薬剤耐性菌感染防除剤
【課題】 バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類の感染防除剤として、合成抗菌薬や抗生物質を用いない特定の微生物剤を有効成分として用いる薬剤耐性菌感染防除剤、その感染防除方法を提供する。
【解決手段】 バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類の感染防除剤として、乳酸菌、その死菌体、その処理物あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とすることにより、特に乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）を用いることにより前記の課題を解決した。
【解決手段】 バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類の感染防除剤として、乳酸菌、その死菌体、その処理物あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とすることにより、特に乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）を用いることにより前記の課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とする、家畜・家禽又は魚介類のバンコマイシン耐性腸球菌（（Vancomycin Resistant Enterococci略してＶＲＥともいう）、多剤耐性菌等の薬剤耐性菌に対する家畜・家禽類又は魚介類の感染防除剤及びその感染防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人における高齢化や高度医療が進展するなかで健康な人ではあまり問題とならないバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン又はバンコマイシン耐性Staphylococcus aureus（MRSA又はVRSA），多剤耐性能を有する病原性大腸菌などの病院内における日和見感染が発生し、これらの病原菌は抗菌性物質による治療が困難となる事例が大きな問題となっている。その薬剤耐性の原因の１つとして、畜水産現場における抗菌性物質の多用により薬剤耐性菌が選択され、それが畜水産物を介して人に伝播し、人の医療に悪影響を及ぼしているのではないかということが、国内のみならず、国際的に議論されている。
【０００３】
従来、このような耐性菌に対する抗菌剤として、合成抗菌剤は多数知られており、例えば、キノリンカルボン酸誘導体及びその塩（例えば、特許文献１参照）、抗生物質である新規マクロライド系化合物（例えば、特許文献２参照）等が知られている。また、天然物由来の原料を主体とする、例えばマンネンタケの子実体傘部の抽出物等（例えば、特許文献３参照）、ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はこれらの塩を有効成分とするバンコマイシン耐性腸球菌用殺菌剤（例えば、特許文献４参照）、ダッタンソバに加水し、自己酵素処理せしめてケルセチン含量を高めた酵素処理物を含有する抗病性飼料添加物（例えば、特許文献５参照）や、更に乳酸菌に関連した技術として、エンテロコッカス属に属する微生物の菌体又はその超音波破砕物等の処理物を有効成分として含有する感染防御剤（例えば、特許文献６参照）、微生物に対して生育阻害作用および毒性減弱作用を示す抗菌性物質を産生することを特徴とするラクトバチラス カゼイ（Lactobacillus casei)（例えば、特許文献７参照）、乳酸菌を用いて作られたフェニル乳酸であって、上記乳酸菌は、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とするフェニル乳酸（例えば、特許文献８参照）等が知られている。
【０００４】
一方、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤として、乳酸菌、その死菌体又はその処理物を有効成分として含有する薬剤は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−７３０５６号公報
【特許文献２】特開２００１−２３８６９２号公報
【特許文献３】特開２０００−１４３５２９号公報
【特許文献４】特開２００１−１３１０６１号公報
【特許文献５】特開２００１−２９２７０６号公報
【特許文献６】特開平８−２８３１６６号公報
【特許文献７】特開２００１−３３３７６６号公報
【特許文献８】特開２０００−３００２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年の抗菌性物質の使用量は、人には年間５２０ｔ使用されているとの報告があるのに対し、動物用医薬品として１０６０ｔ、飼料添加物として２３０ｔ、合計１２９０ｔ使用されており、単純に比較すると人には２倍以上使用されていることになる。現に、国、都道府県等の連携の下で実施されている全国的な家畜由来細菌の抗菌性物質感受性実態調査において、抗菌性物質の使用量に比例して当該抗菌性物質に対する薬剤耐性菌の比率が高くなっていることが明らかにされている。
【０００７】
このように、薬剤耐性菌が重要な問題となるなかで、畜水産現場で使用する抗菌性物質を必要最小限にとどめ、適正使用の下にその使用量を極力減らしていくことに、医薬品製造業者も含めた関係者間に異論はないといえる。農林水産省としては、現在、食品安全委員会に諮問中であるが、抗菌性飼料添加物については、現行指定２９成分のうち、今後製造される予定のない４成分は指定取消し、人用医薬品と類似の９成分は科学的評価に基づき指定見直し、家畜専用の１６成分は指定継続となると考えている。一方、抗菌性動物用医薬品は、動物の疾病の治療に不可欠であることから、獣医師の診察に基づく必要最小限の適正使用を前提に、原則として引続き使用を認める方向としたいと考えられている。
【０００８】
肺炎や下痢の治療に、長期間同じ抗菌性物質を使うと、薬に抵抗する細菌が出現し、病気が治りにくくなる場合がある。抗菌性物質には、抗生物質と合成抗菌薬とがある。抗生物質は、１９４２年にＷａｋｓｍａｎにより「微生物の産生する物質で、他の微生物（特に病原微生物）の発育を阻止する能力を有する化学物質」と定義されている。一方、合成抗菌薬とは、化学的に合成された抗菌性物質で、現在多くの抗菌性物質が、微生物の産生する物質を出発点に化学的に合成（半合成）されているが、これらは、抗生物質に分類されている。一般に、動物用抗菌性物質は、（１）疾病の治療を目的とした動物用抗菌剤（医薬品）と、（２）食用動物における「発育促進」又は「飼料効率の改善」を目的に、低濃度で長期間にわたって飼料に添加される抗菌性飼料添加物（医薬品ではなく抗菌性発育促進物質）とを合わせた用語として使われている。
【０００９】
薬剤耐性菌とは、抗菌性物質に抵抗性を示す細菌のことで、薬剤耐性菌に感染して病気になると、治療のために抗菌性物質を使っても、治らなかったり、治りが悪かったりする。人の食中毒の原因となるネズミチフス菌（サルモネラ・ティフィムリイム）は、家畜を含む動物も感染して病気を起こすが、ＤＴ１０４という多剤耐性菌（いくつもの薬剤に抵抗性の細菌）が問題となっている。また、食中毒の原因菌であるカンピロバクターも、フルオロキノロン（いわゆるニューキノロン）剤などの人の治療に使用する抗菌性物質に対する耐性菌が問題となっており、カンピロバクターは家畜に感染しても殆ど症状を示さず、また耐性菌だからといってすべての人に危害を与えるわけではない。人の薬剤耐性菌の問題となっている原因菌の多くは、皮膚や扁桃や腸管などの常在菌で、健康な人に危害を与えるものではない。ところが、病気などで免疫力が弱っている人では、日和見感染や院内感染により病気になる。ＭＲＳＡやＶＲＥなど、深刻な問題を引き起こしている細菌もいる。ＭＲＳＡやＶＲＥは、家畜にも感染するが、家畜に病気を引き起こすわけではない。このように、問題となっている耐性菌は、人の病気として重要であっても、家畜に病気を引き起こすとは限らない。そして、耐性菌は病原菌と違って、農場を見ただけではそれが存在するかどうかを判断することができない。
【００１０】
動物が細菌による病気にかかった場合、病気を治療するために抗菌性物質が使用されるが、その際、一部の細菌が耐性を獲得し、抗菌性物質により感受性の細菌が殺され、耐性菌だけが生き延びていく。このように、薬剤耐性菌は、人や家畜などに様々な抗生物質が使用されることで増加する。細菌における薬剤耐性獲得の要因としては、細菌増殖時の突然変異や、他の細菌が持っている耐性遺伝子の導入を挙げることができる。現在までに多くの耐性遺伝子が明らかにされてきており、例えば、テトラサイクリン耐性に関係する遺伝子も数種類知られ、１つの薬剤に対する耐性も単一の耐性遺伝子によるものとは限らない。
