化の異なる段階は、当業者に公知の多様な細胞マーカーの発現に基づき同定できる。分離および培養において、臓器提供者の膵臓内分泌細胞は、分化した膵臓内分泌細胞の多様な表現型および遺伝子型の兆候を示し始める。多様な細胞集団および分化の段階の表現型および遺伝子型の兆候は、培養過程間に調節（例えば、増加または減少の調節）される任意の前駆細胞において存在する膨大な数の分子マーカーを含む。
【００７９】
発生段階は、発生中の細胞における特定のマーカーの存在または非存在を同定することにより決定できる。ヒト内分泌細胞は、似たような法則で発生するため、多様なマーカーが、膵臓内分泌前駆細胞から成熟インスリン産生凝集体の表現型に移行する細胞の同定に使用できる。
【００８０】
本発明の方法によって増殖または分化を誘導された細胞でのマーカーの発現は、正常ヒト膵臓発生において発現するマーカーの順序に対して類似性を有する。目的のマーカーは、膵臓において一時的および組織特異的なパターンで発現する分子である（例えば、「Hollingsworth, Ann N Y Acad Sci 880:38-49 (1999)」を参照のこと）。これらの分子マーカーは、３種の一般的なカテゴリーに分けられる。前記のカテゴリーとは、転写因子、ｎｏｔｃｈ経路マーカー、および中間フィラメントマーカーである。転写因子の例は、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ−６．１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＨＥＳ−１を含む。ｎｏｔｃｈ経路マーカーは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１およびＲＢＰｊｋを含む。中間フィラメントマーカーの例は、ＣＫ１９およびネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）を含む。膵臓β細胞の前駆細胞のマーカーの例は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、およびＨｂ９を含む。成熟した膵臓β細胞のマーカーの例は、インスリン、ソマトスタチン、ｇｌｐ−９、およびグルカゴンを含む。
【００８１】
〔９−Ａ−２．膵臓細胞の表現型の評価の一般法〕
培養細胞または分離された細胞におけるタンパク質および核酸の発現を評価する方法は、一般的な技術である。また、前記方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら eds. 2001 supplement)」を参照のこと）、ならびに切片にされた材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、およびフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）において無傷細胞に到達できるマーカーのような免疫学的検定を含む（例えば、「Harlow およびLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)」を参照のこと）。内分泌細胞分化に対する組織化学的な従来マーカーも採用されてよい。免疫組織化学または免疫蛍光分析により試験される細胞は、顕微鏡観察のためガラススライド上で培養されてよい。例えば、「Harlowおよび Lane, supra」を参照のこと。また、従来の組織培養皿中で生育する細胞は、手で培養液から移動され、切片にするためにパラフィンで包埋される。ＰＤＸ−１抗体は、「Leonard J.ら MoI. Endocrinol., 10:1275-1283 (1993)」の技術により作製できるか、またはIncstar,Inc.(Stillwater,MN)のような商業的供給者から購入できる。膵臓内分泌細胞の表現型の具体的な分析方法は、実施例５により詳細に記載する。
【００８２】
〔９−Ｂ．機能分析〕
本明細書に記載した方法による増殖および拡張したベータ細胞の重要な機能の１つは、グルコース量によって細胞自身のインスリン分泌を調整することである。通常、静的グルコース刺激（ＳＧＳ）分析は、異なるグルコース量に反応してインスリンを分泌可能か否かを同定するために、増殖している接着性の膵臓細胞に対して行うことができる。一般的に、細胞は密集度が限界近くになるまで好適な基質上で培養される。ＳＧＳ試験の１〜３日前に、培養液はインスリンを含まず、１ｇ／Ｌのグルコースを含む同じ性質の培地に交換される。前記の培地は毎日交換される。また、実施例６に記載したように、ＳＧＳ試験は４日目に行われる。
【００８３】
〔１０．カプセル化および移植〕
膵臓内分泌細胞のカプセル化は、カプセル中に細胞の凝集体を形成する。カプセル化は、膵臓細胞を糖尿病の患者に移植することを可能にする。さらに、対象動物の免疫反応を最小限にする。３次元環境中において膵臓前駆細胞のさらなる成熟をも可能にする。カプセル膜の気孔率は、カプセルから分泌する生体材料（例えば、インスリン）により選択できる。さらに、外来細胞を宿主動物の免疫系から保護する。
【００８４】
当業者に公知のカプセル化方法は、例えば以下の文献に開示されている：「van Schelfgaardeおよびde Vos, J. MoI. Med. 77:199-205 (1999)」、「Uludagら. Adv. Drug Del Rev. 42:29-64 (2000) 」 および米国特許第５，７６２，９５９号明細書、米国特許第５，５５０，１７８号明細書、および米国特許第５，５７８，３１４号明細書。カプセル化方法は、international application PCT/US02/41616にさらに詳細に記載されており、本明細書に引用して援用する。
【００８５】
哺乳類への埋め込みまたは移植、およびそれに続く内分泌細胞機能の観察は、通常、ランゲルハンス島移植に用いられる方法に従って実行されてよい。例えば、「Ryanら Diabetes 50:710-19 (2001)」、「Peckら Ann Med 33:186-92 (2001)」、「Shapiroら N Engl J Med 343(4):230-8 (2000)」、「Carlssonら Ups J Med Sd 105(2): 107-23 (2000)」、および「Kuhtreiber, WM, Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Birkhauser, Boston, 1999」を参照のこと。限定されない典型例として、埋め込む部位は、皮下、および大網袋（omental pouch）のような腹腔内を含む。
【００８６】
