自己免疫およびアレルギー疾患を処置するための非腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性リンパ球
【課題】自己免疫およびアレルギー疾患を処置するための非腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性リンパ球の提供。
【解決手段】標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、該自己抗原ペプチドがＩｇＥタンパク質からのペプチドまたはＣＤ４０Ｌタンパク質からのペプチドである、上記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。また、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子およびヒトＩｇＥまたはヒトＣＤ４０Ｌからの少なくとも１つの抗原ペプチドを含むキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の非天然抗原提示細胞。
【解決手段】標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、該自己抗原ペプチドがＩｇＥタンパク質からのペプチドまたはＣＤ４０Ｌタンパク質からのペプチドである、上記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。また、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子およびヒトＩｇＥまたはヒトＣＤ４０Ｌからの少なくとも１つの抗原ペプチドを含むキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の非天然抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫およびアレルギー疾患を処置するための非腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性リンパ球に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌およびウイルスに見いだされるような外来抗原に対する免疫応答は、感染を防御し、そして排除する。しかし異常な免疫応答はアレルギー疾患および自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。花粉、ホコリダニ、食物抗原およびハチの針のような外来の、時に無害な物質に対する免疫応答は、枯草熱、喘息および全身性アナフィフラキシーのようなアレルギー疾患を生じ得る。膵島抗原および軟骨抗原のような自己抗原に対する免疫応答は、それぞれ糖尿病および関節炎を導き得る。アレルギー疾患の顕著な特徴は、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化およびＢ細胞によるＩｇＥの高生産である一方、自己免疫疾患の目立った特徴は、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化および炎症性サイトカインの過剰生産である。現行の治療はアレルギーおよび自己免疫疾患の症状の処置に集中してきており、そして疾患の発症および進行を防止するものではない。
【０００３】
ＣＴＬは休止しているナイーブＣＤ８Ｔ細胞から派生し、そして主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子により提示される抗原性ペプチドを認識する。休止しているＣＤ８Ｔ細胞が専門的な抗原提示細胞により提示される抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体と遭遇する時、ＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そして武装した（ａｒｍｅｄ）ＣＴＬに分化する。標的細胞上のペプチド／ＭＨＣ複合体の認識で、抗原特異的ＣＴＬは致命的な打撃を与え、そしてウイルスに感染した標的細胞または腫瘍細胞のような抗原−発現細胞を溶解する。
【０００４】
インビボでのナイーブＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞と樹状細胞のような専門的なＡＰＣとの間の多くの受容体−リガンド相互作用により制御されている（非特許文献１）。ナイーブＴ細胞の活性化には２つのシグナルが必要であることは一般的に受け入れられている（非特許文献２）。シグナル１はそれぞれ、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用により誘導され（非特許文献３）、そしてＣＤ４／ＣＤ８共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のＭＨＣクラスＩＩ／Ｉ分子の非多型領域への結合により助けられている（非特許文献４）。シグナル２はシグナル１と定性的に異なり、そしてＡＰＣ上の相補的リガンドと相互作用するＴ細胞共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を介して、例えばＣＤ２８とＢ７との相互作用を通して送達される（非特許文献５；６）。シグナル１および２は相乗的に機能し、そして最終的にＴ細胞が増殖し、サイトカインを生産し、そしてエフェクター細胞に分化することを誘導する一連のシグナル発信反応を誘起する（非特許文献７；８）。しかしシグナル１と２との間の関係は未知である。
【０００５】
様々な分子が共刺激機能を有すると報告されたが、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用を介して送達される共刺激に特別な注目が集中した（非特許文献９）。ＣＤ２８は一本のＩｇ様ドメインを含む分子であり、そしてＴ細胞上にホモ二量体として構成的に発現される（非特許文献５）。ＣＤ２８分子はＡＰＣｓ上のＢ７−１またはＢ７−２分子のいずれかとの相互作用を通して、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２のような成長−促進サイトカインを生産する独特なシグナルを伝達し（非特許文献１０）、Ｂｃｌ−ＸＬのような生存因子（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ）の発現をアップレギュレートし（非特許文献１１）、そしてシグナル１単独により誘導されるアネルギーを防止する（非特許文献１２）すると考えられている。
【０００６】
Ｔ細胞の活性化に重要な役割を有する別の分子対は、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１である（非特許文献１３）。ＩＣＡＭ−１はＩｇ遺伝子スーパーファミリーに属し、そして５個のＩｇ Ｃ様ドメインを細胞外領域に有し；これは造血および非造血細胞の両方で発現する。Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−１に関する受容体はＬＦＡ−１（ＣＤ１１／ＣＤ１８）であり、これはｂ２インテグリンファミリーに属する（非特許文献１４）。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１との相互作用は、Ｔ細胞に対して有力な共刺激機能を有する（非特許文献１５）が、この機能が別のシグナル経路に反映しているのか、またはＴ細胞とＡＰＣとの接着の上昇に反映するのかについての意見は別れている（非特許文献１６：１７）。
【０００７】
Ｂ７およびＩＣＡＭ−１分子に加えて、ＣＤ７０（非特許文献１８）および熱安定性抗原（ＨＳＡ）（非特許文献１９）を含むＡＰＣ上の幾つかの他の分子は、それらとＴ細胞上のそれらの各リガンドとの相互作用を通して極めて有力な共刺激機能を発揮できる。これはＴ−ＡＰＣ相互作用が高度に複雑であり、そしてＴ細胞とＡＰＣｓ上の分子との相補的な組の間で多くの相互作用が関与していることを意味している。各組の分子の相互作用は異なる細胞性の出来事を誘導する特異的なシグナルを誘起する。異なるシグナルの組み合わせは、最適なＴ細胞の活性化に相乗的に作用し、そしてＴ細胞の最終的な運命を決定し得る。あるいは共刺激分子の機能は重複し、そして各組の共刺激分子により誘導されるシグナルは付加的かもしれない。各組の共刺激分子の必要性は、シグナル１の強さおよび特性により影響されるだろう。
【０００８】
これら２つの可能性を考慮して、ナイーブＴ細胞の刺激に最小の要件を理解することが重要である。ＣＤ２８−／−マウスを用いた実験では、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用が幾つかの状況では高度に重要であるが、他ではそうではないことを示す（非特許文献２０）。同様に１次反応のＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ相互作用への要件は、一定の知見ではない（非特許文献２１）。
【０００９】
ＣＤ８Ｔ細胞は、主にウイルスタンパク質および腫瘍細胞上に発現するタンパク質に由来する抗原性ペプチドを認識する。しかし最近、新しく合成されたタンパク質が抗原処理機構により優先的に処理されたことが報告された（非特許文献２２）。活性化で、免疫細胞は多数の新規タンパク質を合成する能力を獲得し、ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞が、非ＩｇＥ生産細胞および休止ＣＤ４Ｔ細胞とは異なる組のペプチド／ＭＨＣ複合体を提示することが可能である。ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に提示されるこれらペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８Ｔ細胞により認識されることができる。すなわちこれらのペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的なＣＴＬは、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置することができるだろう。しかし多数の免疫寛容メカニズムはインビボで自己抗原に向かうＣＤ８Ｔ細胞の活性化を防ぐことができた。
【００１０】
ＣＤ８リンパ球（ＣＴＬｓ）は感染細胞、腫瘍細胞および同種細胞の認識および排除の原因となる養子免疫の武器である。いったんプライミングすれば（ｐｒｉｍｅｄ）、ＣＴＬは広い種々の細胞上のそれらの標的抗原を認識しそして標的細胞を溶解し、かつ／またはサイトカイン様ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−ガンマを分泌することによりそれらの機能を果たすことができる。
【００１１】
抗原のＣＤ８＋ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）への提示は、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ−Ｉ）のコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）で起こるが、抗原のＣＤ４＋ＨＴＬ（ヘルパーＴリンパ球）への提示はＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテクストで起こる。
【００１２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の効率的誘導には、Ｔ細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわちＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子を発現する細胞と相互作用することが必要である。ＡＰＣは樹状細胞、マクロファージおよび活性化Ｂ細胞である。ほとんどすべての有核細胞はＭＨ
Ｃ−Ｉを発現するが、自然なＣＴＬも効率的なプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）には骨髄が誘導するＡＰＣによる抗原（Ａｇ）の提示を必要とする（非特許文献２３）。樹状細胞はＣＴＬ応答の高度に有力なインデューサーであり（非特許文献２４）、そしてＣＴＬのプライミングに関与する主要なＡＰＣであると考えられている。いったんプライミングすれば、ＣＴＬは広い種々の細胞上のそれらのコグネイトＡｇを認識し、そして標的細胞を溶解し、かつ／またはサイトカインを分泌することにより応答することができる。
【００１３】
骨髄−誘導ＡＰＣはＣＴＬ応答を効率的にプライムすることを必要とするが（非特許文献２５）、活性化されたＣＴＬは直ちに広い種々の細胞により提示されるＡｇを認識し、そして応答することができる。インビボでの腫瘍−またはウイルス−特異的ＣＴＬ免疫応答の誘導は、骨髄由来抗原−提示細胞に依存することが示された（非特許文献２６；２７）。一般に骨髄由来ＡＰＣはこれらの細胞に対する独特なメカニズムを通して、シャペロン分子に会合した可溶性抗原の状態で、または貪食作用によるいずれかで細胞性抗原を取り込むと受け入れられている。
【００１４】
細胞性抗原に対する応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により運ばれる援助に依存すると長い間示されて来た。細胞性抗原はＣＴＬおよびＨＴＬによる認識のために、同じＡＰＣ上に提示されなければならないことも示されて来た。この援助の性質は、ＣＴＬの拡大に必要なＩＬ−２の必要性と解釈されてきた。最近の研究では、この援助がＨＴＬによる樹状細胞の活性化から生じ、そしてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して媒介されることが示された（非特許文献２８）。
【００１５】
したがって細胞性抗原（腫瘍細胞または感染細胞に由来する）に対するＣＤ８媒介免疫応答の誘導に関する同様なシナリオは以下の通りである：樹状細胞が腫瘍または感染細胞に由来する抗原を獲得する。ＤＣ−抗原とＣＤ４細胞との相互作用は、ＤＣがＣＤ８細胞を活性化できるようにする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／２９１，３００号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）９：２７１−２９６
【非特許文献２】Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２７５−２８５
【非特許文献３】Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２８７−２９９
【非特許文献４】Ｍ．Ｃ．Ｍｉｃｅｌｉ ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｐａｒｎｅｓ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）５３：５９−１２２
【非特許文献５】Ｐ．Ｓ．Ｌｉｎｓｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１１：１９１−２１２
【非特許文献６】Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１４：２３３−２５８
【非特許文献７】Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）７：４４５−４８０
【非特許文献８】Ａ．Ｗｅｉｓｓ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２６３−２７４
【非特許文献９】Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：１０６５−１０６８
【非特許文献１０】Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９９４）１５：３２１−３３１）
【非特許文献１１】Ｂｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９５）３：８７−９８
【非特許文献１２】Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）９：３５１−３５７
【非特許文献１３】Ｖａｎ Ｓｅｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４４：４５７９−４５８６
【非特許文献１４】Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：３０１−３１４
【非特許文献１５】Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９０）１１４：１０９−１４３
【非特許文献１６】Ｄａｍｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：２３６８−２３７９
【非特許文献１７】Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９７）７：５４９−５５７
【非特許文献１８】Ｈｉｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：２６１２−２６２３
【非特許文献１９】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：４３７−４４５
【非特許文献２０】Ｓｈａｈｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），２６１：６０９−６１２
【非特許文献２１】Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５７：５３７５−５３８６
【非特許文献２２】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２０００）４０４：７７０−７７４
【非特許文献２３】Ｄａｌｙｏｔ−Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１２）：６７３１−６７３７
【非特許文献２４】Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）３９２：２４５−２５２）
【非特許文献２５】Ｐ．Ｊ．Ｆｉｎｋ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９７８）１４８：７５５−７６６
【非特許文献２６】Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３（１）：３１７−３２２
【非特許文献２７】Ｌａｂｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２（１）：１６８−１７５
【非特許文献２８】Ｓ．Ｒ．Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏ（２０００）６７（５）：６０７−６１４
【発明の概要】
【００１８】
ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞のような免疫細胞は、アレルギー疾患および自己免疫疾患の病因に中心的な役割を果たす。本発明はアレルギーおよび／または自己免疫疾患を引き起こす免疫細胞を排除または抑制するために、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を利用する。すなわち疾患の発症および進行は本発明の方法により防止され、または中断される。
【００１９】
本発明は１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープに対して特異的なＣＴＬの生産法を提供し、この方法は；
ａ）個体からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し；
ｂ）クラスＩ ＭＨＣ分子を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ’ｓ）にＴ細胞エピトープを添
加し；
ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗原を載せたＡＰＣ’ｓと、Ｔ細胞エピトープに特異的な前駆体ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に十分な時間培養し；
ｄ）活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に必要な成分の存在下で、カルチャー中の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させ；そして
ｅ）カルチャーからＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する、
ことを含んでなる。
【００２０】
また本発明は疾患を引き起こす標的細胞に特異的に細胞傷害性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を提供し、ここで標的細胞がその表面にＭＨＣクラスＩ分子と結合する１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープを有し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞は非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープに結合するＭＨＣクラスＩ分子との相互作用によりすでに選択的に活性化されている。
【００２１】
また本発明は疾患を引き起こす標的細胞により媒介される疾患の処置法を提供し、ここで標的細胞はその表面にＭＨＣクラスＩ分子と結合する１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープを有し、この方法はそのような処置が必要な患者に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含んでなり、ここでＣＤ８＋Ｔ細胞は非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープと結合するＭＨＣクラスＩ分子との相互作用によりすでに選択的に活性化されている。
【００２２】
本発明は人工的な抗原提示細胞を作成し、そして使用することにより、自己抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞の免疫寛容が破壊され、そしてＩｇＥまたはＣＤ４０Ｌタンパク質から同定された抗原性ペプチドに対して特異的なＣＴＬが生じたことを示す。ＣＤ４０Ｌに特異的なインビトロで生成したＣＴＬｓのＮＯＤマウスへの養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）は糖尿病の発症を劇的に遅らせ、そしてＩｇＥペプチドに特異的なＣＴＬｓはＩｇＥの生産を抑制し、そして喘息のマウスモデルにおいて肺の炎症を減少させた。上記の系はＣＤ４Ｔ細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞により引き起こされるヒトの疾患にも潜在的に応用できる。ＣＤ４Ｔ細胞により引き起こされる自己免疫疾患は糖尿病、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、多発性硬化症および乾癬である。一方、ＩｇＥにより媒介されるアレルギー疾患は、薬剤、毒およびピーナッツにより引き起こされる全身性アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーおよびアレルギー性喘息である。さらに免疫細胞上に発現する他の自己−抗原も、自己免疫疾患およびアレルギー疾患の処置において、インビボでのようにインビトロでもＣＴＬの生成に使用することができる。抗原性ペプチド、タンパク質または非腫瘍細胞で発現する非腫瘍抗原をコードするＲＮＡおよびＤＮＡも、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置または防止するためのワクチンを開発するために使用することができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
１つの態様において本発明は、個体を非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープで処置する方法を提供し、この方法は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０個の異なるペプチド−エピトープ分子を提示することができ、同時に各ペプチドは約６〜１２個のアミノ酸長であり、そして好ましくは約８〜１０個のアミノ酸長であり、そして約１０ｎＭ〜１００μＭの濃度範囲であり；
ｂ．該個体または適当な供与体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＣＧＭ、好ましくはＩＬ−２、またはＩＬ−２とＩＬ−７を組み合わせたようなサイトカインを含む培地に加え；
ｅ．該個体または適当な供与体から回収した非懸濁末梢血単球、あるいはＣＤ８−欠乏末梢血単球を、約１０〜５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合し；
ｆ．該末梢血単球懸濁液を、所望する末梢血単球を除き懸濁液中のすべての成分を殺菌するために必要な、約３，０００〜７，０００ラドの範囲、好ましくは５，０００ラドのような十分な線量のγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの該各ペプチドを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の接着末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．場合により適当なＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし、そして場合によりＣＴＬ純度、ステリリティ（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）およびエンドトキシン含量についてアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２４】
別の態様では、本発明は個体の処置法を提供し、この方法は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド−エピトープ分子、好ましくは約１０個のペプチドを提示することができ、同時に各ペプチドは８〜１０個のアミノ酸長であり；
ｂ．該個体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で約６〜７日間刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｅ．該個体から回収した末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合し；
ｆ．該ＣＤ８−欠乏末梢血単球懸濁液を、約５，０００ラドのγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１００ｎｇ／ｍｌの該エピトープを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．適当なＣＴＬ活性、純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２５】
本発明の別の態様は、限定するわけではないが慢性関節リウマチ、狼瘡、乾癬、自己免疫腎炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫甲状腺炎、クローン病、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および移植拒絶を含む自己免疫疾患、および／または限定するわけではないが食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息および蛇毒アレルギーを含むアレルギー疾患の個体を処置するための方法を提供し、この方法は；ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはそのような疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド−エピトープ分子、好ましくは約１０個のペプチドを提示
することができ、同時に各ペプチドは８〜１０個のアミノ酸長であり；
ｂ．該個体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で約６〜７日間刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｅ．該個体から回収した末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合し；
ｆ．該ＣＤ８−欠乏末梢血単球懸濁液を、約５，０００ラドのγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１００ｎｇ／ｍｌの該エピトープを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の該末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．適当なＣＴＬ活性、純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２６】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患の処置法であり、ここでｎｎＡＰＣは以下のペプチド、配列番号１５〜配列番号４９を提示する。
【００２７】
本発明の別の態様は、非−癌性疾患またはＨＬＡクラスＩ分子が通常関係する不十分な、または未熟な免疫応答を生じる疾患の状態を処置する方法であり、ここで処置は感染した、または形質転換した細胞を排除し、該排除はＣＴＬｓにより媒介されることが証明された。
【００２８】
本発明の別の態様は、非−癌性疾患またはＨＬＡクラスＩ分子が通常関係する不十分な、または未熟な免疫応答を生じる疾患の状態を処置する方法であり、ここでＣＴＬによる排除に感受性となることが示された感染した、または形質転換した細胞は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはそのような疾患または疾患状態と関係する約１５個までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０個のペプチドエピトープ分子を提示することができ、同時に各ペプチドは６〜１２個のアミノ酸長、好ましくは８〜１０個のアミノ酸長であり、そして約１０ｎＭ〜１００μＭの範囲の濃度であり；
ｂ．該個体または適当な供与体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＣＧＭ、好ましくはＩＬ−２、またはＩＬ−２とＩＬ−７を組み合わせたようなサイトカインを含む培地に加え；
ｅ．該個体または適当な供与体から回収した非懸濁末梢血単球、あるいはＣＤ８−欠乏末梢血単球を、約１０〜５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合し；
