自己Ｔ細胞ワクチン材料および方法
【課題】本発明は、改良された自己Ｔ細胞ワクチンおよびそれらの産生方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、改良された自己Ｔ細胞ワクチンおよびそれらの産生方法に関する。本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを用いて、多発性硬化症および慢性関節リウマチのようなＴ細胞関連疾患を処置するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明のＴ細胞を含む複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる。なお別の実施形態において、これらの複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる。１つの実施形態において、本発明における１つ以上の多発性硬化症関連抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択されるミエリン抗原である。
【解決手段】本発明は、改良された自己Ｔ細胞ワクチンおよびそれらの産生方法に関する。本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを用いて、多発性硬化症および慢性関節リウマチのようなＴ細胞関連疾患を処置するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明のＴ細胞を含む複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる。なお別の実施形態において、これらの複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる。１つの実施形態において、本発明における１つ以上の多発性硬化症関連抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択されるミエリン抗原である。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書中に報告された研究は、部分的にＮＩＨの助成金番号ＮＳ３６１４０によって補助された。
【０００２】
（発明の背景）
ミエリン抗原（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含む）に対する自己免疫Ｔ細胞応答が、多発性硬化症（ＭＳ）の病因に関与することを示唆する、ますます増えつつある証拠が存在する（非特許文献１：Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１７：３３−７５）。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボでの活性化を受けることが見出されており、そしてＭＳ患者の血液および脳脊髄液中に高い前駆体頻度で生じる（非特許文献２〜４：Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４；１７９：９７３−９８４；Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３８：１０５−１１４；Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４７：７１８−７２１）。これらのＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロン）を産生し、そして中枢神経系においてミエリン破壊性炎症を促進すると考えられている（非特許文献５および６：Ｓｈａｒｉｅｆら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１；３２５：４６７−４７２；Ｓｅｌｍａｊら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９１；８７：９４９−９５４）。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＭＳについて動物モデル）を誘発し得ることが示されている（非特許文献７：Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８１；１１：１９５−２０４）。ＥＡＥはまた、化学処理もしくは照射によって不活化されたＭＢＰ反応性Ｔ細胞の反復接種（Ｔ細胞ワクチン接種と呼ばれる処置手順）によって、予防または治療され得る（非特許文献８：Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１）。Ｔ細胞ワクチン接種が、抗イディオタイプＴ細胞および抗エルゴタイプ（ａｎｔｉ−ｅｒｇｏｔｙｐｉｃ）Ｔ細胞からなる調節性免疫応答を誘発し、これは、ＥＡＥおよび他の実験自己免疫疾患モデルに対する処置効果に寄与することが実証されている（非特許文献９および１０：Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２；Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２）。
【０００３】
Ｔ細胞ワクチン接種は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、この疾患の臨床経過を改善し得るという仮説に基づいて、ＭＳ患者における臨床試験に近年進んでいる。先行臨床試験では、本発明者らは、照射した自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンのワクチン接種が、ワクチン接種に用いられるＭＢＰ反応性Ｔ細胞を特異的に認識および溶解するＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞応答を惹起することを実証した（非特許文献１１および１２：Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４，Ｍｅｄｅａｒら，Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８）。照射したＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンでの３つの皮下接種は、ＭＳ患者における循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇をもたらした。Ｔ細胞ワクチン接種によるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇は、再発軽減患者における、再発率、拡大障害スケールスコア（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｓｃａｌｅ ｓｃｏｒｅ；ＥＤＳＳ）およびＭＲＩ病変活性の低減によって実証されるように、臨床的改善と相関するようであった（Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）。研究したＭＳ患者の制限した数に起因して、この先行試験から結論は出せなかったが、優れた安全性プロフィールおよび潜在的臨床利益は、さらなる臨床調査を推奨した。この予備的な臨床試験を行って、循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、ＭＳ患者に臨床的に有利であるか否かを調査した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１７：３３−７５
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４；１７９：９７３−９８４
【非特許文献３】Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３８：１０５−１１４
【非特許文献４】Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４７：７１８−７２１
【非特許文献５】Ｓｈａｒｉｅｆら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１；３２５：４６７−４７２
【非特許文献６】Ｓｅｌｍａｊら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９１；８７：９４９−９５４
【非特許文献７】Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８１；１１：１９５−２０４
【非特許文献８】Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１
【非特許文献９】Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２
【非特許文献１０】Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４
【非特許文献１２】Ｍｅｄｅａｒら，Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを産生するための方法、これらの方法によって産生されたＴ細胞ワクチン、およびこれらのワクチンを用いてＴ細胞関連疾患を処置するための方法に関する。本発明の１つの局面は、自己Ｔ細胞ワクチンの産生および多発性硬化症を処置するためのこれらのワクチンの使用に関する。本発明の別の局面は、Ｔ細胞ワクチンでの慢性関節リウマチの処置に関する。
【０００６】
その局面の別のものでは、本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを含む。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態は、直接増大法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；ＤＥＭ）と呼ばれる方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンを含む。直接増大法は、Ｔ細胞ワクチンを調製するための、より迅速で、より容易で、そして費用対効果のより優れた方法を提供する。この直接増大法は、ミエリンタンパク質またはそのフラグメントに反応性であると同定されたＴ細胞が、５以上の刺激指数（Ｓ．Ｉ．）を有する場合、ワクチン産生のための好ましい方法である。この直接増大法は、処置されるべきＭＳ患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または患者の脳脊髄液由来の単核細胞（ＣＳＦＭＣ）を得る工程を含む。次いで、この患者から得られたＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣは、多発性硬化症関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはＭＢＰの１以上の免疫原性フラグメント）の存在下でインキュベートされる。本発明の実施において有用な他の多発性硬化症関連抗原としては、ミエリンプロテオリピドリソタンパク質（ｌｙｓｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質およびグラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）、ならびにそれらのフラグメントが挙げられる。より好ましい実施形態では、この免疫原性フラグメントまたはＭＢＰのフラグメントは、免疫優性フラグメントである。最も好ましいＭＢＰフラグメントとしては、ＭＢＰのアミノ酸８３〜９９に対応するフラグメントおよびＭＢＰのアミノ酸１５１〜１７０に対応するフラグメントが挙げられる。本発明のさらに他の実施形態では、細胞が、多発性硬化症関連抗原および／またはそのフラグメントを考慮することなく、インキュベートされ得る。ＭＢＰまたはそのフラグメントとのインキュベーション後、次いで、ＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣは、ＭＢＰおよび／またはそのフラグメントとともに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で再度インキュベートされる。本発明の実施において使用するために好ましい抗原提示細胞としては、その患者から得られた、照射したＰＢＭＣが挙げられる。次いで、このようにして処理された細胞は、マイトジェン（好ましくは、フィトヘマグルチニン）およびＩＬ−２を用いた交互の刺激サイクルに供される。本発明のプロセスにおいて有用な他のマイトジェン性分子としては、コンカナバリンＡおよびヨウシュヤマゴボウマイトジェンが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用な他のマイトジェン性分子としては、Ｔ細胞表面レセプターに対する抗体（例えば、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体）が挙げられる。交互の刺激サイクルは、１回以上繰り返され得る。
【０００８】
本発明はまた、自己Ｔ細胞ワクチンを用いてＭＳを処置するための方法に関する。この方法は、その必要がある患者に、有効用量の自己Ｔ細胞ワクチンを投与する工程を包含する。好ましい投薬量は、約４０×１０６〜約８０×１０６細胞を含む。このワクチンは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下を含むがこれらに限定されない多数の投与経路のいずれかを介して投与され得る。皮下注射は、このワクチンの好ましい投与経路である。本発明に関する有効用量は、その患者の循環中のミエリン反応性Ｔ細胞の数または前駆体頻度の低減をもたらすに必要な投薬量である。他の有効性のしるしとしては、ＥＤＳＳにおける低減を含め、広範に知られている基準によって測定した場合の、またはＥＤＳＳにおける増大を予防することによる、またはＥＤＳＳの進行を遅延させることによる、この疾患の臨床的原因の変化が挙げられる。有効性の他のしるしとしては、臨床的増悪の速度の低減、またはＭＲＩもしくは他の診断方法論によって検出した場合の、脳病変のサイズの安定化もしくは低減が挙げられる。
【０００９】
同様に、本発明はまた、本明細書中に記載されるとおりに調製されたＴ細胞ワクチンを用いて慢性関節リウマチを処置するための方法を包含する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、自己Ｔ細胞ワクチンおよび「クローニング方法」によってワクチンを産生するための方法を提供する。このクローニング方法は、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントに対して反応性であると同定され、そして５未満の刺激指数を有するＴ細胞の場合に好ましい。
【００１１】