【００１１】
細菌が抗生物質に抵抗するには、細菌の周りの薬剤を失活させたり、薬剤が作用する細菌の部位にたどり着かなくしたりする必要がある。薬剤を失活させるため、耐性菌は薬剤を分解もしくは修飾する酵素（不活化酵素）を産生する。薬剤を作用部位までたどり着かせなくするには、薬剤の菌体内への侵入を防いだり（細菌の細胞質膜の薬剤透過性の低下）、薬剤が作用する部位の構造を変化させたり（薬剤の一次作用点の変化）、菌体内へ侵入した薬剤を菌体外へ排出したり（薬剤排出ポンプ）する機構が関係する。
【００１２】
薬剤耐性には、自然耐性のように先天的にその薬剤の作用部位をもたない場合と、後天的に耐性遺伝子を獲得して耐性となる場合がある。さらに耐性遺伝子には、耐性菌から感受性菌へと伝達されるものと伝達されないものがある。薬剤を作用部位までたどり着かせなくするような耐性機構では、薬剤耐性が他の菌へと伝達されることは殆どないが、薬剤を失活させる酵素を産生するような耐性機構では、プラスミドやトランスポゾンなどの遺伝子を介して耐性が移行する場合がある。そのようにして耐性を有した耐性菌は、自分以外の細菌を耐性菌へと変化させることができる。このため、病気を引き起こさない細菌の耐性が、病原菌へと移っていくことがある。特にVREに関する耐性機構についてはよく調べられており、ＶＲＥのｖａｎＡ，Ｂ耐性機構は，細胞壁、ペプチドグリカン・ムレインのペンタペプチドがＤ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｌａｃｔａｔｅに置換されることで起こる事が知られている。
そのほかに、交叉耐性（cross-resistance）と共耐性（coresistance）といった問題もある。交叉耐性は、同じようなタイプの抗菌性物質に対して抵抗する現象である。また共耐性とは、複数の異なる仲間の薬剤に対する耐性を一度に獲得しているタイプの耐性の仕組みである。このような仕組みで抗菌性物質に抵抗性となった細菌は、使用歴のある薬剤に耐性となる。
【００１３】
薬剤耐性菌の出現は、薬剤の使用と深い関係があり、薬剤の使用量の増加に伴い耐性菌も増加する。これまでに報告された最近の薬剤感受性試験の成績からも、国内で古くから使われ、使用量の多い薬剤に対する耐性菌が多く見つかっている。通常、耐性菌は、薬剤の使用をやめることによって減少する。デンマークの調査では、抗菌性飼料添加物の使用を中止した後、薬剤耐性菌が減少することが明らかにされた。しかし、中止した７年後の調査において、中止薬剤に対する耐性菌が低率であるが見つかっている。このため、何らかの要因で薬剤により選択された場合、再び耐性菌が増加してくる危険性が残っている。
【００１４】
薬剤耐性菌の問題は、世界的な動きとして１９９０年代に「動物に抗菌性物質を使用すると人の耐性菌の増加を引き起こし、人の病気の治療が難しくなる」という危険性が指摘された。そこで、世界保健機構（ＷＨＯ）は、この問題を検討する専門家による会議（１９９７年：ベルリン、１９９８年：ジュネーブ）を開催した。この国際会議の中で、薬剤耐性菌が動物と人の間でどの程度分布し、広がっているかという状況を把握するためのモニタリング（耐性菌の動向調査と情報収集）の重要性が指摘された。その後、２０００年になって国際獣疫事務局（ＯＩＥ）は、各国で実施している薬剤耐性菌の調査法を統一していくため、薬剤耐性関連のガイドラインを策定し、２００３年５月に制定された。更に、２００３年１２月に開催されたＦＡＯ／ＯＩＥ／ＷＨＯの合同会議においては、「食用動物の耐性菌が、人の健康に危害を与える可能性は否定できない」として、その危険性の低減に向けた取り組みを行っていくことになった。その中で、家畜以外についても、ペットや水産養殖産業での薬剤使用や農薬としての抗菌性物質の使用に伴う耐性菌の出現の危険性もあるため、耐性菌の出現動向についても調査する必要があることが指摘されている。このように、耐性菌の問題は、国際的な大きな流れであることが分かる。
【００１５】
畜産分野における耐性菌の出現を抑えるには、動物用の抗菌性物質の使用を禁止したり、制限したりする方法が考えられる。しかし、抗菌性物質は、安価で安全な畜産物を安定的に生産する重要な道具となっている。また、抗菌性物質がなければ、病気で苦しんでいる動物を治療することができなくなる。このため、すべての抗菌性物質を禁止することは困難といえる。一方、薬剤残留のない安全な畜産物といった食品業界からの声に、ブロイラー生産の現場では、無薬鶏などのブランドを作って、自主的な使用制限を実行している農場もある。近年、消費者の食品の安心・安全性への関心が益々高まるなか、薬剤耐性菌問題と抗菌性物質等の畜産物への残留問題は表裏一体の関係にある。このため、抗菌性物質を使う場合、診断や検査結果などの根拠に基づいて有効な薬剤の使用を最小限に抑え、使用していくことが重要である。
【００１６】
本発明の課題は、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染に対し、合成抗菌薬や抗生物質を用いない安全な薬剤耐性菌感染防除剤を提供することにあり、ひいては、人への薬剤耐性菌感染の予防に貢献する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、薬剤耐性菌感染の家畜・家禽から人への感染を懸念し、研究するなかで、抗生物質アボパルシン（ＡＶＰ）を添加していないわが国ブタでもバンコマイシン耐性菌（ＶＲＥ）が陽性である可能性が示唆された。家畜のＶＲＥ定着はＡＶＰが主因とされてきたが、わが国では他に原因があることも考えられる。そこで、本発明者らは鶏を鳥類モデルとしてヒト由来ＶＲＥの実験感染試験を行い、外来要因からの伝播の可能性について検討し、その結果、その恐れがあることを確認した。更に、実験を進め、バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類に対して、該薬剤耐性菌の防除を試み、防除剤として、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいは乳酸を利用する酪酸菌メガスフェラ・エルスデニを有効成分とする薬剤が顕著な効果を奏することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち本発明は、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分として含有することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項１）や、乳酸菌が、エンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項２）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項３）や、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）がＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項４）や、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項４記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項５）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項６）に関する。
【００１９】
また本発明は、乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項７）や、乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項７記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項８）や、薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項９）や、死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項１０）や、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する組成物を、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１１）や、乳酸菌がエンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１２）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項１２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１３）に関する。
【００２０】
