菌の抗生物質感受性の制御方法
【課題】抗生物質に対する細菌の感受性を制御するための方法、及び抗生物質に対する感受性が増強又は低減された菌を提供する。
【解決手段】細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
【解決手段】細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌の抗生物質感受性の制御機構に関する。
【０００２】
多くの抗生物質は、細胞膜、細胞壁、莢膜等の菌の外被構造をターゲットとする。一方で菌は、外部環境からの抗生物質による攻撃に対して様々な防御機構を発達させてきた。例えば、グラム陽性菌の場合、抗生物質による外被への攻撃は、主に２つのシグナル伝達機構によって感知され、そこから膜の修復や機能維持のための細胞の活動が起こる。この抗生物質による攻撃を感知するための主な機構の１つはＥＣＦ（ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）シグマ因子機構であり、もう１つは二成分制御系と呼ばれる機構である。これらの機構は共同して抗生物質からの攻撃に応答すると考えられている。
【０００３】
二成分制御系とは、刺激に対するレセプター且つヒスチジンキナーゼとして働くセンサータンパク質と、そのセンサーからのリン酸シグナルを受けて活性化し、遺伝子発現を制御するレギュレータータンパク質とで構成される環境応答機構である。枯草菌（Bacillus subtilis）のタンパク質ＬｉａＲ及びＬｉａＳ（あるいはＹｖｑＣ及びＹｖｑＥ）は、細胞壁ストレスに応答する二成分制御系を構成する成分であることが知られている。ＬｉａＲＳ二成分制御系において、ＬｉａＳは細胞壁に作用するいくつかの抗生物質に応答してＬｉａＲをリン酸化し、リン酸化されたＬｉａＲは、ｌｉａＩＨ上流に結合してその発現を制御する。二成分制御系ＬｉａＲＳは、ｌｉａＩＨＧＦＳＲオペロンを活性化させるポジティブレギュレーターとして働く（非特許文献１〜５）。
【０００４】
ＬｉａＲＳ二成分制御系は、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ、ｎｉｓｉｎ等の抗生物質に応答してｌｉａオペロンに対して強いポジティブレギュレーションを及ぼし得るが、一方、ＬｉａＲＳ二成分制御系によるｌｉａＩＨの発現向上が起こった場合にも、上記抗生物質に対する菌の耐性は向上しないことが知られている（特許文献１、非特許文献６）。当該二成分制御系を利用した抗生物質の探索方法や抗生物質に対する耐性の探索方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、ＬｉａＲＳ二成分制御系が実際にプロモーターにどのように作用してｌｉａ遺伝子の発現を制御するのかについての詳細な解析は、従来行われていなかった。
【０００５】
ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎと似た構造及び作用を有する抗生物質であり、ペプチドグリカン生合成におけるトランスグリコシレーションに影響して細胞壁生合成を阻害する。ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、幅広いグラム陽性菌に対して作用する抗生物質であり、またｂａｃｉｔｒａｃｉｎやｖａｎｃｏｍｙｃｉｎとは異なる作用機序を有するので、抗生物質の選択肢として、または新たな抗生物質探索のための研究材料として有用である。しかし、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性を獲得している菌は既に存在している（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第7,309,484号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jordanら，Microbiology, 2007, 153:2530-2540
【非特許文献２】Jordanら，Journal of Bacteriology, 2006, 188(14):5133-5166
【非特許文献３】Mascherら，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(8):2888-2896
【非特許文献４】Jordanら，FEMS Microbiology reviews, 2008, 32:107-146
【非特許文献５】Mascherら，Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006, 70(4):910-938
【非特許文献６】Mascherら，Molecular Microbiology, 2003, 50(5):1591-1604
【非特許文献７】YinおよびZabriskie，Microbiology, 2006, 152:2969-2983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗生物質に対する細菌の感受性を制御するための方法、及び抗生物質に対する感受性が増強又は低減された菌を提供することに関する。また本発明は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性に関与する遺伝子を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、枯草菌二成分制御系の遺伝子ｌｉａＲ及びｌｉａＳ、ならびに当該二成分系によって転写制御を受けるｌｉａＩＨからなる群から選択される遺伝子を菌から削除することによって、特定の抗生物質に対する当該菌の感受性を増強させることができること、したがってこれらの遺伝子が当該抗生物質に対する感受性遺伝子として機能し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいは遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
（２）前記遺伝子を欠失若しくは不活性化させることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）前記遺伝子を導入することを特徴とする（１）記載の方法。
（４）（２）記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株の製造方法。
（５）（４）記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株。
（６）（３）記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株の製造方法。
（７）（６）記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来知られていなかった作用機序を利用した、細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を制御するための新たな方法を提供することができる。また当該方法を利用することによって、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性が増強又は低減された細菌を提供することができる。本発明は、感染症の予防又は治療、薬剤耐性菌の選択又は除去、細菌による汚染の防止、その他細菌を用いた種々の研究のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ノーマーカー削除法による遺伝子欠失株の作製手順。
【図２】抗生物質による転写誘導を示す、ＬａｃＺアッセイデータ。
【図３】欠失株のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎに対する感受性。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載される枯草菌遺伝子のＩＤ番号、名称、塩基配列、及びゲノム上での配置は、特に記載されない限り、ＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)に基づく。
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