当業者は、所定の臓器移植者に応じてマイクロカプセルの好適な用量を決定することができる。また、前記の用量は臓器移植者のインスリン要求に依存する。マイクロカプセルから分泌するインスリンの量は、技術的に公知の多くの方法（例えば、免疫学的に、または生物学的活性量により）により決定される。移植者の体重も、前記用量を決定する際に考慮される。もし必要ならば、１以上の埋め込みが実行でき、カプセル化細胞への移植者の反応が観察される。従って、埋め込みへの反応は、カプセル化細胞の用量の指針として用いることができる(例えば、「Ryanら Diabetes 50:710-19 (2001)」を参照のこと)。
【００８７】
臓器移植者におけるカプセル化細胞の機能は、グルコースへの移植者の反応を観察することにより決定できる。カプセル化細胞の埋め込みは、血中グルコース量を制御できる。加えて、Ｃ−ペプチドまたは膵臓内分泌細胞ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン）量の増加は、移植されたカプセル化細胞機能の指標ともなる。
【００８８】
当業者は、血中グルコースの制御は、異なる方法で観察できることを認識する。例えば、体重およびインスリン要求性として血中グルコースは直接測定できる。経口的ブドウ糖負荷試験も実施できる。また、腎機能は他の代謝パラメータとして決定できる（「Soon-Shiong, Pら PNAS USA 90:5843-5847 (1993)」、「Soon-Shiong, Pら Lancet 343:950-951 (1994)」）。
【００８９】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、および他の出版物は、その全体を本明細書に引用して援用する。
【００９０】
〔実施例〕
以下の実施例は、具体例を提供する目的を含み、いかなる方法においても本発明を限定することが目的とは解釈されない。当業者により実施例に開示した技術（以下に示された技術）は、本発明の実験において発明者によりその機能が明らかとされ、従って、本発明の実施に好ましい形態で表現できる。しかし、当業者は、本発明の開示の観点から見て、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施例において同様の結果を得たまま、多くの変更ができる。
【００９１】
〔実施例１．膵臓内分泌細胞の培養〕
〔１−Ａ．臓器入手〕
膵臓細胞は、死体の膵臓から分離した。臓器の採取は、United Network for Organ Sharing（「UNOS」）および地方の臓器移植団体が取りまとめている。移植者の研究の同意書へのサインのみが使用される。
【００９２】
膵臓の採取のために、腹大動脈を腎動脈の結合部の下部に挿入し、門脈の灌流のために下腸間膜動脈を介してカニューレを挿入した。前記のカニューレを脾静脈（ＳＶ）が門脈（ＰＶ）に結合している上部の門脈に挿入した。緩い２−０結索部は、門脈の結合部でＳＶの周辺に配置し、他の緩い２−０結索部は脾動脈（ＳＡ）の周辺に配置した。ＳＶの結索部を脾臓側に連結し、灌流を開始する前に直ちに切開した。このことは、ランゲルハンス島に損傷を与える大動脈／門脈の二重終末圧を無くし、膵臓の灌流をより効率的にする。また、全ての門脈の灌流液を肝臓に流入させ、脾臓および膵臓から肝臓に入る灌流液の脱水を避けることも可能にする。続いて、網嚢を切開し、正常生理食塩水（ＮＳ）の流出を膵臓全体に観察した。１Ｌの大動脈灌流の後、ＳＡを連結した。膵臓は、肝臓および腎臓が採取された場合、より厳重に保護されるべきである。前記の膵臓を膵臓移植手術において公知で技術的に使用されている手段で取り出した。
【００９３】
前記の臓器を臓器保存のための冷却保存溶液である「ベルザー溶液（Belzer solution）」で満たされたプラスチックの袋に保存した。例えば、「UhlmannらJ Surg Res. 105(2)」: 173-80 (2002)」を参照のこと。ベルザーＵＷ溶液（Belzer UW solution）は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）(Barr Laboratories，Inc．，Pomona，NY)という名称でも商業的供給者から入手できる。
【００９４】
〔１−Ｂ．膵臓の消化〕
ランゲルハンス島は、酵素学的な膵臓の消化により分離した。リベラーゼ（Liberase）（１バイアル瓶、０．５ｇ、Roche）は、３３３ｍｌのＨＢＳＳ（１．５ｍｇ／ｍｌ、３７℃）に溶解し、腺管へのカニューレ挿入により膵臓に注入した。前記の臓器は、８００ｍｌの焼き戻しビーカーで、１０〜２０分の間３７℃で組織が溶け始めるまで培養した。
【００９５】
前記の半消化された組織の塊を金属の消化チャンバーに移し、自動環状消化(automaticcirculating digestion)を開始した。組織は消化チャンバーの攪拌により分離した。
【００９６】
大部分のランゲルハンス島が周辺の組織から離れた時点で消化薬を回収し、Ａ１０培地（ＲＰＭＩ中１０％ウシ胎仔血清）で希釈した。前記の消化手順を約３０分続けた。細胞をＡ１０培地で４℃、１，０００ｒｐｍ、２分間で３回洗浄し、続いて細胞を分離した。
【００９７】
〔１−Ｃ．膵臓細胞の分離〕
前節に記載した洗浄および遠心分離手順から得られた沈殿を３２０ｍｌの膵臓ランゲルハンス島精製溶液（「ＰＩＰＳ」）（１３．７％溶液のＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）ＡＧ（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）と混合した。前記のＮＹＣＯＤＥＮＺ（登録商標）は、合成名５−（Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピルアセトアミド）−２，４，６−トリ−ヨード−Ｎ，Ｎ’−ビス(２，３ジヒドロキシプロピル)イソフタルアミド）で、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）ベルザーＵＷ溶液（密度１．１１４）中で調整され、氷上で１０分間静置された遠心分離密度勾配溶液である。
【００９８】
８本の各２５０ｍｌの平底遠心チューブを７０ｍｌのＰＩＰＳで満たした（密度１．０９０）。４０ｍｌの細胞／ＰＩＰＳ懸濁液は、各チューブの下層に移動する。一方、６０ｍｌの２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０は、ＰＩＰＳの上層に移動する。前記のチューブを１，５００ｒｐｍで０５ＡＲＣロータを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３ＣＰｌｕｓを用いて継続的に６分間遠心した。
【００９９】
上層の界面（Ａ層、精製されたランゲルハンス島細胞）、下層の界面（Ｂ層、取り込まれたランゲルハンス島細胞、断片化したランゲルハンス島細胞、腺房細胞および導管細胞）および沈殿（主に腺房細胞および導管細胞）が分離して集められる。細胞は、Ａ１０培地でさらに２回洗浄され、所望のように用いられる。