さらに本発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項１３記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１４）や、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項１４記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１５）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項１２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１６）や、乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１７）や、乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１８）や、薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１９）や、死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項２０）に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の乳酸菌、その死菌体、又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する家畜・家禽又は魚介類感染防除剤を経口的に投与すると、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染率が著しく低下し、従来のように家畜・家禽又は魚類の感染症に使用されてきた抗生物質や合成抗菌剤を使用することなく、効果的にバンコマイシン耐性腸球菌、多剤耐性能を有する病原菌等の感染防除効果を奏し、このような感染に対し予防および治療が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤としては、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分とするものであれば特に制限されず、また、本発明の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法としては、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分とするものを、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与する方法であれば特に制限されず、上記薬剤耐性菌感染防除剤は、そのままあるいは製剤などあらゆる形態で使用することができる。
【００２３】
本発明において用いる乳酸球菌として、例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペディオコッカス等を挙げることができる。また、本発明において用いる乳酸桿菌として、例えば、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・ヘルベティカス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・デルブリュッキイ、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ガッセリ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・ケフィア、ラクトバシラス・ブルネリ等を挙げることができる。更に、ビフィズス菌として、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス等を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明において用いる乳酸菌として、宿主動物由来の乳酸菌を好適に例示することができる。かかる宿主動物由来の乳酸菌はＶＲＥ等の薬剤耐性菌よりも先に腸管内に定着し、その後の薬剤耐性菌の定着を抑制することが考えられる。これに対して、エンテロコッカス・フェカリス等の死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス等の近縁種であるＶＲＥ等に対して特異的なＩｇＡ，ＩｇＧまたはグラム陽性菌に強い殺菌効果を持つリゾチーム，またはディフェンシンなどの抗菌性物質の産生を促進し、ＶＲＥ等の感染を防御することが考えられる。そしてまた、乳酸から酪酸を生成するメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を、薬剤耐性菌感染防除に用いることができる。メガスフェラ・エルスデニは、例えばブタ大腸から単離することができる。
【００２５】
これらの乳酸菌等は、一種又は二種以上の菌種を配合して用いることができる。これらの乳酸菌等は、常法に従って任意の条件で培養することによって得ることができる。
【００２６】
上記乳酸菌の中でも、エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ１９４３３やエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２等のエンテロコッカス・フェカリスに属する微生物を好適に例示することができるが、特にエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ１６８０３）を用いることが好ましく、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ１６８０３）の１６ＳｒＤＮＡは、国立遺伝研究所に「ＡＢ１５４８２」として登録されている。
【００２７】
本発明において用いられるエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の菌学的性質を（表１）に示す。このエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の培養方法としては、従来公知の乳酸菌の培養方法も含め特に制限されるものではないが、乳酸菌生育用培地を用い、３７℃で培養ｐＨを中性付近に維持しながら５〜１２０時間、好ましくは、１６〜２８時間培養し、生菌数約１０７〜１０１０／ｍｌ、好ましくは約１０８〜１０１０／ｍｌの培養液を得る方法を例示することができる。
【００２８】
【表１】
【００２９】
本発明においては、乳酸菌は、生菌、その死菌体又はその処理物として用いることが、また、メガスフェラ・エルスデニはその生菌を用いることが好ましい。前記死菌体としては、常法により培養、集菌した乳酸菌の菌体を洗浄し、遠心脱水し、必要に応じて洗浄・脱水を繰り返した後、蒸留水、生理食塩水等に懸濁し、この懸濁液を、例えば８０〜１１５℃で３０分〜３秒間加熱することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物、又は前記死菌体懸濁液にガンマ線或いは中性子線を照射することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物を挙げることができる。該死菌体懸濁液の乾燥手段としては公知の乾燥手段であれば特に制限されないが、噴霧乾燥、凍結乾燥等を例示することができる。場合によっては、加熱等による殺菌処理の前後、あるいは、乾燥処理の前後に、酵素処理、界面活性剤処理、磨砕・粉砕処理を行うこともでき、これらの処理により得られるものも、本発明の死菌体又はその処理物に含まれる。
【００３０】
前記の薬剤耐性菌防除剤や組成物を製剤として用いる場合、デンプン、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合材、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁剤等の添加剤を配合して、周知の方法で粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等に製剤化することができる。またグルコン酸塩、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせると相乗効果が期待でき尚良い。かかる製剤はそのまま投与することもできるが、飼料等に混じて給餌させることもできる。
【００３１】
本発明の防除剤は、特にＶＲＥ、中でもヒト由来のエンテロコッカス・フェカリス標準株となっているＶＲＥに対して抗菌作用が認められた。したがって、本発明の防除剤は、耐熱性、耐塩性のエンテロコッカス属に広く適用される。
【００３２】