このクローニング方法は、ＭＢＰもしくはミエリンプロテオリピドリポタンパク質、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質、グラチラマーおよび／または本明細書で上記のうちのいずれかのフラグメントに対して反応性であるＴ細胞株を同定する工程を包含する。５未満のＳ．Ｉ．を有するＴ細胞株は、限界希釈によってクローニングされる。方法は、ＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣを、ＭＢＰまたはそのフラグメント（好ましくは、アミノ酸８３〜９９に対応するフラグメントおよびアミノ酸１５１〜１７０に対応するフラグメント）とともに７日間、培地を交換せずにインキュベートすることによって、ＭＢＰおよび／またはそのフラグメントと反応性のＴ細胞を入手する工程を包含する。全てのウェル由来の約５０％は、２つのウェル（抗原ウェルおよびコントロールウェル）に均等に分割される。両方のウェルセットにおける細胞は、この抗原ウェルに上記のＭＢＰまたはそのフラグメントを入れながら、ＡＰＣ（照射した新鮮ＰＢＭＣまたは照射した解凍ＰＢＭＣ）とともに、５％ ｖ／ｖヒトＡＢ＋血清を含む培地中でインキュベートされる。この刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、本明細書中に記載されるとおりの［３Ｈ］チミジン取り込み増殖アッセイを用いて決定される。次いで、抗原を含み、５未満のＳ．Ｉ．を有するウェルは、限界希釈を用いてクローニングされ、ここで、Ｔ細胞株に対して反応性の各細胞は、プールされ、希釈され、そしてウェル中に、レクチン（好ましくは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ））およびＡＰＣを伴った、１０％ヒトＡＢ＋血清およびインターロイキン（好ましくは、インターロイキン２）を含む培地中に１ウェルあたり約０．３細胞〜約２０細胞の密度で播種される。次いで、培養培地は、３〜４日毎に、ＩＬ−２を含む培地と交換される。約１４日後、細胞のＳ．Ｉ．は、上記の通り、再度試験される。次いで、細胞は、ＭＢＰ（またはそのフラグメント）およびＰＨＡを用いた交互の刺激サイクルによって増大される。
【００１２】
本発明はまた、他のＴ細胞関連障害（例えば、慢性関節リウマチ）の処置において有用な自己Ｔ細胞ワクチンに関する。このようなＴ細胞ワクチンの調製および使用は、ＭＳの処置について上記に記載された自己Ｔ細胞ワクチンの調製および使用と類似している。しかし、Ｔ細胞の最初の供給源は、慢性関節リウマチ患者の滑液である。しかし、ＭＳについてのワクチンの調製とは異なり、滑液由来のＴ細胞は、ＰＨＡ；ＣＤ３に対するモノクローナル抗体または他のマイトジェンによる刺激を受け、そしてＭＳに関連した抗原での刺激には供されない。
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
多発性硬化症の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンであって、以下の工程：
ａ）該ワクチンで処置すべき患者からＴ細胞を含む複数の単核細胞を得る工程；
ｂ）１つ以上の多発性硬化症関連抗原、またはそれらの１つ以上のフラグメントの存在下でＴ細胞をインキュベートする工程；
ｃ）工程ｂ）において得られたＴ細胞を、抗原提示細胞ＡＰＣおよび該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｄ）工程ｃ）のＴ細胞を、該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｅ）工程ｄ）のＴ細胞を、ＩＬ−２の存在下でマイトジェンを用いて刺激する工程；
ｆ）工程ｄ）およびｅ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含するプロセスによって作製される、Ｔ細胞ワクチン。
（項目２）
前記複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる、項目１に記載の
Ｔ細胞ワクチン。
（項目３）
前記複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる、項目１に記
載のＴ細胞ワクチン。
（項目４）
前記１つ以上の多発性硬化症関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択されるミエリン抗原である、項目１に記載のワクチン。
（項目５）
ＩＬ−２が、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）の各々においてＴ細胞に添加される、請求項１に記載のワクチン。
（項目６）
ミエリン塩基性タンパク質の前記免疫原性フラグメントが、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸８３〜９９およびアミノ酸１５１〜１７０からなる群から選択される、項目１
に記載のワクチン。
（項目７）
前記ＡＰＣが、放射線照射した、前記処置すべき患者から得られたＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣである、項目１に記載のワクチン。
（項目８）
前記マイトジェンが、植物性血球凝集素、コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体からなる群より選択される、項目１
に記載のワクチン。
（項目９）
ヒトにおける多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を有する患者に、項目１、２、３、４、または５に記載の自己Ｔ細胞ワクチンの有効量を投
与する工程を包含する、方法。
（項目１０）
前記Ｔ細胞ワクチンの有効量が、前記患者の循環におけるミエリン反応性Ｔ細胞の数を減少させるのに十分な容量である、項目６に記載の方法。
（項目１１）
多発性硬化症の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該自己Ｔ細胞ワクチンが、以下の工程：
ａ）該ワクチンで処置すべき患者からＴ細胞を含む複数の単核細胞を得る工程；
ｂ）１つ以上の多発性硬化症関連抗原、またはそれらの１つ以上のフラグメントの存在下でＴ細胞をインキュベートする工程；
ｃ）工程ｂ）において得られたＴ細胞を、抗原提示細胞ＡＰＣおよび該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｄ）工程ｃ）のＴ細胞を、該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｅ）工程ｄ）のＴ細胞を、ＩＬ−２の存在下でマイトジェンを用いて刺激する工程；
ｆ）工程ｄ）およびｅ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含するプロセスによって作製される、方法。
（項目１２）
前記複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる、項目１１に記載
の方法。
（項目１３）
前記複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる、項目１１に
記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上の多発性硬化症関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト、糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
ＩＬ−２が、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）の各々においてＰＣＭＢに添加される、請求項１１に記載の方法。
（項目１６）
ミエリン塩基性タンパク質の前記免疫原性フラグメントが、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸８３〜９９およびアミノ酸１５１〜１７０からなる群から選択される、項目１
１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡＰＣが、放射線照射した、前記処置すべき患者から得られたＰＢＭＣである、請求項１１に記載の方法。
（項目１８）
前記マイトジェンが、植物性血球凝集素、コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体からなる群より選択される、項目１
１に記載の方法。
（項目１９）
多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を処置する必要のある患者に、項目１に記載の自己Ｔ細胞ワクチンを投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）
多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を処置する必要のある患者に、項目１１に記載の方法によって調製された自己Ｔ細胞ワクチンを投与する
工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ワクチン接種の前と後とでの、循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞の、評価した前駆体頻度における変化を図示する。前駆体頻度を、ワクチン接種プロトコルの前およびワクチン接種プロトコルの完了の２〜３ヶ月後に全ての患者において評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボでの活性化およびクローン性増殖を受け、そして所定の個体において、制限されたＴ細胞レセプターＶ遺伝子使用法を発現するが、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のＴ細胞レセプターは、高度に多様化しており、そして異なるＭＳ患者の間で変化している（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；２５：９５８−９６８，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４；１５２：５５８１−５５９２，Ｈｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９；１６３：３５３０−３５３８）。それゆえ、ＭＳ患者においてＭＢＰ反応性Ｔ細胞を有効に枯渇するための現在のストラテジーは、個別化されるべき処置を必要とする。本発明は、このような個別化された処置を提供し、そしてより有効な、より長期間持続するワクチンを提供するように、個々の患者内でのＴ細胞の多様性を考慮に入れる。
【００１６】
以前の研究（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３；１６４：４０１１−４０１７，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）と一致して、本明細書中のデータは、自己のＭＢＰ反応性Ｔ細胞でのワクチン接種が、患者を免疫して、循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞を枯渇させる、一貫した、そして強力な手段を提供することを確認する。Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導される免疫調節の基礎となる機構は、完全には理解されていないが、Ｔ細胞ワクチン接種が、複数の調節性ネットワークに対して作用してＣＤ８＋抗イディオタイプＴ細胞応答（Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｚｈａｎｇら，１９９５）およびＴｈ２免疫偏移（Ｚｈａｎｇら，２０００）を誘導し得ることがますます明らかになっている。特に、Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導されるこれらの抗イディオタイプＴ細胞は、Ｔ細胞レセプターの可変領域を認識して、免疫Ｔ細胞を溶解することが示された。Ｔ細胞レセプターは、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を担う優性な免疫調節を表す（Ｚｈａｎｇら，２０００）。Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導されたこれらの調節性応答が、ＭＳにおけるＴ細胞ワクチン接種の有益な効果に潜在的に寄与すると考えられる。
【００１７】
ミエリン反応性Ｔ細胞と、ＭＳにおける疾患プロセスとの間の潜在的関連を示唆する間接的な証拠が存在する（Ｚｈａｎｇら，１９９４ Ｃｈｏｕら，１９９２，Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，１９９０）が、ＭＳの病因におけるミエリン反応性Ｔ細胞の役割を確立または拒絶することは困難である。これに関して、Ｔ細胞ワクチン接種は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇が、ＭＳの臨床的経過に対して有利な影響を与えるか否かを評価するための、独特の機会を提供する。
【００１８】
本明細書に記載される実施例は、ＭＳの処置のためにクローン選択法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンおよび直接的増大方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンの使用を記載する。本明細書中に提示されるデータは、Ｔ細胞ワクチン接種と、改善された臨床的変数との好ましい相関を示す。第１に、この結果は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、再発−軽減およびＳＰ−ＭＳコホートの両方において、ＭＳおよび所望の増大方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンの通常の病歴と比較して、進行に長期間かかることと一致することを示す。しかし、加速した進行傾向が、最後の注射の１２ヵ月後に、何人かの患者において観察されたことに留意すべきである。この明らかな加速した進行の重要性は未知であるが、これは、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対してＴ細胞ワクチン接種によって最初に誘導された免疫が徐々に低減することと関連し得る。実際、免疫した患者のうちの約１０〜１２％において、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、その時点の辺りで、再度出現した。このことは、この可能性を示唆する。いくつかの場合、再度出現するＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ワクチン接種前には検出されなかった異なるクローン集団から生じ、このことは、以前の研究においても観察された（Ｚｈａｎｇら，１９９５）。この知見は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、進行中の疾患プロセスと潜在的に関連したクローンシフトまたはエピトープ拡散（Ｔｏｕｈｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９；１８９：１０３３）を受け得ることを示唆する。この観察は、適切な免疫を維持するために、同じまたは新たに出現したＴ細胞クローンでのさらなるブースター注射が必要であり得ることを示唆する。これはまた、起源がポリクローナル性であるＴ細胞ワクチン（例えば、本明細書中に記載される直接増大法によって提供されるもの）を提供して、その結果、クローンシフトまたはエピトープ拡散に伴う課題を回避することが有用であり得ることを示唆する。なぜなら、このようなワクチンによって認識され得る特許されたエピトープアレイは、クローン化集団によって認識されたアレイよりも大きいからである。