ｆ．該末梢血単球懸濁液を、所望する末梢血単球を除き懸濁液中のすべての成分を殺菌するために必要な、約３，０００〜７，０００ラド、好ましくは５，０００ラドのような十分な線量のγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの該各ペプチドを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．場合により適当なＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし、そして場合によりＣＴＬ純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる方法により処理される。
【００２９】
本発明は、発現のためにＤＮＡでトランスフェクトしたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞に由来する天然には存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ここでｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患に関係する最高１５個の異なるペプチド分子、好ましくはＤＮＡによりコードされる１０個のペプチド分子を同時に提示することができる。
【００３０】
本発明は、発現のためにヒト クラスＩ ＨＬＡ、結合および共−刺激分子のＤＮＡでトランスフェクトしたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞に由来する天然には存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ここでｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患に関係する最高１５個の異なるペプチド分子、好ましくはＤＮＡにより同時にコードされる１０個のペプチド分子を同時に提示することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、個体の処置を強化する種々の所望する機能と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば処置される疾患または疾患状態と関係するペプチドに加えて、ｎｎＡＰＣはリンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ−細胞共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のようなアクセサリー分子と関係するペプチドを提示して、細胞−細胞接着またはさらなる細胞活性化シグナルの伝達を強化することができる。
【００３２】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えばＩｇＥに関係または由来するペプチドはアレルゲンに関係または由来するペプチドと、またはさらにＣＤ４０Ｌペプチドと組み合わせて提示される。
【００３３】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する最高１０個の異なるペプチド分子を同時に提示することができる天然に存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造法を提供し、該方法は；
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の卵に由来する昆虫細胞系を調製し；あるいは昆虫細胞系を調製し、ここで該細胞は１２日間成長させ、所望する細胞を同定することができるペプチド、好ましくは四量体で選択し、そして次に所望の細胞をＯＫＴ３およびＩＬ−２で拡大し；
ｂ．該昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるために適する培地、好ましくはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（商標）のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地で成長させ；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成し、ここで該ｐＲｍＨａ−３プラスミドはメタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離したポリアデニレーションシグナルを持つアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含み；ｄ．該ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ＨＬＡヒトクラスＩ Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２，ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３に相補的なＤＮＡを挿入し、ここでＡ２．１はヒト クラスＩ ＤＮＡ配列と置換されることができ；
ｅ．該昆虫細胞をｐｈｓｈｎｅｏプラスミドでトランスフェクトし、そして該ｐＲｍＨａ−３プラスミドは相補的ＤＮＡを含み；
ｆ．該昆虫細胞をＣｕＳＯ４と接触させて、該昆虫細胞中にトランスフェクトした遺伝子の発現を誘導する、
工程を含んでなる。
【００３４】
樹状細胞およびマクロファージのような専門的な抗原提示細胞は、ＩｇＥペプチド（Ｄａｌｖｏｔ−Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）同上）またはＩｇＥ組換えタンパク質（Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）同上）を載せることができ、またはＩｇＥまたはＩｇＥ断片をコードするウイルスで形質導入することができる（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）２０４：２９−３７）。これらの修飾された専門的な抗原−提示細胞は、次にＩｇＥ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を活性化するために使用され、そしてＩｇＥ特異的ＣＴＬｓをインビトロで生産することができる。あるいは非専門的な抗原提示細胞を、多数の共刺激分子をコードする多数の遺伝子に加えてＩｇＥおよびＩｇＥの断片をコードする遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入することもできる。ＩｇＥ特異的ＣＴＬｓを生成するために、修飾された非専門的な抗原提示細胞をこのように使用してＩｇＥ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を刺激することができる。
【００３５】
本発明の昆虫細胞は昆虫を成長させるために適する培地（今後「昆虫成長培地」と呼ぶ）中で成長させる。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（商標）ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地、グレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地およびＴＣ−１００昆虫培地のような昆虫成長培地が多数の会社から市販されている。あるいは昆虫成長培地は当業者が調製できる。典型的には培地には無機塩（例えば塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム）、アミノ酸種々の炭水化物、および化学品（Ｉｍｏｇｅｎｅ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．（１９６４）１５６（１）：９１−１０４）のような昆虫の成長を促進および維持するために必要な成分を含む。あるいは培地はビタミン、ミネラルおよび昆虫の成分を助ける他の成分を含むこともできる。
【００３６】
以下は本明細書中で使用する略号および定義の一覧である。
【００３７】
略号
ＡＰＣ 抗原−提示細胞
ＣＤ８＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＦＡＳ ＣＤ９５としても知られるＴ細胞上のエピトープ
ＩＣＡＭ 細胞間接着分子
ＩＬ インターロイキン
ＬＦＡ リンパ球機能抗原
ＭＨＣ 主要組織適合複合体
ｎｎＡＰＣ 天然には存在しない抗原−提示細胞
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＰＢＳ リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＰＭＩ ローズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍ
ｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
ＲＷＪＰＲＩ Ｔｈｅ Ｒ．Ｗ．ジョンソン製薬調査研究所
Ｔ 標的
ＴＣＲ Ｔ細胞抗原受容体
【００３８】
以下は種々のエピトープについて本明細書で使用する略号の一覧である。個々のアミノ酸残基は当業者に容易知られ、そして使用されている１文字コードに従い同定される。
アミノ酸 略号
３−文字 １−文字
アラニン ａｌａ Ａ
バリン ｖａｌ Ｖ
ロイシン ｌｅｕ Ｌ
イソロイシン ｉｌｅ Ｉ
プロリン ｐｒｏ Ｐ
フェニルアラニン ｐｈｅ Ｆ
トリプトファン ｔｙｒ Ｗ
メチオニン ｍｅｔ Ｍ
グリシン ｇｌｙ Ｇ
セリン ｓｅｒ Ｓ
トレオニン ｔｈｒ Ｔ
システイン ｃｙｓ Ｃ
チロシン ｔｙｒ Ｙ
アスパラギン ａｓｎ Ｎ
グルタミン ｇｌｎ Ｑ
アスパラギン酸 ａｓｐ Ｄ
グルタミン酸 ｇｌｕ Ｅ
リシン ｌｙｓ Ｋ
アルギニン ａｒｇ Ｒ
ヒスチジン ｈｉｓ Ｈ
【００３９】
ペプチドエピトープ略号
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １１はＫＰＣＫＧＴＡＳＭ（配列番号１）のアミノ酸配列を称する。
【００４０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ２０９はＩＰＰＳＰＬＤＬＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を称する。
【００４１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３６６はＧＳＮＱＧＦＦＩＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を称する。
【００４２】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ２９はＦＰＮＰＶＴＶＴＷ（配列番号４）のアミノ酸配列を称する。
【００４３】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １０５はＨＳＳＣＤＰＮＡＦ（配列番号５）のアミノ酸配列を称する。
【００４４】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １１４はＨＳＴＩＱＬＹＣＦ（配列番号６）のアミノ酸配列）を称する。
【００４５】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３６３はＫＳＮＧＳＮＱＧＦ（配列番号７）のアミノ酸配列を称する。
【００４６】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３０７はＲＳＡＰＥＶＹＶＦ（配列番号８）のアミノ酸配列を称する。
【００４７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４４はＭＳＴＶＮＦＰＡＬ（配列番号９）のアミノ酸配列を称する。
【００４８】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４１１はＴＳＬＧＮＴＳＬＲ（配列番号１０）のアミノ酸配列を称する。
【００４９】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １６はＴＡＳＭＴＬＧＣＬ（配列番号１１）のアミノ酸配列を称する。
【００５０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １５９はＡＳＴＣＳＫＬＮＩ（配列番号１２）のアミノ酸配列を称する。
【００５１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １２５はＧＨＩＬＮＤＶＳＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を称する。
【００５２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １７はＬＰＡＳＭＫＩＦＭ（配列番号１５）のアミノ酸配列を称する。
【００５３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８６はＲＰＦＩＶＧＬＷＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列を称する。
【００５４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １１８はＤＰＱＩＡＡＨＶＶ（配列番号１７）のアミノ酸配列を称する。
【００５５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２０はＱＳＶＨＬＧＧＶＦ（配列番号１８）のアミノ酸配列を称する。
【００５６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ９はＳＰＲＳＶＡＴＧＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列を称する。
【００５７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９５はＫＰＳＩＧＳＥＲＩ（配列番号２０）のアミノ酸配列を称する。
【００５８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２５２はＦＳＳＦＧＬＬＫＬ（配列番号２１）のアミノ酸配列を称する。
【００５９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ７はＱＰＳＰＲＳＶＡＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を称する。
【００６０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８１はＥＰＳＳＱＲＰＦＩ（配列番号２３）のアミノ酸配列を称する。
【００６１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ７９はＬＳＬＬＮＣＥＥＭ（配列番号２４）のアミノ酸配列を称する。
【００６２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １５２はＶＭＬＥＮＧＫＱＬ（配列番号２５）のアミノ酸配列を称する。
【００６３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １４６はＴＭＫＳＮＬＶＭＬ（配列番号２６）のアミノ酸配列を称する。
【００６４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２３５はＳＶＦＶＮＶＴＥＡ（配列番号２７）の
アミノ酸配列を称する。
【００６５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３８はＧＳＶＬＦＡＶＹＬ（配列番号２８）のアミノ酸配列を称する。
【００６６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９はＡＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号２９）のアミノ酸配列を称する。
【００６７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２４はＦＭＹＬＬＴＶＦＬ（配列番号３０）のアミノ酸配列を称する。
【００６８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６７はＧＬＹＹＩＹＡＱＶ（配列番号３１）のアミノ酸配列を称する。
【００６９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２はＫＩＦＭＹＬＬＴＶ（配列番号３２）のアミノ酸配列を称する。
【００７０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３６はＭＩＧＳＡＬＦＡＶ（配列番号３３）のアミノ酸配列を称する。
【００７１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ５８はＮＬＨＥＤＦＶＦＭ（配列番号３４）のアミノ酸配列を称する。
【００７２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １７０はＹＩＹＡＱＶＴＦＣ（配列番号３５）のアミノ酸配列を称する。
【００７３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２６はＹＬＬＴＶＦＬＩＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を称する。
【００７４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２３１はＬＱＰＧＡＳＶＦＶ（配列番号３７）のアミノ酸配列を称する。
【００７５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ４５はＹＬＨＲＲＬＤＫＩ（配列番号３８）のアミノ酸配列を称する。
【００７６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １４７はＴＭＳＮＮＬＶＴＬ（配列番号３９）のアミノ酸配列を称する。
【００７７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２９はＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）のアミノ酸配列を称する。
【００７８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６０はＱＬＴＶＫＲＱＧＬ（配列番号４１）のアミノ酸配列を称する。
【００７９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３５はＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）のアミノ酸配列を称する。
【００８０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８５はＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）のアミノ酸配列を称する。
【００８１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９はＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）のアミノ酸配列を称する。
【００８２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １５３はＶＴＬＥＮＧＫＱＬ（配列番号４５）のアミノ酸配列を称する。
【００８３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １２６はＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を称する。
【００８４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２７はＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）のアミノ酸配列を称する。
【００８５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２０はＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）のアミノ酸配列を称する。
【００８６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６５はＲＱＧＬＹＹＴＩＹＡ（配列番号４９）のアミノ酸配列を称する。
【００８７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４７はＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）のアミノ酸配列を称する。
【００８８】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ９６はＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）のアミノ酸配列を称する。
【００８９】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １８５はＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）のアミノ酸配列を称する。
【００９０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３０９はＡＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５３）のアミノ酸配列を称する。
【００９１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８７６はＳＬＬＴＶＳＧＡＷＡ（配列番号５４）のアミノ酸配列を称する。
【００９２】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８３はＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶ（配列番号５５）のアミノ酸配列を称する。
【００９３】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８４はＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号５６）のアミノ酸配列を称する。
【００９４】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８７はＱＭＦＴＣＲＶＡＨＴ（配列番号５７）のアミノ酸配列を称する。
【００９５】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９０はＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）のアミノ酸配列を称する。
【００９６】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９５はＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）のアミノ酸配列を称する。
【００９７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９８はＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）のアミノ酸配列を称する。
【００９８】
用語および定義
本明細書で使用する用語「養子免疫療法」とは、疾患または疾患状態を処置するために供与体または自家Ｔリンパ球の投与を称し、ここで疾患または疾患状態はＨＬＡクラスＩ分子に通常関連する不十分または未熟な免疫応答をもたらす。養子免疫療法は、感染または形質転換した細胞の排除がＣＴＬｓより活性化されることが示された疾患または疾患状態の適切な処置である。例えば疾患または疾患状態には限定するわけではないが黒色腫、前立腺、胸部、結腸−直腸、胃、気管支および首、膵臓、頸部、卵巣、骨、白血病および肺ガンのような癌および／または腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス感染；およびマラリア；結核菌およびリステリア モノサイトゲネスのような細菌感染を含む。
【００９９】
本明細書で使用する用語「Ｂ７．１」とは、抗原−提示細胞に結合する共−刺激分子を称する。
【０１００】
本明細書で使用する用語「ＢＣＮＵ」は、１，３−ビス（２クロロエチル）−１−ニトロソウレアとしても知られているカルムスチンを称する。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「ＢＳＥ」は、ウシ海綿状脳症を称する。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「ＣＤ」は、クラスター オブ ディファレンシエーション（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、抗原エピトープおよび機能によりグループ分けされるＴリンパ球（元は）、Ｂリンパ球、単球、マクロファージおよび顆粒球を称する。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「ＤＴＩＣ」は、ダカルバジン、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドを称する。
【０１０４】
本明細書で使用する用語「エクスビボ」または「エクスビボ 治療」は、生物学的材料、典型的には細胞が患者から得られるか、または適当な供与体のような適当な代替的供給源から得られ、そして修飾されて修飾された細胞が、修飾された細胞により生成される治療的利益の長期送達または一定送達により改善される病理学的状態を処置するために使用できることを称する。処置には、患者または代替の供給源のいずれから得られた修飾された生物学的材料の患者への再導入を含む。エクスビボ治療の利益は、患者を処置からの望ましくない付帯的効果に暴露することなく患者に処置の利益を提供する能力である。例えばサイトカインは癌またはウイルス感染患者にしばしば投与されて、患者のＣＴＬｓの拡大を刺激する。しかしサイトカインは患者に流感様の症状の発症を引き起こすことが多い。エクスビボの手順では、患者の身体外でサイトカインを使用してＣＴＬｓの拡大を刺激し、そして患者にはサイトカインへの暴露および結果としてその副作用がない。あるいは適当な状況または条件下で、適当かつ個体が利益を引き出せる場合、個体を同時に低用量のα−インターフェロンで処置することもできる。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「ＨＥＰＥＳ」は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’２−エタンスルホン酸バッファーを称する。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「ＨＬＡ−Ａ２．１」は、約４５％のコーカサス人に見いだされるＨＬＡクラスＩ分子を称する。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「ＭＰＣ−１０」は磁気粒子濃縮器を称する。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「ＮＫ細胞」はナチュラルキラー細胞を称する。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「ＯＫＴ３」はＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体を称する。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「ＴＡＰ−１、２」は、抗原プロセッシング−１、２に関係するトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−１，２）を称する。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ細胞」は、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋を称する。
【０１１２】
本明細書で使用する用語「Ｃ−レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）」は卵巣癌に関連することが見いだされた配列のペプチドを称する。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む異なる種で記載された組織適合抗原系を包含することを意味する一般名称である。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「エピトープ」、「ペプチドエピトープ」、「抗原性ペプチド」および「免疫原性ペプチド」は、哺乳動物に細胞免疫応答を生じることができる抗原に由来するペプチドを称する。そのようなペプチドはペプチドで免疫感作した動物に由来する抗体に反応性となることができる。そのようなペプチドは約５〜２０個のアミノ酸長、好ましくは約８〜１５個のアミノ酸長、そして最も好ましくは約９〜１０個のアミノ酸長であることができる。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「同族体」は、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、そして本明細書に記載する本発明の機能的観点を示す本発明のポリペプチド配列と実質的に同一なアミノ酸残基の配列を有する任意のポリペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非−極性（疎水性）残基の別の残基との置換、アルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間のような１つの極性（親水性）残基の別の残基への置換、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのような塩基性残基の別の残基への置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸またはその他のような１つの酸性残基の置換を含む。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「保存的置換」には、非−誘導化残基の代わりに化学的に誘導化された残基の使用を含む。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「化学的誘導体」とは、官能性側基の反応により化学的に誘導化された１以上の残基を有する本ポリペプチドを称する。そのような誘導化分子の例は、例えば遊離のアミノ基が誘導化されてアミンヒドロクロライド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導化されて塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また化学的誘導体として含まれるのは、２０種の標準的アミノ酸の１以上の自然に存在するアミノ酸誘導体を含むタンパク質またはペプチドである。例えばプロリンを４−ヒドロキシプロリンに代えてもよく；リシンを５−ヒドロキシリシンに代えてもよく；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに代えてもよく；セリンをホモセリンに代えてもよく；そしてリシンをオルニチンに代えてもよい。本発明のタンパク質またはポ