本発明において、薬剤耐性菌防除の対象となる家畜・家禽類としては、牛、豚、馬、羊、ヤギなどの家畜、鶏、鴨、ダチョウなどの家禽を例示することができ、授乳、哺乳期も含め、いずれの段階の日齢、年齢の家畜・家禽にも適用できる。特に、離乳期前後の子豚や、鶏のヒナは、腸内菌叢が成熟しておらず抵抗力が弱いので、ＶＲＥに罹りやすい。また、魚介類としては、ハマチ、カンパチ、ヒラメ、鯛、鯉、鰻、エビ、アサリ、蛤等通常養殖されている魚介類を好適に例示することができる。
【００３３】
本発明の乳酸菌、その死菌体、又はその処理物や、メガスフェラ・エルスデニを家畜等へ投与する形態は、家畜等へ直接経口投与する方法及び飼料や飲水に混合してから投与する方法があるが、何れでもよい。またこの際グルコン酸Na、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせると相乗効果が期待でき尚良い。
【００３４】
本発明の薬剤耐性菌感染防除剤やその方法における投与量や投与回数は、家畜・家禽の種類、体重、日齢、月齢、病状、回復状態に応じて、適宜決定することができる。たとえば、鶏、ヒナに関しては、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又若しくは処理物を用いる場合、その量は、ヒナ用飼料０．０００１％〜０．０５％投与となるように混合し、通常の１日当たりの飼料の量及び給餌回数とすることを例示することができる。又、豚については、特に離乳期前後の子豚に０．０００１％〜０．０５％添加することができる。
【００３５】
（実施例）
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体の調製）
エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）をロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に０．１（ｖ／ｖ）％接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら、３７℃で２２〜２４時間中和培養を行なった。
【００３７】
培養終了後、連続遠心機で菌体を分離、回収した後、水を加えて元の液量まで希釈して再度連続遠心機で菌体を分離、回収した。この操作を合計４回繰り返して菌体を洗浄した。次いで、洗浄した菌体を適量の水に懸濁し、１００℃で３０分間殺菌した後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥して加熱処理菌体粉末を調製した。
【実施例２】
【００３８】
（ヒト由来ＶＲＥの感染試験）
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナ（２群、各６羽）にＶＲＥ２菌株（ヒト由来標準株２株）の菌液を約１０８個／羽の割合で強制的に経口投与した。投与後０．５、１、３、７及び１４日に糞便スワブを採取し、バンコマイシン（ＶＣＭ）１０μｇ／ｍＬ添加ＥＦ寒天培地に塗布した。３７℃で４８時間培養し、発育したコロニーを釣菌してグラム染色性、形態及び発酵能からEnterococcus属であることが確認した。投与後２１日に解剖し、素嚢、胃、小腸及び盲腸の各消化管への定着を調べた。その結果、ＶＲＥ投与後０．５〜１４日目までの全てのスワブからＶＲＥが単離され、投与後２１日では、素嚢、胃、小腸、盲腸の全ての消化管部位からＶＲＥが単離された。ＶＲＥが少なくとも２１日間はブロイラー腸管内に定着し得ることがわかった。ヒト由来ＶＲＥがブロイラーヒナに感染するという事実は、養鶏現場でのＶＲＥ汚染は外来生物による汚染も起こり得ることが示された。
【実施例３】
【００３９】
（腸管内でのＶＲＥ定着抑制効果）
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナを導入した（４群、各６羽）。無投与対照群、乳酸菌死菌体粉末（ＥＣ−１２）添加飼料投与群、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピー（Lactobacillus sp.）強制経口投与群及び市販競合排除製剤アヴィガード（バイエル社製）噴霧投与群の４群とした。ラクトバシルス・エスピーの投与は１日齢で１回強制投与し、競合排除製剤は、１日齢で散布投与した。ＥＣ−１２の投与は１日齢から解剖検査時まで、基礎飼料に０．０５％添加したものを与えた。実施例２で腸管への定着が確認できたＶＲＥ株を２日齢ヒナに全羽強制経口投与した。ＶＲＥ攻撃（感染）後１，３，７及び１４日に糞便スワブを採取し、実施例２と同様にＶＲＥ排菌状況を定性評価した。ＶＲＥ攻撃（感染）後１４日に解剖検査を行い、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数を測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、無投与対照群はＶＲＥ攻撃（感染）後１４日まで６羽中３羽が陽性を示したが、ラクトバシルス・エスピー投与群では全羽陰性、ＥＣ−１２投与群では１羽が陽性であった。競合排除製剤投与群は６羽中３羽が陽性であった。盲腸内容物中菌数でも同様の傾向が認められ、ラクトバシルス・エスピー又はＥＣ−１２投与群で全羽検出限界以下となった。このように、ラクトバシルス属や、ＥＣ−１２等の乳酸菌がＶＲＥ定着阻止に有用であることがわかった。
【実施例４】
【００４０】
（腸管内でのＶＲＥ定着抑制効果）
本発明で用いる菌又はその製剤として、乳酸菌としてＥＣ−１２死菌体およびラクトバシルス・エスピー及びエンテロコッカス・エスピーを用い、乳酸利用菌としてブタ大腸より単離された酪酸菌メガスフェラ・エルスデニを用い、混合菌として、ラクトバシルス・エスピー及びメガスフェラ・エルスデニを用いた。対照物質として抗生物質であるアヴィガード（バイエル社製）を用いた。供試動物は、ブロイラーヒナ２４羽（１日齢、雄１２羽、雌１２羽）を用いた。基礎飼料としては、市販試験用配合飼料（試験用標準飼料ブロイラー前期用，ＳＤＢＮｏ．１、日本配合飼料（株）製）を使用した。閉鎖系畜舎に１日齢ヒナを収容し、体重を測定し、できるだけ体重が均一になるように配慮して４群に分け、群ごとにステンレス製ケージに入れた。投与形態として、ＥＣ−１２及びエンテロコッカス・フェシウムは、試験開始（１日齢）から試験終了（１６日齢）までを飼料に添加して投与した。ラクトバシルス・エスピー、及びメガスフェラ・エルスデニ、ラクトバシルス・エスピーとメガスフェラ・エルスデニの混合物は、１日齢のとき、強制経口投与した。アヴィガードはその用法・用量に従って試験開始時（１日齢）に１回投与した。
【００４１】
ＶＲＥ感染は、２日齢ヒナにＶＲＥを強制経口投与した。該菌株はブタ由来の野外分離株Ｅ６株を用い、培養菌液（菌体濃度１０８個／０．５ｍＬ）を０．５ｍＬずつ投与した。該ＶＲＥ投与時に全羽糞便スワブを採取し、バンコマイシン（ＶＣＭ）添加ＥＦ寒天培地に塗抹してＶＲＥフリーであることを予め確認した。
該ＶＲＥ投与後、０,１，３及び７日に滅菌綿棒を用いて糞便を採取し、ＶＣＭ添加ＥＦ寒天培地に塗抹してＶＲＥの定着もしくは通過を確認した。その結果を表２に示す。また、実験終了時（バンコマイシン投与後１４日）に解剖を行った。盲腸を採取し、検体希釈液で１０倍段階希釈を行い、ＶＣＭ添加ＥＦ寒天平板及びＬＢＳ寒天平板に適当な段階の希釈液を塗抹し、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数及びその結果も合わせて表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、乳酸菌自体（エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバシルス・エスピー）、乳酸菌の死菌体（ＥＣ−１２）、メガスフェラ・エルスデニ及びラクトバシルス・エスピーとメガスフェラ・エルスデニの混合菌がＶＲＥに感染した家禽に対し、定着抑制効果があることがわかった。
【実施例５】
【００４４】
（バンコマイシン耐性菌の感染試験）
バンコマイシン耐性菌として、エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９株を用いた。エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９株の各種抗生物質に対するＭＩＣ値は表３に示すとおりである。
【００４５】
【表３】
【００４６】
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナを、無投与対照群として雄６羽、雌７羽を用意し、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピー強制投与群として雄３羽、雌３羽を用意し、ＥＣ−１２群として雄７羽、雌６羽を用意し、計３群とした。ＥＣ−１２は、乳酸菌死菌体粉末を１日齢から解剖検査時まで（期間中）基礎飼料に０．０５％添加したものを飼料添加投与し、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピーは、１日齢で１回強制経口投与した。ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１，３，７及び１４日目の前記３群について、平均体重、平均増体重を測定した。その結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