【００１９】
本発明のＴ細胞ワクチンで処置した患者の毎年のＭＲＩ検査は、最初の年に、ＭＲＩ病変活性におけるわずかな減少を示し、そして２年目にほんの３．３％の増加を示した。ＭＲＩの知見は、Ｔ細胞ワクチン接種で処置した患者における顕著な安定化を示唆し得る。ＭＲＩの知見は、進行が、最初は時間的に遅延して、次いで２年目に明らかに加速することと一貫し、これは、Ｔ細胞ワクチン接種の最初の影響が、２年目に消失した可能性を強化する。
【００２０】
本発明の方法はまた、ワクチン接種した患者における再発の年率およびＥＤＳＳを含め、他の臨床的変数における好ましい変化をもたらした。このことは、ＭＳの臨床的経過に対するＴ細胞ワクチン接種の有益な効果を示唆する。この研究の結果は、先行臨床試験（Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）において報告された知見とほぼ一貫している。しかし、他の臨床的変数とは対照的に、ＥＤＳＳによって測定したところ、臨床的障害に対するＴ細胞ワクチン接種の影響は、両方の研究群において最小であった。これは、比較的短期間（２４ヶ月）にわたる変化を測定することについてのＥＤＳＳの感度の欠如を反映し得る。自己免疫成分がＴ細胞ワクチン接種によって除去または抑制された後でさえ、炎症病変が消散するまでに依然として長期間かかり得、そして既存の組織損傷の一部は永続性である可能性もまた、存在する。これらの結果を考慮すると、本発明は、ＭＳの処置のための自己Ｔ細胞ワクチン、ならびにＭＳの処置のためにこのワクチンを使用するための方法を提供する。
【００２１】
本明細書中に報告される臨床的結果が、患者自身の処置前状態ならびに以前のＭＳ試験において実証されたＭＳの通常の病歴の評価と比較され、プラシーボコントロールと比較されていないことが指摘されるべきである。本研究はまた、本研究のオープンラベル臨床的設計に関連した潜在的プラシーボ効果によって制限される。それゆえ、本研究は、ＭＳにおけるＴ細胞ワクチン接種の役割に有利な重要な臨床的指標を提供したとはいえ、Ｔ細胞ワクチン接種の処置効力は、二重盲検およびプラシーボでコントロールした臨床試験において最良に評価される。
【００２２】
本発明はまた、自己Ｔ細胞ワクチンの調製のための新規な方法を提供する。この方法は、より初期のＴ細胞ワクチンよりも調製が容易であって、患者における改善された免疫学的応答を協調して提供するように作用し得る不均質細胞集団（非クローン性）を提供し、そしてエピトープ拡散またはクローンシフトについての潜在的問題を回避し、そして疾患を担う、より多様性の大きなＴ細胞をより良く除去するように設計される。
【実施例】
【００２３】
（実施例１：ＭＳ患者の血液中のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度の評価）
ＭＳ患者の血液中のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度を、Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）によって記載される方法を用いて評価した。各場合、細胞の処理および細胞培養のために用いた材料は、厳密に自己であった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理した静脈血から、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配分離によって調製した。これらのＰＢＭＣを、２つの免疫優性領域（アミノ酸残基８３〜９９およびアミノ酸残基１５１〜１７０，Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，Ｍａｒ；３１（３）９０７−９１７）に対応するヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の２つの合成ペプチド（それぞれ、２０μｇ／ｍｌの濃度）の存在下で、１０％熱不活化自己血清および５０ＩＵ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中に（合計９６ウェルについて）２００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。インキュベーションを、３７℃で行った。７日後、全ての培養物を、パルス照射した自己ＰＢＭＣ（凍結または新鮮）で再刺激した。使用の前に、ＰＢＭＣのパルス処理を、ＰＢＭＣを１００μｇ／ｍｌの濃度の各ペプチドとともに３７℃で３時間インキュベートすることにより行い、続いて６０Ｃｏ供給源で４，０００ラドで照射した。さらに１週間のインキュベーション後、各培養物を、ＭＢＰペプチドに応答した特異的増殖について、以下に記載の増殖アッセイにおいて試験した。
【００２４】
手短に述べると、各ウェルを、４つのアリコートに分け（１アリコートあたり約１０４細胞）、そして上記のＭＢＰペプチドの存在下または不存在下（コントロール）において、１０５個のパルス照射した自己ＰＢＭＣとともに２連で培養した。培養物を、３日間インキュベートし、そして最後の１６時間の培養の間、［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で１ウェルあたり１μＣｉでパルスした。次いで、細胞を、自動化細胞収集機を用いて収集し、そして［３Ｈ］−チミジン取り込みを、βプレートカウンター中で測定した。細胞中に取り込まれた３Ｈ−チミジンの１分間あたりのカウントが、１，５００よりも多く、そしてコントロール（ペプチドの不存在下）の１分間あたりのカウントを少なくとも３倍超えた場合、細胞を、ＭＢＰペプチドについて反応性と定義した。次いで、充分な反応性を示すウェルの数を、最初の培養物中に播種したＰＢＭＣの総数（１９．２×１０６細胞）によって除算することによって、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度を評価した（例えば、Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５を参照のこと）。同じ算出方法を一貫して用いて、本研究全体を通してのＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度の変化を比較した。
【００２５】
図１に示すように、これらのＭＳ患者において検出された循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度は、約１４×１０−５であった。これは、Ｚｈａｎｇら，（１９９４）、およびＯｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：１８３−１８７（１９９０）によって報告された約１０×１０−５の頻度と匹敵する（実施例５も参照のこと）。
【００２６】
（実施例２：Ｔ細胞ワクチン接種のためのミエリン反応性Ｔ細胞の作製）
（ＰＢＭＣの調製および一次刺激）
新鮮な血液標本を、収集２時間以内に処理した。あるいは、単核細胞は、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）から入手され得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配分離法によって、全血から単離した。特に、ヘパリン処理した血液をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（１：１の血液／ＨＢＳＳ）で希釈し、次いで遠心管中のＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ溶液上にゆっくりと重層した。そして１８００ｒｐｍで１８℃〜２５℃、ブレークなしで２０分間遠心分離する。次いで、ＰＢＭＣを、過剰のＨＢＳＳを添加して１７００ｒｐｍで１０分間、１８℃〜２５℃で遠心分離することによって洗浄した。精製したＰＢＭＣを、遠心分離によってＲＰＭＩ １６４０培地中で３回洗浄し、続いてＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中に再懸濁した。細胞数を数え、そして細胞を、２００，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルＵ字底型培養プレート上にプレーティングした。全てのプレートを、患者数および患者のイニシャルでラベルした。実施例１で考察したミエリンペプチドを、それぞれ、２０μｇ／ｍｌでこの培養物に添加した。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中に配置し、そして毎日目視試験試験した。細胞を、培養培地を交換することなく７日間培養して、ペプチド特異的Ｔ細胞を選択的に増殖させた。
【００２７】
（ＭＢＰペプチド特異的Ｔ細胞株の同定および選択）
全てのウェル由来の細胞の約５０％を取り出し、そして２つのウェル（抗原ウェルおよびコントロールウェル）に均等に分けた。新鮮なＰＢＭＣまたは解凍したＰＢＭＣを、８，０００（６０Ｃｏ源を用いる）ラドで照射し、そして供給源の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、１００，０００細胞／ウェルで用いた。細胞を、５％ヒトＡＢ＋血清を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した。上記の実施例１に記載されるミエリンペプチドを、それぞれ、２０μｇ／ｍｌで、この抗原ウェルに対して添加した。ミエリンペプチドを含まない培地を、一対のコントロールウェルに対して添加した。あるいは、以下によって記載されるものを含め、他の多発性硬化症関連抗原（すなわち、ミエリン抗原および／またはそのフラグメント）を用い得る：Ｍａｒｋｏｖｉｃ−Ｐｌｅｓｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９５），９８２−９９２（プロテオリピドタンパク質エピトープ）；Ｇｅｎａｉｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９５），２９６６−２９７４；Ｋｅｒｌｅｒｏ ｄｅ Ｒｏｓｂｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９３）９２：２６０２−２６０８；Ｔｒｏｔｔｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９８）８４：１７２−１７８およびＴｒｏｔｔｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）７５：９５（ミエリンプロテオリピドタンパク質）；Ｌｉｎｄｅｒら，Ｂｒａｉｎ，（１９９９）１２２：２０８９（ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質）；およびＪｏｈｎｓｏｎら，Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９５）４５：１２６４（グラチラマー［コポリマー１］）。本発明によってまた、上記の抗原および／またはそのフラグメントの組み合わせの使用が企図される。
【００２８】
次いで、細胞を、自動化細胞収集機を用いて収集し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みをＢｅｔａｐｌａｔｅカウンター中で測定した。対応するミエリンペプチドに対する各Ｔ細胞株／ウェルの反応性を、［３Ｈ］チミジン取り込み増殖アッセイによって決定した。特に、各ウェル由来の細胞を、４つのアリコート（１アリコートあたり約１０４細胞）に分け、そして２連で、ミエリンペプチドの存在下および不存在下で、ＡＰＣの供給源としての、照射した１０５個の自己ＰＢＭＣとともに培養した。培養物を３日間インキュベートし、そして培養の最後の１６時間の間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンでパルスした。この抗原ウェルの１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）／コントロールウェルのｃｐｍの商が、３以上である；およびこの抗原ウェルの総ｃｐｍが１，５００よりも大きいの両方である場合、Ｔ細胞株は、ミエリンペプチド特異的であると定義される。ミエリン反応性Ｔ細胞の頻度を、ポアッソンの統計学に従って評価した。同定されたミエリン反応性Ｔ細胞株の残りの５０％の細胞を、照射したＰＢＭＣで、増大のために再刺激する。
【００２９】
（選択したＴ細胞株／クローンの増大および確立）
Ｔ細胞株が、ミエリンペプチド反応性であると同定され、続いて、１回再刺激された後、これをさらに増殖して、以下の方法のうちの１つを用いて、ワクチン接種のために十分な細胞を産生する：直接増大法およびＴクローン化方法。増殖方法の選択は、そのミエリンペプチドに対するＴ細胞株の特異性および反応性に依存する。これらの特異性は、刺激指数（ＳＩ）によって測定される。ＳＩは、上記の［３Ｈ］−チミジン取り込み増殖アッセイによる結果から計算される。ＳＩは、抗原ウェルの１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）／コントロールウェルのｃｐｍの商である。ＳＩが５以上である場合、この直接増大法が用いられる。ＳＩが５未満である場合、クローニング方法が用いられる。
【００３０】
（直接増大法）
手短に述べると、次いで、５以上のＳ．Ｉ．を有すると同定されたミエリン反応性Ｔ細胞を、照射した自己ＰＢＭＣの存在下で、対応するミエリンペプチドでの刺激サイクルとＰＨＡでの刺激サイクルとを交互に行う、直接増大法（ＤＥＭ）によって増大させた。各刺激サイクルを、７〜１０日間実施した。より詳細には、上記のとおりに同定されたミエリン反応性Ｔ細胞を、照射したＰＢＭＣ（ＡＰＣ）（１ウェルあたり１００，０００細胞）の存在下で、１ウェルあたり２０，０００〜４０，０００細胞でプレーティングした。それぞれ、対応するミエリンペプチドを抗原刺激サイクルのために２０μｇ／ｍｌで添加した。そしてＰＨＡを各ＰＨＡ刺激サイクルのために１μｇ／ｍｌで添加する。組換えヒトＩＬ−２もまた、刺激サイクルの２日目に１００ＩＵ／ｍｌで添加した。培養物を、１０％ヒトＡＢ＋血清および１００ＩＵ／ｍｌ ｒＩＬ−２を含むＲＰＭＩ １６４０培地で３〜４日毎にリフレッシュした。ミエリン反応性Ｔ細胞株を、総細胞数が約２０００万個に達するまで、交互刺激サイクルで増殖させた。
【００３１】
（ＤＥＭによって調製されたＴ細胞株の反応性）
【００３２】
【数１】