ｌｉａＲ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５７）及びｌｉａＳ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９６７）は、枯草菌二成分制御系を構成するタンパク質をコードする遺伝子であり、各々ｙｖｑＣ及びｙｖｑＥとも称され、また本明細書において集合的にｌｉａＲＳとも記載される。ｌｉａＳによってコードされるタンパク質ＬｉａＳ（ＢＳＵ３３０９０）はヒスチジンキナーゼであって、二成分制御系のセンサーとして働き、一方、ｌｉａＲによってコードされるタンパク質ＬｉａＲ（ＢＳＵ３３０８０）は二成分制御系のレギュレーターとして働くと考えられている。また、ｌｉａＩ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５８）及びｌｉａＨ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３８５８５）は、各々ｙｖｑＩ及びｙｖｑＨとも称され、また本明細書において集合的にｌｉａＩＨとも記載される。ｌｉａＩＨは、その上流領域にＬｉａＲが結合することによって転写が活性化されることが知られている遺伝子である。ｌｉａＩによってコードされるタンパク質ＬｉａＩ（ＢＳＵ３３１３０）は膜タンパク質と考えられており、一方、ｌｉａＨによってコードされるタンパク質ＬｉａＨ（ＢＳＵ３３１２０）はファージショックタンパク質と類似することが知られている。
【００１６】
本明細書において「ｌｉａＳに相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＳ（又はｙｖｑＥ）遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＳと同様に二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＳと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ｌｉａＳに相当する遺伝子」である。
【００１７】
本明細書において「ｌｉａＲに相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＲ（又はｙｖｑＣ）遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲと同様に二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＲと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ｌｉａＲに相当する遺伝子」である。
【００１８】
本明細書において、「ｌｉａＩに相当する遺伝子」及び「ｌｉａＨに相当する遺伝子」とは、各々、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＩ遺伝子及びｌｉａＨ遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つｌｉａＲ又はそれに相当する遺伝子の発現産物が特異的に結合してレギュレーター活性を発揮するプロモーターによってその転写が誘導される遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＩ及びｌｉａＨと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、各々「ｌｉａＩに相当する遺伝子」及び「ｌｉａＨに相当する遺伝子」である。
【００１９】
ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ又はｌｉａＨに相当する遺伝子としては、例えば、下記表１に記載の遺伝子が挙げられる。表１は、各バクテリア種の代表的な菌株とその代表的なｌｉａＲＳＩＨ相同遺伝子を挙げたものである。表１の菌がさらに有する別の相同遺伝子、及び表１と同種の異なる菌株が有する表１と同じ相同遺伝子又は別の相同遺伝子も、本発明におけるｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ、ｌｉａＨ各遺伝子に相当する遺伝子に含まれる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明の方法においては、標的の細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいは遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することによって、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する当該細菌の感受性を制御する。例えば、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ若しくはｌｉａＨ、又はこれらに相当する遺伝子を有する細菌において、ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を当該細菌から欠失若しくは不活性化させることにより、当該細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を増強させることができる。一方、遺伝子ｌｉａＩ若しくはｌｉａＨ、又はこれらに相当する遺伝子を有さない細菌において、遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子、あるいはさらに必要に応じて、遺伝子ｌｉａＲ若しくはｌｉａＳ又はこれらに相当する遺伝子、又はｌｉａＩＨ上流のｌｉａＩＨプロモーター若しくはｌｉａＩＨに相当する遺伝子のプロモーター等のプロモーターを当該細菌に導入することにより、当該細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を減弱させることができる。
【００２２】
本発明の方法に供される細菌としては、特に限定されないが、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属等のグラム陽性菌が好ましく、バチルス属細菌等がより好ましい。バチルス属細菌の中では、枯草菌又はその変異株が好ましい。
【００２３】
本発明の方法においては、細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上を導入すればよい。遺伝子の欠失若しくは不活性化においては、上記の遺伝子の１以上、例えば、いずれか２、いずれか３又はそれ以上を欠失若しくは不活性化させてもよい。遺伝子の導入においては、ｌｉａＩ及びｌｉａＨのいずれか又は両方を導入すればよいが、さらに必要に応じて、ｌｉａＲ若しくはｌｉａＳ又はこれらに相当する遺伝子、あるいはｌｉａＩＨ上流のｌｉａＩＨプロモーター若しくはｌｉａＩＨに相当する遺伝子のプロモーター等のプロモーターを導入してもよい。
【００２４】
上記遺伝子の導入には、当該分野で通常用いられる任意の方法を用いればよい。例えば、上記遺伝子を含むベクターの細菌への組み込みにより細菌を形質転換することによって、細菌に上記遺伝子を導入することができる。このとき、ベクターとして発現ベクターを利用したり、ベクター上でｌｉａＩＨの上流にｌｉａＩＨプロモーター等のプロモーターを配置することによって、ベクターに含まれるｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。発現ベクターの作製及び細菌への導入の手順は、当業者に周知である。例えば、ベクターへ目的ＤＮＡを導入する場合、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、制限酵素切断配列を端部に有するように構築した目的ＤＮＡを添加することによって、目的ＤＮＡをベクターに導入することができる（制限酵素法）。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）等が好ましい。作製した目的ＤＮＡを含む発現ベクターを、コンピテント法等の通常の方法で宿主細菌に導入すれば、目的ＤＮＡが導入された細菌を得ることができる。
【００２５】
また例えば、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片と細菌ゲノムとの相同組換えにより細菌を形質転換することによって、細菌に当該遺伝子を導入することができる。このとき、上記ＤＮＡ断片上でｌｉａＩＨの上流にｌｉａＩＨプロモーター等のプロモーターを配置することによって、ｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。または、上記ＤＮＡ断片中のｌｉａＩＨが細菌の発現系に組み込まれるように、細菌ゲノム上の適切な領域と当該ＤＮＡ断片とを組み換えることによって、ｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。
【００２６】