次に、ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１、３、７及び１４日の前記３群のそれぞれの糞便スワブを採取し、ＶＲＥの排菌状況を評価した。ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１４日に解剖検査を行い、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数を測定した。さらに、血液、肝臓、脾臓のＡＴＣＣ５１２９９株のトランスロケーションを調べた。以上の結果を表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
また、前記の３群についての解剖時の盲腸内容物中の総ＩｇＡ濃度及び血清中の総ＩｇＧ濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡはＣｈｉｃｋｅｎＩｇＡ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX）とＣｈｉｃｋｅｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Bethyl Laboratories Inc.）で測定した。結果を表６に示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】
さらに、前記の３群について血清を２０倍希釈し、ＡＴＣＣ５１２９９株の膜タンパク特異的ＩｇＧを吸光度［４９０ｎｍ］において同様にＥＬＩＳＡで測定した。方法は以下の通りです。ＶＲＥ細胞質の薄膜蛋白質溶液は炭酸塩バッファー［５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６］で薄め、コーティング抗体として使用した。ＶＲＥ細胞質の膜蛋白質溶液は以下のようにして準備した。
１）エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９はＧＡＭ培地中でＭＧ期まで培養した。
２）培地を遠心し、ペレットは再懸濁溶液［１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４］で攪拌し、細胞壁が完全に壊れるまで、氷の上で超音波処理した。
３）超音波処理した溶液は細胞内画分を除去するために超遠心した［４７，０００ｘ ｇ、２０分、4℃；日立ｈｉｍａｃＣＰ６５β（日立）、東京（日本）］。
４）超音波処理した溶液（ＶＲＥの細胞質の膜蛋白質）のペレットを２回洗った。（再懸濁溶液によって攪拌し超遠心［４７，０００のｘｇ、２０ｍｉｎ、４℃］）
ＶＲＥ細胞質の膜蛋白質ペレットは、炭酸塩バッファーの中で攪拌し、細胞質の膜蛋白質溶液の１０mｇ／ｍＬになるように調整した。蛋白質の溶液はＶＲＥ特異的なＥＬＩＳＡ分析における抗体のコートのために使用した。その結果を表７に示す。
【００５３】
【表７】
【００５４】
以上、多剤耐性菌の感染試験において、表４から、無投与対照に比べて、本発明の乳酸菌ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）、ＥＣ−１２飼料添加投与(試験期間中)については、平均体重は、無投与対照に比べて、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）ではむしろ劣るが、ＥＣ−１２飼料添加投与(試験期間中)では、１４日後では無投与対照のものより約６％体重が上回っている。
【００５５】
表５からは、７日目の糞便中のＡＴＣＣ５１２９９株の菌は、無投与対照群は、陽性率７７％、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）では１００％、ＥＣ−１２飼料添加投与（試験期間中）では３８％であって、ＥＣ−１２の投与は、ＡＴＣＣ５１２９９株の菌の生育を抑制するか生育を阻止することに大きく寄与することがわかった。また、陽性だった個体の中での盲腸内容物中のＡＴＣＣ５１２９９株の平均菌数は、無投与対照群では、８５６００個であるのに対し、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）のものは６５００個、ＥＣ−１２飼料添加投与（試験期間中）では８０００個であり、対照群に比べて、本発明のいずれも、盲腸内容物中、ＡＴＣＣ５１２９９株の菌の存在は格段に低い。
【００５６】
表６からは、盲腸内容物５０倍希釈における総ＩｇＡ濃度［ｎｇ／ｍｌ］は、本発明のものは、共に無投与対照群に比べて、高く、また、総ＩｇＧ濃度［ｎｇ／ｍｌ］では、ＥＣ−１２は、無投与対照に比して、非常に高い。このようにＥＣ−１２は、免疫力を高める作用があり、疾病防御に効果がある。
【００５７】
表７からは、解剖時の血清中のＡＴＣＣ５１２９９株膜タンパク特異的ＩｇＧ（血清２０倍希釈）では、ＥＣ−１２が、無投与対照に比して、非常に高く、このことについても、表６に示す結果と同様である。
【００５８】
以上の実施例５より、宿主動物由来の乳酸菌はＶＲＥ等の薬剤耐性菌よりも先に腸管内に定着し、その後の薬剤耐性菌の定着を抑制すると思われる。これに対して、エンテロコッカス・フェカリス等の死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス等の近縁種であるＶＲＥ等に対して特異的なＩｇＡ，ＩｇＧの産生を促進し、ＶＲＥ等の感染を防御すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の各菌株の投与によるＶＲＥ陽性率の変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とする、家畜・家禽又は魚介類のバンコマイシン耐性腸球菌（（Vancomycin Resistant Enterococci略してＶＲＥともいう）、多剤耐性菌等の薬剤耐性菌に対する家畜・家禽類又は魚介類の感染防除剤及びその感染防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人における高齢化や高度医療が進展するなかで健康な人ではあまり問題とならないバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン又はバンコマイシン耐性Staphylococcus aureus（MRSA又はVRSA），多剤耐性能を有する病原性大腸菌などの病院内における日和見感染が発生し、これらの病原菌は抗菌性物質による治療が困難となる事例が大きな問題となっている。その薬剤耐性の原因の１つとして、畜水産現場における抗菌性物質の多用により薬剤耐性菌が選択され、それが畜水産物を介して人に伝播し、人の医療に悪影響を及ぼしているのではないかということが、国内のみならず、国際的に議論されている。
【０００３】
従来、このような耐性菌に対する抗菌剤として、合成抗菌剤は多数知られており、例えば、キノリンカルボン酸誘導体及びその塩（例えば、特許文献１参照）、抗生物質である新規マクロライド系化合物（例えば、特許文献２参照）等が知られている。また、天然物由来の原料を主体とする、例えばマンネンタケの子実体傘部の抽出物等（例えば、特許文献３参照）、ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はこれらの塩を有効成分とするバンコマイシン耐性腸球菌用殺菌剤（例えば、特許文献４参照）、ダッタンソバに加水し、自己酵素処理せしめてケルセチン含量を高めた酵素処理物を含有する抗病性飼料添加物（例えば、特許文献５参照）や、更に乳酸菌に関連した技術として、エンテロコッカス属に属する微生物の菌体又はその超音波破砕物等の処理物を有効成分として含有する感染防御剤（例えば、特許文献６参照）、微生物に対して生育阻害作用および毒性減弱作用を示す抗菌性物質を産生することを特徴とするラクトバチラス カゼイ（Lactobacillus casei)（例えば、特許文献７参照）、乳酸菌を用いて作られたフェニル乳酸であって、上記乳酸菌は、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とするフェニル乳酸（例えば、特許文献８参照）等が知られている。
【０００４】