このクローニング方法において、Ｔ細胞株を、限界希釈アッセイを使用してクローニングした。各ミエリンペプチド反応性Ｔ細胞株の細胞をプールし、そして１０％ヒトＡＢ＋血清および１００ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ−２を含むＲＰＭＩ １６４０培養培地中に約０．３〜約２０細胞／ウェルで播種した。ＰＨＡを１μｇ／ｍＬで添加し、そして照射した自己ＡＰＣを１００，０００細胞／ウェルで添加した。１００ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ−２を含む培養培地ＲＰＭＩ １６４０を、３〜４日毎に交換した。培養の１４日後、増殖陽性ウェルをアッセイして、上記のような対応するミエリンペプチドに対する特異的反応性を決定した。これらのペプチド特異的Ｔ細胞株のさらなる増殖を、対応するミエリンペプチドおよびＰＨＡを用いる代替的刺激サイクルにおいて、上記の直接的増殖方法に従って実施した。
【００３３】
（実施例３）
（Ｔ細胞ワクチン接種による、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇）
ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝２８）を有する患者およびＳＰ−ＭＳ（ｎ＝２６）を有する患者５４人を、この非盲検研究のために採用した。これらの患者のベースラインの臨床的特徴を、表１に示す。各患者は、上記のように準備された２ヶ月間隔で、照射した自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（このクローニング方法によって調製された）を用いる皮下注射の３つの過程を受けた。患者を、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度、再発率、ＥＤＳＳおよびＭＲＩ病変活性における変化について、２４時間モニタリングした。これらの結果を、自己対合様式でワクチン接種前の値と比較した。さらに、β−インターフェロン−１ａ臨床試験におけるＲＲ−ＭＳ（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）および最近のβ−ＩＦＮ−１ｂ研究におけるＳＰ−ＭＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、３５２：１４９１−１４９７（１９８８））の偽薬対照集団の臨床データを、比較のためのＭＳの自然歴データを提供するために含めた。この研究において記載される偽薬コントロール被験体のベースライン特徴は、より低い平均ＥＤＳＳ以外は、本明細書中に記載される患者集団研究のベースライン特徴と類似であった。
【００３４】
図１に示されるように、そして実施例１に簡潔に記載されるように、ベースライン（１４×１０−５）にてこれらのＭＳ患者において検出される循環ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度は、以前の研究において報告された頻度（末梢血単核球中に約１０×１０−５）（Ｚｈａｎｇら、１９９４、Ｏｔａら、１９９０）に高度に匹敵した。ＲＲ−ＭＳ集団とＳＰ−ＭＳ集団との間のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度においては、有意な差異は見出されなかった。Ｔ細胞頻度は、９２％の患者において検出不能であったか、または３つの過程のワクチン接種の終了後２〜３ヶ月に、残りの患者において実質的に減衰した（１４×１０−５ 対 １．９×１０−５、ｐ＜０．０００１）。これらの結果により、ＭＳを有する患者におけるＴ細胞ワクチン接種による、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を確認した。
【００３５】
（実施例４）
（自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を使用するＭＳ患者のワクチン接種）
５４人のＭＳを有する患者を、この試験に参加させた。包括基準は、少なくとも２年間にわたる臨床的に明確なＭＳ、ＲＲ−ＭＳについて１．５〜６．５の、そして二次進行性ＭＳ（ＳＰ−ＭＳ）を有する患者について４．０〜８．０の、ベースラインの拡大身体障害状態スケール（ＥＤＳＳ）、および緩和−軽減ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）集団について、研究に入る前の過去２年間での少なくとも１回の再燃、であった。約２５％の患者は、β−インターフェロンまたはグラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）を用いた処置に対して応答または許容することに以前に失敗し、そして残りの患者は、研究に入る前の少なくとも１ヶ月間および研究の間中、これらの薬剤で処置されていなかった。これらの患者は、研究に参加する前の少なくとも３ヶ月間、いかなる免疫抑制薬物（ステロイドを含む）をも摂取していなかった。悪化が生じる場合には、ステロイドをこの研究の間に許容した。疲労、痙縮および膀胱病訴についての全身処置は、禁止しなかった。インフォームドコンセントを、実験手順の説明後に患者から得た。このプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって承認された。
【００３６】
ワクチン接種プロトコルは、以前の臨床研究において使用されたプロトコルと類似であった（Ｚｈａｎｇら、１９９３、Ｍｅｄａｅｒら、１９９５）。簡潔には、上記のクローニング方法によって調製したＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンを、アクセサリー細胞の供給源としての照射したＰＢＭＣの存在下で、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１μｇ／ｍｌ）を用いて予め活性化した。次いで、細胞を、１０％心臓不活化自己血清および５０単位のｒＩＬ−２を補充したＲＲＩＭ １６４０中で５〜６日間培養した。活性化ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を、引き続いて滅菌生理食塩水で３回洗浄して、残留ＰＨＡおよび細胞細片を除去した。照射（８，０００ｒａｄｓ、６０Ｃｏ源）後、細胞を、２ｍｌの生理食塩水中に再懸濁し、そして２本の腕に皮下注射した（１ｍｌ／腕）。ワクチン接種のために使用したＴ細胞数は、１回の注射当たり４０×１０６〜８０×１０６細胞の範囲であり、そして相対的皮膚表面積基準で、実験動物において有効なＴ細胞用量の外挿によって選択した（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら、１９８１）。各患者は、２ヶ月間隔で３回の皮下注射を受けた。
【００３７】
次いで、患者を、障害の進行、ＥＤＳＳ、再発率およびＭＲＩ病変活性の確認開始までの時間にわたり、観察した。これらの結果を、この患者自身の処置前の過程、ならびにＲＲ−ＭＳ患者およびＳＰ−ＭＳ患者における２つの最近の臨床試験の偽薬集団（これは、ＭＳの自然歴の概算として働く）と比較した（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８）。進行までの時間を、少なくとも２ヶ月間にわたって持続する、ＥＤＳＳに対する少なくとも１．０の増加（Ｐｏｓｅｒら、１９８３）によって決定した。研究中の悪化は、新たな神経学的症状の出現、または神経学的試験に対する客観的な変化（ＥＤＳＳに対する少なくとも０．５ポイントの悪化）を伴う、少なくとも４８時間続く既存の神経学的症状の悪化、によって定義した。患者に、計画された定期的な訪問の間の事象を報告するように指示し、そして症状が悪化を示唆した場合に、神経学者が患者を試験した。安全性評価は、定期的な訪問時の有害事象、バイタルサインおよび身体試験を含んだ。Ｔ細胞ワクチン接種の前後の研究患者における臨床的変数の差異を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用して分析した。
【００３８】
（実施例５）
（ワクチン接種後のＭＳの臨床過程の変化）
Ｔ細胞ワクチン接種による循環ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇がＭＳの臨床過程を変更するか否かを解決することを試みた。患者は、上記のように調製した自己Ｔ細胞ワクチンを受けた。幾人かの患者において注射部位で見られた弱く一過的な紅斑以外には、Ｔ細胞ワクチン摂取に伴う有害効果は存在せず、そして全ての患者を、外来診療所で処置した。表２に示されるように、平均ＥＤＳＳは、ワクチン接種後２４ヶ月間に亘って、ＲＲ−ＭＳを有する患者において僅かに減少した（開始時３．２１ 対 終了時３．１）。比較として、β−ＩＦＮ−１ａ試験を使用して実施された試験（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）において報告されたのと同じ観察期間にわたって、ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝５６）の自然歴において、平均ＥＤＳＳが０．６１増加した。さらに、ＥＤＳＳを変化させなかったかまたは改善したのいずれかであった患者集団は、自然ＭＳ歴の患者集団と比較して、かなり高かった（７５％ 対 ５０％）。処置されたＲＲ−ＭＳ群中の一人（３．５％）の患者だけが、ＭＳの自然歴中の患者の１８％と比較して、２４ヶ月以内に２．０のＥＤＳＳを超えて進行した（表２）。
【００３９】
ＳＰ−ＭＳ集団において、平均ＥＤＳＳは、ＳＰ−ＭＳの自然歴において記録された＋０．６と比較して、２４ヶ月間の期間にわたって僅かに進行した（＋０．１２）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８；３５２：１４９１−１４９７）。さらに、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して確認された進行までの時間の概算は、ＭＳ患者の自然歴（ＲＲ−ＭＳについて１２ヶ月およびＳＰ−ＭＳについて９ヶ月で、２０％の進行）と比較して、かなりの遅延（両方の処置群について、１８ヶ月で２０％の進行）を示した（Ｊａｃｏｂｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ、１９９６；３９；２８５−２９４、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８）。しかし、進行は、両方の研究群において、１８ヶ月後（最後のワクチン接種の１２ヶ月後）に加速するようであった。
【００４０】
（実施例６）
（臨床的悪化速度の変化）
表３に示されるように、再発の年率は、Ｔ細胞ワクチン接種後のＲＲ−ＭＳを有する患者において減少し、ベースラインの再発率からの４０％の減少を示した。再発率における有意な差異は、処置の１年目と２年目との間には見出されなかった。比較として、再発の年率における２５％の減少が、ＲＲ−ＭＳの自然歴において観察された（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）。さらに、攻撃を示さないかまたは攻撃をほとんど示さない患者集団は、自然ＭＳ歴における患者集団よりもかなり高かった（表３）。再発率は、ＳＰ−ＭＳ集団において５０％減少したが、本明細書中で試験した少数の二次進行性患者だけ（６／２６）が、研究に入る前の２年間に再発した。
【００４１】
（実施例７）
（画像共鳴像試験による脳病変活性）
画像共鳴像（ＭＲＩ）を、ガドリニウム増強Ｔ２加重画像として実施した。より高い信号強度の領域を、半定量的様式でスコアリングした（Ｓｃｈｅｌｔｅｎら、Ｂｒａｉｎ １９９２；１１５：７３５−７４８、Ｔｒｕｙｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９０；９６：１７３−１８２）。このスコアリング方法は、増大した信号過剰強度（ｈｙｐｅｒｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を有する病巣のサイズおよび数の両方に関連するスコアを
生じた。信号過剰強度を、以下の領域においてスコアリングした：（ｉ）前頭および後頭領域の脳室周囲、ならびに側脳室に対して平行；（ｉｉ）前頭、側頭、頭頂骨および後頭領域中の別々の葉性白質；（ｉｉｉ）脳幹神経節、尾状核、被殻、淡蒼球および視床、ならびに（ｉｖ）テント下領域、小脳、中脳、橋および髄質。病変を、以下のようにスコアリングした：直径０．５ｃｍ未満の病変には、スコア「１」を与え、０．５ｃｍと１．０ｃｍとの間には「２」を与え、１．０ｃｍと１．５ｃｍとの間には「３」を与え、１．５ｃｍと２．０ｃｍとの間には「４」を与えそして２．０ｃｍより大きいものには「５」を与えた。融合性病変を、以下のように測定した：上記のような目的の領域の２５％未満が異常な信号強度であるとみなされた場合、スコア「５」を与え、目的の可視化領域の５０％より多くが罹患している場合には、２５％および５０％については「１０」および「１５」を与えた。次いで、これらの値を、「個々の」病変スコアに加算した。
【００４２】
３つのガドリニウム増強Ｔ２加重ＭＲＩ試験を、開始時（ベースライン）、１２ヶ月目および終了時（２４ヶ月）で実施して、疾患進行の指標として脳病変活性の変化をモニタリングした。異なる医療センターで実施されたいくつかのスキャンの技術的不適合性に起因して、３４人の患者だけからのＭＲＩスキャンを分析し得た。全てのＭＲＩスキャンを、この臨床試験に関与しなかった外部の神経学者によって評価した。本発明者らの予備臨床試験および他の関連の研究において以前に使用した半定量的スコアリング方法を使用して、病変活性を評価した（Ｍｅｄａｅｒら、１９９５、Ｓｃｈｅｌｔｅｎｓら、１９９２、Ｔｒｕｙｅｎら、１９９０）。このスコアリング方法は、Ｔ２加重画像の増大した信号過剰強度を有する病巣のサイズおよび数の両方に関連するスコアを生じた。表４に示されるように、これらの結果は、試験した患者の７０％において、ＭＲＩ病変スコアが、病変スコアにおける少なくとも１ポイントの減少によって規定されるように、不変であったかまたは改善されたかのいずれかであったが、一方で残り３０％の患者は、研究過程の間に増加した病変スコアを有したことを明らかにした。集団的に、平均ＭＲＩ病変スコアにおける変化は、１年目には１．２％の減少を示したが、２年目にはベースラインＭＲＩから３．３％の増加を示した。しかし、これらの変化は有意ではなかった（Ｐ＞０．４）。これらの結果は、Ｔ細胞ワクチン接種に寄与する安定化またはいくらかの改善を反映し得る。なぜなら、ＭＲＩ病変は、一般に、種々の臨床試験において報告されたように、未処置のＲＲ−ＭＡ患者において１年基準で約１０％進行するからである（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８、ＩＦＮＢ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９３；４３：６５５−６６１）。まとめると、これらの知見は、Ｔ細胞ワクチン接種によるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇と試験したＭＳ患者における臨床的改善との間の有利な相関を示唆する。
【００４３】
本発明を、非限定的な実施例および好ましい実施形態によって記載してきたが、これらは、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲を限定するとは意図されない。