上述の手順に従って遺伝子を導入した細菌は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性が減弱された細菌である。
【００２７】
また遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上の欠失若しくは不活性化にも、当該分野で通常用いられる任意の方法を用いることができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５４：３６７−３８２）等による部位特異的突然変異誘発や、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）を利用したノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）等に従ってｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上（以下、標的遺伝子）を含まないＤＮＡと細菌ゲノムとを相同組換えさせることにより、細菌から標的遺伝子を選択的に欠失若しくは不活性化させることができる。上述の手順に従って標的遺伝子を欠失若しくは不活性化させた細菌は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性が増強された細菌である。
【００２８】
一態様として、ノーマーカー削除法による細菌からの標的遺伝子欠失手順を以下に説明する。
まず、ＳＯＥ−ＰＣＲ法によって調製した欠失用ＤＮＡ断片と細菌ゲノムとの２重交差法によって、細菌ゲノムの標的遺伝子を欠失用ＤＮＡ断片と置換し、標的遺伝子を細菌ゲノム上から欠失させる（第１相同組換え）。このとき、欠失用ＤＮＡ断片にスペクチノマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤の耐性遺伝子を挿入しておけば、当該薬剤によりコロニーを選択することで標的遺伝子欠失株を効率的に選択することができる。次いで、得られた欠失株の中から、ゲノム内で第２相同組換えが生じて薬剤耐性マーカー遺伝子が除去された菌株を選択することで、元のゲノムに対して標的領域が欠失し、且つ外来のマーカー遺伝子を含まない菌株を取得することができる。
【００２９】
具体的には、まず、標的遺伝子領域の５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組換え領域上流（断片Ｃ）、そしてlacI及び薬剤耐性遺伝子を含む断片（選択マーカー遺伝子カセット）をそれぞれＰＣＲにより増幅する。次いで、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組換え領域上流（断片Ｃ）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法を行い、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡを構築する（図１）。構築した供与体ＤＮＡを用いて細菌を形質転換し、得られた形質転換体を供与体ＤＮＡに含まれる薬剤耐性遺伝子を利用して選択する。選択された菌株は、第１相同組換えによってゲノムに供与体ＤＮＡが組み込まれて薬剤耐性を示す菌株である。
【００３０】
次に、選択した菌株をＩＰＴＧを含む培地で培養する。ＩＰＴＧ含有培地で生育する菌株は、第２相同組み換えによって、欠失対象領域とともにlacIを含む供与体ＤＮＡが欠失している菌株である（図１）。当該菌株を選択することによって、標的遺伝子が欠失した菌株を取得することができる。同様の手順で標的遺伝子を一部欠失させたり、他の遺伝子や停止コドン等を置換又は挿入することによって、標的遺伝子を不活性化させることも可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例で使用したプライマー及び菌株の一覧を下記表２−１、２−２及び表３に示す。
【００３２】
【表２−１】
【００３３】
【表２−２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
（１）ｌｉａ遺伝子欠失株の作製
ノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）に従って、下記のとおりｌｉａＩＨＧＦＳＲ各遺伝子の欠失株を作製した。
【００３６】
実施例１：ｌｉａＩ欠失株（ΔｌｉａＩ）
枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＰＮＣ−Ｆプライマー（３７）とｃｈｐＡ−Ｒプライマー（３８）（配列番号３７及び３８）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域ｌｉａＩの５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）を、それぞれプライマー１と２（配列番号１及び２）、３と４（配列番号３及び４）及び５と６（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
次に、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）並びにプライマー１と６（配列番号１及び６）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77(1):61-68）を行った。これにより、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡ断片（図１）を取得することができた。
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換方法（J. Bacteriol., 1967, 93(6):1925-1937）に従って、枯草菌１６８株を形質転換した。形質転換は、ＰＣＲ産物を２０μｇ以上用いて行った。
得られた形質転換体を、供与体ＤＮＡに含まれるスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。すなわち、上記形質転換処理後の細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、コロニーを得た。この培養によれば、第１相同組み換え（図１）によって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をＬＢ液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を１ｍＭ ＩＰＴＧを入れたＬＢ寒天プレートに塗布した。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換え（図２）によって、欠失対象領域とともに供与体ＤＮＡが宿主ＤＮＡから欠失したｌｉａＩ削除株（ΔｌｉａＩ）である。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＩ遺伝子の欠失を確認した。
【００３７】
実施例２〜４：ｌｉａＨ、ｌｉａＲ、ｌｉａＳ各遺伝子欠失株（ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、ΔｌｉａＳ）
上記の選択マーカー遺伝子カセット及び表２−１〜２−２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＨ、ｌｉａＲ及びｌｉａＳ各遺伝子の欠失株（ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、及びΔｌｉａＳ）を作製した。得られた各株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＨＳＲ各遺伝子の欠失を確認した。
【００３８】
比較例１〜２：ｌｉａＧ、ｌｉａＦ各遺伝子欠失株（ΔｌｉａＧ、ΔｌｉａＦ）
上記の選択マーカー遺伝子カセット及び表２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＧ及びｌｉａＦ各遺伝子の欠失株（ΔｌｉａＧ及びΔｌｉａＦ）を作製した。ｌｉａＧ及びｌｉａＦは、ｌｉａＩＨの下流に位置する遺伝子である。得られた各株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＧＦ各遺伝子の欠失を確認した。
【００３９】
試験例１：抗生物質に対するＬｉａＲＳ二成分系の応答
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３９と４０（配列番号３９及び４０）によって増幅したｌｉａＩプロモーター領域（転写開始点の-120〜+84領域）のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤＬ２（Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146(Pt 7):1573-83）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)を作製した。
このｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)でΔｌｉａＨ欠失株を形質転換し、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーを（１６８，ａｍｙＥ：：ｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株として取得した。得られた株については、ＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺが挿入されていることを確認した。
得られた株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養し、次いで細胞に０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、及び２μｇ／ｍｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを負荷し、３０分後に集菌した。コントロールとして抗生物質非添加群を調製した。
集菌した細胞に対してＬａｃＺアッセイを行った。ＬａｃＺアッセイはYoungman et al.（In Molecular Biology of Microbial Differentation. 1985, American Society for Microbiology Washington D.C., pp47-54）の方法に従った。細胞を１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１００μｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む、２００μｌ Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ４、０．０４Ｍ ＮａＨ2ＰＯ４、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4、０．００１Ｍ ＤＴＴ）に懸濁し、３７℃で２０分インキュベートして細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心を行い、得られた上清５０μｌに０．４ｍｇ／ｍｌ ＭＵＧ１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、９５℃で１０分間処理して反応を停止させた。４ＭＵの蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。また、上清のタンパク質量はＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、サンプル間の補正に使用した。
【００４０】
ＬａｃＺアッセイの結果を図２に示す。（１６８，ａｍｙＥ：：ｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株において、プロモーターＰｌｉａＩＨの活性化レベルの指標であるＬａｃＺ活性が抗生物質によって顕著に向上した。ＰｌｉａＩＨはＬｉａＲによってアップレギュレーションを受けてｌｉａＩＨの転写を誘導することが知られているプロモーターであるので、本試験の結果から、抗生物質によってＬｉａＲＳ二成分系が顕著に活性化されてｌｉａＩＨ発現が向上することが示された。また、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎやｖａｎｃｏｍｙｃｉｎに比べて、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎはより低濃度でＬａｃＺ活性を向上させ得ることから、ＬｉａＲＳ二成分系はｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対して特に強く応答することが示唆された。
【００４１】
試験例２ ｌｉａ遺伝子欠失株の抗生物質感受性
（１）手順
野生株１６８株、ならびにΔｌｉａＩ、ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＧ、ΔｌｉａＦ、ΔｌｉａＲ及びΔｌｉａＳ各遺伝子欠失株を、ＬＢ液体培地３７℃で一晩培養した。この培養液をＬＢ液体培地で１０0〜１０5倍希釈したもの１０μｌずつを、薬剤を含むＬＢ寒天培地にスポットして３７℃一晩培養し、培養後のプレートを観察した。薬剤の濃度については、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ ０．００５μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ １０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００４２】
（２）結果
実施例１〜４（ΔｌｉａＩ、ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、及びΔｌｉａＳ）の各欠失株は、野生株の生育限界の約１／１００〜１／１０００の濃度のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ存在下でもほとんど生存することができず、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性が大きく損なわれていることが示された（図３）。一方、比較例１〜２（ΔｌｉａＦ及びΔｌｉａＧ）の欠失株は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ存在下での培養で野生株と同程度の生育率を示し、野性株と同様にｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性を保持していた。また、抗生物質としてｂａｃｔｏｒａｃｉｎおよびｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを用いて同様の実験を行った場合、何れの欠失株も野生株と同等の抗生物質耐性を示し、遺伝子の欠失が抗生物質感受性に影響しないことが明らかになった（図３）。
【００４３】
試験例１及び２の結果より、ＬｉａＲＳ二成分系は種々の抗生物質に対して活性化するが、それらの抗生物質の全てに対する菌の感受性に関与するものではないことが示された。また試験例２の結果より、ＬｉａＲＳ二成分系の経路の中でも、抗生物質耐性に寄与し得る成分と、そうでない成分があることが示された。ＬｉａＲＳ二成分系の遺伝子ｌｉａＳ、ｌｉａＲ、ｌｉａＩ、ｌｉａＨは細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性に関与すること、特にｌｉａＩ、ｌｉａＨはｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ耐性付与遺伝子である可能性が示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌の抗生物質感受性の制御機構に関する。
【０００２】
多くの抗生物質は、細胞膜、細胞壁、莢膜等の菌の外被構造をターゲットとする。一方で菌は、外部環境からの抗生物質による攻撃に対して様々な防御機構を発達させてきた。例えば、グラム陽性菌の場合、抗生物質による外被への攻撃は、主に２つのシグナル伝達機構によって感知され、そこから膜の修復や機能維持のための細胞の活動が起こる。この抗生物質による攻撃を感知するための主な機構の１つはＥＣＦ（ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）シグマ因子機構であり、もう１つは二成分制御系と呼ばれる機構である。これらの機構は共同して抗生物質からの攻撃に応答すると考えられている。
【０００３】
二成分制御系とは、刺激に対するレセプター且つヒスチジンキナーゼとして働くセンサータンパク質と、そのセンサーからのリン酸シグナルを受けて活性化し、遺伝子発現を制御するレギュレータータンパク質とで構成される環境応答機構である。枯草菌（Bacillus subtilis）のタンパク質ＬｉａＲ及びＬｉａＳ（あるいはＹｖｑＣ及びＹｖｑＥ）は、細胞壁ストレスに応答する二成分制御系を構成する成分であることが知られている。ＬｉａＲＳ二成分制御系において、ＬｉａＳは細胞壁に作用するいくつかの抗生物質に応答してＬｉａＲをリン酸化し、リン酸化されたＬｉａＲは、ｌｉａＩＨ上流に結合してその発現を制御する。二成分制御系ＬｉａＲＳは、ｌｉａＩＨＧＦＳＲオペロンを活性化させるポジティブレギュレーターとして働く（非特許文献１〜５）。