一方、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤として、乳酸菌、その死菌体又はその処理物を有効成分として含有する薬剤は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−７３０５６号公報
【特許文献２】特開２００１−２３８６９２号公報
【特許文献３】特開２０００−１４３５２９号公報
【特許文献４】特開２００１−１３１０６１号公報
【特許文献５】特開２００１−２９２７０６号公報
【特許文献６】特開平８−２８３１６６号公報
【特許文献７】特開２００１−３３３７６６号公報
【特許文献８】特開２０００−３００２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年の抗菌性物質の使用量は、人には年間５２０ｔ使用されているとの報告があるのに対し、動物用医薬品として１０６０ｔ、飼料添加物として２３０ｔ、合計１２９０ｔ使用されており、単純に比較すると人には２倍以上使用されていることになる。現に、国、都道府県等の連携の下で実施されている全国的な家畜由来細菌の抗菌性物質感受性実態調査において、抗菌性物質の使用量に比例して当該抗菌性物質に対する薬剤耐性菌の比率が高くなっていることが明らかにされている。
【０００７】
このように、薬剤耐性菌が重要な問題となるなかで、畜水産現場で使用する抗菌性物質を必要最小限にとどめ、適正使用の下にその使用量を極力減らしていくことに、医薬品製造業者も含めた関係者間に異論はないといえる。農林水産省としては、現在、食品安全委員会に諮問中であるが、抗菌性飼料添加物については、現行指定２９成分のうち、今後製造される予定のない４成分は指定取消し、人用医薬品と類似の９成分は科学的評価に基づき指定見直し、家畜専用の１６成分は指定継続となると考えている。一方、抗菌性動物用医薬品は、動物の疾病の治療に不可欠であることから、獣医師の診察に基づく必要最小限の適正使用を前提に、原則として引続き使用を認める方向としたいと考えられている。
【０００８】
肺炎や下痢の治療に、長期間同じ抗菌性物質を使うと、薬に抵抗する細菌が出現し、病気が治りにくくなる場合がある。抗菌性物質には、抗生物質と合成抗菌薬とがある。抗生物質は、１９４２年にＷａｋｓｍａｎにより「微生物の産生する物質で、他の微生物（特に病原微生物）の発育を阻止する能力を有する化学物質」と定義されている。一方、合成抗菌薬とは、化学的に合成された抗菌性物質で、現在多くの抗菌性物質が、微生物の産生する物質を出発点に化学的に合成（半合成）されているが、これらは、抗生物質に分類されている。一般に、動物用抗菌性物質は、（１）疾病の治療を目的とした動物用抗菌剤（医薬品）と、（２）食用動物における「発育促進」又は「飼料効率の改善」を目的に、低濃度で長期間にわたって飼料に添加される抗菌性飼料添加物（医薬品ではなく抗菌性発育促進物質）とを合わせた用語として使われている。
【０００９】
薬剤耐性菌とは、抗菌性物質に抵抗性を示す細菌のことで、薬剤耐性菌に感染して病気になると、治療のために抗菌性物質を使っても、治らなかったり、治りが悪かったりする。人の食中毒の原因となるネズミチフス菌（サルモネラ・ティフィムリイム）は、家畜を含む動物も感染して病気を起こすが、ＤＴ１０４という多剤耐性菌（いくつもの薬剤に抵抗性の細菌）が問題となっている。また、食中毒の原因菌であるカンピロバクターも、フルオロキノロン（いわゆるニューキノロン）剤などの人の治療に使用する抗菌性物質に対する耐性菌が問題となっており、カンピロバクターは家畜に感染しても殆ど症状を示さず、また耐性菌だからといってすべての人に危害を与えるわけではない。人の薬剤耐性菌の問題となっている原因菌の多くは、皮膚や扁桃や腸管などの常在菌で、健康な人に危害を与えるものではない。ところが、病気などで免疫力が弱っている人では、日和見感染や院内感染により病気になる。ＭＲＳＡやＶＲＥなど、深刻な問題を引き起こしている細菌もいる。ＭＲＳＡやＶＲＥは、家畜にも感染するが、家畜に病気を引き起こすわけではない。このように、問題となっている耐性菌は、人の病気として重要であっても、家畜に病気を引き起こすとは限らない。そして、耐性菌は病原菌と違って、農場を見ただけではそれが存在するかどうかを判断することができない。
【００１０】
動物が細菌による病気にかかった場合、病気を治療するために抗菌性物質が使用されるが、その際、一部の細菌が耐性を獲得し、抗菌性物質により感受性の細菌が殺され、耐性菌だけが生き延びていく。このように、薬剤耐性菌は、人や家畜などに様々な抗生物質が使用されることで増加する。細菌における薬剤耐性獲得の要因としては、細菌増殖時の突然変異や、他の細菌が持っている耐性遺伝子の導入を挙げることができる。現在までに多くの耐性遺伝子が明らかにされてきており、例えば、テトラサイクリン耐性に関係する遺伝子も数種類知られ、１つの薬剤に対する耐性も単一の耐性遺伝子によるものとは限らない。
【００１１】
細菌が抗生物質に抵抗するには、細菌の周りの薬剤を失活させたり、薬剤が作用する細菌の部位にたどり着かなくしたりする必要がある。薬剤を失活させるため、耐性菌は薬剤を分解もしくは修飾する酵素（不活化酵素）を産生する。薬剤を作用部位までたどり着かせなくするには、薬剤の菌体内への侵入を防いだり（細菌の細胞質膜の薬剤透過性の低下）、薬剤が作用する部位の構造を変化させたり（薬剤の一次作用点の変化）、菌体内へ侵入した薬剤を菌体外へ排出したり（薬剤排出ポンプ）する機構が関係する。
【００１２】
薬剤耐性には、自然耐性のように先天的にその薬剤の作用部位をもたない場合と、後天的に耐性遺伝子を獲得して耐性となる場合がある。さらに耐性遺伝子には、耐性菌から感受性菌へと伝達されるものと伝達されないものがある。薬剤を作用部位までたどり着かせなくするような耐性機構では、薬剤耐性が他の菌へと伝達されることは殆どないが、薬剤を失活させる酵素を産生するような耐性機構では、プラスミドやトランスポゾンなどの遺伝子を介して耐性が移行する場合がある。そのようにして耐性を有した耐性菌は、自分以外の細菌を耐性菌へと変化させることができる。このため、病気を引き起こさない細菌の耐性が、病原菌へと移っていくことがある。特にVREに関する耐性機構についてはよく調べられており、ＶＲＥのｖａｎＡ，Ｂ耐性機構は，細胞壁、ペプチドグリカン・ムレインのペンタペプチドがＤ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｌａｃｔａｔｅに置換されることで起こる事が知られている。
そのほかに、交叉耐性（cross-resistance）と共耐性（coresistance）といった問題もある。交叉耐性は、同じようなタイプの抗菌性物質に対して抵抗する現象である。また共耐性とは、複数の異なる仲間の薬剤に対する耐性を一度に獲得しているタイプの耐性の仕組みである。このような仕組みで抗菌性物質に抵抗性となった細菌は、使用歴のある薬剤に耐性となる。
【００１３】
薬剤耐性菌の出現は、薬剤の使用と深い関係があり、薬剤の使用量の増加に伴い耐性菌も増加する。これまでに報告された最近の薬剤感受性試験の成績からも、国内で古くから使われ、使用量の多い薬剤に対する耐性菌が多く見つかっている。通常、耐性菌は、薬剤の使用をやめることによって減少する。デンマークの調査では、抗菌性飼料添加物の使用を中止した後、薬剤耐性菌が減少することが明らかにされた。しかし、中止した７年後の調査において、中止薬剤に対する耐性菌が低率であるが見つかっている。このため、何らかの要因で薬剤により選択された場合、再び耐性菌が増加してくる危険性が残っている。
【００１４】
薬剤耐性菌の問題は、世界的な動きとして１９９０年代に「動物に抗菌性物質を使用すると人の耐性菌の増加を引き起こし、人の病気の治療が難しくなる」という危険性が指摘された。そこで、世界保健機構（ＷＨＯ）は、この問題を検討する専門家による会議（１９９７年：ベルリン、１９９８年：ジュネーブ）を開催した。この国際会議の中で、薬剤耐性菌が動物と人の間でどの程度分布し、広がっているかという状況を把握するためのモニタリング（耐性菌の動向調査と情報収集）の重要性が指摘された。その後、２０００年になって国際獣疫事務局（ＯＩＥ）は、各国で実施している薬剤耐性菌の調査法を統一していくため、薬剤耐性関連のガイドラインを策定し、２００３年５月に制定された。更に、２００３年１２月に開催されたＦＡＯ／ＯＩＥ／ＷＨＯの合同会議においては、「食用動物の耐性菌が、人の健康に危害を与える可能性は否定できない」として、その危険性の低減に向けた取り組みを行っていくことになった。その中で、家畜以外についても、ペットや水産養殖産業での薬剤使用や農薬としての抗菌性物質の使用に伴う耐性菌の出現の危険性もあるため、耐性菌の出現動向についても調査する必要があることが指摘されている。このように、耐性菌の問題は、国際的な大きな流れであることが分かる。
【００１５】