【００４４】
【表１】
ａβ−ＩＮＦ−１ａ試験のプラシーボコントロール群［７］。ｂβ−ＩＮＦ−１ｂ試験のプラシーボコントロール群［７］。
【００４５】
【表２】
ａ２年間の、ベースラインからのＥＤＳＳにおける個体内変化。ｂβ−ＩＮＦ−１ａ試験のプラシーボコントロール群［７］。ｃβ−ＩＮＦ−１ｂ試験のプラシーボコントロール群［５］。
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【背景技術】
【０００１】
本明細書中に報告された研究は、部分的にＮＩＨの助成金番号ＮＳ３６１４０によって補助された。
【０００２】
（発明の背景）
ミエリン抗原（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含む）に対する自己免疫Ｔ細胞応答が、多発性硬化症（ＭＳ）の病因に関与することを示唆する、ますます増えつつある証拠が存在する（非特許文献１：Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１７：３３−７５）。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボでの活性化を受けることが見出されており、そしてＭＳ患者の血液および脳脊髄液中に高い前駆体頻度で生じる（非特許文献２〜４：Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４；１７９：９７３−９８４；Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３８：１０５−１１４；Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４７：７１８−７２１）。これらのＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロン）を産生し、そして中枢神経系においてミエリン破壊性炎症を促進すると考えられている（非特許文献５および６：Ｓｈａｒｉｅｆら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１；３２５：４６７−４７２；Ｓｅｌｍａｊら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９１；８７：９４９−９５４）。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＭＳについて動物モデル）を誘発し得ることが示されている（非特許文献７：Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８１；１１：１９５−２０４）。ＥＡＥはまた、化学処理もしくは照射によって不活化されたＭＢＰ反応性Ｔ細胞の反復接種（Ｔ細胞ワクチン接種と呼ばれる処置手順）によって、予防または治療され得る（非特許文献８：Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１）。Ｔ細胞ワクチン接種が、抗イディオタイプＴ細胞および抗エルゴタイプ（ａｎｔｉ−ｅｒｇｏｔｙｐｉｃ）Ｔ細胞からなる調節性免疫応答を誘発し、これは、ＥＡＥおよび他の実験自己免疫疾患モデルに対する処置効果に寄与することが実証されている（非特許文献９および１０：Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２；Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２）。
【０００３】
Ｔ細胞ワクチン接種は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、この疾患の臨床経過を改善し得るという仮説に基づいて、ＭＳ患者における臨床試験に近年進んでいる。先行臨床試験では、本発明者らは、照射した自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンのワクチン接種が、ワクチン接種に用いられるＭＢＰ反応性Ｔ細胞を特異的に認識および溶解するＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞応答を惹起することを実証した（非特許文献１１および１２：Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４，Ｍｅｄｅａｒら，Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８）。照射したＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンでの３つの皮下接種は、ＭＳ患者における循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇をもたらした。Ｔ細胞ワクチン接種によるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇は、再発軽減患者における、再発率、拡大障害スケールスコア（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｓｃａｌｅ ｓｃｏｒｅ；ＥＤＳＳ）およびＭＲＩ病変活性の低減によって実証されるように、臨床的改善と相関するようであった（Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）。研究したＭＳ患者の制限した数に起因して、この先行試験から結論は出せなかったが、優れた安全性プロフィールおよび潜在的臨床利益は、さらなる臨床調査を推奨した。この予備的な臨床試験を行って、循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、ＭＳ患者に臨床的に有利であるか否かを調査した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１７：３３−７５
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４；１７９：９７３−９８４
【非特許文献３】Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２；３８：１０５−１１４
【非特許文献４】Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４７：７１８−７２１
【非特許文献５】Ｓｈａｒｉｅｆら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１；３２５：４６７−４７２
【非特許文献６】Ｓｅｌｍａｊら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９１；８７：９４９−９５４
【非特許文献７】Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８１；１１：１９５−２０４
【非特許文献８】Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１
【非特許文献９】Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２
【非特許文献１０】Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４
【非特許文献１２】Ｍｅｄｅａｒら，Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを産生するための方法、これらの方法によって産生されたＴ細胞ワクチン、およびこれらのワクチンを用いてＴ細胞関連疾患を処置するための方法に関する。本発明の１つの局面は、自己Ｔ細胞ワクチンの産生および多発性硬化症を処置するためのこれらのワクチンの使用に関する。本発明の別の局面は、Ｔ細胞ワクチンでの慢性関節リウマチの処置に関する。
【０００６】
その局面の別のものでは、本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンを含む。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態は、直接増大法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；ＤＥＭ）と呼ばれる方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンを含む。直接増大法は、Ｔ細胞ワクチンを調製するための、より迅速で、より容易で、そして費用対効果のより優れた方法を提供する。この直接増大法は、ミエリンタンパク質またはそのフラグメントに反応性であると同定されたＴ細胞が、５以上の刺激指数（Ｓ．Ｉ．）を有する場合、ワクチン産生のための好ましい方法である。この直接増大法は、処置されるべきＭＳ患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または患者の脳脊髄液由来の単核細胞（ＣＳＦＭＣ）を得る工程を含む。次いで、この患者から得られたＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣは、多発性硬化症関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはＭＢＰの１以上の免疫原性フラグメント）の存在下でインキュベートされる。本発明の実施において有用な他の多発性硬化症関連抗原としては、ミエリンプロテオリピドリソタンパク質（ｌｙｓｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質およびグラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）、ならびにそれらのフラグメントが挙げられる。より好ましい実施形態では、この免疫原性フラグメントまたはＭＢＰのフラグメントは、免疫優性フラグメントである。最も好ましいＭＢＰフラグメントとしては、ＭＢＰのアミノ酸８３〜９９に対応するフラグメントおよびＭＢＰのアミノ酸１５１〜１７０に対応するフラグメントが挙げられる。本発明のさらに他の実施形態では、細胞が、多発性硬化症関連抗原および／またはそのフラグメントを考慮することなく、インキュベートされ得る。ＭＢＰまたはそのフラグメントとのインキュベーション後、次いで、ＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣは、ＭＢＰおよび／またはそのフラグメントとともに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で再度インキュベートされる。本発明の実施において使用するために好ましい抗原提示細胞としては、その患者から得られた、照射したＰＢＭＣが挙げられる。次いで、このようにして処理された細胞は、マイトジェン（好ましくは、フィトヘマグルチニン）およびＩＬ−２を用いた交互の刺激サイクルに供される。本発明のプロセスにおいて有用な他のマイトジェン性分子としては、コンカナバリンＡおよびヨウシュヤマゴボウマイトジェンが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用な他のマイトジェン性分子としては、Ｔ細胞表面レセプターに対する抗体（例えば、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体）が挙げられる。交互の刺激サイクルは、１回以上繰り返され得る。
【０００８】
本発明はまた、自己Ｔ細胞ワクチンを用いてＭＳを処置するための方法に関する。この方法は、その必要がある患者に、有効用量の自己Ｔ細胞ワクチンを投与する工程を包含する。好ましい投薬量は、約４０×１０６〜約８０×１０６細胞を含む。このワクチンは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下を含むがこれらに限定されない多数の投与経路のいずれかを介して投与され得る。皮下注射は、このワクチンの好ましい投与経路である。本発明に関する有効用量は、その患者の循環中のミエリン反応性Ｔ細胞の数または前駆体頻度の低減をもたらすに必要な投薬量である。他の有効性のしるしとしては、ＥＤＳＳにおける低減を含め、広範に知られている基準によって測定した場合の、またはＥＤＳＳにおける増大を予防することによる、またはＥＤＳＳの進行を遅延させることによる、この疾患の臨床的原因の変化が挙げられる。有効性の他のしるしとしては、臨床的増悪の速度の低減、またはＭＲＩもしくは他の診断方法論によって検出した場合の、脳病変のサイズの安定化もしくは低減が挙げられる。
【０００９】
同様に、本発明はまた、本明細書中に記載されるとおりに調製されたＴ細胞ワクチンを用いて慢性関節リウマチを処置するための方法を包含する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、自己Ｔ細胞ワクチンおよび「クローニング方法」によってワクチンを産生するための方法を提供する。このクローニング方法は、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントに対して反応性であると同定され、そして５未満の刺激指数を有するＴ細胞の場合に好ましい。
【００１１】
このクローニング方法は、ＭＢＰもしくはミエリンプロテオリピドリポタンパク質、ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質、グラチラマーおよび／または本明細書で上記のうちのいずれかのフラグメントに対して反応性であるＴ細胞株を同定する工程を包含する。５未満のＳ．Ｉ．を有するＴ細胞株は、限界希釈によってクローニングされる。方法は、ＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣを、ＭＢＰまたはそのフラグメント（好ましくは、アミノ酸８３〜９９に対応するフラグメントおよびアミノ酸１５１〜１７０に対応するフラグメント）とともに７日間、培地を交換せずにインキュベートすることによって、ＭＢＰおよび／またはそのフラグメントと反応性のＴ細胞を入手する工程を包含する。全てのウェル由来の約５０％は、２つのウェル（抗原ウェルおよびコントロールウェル）に均等に分割される。両方のウェルセットにおける細胞は、この抗原ウェルに上記のＭＢＰまたはそのフラグメントを入れながら、ＡＰＣ（照射した新鮮ＰＢＭＣまたは照射した解凍ＰＢＭＣ）とともに、５％ ｖ／ｖヒトＡＢ＋血清を含む培地中でインキュベートされる。この刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、本明細書中に記載されるとおりの［３Ｈ］チミジン取り込み増殖アッセイを用いて決定される。次いで、抗原を含み、５未満のＳ．Ｉ．を有するウェルは、限界希釈を用いてクローニングされ、ここで、Ｔ細胞株に対して反応性の各細胞は、プールされ、希釈され、そしてウェル中に、レクチン（好ましくは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ））およびＡＰＣを伴った、１０％ヒトＡＢ＋血清およびインターロイキン（好ましくは、インターロイキン２）を含む培地中に１ウェルあたり約０．３細胞〜約２０細胞の密度で播種される。次いで、培養培地は、３〜４日毎に、ＩＬ−２を含む培地と交換される。約１４日後、細胞のＳ．Ｉ．は、上記の通り、再度試験される。次いで、細胞は、ＭＢＰ（またはそのフラグメント）およびＰＨＡを用いた交互の刺激サイクルによって増大される。