【０００４】
ＬｉａＲＳ二成分制御系は、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ、ｎｉｓｉｎ等の抗生物質に応答してｌｉａオペロンに対して強いポジティブレギュレーションを及ぼし得るが、一方、ＬｉａＲＳ二成分制御系によるｌｉａＩＨの発現向上が起こった場合にも、上記抗生物質に対する菌の耐性は向上しないことが知られている（特許文献１、非特許文献６）。当該二成分制御系を利用した抗生物質の探索方法や抗生物質に対する耐性の探索方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、ＬｉａＲＳ二成分制御系が実際にプロモーターにどのように作用してｌｉａ遺伝子の発現を制御するのかについての詳細な解析は、従来行われていなかった。
【０００５】
ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎと似た構造及び作用を有する抗生物質であり、ペプチドグリカン生合成におけるトランスグリコシレーションに影響して細胞壁生合成を阻害する。ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、幅広いグラム陽性菌に対して作用する抗生物質であり、またｂａｃｉｔｒａｃｉｎやｖａｎｃｏｍｙｃｉｎとは異なる作用機序を有するので、抗生物質の選択肢として、または新たな抗生物質探索のための研究材料として有用である。しかし、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性を獲得している菌は既に存在している（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第7,309,484号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jordanら，Microbiology, 2007, 153:2530-2540
【非特許文献２】Jordanら，Journal of Bacteriology, 2006, 188(14):5133-5166
【非特許文献３】Mascherら，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(8):2888-2896
【非特許文献４】Jordanら，FEMS Microbiology reviews, 2008, 32:107-146
【非特許文献５】Mascherら，Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006, 70(4):910-938
【非特許文献６】Mascherら，Molecular Microbiology, 2003, 50(5):1591-1604
【非特許文献７】YinおよびZabriskie，Microbiology, 2006, 152:2969-2983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗生物質に対する細菌の感受性を制御するための方法、及び抗生物質に対する感受性が増強又は低減された菌を提供することに関する。また本発明は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性に関与する遺伝子を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、枯草菌二成分制御系の遺伝子ｌｉａＲ及びｌｉａＳ、ならびに当該二成分系によって転写制御を受けるｌｉａＩＨからなる群から選択される遺伝子を菌から削除することによって、特定の抗生物質に対する当該菌の感受性を増強させることができること、したがってこれらの遺伝子が当該抗生物質に対する感受性遺伝子として機能し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいは遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
（２）前記遺伝子を欠失若しくは不活性化させることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）前記遺伝子を導入することを特徴とする（１）記載の方法。
（４）（２）記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株の製造方法。
（５）（４）記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株。
（６）（３）記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株の製造方法。
（７）（６）記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来知られていなかった作用機序を利用した、細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を制御するための新たな方法を提供することができる。また当該方法を利用することによって、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性が増強又は低減された細菌を提供することができる。本発明は、感染症の予防又は治療、薬剤耐性菌の選択又は除去、細菌による汚染の防止、その他細菌を用いた種々の研究のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ノーマーカー削除法による遺伝子欠失株の作製手順。
【図２】抗生物質による転写誘導を示す、ＬａｃＺアッセイデータ。
【図３】欠失株のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎに対する感受性。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載される枯草菌遺伝子のＩＤ番号、名称、塩基配列、及びゲノム上での配置は、特に記載されない限り、ＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)に基づく。
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
ｌｉａＲ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５７）及びｌｉａＳ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９６７）は、枯草菌二成分制御系を構成するタンパク質をコードする遺伝子であり、各々ｙｖｑＣ及びｙｖｑＥとも称され、また本明細書において集合的にｌｉａＲＳとも記載される。ｌｉａＳによってコードされるタンパク質ＬｉａＳ（ＢＳＵ３３０９０）はヒスチジンキナーゼであって、二成分制御系のセンサーとして働き、一方、ｌｉａＲによってコードされるタンパク質ＬｉａＲ（ＢＳＵ３３０８０）は二成分制御系のレギュレーターとして働くと考えられている。また、ｌｉａＩ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５８）及びｌｉａＨ遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３８５８５）は、各々ｙｖｑＩ及びｙｖｑＨとも称され、また本明細書において集合的にｌｉａＩＨとも記載される。ｌｉａＩＨは、その上流領域にＬｉａＲが結合することによって転写が活性化されることが知られている遺伝子である。ｌｉａＩによってコードされるタンパク質ＬｉａＩ（ＢＳＵ３３１３０）は膜タンパク質と考えられており、一方、ｌｉａＨによってコードされるタンパク質ＬｉａＨ（ＢＳＵ３３１２０）はファージショックタンパク質と類似することが知られている。
【００１６】
本明細書において「ｌｉａＳに相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＳ（又はｙｖｑＥ）遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＳと同様に二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＳと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ｌｉａＳに相当する遺伝子」である。
【００１７】