リペプチドは必要な活性が維持される限り、１以上の付加および／または削除、またはコードされているポリペプチドの配列が本発明の核酸配列に対応するポリペプチドの配列に関する残基を有する任意のポリペプチドを含む。
【０１１８】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は、ウイルス感染対する防御の主な道筋である。ＣＤ８＋リンパ球はウイルスに感染した宿主細胞を特異的に認識し、そして殺す。理論的には癌を含む他の種類の疾患を克服するために免疫系を利用することが可能なはずである。しかしＣＴＬｓを特異的に活性化するために利用できたインビトロ／エクスビボの手順はほとんどない。本明細書で注目した重要なアレルギーおよび／または自己免疫抗原の同定、および以下に記載するＣＴＬｓの特異的インビトロ活性化法は今、アレルギーおよび／または自己免疫疾患の養子免疫療法の概念を試験できるようにする。
【０１１９】
すべての自然なＴ細胞には、免疫応答を誘導するための活性化に２つのシグナルを必要とする。ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬｓ）について、特異性を伝える第１シグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面に存在するクラスＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体に結合した抗原の免疫原性ペプチド断片（エピトープ）をＣＤ８＋リンパ球に提示することからなる。この複合体はシグナルを細胞内に連絡するＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識される。
【０１２０】
Ｔ細胞受容体への結合は必要であるが、Ｔ細胞活性化を誘導するには十分ではなく、そして通常は細胞の増殖またはサイトカイン分泌を導かない。完全な活性化には第２の共−刺激シグナル（１つまたは複数）が必要であり、これらのシグナルが活性化カスケードをさらに強化するために役立つ。抗原−提示細胞に関する共−刺激分子の中で、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１のような細胞接着分子（インテグリン）はＴ細胞上のＣＤ２８およびＬＦＡ−１にそれぞれ結合することによりこのプロセスを援助する。ＣＤ８＋細胞が適当な共刺激分子との相互作用の存在下で、ＭＨＣクラスＩ分子により結合された免疫原性ペプチド（エピトープ）を持つ抗原提示細胞と相互作用する時、ＣＤ８＋細胞は完全に細胞傷害性のＴ細胞になる。
【０１２１】
リンパ球が媒介する殺細胞には、ＣＤ８＋ＣＴＬが抗原を持つ標的（腫瘍）細胞に、Ｔ細胞活性化に関して上記のプロセスにより認識される手段により結合することから始まる一連の生物学的出来事が関与する。この相互作用はＡＰＣまたは標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合している抗原のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）への結合から始まる。リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ細胞−共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のようなアクセサリー分子は、細胞−細胞接着またはさらなる細胞活性化シグナルの伝達を強化する。
【０１２２】
細胞−細胞相互作用の後、ＣＴＬは標的細胞を可溶性の細胞溶解性メディエーター（Ｔ細胞中の細胞質顆粒に保存されたパーフォリンおよびグランザイム）およびＣＴＬ表面分子（ＦＡＳリガンド）の作用を通して殺す。細胞溶解的攻撃後、標的細胞はネクローシス（膜の穿孔および細胞小器官の破壊）またはアポトーシス（クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化および膜の泡状化）により死ぬ。
【０１２３】
リンパ球が媒介する細胞溶解のメカニズムを、図２にグラフ的に示す。図２のパネルＡでは、標的細胞に結合した後、パーフォリンおよびグランザイムを含む顆粒を細胞間間隙に放出するために、ＣＴＬ中の細胞質顆粒は急速に標的細胞に向けられる。これらのタンパク質溶解酵素は標的細胞の形質膜に孔を形成し、最終的に細胞のネクローシスを導く。パネルＢでは、標的細胞に結合した後、ＣＴＬ上のＦＡＳ発現レベルが上昇する。ＦＡＳと標的細胞上のＦＡＳ受容体との相互作用はアポトーシスを導く。ＣＰＰ３２のようなプロテアーゼおよび他のＩＬ−１ｂ−転換酵素（ＩＣＥ）に関する酵素がアポトーシスの誘
導に関係した。
【０１２４】
天然に存在する抗原−提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、自家腫瘍細胞をインビトロのＣＤ８＋活性化に使用することは可能である。しかしこのアプローチの後の活性化の効率は低い。これはナイーブＡＰＣのクラスＩ分子が腫瘍エピトープの外に多くの種類のペプチドエピトープを含むからである。ほとんどのペプチドは正常で無害な細胞タンパク質から派生し、腫瘍に対して実際に効果的である活性なナイーブＡＰＣｓの数を希釈する（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：６８２−６８６）。
【０１２５】
この問題に対するより直接的かつ効率的な取り組みは、特異的疾患（アレルギーおよび／または自己免疫疾患のような）を克服すること関連するエピトープだけでＣＤ８＋細胞を特異的に活性化することである。このために、人工抗原提示細胞を、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）細胞でＭＨＣクラスＩ分子を発現させることにより作成する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は免疫系を持たないので、ペプチドエピトープをクラスＩ分子に載せることに関与するＴＡＰ−１，２ペプチド輸送体が無い。その結果、クラスＩ分子は空の導管としてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞上に現れる。これらトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を、限定するわけではないが黒色腫特異的エピトープを含む癌または腫瘍に特異的なエピトープのようなクラスＩ分子に結合する外因性のペプチドとインキューベーションすることにより、幾つかのペプチドで各クラスＩ分子を占有することが可能である。これらショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣにおける１つのペプチドを含むクラスＩ分子の高密度発現により、抗原ペプチドに完全に特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞をインビトロで生成することが可能となる。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を調製するための方法および手順は、１９９６年６月２５日に発効された「ヒトクラスＩＭＨＣおよびβ２−ミクログロブリンを発現する昆虫細胞を使用した細胞傷害性Ｔ−細胞のインビトロ活性化（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ａｎｄ β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」という表題の米国特許第５，５２９，９２１号明細書、および１９９４年５月２４日に発効された「ＭＨＣクラスＩ抗原およびβ２−ミクログロブリンをコードする遺伝子を発現し、そして空の複合体を集成することができるショウジョウバエの細胞系および該細胞系の作成法（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｄ β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ
Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｅｍｐｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）」という表題の米国特許第５，３１４，８１３号明細書に教示されている。特に米国特許第５，５２９，９２１号明細書は、カラム２６、第５６行からカラム２８、第２２行に前駆体細胞のカルチャーを分離し、かつ／または濃縮する様々な方法を開示している。
【０１２６】
さらにこの特徴は種々のサイトカインを用いた免疫系のインビボ刺激の必要性を排除する。これによりサイトカインにより生じる副作用の先を行く処置をもたらす。あるいは適当な状況または条件下で、適切かつ個体が利益を導くことができる場合、個体は低用量のαインターフェロンを用いて同時に処置することができる。
【０１２７】
サイトカインを用いたインビボ刺激に関する必要性を排除することは、患者のケアの質の向上を提供する。サイトカインを患者に投与することを含む処置計画は、患者に悪心、吐き気および熱のような流感様の症状を生じることが多い。これらの副作用は一般に生命を脅かすものではないが、すでに衰弱した状態の患者に特に重篤な反応が起こると、生命
に危険な状態をもたら可能性がある。別の考察はそうでなければ有益な治療法の患者のアクセプタンスおよびコンプライアンスにそのような副作用が悪影響を及ぼすことである。サイトカインを用いたインビボ刺激の必要性を除去することにより患者の快適さを改善する治療計画をもたらし、そして患者が医師により従うようになる効果的な処置法を提供する。
【０１２８】
養子免疫療法のためのこの方法の用途は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスの２Ｃ系に由来するＡＰＣｓおよびＣＤ８＋細胞のようなトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を使用してマウスで証明された。この系では、精製したＣＤ８＋２Ｃ細胞が共−刺激分子Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１も持つＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるインビトロのペプチドに高度に反応性である。プライムしていない（ｕｎｐｒｉｍｅｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するための最少要件を決定するためのプローブとしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞をトランスフェクトした（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ．（１９９６）９３：１４７３６−１４７４１）。あるいは精製された２Ｃ細胞の代わりに反応体として分離していないマウスの脾臓細胞を使用する時、共−刺激分子の必要性は適用しない。この場合、脾臓群中のＣＤ８＋細胞が、活性化されたＢ細胞から「傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）」の共−刺激を受容する。この知見を利用して、ＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、正常なＤＢＡ／２マウス脾臓細胞に、リンホカインを加えることなくインビトロで相乗的なＰ８１５肥満細胞腫−特異的ペプチドに対する応答を誘導できることを示すことが可能であった。これらのＣＴＬｓをＰ８１５肥満細胞腫を持つＤＢＡ／２マウスに注射すると、急速な腫瘍の退行を導いた（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４：５５５−５６４）。
【０１２９】
細胞傷害性Ｔリンパ球をインビトロで生成するために、任意の天然の、または人工的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）系を使用することは、これらの系が生成できる抗原の特異性により限定される。
【０１３０】
以下のＡＰＣ系は１つのエピトープに対する抗原−特異的ＣＴＬｓを生成するために利用されてきた：
１．定めたペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）；
２．リンパ芽球に向けられ、そしてペプチドを適用した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）；３．天然のペプチドが酸で剥がされ、そして目的のペプチドが載せられたリンパ芽球状の細胞系（ＬＣＬ）；
４．空のクラスＩ分子を発現するように操作したショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞；およびヒトクラスＩおよび共−刺激分子でトランスフェクトしたマウス３Ｔ３細胞（Ｊ−Ｂ．Ｌａｔｏｕｃｈｅ ａｎｄ Ｍ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０００）１８：４０５−４０９）。
【０１３１】
樹状細胞（ＤＣｓ）は１次抗原細胞の提示におけるそれらの広い応用により、ヒトにおける１次抗原提示細胞系と考えられる。自己または外来タンパク質はＤＣ中でプロセッシングされる。生じたペプチドエピトープはＨＬＡ分子により提示され、そしてＤＣの表面に輸送される。しかしＤＣｓは４種の異なるペプチドに向けられたＣＴＬｓをインビトロで一定して生成しないことが分かった。これは４種の各ペプチドに対応する活性を有するＣＴＬｓを提供した。さらにペプチドを適用した時点でＤＣの表現型は、成熟または未成熟で結果に影響しないことも分かった。
【０１３２】
あるいはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞刺激は通常、最高１０種の異なるペプチドに向けられたＣＴＬｓを生じた。これは１０種の各ペプチドに対して活性
であるＣＴＬｓを提供する。
【０１３３】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞およびＤＣがＣＴＬ応答を誘導する能力は、ＤＣｓおよびトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞の比較するために、最初に１つのペプチドエピトープに対して各々について標準的な刺激プロトコールに従い評価した。未成熟ＤＣｓは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で１週間、自家単球を培養することにより生成した。成熟ＤＣｓは回収の２４時間前に培養基にＴＮＦαを加えることにより未成熟ＤＣｓから得た。ＤＣｓ（未成熟および成熟）は、ＣＤ８細胞およびペプチド−適用ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激について使用した手順に従い、回収し、ペプチドを適用し、そして精製したＣＤ８細胞と混合した。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は一般にＤＣよりもよい刺激物であることが分かった。さらに未成熟または成熟のいずれかの表現型を表すＤＣｓは、定めたペプチドをＡＰＣに適用するために使用した時、特異的なＣＴＬ応答の誘導においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的ではなかった。これは免疫系においてＤＣｓが果たす優性の役割から特に驚くべきである。
【０１３４】
細胞傷害性リンパ球の調製
抗−ＣＤ８抗体を用いた陽性選択により白血球除去血サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２．１）、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＢ７．２を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるペプチドに関係するＩｇＥおよび／またはＣＤ４０Ｌに対して刺激する。ＣＤ８＋細胞はＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下でペプチドエピトープを添加した自家単球で２回、再刺激する。ＣＴＬｓはＯＫＴ３およびＩＬ−２で非特異的に増大させる。ＣＴＬ活性は細胞に対して測定し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーで評価する。
【０１３５】
製造法およびプロトコールは、グッドラボラトリープラクティス（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）およびグッドマニファクチャリングプラクティス（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従い行う。「グッドラボラトリープラクティス」および「グッドマニファクチャリングプラクティス」は、研究および製造プラクティスの標準であり、これは米国食品医薬品局により設定され、そして当業者は容易に知っている。ＣＴＬｓは同一性、生存能、ＣＴＬ活性、ステリリティおよびエンドトキシン濃度について監視される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＩｇＥａ配列番号１４およびＩｇＥｂ配列番号５０定常領域のアミノ酸配列を、ベクターＮＴＩソフトウェアで並列配置した。２つの対立遺伝子間の配列の差異は太字または下線を付す。
【図２】パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ：ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＢＦ１／Ｊマウスのリンパ節（Ａ、ＢおよびＤ）、またはＢ６、インターフェロンγノックアウトマウス（ＩＦＮγ−／−）またはパーホリン（ＰＦ−／−）ノックアウトマウス（Ｃ）から精製した。精製したＣＤ８Ｔ細胞は、ＤｂＭＨＣクラスＩ、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）分子でトランスフェクトしたＳＣ２細胞により提示される、示したＩｇＥペプチドと培養した。低用量の組換えＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日目、そしてその後１日おきにカルチャーに加えた。９日目に、ＣＴＬ活性は示したＩｇＥペプチドを載せた、または載せていない５１Ｃｒ標識ＲＭＡＳ細胞に対して測定した。図２、パネルＤでは、抗−ＤｂｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）をＣＴＬアッセイの始めに加えた。
【図３】成体ＣＢＦ１／Ｊマウス（８〜１２週）は、１日および１４日目にそれぞれ水酸化アルミニウムで沈殿させた５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を腹腔内に免疫感作した。血清ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａは２８日目にＥＬＩＳＡにより測定した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。ＩｇＥ−特異的ＣＴＬまたは対照ＣＴＬ（５ｘ１０６）は各追加免疫から１日後に静脈内に与えた。血清ＩｇＧおよびＩｇＥは最後のＣＴＬ治療から２週間後に再度測定した。
【図４】パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ： ＣＢＦ１／Ｊマウスは図３のように免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、２つの異なる用量（５ｘ１０６および１０ｘ１０６）の抗−ＩｇＥ ＣＴＬを１日おき３日、静脈内に与えた。ＣＴＬ処置から３週間後、血清ＩｇＥおよびＯＶＡ−特異的ＩｇＥを測定し、そしてＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。最後の処置後、気管支胞肺洗浄液（ＢＡＬ）を集め、そしてＢＡＬ中の全細胞をカウントした。ＢＡＬ中のエオタキシンはＥＬＩＳＡにより測定し、そしてＢＡＬ中の好酸球細胞をＨＥ染色により区別した。
【図５】パネルＡおよびＢ： ＣＢＦ１／Ｊマウスは、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで１日および１４日目に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスは１日おきに３処置、ＰＢＳ、抗−ＩｇＥ ＣＴＬまたは対照ＣＴＬ（抗−インフルエンザＣＴＬ）の注射を受けた。最後の処置から３週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。ＯＶＡでの最後の処置から１日後、各マウスのメタコリンに対する気道応答性を全身プレトログラフィ（ｐｌｅｔｈｒｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。２回の独立した実験を、パネルＡおよびＢにそれぞれ示した。
【図６】パネルＡおよびＢ： 成体ＣＢＦ１／Ｊマウス（８〜１２週）は、１日および１４日目にそれぞれ水酸化アルミニウムで沈殿させた５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を腹腔内に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスにＩｇＥ−特異的ＣＴＬ（５ｘ１０６）またはＰＢＳを静脈内に与えた。最後の処理から３週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに２〜３処置、鼻内に追加免疫した。ＯＶＡでの最後の処置から１日後、各マウスからＢＡＬを調製し、そして各マウス由来の肺を固定し、そしてＨＥで染色した。ＰＢＳ（パネルＡ）を受容したマウスまたは抗−ＩｇＥＣＴＬ（パネルＢ）を受容したマウスに由来する肺組織の代表的ＨＥ染色を示した。
【図７】ヒトＩｇＥ定常領域をコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列。全ＲＮＡはヒトＩｇＥを生産するＵ２６６細胞系から調製した。全ＲＮＡを逆転写し、そして５’および３’ヒトＩｇＥ定常領域をそれぞれコードする２つのオリゴを用いてＰＣＲにより増幅した。ｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３ベクターにクローン化し、そして配列決定した。
【図８】ヒトＨＬＡ−Ａ２クラスＩｃＤＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を滴定濃度の示したペプチドまたは対照ペプチド（Ｈ６９０）と室温で一晩培養し、そしてさらに３７℃で２時間培養した。細胞を洗浄し、そして抗−ＨＬＡ−Ａ２ ｍＡｂで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。平均蛍光強度はＹ軸に示し、そしてペプチド濃度をＸ軸に示した。
【図９】パネルＡ，Ｂ、ＣおよびＤ： ＣＤ８Ｔ細胞は個々の供与体から精製し、そしてＨＬＡ−Ａ２、ｈＢ７−１、ｈＢ７−２、ｈＩＣＡＭ−１およびｈＬＦＡ−３分子でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と示したペプチドの存在下で培養した。６日間培養した後、低用量のｈＩＬ−２をカルチャーに加え、そしてペプチドを載せた自家接着細胞でさらに７日間、再刺激した。次いでＣＴＬを回収し、そして特異的な殺活性を示したペプチドを載せた５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞で標準的なクロム放出アッセイにより試験した。
【図１０】ヒトＩｇＥのアミノ酸配列は図６に記載するように誘導した。９個のアミノ酸を含む抗原性ペプチドには下線を付し、そして１０個のアミノ酸を含む抗原性ペプチドは太字で示す。
【図１１】ＴＡＰ２欠損ＲＭＡ．Ｓ細胞（右パネル）またはＬｄでトランスフェクトしたＲＭＡ．Ｓ細胞（左パネル）を、示した濃度のペプチドで２８℃にて一晩インキューベーションし、そして次いで３７℃で２〜４時間インキューベーションした。細胞を回収し、そしてＬｄ（右パネル）またはＤｂ（左パネル）に特異的なｍＡｂで染色し、そしてＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【図１２】ＣＤ８＋Ｔ細胞はＢ１０．Ｄ２マウスのＬＮから精製し、そしてＬｄ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＣＤ４０Ｌ．１８６ペプチド（左パネル）またはＱＬ９ペプチド（右パネル）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目に、ＣＴＬ活性を示したペプチドの存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡＳ．Ｌｄ標的細胞に対して測定した。
【図１３】Ｂ６マウスに由来する精製したＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｄｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を、ＩｇＥ．４４ペプチド（左パネル）またはＩｇＥ．３６６ペプチド（右パネル）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を３および５日目にカルチャーに加えた。ＣＴＬを７日目に回収し、そしてそれらの特異的活性を示したペプチドの存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。
【図１４】パネルＡおよびＢ： 精製したＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞は、プレートに結合した抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４０時間（上パネル）または示した時間（下パネル）活性化し、そして示したｍＡｂ．１で染色した。
【図１５】ＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬは図２に記載するように生成した。標的として使用したＣＤ４細胞は、野生型、ＣＤ４０Ｌ−／−またはμ２ｍ−／−マウスから精製し、そして抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４０時間活性化した。
【図１６】Ｂ１０．Ｄ２（上パネル）またはＢ６（下パネル）はＯＶＡ＋ＣＦＡで免疫感作し、そしてＡｂまたはＣＴＬで示したように処置した。脾臓細胞はＯＶＡ−生産Ｂ細胞についてＥＬＩＳＡスポットにより免疫感作から２１日後に測定した。
【図１７】パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ Ｂ１０．２マウスは、１日目にＯＶＡ＋ＣＦＡで免疫感作した。抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬまたは抗−ＣＤ４０Ｌ Ａｂは１、３、５日目に与えた。血清を１４日目に集め、そしてＯＶＡ特異的免疫グロブリンをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１８】パネルＡ、ＢおよびＣ： ＣＤ８Ｔ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスから精製し、そしてＤｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＩｇＥ．４４ペプチド（Ａ）、ＩｇＥ．３６６ペプチド（Ｂ）およびＩｇＥ／１２５（Ｃ）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目にＣＴＬを回収し、そしてそれらの特異的な殺活性を示したペプチドの存在下または不存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。
【図１９】Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、パーホリンノックアウトマウス（ｐｆ−／−）およびＩＦＮγノックアウトマウス（ＩＦＮγ−／−）から精製したＣＤ８Ｔ細胞は、Ｄｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＩｇＥ．４４ペプチドの存在下で培養した。ＩＬ−２０（２０単位／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目にＣＴＬを試験し、そしてそれらの特異的な殺活性をＩｇＥ．４４ペプチドの存在下または不存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。パネルＡでは、ＣＴＬ活性を１０μｇ／ｍｌの抗−Ｄｂモノクローナル抗体の存在または不存在下で測定した。
【図２０】ＣＤ１９＋Ｂ細胞はヒトＰＢＭＣから精製し、そしてＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）および抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（５ｍｇ／ｍｌ）と培養した。抗−ＩｇＥ ＣＴＬを図９に記載したように示したＩｇＥペプチド（Ｂ）ＩｇＥ４７および９６、（Ｃ）ＩｇＥ８８４および８９０の存在下で生成した。ＣＴＬは４日目にカルチャーＢおよびＣに加えた。６日目に、培養上清を集め、そしてヒトＩｇＥをＥＬＩＳＡにより測定した。カルチャーＡでは、ＣＴＬを加えず、そしてカルチャーＤにはＢ細胞を加えなかった。
【０１３７】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのものであり、限定するものではない。
【実施例１】
【０１３８】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の抗原提示細胞の製造
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｓ２細胞系はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（オレゴン−Ｒ）の卵から公開された手順に従い調製し、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＲＬ １０９７４）に寄託した。Ｓ２細胞は１０％ウシ胎児血清を補充した市販のシュナイダーのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地で成長させる。
【０１３９】
ＭＨＣクラスＩおよび共刺激タンパク質をＳ２細胞中で発現させるためのｐＲｍＨａ−３プラスミドベクターは、文献に記載されたように構築したｐＲｍＨａ−１発現ベクターに由来した。これはメタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離したポリアデニレーションシグナルを持つアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
【０１４０】
トランスフェクション用の相補的ＤＮＡは以下のように調製した：
ＨＬＡ−Ａ２．１およびβ−ミクログロブリン：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