【０１００】
〔１−Ｄ．膵臓細胞培養〕
膵臓細胞は、５％ＦＢＳを含む１０ｍｌ ＳＭ９５／ＲＰＭＩ１６４０（１：１の比率）（コントロール培地として指定）、または以下の補助栄養物質を含み５％のＦＢＳを含むＳＭ９５／ＲＰＭＩ１６４０（１：１の比率）培地のどちらかに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で１００ｍｍプラスチック組織培養皿（BD Biosciences, San Jose, CA）に撒かれる。前記の補助栄養物質は、外因性成長因子ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（７０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＩＧＦ−ＩＩ（５０ｎｇ／ｍｌ）（全てR&D Systems Inc.）、および外因性カスパーゼ抑制剤である非Ｏ−メチル化ＶＤ−ＯＰＨ（１００μＭ）（MP Biomedical, Solon, OH）（生存培地として指定）。培養液は３日毎に交換した。細胞が９０％の密集度に到達すれば、０．０５％トリプシン（トリプシン／ＥＤＴＡ、Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてＰ１に継代した。前記の細胞の分離比率は、コントロール培地においては１：４、生存培地においては１：６である。Ｐ１培養は、約５日で９０％の密集度に到達した。この時点で分離比率１：３でＰ２に継代した。以降の全ての継代はＰ１培養に記載したように行った。
【０１０１】
〔実施例２．生存培地における膵臓前駆細胞の増殖〕
〔２−Ａ．トリパンブルーを用いた生細胞数の測定〕
生存培地で培養した膵臓前駆細胞の増殖および生存をコントロール培地での培養と比べて評価するために、培養過程の異なる段階の間で細胞数および増殖を評価した。９０％以上の密集度に達した前記の細胞から０．０５％トリプシンを用いて単一膵臓細胞懸濁液を作製した。細胞の生存を評価するためトリパンブルーを用いて、血球計数機により生存細胞数を数えた。その結果、生存培地で培養すると生存細胞の数がコントロール培地での培養に比べて増加した。
【０１０２】
〔２−Ｂ．細胞増殖マーカー（Ｋｉ−６７）に対する抗体を用いた免疫標識〕
生存培地において生育および拡大された膵臓内分泌細胞は、コントロール培地において生育および拡張した膵臓内分泌細胞よりも高い割合で増殖および生存する。このことを確認するために、細胞を４ウェルチャンバースライドで生育し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。細胞をブロック液（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／１％正常ヤギ血清）中で１時間培養した後、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸを用いて５分間透過化した。続いて細胞をブロッキング液で洗浄した。次に、モルモット抗ヒトＣ−ペプチド抗体（DAKO Inc.,Carpinteria, CA）またはウサギ抗Ｋｉ−６７抗体（Neomarkers, Fremont, CA）と１時間室温で培養した。細胞をそれぞれ１５分間ＰＢＳ／１％ トリトンＸ／１％ＢＳＡで３回洗浄し、二次抗体としてアレクサ４８８抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）と１時間培養した。次に、細胞を３回、各１５分間洗浄し、再び４％のパラホルムアルデヒドで固定した。次に、細胞をＰＢＳ／ＲＮＡｓｅで５分間洗浄し、ＤＡＰＩ核染色（Vector Labs, Burlingame, CA）を含むベクターシールド（Vectashield）で包埋した。図３Ａは、前記のＫｉ−６７で免疫標識されたコントロール培地または生存培地のどちらかで生育した膵臓細胞を示す。この結果は、生存培地で生育した細胞では、コントロール培地中で生育した細胞と比較して細胞のＫｉ−６７標識が約５倍増加することを示す（図３Ｂを参照のこと）。
【０１０３】
〔２−Ｃ．細胞増殖の指標としてのＤＮＡ含有量〕
Ｋｉ−６７標識により示された細胞数の増加は、メーカーの使用説明書に従ってＣＹＱＵＡＮＴ細胞増殖試験（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR）を用いてトリプシン処理細胞数を測定することにより確認した。細胞は、ＣＹＱＵＡＮＴ ＧＲ色素を含有する緩衝液の添加により溶解した。蛍光マイクロプレートリーダーは、続いて試料の蛍光の直接測定に用いた。前記の分析は、単一色素濃度を用いて２００μｌの容量あたり５０〜５０，０００個の細胞範囲に及ぶ直線的検出範囲（linear detection range）を有する。対数期にない細胞は、高いＤＮＡ含有量を示し、コントロール培地での生育と比較して生存培地中で生育した場合では細胞数が約３０％増加する（図３Ｃを参照のこと）。
【０１０４】
〔実施例３．膵臓細胞および繊維芽細胞培養中のアポトーシスおよび活性化カスパーゼの検出〕
〔３−Ａ．膵臓細胞および繊維芽細胞におけるアポトーシス〕
アポトーシスの最初の兆候の１つは、原形質膜の内部から外葉への膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位である。一度ＰＳが細胞外環境にさらされると、その結合部位がアネキシンＶ（ＰＳに高親和性を有する、３５〜３６ｋＤａ、Ｃａ２＋依存性、リン脂質結合タンパク質）に利用可能となる。初期のアポトーシスを起こす細胞を検出するために、Ｐ０膵臓細胞、または正常ヒト繊維芽細胞を４−ウェルチャンバースライドに静置し、本明細書に記載された条件下で生育した。継代の前に、メーカーの使用説明書に従って前記の細胞をアネキシンＶ、アネキシンＶ−ＥＧＦＰの蛍光共役体と５分間、５００μｌの結合緩衝液中で培養した（U.S. Biological, Swampscott, MA）。アポトーシスを起こした細胞をそれぞれＦＩＴＣおよびローダミンの二重フィルターを用いて蛍光顕微鏡を利用して可視化し数を数えた。次に、アネキシンＶに陽性の染色された膵臓細胞と、染色されない正常環状繊維芽細胞とを比較した。我々は、アネキシンＶによる染色はＰ０膵臓細胞に特異的だと確認した。アネキシンＶの結合は、カルシウム依存的であり、コントロールとしてカルシウムのキレート剤である１μＭのＥＧＴＡ（Sigma,St Louis,MI）をＰ０膵臓培養へ添加すると染色が阻害されるためである。失われる細胞は、接着性および非接着性細胞集団のＰＤＸ−１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ、およびインスリンｍＲＮＡの特長により示されたようなベータ細胞および内分泌細胞と推定される細胞であった。加えて、１：１０００希釈での抗ヒトＣ−ペプチド(DAKO, Carpinteria, CA)およびアネキシンＶを用いた二重免疫蛍光染色は、多くのベータ細胞（抗ヒトＣ−ペプチド陽性）が、アネキシンＶ陽性であることを明らかにした（図２を参照のこと）。これらの結果は、インビトロでのヒト膵臓細胞の培養は、有用な内分泌系統細胞がアポトーシスを起こし減少すること示す。