本明細書において「ｌｉａＲに相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＲ（又はｙｖｑＣ）遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲと同様に二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＲと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ｌｉａＲに相当する遺伝子」である。
【００１８】
本明細書において、「ｌｉａＩに相当する遺伝子」及び「ｌｉａＨに相当する遺伝子」とは、各々、ＮＣＢＩデータベースに記載のｌｉａＩ遺伝子及びｌｉａＨ遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つｌｉａＲ又はそれに相当する遺伝子の発現産物が特異的に結合してレギュレーター活性を発揮するプロモーターによってその転写が誘導される遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＩ及びｌｉａＨと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、各々「ｌｉａＩに相当する遺伝子」及び「ｌｉａＨに相当する遺伝子」である。
【００１９】
ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ又はｌｉａＨに相当する遺伝子としては、例えば、下記表１に記載の遺伝子が挙げられる。表１は、各バクテリア種の代表的な菌株とその代表的なｌｉａＲＳＩＨ相同遺伝子を挙げたものである。表１の菌がさらに有する別の相同遺伝子、及び表１と同種の異なる菌株が有する表１と同じ相同遺伝子又は別の相同遺伝子も、本発明におけるｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ、ｌｉａＨ各遺伝子に相当する遺伝子に含まれる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明の方法においては、標的の細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいは遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することによって、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する当該細菌の感受性を制御する。例えば、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ若しくはｌｉａＨ、又はこれらに相当する遺伝子を有する細菌において、ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を当該細菌から欠失若しくは不活性化させることにより、当該細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を増強させることができる。一方、遺伝子ｌｉａＩ若しくはｌｉａＨ、又はこれらに相当する遺伝子を有さない細菌において、遺伝子ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子、あるいはさらに必要に応じて、遺伝子ｌｉａＲ若しくはｌｉａＳ又はこれらに相当する遺伝子、又はｌｉａＩＨ上流のｌｉａＩＨプロモーター若しくはｌｉａＩＨに相当する遺伝子のプロモーター等のプロモーターを当該細菌に導入することにより、当該細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性を減弱させることができる。
【００２２】
本発明の方法に供される細菌としては、特に限定されないが、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属等のグラム陽性菌が好ましく、バチルス属細菌等がより好ましい。バチルス属細菌の中では、枯草菌又はその変異株が好ましい。
【００２３】
本発明の方法においては、細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上を導入すればよい。遺伝子の欠失若しくは不活性化においては、上記の遺伝子の１以上、例えば、いずれか２、いずれか３又はそれ以上を欠失若しくは不活性化させてもよい。遺伝子の導入においては、ｌｉａＩ及びｌｉａＨのいずれか又は両方を導入すればよいが、さらに必要に応じて、ｌｉａＲ若しくはｌｉａＳ又はこれらに相当する遺伝子、あるいはｌｉａＩＨ上流のｌｉａＩＨプロモーター若しくはｌｉａＩＨに相当する遺伝子のプロモーター等のプロモーターを導入してもよい。
【００２４】
上記遺伝子の導入には、当該分野で通常用いられる任意の方法を用いればよい。例えば、上記遺伝子を含むベクターの細菌への組み込みにより細菌を形質転換することによって、細菌に上記遺伝子を導入することができる。このとき、ベクターとして発現ベクターを利用したり、ベクター上でｌｉａＩＨの上流にｌｉａＩＨプロモーター等のプロモーターを配置することによって、ベクターに含まれるｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。発現ベクターの作製及び細菌への導入の手順は、当業者に周知である。例えば、ベクターへ目的ＤＮＡを導入する場合、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、制限酵素切断配列を端部に有するように構築した目的ＤＮＡを添加することによって、目的ＤＮＡをベクターに導入することができる（制限酵素法）。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）等が好ましい。作製した目的ＤＮＡを含む発現ベクターを、コンピテント法等の通常の方法で宿主細菌に導入すれば、目的ＤＮＡが導入された細菌を得ることができる。
【００２５】
また例えば、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片と細菌ゲノムとの相同組換えにより細菌を形質転換することによって、細菌に当該遺伝子を導入することができる。このとき、上記ＤＮＡ断片上でｌｉａＩＨの上流にｌｉａＩＨプロモーター等のプロモーターを配置することによって、ｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。または、上記ＤＮＡ断片中のｌｉａＩＨが細菌の発現系に組み込まれるように、細菌ゲノム上の適切な領域と当該ＤＮＡ断片とを組み換えることによって、ｌｉａＩＨ遺伝子を細菌内で効率よく発現させることができる。
【００２６】
上述の手順に従って遺伝子を導入した細菌は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性が減弱された細菌である。
【００２７】
また遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上の欠失若しくは不活性化にも、当該分野で通常用いられる任意の方法を用いることができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５４：３６７−３８２）等による部位特異的突然変異誘発や、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）を利用したノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）等に従ってｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子のいずれか１以上（以下、標的遺伝子）を含まないＤＮＡと細菌ゲノムとを相同組換えさせることにより、細菌から標的遺伝子を選択的に欠失若しくは不活性化させることができる。上述の手順に従って標的遺伝子を欠失若しくは不活性化させた細菌は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性が増強された細菌である。
【００２８】
一態様として、ノーマーカー削除法による細菌からの標的遺伝子欠失手順を以下に説明する。
まず、ＳＯＥ−ＰＣＲ法によって調製した欠失用ＤＮＡ断片と細菌ゲノムとの２重交差法によって、細菌ゲノムの標的遺伝子を欠失用ＤＮＡ断片と置換し、標的遺伝子を細菌ゲノム上から欠失させる（第１相同組換え）。このとき、欠失用ＤＮＡ断片にスペクチノマイシンやクロラムフェニコール等の薬剤の耐性遺伝子を挿入しておけば、当該薬剤によりコロニーを選択することで標的遺伝子欠失株を効率的に選択することができる。次いで、得られた欠失株の中から、ゲノム内で第２相同組換えが生じて薬剤耐性マーカー遺伝子が除去された菌株を選択することで、元のゲノムに対して標的領域が欠失し、且つ外来のマーカー遺伝子を含まない菌株を取得することができる。