畜産分野における耐性菌の出現を抑えるには、動物用の抗菌性物質の使用を禁止したり、制限したりする方法が考えられる。しかし、抗菌性物質は、安価で安全な畜産物を安定的に生産する重要な道具となっている。また、抗菌性物質がなければ、病気で苦しんでいる動物を治療することができなくなる。このため、すべての抗菌性物質を禁止することは困難といえる。一方、薬剤残留のない安全な畜産物といった食品業界からの声に、ブロイラー生産の現場では、無薬鶏などのブランドを作って、自主的な使用制限を実行している農場もある。近年、消費者の食品の安心・安全性への関心が益々高まるなか、薬剤耐性菌問題と抗菌性物質等の畜産物への残留問題は表裏一体の関係にある。このため、抗菌性物質を使う場合、診断や検査結果などの根拠に基づいて有効な薬剤の使用を最小限に抑え、使用していくことが重要である。
【００１６】
本発明の課題は、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染に対し、合成抗菌薬や抗生物質を用いない安全な薬剤耐性菌感染防除剤を提供することにあり、ひいては、人への薬剤耐性菌感染の予防に貢献する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、薬剤耐性菌感染の家畜・家禽から人への感染を懸念し、研究するなかで、抗生物質アボパルシン（ＡＶＰ）を添加していないわが国ブタでもバンコマイシン耐性菌（ＶＲＥ）が陽性である可能性が示唆された。家畜のＶＲＥ定着はＡＶＰが主因とされてきたが、わが国では他に原因があることも考えられる。そこで、本発明者らは鶏を鳥類モデルとしてヒト由来ＶＲＥの実験感染試験を行い、外来要因からの伝播の可能性について検討し、その結果、その恐れがあることを確認した。更に、実験を進め、バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類に対して、該薬剤耐性菌の防除を試み、防除剤として、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいは乳酸を利用する酪酸菌メガスフェラ・エルスデニを有効成分とする薬剤が顕著な効果を奏することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち本発明は、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分として含有することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項１）や、乳酸菌が、エンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項２）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項３）や、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）がＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項４）や、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項４記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項５）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項６）に関する。
【００１９】
また本発明は、乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項７）や、乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項７記載の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項８）や、薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項９）や、死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤（請求項１０）や、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する組成物を、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１１）や、乳酸菌がエンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１２）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項１２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１３）に関する。
【００２０】
さらに本発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項１３記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１４）や、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項１４記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１５）や、エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項１２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１６）や、乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１７）や、乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１８）や、薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項１９）や、死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法（請求項２０）に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の乳酸菌、その死菌体、又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する家畜・家禽又は魚介類感染防除剤を経口的に投与すると、家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染率が著しく低下し、従来のように家畜・家禽又は魚類の感染症に使用されてきた抗生物質や合成抗菌剤を使用することなく、効果的にバンコマイシン耐性腸球菌、多剤耐性能を有する病原菌等の感染防除効果を奏し、このような感染に対し予防および治療が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤としては、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分とするものであれば特に制限されず、また、本発明の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法としては、乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分とするものを、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与する方法であれば特に制限されず、上記薬剤耐性菌感染防除剤は、そのままあるいは製剤などあらゆる形態で使用することができる。
【００２３】
本発明において用いる乳酸球菌として、例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペディオコッカス等を挙げることができる。また、本発明において用いる乳酸桿菌として、例えば、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・ヘルベティカス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・デルブリュッキイ、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ガッセリ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・ケフィア、ラクトバシラス・ブルネリ等を挙げることができる。更に、ビフィズス菌として、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス等を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明において用いる乳酸菌として、宿主動物由来の乳酸菌を好適に例示することができる。かかる宿主動物由来の乳酸菌はＶＲＥ等の薬剤耐性菌よりも先に腸管内に定着し、その後の薬剤耐性菌の定着を抑制することが考えられる。これに対して、エンテロコッカス・フェカリス等の死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス等の近縁種であるＶＲＥ等に対して特異的なＩｇＡ，ＩｇＧまたはグラム陽性菌に強い殺菌効果を持つリゾチーム，またはディフェンシンなどの抗菌性物質の産生を促進し、ＶＲＥ等の感染を防御することが考えられる。そしてまた、乳酸から酪酸を生成するメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を、薬剤耐性菌感染防除に用いることができる。メガスフェラ・エルスデニは、例えばブタ大腸から単離することができる。