Ｂ７．１：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
ＩＣＡＭ−１：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
Ｂ７．２：公開された配列に由来するプライマーを使用したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ。
ＬＦＡ−３：公開された配列に由来するプライマーを使用したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ。
【０１４１】
相補的ＤＮＡは個々にｐＲｍＨａ−３ベクターに挿入した。Ｓ２細胞はＨＬＡ−Ａ．２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１プラスミドＤＮＡおよびｐｈｓｈｎｅｏプラスミドの混合物を用いてリン酸カルシウム沈殿法を使用してトランスフェクトした。安定にトランスフェクトした細胞は、ジェネティシンを含むシュナイダーの培地中で培養することにより選択した。使用する２４時間前、トランスフェクトした遺伝子の発現をＣｕＳＯ４の添加により誘導した。発現レベルは抗−ＨＬＡ−Ａ２．１、抗−Ｂ７．１および抗−ＩＣＡＭ−１抗体を使用してフローサイトメトリーにより評価した。細胞の３０％より多いＨＬＡ発現が、ＣＤ８＋リンパ球の効率的なインビトロ活性化に必要である。
【０１４２】
ヒトＣＤ８＋細胞の単離
ＣＤ８＋細胞は白血球除去血サンプルから、Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標）単離法（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））を使用した陽性選択により単離した。抗−ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体（ヒトガンマグロブリン［Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）］中の５０μｇ／ｍｌ）を、１％ヒト血清アルブミン（バクスター−ハイランド（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）および０．２％クエン酸Ｎａを補充したダルベッコのＰＢＳ中の洗浄した細胞に加える。ゆるやかに混合しながら４℃で４５分間インキューベーションした後、細胞を洗浄し、そしてヒツジ抗−マウスＩｇＧでコートしたダイナルの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））を含む同じバッファー中に再懸濁する（１：１のビーズ：細胞比）。細胞およびビーズを滅菌した試験管に入れ、そして４℃で４５分間ゆるやかに混合する。この時間の終わりに、抗体に結合した細胞は製造元の使用説明（ダイナル）に従いＭＰＣ−１（商標）分離機を使用して磁気的に取り出す。ＣＤ８細胞−ビーズ複合体の解離は、ＣＤ８ペプチド５９−７０（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ、配列番号５２）の存在下、３７℃で４５分間インキューベーションすることにより達成する。遊離のビーズは磁気的に除去し、そしてＣＤ８細胞は純度を評価するためにフローサイトメトリーによりカウントし、そして分析する。ＣＤ８＋細胞の回収は典型的には８０％より多い。表１は抗−ＣＤ８−抗体を
用いた陽性選択により、正常ヒトＰＢＭＣ調製物からの１４の別個のＣＤ８＋調製物の細胞組成をまとめる。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
精製したヒトＣＤ８＋細胞のインビトロ免疫感作
初回刺激：トランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞は１０％ウシ胎児血清およびＣｕＳＯ４を補充したシュナイダーの培地中で（１０６細胞／ｍｌ）、２７℃にて２４時間インキューベーションする。細胞を回収し、洗浄し、そして１００μｇ／ｍｌのヒトチロシナーゼ３６９−３７７（ＲＷＪＰＲＩ）を含む昆虫Ｘ−プレス（ｐｒｅｓｓ）培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）に再懸濁する。２７℃にて３時間インキューベーションした後、Ｓ２細胞をＣＤ８＋細胞と、１：１０の比率で１０％自家血清を補充したＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中にて混合する。細胞混合物を３７℃で４日間インキューベーションし、この間、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞は死ぬ。５日目に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を培地交換と共に加え、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ群に増大させる。
【０１４５】
再−刺激：白血球除去血の時点で得た、凍結した自家ＣＤ８−欠乏ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、そして１０％自家血清（β２ミクログロフリンの供給源として）および２０μｇ／ｍｌのペプチドエピトープを含むＲＰＭＩ培地中に、１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。γ−照射（５，０００ラド）の後、細胞を３７℃で２時間インキューベーションする。非−接着細胞はダルベッコのＰＢＳで洗浄することにより除去する。接着単球は１０％自家血清および１０μｇ／ｍｌのペプチドエピトープを含むＨｅｐｅｓ−緩衝化ＲＰＭＩ培地中で９０分間インキューベーションすることによりチロシナーゼエピトープを載せる。上清を除去し、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）−活性化ＣＤ８＋細胞懸濁液（１０％自家血清を含むＲＰＭＩ培地中の３ｘ１０６細胞／ｍｌ）を１０のＣＤ８＋細胞対１の接着単球の比率で加える。３７℃で培養の３〜４日後、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を、培地交換と共に加え、エピトープ特異的ＣＴＬ群を選択的に増大させる。
【０１４６】
非−特異的拡大：ＣＤ８を非特異的に拡大させ、そしてそれらを自家血清、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ（商標）３）、ＩＬ−２およびγ照射した自家ＰＢＭＣを補充したＲＰＭＩ培地中で培養する。
【０１４７】
活性および純度に関するアッセイ
ＣＴＬアッセイ：エピトープを持つ（標的）細胞を５１Ｃｒ放出アッセイで標的細胞として使用する。４％ウシ胎児血清、１％ＨＥＰＥＳバッファーおよび０．２５％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ培地中の５ｘ１０６の標的細胞を、３７℃で１時間、０．１ｍＣｉの
５１Ｃｒで標識する。細胞を４回洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））中で１０５細胞／ｍｌに希釈する。９６−ウェルのマイクロタイタープレート中で、１００μｌのエフェクターＣＴＬおよび１００μｌのペプチドを載せた５１Ｃｒ−標識標的細胞を１００：１、２０：１および４：１（エフェクター：標的）の割合で合わせる。Ｋ５６２細胞を２０：１（Ｋ５６２）の比率で加えて、ナチュラルキラー細胞のバックグラウンド溶解を減少させる。非−特異的溶解は５１Ｃｒで標識した細胞を使用して上記のように評価するがエピトープを持たない。５１Ｃｒの自然な放出および最大放出を測定するための対照を二連で含める。３７℃で６時間インキューベーションした後、プレートを遠心し、そして上清をカウントして５１Ｃｒ放出を測定する。
【０１４８】
特異的溶解の割合は以下の式を使用して算出する：
【０１４９】
【数１】
【０１５０】
フローサイトメトリー：インビトロ活性化前および後のＣＤ８＋細胞は、蛍光モノクローナル抗体およびＦＡＣＳ分析を使用して細胞表面マーカーの数について分析した。健康な供与体に由来する細胞を使用した典型的な活性化プロトコールからの結果を表２に示す。
【０１５１】
【表２】
【０１５２】
活性および純度に加えて、ＣＴＬ調製物はステリリティおよびエンドトキシン含量についてもアッセイする。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】
【表４】
【実施例２】
【０１５５】
ＩｇＥ生産細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞注入の試み
試験の提案
この実施例は、以下の要因に従い評価されるアレルギー疾患の処置における細胞傷害性Ｔ細胞注入の効力を教示する。
１．インビトロ免疫感作後の再注入自家ＣＴＬの安全性および寛容（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ）
２．限界希釈分析を考慮した全身循環における注入ＣＴＬの動力学
３．ラジオシンチグラフィーによるＣＴＬの全身配置（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）
４．免疫組織学による生検小節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）；および
５．測定可能な損傷の退行および２カ月間にわたる応答期間
【０１５６】
エクスビボで生成した自家ＣＴＬでの処置
すべての患者は少なくとも１回の自家ＣＴＬ注入を受ける。各患者に投与したサイクル数および細胞の用量は表１にまとめる。インビトロで生成した細胞数は、アフェレーシス（ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ）法から単離したＰＢＭＣ数および各ＰＢＭＣ調製物に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞数のような患者に関連する因子に依存する。インビトロで生成した細胞のすべてが供与体に再注入されるので、各患者に投与される用量は必然的に変動する。患者
間の用量を標準化するために、計算された「効力」スコアを各用量について記録する。この値は細胞の総数にペプチドを載せた標的細胞で得られた溶解活性を掛けることにより得られる。患者は各サイクルの終わりの彼らの臨床的状態に基づき、第２、３または４サイクルの処置に入る。単離される自然なＣＤ８＋Ｔ細胞の総数は、各ＰＢＭＣ調製物中のその割合に依存する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は患者間で変動する。エクスビボでのＣＴＬの生成に関する手順は、明細書および上記実施例１に教示されている。
【０１５７】
ＩＦＮα−２ｂに応答するクラスＩおよび黒色腫関連抗原のアップレギュレーション
抗原特異的なＣＴＬがＩｇＥ生産細胞をインビボで溶解する能力を強化する試みでは、低用量のＩＦＮα−２ｂをＣＴＬ注入前に５日間連続して投与し、そしてさらに４週間、週に３回投与する。サイトカインに対するインビボ応答を測定する１つの方法は、連続的な時点で得た生検体を特異的抗体を用いた陽性染色に関して免疫組織化学的分析により評価することである。
【０１５８】
エクスビボで生成したＣＴＬの抗原特異性
すべての患者から生成したＣＴＬは、生検材料が系を樹立するために利用できれば、放出の日にペプチドを載せたＴ２標的、ＨＬＡ−Ａ２ ＩｇＥ生産Ｍ−１４クローン４細胞系および自家Ｍ−１４細胞系に対して評価する。細胞の各調製用量は、その細胞溶解活性について評価する。いずれかの各ペプチドのみ、またはすべてのペプチドを同時に提示するペプチドを載せたＴ２細胞を使用して、各患者について生じるＣＴＬ応答の特異性を決定する。内因的に発現した、ＨＬＡ−Ａ２に結合した抗原を持つ細胞を溶解する能力は、ＨＬＡ−Ａ２に合った系または自家細胞系を用いて評価する。細胞溶解活性に加えて、抗原−特異性は、特異的なペプチド刺激に応答して作られる細胞内ガンマインターフェロン生産を検出するために確立された方法を用いて評価する。エクスビボのプロトコールの終わりに、生成したＣＴＬはこの方法により評価する。各ペプチドに特異的な細胞の割合を各々記録する。患者に由来する各々の大量のＣＤ８カルチャーの特異的細胞の総数は、そのＴ細胞群で検出される各ペプチド特異性を加えることにより算出する。特異的細胞の総数における増加が、各連続的処理サイクルで検出される。
【０１５９】
アネルギー状態の存在はＣＴＬを生成する能力を排除せず、または臨床的応答を防止しなかった
このプロトコール下で処置された患者のほとんどが、事前に医学的介入を受けている。前処置皮膚試験を行って、７種の共通抗原のパネルに対するアネルギー応答がエクスビボでＣＴＬを生成できないこと、または証明された臨床的応答の防止に相関するかどうかを決定する。エクスビボでＣＴＬを生成する能力は患者の前処置皮膚試験の結果と相関しない。
【実施例３】
【０１６０】
ＩｇＥはアレルギー性喘息の病因に本質的な役割を果たす。ここで我々は、ＩｇＥ分子に由来する抗原性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、人工的な抗原提示細胞により提示されるＩｇＥペプチドを用いて休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞を刺激することによりインビトロで生成できることを示す。ＩｇＥ特異的ＣＴＬはＩｇＥペプチドを載せた標的細胞をインビトロで溶解し、そしてインビボでＩｇＥ応答に特異的な抗原を抑制する。さらにＩｇＥ特異的ＣＴＬを喘息マウスモデルに養子移入すると、肺の炎症および気道の過敏性の発症を抑えることができる。すなわちＩｇＥ特異的ＣＴＬはアレルギー性喘息および他のＩｇＥ−媒介アレルギー疾患の処置を提供することができる。
【０１６１】
細胞傷害性Ｔリンパ球は休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞に由来する。抗原および共刺激物の存在下で、休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そして武装した細胞傷害性Ｔ細胞に分化し、これが抗原を発現する標的細胞を破壊することができる。ＣＴＬは
感染した細胞の溶解により、および／またはＣＴＬが生産するサイトカインの効果を通してウイルスおよび細胞内の病原体に対する免疫に必須な役割を果たす。
【０１６２】
ＩｇＥタンパク質配列に由来する抗原性ペプチドの同定：
マウスＩｇＥの２つの対立遺伝子（ＩｇＥａおよびＩｇＥｂ）はすでに記載された（ＰＯ６３３６）。ＩｇＥａおよびＩｇＥｂのアミノ酸配列の並列配置により、９５％のアミノ酸配列が同一であることが示された。１４個のアミノ酸の差異がＣＨ１とＣＨ２間の連結領域に位置し、そして別の５個のアミノ酸の差異がＣＨ３とＣＨ４間の連結領域に位置する。ＩｇＥｂのアミノ酸配列をＬｄおよびＤｂＭＨＣクラスＩ分子に関する結合モチーフを含む９ｍｅｒのペプチド配列について、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／で利用可能なバイオインフォーマチックス＆モレキュラーアナリシスセクション（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ）のソフトウェアを使用することにより分析した。このプログラムはＭＨＣクラスＩ分子に対して予測される解離のハーフタイム（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）に基づき有力なノナペプチドの順位をつける。順位付けの分析に基づき、Ｌｄ結合モチーフを持つ８個のペプチドおよびＤｂ結合モチーフを持つ５個のペプチドが合成に選択された（表１）。
【０１６３】
これら合成ペプチドのＬｄおよびＤｂクラスＩ分子への結合能力は、ＭＨＣクラスＩ安定化アッセイで試験した（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）同上）。抗原−輸送欠損（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）（ＴＡＰ−）ＲＭＡＳ細胞（Ｈ−２ｂ）またはＬｄトランスフェクトＲＭＡＳ（ＲＭＡＳ−Ｌｄ）細胞を、滴定濃度のペプチドの存在下、２７℃で培養した。２７℃で一晩培養した後、これらの細胞をさらに２時間、３７℃で培養し、そして細胞上のＬｄおよびＤｂの表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。表１に示すように、２つのＩｇＥペプチド、ＩｇＥ１１およびＩｇＥ３６６がＬｄに強く結合し、一方、ＩｇＥ１１４はＬｄに弱く結合する。Ｄｂに結合すると予測された５個のペプチドの中で、ＩｇＥ４４だけがＤｂに強く結合し、そして２つのペプチドＩｇＥ１６およびＩｇＥ１２５はＤｂに弱く結合する。興味深いことには始めにＬｄに結合すると予想されたＩｇＥ３６６が、ＬｄおよびＤｂの両方に結合した。すなわち全部で６個のペプチドがＬｄまたはＤｂＭＨＣクラスＩ分子のいずれかに結合すると同定された。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
ＩｇＥペプチドに特異的なＣＴＬのインビトロでの生成
これらのＩｇＥペプチドがＣＴＬ応答を誘導する能力をインビトロで評価した。すでに記載したように、ＭＨＣクラスＩに加えてＢ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、インビトロで休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞の活性化において有力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞をマウスのリンパ節から精製し、そしてＬｄまたはＤｂに加えてＢ７−１およびＩＣＡＭでトランスフェクトしたペプチドを載せたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞と、サイトカインの不存在下で培養した。ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日目に加え、そしてその後、１日おきに加えた。ペプチドを載せたＲＭＡＳ（Ｋ
ｂ、Ｄｂ）細胞またはＲＭＡＳ−Ｌｄ細胞に対するＣＴＬ活性を９日目に測定した。図１に示すように、ＩｇＥ４４ペプチドにより誘導されるＣＴＬは、ＩｇＥ４４ペプチドを載せたＲＭＡＳ細胞を特異的に溶解し、標的細胞単独または他のＩｇＥペプチドを載せた標的細胞のいずれもＩｇＥ４４特異的ＣＴＬにより認識されなかった。
【０１６６】
特異的ＣＴＬ活性は、Ｄｂに結合することが示されたＩｇＥ１６またはＩｇＥ１２５ペプチドにより誘導されなかった。ＩｇＥ３６６は元はＬｄ結合ペプチドとして同定され、興味深いことには、ＩｇＥ３６６によるＬｄ拘束性ＣＴＬを誘導することに加えて、ＩｇＥ３６６はＤｂ拘束性ＣＴＬも誘導する（図２、パネルＢ）。３個のＬｄ結合ペプチドの中で、ＩｇＥ３６６に加えてＩｇＥ１１も抗原特異的ＣＴＬを誘導する、ＩｇＥ特異的ＣＴＬの殺しはパーフォリン依存的であり、そしてＩＦＮγの発現からは独立している（図２、パネルＣ）。さらにＩｇＥペプチドにより誘導されるＣＴＬは、ＩｇＥ４４特異的ＣＴＬによるＩｇＥ４４を載せたＲＭＡＳ標的の殺しが抗−ＤｂｍＡｂにより完全に遮断されたので、ＭＨＣ拘束性である（図２、パネルＤ）。これらＣＴＬのＦＡＣＳ分析では、それらがαβＴＣＲ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、そしてＮＫ細胞マーカー（ＤＸ５またはＮＫ１．１）の発現がこれらの細胞上では検出されなかったことを明らかにした（データは示さず）。
【０１６７】
抗−ＩｇＥ特異的ＣＴＬによるＩｇＥ応答の抑制
ＩｇＥペプチドにより誘導されるＣＴＬはインビトロで標的細胞を特異的に殺すので、これらのＣＴＬがＩｇＥ応答をインビボで抑制することができれば興味深いと考えた。マウスは大変低い血清ＩｇＥを有し、そしてアレルギー応答を自然には生じない。水酸化アルミニウムで沈殿した卵白アルブミンを使用してマウスに抗原特異的ＩｇＥ応答を誘導した。図３に示すように、ＯＶＡに水酸化アルミニウムを加えて用いた２回の免疫感作後、免疫感作したマウス中の全血清ＩｇＥおよび卵白特異的ＩｇＥの両方は高く、そしてＩｇＥレベルはこれらのマウスをＯＶＡで鼻内追加免疫した後にさらに上昇した。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
ａ成体ＣＢＦ１／Ｊマウスは、１日および１４日に５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）に加えて水酸化アルミニウムで腹腔内に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、５ｘ１０６抗−ＩｇＥ ＣＴＬまたは対照ＣＴＬまたはＰＢＳを１日おきに３回与えた。最後のＣＴＬ処置から３週間後、１日おきに３回、マウスの鼻内にＯＶＡを追加免疫した。最後の追加免疫から１日後、気管支の胞肺洗浄液を集め、そして肺組織を各マウスから集め、そしてＨＥ染色により染めた。各マウスの肺の炎症は病理学者により別個に評価された。
ｂスコア：０＝正常；Ｔ＝微量；ｌ＝おだやか；２＝おだやかから中程度；３＝中程度；４＝重度
ｃＢＡＬＴ＝気管支関連リンパ球過形成
【０１７０】
【表７】
【０１７１】
【表８】
【実施例４】
【０１７２】
特異抗原および共刺激の存在下で、休止しているＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そしてＣＴＬに分化することができ、これは抗−ウイルス免疫応答に本質的な役割を果たす。最近、インビトロで生成された腫瘍に関係する抗原に特異的なＣＴＬを癌患者の処置に使用できることが示された。我々は今、非−腫瘍自己抗原に由来する抗原性ペプチドがインビトロで特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導できることを示す。活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に一時的に発現される自己抗原である、ＣＤ４０Ｌから同定されたペプチドにより誘導されるＣＴＬは、活性化ＣＤ４細胞を殺すことができ、そしてこの殺しは拘束性クラスＩ分子に特異的な抗体（Ａｂ）によるか、またはＣＤ８分子を認識するＡｂのいずれかにより遮断することができる。さらにＣＤ４０Ｌ−／−マウスから、または２ｍ−／−マウスから生成した活性化ＣＤ４Ｔ細胞のいずれもＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬにより殺されず、ＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬによる活性化ＣＤ４Ｔ細胞の殺しは、抗原−依存的かつＭＨＣに拘束性である。重要なことはＣＤ４０Ｌに特異的なインビトロで生成したＣＴＬがインビボですべてのアイソタイプのＣＤ４−依存的抗体応答を抑制する点である。対照的に、ＩｇＥに由来する抗原性ペプチドにより誘導されるＣＴＬはＩｇＥ応答を抑制し、そしてＣＤ４０Ｌ−特異的ＣＴＬの若い段階でのＮＯＤマウスへの養子移入は、ＮＯＤマウスに糖尿病の発症を遅らせる。すなわち活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に発現する非腫瘍自己−抗原に
特異的なインビトロで生成したＣＴＬは、インビボで免疫を調節することができる。
【０１７３】
枯草熱、喘息および全身性アナフィラキシーのようなアレルギー疾患は、無害物質に対する免疫応答である。疾患の顕著な特徴はＣＤ４細胞の活性化およびＢ細胞によるＩｇＥの過剰生産である。現在の治療は症状の処置に集中し、そして疾患の発症および進行を防ぐものではない。アレルゲン−活性化ＣＤ４細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞はアレルギーの病因に中心的な役割を果たしているので、我々の方法は自家ＣＴＬを使用して活性化ＣＤ４Ｔ細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞を排除し、これにより疾患の発症および進行を防止する。２つの分子、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＩｇＥは、ＣＴＬ療法の標的抗原として選択した。ＣＤ４０Ｌに由来する３種の抗原性ペプチドおよびＩｇＥに由来する２種の抗原性ペプチドを同定した。これらのペプチドに対して特異的なＣＴＬを生成し、そしてこれらＣＴＬの機能をインビトロおよびインビボの両方で評価した。
【０１７４】
ＣＤ４０Ｌに由来する３種の抗原性エピトープおよびＩｇＥ分子に由来する２種のエピトープを同定した。抗原性エピトープの合成ペプチドはクラスＩ分子に結合し、そして休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞をインビトロで活性化することができた。
【０１７５】
ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を発現しているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるＣＤ４０ＬまたはＩｇＥペプチドを持つＣＤ８Ｔ細胞の刺激により生成された。インビトロでこのように生成したＣＴＬは、ペプチドを載せた標的細胞を特異的に殺した。ＣＤ４０Ｌ−ペプチド特異的ＣＴＬは活性化ＣＤ４Ｔ細胞を殺し、そしてその認識はＣＤ４０ＬおよびＭＨＣクラスＩ分子の発現に依存した。
【０１７６】
ＣＤ４０Ｌ−特異的ＣＴＬの機能は、インビボでも評価した。抗原−特異的抗体応答は、抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬにより抑制された。抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬおよび抗−ＩｇＥ
ＣＴＬのアレルギーおよび自己免疫疾患に及ぼす効果は、動物モデルで調査する。
【０１７７】
【表９】
【０１７８】
【表１０】
【０１７９】
【表１１】
【０１８０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞はＰＢＭＣから精製し、そしてＡ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１
でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞とＩｇＥペプチドの存在下で培養した。統計ではＩｇＥペプチドが異なる供与体から特異的ＣＴＬ応答を生成する能力が示された。１および２は抗−ＩｇＥ ＣＴＬが９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒからそれぞれ生成されたことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫およびアレルギー疾患を処置するための非腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性リンパ球に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌およびウイルスに見いだされるような外来抗原に対する免疫応答は、感染を防御し、そして排除する。しかし異常な免疫応答はアレルギー疾患および自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。花粉、ホコリダニ、食物抗原およびハチの針のような外来の、時に無害な物質に対する免疫応答は、枯草熱、喘息および全身性アナフィフラキシーのようなアレルギー疾患を生じ得る。膵島抗原および軟骨抗原のような自己抗原に対する免疫応答は、それぞれ糖尿病および関節炎を導き得る。アレルギー疾患の顕著な特徴は、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化およびＢ細胞によるＩｇＥの高生産である一方、自己免疫疾患の目立った特徴は、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化および炎症性サイトカインの過剰生産である。現行の治療はアレルギーおよび自己免疫疾患の症状の処置に集中してきており、そして疾患の発症および進行を防止するものではない。
【０００３】
ＣＴＬは休止しているナイーブＣＤ８Ｔ細胞から派生し、そして主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子により提示される抗原性ペプチドを認識する。休止しているＣＤ８Ｔ細胞が専門的な抗原提示細胞により提示される抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体と遭遇する時、ＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そして武装した（ａｒｍｅｄ）ＣＴＬに分化する。標的細胞上のペプチド／ＭＨＣ複合体の認識で、抗原特異的ＣＴＬは致命的な打撃を与え、そしてウイルスに感染した標的細胞または腫瘍細胞のような抗原−発現細胞を溶解する。
【０００４】
インビボでのナイーブＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞と樹状細胞のような専門的なＡＰＣとの間の多くの受容体−リガンド相互作用により制御されている（非特許文献１）。ナイーブＴ細胞の活性化には２つのシグナルが必要であることは一般的に受け入れられている（非特許文献２）。シグナル１はそれぞれ、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用により誘導され（非特許文献３）、そしてＣＤ４／ＣＤ８共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のＭＨＣクラスＩＩ／Ｉ分子の非多型領域への結合により助けられている（非特許文献４）。シグナル２はシグナル１と定性的に異なり、そしてＡＰＣ上の相補的リガンドと相互作用するＴ細胞共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を介して、例えばＣＤ２８とＢ７との相互作用を通して送達される（非特許文献５；６）。シグナル１および２は相乗的に機能し、そして最終的にＴ細胞が増殖し、サイトカインを生産し、そしてエフェクター細胞に分化することを誘導する一連のシグナル発信反応を誘起する（非特許文献７；８）。しかしシグナル１と２との間の関係は未知である。
【０００５】
様々な分子が共刺激機能を有すると報告されたが、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用を介して送達される共刺激に特別な注目が集中した（非特許文献９）。ＣＤ２８は一本のＩｇ様ドメインを含む分子であり、そしてＴ細胞上にホモ二量体として構成的に発現される（非特許文献５）。ＣＤ２８分子はＡＰＣｓ上のＢ７−１またはＢ７−２分子のいずれかとの相互作用を通して、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２のような成長−促進サイトカインを生産する独特なシグナルを伝達し（非特許文献１０）、Ｂｃｌ−ＸＬのような生存因子（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ）の発現をアップレギュレートし（非特許文献１１）、そしてシグナル１単独により誘導されるアネルギーを防止する（非特許文献１２）すると考えられている。
【０００６】