【０１０５】
〔Ｂ．膵臓内分泌細胞および繊維芽細胞培養中のカスパーゼ活性化におけるカスパーゼ抑制剤の効果〕
アポトーシスの顕著な特徴の１つはカスパーゼの活性化である。カスパーゼ３および７はその下流に共通配列ＤＥＶＤを有する。培養におけるアポトーシスの程度を決定するため、我々は、メーカーの使用説明書に従ってＡｐｏ−ＯＮＥ分析システム（Promega）を用いた（図１）。細胞を９６ウェルプレートに移し、細胞溶解液をカスパーゼ活性を支持する緩衝液（Promega,Madison,WI）中で調製した。また、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍでＡｐｏ−ＯＮＥカスパーゼ３／７蛍光分析（Promega, Madison, WI）を用いて蛍光プレートリーダーで分析した。我々の分析により、アポトーシスおよびカスパーゼ活性の潜在的誘導剤であるスタウロスポリンで処理した繊維芽細胞培養量に相当する量の接着細胞由来のＰ０培養の内分泌細胞においてカスパーゼが活性化されたことが示された。広い範囲のカスパーゼ抑制剤であるＶＤ−ＯＰＨ−１９（MP Biomedicals, Solon, OH）を１μＭの濃度で添加するとカスパーゼの活性化が完全に消滅した（図１を参照のこと）。
【０１０６】
〔実施例４．ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを用いた活性化Ａｋｔ量の決定〕
Ａｋｔ量について我々の膵臓細胞培養条件の効果を評価するために、ウエスタンブロット分析により定常状態でのＡｋｔタンパク質量を測定した（図４Ａおよび４Ｂ）。培養３日後および１回の培地の交換後、ゲル電気泳動および免疫ブロット分析のため膵臓細胞培養に由来する接着性画分および非接着性画分の両者を採取した。陽性コントロールとしてスタウロスポリン（アポトーシスおよびカスパーゼ活性の潜在的誘導剤）で処理した細胞、または陰性コントロールとしてスタウロスポリン未処理の細胞のどちらかをコントロールとしてヒト初代繊維芽細胞を調べた。細胞単層および細胞懸濁液は、冷やしたＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ抑制剤のカクテル（Roche,Palo Alto）を含むＲＩＰＡ緩衝液中において４℃で溶解した。前記のＲＩＰＡ緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、および１ｍＭ ＮａＦを含む。不純物を除くために細胞溶解液を４℃で遠心した。タンパク質の濃度をメーカーの使用説明書に従ってＢＩＯＲＡＤタンパク質分析試薬（Biorad）を用いて各上清について決定した。等量の２×レムリ（Laemmli）ＳＤＳサンプル緩衝液を各試料に添加した。試料を加熱し、等量のタンパク質をゲルにのせた。前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いてＰＤＶＦ膜に転写した。前記のＰＤＶＦ膜を３％無脂肪粉ミルクを含むＰＢＳ中で室温で２時間ブロッキングし、ウエスタンブロット分析を行った。ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを前記のように行い、リン酸化特異的抗体で標識された膜の場合を除いて、ブロッキング緩衝液は３％ＢＳＡを含むＰＢＳとした。タンパク質のブロットを１：１００に希釈された抗体（抗Ａｋｔ抗体および抗リン酸化セリン４７３−Ａｋｔ抗体）(Cell Signaling, Beverly, MA)で標識した。コントロールとしてＧＡＰＤＨに対する抗体（Santa Cruz）を１：５００希釈で使用した。続いてブロットを１：１５，０００で希釈したＨＲＰ共役抗体（二次抗体）（Pierce）中で培養した。タンパク質の検出は、化学蛍光促進剤（ＥＣＬ）（Pierce）を用いて行った。非接触細胞において全長Ａｋｔの切断、および多くのタンパク質分解断片の存在を明らかにした抗Ａｋｔ抗体による免疫ブロット法分析は、接着性細胞画分では前記の切断および断片は少ないことも明らかにした。この現象は、スタウロスポリン（アポトーシスの潜在的誘導剤）で処理した初代繊維芽細胞においては観察されないが、Ａｋｔ不活性化の新しい機構を表す。さらに、接着性細胞においてもＡｋｔが切断されることは、前記の細胞がアポトーシスを運命付けられていることを示す。このことは、多くの接着性の細胞がアネキシンＶに陽性に染色された先の知見と一致する。Ａｋｔ活性化成長因子の添加は、細胞の定常状態のＡｋｔ量を上昇させ（図４Ｃ）、細胞の生存とＡｋｔタンパク質の増加との間の相関関係を証明するものである。
【０１０７】
抗リン酸化セリン−４７３抗体を用いた免疫ブロット法は、全長Ａｋｔがリン酸化されており、おそらく接着性の膵臓細胞において活性であることを明らかにした（図４Ｂ）。リン酸化された断片は、非接着性細胞において顕著であり、接着性細胞集団においては少量であった。培地へのＰＤＧＦ−ＢＢの添加（R &D Systems, Minneapolis, MN）（５０ｎｇ／ｍｌ）は、全長リン酸化Ａｋｔの増加を生じる（図４を参照のこと）。これらの結果は、Ａｋｔの脱リン酸化は、Ａｋｔのカスパーゼ不活性化を必要としないことを示し、その上、リン酸化され活性化したＡｋｔ断片はアポトーシスの間に機能可能であることを示している。
【０１０８】
〔実施例５．生存培地において処理および拡張された細胞の表現型分析〕
〔５−Ａ．免疫蛍光法〕
膵臓細胞の増殖における生存培地の効果を測定するために、増殖細胞のマーカーであるＫｉ−６７の発現を調べた（図３）。免疫蛍光法のため、細胞は４ウェルチャンバースライドで生育し、対数期の細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。細胞は、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／１％の正常ヤギ血清）で１時間培養した。続いて、ＰＢＳ／０．２％トリトンＸで５分間透過化した。次に、洗浄し、モルモット抗ヒトＣ−ペプチド抗体（ポリクローナル抗体）（ＤＡＫＯ）、または１：５００に希釈したＫｉ６７に対する抗体（Neomarkers, Fremont, CA）と１時間培養した。細胞をＰＢＳ／１％トリトンＸ／１％ＢＳＡで３回各１５分洗浄し、アレクサ４８８共役抗体（１：２００）（二次抗体）（Molecular Probes, Carlsbad, CA）と１時間培養した。次に、細胞を１５分間洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで再び固定した。５分間のＰＢＳ／ＲＮＡｓｅでの洗浄後、細胞を核染色ＤＡＰＩを含むベクターシールドを用いて封入した（Vector Labs, Burlingame, CA）。その結果、Ｋｉ６７陽性細胞は劇的な増加を示し、生存培地において拡張された細胞の増殖率をさらに増大する。従って、生存培地の使用は、内分泌細胞系統集団の迅速な拡張により、少ない臓器提供者から培養を開始する細胞集団を最大化する方法を示す。