【００１２】
本発明はまた、他のＴ細胞関連障害（例えば、慢性関節リウマチ）の処置において有用な自己Ｔ細胞ワクチンに関する。このようなＴ細胞ワクチンの調製および使用は、ＭＳの処置について上記に記載された自己Ｔ細胞ワクチンの調製および使用と類似している。しかし、Ｔ細胞の最初の供給源は、慢性関節リウマチ患者の滑液である。しかし、ＭＳについてのワクチンの調製とは異なり、滑液由来のＴ細胞は、ＰＨＡ；ＣＤ３に対するモノクローナル抗体または他のマイトジェンによる刺激を受け、そしてＭＳに関連した抗原での刺激には供されない。
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
多発性硬化症の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンであって、以下の工程：
ａ）該ワクチンで処置すべき患者からＴ細胞を含む複数の単核細胞を得る工程；
ｂ）１つ以上の多発性硬化症関連抗原、またはそれらの１つ以上のフラグメントの存在下でＴ細胞をインキュベートする工程；
ｃ）工程ｂ）において得られたＴ細胞を、抗原提示細胞ＡＰＣおよび該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｄ）工程ｃ）のＴ細胞を、該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｅ）工程ｄ）のＴ細胞を、ＩＬ−２の存在下でマイトジェンを用いて刺激する工程；
ｆ）工程ｄ）およびｅ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含するプロセスによって作製される、Ｔ細胞ワクチン。
（項目２）
前記複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる、項目１に記載の
Ｔ細胞ワクチン。
（項目３）
前記複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる、項目１に記
載のＴ細胞ワクチン。
（項目４）
前記１つ以上の多発性硬化症関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択されるミエリン抗原である、項目１に記載のワクチン。
（項目５）
ＩＬ−２が、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）の各々においてＴ細胞に添加される、請求項１に記載のワクチン。
（項目６）
ミエリン塩基性タンパク質の前記免疫原性フラグメントが、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸８３〜９９およびアミノ酸１５１〜１７０からなる群から選択される、項目１
に記載のワクチン。
（項目７）
前記ＡＰＣが、放射線照射した、前記処置すべき患者から得られたＰＢＭＣまたはＣＳＦＭＣである、項目１に記載のワクチン。
（項目８）
前記マイトジェンが、植物性血球凝集素、コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体からなる群より選択される、項目１
に記載のワクチン。
（項目９）
ヒトにおける多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を有する患者に、項目１、２、３、４、または５に記載の自己Ｔ細胞ワクチンの有効量を投
与する工程を包含する、方法。
（項目１０）
前記Ｔ細胞ワクチンの有効量が、前記患者の循環におけるミエリン反応性Ｔ細胞の数を減少させるのに十分な容量である、項目６に記載の方法。
（項目１１）
多発性硬化症の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンを調製する方法であって、該自己Ｔ細胞ワクチンが、以下の工程：
ａ）該ワクチンで処置すべき患者からＴ細胞を含む複数の単核細胞を得る工程；
ｂ）１つ以上の多発性硬化症関連抗原、またはそれらの１つ以上のフラグメントの存在下でＴ細胞をインキュベートする工程；
ｃ）工程ｂ）において得られたＴ細胞を、抗原提示細胞ＡＰＣおよび該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｄ）工程ｃ）のＴ細胞を、該多発性硬化症関連抗原、またはそれらのフラグメントで刺激する工程；
ｅ）工程ｄ）のＴ細胞を、ＩＬ−２の存在下でマイトジェンを用いて刺激する工程；
ｆ）工程ｄ）およびｅ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含するプロセスによって作製される、方法。
（項目１２）
前記複数の単核細胞が、前記患者の末梢血（ＰＢＭＣ）から得られる、項目１１に記載
の方法。
（項目１３）
前記複数の単核細胞が、前記患者の脳骨髄液（ＣＳＦＭＣ）から得られる、項目１１に
記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上の多発性硬化症関連抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドリポタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト、糖タンパク質またはそれらのフラグメントからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
ＩＬ−２が、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）の各々においてＰＣＭＢに添加される、請求項１１に記載の方法。
（項目１６）
ミエリン塩基性タンパク質の前記免疫原性フラグメントが、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸８３〜９９およびアミノ酸１５１〜１７０からなる群から選択される、項目１
１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡＰＣが、放射線照射した、前記処置すべき患者から得られたＰＢＭＣである、請求項１１に記載の方法。
（項目１８）
前記マイトジェンが、植物性血球凝集素、コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体からなる群より選択される、項目１
１に記載の方法。
（項目１９）
多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を処置する必要のある患者に、項目１に記載の自己Ｔ細胞ワクチンを投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）
多発性硬化症を処置するための方法であって、該方法は、多発性硬化症を処置する必要のある患者に、項目１１に記載の方法によって調製された自己Ｔ細胞ワクチンを投与する
工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ワクチン接種の前と後とでの、循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞の、評価した前駆体頻度における変化を図示する。前駆体頻度を、ワクチン接種プロトコルの前およびワクチン接種プロトコルの完了の２〜３ヶ月後に全ての患者において評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボでの活性化およびクローン性増殖を受け、そして所定の個体において、制限されたＴ細胞レセプターＶ遺伝子使用法を発現するが、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のＴ細胞レセプターは、高度に多様化しており、そして異なるＭＳ患者の間で変化している（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；２５：９５８−９６８，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４；１５２：５５８１−５５９２，Ｈｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９；１６３：３５３０−３５３８）。それゆえ、ＭＳ患者においてＭＢＰ反応性Ｔ細胞を有効に枯渇するための現在のストラテジーは、個別化されるべき処置を必要とする。本発明は、このような個別化された処置を提供し、そしてより有効な、より長期間持続するワクチンを提供するように、個々の患者内でのＴ細胞の多様性を考慮に入れる。
【００１６】
以前の研究（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３；１６４：４０１１−４０１７，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）と一致して、本明細書中のデータは、自己のＭＢＰ反応性Ｔ細胞でのワクチン接種が、患者を免疫して、循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞を枯渇させる、一貫した、そして強力な手段を提供することを確認する。Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導される免疫調節の基礎となる機構は、完全には理解されていないが、Ｔ細胞ワクチン接種が、複数の調節性ネットワークに対して作用してＣＤ８＋抗イディオタイプＴ細胞応答（Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｚｈａｎｇら，１９９５）およびＴｈ２免疫偏移（Ｚｈａｎｇら，２０００）を誘導し得ることがますます明らかになっている。特に、Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導されるこれらの抗イディオタイプＴ細胞は、Ｔ細胞レセプターの可変領域を認識して、免疫Ｔ細胞を溶解することが示された。Ｔ細胞レセプターは、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を担う優性な免疫調節を表す（Ｚｈａｎｇら，２０００）。Ｔ細胞ワクチン接種によって誘導されたこれらの調節性応答が、ＭＳにおけるＴ細胞ワクチン接種の有益な効果に潜在的に寄与すると考えられる。
【００１７】
ミエリン反応性Ｔ細胞と、ＭＳにおける疾患プロセスとの間の潜在的関連を示唆する間接的な証拠が存在する（Ｚｈａｎｇら，１９９４ Ｃｈｏｕら，１９９２，Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａら，１９９０）が、ＭＳの病因におけるミエリン反応性Ｔ細胞の役割を確立または拒絶することは困難である。これに関して、Ｔ細胞ワクチン接種は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇が、ＭＳの臨床的経過に対して有利な影響を与えるか否かを評価するための、独特の機会を提供する。
【００１８】
本明細書に記載される実施例は、ＭＳの処置のためにクローン選択法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンおよび直接的増大方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンの使用を記載する。本明細書中に提示されるデータは、Ｔ細胞ワクチン接種と、改善された臨床的変数との好ましい相関を示す。第１に、この結果は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇が、再発−軽減およびＳＰ−ＭＳコホートの両方において、ＭＳおよび所望の増大方法によって調製される自己Ｔ細胞ワクチンの通常の病歴と比較して、進行に長期間かかることと一致することを示す。しかし、加速した進行傾向が、最後の注射の１２ヵ月後に、何人かの患者において観察されたことに留意すべきである。この明らかな加速した進行の重要性は未知であるが、これは、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対してＴ細胞ワクチン接種によって最初に誘導された免疫が徐々に低減することと関連し得る。実際、免疫した患者のうちの約１０〜１２％において、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、その時点の辺りで、再度出現した。このことは、この可能性を示唆する。いくつかの場合、再度出現するＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ワクチン接種前には検出されなかった異なるクローン集団から生じ、このことは、以前の研究においても観察された（Ｚｈａｎｇら，１９９５）。この知見は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、進行中の疾患プロセスと潜在的に関連したクローンシフトまたはエピトープ拡散（Ｔｏｕｈｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９；１８９：１０３３）を受け得ることを示唆する。この観察は、適切な免疫を維持するために、同じまたは新たに出現したＴ細胞クローンでのさらなるブースター注射が必要であり得ることを示唆する。これはまた、起源がポリクローナル性であるＴ細胞ワクチン（例えば、本明細書中に記載される直接増大法によって提供されるもの）を提供して、その結果、クローンシフトまたはエピトープ拡散に伴う課題を回避することが有用であり得ることを示唆する。なぜなら、このようなワクチンによって認識され得る特許されたエピトープアレイは、クローン化集団によって認識されたアレイよりも大きいからである。
【００１９】
本発明のＴ細胞ワクチンで処置した患者の毎年のＭＲＩ検査は、最初の年に、ＭＲＩ病変活性におけるわずかな減少を示し、そして２年目にほんの３．３％の増加を示した。ＭＲＩの知見は、Ｔ細胞ワクチン接種で処置した患者における顕著な安定化を示唆し得る。ＭＲＩの知見は、進行が、最初は時間的に遅延して、次いで２年目に明らかに加速することと一貫し、これは、Ｔ細胞ワクチン接種の最初の影響が、２年目に消失した可能性を強化する。
【００２０】
本発明の方法はまた、ワクチン接種した患者における再発の年率およびＥＤＳＳを含め、他の臨床的変数における好ましい変化をもたらした。このことは、ＭＳの臨床的経過に対するＴ細胞ワクチン接種の有益な効果を示唆する。この研究の結果は、先行臨床試験（Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）において報告された知見とほぼ一貫している。しかし、他の臨床的変数とは対照的に、ＥＤＳＳによって測定したところ、臨床的障害に対するＴ細胞ワクチン接種の影響は、両方の研究群において最小であった。これは、比較的短期間（２４ヶ月）にわたる変化を測定することについてのＥＤＳＳの感度の欠如を反映し得る。自己免疫成分がＴ細胞ワクチン接種によって除去または抑制された後でさえ、炎症病変が消散するまでに依然として長期間かかり得、そして既存の組織損傷の一部は永続性である可能性もまた、存在する。これらの結果を考慮すると、本発明は、ＭＳの処置のための自己Ｔ細胞ワクチン、ならびにＭＳの処置のためにこのワクチンを使用するための方法を提供する。