Ｔ細胞の活性化に重要な役割を有する別の分子対は、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１である（非特許文献１３）。ＩＣＡＭ−１はＩｇ遺伝子スーパーファミリーに属し、そして５個のＩｇ Ｃ様ドメインを細胞外領域に有し；これは造血および非造血細胞の両方で発現する。Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−１に関する受容体はＬＦＡ−１（ＣＤ１１／ＣＤ１８）であり、これはｂ２インテグリンファミリーに属する（非特許文献１４）。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１との相互作用は、Ｔ細胞に対して有力な共刺激機能を有する（非特許文献１５）が、この機能が別のシグナル経路に反映しているのか、またはＴ細胞とＡＰＣとの接着の上昇に反映するのかについての意見は別れている（非特許文献１６：１７）。
【０００７】
Ｂ７およびＩＣＡＭ−１分子に加えて、ＣＤ７０（非特許文献１８）および熱安定性抗原（ＨＳＡ）（非特許文献１９）を含むＡＰＣ上の幾つかの他の分子は、それらとＴ細胞上のそれらの各リガンドとの相互作用を通して極めて有力な共刺激機能を発揮できる。これはＴ−ＡＰＣ相互作用が高度に複雑であり、そしてＴ細胞とＡＰＣｓ上の分子との相補的な組の間で多くの相互作用が関与していることを意味している。各組の分子の相互作用は異なる細胞性の出来事を誘導する特異的なシグナルを誘起する。異なるシグナルの組み合わせは、最適なＴ細胞の活性化に相乗的に作用し、そしてＴ細胞の最終的な運命を決定し得る。あるいは共刺激分子の機能は重複し、そして各組の共刺激分子により誘導されるシグナルは付加的かもしれない。各組の共刺激分子の必要性は、シグナル１の強さおよび特性により影響されるだろう。
【０００８】
これら２つの可能性を考慮して、ナイーブＴ細胞の刺激に最小の要件を理解することが重要である。ＣＤ２８−／−マウスを用いた実験では、ＣＤ２８−Ｂ７相互作用が幾つかの状況では高度に重要であるが、他ではそうではないことを示す（非特許文献２０）。同様に１次反応のＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ相互作用への要件は、一定の知見ではない（非特許文献２１）。
【０００９】
ＣＤ８Ｔ細胞は、主にウイルスタンパク質および腫瘍細胞上に発現するタンパク質に由来する抗原性ペプチドを認識する。しかし最近、新しく合成されたタンパク質が抗原処理機構により優先的に処理されたことが報告された（非特許文献２２）。活性化で、免疫細胞は多数の新規タンパク質を合成する能力を獲得し、ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞が、非ＩｇＥ生産細胞および休止ＣＤ４Ｔ細胞とは異なる組のペプチド／ＭＨＣ複合体を提示することが可能である。ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に提示されるこれらペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８Ｔ細胞により認識されることができる。すなわちこれらのペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的なＣＴＬは、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置することができるだろう。しかし多数の免疫寛容メカニズムはインビボで自己抗原に向かうＣＤ８Ｔ細胞の活性化を防ぐことができた。
【００１０】
ＣＤ８リンパ球（ＣＴＬｓ）は感染細胞、腫瘍細胞および同種細胞の認識および排除の原因となる養子免疫の武器である。いったんプライミングすれば（ｐｒｉｍｅｄ）、ＣＴＬは広い種々の細胞上のそれらの標的抗原を認識しそして標的細胞を溶解し、かつ／またはサイトカイン様ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−ガンマを分泌することによりそれらの機能を果たすことができる。
【００１１】
抗原のＣＤ８＋ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）への提示は、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ−Ｉ）のコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）で起こるが、抗原のＣＤ４＋ＨＴＬ（ヘルパーＴリンパ球）への提示はＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテクストで起こる。
【００１２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の効率的誘導には、Ｔ細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわちＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子を発現する細胞と相互作用することが必要である。ＡＰＣは樹状細胞、マクロファージおよび活性化Ｂ細胞である。ほとんどすべての有核細胞はＭＨ
Ｃ−Ｉを発現するが、自然なＣＴＬも効率的なプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）には骨髄が誘導するＡＰＣによる抗原（Ａｇ）の提示を必要とする（非特許文献２３）。樹状細胞はＣＴＬ応答の高度に有力なインデューサーであり（非特許文献２４）、そしてＣＴＬのプライミングに関与する主要なＡＰＣであると考えられている。いったんプライミングすれば、ＣＴＬは広い種々の細胞上のそれらのコグネイトＡｇを認識し、そして標的細胞を溶解し、かつ／またはサイトカインを分泌することにより応答することができる。
【００１３】
骨髄−誘導ＡＰＣはＣＴＬ応答を効率的にプライムすることを必要とするが（非特許文献２５）、活性化されたＣＴＬは直ちに広い種々の細胞により提示されるＡｇを認識し、そして応答することができる。インビボでの腫瘍−またはウイルス−特異的ＣＴＬ免疫応答の誘導は、骨髄由来抗原−提示細胞に依存することが示された（非特許文献２６；２７）。一般に骨髄由来ＡＰＣはこれらの細胞に対する独特なメカニズムを通して、シャペロン分子に会合した可溶性抗原の状態で、または貪食作用によるいずれかで細胞性抗原を取り込むと受け入れられている。
【００１４】
細胞性抗原に対する応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により運ばれる援助に依存すると長い間示されて来た。細胞性抗原はＣＴＬおよびＨＴＬによる認識のために、同じＡＰＣ上に提示されなければならないことも示されて来た。この援助の性質は、ＣＴＬの拡大に必要なＩＬ−２の必要性と解釈されてきた。最近の研究では、この援助がＨＴＬによる樹状細胞の活性化から生じ、そしてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して媒介されることが示された（非特許文献２８）。
【００１５】
したがって細胞性抗原（腫瘍細胞または感染細胞に由来する）に対するＣＤ８媒介免疫応答の誘導に関する同様なシナリオは以下の通りである：樹状細胞が腫瘍または感染細胞に由来する抗原を獲得する。ＤＣ−抗原とＣＤ４細胞との相互作用は、ＤＣがＣＤ８細胞を活性化できるようにする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／２９１，３００号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）９：２７１−２９６
【非特許文献２】Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２７５−２８５
【非特許文献３】Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２８７−２９９
【非特許文献４】Ｍ．Ｃ．Ｍｉｃｅｌｉ ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｐａｒｎｅｓ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）５３：５９−１２２
【非特許文献５】Ｐ．Ｓ．Ｌｉｎｓｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１１：１９１−２１２
【非特許文献６】Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１４：２３３−２５８
【非特許文献７】Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）７：４４５−４８０
【非特許文献８】Ａ．Ｗｅｉｓｓ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：２６３−２７４
【非特許文献９】Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：１０６５−１０６８
【非特許文献１０】Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９９４）１５：３２１−３３１）
【非特許文献１１】Ｂｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９５）３：８７−９８
【非特許文献１２】Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）９：３５１−３５７
【非特許文献１３】Ｖａｎ Ｓｅｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４４：４５７９−４５８６
【非特許文献１４】Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：３０１−３１４
【非特許文献１５】Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９０）１１４：１０９−１４３
【非特許文献１６】Ｄａｍｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：２３６８−２３７９
【非特許文献１７】Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９７）７：５４９−５５７
【非特許文献１８】Ｈｉｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：２６１２−２６２３
【非特許文献１９】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：４３７−４４５
【非特許文献２０】Ｓｈａｈｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），２６１：６０９−６１２
【非特許文献２１】Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５７：５３７５−５３８６
【非特許文献２２】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２０００）４０４：７７０−７７４
【非特許文献２３】Ｄａｌｙｏｔ−Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１２）：６７３１−６７３７
【非特許文献２４】Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）３９２：２４５−２５２）
【非特許文献２５】Ｐ．Ｊ．Ｆｉｎｋ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９７８）１４８：７５５−７６６
【非特許文献２６】Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３（１）：３１７−３２２
【非特許文献２７】Ｌａｂｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２（１）：１６８−１７５
【非特許文献２８】Ｓ．Ｒ．Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏ（２０００）６７（５）：６０７−６１４
【発明の概要】
【００１８】
ＩｇＥ生産Ｂ細胞および活性化ＣＤ４Ｔ細胞のような免疫細胞は、アレルギー疾患および自己免疫疾患の病因に中心的な役割を果たす。本発明はアレルギーおよび／または自己免疫疾患を引き起こす免疫細胞を排除または抑制するために、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を利用する。すなわち疾患の発症および進行は本発明の方法により防止され、または中断される。
【００１９】
本発明は１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープに対して特異的なＣＴＬの生産法を提供し、この方法は；
ａ）個体からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し；
ｂ）クラスＩ ＭＨＣ分子を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ’ｓ）にＴ細胞エピトープを添
加し；
ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗原を載せたＡＰＣ’ｓと、Ｔ細胞エピトープに特異的な前駆体ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に十分な時間培養し；
ｄ）活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に必要な成分の存在下で、カルチャー中の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させ；そして
ｅ）カルチャーからＣＤ８＋Ｔ細胞を回収する、
ことを含んでなる。
【００２０】
また本発明は疾患を引き起こす標的細胞に特異的に細胞傷害性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を提供し、ここで標的細胞がその表面にＭＨＣクラスＩ分子と結合する１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープを有し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞は非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープに結合するＭＨＣクラスＩ分子との相互作用によりすでに選択的に活性化されている。
【００２１】
また本発明は疾患を引き起こす標的細胞により媒介される疾患の処置法を提供し、ここで標的細胞はその表面にＭＨＣクラスＩ分子と結合する１以上の非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープを有し、この方法はそのような処置が必要な患者に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含んでなり、ここでＣＤ８＋Ｔ細胞は非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープと結合するＭＨＣクラスＩ分子との相互作用によりすでに選択的に活性化されている。
【００２２】
本発明は人工的な抗原提示細胞を作成し、そして使用することにより、自己抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞の免疫寛容が破壊され、そしてＩｇＥまたはＣＤ４０Ｌタンパク質から同定された抗原性ペプチドに対して特異的なＣＴＬが生じたことを示す。ＣＤ４０Ｌに特異的なインビトロで生成したＣＴＬｓのＮＯＤマウスへの養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）は糖尿病の発症を劇的に遅らせ、そしてＩｇＥペプチドに特異的なＣＴＬｓはＩｇＥの生産を抑制し、そして喘息のマウスモデルにおいて肺の炎症を減少させた。上記の系はＣＤ４Ｔ細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞により引き起こされるヒトの疾患にも潜在的に応用できる。ＣＤ４Ｔ細胞により引き起こされる自己免疫疾患は糖尿病、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、多発性硬化症および乾癬である。一方、ＩｇＥにより媒介されるアレルギー疾患は、薬剤、毒およびピーナッツにより引き起こされる全身性アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーおよびアレルギー性喘息である。さらに免疫細胞上に発現する他の自己−抗原も、自己免疫疾患およびアレルギー疾患の処置において、インビボでのようにインビトロでもＣＴＬの生成に使用することができる。抗原性ペプチド、タンパク質または非腫瘍細胞で発現する非腫瘍抗原をコードするＲＮＡおよびＤＮＡも、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置または防止するためのワクチンを開発するために使用することができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
１つの態様において本発明は、個体を非−腫瘍自己抗原Ｔ細胞エピトープで処置する方法を提供し、この方法は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０個の異なるペプチド−エピトープ分子を提示することができ、同時に各ペプチドは約６〜１２個のアミノ酸長であり、そして好ましくは約８〜１０個のアミノ酸長であり、そして約１０ｎＭ〜１００μＭの濃度範囲であり；
ｂ．該個体または適当な供与体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＣＧＭ、好ましくはＩＬ−２、またはＩＬ−２とＩＬ−７を組み合わせたようなサイトカインを含む培地に加え；
ｅ．該個体または適当な供与体から回収した非懸濁末梢血単球、あるいはＣＤ８−欠乏末梢血単球を、約１０〜５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合し；
ｆ．該末梢血単球懸濁液を、所望する末梢血単球を除き懸濁液中のすべての成分を殺菌するために必要な、約３，０００〜７，０００ラドの範囲、好ましくは５，０００ラドのような十分な線量のγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの該各ペプチドを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の接着末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．場合により適当なＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし、そして場合によりＣＴＬ純度、ステリリティ（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）およびエンドトキシン含量についてアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２４】
別の態様では、本発明は個体の処置法を提供し、この方法は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド−エピトープ分子、好ましくは約１０個のペプチドを提示することができ、同時に各ペプチドは８〜１０個のアミノ酸長であり；
ｂ．該個体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で約６〜７日間刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｅ．該個体から回収した末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合し；
ｆ．該ＣＤ８−欠乏末梢血単球懸濁液を、約５，０００ラドのγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１００ｎｇ／ｍｌの該エピトープを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．適当なＣＴＬ活性、純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２５】
本発明の別の態様は、限定するわけではないが慢性関節リウマチ、狼瘡、乾癬、自己免疫腎炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫甲状腺炎、クローン病、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および移植拒絶を含む自己免疫疾患、および／または限定するわけではないが食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息および蛇毒アレルギーを含むアレルギー疾患の個体を処置するための方法を提供し、この方法は；ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはそのような疾患と関係する約１５個までの異なるペプチド−エピトープ分子、好ましくは約１０個のペプチドを提示
することができ、同時に各ペプチドは８〜１０個のアミノ酸長であり；
ｂ．該個体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で約６〜７日間刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｅ．該個体から回収した末梢血単球を、約２０μｇ／ｍｌの各ペプチドと混合し；
ｆ．該ＣＤ８−欠乏末梢血単球懸濁液を、約５，０００ラドのγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１００ｎｇ／ｍｌの該エピトープを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の該末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．ＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．適当なＣＴＬ活性、純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる。
【００２６】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患の処置法であり、ここでｎｎＡＰＣは以下のペプチド、配列番号１５〜配列番号４９を提示する。
【００２７】
本発明の別の態様は、非−癌性疾患またはＨＬＡクラスＩ分子が通常関係する不十分な、または未熟な免疫応答を生じる疾患の状態を処置する方法であり、ここで処置は感染した、または形質転換した細胞を排除し、該排除はＣＴＬｓにより媒介されることが証明された。
【００２８】
本発明の別の態様は、非−癌性疾患またはＨＬＡクラスＩ分子が通常関係する不十分な、または未熟な免疫応答を生じる疾患の状態を処置する方法であり、ここでＣＴＬによる排除に感受性となることが示された感染した、または形質転換した細胞は；
ａ．天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）または天然には存在しない抗原提示細胞系（ｎｎＡＰＣ）を調製し、ここで該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣはそのような疾患または疾患状態と関係する約１５個までの異なるペプチド分子、好ましくは約１０個のペプチドエピトープ分子を提示することができ、同時に各ペプチドは６〜１２個のアミノ酸長、好ましくは８〜１０個のアミノ酸長であり、そして約１０ｎＭ〜１００μＭの範囲の濃度であり；
ｂ．該個体または適当な供与体からＣＤ８＋細胞を回収し；
ｃ．該ＣＤ８＋細胞を該ＡＰＣまたは該ｎｎＡＰＣ細胞系で刺激し；
ｄ．該ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＣＧＭ、好ましくはＩＬ−２、またはＩＬ−２とＩＬ−７を組み合わせたようなサイトカインを含む培地に加え；
ｅ．該個体または適当な供与体から回収した非懸濁末梢血単球、あるいはＣＤ８−欠乏末梢血単球を、約１０〜５０μｇ／ｍｌのペプチドと混合し；
ｆ．該末梢血単球懸濁液を、所望する末梢血単球を除き懸濁液中のすべての成分を殺菌するために必要な、約３，０００〜７，０００ラド、好ましくは５，０００ラドのような十分な線量のγ−放射線で照射し；
ｇ．接着末梢血単球を単離し；
ｈ．該接着末梢血単球に約１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの該各ペプチドを載せ；
ｉ．該ＣＤ８＋細胞と該接着末梢血単球を、約１０のＣＤ８＋細胞対１の末梢血単球の割合で合わせ；
ｊ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球を合わせた該懸濁液を、約６〜７日間刺激し；
ｋ．場合によりＣＤ８＋細胞および末梢血単球の該懸濁液を、培地中のＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し；
ｌ．場合により適当なＣＴＬ活性についてＣＤ８＋懸濁液をアッセイし、そして場合によりＣＴＬ純度、ステリリティおよびエンドトキシン含量についてアッセイし；そして
ｍ．該個体にＣＤ８＋懸濁液を接種する、
ことを含んでなる方法により処理される。
【００２９】
本発明は、発現のためにＤＮＡでトランスフェクトしたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞に由来する天然には存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ここでｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患に関係する最高１５個の異なるペプチド分子、好ましくはＤＮＡによりコードされる１０個のペプチド分子を同時に提示することができる。
【００３０】
本発明は、発現のためにヒト クラスＩ ＨＬＡ、結合および共−刺激分子のＤＮＡでトランスフェクトしたキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞に由来する天然には存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）を提供し、ここでｎｎＡＰＣはアレルギーおよび／または自己免疫疾患に関係する最高１５個の異なるペプチド分子、好ましくはＤＮＡにより同時にコードされる１０個のペプチド分子を同時に提示することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、個体の処置を強化する種々の所望する機能と関連するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えば処置される疾患または疾患状態と関係するペプチドに加えて、ｎｎＡＰＣはリンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ−細胞共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のようなアクセサリー分子と関係するペプチドを提示して、細胞−細胞接着またはさらなる細胞活性化シグナルの伝達を強化することができる。
【００３２】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係するペプチドを提示するｎｎＡＰＣを提供する。例えばＩｇＥに関係または由来するペプチドはアレルゲンに関係または由来するペプチドと、またはさらにＣＤ４０Ｌペプチドと組み合わせて提示される。
【００３３】
本発明の別の態様は、アレルギーおよび／または自己免疫疾患と関係する最高１０個の異なるペプチド分子を同時に提示することができる天然に存在しない抗原−提示細胞（ｎｎＡＰＣ）の製造法を提供し、該方法は；
ａ．キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の卵に由来する昆虫細胞系を調製し；あるいは昆虫細胞系を調製し、ここで該細胞は１２日間成長させ、所望する細胞を同定することができるペプチド、好ましくは四量体で選択し、そして次に所望の細胞をＯＫＴ３およびＩＬ−２で拡大し；
ｂ．該昆虫細胞を、昆虫細胞を成長させるために適する培地、好ましくはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（商標）のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地で成長させ；
ｃ．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターからｐＲｍＨａ−３プラスミドを作成し、ここで該ｐＲｍＨａ−３プラスミドはメタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離したポリアデニレーションシグナルを持つアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含み；ｄ．該ｐＲｍＨａ−３プラスミドに、ＨＬＡヒトクラスＩ Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２，ＩＣＡＭ−１、β−２ミクログロブリンおよびＬＦＡ−３に相補的なＤＮＡを挿入し、ここでＡ２．１はヒト クラスＩ ＤＮＡ配列と置換されることができ；
ｅ．該昆虫細胞をｐｈｓｈｎｅｏプラスミドでトランスフェクトし、そして該ｐＲｍＨａ−３プラスミドは相補的ＤＮＡを含み；
ｆ．該昆虫細胞をＣｕＳＯ４と接触させて、該昆虫細胞中にトランスフェクトした遺伝子の発現を誘導する、
工程を含んでなる。
【００３４】
樹状細胞およびマクロファージのような専門的な抗原提示細胞は、ＩｇＥペプチド（Ｄａｌｖｏｔ−Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）同上）またはＩｇＥ組換えタンパク質（Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）同上）を載せることができ、またはＩｇＥまたはＩｇＥ断片をコードするウイルスで形質導入することができる（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）２０４：２９−３７）。これらの修飾された専門的な抗原−提示細胞は、次にＩｇＥ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を活性化するために使用され、そしてＩｇＥ特異的ＣＴＬｓをインビトロで生産することができる。あるいは非専門的な抗原提示細胞を、多数の共刺激分子をコードする多数の遺伝子に加えてＩｇＥおよびＩｇＥの断片をコードする遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入することもできる。ＩｇＥ特異的ＣＴＬｓを生成するために、修飾された非専門的な抗原提示細胞をこのように使用してＩｇＥ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を刺激することができる。