【００２９】
具体的には、まず、標的遺伝子領域の５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組換え領域上流（断片Ｃ）、そしてlacI及び薬剤耐性遺伝子を含む断片（選択マーカー遺伝子カセット）をそれぞれＰＣＲにより増幅する。次いで、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組換え領域上流（断片Ｃ）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法を行い、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡを構築する（図１）。構築した供与体ＤＮＡを用いて細菌を形質転換し、得られた形質転換体を供与体ＤＮＡに含まれる薬剤耐性遺伝子を利用して選択する。選択された菌株は、第１相同組換えによってゲノムに供与体ＤＮＡが組み込まれて薬剤耐性を示す菌株である。
【００３０】
次に、選択した菌株をＩＰＴＧを含む培地で培養する。ＩＰＴＧ含有培地で生育する菌株は、第２相同組み換えによって、欠失対象領域とともにlacIを含む供与体ＤＮＡが欠失している菌株である（図１）。当該菌株を選択することによって、標的遺伝子が欠失した菌株を取得することができる。同様の手順で標的遺伝子を一部欠失させたり、他の遺伝子や停止コドン等を置換又は挿入することによって、標的遺伝子を不活性化させることも可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例で使用したプライマー及び菌株の一覧を下記表２−１、２−２及び表３に示す。
【００３２】
【表２−１】
【００３３】
【表２−２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
（１）ｌｉａ遺伝子欠失株の作製
ノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）に従って、下記のとおりｌｉａＩＨＧＦＳＲ各遺伝子の欠失株を作製した。
【００３６】
実施例１：ｌｉａＩ欠失株（ΔｌｉａＩ）
枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＰＮＣ−Ｆプライマー（３７）とｃｈｐＡ−Ｒプライマー（３８）（配列番号３７及び３８）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域ｌｉａＩの５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）を、それぞれプライマー１と２（配列番号１及び２）、３と４（配列番号３及び４）及び５と６（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
次に、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）並びにプライマー１と６（配列番号１及び６）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77(1):61-68）を行った。これにより、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡ断片（図１）を取得することができた。
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換方法（J. Bacteriol., 1967, 93(6):1925-1937）に従って、枯草菌１６８株を形質転換した。形質転換は、ＰＣＲ産物を２０μｇ以上用いて行った。
得られた形質転換体を、供与体ＤＮＡに含まれるスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。すなわち、上記形質転換処理後の細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、コロニーを得た。この培養によれば、第１相同組み換え（図１）によって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をＬＢ液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を１ｍＭ ＩＰＴＧを入れたＬＢ寒天プレートに塗布した。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換え（図２）によって、欠失対象領域とともに供与体ＤＮＡが宿主ＤＮＡから欠失したｌｉａＩ削除株（ΔｌｉａＩ）である。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＩ遺伝子の欠失を確認した。
【００３７】
実施例２〜４：ｌｉａＨ、ｌｉａＲ、ｌｉａＳ各遺伝子欠失株（ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、ΔｌｉａＳ）
上記の選択マーカー遺伝子カセット及び表２−１〜２−２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＨ、ｌｉａＲ及びｌｉａＳ各遺伝子の欠失株（ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、及びΔｌｉａＳ）を作製した。得られた各株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＨＳＲ各遺伝子の欠失を確認した。
【００３８】
比較例１〜２：ｌｉａＧ、ｌｉａＦ各遺伝子欠失株（ΔｌｉａＧ、ΔｌｉａＦ）
上記の選択マーカー遺伝子カセット及び表２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＧ及びｌｉａＦ各遺伝子の欠失株（ΔｌｉａＧ及びΔｌｉａＦ）を作製した。ｌｉａＧ及びｌｉａＦは、ｌｉａＩＨの下流に位置する遺伝子である。得られた各株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＧＦ各遺伝子の欠失を確認した。
【００３９】
試験例１：抗生物質に対するＬｉａＲＳ二成分系の応答
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３９と４０（配列番号３９及び４０）によって増幅したｌｉａＩプロモーター領域（転写開始点の-120〜+84領域）のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤＬ２（Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146(Pt 7):1573-83）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)を作製した。
このｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)でΔｌｉａＨ欠失株を形質転換し、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーを（１６８，ａｍｙＥ：：ｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株として取得した。得られた株については、ＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺが挿入されていることを確認した。
得られた株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養し、次いで細胞に０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、及び２μｇ／ｍｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを負荷し、３０分後に集菌した。コントロールとして抗生物質非添加群を調製した。