【００２１】
本明細書中に報告される臨床的結果が、患者自身の処置前状態ならびに以前のＭＳ試験において実証されたＭＳの通常の病歴の評価と比較され、プラシーボコントロールと比較されていないことが指摘されるべきである。本研究はまた、本研究のオープンラベル臨床的設計に関連した潜在的プラシーボ効果によって制限される。それゆえ、本研究は、ＭＳにおけるＴ細胞ワクチン接種の役割に有利な重要な臨床的指標を提供したとはいえ、Ｔ細胞ワクチン接種の処置効力は、二重盲検およびプラシーボでコントロールした臨床試験において最良に評価される。
【００２２】
本発明はまた、自己Ｔ細胞ワクチンの調製のための新規な方法を提供する。この方法は、より初期のＴ細胞ワクチンよりも調製が容易であって、患者における改善された免疫学的応答を協調して提供するように作用し得る不均質細胞集団（非クローン性）を提供し、そしてエピトープ拡散またはクローンシフトについての潜在的問題を回避し、そして疾患を担う、より多様性の大きなＴ細胞をより良く除去するように設計される。
【実施例】
【００２３】
（実施例１：ＭＳ患者の血液中のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度の評価）
ＭＳ患者の血液中のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度を、Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）によって記載される方法を用いて評価した。各場合、細胞の処理および細胞培養のために用いた材料は、厳密に自己であった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処理した静脈血から、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配分離によって調製した。これらのＰＢＭＣを、２つの免疫優性領域（アミノ酸残基８３〜９９およびアミノ酸残基１５１〜１７０，Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，Ｍａｒ；３１（３）９０７−９１７）に対応するヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の２つの合成ペプチド（それぞれ、２０μｇ／ｍｌの濃度）の存在下で、１０％熱不活化自己血清および５０ＩＵ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中に（合計９６ウェルについて）２００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。インキュベーションを、３７℃で行った。７日後、全ての培養物を、パルス照射した自己ＰＢＭＣ（凍結または新鮮）で再刺激した。使用の前に、ＰＢＭＣのパルス処理を、ＰＢＭＣを１００μｇ／ｍｌの濃度の各ペプチドとともに３７℃で３時間インキュベートすることにより行い、続いて６０Ｃｏ供給源で４，０００ラドで照射した。さらに１週間のインキュベーション後、各培養物を、ＭＢＰペプチドに応答した特異的増殖について、以下に記載の増殖アッセイにおいて試験した。
【００２４】
手短に述べると、各ウェルを、４つのアリコートに分け（１アリコートあたり約１０４細胞）、そして上記のＭＢＰペプチドの存在下または不存在下（コントロール）において、１０５個のパルス照射した自己ＰＢＭＣとともに２連で培養した。培養物を、３日間インキュベートし、そして最後の１６時間の培養の間、［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で１ウェルあたり１μＣｉでパルスした。次いで、細胞を、自動化細胞収集機を用いて収集し、そして［３Ｈ］−チミジン取り込みを、βプレートカウンター中で測定した。細胞中に取り込まれた３Ｈ−チミジンの１分間あたりのカウントが、１，５００よりも多く、そしてコントロール（ペプチドの不存在下）の１分間あたりのカウントを少なくとも３倍超えた場合、細胞を、ＭＢＰペプチドについて反応性と定義した。次いで、充分な反応性を示すウェルの数を、最初の培養物中に播種したＰＢＭＣの総数（１９．２×１０６細胞）によって除算することによって、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度を評価した（例えば、Ｚｈａｎｇら，１９９４，Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５を参照のこと）。同じ算出方法を一貫して用いて、本研究全体を通してのＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度の変化を比較した。
【００２５】
図１に示すように、これらのＭＳ患者において検出された循環しているＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度は、約１４×１０−５であった。これは、Ｚｈａｎｇら，（１９９４）、およびＯｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：１８３−１８７（１９９０）によって報告された約１０×１０−５の頻度と匹敵する（実施例５も参照のこと）。
【００２６】
（実施例２：Ｔ細胞ワクチン接種のためのミエリン反応性Ｔ細胞の作製）
（ＰＢＭＣの調製および一次刺激）
新鮮な血液標本を、収集２時間以内に処理した。あるいは、単核細胞は、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）から入手され得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配分離法によって、全血から単離した。特に、ヘパリン処理した血液をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（１：１の血液／ＨＢＳＳ）で希釈し、次いで遠心管中のＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ溶液上にゆっくりと重層した。そして１８００ｒｐｍで１８℃〜２５℃、ブレークなしで２０分間遠心分離する。次いで、ＰＢＭＣを、過剰のＨＢＳＳを添加して１７００ｒｐｍで１０分間、１８℃〜２５℃で遠心分離することによって洗浄した。精製したＰＢＭＣを、遠心分離によってＲＰＭＩ １６４０培地中で３回洗浄し、続いてＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中に再懸濁した。細胞数を数え、そして細胞を、２００，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルＵ字底型培養プレート上にプレーティングした。全てのプレートを、患者数および患者のイニシャルでラベルした。実施例１で考察したミエリンペプチドを、それぞれ、２０μｇ／ｍｌでこの培養物に添加した。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中に配置し、そして毎日目視試験試験した。細胞を、培養培地を交換することなく７日間培養して、ペプチド特異的Ｔ細胞を選択的に増殖させた。
【００２７】
（ＭＢＰペプチド特異的Ｔ細胞株の同定および選択）
全てのウェル由来の細胞の約５０％を取り出し、そして２つのウェル（抗原ウェルおよびコントロールウェル）に均等に分けた。新鮮なＰＢＭＣまたは解凍したＰＢＭＣを、８，０００（６０Ｃｏ源を用いる）ラドで照射し、そして供給源の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、１００，０００細胞／ウェルで用いた。細胞を、５％ヒトＡＢ＋血清を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した。上記の実施例１に記載されるミエリンペプチドを、それぞれ、２０μｇ／ｍｌで、この抗原ウェルに対して添加した。ミエリンペプチドを含まない培地を、一対のコントロールウェルに対して添加した。あるいは、以下によって記載されるものを含め、他の多発性硬化症関連抗原（すなわち、ミエリン抗原および／またはそのフラグメント）を用い得る：Ｍａｒｋｏｖｉｃ−Ｐｌｅｓｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９５），９８２−９９２（プロテオリピドタンパク質エピトープ）；Ｇｅｎａｉｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９５），２９６６−２９７４；Ｋｅｒｌｅｒｏ ｄｅ Ｒｏｓｂｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，（１９９３）９２：２６０２−２６０８；Ｔｒｏｔｔｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９８）８４：１７２−１７８およびＴｒｏｔｔｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）７５：９５（ミエリンプロテオリピドタンパク質）；Ｌｉｎｄｅｒら，Ｂｒａｉｎ，（１９９９）１２２：２０８９（ミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質）；およびＪｏｈｎｓｏｎら，Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９５）４５：１２６４（グラチラマー［コポリマー１］）。本発明によってまた、上記の抗原および／またはそのフラグメントの組み合わせの使用が企図される。
【００２８】
次いで、細胞を、自動化細胞収集機を用いて収集し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みをＢｅｔａｐｌａｔｅカウンター中で測定した。対応するミエリンペプチドに対する各Ｔ細胞株／ウェルの反応性を、［３Ｈ］チミジン取り込み増殖アッセイによって決定した。特に、各ウェル由来の細胞を、４つのアリコート（１アリコートあたり約１０４細胞）に分け、そして２連で、ミエリンペプチドの存在下および不存在下で、ＡＰＣの供給源としての、照射した１０５個の自己ＰＢＭＣとともに培養した。培養物を３日間インキュベートし、そして培養の最後の１６時間の間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンでパルスした。この抗原ウェルの１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）／コントロールウェルのｃｐｍの商が、３以上である；およびこの抗原ウェルの総ｃｐｍが１，５００よりも大きいの両方である場合、Ｔ細胞株は、ミエリンペプチド特異的であると定義される。ミエリン反応性Ｔ細胞の頻度を、ポアッソンの統計学に従って評価した。同定されたミエリン反応性Ｔ細胞株の残りの５０％の細胞を、照射したＰＢＭＣで、増大のために再刺激する。
【００２９】
（選択したＴ細胞株／クローンの増大および確立）
Ｔ細胞株が、ミエリンペプチド反応性であると同定され、続いて、１回再刺激された後、これをさらに増殖して、以下の方法のうちの１つを用いて、ワクチン接種のために十分な細胞を産生する：直接増大法およびＴクローン化方法。増殖方法の選択は、そのミエリンペプチドに対するＴ細胞株の特異性および反応性に依存する。これらの特異性は、刺激指数（ＳＩ）によって測定される。ＳＩは、上記の［３Ｈ］−チミジン取り込み増殖アッセイによる結果から計算される。ＳＩは、抗原ウェルの１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）／コントロールウェルのｃｐｍの商である。ＳＩが５以上である場合、この直接増大法が用いられる。ＳＩが５未満である場合、クローニング方法が用いられる。
【００３０】
（直接増大法）
手短に述べると、次いで、５以上のＳ．Ｉ．を有すると同定されたミエリン反応性Ｔ細胞を、照射した自己ＰＢＭＣの存在下で、対応するミエリンペプチドでの刺激サイクルとＰＨＡでの刺激サイクルとを交互に行う、直接増大法（ＤＥＭ）によって増大させた。各刺激サイクルを、７〜１０日間実施した。より詳細には、上記のとおりに同定されたミエリン反応性Ｔ細胞を、照射したＰＢＭＣ（ＡＰＣ）（１ウェルあたり１００，０００細胞）の存在下で、１ウェルあたり２０，０００〜４０，０００細胞でプレーティングした。それぞれ、対応するミエリンペプチドを抗原刺激サイクルのために２０μｇ／ｍｌで添加した。そしてＰＨＡを各ＰＨＡ刺激サイクルのために１μｇ／ｍｌで添加する。組換えヒトＩＬ−２もまた、刺激サイクルの２日目に１００ＩＵ／ｍｌで添加した。培養物を、１０％ヒトＡＢ＋血清および１００ＩＵ／ｍｌ ｒＩＬ−２を含むＲＰＭＩ １６４０培地で３〜４日毎にリフレッシュした。ミエリン反応性Ｔ細胞株を、総細胞数が約２０００万個に達するまで、交互刺激サイクルで増殖させた。
【００３１】
（ＤＥＭによって調製されたＴ細胞株の反応性）
【００３２】
【数１】
このクローニング方法において、Ｔ細胞株を、限界希釈アッセイを使用してクローニングした。各ミエリンペプチド反応性Ｔ細胞株の細胞をプールし、そして１０％ヒトＡＢ＋血清および１００ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ−２を含むＲＰＭＩ １６４０培養培地中に約０．３〜約２０細胞／ウェルで播種した。ＰＨＡを１μｇ／ｍＬで添加し、そして照射した自己ＡＰＣを１００，０００細胞／ウェルで添加した。１００ＩＵ／ｍＬのｒＩＬ−２を含む培養培地ＲＰＭＩ １６４０を、３〜４日毎に交換した。培養の１４日後、増殖陽性ウェルをアッセイして、上記のような対応するミエリンペプチドに対する特異的反応性を決定した。これらのペプチド特異的Ｔ細胞株のさらなる増殖を、対応するミエリンペプチドおよびＰＨＡを用いる代替的刺激サイクルにおいて、上記の直接的増殖方法に従って実施した。
【００３３】
（実施例３）
（Ｔ細胞ワクチン接種による、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇）
ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝２８）を有する患者およびＳＰ−ＭＳ（ｎ＝２６）を有する患者５４人を、この非盲検研究のために採用した。これらの患者のベースラインの臨床的特徴を、表１に示す。各患者は、上記のように準備された２ヶ月間隔で、照射した自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（このクローニング方法によって調製された）を用いる皮下注射の３つの過程を受けた。患者を、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度、再発率、ＥＤＳＳおよびＭＲＩ病変活性における変化について、２４時間モニタリングした。これらの結果を、自己対合様式でワクチン接種前の値と比較した。さらに、β−インターフェロン−１ａ臨床試験におけるＲＲ−ＭＳ（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）および最近のβ−ＩＦＮ−１ｂ研究におけるＳＰ−ＭＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、３５２：１４９１−１４９７（１９８８））の偽薬対照集団の臨床データを、比較のためのＭＳの自然歴データを提供するために含めた。この研究において記載される偽薬コントロール被験体のベースライン特徴は、より低い平均ＥＤＳＳ以外は、本明細書中に記載される患者集団研究のベースライン特徴と類似であった。