【００３５】
本発明の昆虫細胞は昆虫を成長させるために適する培地（今後「昆虫成長培地」と呼ぶ）中で成長させる。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（商標）ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地、グレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地およびＴＣ−１００昆虫培地のような昆虫成長培地が多数の会社から市販されている。あるいは昆虫成長培地は当業者が調製できる。典型的には培地には無機塩（例えば塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウム）、アミノ酸種々の炭水化物、および化学品（Ｉｍｏｇｅｎｅ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．（１９６４）１５６（１）：９１−１０４）のような昆虫の成長を促進および維持するために必要な成分を含む。あるいは培地はビタミン、ミネラルおよび昆虫の成分を助ける他の成分を含むこともできる。
【００３６】
以下は本明細書中で使用する略号および定義の一覧である。
【００３７】
略号
ＡＰＣ 抗原−提示細胞
ＣＤ８＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＦＡＳ ＣＤ９５としても知られるＴ細胞上のエピトープ
ＩＣＡＭ 細胞間接着分子
ＩＬ インターロイキン
ＬＦＡ リンパ球機能抗原
ＭＨＣ 主要組織適合複合体
ｎｎＡＰＣ 天然には存在しない抗原−提示細胞
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＰＢＳ リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＰＭＩ ローズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍ
ｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）
ＲＷＪＰＲＩ Ｔｈｅ Ｒ．Ｗ．ジョンソン製薬調査研究所
Ｔ 標的
ＴＣＲ Ｔ細胞抗原受容体
【００３８】
以下は種々のエピトープについて本明細書で使用する略号の一覧である。個々のアミノ酸残基は当業者に容易知られ、そして使用されている１文字コードに従い同定される。
アミノ酸 略号
３−文字 １−文字
アラニン ａｌａ Ａ
バリン ｖａｌ Ｖ
ロイシン ｌｅｕ Ｌ
イソロイシン ｉｌｅ Ｉ
プロリン ｐｒｏ Ｐ
フェニルアラニン ｐｈｅ Ｆ
トリプトファン ｔｙｒ Ｗ
メチオニン ｍｅｔ Ｍ
グリシン ｇｌｙ Ｇ
セリン ｓｅｒ Ｓ
トレオニン ｔｈｒ Ｔ
システイン ｃｙｓ Ｃ
チロシン ｔｙｒ Ｙ
アスパラギン ａｓｎ Ｎ
グルタミン ｇｌｎ Ｑ
アスパラギン酸 ａｓｐ Ｄ
グルタミン酸 ｇｌｕ Ｅ
リシン ｌｙｓ Ｋ
アルギニン ａｒｇ Ｒ
ヒスチジン ｈｉｓ Ｈ
【００３９】
ペプチドエピトープ略号
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １１はＫＰＣＫＧＴＡＳＭ（配列番号１）のアミノ酸配列を称する。
【００４０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ２０９はＩＰＰＳＰＬＤＬＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を称する。
【００４１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３６６はＧＳＮＱＧＦＦＩＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を称する。
【００４２】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ２９はＦＰＮＰＶＴＶＴＷ（配列番号４）のアミノ酸配列を称する。
【００４３】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １０５はＨＳＳＣＤＰＮＡＦ（配列番号５）のアミノ酸配列を称する。
【００４４】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １１４はＨＳＴＩＱＬＹＣＦ（配列番号６）のアミノ酸配列）を称する。
【００４５】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３６３はＫＳＮＧＳＮＱＧＦ（配列番号７）のアミノ酸配列を称する。
【００４６】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３０７はＲＳＡＰＥＶＹＶＦ（配列番号８）のアミノ酸配列を称する。
【００４７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４４はＭＳＴＶＮＦＰＡＬ（配列番号９）のアミノ酸配列を称する。
【００４８】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４１１はＴＳＬＧＮＴＳＬＲ（配列番号１０）のアミノ酸配列を称する。
【００４９】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １６はＴＡＳＭＴＬＧＣＬ（配列番号１１）のアミノ酸配列を称する。
【００５０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １５９はＡＳＴＣＳＫＬＮＩ（配列番号１２）のアミノ酸配列を称する。
【００５１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １２５はＧＨＩＬＮＤＶＳＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を称する。
【００５２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １７はＬＰＡＳＭＫＩＦＭ（配列番号１５）のアミノ酸配列を称する。
【００５３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８６はＲＰＦＩＶＧＬＷＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列を称する。
【００５４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １１８はＤＰＱＩＡＡＨＶＶ（配列番号１７）のアミノ酸配列を称する。
【００５５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２０はＱＳＶＨＬＧＧＶＦ（配列番号１８）のアミノ酸配列を称する。
【００５６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ９はＳＰＲＳＶＡＴＧＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列を称する。
【００５７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９５はＫＰＳＩＧＳＥＲＩ（配列番号２０）のアミノ酸配列を称する。
【００５８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２５２はＦＳＳＦＧＬＬＫＬ（配列番号２１）のアミノ酸配列を称する。
【００５９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ７はＱＰＳＰＲＳＶＡＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を称する。
【００６０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８１はＥＰＳＳＱＲＰＦＩ（配列番号２３）のアミノ酸配列を称する。
【００６１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ７９はＬＳＬＬＮＣＥＥＭ（配列番号２４）のアミノ酸配列を称する。
【００６２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １５２はＶＭＬＥＮＧＫＱＬ（配列番号２５）のアミノ酸配列を称する。
【００６３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １４６はＴＭＫＳＮＬＶＭＬ（配列番号２６）のアミノ酸配列を称する。
【００６４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２３５はＳＶＦＶＮＶＴＥＡ（配列番号２７）の
アミノ酸配列を称する。
【００６５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３８はＧＳＶＬＦＡＶＹＬ（配列番号２８）のアミノ酸配列を称する。
【００６６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９はＡＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号２９）のアミノ酸配列を称する。
【００６７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２４はＦＭＹＬＬＴＶＦＬ（配列番号３０）のアミノ酸配列を称する。
【００６８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６７はＧＬＹＹＩＹＡＱＶ（配列番号３１）のアミノ酸配列を称する。
【００６９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２はＫＩＦＭＹＬＬＴＶ（配列番号３２）のアミノ酸配列を称する。
【００７０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３６はＭＩＧＳＡＬＦＡＶ（配列番号３３）のアミノ酸配列を称する。
【００７１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ５８はＮＬＨＥＤＦＶＦＭ（配列番号３４）のアミノ酸配列を称する。
【００７２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １７０はＹＩＹＡＱＶＴＦＣ（配列番号３５）のアミノ酸配列を称する。
【００７３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２６はＹＬＬＴＶＦＬＩＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を称する。
【００７４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２３１はＬＱＰＧＡＳＶＦＶ（配列番号３７）のアミノ酸配列を称する。
【００７５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ４５はＹＬＨＲＲＬＤＫＩ（配列番号３８）のアミノ酸配列を称する。
【００７６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １４７はＴＭＳＮＮＬＶＴＬ（配列番号３９）のアミノ酸配列を称する。
【００７７】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２９はＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）のアミノ酸配列を称する。
【００７８】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６０はＱＬＴＶＫＲＱＧＬ（配列番号４１）のアミノ酸配列を称する。
【００７９】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ３５はＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）のアミノ酸配列を称する。
【００８０】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １８５はＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）のアミノ酸配列を称する。
【００８１】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １９はＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）のアミノ酸配列を称する。
【００８２】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １５３はＶＴＬＥＮＧＫＱＬ（配列番号４５）のアミノ酸配列を称する。
【００８３】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １２６はＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を称する。
【００８４】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２２７はＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）のアミノ酸配列を称する。
【００８５】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ ２０はＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）のアミノ酸配列を称する。
【００８６】
本明細書で使用する用語ＣＤ４０Ｌ １６５はＲＱＧＬＹＹＴＩＹＡ（配列番号４９）のアミノ酸配列を称する。
【００８７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ４７はＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）のアミノ酸配列を称する。
【００８８】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ９６はＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）のアミノ酸配列を称する。
【００８９】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ １８５はＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）のアミノ酸配列を称する。
【００９０】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ３０９はＡＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５３）のアミノ酸配列を称する。
【００９１】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８７６はＳＬＬＴＶＳＧＡＷＡ（配列番号５４）のアミノ酸配列を称する。
【００９２】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８３はＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶ（配列番号５５）のアミノ酸配列を称する。
【００９３】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８４はＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号５６）のアミノ酸配列を称する。
【００９４】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８８７はＱＭＦＴＣＲＶＡＨＴ（配列番号５７）のアミノ酸配列を称する。
【００９５】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９０はＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）のアミノ酸配列を称する。
【００９６】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９５はＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）のアミノ酸配列を称する。
【００９７】
本明細書で使用する用語ＩｇＥ ８９８はＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）のアミノ酸配列を称する。
【００９８】
用語および定義
本明細書で使用する用語「養子免疫療法」とは、疾患または疾患状態を処置するために供与体または自家Ｔリンパ球の投与を称し、ここで疾患または疾患状態はＨＬＡクラスＩ分子に通常関連する不十分または未熟な免疫応答をもたらす。養子免疫療法は、感染または形質転換した細胞の排除がＣＴＬｓより活性化されることが示された疾患または疾患状態の適切な処置である。例えば疾患または疾患状態には限定するわけではないが黒色腫、前立腺、胸部、結腸−直腸、胃、気管支および首、膵臓、頸部、卵巣、骨、白血病および肺ガンのような癌および／または腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス感染；およびマラリア；結核菌およびリステリア モノサイトゲネスのような細菌感染を含む。
【００９９】
本明細書で使用する用語「Ｂ７．１」とは、抗原−提示細胞に結合する共−刺激分子を称する。
【０１００】
本明細書で使用する用語「ＢＣＮＵ」は、１，３−ビス（２クロロエチル）−１−ニトロソウレアとしても知られているカルムスチンを称する。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「ＢＳＥ」は、ウシ海綿状脳症を称する。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「ＣＤ」は、クラスター オブ ディファレンシエーション（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、抗原エピトープおよび機能によりグループ分けされるＴリンパ球（元は）、Ｂリンパ球、単球、マクロファージおよび顆粒球を称する。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「ＤＴＩＣ」は、ダカルバジン、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドを称する。
【０１０４】
本明細書で使用する用語「エクスビボ」または「エクスビボ 治療」は、生物学的材料、典型的には細胞が患者から得られるか、または適当な供与体のような適当な代替的供給源から得られ、そして修飾されて修飾された細胞が、修飾された細胞により生成される治療的利益の長期送達または一定送達により改善される病理学的状態を処置するために使用できることを称する。処置には、患者または代替の供給源のいずれから得られた修飾された生物学的材料の患者への再導入を含む。エクスビボ治療の利益は、患者を処置からの望ましくない付帯的効果に暴露することなく患者に処置の利益を提供する能力である。例えばサイトカインは癌またはウイルス感染患者にしばしば投与されて、患者のＣＴＬｓの拡大を刺激する。しかしサイトカインは患者に流感様の症状の発症を引き起こすことが多い。エクスビボの手順では、患者の身体外でサイトカインを使用してＣＴＬｓの拡大を刺激し、そして患者にはサイトカインへの暴露および結果としてその副作用がない。あるいは適当な状況または条件下で、適当かつ個体が利益を引き出せる場合、個体を同時に低用量のα−インターフェロンで処置することもできる。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「ＨＥＰＥＳ」は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’２−エタンスルホン酸バッファーを称する。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「ＨＬＡ−Ａ２．１」は、約４５％のコーカサス人に見いだされるＨＬＡクラスＩ分子を称する。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「ＭＰＣ−１０」は磁気粒子濃縮器を称する。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「ＮＫ細胞」はナチュラルキラー細胞を称する。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「ＯＫＴ３」はＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体を称する。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「ＴＡＰ−１、２」は、抗原プロセッシング−１、２に関係するトランスポーター（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−１，２）を称する。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ細胞」は、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋を称する。
【０１１２】
本明細書で使用する用語「Ｃ−レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）」は卵巣癌に関連することが見いだされた配列のペプチドを称する。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む異なる種で記載された組織適合抗原系を包含することを意味する一般名称である。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「エピトープ」、「ペプチドエピトープ」、「抗原性ペプチド」および「免疫原性ペプチド」は、哺乳動物に細胞免疫応答を生じることができる抗原に由来するペプチドを称する。そのようなペプチドはペプチドで免疫感作した動物に由来する抗体に反応性となることができる。そのようなペプチドは約５〜２０個のアミノ酸長、好ましくは約８〜１５個のアミノ酸長、そして最も好ましくは約９〜１０個のアミノ酸長であることができる。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「同族体」は、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、そして本明細書に記載する本発明の機能的観点を示す本発明のポリペプチド配列と実質的に同一なアミノ酸残基の配列を有する任意のポリペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非−極性（疎水性）残基の別の残基との置換、アルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間のような１つの極性（親水性）残基の別の残基への置換、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのような塩基性残基の別の残基への置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸またはその他のような１つの酸性残基の置換を含む。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「保存的置換」には、非−誘導化残基の代わりに化学的に誘導化された残基の使用を含む。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「化学的誘導体」とは、官能性側基の反応により化学的に誘導化された１以上の残基を有する本ポリペプチドを称する。そのような誘導化分子の例は、例えば遊離のアミノ基が誘導化されてアミンヒドロクロライド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導化されて塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また化学的誘導体として含まれるのは、２０種の標準的アミノ酸の１以上の自然に存在するアミノ酸誘導体を含むタンパク質またはペプチドである。例えばプロリンを４−ヒドロキシプロリンに代えてもよく；リシンを５−ヒドロキシリシンに代えてもよく；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに代えてもよく；セリンをホモセリンに代えてもよく；そしてリシンをオルニチンに代えてもよい。本発明のタンパク質またはポ
リペプチドは必要な活性が維持される限り、１以上の付加および／または削除、またはコードされているポリペプチドの配列が本発明の核酸配列に対応するポリペプチドの配列に関する残基を有する任意のポリペプチドを含む。
【０１１８】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は、ウイルス感染対する防御の主な道筋である。ＣＤ８＋リンパ球はウイルスに感染した宿主細胞を特異的に認識し、そして殺す。理論的には癌を含む他の種類の疾患を克服するために免疫系を利用することが可能なはずである。しかしＣＴＬｓを特異的に活性化するために利用できたインビトロ／エクスビボの手順はほとんどない。本明細書で注目した重要なアレルギーおよび／または自己免疫抗原の同定、および以下に記載するＣＴＬｓの特異的インビトロ活性化法は今、アレルギーおよび／または自己免疫疾患の養子免疫療法の概念を試験できるようにする。
【０１１９】
すべての自然なＴ細胞には、免疫応答を誘導するための活性化に２つのシグナルを必要とする。ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬｓ）について、特異性を伝える第１シグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面に存在するクラスＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ）複合体に結合した抗原の免疫原性ペプチド断片（エピトープ）をＣＤ８＋リンパ球に提示することからなる。この複合体はシグナルを細胞内に連絡するＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識される。
【０１２０】
Ｔ細胞受容体への結合は必要であるが、Ｔ細胞活性化を誘導するには十分ではなく、そして通常は細胞の増殖またはサイトカイン分泌を導かない。完全な活性化には第２の共−刺激シグナル（１つまたは複数）が必要であり、これらのシグナルが活性化カスケードをさらに強化するために役立つ。抗原−提示細胞に関する共−刺激分子の中で、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１のような細胞接着分子（インテグリン）はＴ細胞上のＣＤ２８およびＬＦＡ−１にそれぞれ結合することによりこのプロセスを援助する。ＣＤ８＋細胞が適当な共刺激分子との相互作用の存在下で、ＭＨＣクラスＩ分子により結合された免疫原性ペプチド（エピトープ）を持つ抗原提示細胞と相互作用する時、ＣＤ８＋細胞は完全に細胞傷害性のＴ細胞になる。
【０１２１】
リンパ球が媒介する殺細胞には、ＣＤ８＋ＣＴＬが抗原を持つ標的（腫瘍）細胞に、Ｔ細胞活性化に関して上記のプロセスにより認識される手段により結合することから始まる一連の生物学的出来事が関与する。この相互作用はＡＰＣまたは標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合している抗原のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）への結合から始まる。リンパ球機能抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｔ細胞−共刺激因子（ＣＤ２、ＣＤ２８、Ｂ７）のようなアクセサリー分子は、細胞−細胞接着またはさらなる細胞活性化シグナルの伝達を強化する。
【０１２２】
細胞−細胞相互作用の後、ＣＴＬは標的細胞を可溶性の細胞溶解性メディエーター（Ｔ細胞中の細胞質顆粒に保存されたパーフォリンおよびグランザイム）およびＣＴＬ表面分子（ＦＡＳリガンド）の作用を通して殺す。細胞溶解的攻撃後、標的細胞はネクローシス（膜の穿孔および細胞小器官の破壊）またはアポトーシス（クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化および膜の泡状化）により死ぬ。
【０１２３】
リンパ球が媒介する細胞溶解のメカニズムを、図２にグラフ的に示す。図２のパネルＡでは、標的細胞に結合した後、パーフォリンおよびグランザイムを含む顆粒を細胞間間隙に放出するために、ＣＴＬ中の細胞質顆粒は急速に標的細胞に向けられる。これらのタンパク質溶解酵素は標的細胞の形質膜に孔を形成し、最終的に細胞のネクローシスを導く。パネルＢでは、標的細胞に結合した後、ＣＴＬ上のＦＡＳ発現レベルが上昇する。ＦＡＳと標的細胞上のＦＡＳ受容体との相互作用はアポトーシスを導く。ＣＰＰ３２のようなプロテアーゼおよび他のＩＬ−１ｂ−転換酵素（ＩＣＥ）に関する酵素がアポトーシスの誘
導に関係した。
【０１２４】
天然に存在する抗原−提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、自家腫瘍細胞をインビトロのＣＤ８＋活性化に使用することは可能である。しかしこのアプローチの後の活性化の効率は低い。これはナイーブＡＰＣのクラスＩ分子が腫瘍エピトープの外に多くの種類のペプチドエピトープを含むからである。ほとんどのペプチドは正常で無害な細胞タンパク質から派生し、腫瘍に対して実際に効果的である活性なナイーブＡＰＣｓの数を希釈する（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）７：６８２−６８６）。
【０１２５】