【０１０９】
〔５−Ｂ．免疫組織化学〕
内分泌細胞系統集団における生存培地の効果をさらに測定するために、これらの細胞において発現しているインスリンおよびＰＤＸタンパク質の量を測定した（図５）。膵臓細胞は、ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、Ｂｏｕｉｎ ｆｌｕｉｄで１時間固定し、等級アルコールにおいて脱水し、パラフィン包埋した。４μｍの薄さのパラフィン切片を切断し、ガラスプレート上に静置した。スライドは、通常の組織学的方法を用いて処理し、続いて外因性のぺロキシダーゼ活性を止めるために０．３％Ｈ２Ｏ２中で培養した。全てのスライドを１０％の好適な種の正常血清を用いてブロックした。一次抗体は以下に挙げる希釈倍率で、組織に室温で６０分間反応させた。用いた抗体は、モルモット抗Ｃ−ペプチド抗体（1 :2000; DAKO, Carpinteria, CA）、ウサギ抗ＰＤＸ−１（1 :1000; Incstar, Stillwater, MN）である（図５）。抗体の結合の特異性は、類似した正常血清または非特異的ＩｇＧで希釈した一次抗体を置換することで調節した。続いて、スライドは、メーカーの使用説明書に従って好適なビオチン化された二次抗体と培養した(Vector Lab, Burlingame, CA)。抗体は、ＡＢＣ／ＤＡＢキット（ＤＡＫＯ）を用いて可視化した。また、組織切片はヘマトキシリンで対比染色した。その結果、生存培地で拡充した細胞集団では、より多くの細胞がＣ−ペプチドおよびＰＤＸ−１に陽性に染色された。これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光染色により示したように、より多くの内分泌細胞が生存培地で処理した細胞に存在するという我々の最初の発見を裏付けるものである。
【０１１０】
〔５−Ｃ．リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ〕
内分泌系統細胞における生存培地の効果を測定するために、我々は、例えば図６に示したように定量的ＲＴ−ＰＣＲにより拡充した内分泌細胞の遺伝子発現を調べた。細胞のＲＮＡは、Nucleospin RNA IIキット(BD Biosciences, Inc.)を用いて細胞から分離した。逆転写は、５μｇの全ＲＮＡ ＭＭＬＶ逆転写酵素（Invitorogen）を用い、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Sigma, St. Louis, MO）、２５ｎｇ／μｌのオリゴ（ｄｔ）１２−１８プライマー（Sigma）、ＲＮａｓｅ抑制剤（Sigma）および１×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ緩衝液（Invitrogen）を用いて行った。前記の混合物を６５℃で５分間加熱した。その後、逆転写酵素を加え、６０分間、３７℃で培養した。反応を終了し、リアルタイム定量ＰＣＲを５倍希釈したｃＤＮＡ０．５ｍｌの存在下で、Light Cycler machines１．０および２．０（Roche）を用いてメーカーの使用説明書に従って行った。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＤＸ−１、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ１、ＣＫ−１９、アミラーゼ、ＨＮＦ３ベータ、およびベータアクチンのプライマー配列を公表されたヒトｍＲＮＡ配列に基づいて設計した。ｍＲＮＡデータは、絶対的定量法を用いた予測に従って表されるか、コントロールに対する増加率として表される。異なる遺伝子の全ての発現量をベータアクチンに対して標準化した。生存培地で拡張した細胞での内分泌細胞および前駆細胞マーカーの遺伝子発現の増加は、内分泌細胞系統集団が保護され、拡張されることを示唆する（例えば、図６を参照のこと）。従って、膵臓内分泌細胞は、コントロール培地における増殖および生存に比べて生存培地において増殖および生存率が増加する。
【０１１１】
〔実施例６．生存培地において処理および拡充された細胞の機能分析〕
〔６−Ａ．細胞のマイクロカプセル封入〕
細胞の拡張において、最終的に分化したベータ細胞の機能を評価するために細胞を分化させる必要がある。細胞のアルギン酸塩マイクロカプセルへの封入は、分化の典型例を提供する。ここで、マイクロカプセル化された単細胞は凝集し、ＤＭ（分化培地）の存在下で最終的に分化する。採取した細胞は、１．６％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム溶液に浮遊した状態で、以下に記載された空気ジェットを用いてアルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）−アルギン酸塩マイクロカプセルにカプセル化した（Soon-Shiongら Transplantation 54:769-74, (1992)）。細胞の凝集を促進するために、初期のカプセル内でゲル化したアルギン酸塩の中心部は、５５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２ ２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中でカプセルを培養することで液化する。前記のカプセル化した細胞凝集体は、ＳＭ９５培地を含む組織培養フラスコ中に静置した。細胞を回復させた後、培地をＤＭに交換した（分化培地）。その後、一週間に二度完全な培地交換を行った。培養１〜３週間後、カプセル化細胞凝集体を静的グルコース刺激に用いた（例えば、図８を参照のこと）。
【０１１２】
〔６−Ｂ．静的グルコース刺激（ＳＧＳ）分析〕