【００３４】
図１に示されるように、そして実施例１に簡潔に記載されるように、ベースライン（１４×１０−５）にてこれらのＭＳ患者において検出される循環ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度は、以前の研究において報告された頻度（末梢血単核球中に約１０×１０−５）（Ｚｈａｎｇら、１９９４、Ｏｔａら、１９９０）に高度に匹敵した。ＲＲ−ＭＳ集団とＳＰ−ＭＳ集団との間のＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度においては、有意な差異は見出されなかった。Ｔ細胞頻度は、９２％の患者において検出不能であったか、または３つの過程のワクチン接種の終了後２〜３ヶ月に、残りの患者において実質的に減衰した（１４×１０−５ 対 １．９×１０−５、ｐ＜０．０００１）。これらの結果により、ＭＳを有する患者におけるＴ細胞ワクチン接種による、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を確認した。
【００３５】
（実施例４）
（自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を使用するＭＳ患者のワクチン接種）
５４人のＭＳを有する患者を、この試験に参加させた。包括基準は、少なくとも２年間にわたる臨床的に明確なＭＳ、ＲＲ−ＭＳについて１．５〜６．５の、そして二次進行性ＭＳ（ＳＰ−ＭＳ）を有する患者について４．０〜８．０の、ベースラインの拡大身体障害状態スケール（ＥＤＳＳ）、および緩和−軽減ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）集団について、研究に入る前の過去２年間での少なくとも１回の再燃、であった。約２５％の患者は、β−インターフェロンまたはグラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）を用いた処置に対して応答または許容することに以前に失敗し、そして残りの患者は、研究に入る前の少なくとも１ヶ月間および研究の間中、これらの薬剤で処置されていなかった。これらの患者は、研究に参加する前の少なくとも３ヶ月間、いかなる免疫抑制薬物（ステロイドを含む）をも摂取していなかった。悪化が生じる場合には、ステロイドをこの研究の間に許容した。疲労、痙縮および膀胱病訴についての全身処置は、禁止しなかった。インフォームドコンセントを、実験手順の説明後に患者から得た。このプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって承認された。
【００３６】
ワクチン接種プロトコルは、以前の臨床研究において使用されたプロトコルと類似であった（Ｚｈａｎｇら、１９９３、Ｍｅｄａｅｒら、１９９５）。簡潔には、上記のクローニング方法によって調製したＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンを、アクセサリー細胞の供給源としての照射したＰＢＭＣの存在下で、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１μｇ／ｍｌ）を用いて予め活性化した。次いで、細胞を、１０％心臓不活化自己血清および５０単位のｒＩＬ−２を補充したＲＲＩＭ １６４０中で５〜６日間培養した。活性化ＭＢＰ反応性Ｔ細胞を、引き続いて滅菌生理食塩水で３回洗浄して、残留ＰＨＡおよび細胞細片を除去した。照射（８，０００ｒａｄｓ、６０Ｃｏ源）後、細胞を、２ｍｌの生理食塩水中に再懸濁し、そして２本の腕に皮下注射した（１ｍｌ／腕）。ワクチン接種のために使用したＴ細胞数は、１回の注射当たり４０×１０６〜８０×１０６細胞の範囲であり、そして相対的皮膚表面積基準で、実験動物において有効なＴ細胞用量の外挿によって選択した（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら、１９８１）。各患者は、２ヶ月間隔で３回の皮下注射を受けた。
【００３７】
次いで、患者を、障害の進行、ＥＤＳＳ、再発率およびＭＲＩ病変活性の確認開始までの時間にわたり、観察した。これらの結果を、この患者自身の処置前の過程、ならびにＲＲ−ＭＳ患者およびＳＰ−ＭＳ患者における２つの最近の臨床試験の偽薬集団（これは、ＭＳの自然歴の概算として働く）と比較した（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８）。進行までの時間を、少なくとも２ヶ月間にわたって持続する、ＥＤＳＳに対する少なくとも１．０の増加（Ｐｏｓｅｒら、１９８３）によって決定した。研究中の悪化は、新たな神経学的症状の出現、または神経学的試験に対する客観的な変化（ＥＤＳＳに対する少なくとも０．５ポイントの悪化）を伴う、少なくとも４８時間続く既存の神経学的症状の悪化、によって定義した。患者に、計画された定期的な訪問の間の事象を報告するように指示し、そして症状が悪化を示唆した場合に、神経学者が患者を試験した。安全性評価は、定期的な訪問時の有害事象、バイタルサインおよび身体試験を含んだ。Ｔ細胞ワクチン接種の前後の研究患者における臨床的変数の差異を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用して分析した。
【００３８】
（実施例５）
（ワクチン接種後のＭＳの臨床過程の変化）
Ｔ細胞ワクチン接種による循環ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇がＭＳの臨床過程を変更するか否かを解決することを試みた。患者は、上記のように調製した自己Ｔ細胞ワクチンを受けた。幾人かの患者において注射部位で見られた弱く一過的な紅斑以外には、Ｔ細胞ワクチン摂取に伴う有害効果は存在せず、そして全ての患者を、外来診療所で処置した。表２に示されるように、平均ＥＤＳＳは、ワクチン接種後２４ヶ月間に亘って、ＲＲ−ＭＳを有する患者において僅かに減少した（開始時３．２１ 対 終了時３．１）。比較として、β−ＩＦＮ−１ａ試験を使用して実施された試験（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）において報告されたのと同じ観察期間にわたって、ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝５６）の自然歴において、平均ＥＤＳＳが０．６１増加した。さらに、ＥＤＳＳを変化させなかったかまたは改善したのいずれかであった患者集団は、自然ＭＳ歴の患者集団と比較して、かなり高かった（７５％ 対 ５０％）。処置されたＲＲ−ＭＳ群中の一人（３．５％）の患者だけが、ＭＳの自然歴中の患者の１８％と比較して、２４ヶ月以内に２．０のＥＤＳＳを超えて進行した（表２）。
【００３９】
ＳＰ−ＭＳ集団において、平均ＥＤＳＳは、ＳＰ−ＭＳの自然歴において記録された＋０．６と比較して、２４ヶ月間の期間にわたって僅かに進行した（＋０．１２）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８；３５２：１４９１−１４９７）。さらに、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して確認された進行までの時間の概算は、ＭＳ患者の自然歴（ＲＲ−ＭＳについて１２ヶ月およびＳＰ−ＭＳについて９ヶ月で、２０％の進行）と比較して、かなりの遅延（両方の処置群について、１８ヶ月で２０％の進行）を示した（Ｊａｃｏｂｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ、１９９６；３９；２８５−２９４、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８）。しかし、進行は、両方の研究群において、１８ヶ月後（最後のワクチン接種の１２ヶ月後）に加速するようであった。
【００４０】
（実施例６）
（臨床的悪化速度の変化）
表３に示されるように、再発の年率は、Ｔ細胞ワクチン接種後のＲＲ−ＭＳを有する患者において減少し、ベースラインの再発率からの４０％の減少を示した。再発率における有意な差異は、処置の１年目と２年目との間には見出されなかった。比較として、再発の年率における２５％の減少が、ＲＲ−ＭＳの自然歴において観察された（Ｊａｃｏｂｓら、１９９６）。さらに、攻撃を示さないかまたは攻撃をほとんど示さない患者集団は、自然ＭＳ歴における患者集団よりもかなり高かった（表３）。再発率は、ＳＰ−ＭＳ集団において５０％減少したが、本明細書中で試験した少数の二次進行性患者だけ（６／２６）が、研究に入る前の２年間に再発した。
【００４１】
（実施例７）
（画像共鳴像試験による脳病変活性）
画像共鳴像（ＭＲＩ）を、ガドリニウム増強Ｔ２加重画像として実施した。より高い信号強度の領域を、半定量的様式でスコアリングした（Ｓｃｈｅｌｔｅｎら、Ｂｒａｉｎ １９９２；１１５：７３５−７４８、Ｔｒｕｙｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９０；９６：１７３−１８２）。このスコアリング方法は、増大した信号過剰強度（ｈｙｐｅｒｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を有する病巣のサイズおよび数の両方に関連するスコアを
生じた。信号過剰強度を、以下の領域においてスコアリングした：（ｉ）前頭および後頭領域の脳室周囲、ならびに側脳室に対して平行；（ｉｉ）前頭、側頭、頭頂骨および後頭領域中の別々の葉性白質；（ｉｉｉ）脳幹神経節、尾状核、被殻、淡蒼球および視床、ならびに（ｉｖ）テント下領域、小脳、中脳、橋および髄質。病変を、以下のようにスコアリングした：直径０．５ｃｍ未満の病変には、スコア「１」を与え、０．５ｃｍと１．０ｃｍとの間には「２」を与え、１．０ｃｍと１．５ｃｍとの間には「３」を与え、１．５ｃｍと２．０ｃｍとの間には「４」を与えそして２．０ｃｍより大きいものには「５」を与えた。融合性病変を、以下のように測定した：上記のような目的の領域の２５％未満が異常な信号強度であるとみなされた場合、スコア「５」を与え、目的の可視化領域の５０％より多くが罹患している場合には、２５％および５０％については「１０」および「１５」を与えた。次いで、これらの値を、「個々の」病変スコアに加算した。
【００４２】
３つのガドリニウム増強Ｔ２加重ＭＲＩ試験を、開始時（ベースライン）、１２ヶ月目および終了時（２４ヶ月）で実施して、疾患進行の指標として脳病変活性の変化をモニタリングした。異なる医療センターで実施されたいくつかのスキャンの技術的不適合性に起因して、３４人の患者だけからのＭＲＩスキャンを分析し得た。全てのＭＲＩスキャンを、この臨床試験に関与しなかった外部の神経学者によって評価した。本発明者らの予備臨床試験および他の関連の研究において以前に使用した半定量的スコアリング方法を使用して、病変活性を評価した（Ｍｅｄａｅｒら、１９９５、Ｓｃｈｅｌｔｅｎｓら、１９９２、Ｔｒｕｙｅｎら、１９９０）。このスコアリング方法は、Ｔ２加重画像の増大した信号過剰強度を有する病巣のサイズおよび数の両方に関連するスコアを生じた。表４に示されるように、これらの結果は、試験した患者の７０％において、ＭＲＩ病変スコアが、病変スコアにおける少なくとも１ポイントの減少によって規定されるように、不変であったかまたは改善されたかのいずれかであったが、一方で残り３０％の患者は、研究過程の間に増加した病変スコアを有したことを明らかにした。集団的に、平均ＭＲＩ病変スコアにおける変化は、１年目には１．２％の減少を示したが、２年目にはベースラインＭＲＩから３．３％の増加を示した。しかし、これらの変化は有意ではなかった（Ｐ＞０．４）。これらの結果は、Ｔ細胞ワクチン接種に寄与する安定化またはいくらかの改善を反映し得る。なぜなら、ＭＲＩ病変は、一般に、種々の臨床試験において報告されたように、未処置のＲＲ−ＭＡ患者において１年基準で約１０％進行するからである（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９８、ＩＦＮＢ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９３；４３：６５５−６６１）。まとめると、これらの知見は、Ｔ細胞ワクチン接種によるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇と試験したＭＳ患者における臨床的改善との間の有利な相関を示唆する。
【００４３】
本発明を、非限定的な実施例および好ましい実施形態によって記載してきたが、これらは、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲を限定するとは意図されない。
【００４４】
【表１】
ａβ−ＩＮＦ−１ａ試験のプラシーボコントロール群［７］。ｂβ−ＩＮＦ−１ｂ試験のプラシーボコントロール群［７］。
【００４５】
【表２】
ａ２年間の、ベースラインからのＥＤＳＳにおける個体内変化。ｂβ−ＩＮＦ−１ａ試験のプラシーボコントロール群［７］。ｃβ−ＩＮＦ−１ｂ試験のプラシーボコントロール群［５］。
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１６８６１８（Ｐ２０１１−１６８６１８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１９７７１（Ｐ２０１１−１１９７７１）
【出願日】平成２３年５月２７日（２０１１．５．２７）
【分割の表示】特願２００７−１７１３０３（Ｐ２００７−１７１３０３）の分割
【原出願日】平成１４年９月１２日（２００２．９．１２）
【出願人】（５０４０５１７２２）オペクサ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (4)
【出願人】（３９１０５８０６０）ベイラー カレッジ オブ メディスン (16)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２７日（２０１１．５．２７）
【分割の表示】特願２００７−１７１３０３（Ｐ２００７−１７１３０３）の分割
【原出願日】平成１４年９月１２日（２００２．９．１２）
【出願人】（５０４０５１７２２）オペクサ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (4)
【出願人】（３９１０５８０６０）ベイラー カレッジ オブ メディスン (16)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【Ｆターム（参考）】
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