この問題に対するより直接的かつ効率的な取り組みは、特異的疾患（アレルギーおよび／または自己免疫疾患のような）を克服すること関連するエピトープだけでＣＤ８＋細胞を特異的に活性化することである。このために、人工抗原提示細胞を、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）細胞でＭＨＣクラスＩ分子を発現させることにより作成する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は免疫系を持たないので、ペプチドエピトープをクラスＩ分子に載せることに関与するＴＡＰ−１，２ペプチド輸送体が無い。その結果、クラスＩ分子は空の導管としてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞上に現れる。これらトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を、限定するわけではないが黒色腫特異的エピトープを含む癌または腫瘍に特異的なエピトープのようなクラスＩ分子に結合する外因性のペプチドとインキューベーションすることにより、幾つかのペプチドで各クラスＩ分子を占有することが可能である。これらショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡＰＣにおける１つのペプチドを含むクラスＩ分子の高密度発現により、抗原ペプチドに完全に特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞をインビトロで生成することが可能となる。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を調製するための方法および手順は、１９９６年６月２５日に発効された「ヒトクラスＩＭＨＣおよびβ２−ミクログロブリンを発現する昆虫細胞を使用した細胞傷害性Ｔ−細胞のインビトロ活性化（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ａｎｄ β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」という表題の米国特許第５，５２９，９２１号明細書、および１９９４年５月２４日に発効された「ＭＨＣクラスＩ抗原およびβ２−ミクログロブリンをコードする遺伝子を発現し、そして空の複合体を集成することができるショウジョウバエの細胞系および該細胞系の作成法（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｄ β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ
Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｅｍｐｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）」という表題の米国特許第５，３１４，８１３号明細書に教示されている。特に米国特許第５，５２９，９２１号明細書は、カラム２６、第５６行からカラム２８、第２２行に前駆体細胞のカルチャーを分離し、かつ／または濃縮する様々な方法を開示している。
【０１２６】
さらにこの特徴は種々のサイトカインを用いた免疫系のインビボ刺激の必要性を排除する。これによりサイトカインにより生じる副作用の先を行く処置をもたらす。あるいは適当な状況または条件下で、適切かつ個体が利益を導くことができる場合、個体は低用量のαインターフェロンを用いて同時に処置することができる。
【０１２７】
サイトカインを用いたインビボ刺激に関する必要性を排除することは、患者のケアの質の向上を提供する。サイトカインを患者に投与することを含む処置計画は、患者に悪心、吐き気および熱のような流感様の症状を生じることが多い。これらの副作用は一般に生命を脅かすものではないが、すでに衰弱した状態の患者に特に重篤な反応が起こると、生命
に危険な状態をもたら可能性がある。別の考察はそうでなければ有益な治療法の患者のアクセプタンスおよびコンプライアンスにそのような副作用が悪影響を及ぼすことである。サイトカインを用いたインビボ刺激の必要性を除去することにより患者の快適さを改善する治療計画をもたらし、そして患者が医師により従うようになる効果的な処置法を提供する。
【０１２８】
養子免疫療法のためのこの方法の用途は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスの２Ｃ系に由来するＡＰＣｓおよびＣＤ８＋細胞のようなトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を使用してマウスで証明された。この系では、精製したＣＤ８＋２Ｃ細胞が共−刺激分子Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１も持つＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるインビトロのペプチドに高度に反応性である。プライムしていない（ｕｎｐｒｉｍｅｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するための最少要件を決定するためのプローブとしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞をトランスフェクトした（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ＵＳＡ．（１９９６）９３：１４７３６−１４７４１）。あるいは精製された２Ｃ細胞の代わりに反応体として分離していないマウスの脾臓細胞を使用する時、共−刺激分子の必要性は適用しない。この場合、脾臓群中のＣＤ８＋細胞が、活性化されたＢ細胞から「傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）」の共−刺激を受容する。この知見を利用して、ＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、正常なＤＢＡ／２マウス脾臓細胞に、リンホカインを加えることなくインビトロで相乗的なＰ８１５肥満細胞腫−特異的ペプチドに対する応答を誘導できることを示すことが可能であった。これらのＣＴＬｓをＰ８１５肥満細胞腫を持つＤＢＡ／２マウスに注射すると、急速な腫瘍の退行を導いた（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４：５５５−５６４）。
【０１２９】
細胞傷害性Ｔリンパ球をインビトロで生成するために、任意の天然の、または人工的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）系を使用することは、これらの系が生成できる抗原の特異性により限定される。
【０１３０】
以下のＡＰＣ系は１つのエピトープに対する抗原−特異的ＣＴＬｓを生成するために利用されてきた：
１．定めたペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）；
２．リンパ芽球に向けられ、そしてペプチドを適用した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）；３．天然のペプチドが酸で剥がされ、そして目的のペプチドが載せられたリンパ芽球状の細胞系（ＬＣＬ）；
４．空のクラスＩ分子を発現するように操作したショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞；およびヒトクラスＩおよび共−刺激分子でトランスフェクトしたマウス３Ｔ３細胞（Ｊ−Ｂ．Ｌａｔｏｕｃｈｅ ａｎｄ Ｍ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０００）１８：４０５−４０９）。
【０１３１】
樹状細胞（ＤＣｓ）は１次抗原細胞の提示におけるそれらの広い応用により、ヒトにおける１次抗原提示細胞系と考えられる。自己または外来タンパク質はＤＣ中でプロセッシングされる。生じたペプチドエピトープはＨＬＡ分子により提示され、そしてＤＣの表面に輸送される。しかしＤＣｓは４種の異なるペプチドに向けられたＣＴＬｓをインビトロで一定して生成しないことが分かった。これは４種の各ペプチドに対応する活性を有するＣＴＬｓを提供した。さらにペプチドを適用した時点でＤＣの表現型は、成熟または未成熟で結果に影響しないことも分かった。
【０１３２】
あるいはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞刺激は通常、最高１０種の異なるペプチドに向けられたＣＴＬｓを生じた。これは１０種の各ペプチドに対して活性
であるＣＴＬｓを提供する。
【０１３３】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞およびＤＣがＣＴＬ応答を誘導する能力は、ＤＣｓおよびトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞の比較するために、最初に１つのペプチドエピトープに対して各々について標準的な刺激プロトコールに従い評価した。未成熟ＤＣｓは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で１週間、自家単球を培養することにより生成した。成熟ＤＣｓは回収の２４時間前に培養基にＴＮＦαを加えることにより未成熟ＤＣｓから得た。ＤＣｓ（未成熟および成熟）は、ＣＤ８細胞およびペプチド−適用ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の刺激について使用した手順に従い、回収し、ペプチドを適用し、そして精製したＣＤ８細胞と混合した。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は一般にＤＣよりもよい刺激物であることが分かった。さらに未成熟または成熟のいずれかの表現型を表すＤＣｓは、定めたペプチドをＡＰＣに適用するために使用した時、特異的なＣＴＬ応答の誘導においてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞ほど効率的ではなかった。これは免疫系においてＤＣｓが果たす優性の役割から特に驚くべきである。
【０１３４】
細胞傷害性リンパ球の調製
抗−ＣＤ８抗体を用いた陽性選択により白血球除去血サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２．１）、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＢ７．２を発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるペプチドに関係するＩｇＥおよび／またはＣＤ４０Ｌに対して刺激する。ＣＤ８＋細胞はＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下でペプチドエピトープを添加した自家単球で２回、再刺激する。ＣＴＬｓはＯＫＴ３およびＩＬ−２で非特異的に増大させる。ＣＴＬ活性は細胞に対して測定し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーで評価する。
【０１３５】
製造法およびプロトコールは、グッドラボラトリープラクティス（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）およびグッドマニファクチャリングプラクティス（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従い行う。「グッドラボラトリープラクティス」および「グッドマニファクチャリングプラクティス」は、研究および製造プラクティスの標準であり、これは米国食品医薬品局により設定され、そして当業者は容易に知っている。ＣＴＬｓは同一性、生存能、ＣＴＬ活性、ステリリティおよびエンドトキシン濃度について監視される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＩｇＥａ配列番号１４およびＩｇＥｂ配列番号５０定常領域のアミノ酸配列を、ベクターＮＴＩソフトウェアで並列配置した。２つの対立遺伝子間の配列の差異は太字または下線を付す。
【図２】パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ：ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＢＦ１／Ｊマウスのリンパ節（Ａ、ＢおよびＤ）、またはＢ６、インターフェロンγノックアウトマウス（ＩＦＮγ−／−）またはパーホリン（ＰＦ−／−）ノックアウトマウス（Ｃ）から精製した。精製したＣＤ８Ｔ細胞は、ＤｂＭＨＣクラスＩ、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）分子でトランスフェクトしたＳＣ２細胞により提示される、示したＩｇＥペプチドと培養した。低用量の組換えＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日目、そしてその後１日おきにカルチャーに加えた。９日目に、ＣＴＬ活性は示したＩｇＥペプチドを載せた、または載せていない５１Ｃｒ標識ＲＭＡＳ細胞に対して測定した。図２、パネルＤでは、抗−ＤｂｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）をＣＴＬアッセイの始めに加えた。
【図３】成体ＣＢＦ１／Ｊマウス（８〜１２週）は、１日および１４日目にそれぞれ水酸化アルミニウムで沈殿させた５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を腹腔内に免疫感作した。血清ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａは２８日目にＥＬＩＳＡにより測定した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。ＩｇＥ−特異的ＣＴＬまたは対照ＣＴＬ（５ｘ１０６）は各追加免疫から１日後に静脈内に与えた。血清ＩｇＧおよびＩｇＥは最後のＣＴＬ治療から２週間後に再度測定した。
【図４】パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ： ＣＢＦ１／Ｊマウスは図３のように免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、２つの異なる用量（５ｘ１０６および１０ｘ１０６）の抗−ＩｇＥ ＣＴＬを１日おき３日、静脈内に与えた。ＣＴＬ処置から３週間後、血清ＩｇＥおよびＯＶＡ−特異的ＩｇＥを測定し、そしてＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。最後の処置後、気管支胞肺洗浄液（ＢＡＬ）を集め、そしてＢＡＬ中の全細胞をカウントした。ＢＡＬ中のエオタキシンはＥＬＩＳＡにより測定し、そしてＢＡＬ中の好酸球細胞をＨＥ染色により区別した。
【図５】パネルＡおよびＢ： ＣＢＦ１／Ｊマウスは、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで１日および１４日目に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスは１日おきに３処置、ＰＢＳ、抗−ＩｇＥ ＣＴＬまたは対照ＣＴＬ（抗−インフルエンザＣＴＬ）の注射を受けた。最後の処置から３週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに３処置、鼻内に追加免疫した。ＯＶＡでの最後の処置から１日後、各マウスのメタコリンに対する気道応答性を全身プレトログラフィ（ｐｌｅｔｈｒｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。２回の独立した実験を、パネルＡおよびＢにそれぞれ示した。
【図６】パネルＡおよびＢ： 成体ＣＢＦ１／Ｊマウス（８〜１２週）は、１日および１４日目にそれぞれ水酸化アルミニウムで沈殿させた５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を腹腔内に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、マウスにＩｇＥ−特異的ＣＴＬ（５ｘ１０６）またはＰＢＳを静脈内に与えた。最後の処理から３週間後、マウスにＯＶＡを１日おきに２〜３処置、鼻内に追加免疫した。ＯＶＡでの最後の処置から１日後、各マウスからＢＡＬを調製し、そして各マウス由来の肺を固定し、そしてＨＥで染色した。ＰＢＳ（パネルＡ）を受容したマウスまたは抗−ＩｇＥＣＴＬ（パネルＢ）を受容したマウスに由来する肺組織の代表的ＨＥ染色を示した。
【図７】ヒトＩｇＥ定常領域をコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列。全ＲＮＡはヒトＩｇＥを生産するＵ２６６細胞系から調製した。全ＲＮＡを逆転写し、そして５’および３’ヒトＩｇＥ定常領域をそれぞれコードする２つのオリゴを用いてＰＣＲにより増幅した。ｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３ベクターにクローン化し、そして配列決定した。
【図８】ヒトＨＬＡ−Ａ２クラスＩｃＤＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を滴定濃度の示したペプチドまたは対照ペプチド（Ｈ６９０）と室温で一晩培養し、そしてさらに３７℃で２時間培養した。細胞を洗浄し、そして抗−ＨＬＡ−Ａ２ ｍＡｂで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。平均蛍光強度はＹ軸に示し、そしてペプチド濃度をＸ軸に示した。
【図９】パネルＡ，Ｂ、ＣおよびＤ： ＣＤ８Ｔ細胞は個々の供与体から精製し、そしてＨＬＡ−Ａ２、ｈＢ７−１、ｈＢ７−２、ｈＩＣＡＭ−１およびｈＬＦＡ−３分子でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と示したペプチドの存在下で培養した。６日間培養した後、低用量のｈＩＬ−２をカルチャーに加え、そしてペプチドを載せた自家接着細胞でさらに７日間、再刺激した。次いでＣＴＬを回収し、そして特異的な殺活性を示したペプチドを載せた５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞で標準的なクロム放出アッセイにより試験した。
【図１０】ヒトＩｇＥのアミノ酸配列は図６に記載するように誘導した。９個のアミノ酸を含む抗原性ペプチドには下線を付し、そして１０個のアミノ酸を含む抗原性ペプチドは太字で示す。
【図１１】ＴＡＰ２欠損ＲＭＡ．Ｓ細胞（右パネル）またはＬｄでトランスフェクトしたＲＭＡ．Ｓ細胞（左パネル）を、示した濃度のペプチドで２８℃にて一晩インキューベーションし、そして次いで３７℃で２〜４時間インキューベーションした。細胞を回収し、そしてＬｄ（右パネル）またはＤｂ（左パネル）に特異的なｍＡｂで染色し、そしてＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【図１２】ＣＤ８＋Ｔ細胞はＢ１０．Ｄ２マウスのＬＮから精製し、そしてＬｄ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＣＤ４０Ｌ．１８６ペプチド（左パネル）またはＱＬ９ペプチド（右パネル）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目に、ＣＴＬ活性を示したペプチドの存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡＳ．Ｌｄ標的細胞に対して測定した。
【図１３】Ｂ６マウスに由来する精製したＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｄｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を、ＩｇＥ．４４ペプチド（左パネル）またはＩｇＥ．３６６ペプチド（右パネル）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を３および５日目にカルチャーに加えた。ＣＴＬを７日目に回収し、そしてそれらの特異的活性を示したペプチドの存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。
【図１４】パネルＡおよびＢ： 精製したＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞は、プレートに結合した抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４０時間（上パネル）または示した時間（下パネル）活性化し、そして示したｍＡｂ．１で染色した。
【図１５】ＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬは図２に記載するように生成した。標的として使用したＣＤ４細胞は、野生型、ＣＤ４０Ｌ−／−またはμ２ｍ−／−マウスから精製し、そして抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４０時間活性化した。
【図１６】Ｂ１０．Ｄ２（上パネル）またはＢ６（下パネル）はＯＶＡ＋ＣＦＡで免疫感作し、そしてＡｂまたはＣＴＬで示したように処置した。脾臓細胞はＯＶＡ−生産Ｂ細胞についてＥＬＩＳＡスポットにより免疫感作から２１日後に測定した。
【図１７】パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ Ｂ１０．２マウスは、１日目にＯＶＡ＋ＣＦＡで免疫感作した。抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬまたは抗−ＣＤ４０Ｌ Ａｂは１、３、５日目に与えた。血清を１４日目に集め、そしてＯＶＡ特異的免疫グロブリンをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１８】パネルＡ、ＢおよびＣ： ＣＤ８Ｔ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスから精製し、そしてＤｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＩｇＥ．４４ペプチド（Ａ）、ＩｇＥ．３６６ペプチド（Ｂ）およびＩｇＥ／１２５（Ｃ）の存在下で培養した。ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目にＣＴＬを回収し、そしてそれらの特異的な殺活性を示したペプチドの存在下または不存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。
【図１９】Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、パーホリンノックアウトマウス（ｐｆ−／−）およびＩＦＮγノックアウトマウス（ＩＦＮγ−／−）から精製したＣＤ８Ｔ細胞は、Ｄｂ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞と、ＩｇＥ．４４ペプチドの存在下で培養した。ＩＬ−２０（２０単位／ｍｌ）を３日および５日目にカルチャーに加えた。７日目にＣＴＬを試験し、そしてそれらの特異的な殺活性をＩｇＥ．４４ペプチドの存在下または不存在下にて５１Ｃｒ標識ＲＭＡ．Ｓ標的細胞に対して測定した。パネルＡでは、ＣＴＬ活性を１０μｇ／ｍｌの抗−Ｄｂモノクローナル抗体の存在または不存在下で測定した。
【図２０】ＣＤ１９＋Ｂ細胞はヒトＰＢＭＣから精製し、そしてＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）および抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（５ｍｇ／ｍｌ）と培養した。抗−ＩｇＥ ＣＴＬを図９に記載したように示したＩｇＥペプチド（Ｂ）ＩｇＥ４７および９６、（Ｃ）ＩｇＥ８８４および８９０の存在下で生成した。ＣＴＬは４日目にカルチャーＢおよびＣに加えた。６日目に、培養上清を集め、そしてヒトＩｇＥをＥＬＩＳＡにより測定した。カルチャーＡでは、ＣＴＬを加えず、そしてカルチャーＤにはＢ細胞を加えなかった。
【０１３７】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのものであり、限定するものではない。
【実施例１】
【０１３８】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の抗原提示細胞の製造
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｓ２細胞系はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（オレゴン−Ｒ）の卵から公開された手順に従い調製し、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＲＬ １０９７４）に寄託した。Ｓ２細胞は１０％ウシ胎児血清を補充した市販のシュナイダーのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）培地で成長させる。
【０１３９】
ＭＨＣクラスＩおよび共刺激タンパク質をＳ２細胞中で発現させるためのｐＲｍＨａ−３プラスミドベクターは、文献に記載されたように構築したｐＲｍＨａ−１発現ベクターに由来した。これはメタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から単離したポリアデニレーションシグナルを持つアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
【０１４０】
トランスフェクション用の相補的ＤＮＡは以下のように調製した：
ＨＬＡ−Ａ２．１およびβ−ミクログロブリン：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
Ｂ７．１：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
ＩＣＡＭ−１：公開された配列に由来するプライマーを使用したＫ５６２細胞からの逆転写ＰＣＲ。
Ｂ７．２：公開された配列に由来するプライマーを使用したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ。
ＬＦＡ−３：公開された配列に由来するプライマーを使用したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２４０）からの逆転写ＰＣＲ。
【０１４１】
相補的ＤＮＡは個々にｐＲｍＨａ−３ベクターに挿入した。Ｓ２細胞はＨＬＡ−Ａ．２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１プラスミドＤＮＡおよびｐｈｓｈｎｅｏプラスミドの混合物を用いてリン酸カルシウム沈殿法を使用してトランスフェクトした。安定にトランスフェクトした細胞は、ジェネティシンを含むシュナイダーの培地中で培養することにより選択した。使用する２４時間前、トランスフェクトした遺伝子の発現をＣｕＳＯ４の添加により誘導した。発現レベルは抗−ＨＬＡ−Ａ２．１、抗−Ｂ７．１および抗−ＩＣＡＭ−１抗体を使用してフローサイトメトリーにより評価した。細胞の３０％より多いＨＬＡ発現が、ＣＤ８＋リンパ球の効率的なインビトロ活性化に必要である。
【０１４２】
ヒトＣＤ８＋細胞の単離
ＣＤ８＋細胞は白血球除去血サンプルから、Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標）単離法（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））を使用した陽性選択により単離した。抗−ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体（ヒトガンマグロブリン［Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）］中の５０μｇ／ｍｌ）を、１％ヒト血清アルブミン（バクスター−ハイランド（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）および０．２％クエン酸Ｎａを補充したダルベッコのＰＢＳ中の洗浄した細胞に加える。ゆるやかに混合しながら４℃で４５分間インキューベーションした後、細胞を洗浄し、そしてヒツジ抗−マウスＩｇＧでコートしたダイナルの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））を含む同じバッファー中に再懸濁する（１：１のビーズ：細胞比）。細胞およびビーズを滅菌した試験管に入れ、そして４℃で４５分間ゆるやかに混合する。この時間の終わりに、抗体に結合した細胞は製造元の使用説明（ダイナル）に従いＭＰＣ−１（商標）分離機を使用して磁気的に取り出す。ＣＤ８細胞−ビーズ複合体の解離は、ＣＤ８ペプチド５９−７０（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ、配列番号５２）の存在下、３７℃で４５分間インキューベーションすることにより達成する。遊離のビーズは磁気的に除去し、そしてＣＤ８細胞は純度を評価するためにフローサイトメトリーによりカウントし、そして分析する。ＣＤ８＋細胞の回収は典型的には８０％より多い。表１は抗−ＣＤ８−抗体を
用いた陽性選択により、正常ヒトＰＢＭＣ調製物からの１４の別個のＣＤ８＋調製物の細胞組成をまとめる。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
精製したヒトＣＤ８＋細胞のインビトロ免疫感作
初回刺激：トランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞は１０％ウシ胎児血清およびＣｕＳＯ４を補充したシュナイダーの培地中で（１０６細胞／ｍｌ）、２７℃にて２４時間インキューベーションする。細胞を回収し、洗浄し、そして１００μｇ／ｍｌのヒトチロシナーゼ３６９−３７７（ＲＷＪＰＲＩ）を含む昆虫Ｘ−プレス（ｐｒｅｓｓ）培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）に再懸濁する。２７℃にて３時間インキューベーションした後、Ｓ２細胞をＣＤ８＋細胞と、１：１０の比率で１０％自家血清を補充したＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中にて混合する。細胞混合物を３７℃で４日間インキューベーションし、この間、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞は死ぬ。５日目に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を培地交換と共に加え、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ群に増大させる。
【０１４５】
再−刺激：白血球除去血の時点で得た、凍結した自家ＣＤ８−欠乏ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、そして１０％自家血清（β２ミクログロフリンの供給源として）および２０μｇ／ｍｌのペプチドエピトープを含むＲＰＭＩ培地中に、１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。γ−照射（５，０００ラド）の後、細胞を３７℃で２時間インキューベーションする。非−接着細胞はダルベッコのＰＢＳで洗浄することにより除去する。接着単球は１０％自家血清および１０μｇ／ｍｌのペプチドエピトープを含むＨｅｐｅｓ−緩衝化ＲＰＭＩ培地中で９０分間インキューベーションすることによりチロシナーゼエピトープを載せる。上清を除去し、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）−活性化ＣＤ８＋細胞懸濁液（１０％自家血清を含むＲＰＭＩ培地中の３ｘ１０６細胞／ｍｌ）を１０のＣＤ８＋細胞対１の接着単球の比率で加える。３７℃で培養の３〜４日後、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍｌ）を、培地交換と共に加え、エピトープ特異的ＣＴＬ群を選択的に増大させる。
【０１４６】
非−特異的拡大：ＣＤ８を非特異的に拡大させ、そしてそれらを自家血清、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ（商標）３）、ＩＬ−２およびγ照射した自家ＰＢＭＣを補充したＲＰＭＩ培地中で培養する。
【０１４７】
活性および純度に関するアッセイ