ベータ細胞の機能について生存培地の効果を調べるために、カプセル化した細胞（２００−２５０マイクロカプセル（mics））を５ｍｌの低グルコース（１００ｍｇ／ｄｌ）と一晩（３７℃、５％ＣＯ２）インスリン欠損培地で培養した。カプセル化細胞は、Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ溶液中で６０分間連続培養（３７℃、５％ＣＯ２）することにより機能性を試験した。前記のＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ溶液は、６０ｍｇ／ｄｌグルコース（低濃度１）、４５０ｍｇ／ｄｌグルコース（Sigma）（高濃度）、および６０ｍｇ／ｄｌグルコース（低濃度２）を含む。各段階の後、溶液を回収し、以降の試験のために保存した。最終段階の後、解剖用顕微鏡下でカプセルの数を数えた。各溶液のヒトＣ−ペプチド含有量は、超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡ（Mercodia, Uppsala, Sweden）を用いてメーカーの使用説明書に従って定量した。Ｃ−ペプチドの放出は、緩衝液１ｍｌあたりに凝集体として発現する（各培養段階の後に回収した）か、または低濃度グルコース（低濃度１）によって得られるインスリンの分泌により区別される高濃度グルコース溶液（高濃度）において得られるインスリンの分泌である相対的な刺激指数（ＳＩ）として発現する。前記の値は、カプセルあたりに同数の細胞を含むカプセル数に対して標準化した。図８Ａおよび８Ｂに示した結果は、より高い内分泌細胞遺伝子発現と同様に生存培地中で拡張された細胞においてグルコース刺激への高い反応性を示し、我々の内分泌系統細胞の濃縮の知見を支えるものである。加えて、前記の拡張は細胞の機能を失わない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、ヒト膵臓細胞培養においてカスパーゼが活性化されていることを示す。培養した膵臓細胞の細胞溶解液中でのカスパーゼ活性の量を測定することでアポトーシスの程度を決定するために、カスパーゼ３／７比色実験を行った。陰性および陽性コントロールとして、カスパーゼ活性を、カスパーゼ依存性のアポトーシスを誘導するために１ｎＭのスタウロスポリンで１２時間処理した培養ヒト繊維芽細胞、または無処理の培養ヒト繊維芽細胞において測定した。カスパーゼ阻害剤、非Ｏ−メチル化Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ（ＯＰＨ−１０９）は、濃度依存的にカスパーゼ抑制を示した。これらの値は独立した３つの実験の代表値である。
【図２】図２（２Ａおよび２Ｂ）は生存培地（Survival Medium）がヒト膵臓細胞をアポトーシスから救うことを示す。図２Ａは、トリパンブルー排除染色により決定された継代前の膵臓細胞の生存の定量的評価（総細胞数に対する生存細胞の割合）を示す。図２Ｂは、コントロール培地または生存培地中で生育したヒト膵臓細胞のＣ−ペプチドとアネキシンＶ−ＥＧＦＰとの共染色を示す。中央のパネルは、正常ウサギＩｇＧを用いた抗体染色の特異性を調べるためのコントロールを示す。
【図３】図３（Ａ−Ｃ）は、生存培地中で培養された膵臓細胞の増殖を表す。図３Ａは、ＤＡＰＩ（左列）でラベルされたヒト膵臓細胞、またはウサギ抗Ｋｉ６７抗体（右列）で免疫染色されたヒト膵臓細胞の密集度８０％の対数期培養を示す。細胞は、コントロール培地（上段パネル）または生存培地（中段パネル）のどちらかで生育した。正常ウサギＩｇＧを抗体染色の特異性を調べるためのコントロールとして用いた（下段パネル）。図３Ｂは、総ＤＡＰＩ陽性細胞の割合として表したＫｉ−６７陽性細胞の数の定量分析を示す。図３Ｃの細胞数は、細胞数を数えることで算出した細胞数、およびコントロール培地または生存培地のどちらかで増殖させた密集培養中のＤＮＡ含量を測定することで算出した細胞数である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、培養膵臓細胞から調製され（継代後３日）、抗Ａｋｔ抗体（図４Ａ）または抗ＡｋｔＳｅｒ４７３リン酸化特異的抗体（図４Ｂ）で標識された全細胞溶解液をイムノブロット分析したものを示す。未処理の繊維芽細胞（図Ａおよび図Ｂレーン１）、スタウロスポリンで処理された繊維芽細胞（図Ａおよび図Ｂレーン２）、並びに培養膵臓細胞の接着性画分（図Ａおよび図Ｂレーン３）、および非接着性（図Ａおよび図Ｂレーン４）画分の免疫ブロットを示す。１００ｎＭＰＤＧＦで処理した膵臓細胞培養のコントロール溶解物をコントロール（図Ｂレーン５）として示した。図４Ｃは、生存培地で処理した細胞の定常状態のＡｋｔ発現量を示す。コントロール培地または生存培地のどちらかにおいて生育した接着性細胞および非接着性細胞の全細胞溶解液を抗Ａｋｔ抗体で標識し、免疫ブロッティングを行った。
【図５】図５（Ａ−Ｆ）は、生存培地で処理した後、Ｃ−ペプチドおよびＰＤＸ−１で免疫標識した膵臓細胞を示す。図Ａ−Ｄは、コントロール培地（パネルＡおよびＤ）または生存培地（パネルＢおよびＥ）のどちらかで生育した細胞に由来する膵臓細胞凝集体のパラフィン包埋切片について行った免疫細胞化学の結果を示す。抗Ｃ−ペプチド抗体染色を上段のパネル、抗ＰＤＸ−１抗体染色を下段に示す。Ｃ−ペプチド（＋）細胞の割合（パネルＣ）およびＰＤＸ−１（＋）細胞の割合（パネルＦ）を示す。実験は３回行い、４つの独立した領域の平均を定量化した。
【図６】図６（Ａ−Ｄ）は、生存培地において生育した膵臓細胞は、内分泌細胞および前駆細胞のマーカーの発現が増加することを示す。コントロール培地（各パネルの左の棒グラフ）または生存培地（各パネルの右の棒グラフ）のどちらかにおいて３回継代され、維持されたヒト膵臓細胞のＲＮＡ溶解物について、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてインスリン、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＤＸ−１およびＨＮＦ３−βの発現を調べた。遺伝子の発現は、βアクチンｍＲＮＡに対する遺伝子の比率として示した。データは、コントロールと比べて生存培地において各遺伝子の比率が何倍も上昇することも表す。例えば、インスリンは、コントロール培地中で生育した細胞と比べて生存培地中で生育した細胞では２８倍増加した。同様に、コントロール培地で生育した細胞と比べて生存培地で生育した細胞ではＮｅｕｒｏＤは１５倍、ＰＤＸ−１は２７５倍増加し、ＨＮＦ３−βは８８倍増加した。
【図７】図７は、膵臓内分泌細胞培養中のインスリン遺伝子発現においてＡｋｔ活性化成長因子とカスパーゼ抑制剤との間の相乗効果を示す。このデータは、コントロール培地単独での細胞の生育から得られた比率の何倍もの増加を示すβアクチンｍＲＮＡで標準化したインスリンｍＲＮＡの比率であるこの結果は、Ａｋｔ活性化成長因子のコントロール培地への添加は、コントロール培地のみで生育した細胞に比べてインスリン遺伝子発現を増加する効果はないことを示す。このことは、成長因子は、内分泌細胞集団の増殖または生存を増加させないことを示す。しかし、カスパーゼ抑制剤（ＯＰＨ−１０９）を添加すると、コントロール培地のみで生育した細胞に比べてインスリン遺伝子発現が１０倍増加する。このことは、内分泌細胞集団においてアポトーシスが減少し、生存する細胞が増加したことを示す。驚くべきことに、コントロール培地におけるＡｋｔ活性化成長因子とカスパーゼ抑制剤との複合効果は、相乗的に働きコントロール培地のみで生育した細胞よりもインスリン遺伝子発現が１６倍増加する。この相乗効果は、成長因子またはカスパーゼ抑制剤のどちらか単独でコントロール培地に加えて生育した細胞と比べて、内分泌細胞集団の増殖および生存が増加することを示す。