集菌した細胞に対してＬａｃＺアッセイを行った。ＬａｃＺアッセイはYoungman et al.（In Molecular Biology of Microbial Differentation. 1985, American Society for Microbiology Washington D.C., pp47-54）の方法に従った。細胞を１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１００μｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む、２００μｌ Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ４、０．０４Ｍ ＮａＨ2ＰＯ４、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4、０．００１Ｍ ＤＴＴ）に懸濁し、３７℃で２０分インキュベートして細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心を行い、得られた上清５０μｌに０．４ｍｇ／ｍｌ ＭＵＧ１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、９５℃で１０分間処理して反応を停止させた。４ＭＵの蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。また、上清のタンパク質量はＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、サンプル間の補正に使用した。
【００４０】
ＬａｃＺアッセイの結果を図２に示す。（１６８，ａｍｙＥ：：ｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株において、プロモーターＰｌｉａＩＨの活性化レベルの指標であるＬａｃＺ活性が抗生物質によって顕著に向上した。ＰｌｉａＩＨはＬｉａＲによってアップレギュレーションを受けてｌｉａＩＨの転写を誘導することが知られているプロモーターであるので、本試験の結果から、抗生物質によってＬｉａＲＳ二成分系が顕著に活性化されてｌｉａＩＨ発現が向上することが示された。また、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎやｖａｎｃｏｍｙｃｉｎに比べて、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎはより低濃度でＬａｃＺ活性を向上させ得ることから、ＬｉａＲＳ二成分系はｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対して特に強く応答することが示唆された。
【００４１】
試験例２ ｌｉａ遺伝子欠失株の抗生物質感受性
（１）手順
野生株１６８株、ならびにΔｌｉａＩ、ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＧ、ΔｌｉａＦ、ΔｌｉａＲ及びΔｌｉａＳ各遺伝子欠失株を、ＬＢ液体培地３７℃で一晩培養した。この培養液をＬＢ液体培地で１０0〜１０5倍希釈したもの１０μｌずつを、薬剤を含むＬＢ寒天培地にスポットして３７℃一晩培養し、培養後のプレートを観察した。薬剤の濃度については、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ ０．００５μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ １０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００４２】
（２）結果
実施例１〜４（ΔｌｉａＩ、ΔｌｉａＨ、ΔｌｉａＲ、及びΔｌｉａＳ）の各欠失株は、野生株の生育限界の約１／１００〜１／１０００の濃度のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ存在下でもほとんど生存することができず、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性が大きく損なわれていることが示された（図３）。一方、比較例１〜２（ΔｌｉａＦ及びΔｌｉａＧ）の欠失株は、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ存在下での培養で野生株と同程度の生育率を示し、野性株と同様にｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する耐性を保持していた。また、抗生物質としてｂａｃｔｏｒａｃｉｎおよびｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを用いて同様の実験を行った場合、何れの欠失株も野生株と同等の抗生物質耐性を示し、遺伝子の欠失が抗生物質感受性に影響しないことが明らかになった（図３）。
【００４３】
試験例１及び２の結果より、ＬｉａＲＳ二成分系は種々の抗生物質に対して活性化するが、それらの抗生物質の全てに対する菌の感受性に関与するものではないことが示された。また試験例２の結果より、ＬｉａＲＳ二成分系の経路の中でも、抗生物質耐性に寄与し得る成分と、そうでない成分があることが示された。ＬｉａＲＳ二成分系の遺伝子ｌｉａＳ、ｌｉａＲ、ｌｉａＩ、ｌｉａＨは細菌のｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する感受性に関与すること、特にｌｉａＩ、ｌｉａＨはｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ耐性付与遺伝子である可能性が示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
【請求項２】
前記遺伝子を欠失若しくは不活性化させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子を導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株の製造方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株。
【請求項６】
請求項３記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株の製造方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株。
【請求項１】
細菌において、遺伝子ｌｉａＲ、ｌｉａＳ、ｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失若しくは不活性化するか、あるいはｌｉａＩ及びｌｉａＨ、ならびにこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を導入することを特徴とするｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎに対する細菌の感受性を制御する方法。
【請求項２】
前記遺伝子を欠失若しくは不活性化させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子を導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株の製造方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性増強株。
【請求項６】
請求項３記載の方法によるｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株の製造方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法によって作製したｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ感受性低減株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−９２０５７（Ｐ２０１１−９２０５７Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４７８９１（Ｐ２００９−２４７８９１）
【出願日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月８日「国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学の博士論文公聴会」において文書をもって発表
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月８日「国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学の博士論文公聴会」において文書をもって発表
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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