ＣＴＬアッセイ：エピトープを持つ（標的）細胞を５１Ｃｒ放出アッセイで標的細胞として使用する。４％ウシ胎児血清、１％ＨＥＰＥＳバッファーおよび０．２５％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ培地中の５ｘ１０６の標的細胞を、３７℃で１時間、０．１ｍＣｉの
５１Ｃｒで標識する。細胞を４回洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））中で１０５細胞／ｍｌに希釈する。９６−ウェルのマイクロタイタープレート中で、１００μｌのエフェクターＣＴＬおよび１００μｌのペプチドを載せた５１Ｃｒ−標識標的細胞を１００：１、２０：１および４：１（エフェクター：標的）の割合で合わせる。Ｋ５６２細胞を２０：１（Ｋ５６２）の比率で加えて、ナチュラルキラー細胞のバックグラウンド溶解を減少させる。非−特異的溶解は５１Ｃｒで標識した細胞を使用して上記のように評価するがエピトープを持たない。５１Ｃｒの自然な放出および最大放出を測定するための対照を二連で含める。３７℃で６時間インキューベーションした後、プレートを遠心し、そして上清をカウントして５１Ｃｒ放出を測定する。
【０１４８】
特異的溶解の割合は以下の式を使用して算出する：
【０１４９】
【数１】
【０１５０】
フローサイトメトリー：インビトロ活性化前および後のＣＤ８＋細胞は、蛍光モノクローナル抗体およびＦＡＣＳ分析を使用して細胞表面マーカーの数について分析した。健康な供与体に由来する細胞を使用した典型的な活性化プロトコールからの結果を表２に示す。
【０１５１】
【表２】
【０１５２】
活性および純度に加えて、ＣＴＬ調製物はステリリティおよびエンドトキシン含量についてもアッセイする。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】
【表４】
【実施例２】
【０１５５】
ＩｇＥ生産細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞注入の試み
試験の提案
この実施例は、以下の要因に従い評価されるアレルギー疾患の処置における細胞傷害性Ｔ細胞注入の効力を教示する。
１．インビトロ免疫感作後の再注入自家ＣＴＬの安全性および寛容（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ）
２．限界希釈分析を考慮した全身循環における注入ＣＴＬの動力学
３．ラジオシンチグラフィーによるＣＴＬの全身配置（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）
４．免疫組織学による生検小節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）；および
５．測定可能な損傷の退行および２カ月間にわたる応答期間
【０１５６】
エクスビボで生成した自家ＣＴＬでの処置
すべての患者は少なくとも１回の自家ＣＴＬ注入を受ける。各患者に投与したサイクル数および細胞の用量は表１にまとめる。インビトロで生成した細胞数は、アフェレーシス（ａｐｈａｅｒｅｓｉｓ）法から単離したＰＢＭＣ数および各ＰＢＭＣ調製物に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞数のような患者に関連する因子に依存する。インビトロで生成した細胞のすべてが供与体に再注入されるので、各患者に投与される用量は必然的に変動する。患者
間の用量を標準化するために、計算された「効力」スコアを各用量について記録する。この値は細胞の総数にペプチドを載せた標的細胞で得られた溶解活性を掛けることにより得られる。患者は各サイクルの終わりの彼らの臨床的状態に基づき、第２、３または４サイクルの処置に入る。単離される自然なＣＤ８＋Ｔ細胞の総数は、各ＰＢＭＣ調製物中のその割合に依存する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は患者間で変動する。エクスビボでのＣＴＬの生成に関する手順は、明細書および上記実施例１に教示されている。
【０１５７】
ＩＦＮα−２ｂに応答するクラスＩおよび黒色腫関連抗原のアップレギュレーション
抗原特異的なＣＴＬがＩｇＥ生産細胞をインビボで溶解する能力を強化する試みでは、低用量のＩＦＮα−２ｂをＣＴＬ注入前に５日間連続して投与し、そしてさらに４週間、週に３回投与する。サイトカインに対するインビボ応答を測定する１つの方法は、連続的な時点で得た生検体を特異的抗体を用いた陽性染色に関して免疫組織化学的分析により評価することである。
【０１５８】
エクスビボで生成したＣＴＬの抗原特異性
すべての患者から生成したＣＴＬは、生検材料が系を樹立するために利用できれば、放出の日にペプチドを載せたＴ２標的、ＨＬＡ−Ａ２ ＩｇＥ生産Ｍ−１４クローン４細胞系および自家Ｍ−１４細胞系に対して評価する。細胞の各調製用量は、その細胞溶解活性について評価する。いずれかの各ペプチドのみ、またはすべてのペプチドを同時に提示するペプチドを載せたＴ２細胞を使用して、各患者について生じるＣＴＬ応答の特異性を決定する。内因的に発現した、ＨＬＡ−Ａ２に結合した抗原を持つ細胞を溶解する能力は、ＨＬＡ−Ａ２に合った系または自家細胞系を用いて評価する。細胞溶解活性に加えて、抗原−特異性は、特異的なペプチド刺激に応答して作られる細胞内ガンマインターフェロン生産を検出するために確立された方法を用いて評価する。エクスビボのプロトコールの終わりに、生成したＣＴＬはこの方法により評価する。各ペプチドに特異的な細胞の割合を各々記録する。患者に由来する各々の大量のＣＤ８カルチャーの特異的細胞の総数は、そのＴ細胞群で検出される各ペプチド特異性を加えることにより算出する。特異的細胞の総数における増加が、各連続的処理サイクルで検出される。
【０１５９】
アネルギー状態の存在はＣＴＬを生成する能力を排除せず、または臨床的応答を防止しなかった
このプロトコール下で処置された患者のほとんどが、事前に医学的介入を受けている。前処置皮膚試験を行って、７種の共通抗原のパネルに対するアネルギー応答がエクスビボでＣＴＬを生成できないこと、または証明された臨床的応答の防止に相関するかどうかを決定する。エクスビボでＣＴＬを生成する能力は患者の前処置皮膚試験の結果と相関しない。
【実施例３】
【０１６０】
ＩｇＥはアレルギー性喘息の病因に本質的な役割を果たす。ここで我々は、ＩｇＥ分子に由来する抗原性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、人工的な抗原提示細胞により提示されるＩｇＥペプチドを用いて休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞を刺激することによりインビトロで生成できることを示す。ＩｇＥ特異的ＣＴＬはＩｇＥペプチドを載せた標的細胞をインビトロで溶解し、そしてインビボでＩｇＥ応答に特異的な抗原を抑制する。さらにＩｇＥ特異的ＣＴＬを喘息マウスモデルに養子移入すると、肺の炎症および気道の過敏性の発症を抑えることができる。すなわちＩｇＥ特異的ＣＴＬはアレルギー性喘息および他のＩｇＥ−媒介アレルギー疾患の処置を提供することができる。
【０１６１】
細胞傷害性Ｔリンパ球は休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞に由来する。抗原および共刺激物の存在下で、休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そして武装した細胞傷害性Ｔ細胞に分化し、これが抗原を発現する標的細胞を破壊することができる。ＣＴＬは
感染した細胞の溶解により、および／またはＣＴＬが生産するサイトカインの効果を通してウイルスおよび細胞内の病原体に対する免疫に必須な役割を果たす。
【０１６２】
ＩｇＥタンパク質配列に由来する抗原性ペプチドの同定：
マウスＩｇＥの２つの対立遺伝子（ＩｇＥａおよびＩｇＥｂ）はすでに記載された（ＰＯ６３３６）。ＩｇＥａおよびＩｇＥｂのアミノ酸配列の並列配置により、９５％のアミノ酸配列が同一であることが示された。１４個のアミノ酸の差異がＣＨ１とＣＨ２間の連結領域に位置し、そして別の５個のアミノ酸の差異がＣＨ３とＣＨ４間の連結領域に位置する。ＩｇＥｂのアミノ酸配列をＬｄおよびＤｂＭＨＣクラスＩ分子に関する結合モチーフを含む９ｍｅｒのペプチド配列について、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／で利用可能なバイオインフォーマチックス＆モレキュラーアナリシスセクション（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ）のソフトウェアを使用することにより分析した。このプログラムはＭＨＣクラスＩ分子に対して予測される解離のハーフタイム（ｈａｌｆ ｔｉｍｅ）に基づき有力なノナペプチドの順位をつける。順位付けの分析に基づき、Ｌｄ結合モチーフを持つ８個のペプチドおよびＤｂ結合モチーフを持つ５個のペプチドが合成に選択された（表１）。
【０１６３】
これら合成ペプチドのＬｄおよびＤｂクラスＩ分子への結合能力は、ＭＨＣクラスＩ安定化アッセイで試験した（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）同上）。抗原−輸送欠損（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）（ＴＡＰ−）ＲＭＡＳ細胞（Ｈ−２ｂ）またはＬｄトランスフェクトＲＭＡＳ（ＲＭＡＳ−Ｌｄ）細胞を、滴定濃度のペプチドの存在下、２７℃で培養した。２７℃で一晩培養した後、これらの細胞をさらに２時間、３７℃で培養し、そして細胞上のＬｄおよびＤｂの表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。表１に示すように、２つのＩｇＥペプチド、ＩｇＥ１１およびＩｇＥ３６６がＬｄに強く結合し、一方、ＩｇＥ１１４はＬｄに弱く結合する。Ｄｂに結合すると予測された５個のペプチドの中で、ＩｇＥ４４だけがＤｂに強く結合し、そして２つのペプチドＩｇＥ１６およびＩｇＥ１２５はＤｂに弱く結合する。興味深いことには始めにＬｄに結合すると予想されたＩｇＥ３６６が、ＬｄおよびＤｂの両方に結合した。すなわち全部で６個のペプチドがＬｄまたはＤｂＭＨＣクラスＩ分子のいずれかに結合すると同定された。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
ＩｇＥペプチドに特異的なＣＴＬのインビトロでの生成
これらのＩｇＥペプチドがＣＴＬ応答を誘導する能力をインビトロで評価した。すでに記載したように、ＭＨＣクラスＩに加えてＢ７−１およびＩＣＡＭ−１でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、インビトロで休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞の活性化において有力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞をマウスのリンパ節から精製し、そしてＬｄまたはＤｂに加えてＢ７−１およびＩＣＡＭでトランスフェクトしたペプチドを載せたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞と、サイトカインの不存在下で培養した。ＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を３日目に加え、そしてその後、１日おきに加えた。ペプチドを載せたＲＭＡＳ（Ｋ
ｂ、Ｄｂ）細胞またはＲＭＡＳ−Ｌｄ細胞に対するＣＴＬ活性を９日目に測定した。図１に示すように、ＩｇＥ４４ペプチドにより誘導されるＣＴＬは、ＩｇＥ４４ペプチドを載せたＲＭＡＳ細胞を特異的に溶解し、標的細胞単独または他のＩｇＥペプチドを載せた標的細胞のいずれもＩｇＥ４４特異的ＣＴＬにより認識されなかった。
【０１６６】
特異的ＣＴＬ活性は、Ｄｂに結合することが示されたＩｇＥ１６またはＩｇＥ１２５ペプチドにより誘導されなかった。ＩｇＥ３６６は元はＬｄ結合ペプチドとして同定され、興味深いことには、ＩｇＥ３６６によるＬｄ拘束性ＣＴＬを誘導することに加えて、ＩｇＥ３６６はＤｂ拘束性ＣＴＬも誘導する（図２、パネルＢ）。３個のＬｄ結合ペプチドの中で、ＩｇＥ３６６に加えてＩｇＥ１１も抗原特異的ＣＴＬを誘導する、ＩｇＥ特異的ＣＴＬの殺しはパーフォリン依存的であり、そしてＩＦＮγの発現からは独立している（図２、パネルＣ）。さらにＩｇＥペプチドにより誘導されるＣＴＬは、ＩｇＥ４４特異的ＣＴＬによるＩｇＥ４４を載せたＲＭＡＳ標的の殺しが抗−ＤｂｍＡｂにより完全に遮断されたので、ＭＨＣ拘束性である（図２、パネルＤ）。これらＣＴＬのＦＡＣＳ分析では、それらがαβＴＣＲ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、そしてＮＫ細胞マーカー（ＤＸ５またはＮＫ１．１）の発現がこれらの細胞上では検出されなかったことを明らかにした（データは示さず）。
【０１６７】
抗−ＩｇＥ特異的ＣＴＬによるＩｇＥ応答の抑制
ＩｇＥペプチドにより誘導されるＣＴＬはインビトロで標的細胞を特異的に殺すので、これらのＣＴＬがＩｇＥ応答をインビボで抑制することができれば興味深いと考えた。マウスは大変低い血清ＩｇＥを有し、そしてアレルギー応答を自然には生じない。水酸化アルミニウムで沈殿した卵白アルブミンを使用してマウスに抗原特異的ＩｇＥ応答を誘導した。図３に示すように、ＯＶＡに水酸化アルミニウムを加えて用いた２回の免疫感作後、免疫感作したマウス中の全血清ＩｇＥおよび卵白特異的ＩｇＥの両方は高く、そしてＩｇＥレベルはこれらのマウスをＯＶＡで鼻内追加免疫した後にさらに上昇した。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
ａ成体ＣＢＦ１／Ｊマウスは、１日および１４日に５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）に加えて水酸化アルミニウムで腹腔内に免疫感作した。２回目の免疫感作から２週間後、５ｘ１０６抗−ＩｇＥ ＣＴＬまたは対照ＣＴＬまたはＰＢＳを１日おきに３回与えた。最後のＣＴＬ処置から３週間後、１日おきに３回、マウスの鼻内にＯＶＡを追加免疫した。最後の追加免疫から１日後、気管支の胞肺洗浄液を集め、そして肺組織を各マウスから集め、そしてＨＥ染色により染めた。各マウスの肺の炎症は病理学者により別個に評価された。
ｂスコア：０＝正常；Ｔ＝微量；ｌ＝おだやか；２＝おだやかから中程度；３＝中程度；４＝重度
ｃＢＡＬＴ＝気管支関連リンパ球過形成
【０１７０】
【表７】
【０１７１】
【表８】
【実施例４】
【０１７２】
特異抗原および共刺激の存在下で、休止しているＣＤ８Ｔ細胞は活性化され、そしてＣＴＬに分化することができ、これは抗−ウイルス免疫応答に本質的な役割を果たす。最近、インビトロで生成された腫瘍に関係する抗原に特異的なＣＴＬを癌患者の処置に使用できることが示された。我々は今、非−腫瘍自己抗原に由来する抗原性ペプチドがインビトロで特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導できることを示す。活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に一時的に発現される自己抗原である、ＣＤ４０Ｌから同定されたペプチドにより誘導されるＣＴＬは、活性化ＣＤ４細胞を殺すことができ、そしてこの殺しは拘束性クラスＩ分子に特異的な抗体（Ａｂ）によるか、またはＣＤ８分子を認識するＡｂのいずれかにより遮断することができる。さらにＣＤ４０Ｌ−／−マウスから、または２ｍ−／−マウスから生成した活性化ＣＤ４Ｔ細胞のいずれもＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬにより殺されず、ＣＤ４０Ｌ特異的ＣＴＬによる活性化ＣＤ４Ｔ細胞の殺しは、抗原−依存的かつＭＨＣに拘束性である。重要なことはＣＤ４０Ｌに特異的なインビトロで生成したＣＴＬがインビボですべてのアイソタイプのＣＤ４−依存的抗体応答を抑制する点である。対照的に、ＩｇＥに由来する抗原性ペプチドにより誘導されるＣＴＬはＩｇＥ応答を抑制し、そしてＣＤ４０Ｌ−特異的ＣＴＬの若い段階でのＮＯＤマウスへの養子移入は、ＮＯＤマウスに糖尿病の発症を遅らせる。すなわち活性化ＣＤ４Ｔ細胞上に発現する非腫瘍自己−抗原に
特異的なインビトロで生成したＣＴＬは、インビボで免疫を調節することができる。
【０１７３】
枯草熱、喘息および全身性アナフィラキシーのようなアレルギー疾患は、無害物質に対する免疫応答である。疾患の顕著な特徴はＣＤ４細胞の活性化およびＢ細胞によるＩｇＥの過剰生産である。現在の治療は症状の処置に集中し、そして疾患の発症および進行を防ぐものではない。アレルゲン−活性化ＣＤ４細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞はアレルギーの病因に中心的な役割を果たしているので、我々の方法は自家ＣＴＬを使用して活性化ＣＤ４Ｔ細胞およびＩｇＥ生産Ｂ細胞を排除し、これにより疾患の発症および進行を防止する。２つの分子、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＩｇＥは、ＣＴＬ療法の標的抗原として選択した。ＣＤ４０Ｌに由来する３種の抗原性ペプチドおよびＩｇＥに由来する２種の抗原性ペプチドを同定した。これらのペプチドに対して特異的なＣＴＬを生成し、そしてこれらＣＴＬの機能をインビトロおよびインビボの両方で評価した。
【０１７４】
ＣＤ４０Ｌに由来する３種の抗原性エピトープおよびＩｇＥ分子に由来する２種のエピトープを同定した。抗原性エピトープの合成ペプチドはクラスＩ分子に結合し、そして休止している自然なＣＤ８Ｔ細胞をインビトロで活性化することができた。
【０１７５】
ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１分子を発現しているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により提示されるＣＤ４０ＬまたはＩｇＥペプチドを持つＣＤ８Ｔ細胞の刺激により生成された。インビトロでこのように生成したＣＴＬは、ペプチドを載せた標的細胞を特異的に殺した。ＣＤ４０Ｌ−ペプチド特異的ＣＴＬは活性化ＣＤ４Ｔ細胞を殺し、そしてその認識はＣＤ４０ＬおよびＭＨＣクラスＩ分子の発現に依存した。
【０１７６】
ＣＤ４０Ｌ−特異的ＣＴＬの機能は、インビボでも評価した。抗原−特異的抗体応答は、抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬにより抑制された。抗−ＣＤ４０Ｌ ＣＴＬおよび抗−ＩｇＥ
ＣＴＬのアレルギーおよび自己免疫疾患に及ぼす効果は、動物モデルで調査する。
【０１７７】
【表９】
【０１７８】
【表１０】
【０１７９】
【表１１】
【０１８０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞はＰＢＭＣから精製し、そしてＡ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１
でトランスフェクトしたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞とＩｇＥペプチドの存在下で培養した。統計ではＩｇＥペプチドが異なる供与体から特異的ＣＴＬ応答を生成する能力が示された。１および２は抗−ＩｇＥ ＣＴＬが９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒからそれぞれ生成されたことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、
該自己抗原ペプチドがＩｇＥタンパク質からのペプチドであり、そしてＴＱＳＰＳＶＦＰＬ（配列番号６４）、ＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）、ＴＭＴＬＰＡＴＴＬ（配列番号６９）、ＴＬＰＡＴＴＬＴＬ（配列番号６７）、ＴＬＳＧＨＹＡＴＩ（配列番号６８）、ＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）、ＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）、ＡＬＭＲＳＴＴＫＫＴ（配列番号６５）、ＮＦＭＰＥＤＩＳＶ（配列番号７９）、ＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）、ＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号：５６）、ＳＶＱＷＬＨＮＥＶ（配列番号：７６）、ＱＷＬＨＮＥＶＱＬ（配列番号８０）、ＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）およびＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）からなる群より選ばれ、かつ、
該ＣＤ＋Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養されることにより選択的に活性化されたものであり、かつ、
該ＡＰＣは前記非腫瘍自己抗原ペプチドの一つが載せられている、上記前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２】
標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、
該自己抗原ペプチドがＣＤ４０Ｌタンパク質からのペプチドであり、そしてＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）、ＱＬＴＶＫＲＱＲＬ（配列番号４１）、ＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）、ＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）、ＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）、ＶＴＬＥＮＧＫＱＬＬ（配列番号４５）、ＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）、ＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）、ＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）およびＲＱＧＬＹＹＩＹＡ（配列番号４９）からなる群より選ばれる、上記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項３】
細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子およびヒトＩｇＥまたはヒトＣＤ４０Ｌからの少なくとも１つの抗原ペプチドを含むキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の非天然抗原提示細胞。
【請求項４】
少なくとも１つのヒトＩｇＥ抗原ペプチドが、ＴＱＳＰＳＶＦＰＬ（配列番号６４）、ＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）、ＴＭＴＬＰＡＴＴＬ（配列番号６９）、ＴＬＰＡＴＴＬＴＬ（配列番号６７）、ＴＬＳＧＨＹＡＴＩ（配列番号６８）、ＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）、ＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）、ＡＬＭＲＳＴＴＫＫＴ（配列番号６５）、ＮＦＭＰＥＤＩＳＶ（配列番号７９）、ＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）、ＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号５６）、ＳＶＱＷＬＨＮＥＶ（配列番号７６）、ＱＷＬＨＮＥＶＱＬ（配列番号８０）、ＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）およびＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）からなる群より選ばれる請求項３記載の細胞。
【請求項５】
少なくとも１つのヒトＣＤ４０Ｌペプチドが、ＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）、ＱＬＴＶＫＲＱＲＬ（配列番号４１）、ＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）、ＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）、ＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）、ＶＴＬＥＮＧＫＱＬＬ（配列番号４５）、ＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）、ＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）、ＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）およびＲＱＧＬＹＹＩＹＡ（配列番号４９）からなる群より選ばれる、請求項３記載の細胞。
【請求項１】
標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、
該自己抗原ペプチドがＩｇＥタンパク質からのペプチドであり、そしてＴＱＳＰＳＶＦＰＬ（配列番号６４）、ＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）、ＴＭＴＬＰＡＴＴＬ（配列番号６９）、ＴＬＰＡＴＴＬＴＬ（配列番号６７）、ＴＬＳＧＨＹＡＴＩ（配列番号６８）、ＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）、ＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）、ＡＬＭＲＳＴＴＫＫＴ（配列番号６５）、ＮＦＭＰＥＤＩＳＶ（配列番号７９）、ＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）、ＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号：５６）、ＳＶＱＷＬＨＮＥＶ（配列番号：７６）、ＱＷＬＨＮＥＶＱＬ（配列番号８０）、ＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）およびＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）からなる群より選ばれ、かつ、
該ＣＤ＋Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養されることにより選択的に活性化されたものであり、かつ、
該ＡＰＣは前記非腫瘍自己抗原ペプチドの一つが載せられている、上記前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２】
標的細胞に対して特異的に細胞傷害性である単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であって、該標的細胞がＭＨＣクラスＩ分子と結合した１以上の非腫瘍自己抗原ペプチドをその表面に有しており、かつ、
該自己抗原ペプチドがＣＤ４０Ｌタンパク質からのペプチドであり、そしてＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）、ＱＬＴＶＫＲＱＲＬ（配列番号４１）、ＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）、ＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）、ＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）、ＶＴＬＥＮＧＫＱＬＬ（配列番号４５）、ＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）、ＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）、ＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）およびＲＱＧＬＹＹＩＹＡ（配列番号４９）からなる群より選ばれる、上記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項３】
細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子およびヒトＩｇＥまたはヒトＣＤ４０Ｌからの少なくとも１つの抗原ペプチドを含むキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の非天然抗原提示細胞。
【請求項４】
少なくとも１つのヒトＩｇＥ抗原ペプチドが、ＴＱＳＰＳＶＦＰＬ（配列番号６４）、ＳＬＮＧＴＴＭＴＬ（配列番号５０）、ＴＭＴＬＰＡＴＴＬ（配列番号６９）、ＴＬＰＡＴＴＬＴＬ（配列番号６７）、ＴＬＳＧＨＹＡＴＩ（配列番号６８）、ＷＶＤＮＫＴＦＳＶ（配列番号５１）、ＷＬＳＤＲＴＹＴＣ（配列番号５２）、ＡＬＭＲＳＴＴＫＫＴ（配列番号６５）、ＮＦＭＰＥＤＩＳＶ（配列番号７９）、ＹＡＴＩＳＬＬＴＶ（配列番号５８）、ＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶ（配列番号５６）、ＳＶＱＷＬＨＮＥＶ（配列番号７６）、ＱＷＬＨＮＥＶＱＬ（配列番号８０）、ＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭ（配列番号５９）およびＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ（配列番号６０）からなる群より選ばれる請求項３記載の細胞。
【請求項５】
少なくとも１つのヒトＣＤ４０Ｌペプチドが、ＦＥＬＱＰＧＡＳＶ（配列番号４０）、ＱＬＴＶＫＲＱＲＬ（配列番号４１）、ＱＭＩＧＳＡＬＦＡ（配列番号４２）、ＳＱＡＰＦＩＡＳＬ（配列番号４３）、ＩＳＭＫＩＦＭＹＬ（配列番号４４）、ＶＴＬＥＮＧＫＱＬＬ（配列番号４５）、ＶＩＳＥＡＳＳＫＴ（配列番号４６）、ＧＶＦＥＬＱＰＧＡ（配列番号４７）、ＳＭＫＩＦＭＹＬＬ（配列番号４８）およびＲＱＧＬＹＹＩＹＡ（配列番号４９）からなる群より選ばれる、請求項３記載の細胞。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００９−１６５４８２（Ｐ２００９−１６５４８２Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６２５５４（Ｐ２００９−６２５５４）
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【分割の表示】特願２００２−５８９６４１（Ｐ２００２−５８９６４１）の分割
【原出願日】平成１４年５月１３日（２００２．５．１３）
【出願人】（５９８０９３０２６）オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【分割の表示】特願２００２−５８９６４１（Ｐ２００２−５８９６４１）の分割
【原出願日】平成１４年５月１３日（２００２．５．１３）
【出願人】（５９８０９３０２６）オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド (25)
【Ｆターム（参考）】
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