【図８】図８（Ａ−Ｂ）は、コントロール培地または生存培地において生育し、分化因子で処理したカプセル化細胞の静的刺激および遺伝子発現分析を示す。図８Ａにおいて、６０ｍｇ／ｄｌのグルコースおよび４５０ｍｇ／ｄｌのグルコースを添加したクレブス溶液（Ｋｒｅｂｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中での連続培養によってカプセル化細胞の機能性を評価した。ヒトＣ−ペプチド含有量は、超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡを用いて定量した。Ｃ−ペプチド分泌は緩衝液（Ａ）の１ｍｌあたりの累積として表した。細胞は、カプセルから回収され、溶解、およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、βアクチンｍＲＮＡに対する遺伝子の比率として図８Ｂに示したように遺伝子発現を決定した。実験は３回行い、独立した２つの実験の平均を表した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤、および
（２）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔの量を増加するために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子、
に接触させることにより、膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する方法。
【請求項２】
上記膵臓内分泌細胞がインスリン産生凝集体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記カスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、およびＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／アポパイン抑制剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度は、約１μｍから約１００μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記カスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択された不可逆の汎カスパーゼ抑制剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記カスパーゼ抑制剤はＱ−ＶＤ−ＯＰＨである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記成長因子は、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘレグリン、およびＰＤＧＦ−ＢＢからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記成長因子はＰＤＧＦ−ＢＢ、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩからなる群の１以上の成長因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記各成長因子の培地中の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の（１）から（３）を含む、膵臓内分泌細胞の増殖および生存のための細胞培養培地組成物：
（１）膵臓内分泌細胞を含む培地；
（２）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤；
（３）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔの量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子。
【請求項１１】
上記膵臓内分泌細胞はインスリン産生凝集体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
生理学的に条件を満たした上記培地が、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、およびＳＭ９５からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
上記カスパーゼ抑制剤が、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、およびＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ／アポパイン抑制剤からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度が、約１μＭから１００μＭである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
上記カスパーゼ抑制剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択された不可逆の汎カスパーゼ抑制剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
上記カスパーゼ抑制剤がＱ−ＶＤ−ＯＰＨである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度は、約１μＭから約１００μＭである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
上記成長因子はＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘレグリン、およびＰＤＧＦ−ＢＢからなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
上記成長因子はＰＤＧＦ−ＢＢ、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩからなる群の１以上の成長因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
上記各成長因子の培地中の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１】
（１）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤、および
（２）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔの量を増加するために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子、
に接触させることにより、膵臓内分泌細胞の増殖および生存を促進する方法。
【請求項２】
上記膵臓内分泌細胞がインスリン産生凝集体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記カスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、およびＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ３２／アポパイン抑制剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度は、約１μｍから約１００μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記カスパーゼ抑制剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択された不可逆の汎カスパーゼ抑制剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記カスパーゼ抑制剤はＱ−ＶＤ−ＯＰＨである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記成長因子は、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘレグリン、およびＰＤＧＦ−ＢＢからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記成長因子はＰＤＧＦ−ＢＢ、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩからなる群の１以上の成長因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記各成長因子の培地中の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の（１）から（３）を含む、膵臓内分泌細胞の増殖および生存のための細胞培養培地組成物：
（１）膵臓内分泌細胞を含む培地；
（２）膵臓内分泌細胞においてアポトーシスを減少させるために十分な量の外因性カスパーゼ抑制剤；
（３）膵臓内分泌細胞において活性化Ａｋｔの量を増加させるために十分な量の少なくとも１つの外因性成長因子。
【請求項１１】
上記膵臓内分泌細胞はインスリン産生凝集体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
生理学的に条件を満たした上記培地が、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、およびＳＭ９５からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
上記カスパーゼ抑制剤が、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｂｏｃ−Ｄ−ＦＭＫ、ＢＡＣＭＫ、ＢＩ−９Ｂ１２、Ａｃ−ＬＤＥＳＤ−ＣＨＯ、およびＤＥＶＤ−ＣＨＯ ＣＰＰ／アポパイン抑制剤からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度が、約１μＭから１００μＭである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
上記カスパーゼ抑制剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択された不可逆の汎カスパーゼ抑制剤である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
上記カスパーゼ抑制剤がＱ−ＶＤ−ＯＰＨである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
上記カスパーゼ抑制剤の濃度は、約１μＭから約１００μＭである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
上記成長因子はＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘレグリン、およびＰＤＧＦ−ＢＢからなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
上記成長因子はＰＤＧＦ−ＢＢ、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩからなる群の１以上の成長因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
上記各成長因子の培地中の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２３４４９（Ｐ２００９−５２３４４９Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５１４３８（Ｐ２００８−５５１４３８）
【出願日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４７３０
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０８２１８７０７）リニューロン インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲｅＮｅｕｒｏｎ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８４７３０
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０８２１８７０７）リニューロン インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲｅＮｅｕｒｏｎ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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