【００２５】
これらの乳酸菌等は、一種又は二種以上の菌種を配合して用いることができる。これらの乳酸菌等は、常法に従って任意の条件で培養することによって得ることができる。
【００２６】
上記乳酸菌の中でも、エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ１９４３３やエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２等のエンテロコッカス・フェカリスに属する微生物を好適に例示することができるが、特にエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ１６８０３）を用いることが好ましく、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ１６８０３）の１６ＳｒＤＮＡは、国立遺伝研究所に「ＡＢ１５４８２」として登録されている。
【００２７】
本発明において用いられるエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の菌学的性質を（表１）に示す。このエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の培養方法としては、従来公知の乳酸菌の培養方法も含め特に制限されるものではないが、乳酸菌生育用培地を用い、３７℃で培養ｐＨを中性付近に維持しながら５〜１２０時間、好ましくは、１６〜２８時間培養し、生菌数約１０７〜１０１０／ｍｌ、好ましくは約１０８〜１０１０／ｍｌの培養液を得る方法を例示することができる。
【００２８】
【表１】
【００２９】
本発明においては、乳酸菌は、生菌、その死菌体又はその処理物として用いることが、また、メガスフェラ・エルスデニはその生菌を用いることが好ましい。前記死菌体としては、常法により培養、集菌した乳酸菌の菌体を洗浄し、遠心脱水し、必要に応じて洗浄・脱水を繰り返した後、蒸留水、生理食塩水等に懸濁し、この懸濁液を、例えば８０〜１１５℃で３０分〜３秒間加熱することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物、又は前記死菌体懸濁液にガンマ線或いは中性子線を照射することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物を挙げることができる。該死菌体懸濁液の乾燥手段としては公知の乾燥手段であれば特に制限されないが、噴霧乾燥、凍結乾燥等を例示することができる。場合によっては、加熱等による殺菌処理の前後、あるいは、乾燥処理の前後に、酵素処理、界面活性剤処理、磨砕・粉砕処理を行うこともでき、これらの処理により得られるものも、本発明の死菌体又はその処理物に含まれる。
【００３０】
前記の薬剤耐性菌防除剤や組成物を製剤として用いる場合、デンプン、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合材、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁剤等の添加剤を配合して、周知の方法で粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等に製剤化することができる。またグルコン酸塩、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせると相乗効果が期待でき尚良い。かかる製剤はそのまま投与することもできるが、飼料等に混じて給餌させることもできる。
【００３１】
本発明の防除剤は、特にＶＲＥ、中でもヒト由来のエンテロコッカス・フェカリス標準株となっているＶＲＥに対して抗菌作用が認められた。したがって、本発明の防除剤は、耐熱性、耐塩性のエンテロコッカス属に広く適用される。
【００３２】
本発明において、薬剤耐性菌防除の対象となる家畜・家禽類としては、牛、豚、馬、羊、ヤギなどの家畜、鶏、鴨、ダチョウなどの家禽を例示することができ、授乳、哺乳期も含め、いずれの段階の日齢、年齢の家畜・家禽にも適用できる。特に、離乳期前後の子豚や、鶏のヒナは、腸内菌叢が成熟しておらず抵抗力が弱いので、ＶＲＥに罹りやすい。また、魚介類としては、ハマチ、カンパチ、ヒラメ、鯛、鯉、鰻、エビ、アサリ、蛤等通常養殖されている魚介類を好適に例示することができる。
【００３３】
本発明の乳酸菌、その死菌体、又はその処理物や、メガスフェラ・エルスデニを家畜等へ投与する形態は、家畜等へ直接経口投与する方法及び飼料や飲水に混合してから投与する方法があるが、何れでもよい。またこの際グルコン酸Na、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせると相乗効果が期待でき尚良い。
【００３４】
本発明の薬剤耐性菌感染防除剤やその方法における投与量や投与回数は、家畜・家禽の種類、体重、日齢、月齢、病状、回復状態に応じて、適宜決定することができる。たとえば、鶏、ヒナに関しては、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又若しくは処理物を用いる場合、その量は、ヒナ用飼料０．０００１％〜０．０５％投与となるように混合し、通常の１日当たりの飼料の量及び給餌回数とすることを例示することができる。又、豚については、特に離乳期前後の子豚に０．０００１％〜０．０５％添加することができる。
【００３５】
（実施例）
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体の調製）
エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）をロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に０．１（ｖ／ｖ）％接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら、３７℃で２２〜２４時間中和培養を行なった。
【００３７】
培養終了後、連続遠心機で菌体を分離、回収した後、水を加えて元の液量まで希釈して再度連続遠心機で菌体を分離、回収した。この操作を合計４回繰り返して菌体を洗浄した。次いで、洗浄した菌体を適量の水に懸濁し、１００℃で３０分間殺菌した後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥して加熱処理菌体粉末を調製した。
【実施例２】
【００３８】
（ヒト由来ＶＲＥの感染試験）
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナ（２群、各６羽）にＶＲＥ２菌株（ヒト由来標準株２株）の菌液を約１０８個／羽の割合で強制的に経口投与した。投与後０．５、１、３、７及び１４日に糞便スワブを採取し、バンコマイシン（ＶＣＭ）１０μｇ／ｍＬ添加ＥＦ寒天培地に塗布した。３７℃で４８時間培養し、発育したコロニーを釣菌してグラム染色性、形態及び発酵能からEnterococcus属であることが確認した。投与後２１日に解剖し、素嚢、胃、小腸及び盲腸の各消化管への定着を調べた。その結果、ＶＲＥ投与後０．５〜１４日目までの全てのスワブからＶＲＥが単離され、投与後２１日では、素嚢、胃、小腸、盲腸の全ての消化管部位からＶＲＥが単離された。ＶＲＥが少なくとも２１日間はブロイラー腸管内に定着し得ることがわかった。ヒト由来ＶＲＥがブロイラーヒナに感染するという事実は、養鶏現場でのＶＲＥ汚染は外来生物による汚染も起こり得ることが示された。
【実施例３】
【００３９】
（腸管内でのＶＲＥ定着抑制効果）
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナを導入した（４群、各６羽）。無投与対照群、乳酸菌死菌体粉末（ＥＣ−１２）添加飼料投与群、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピー（Lactobacillus sp.）強制経口投与群及び市販競合排除製剤アヴィガード（バイエル社製）噴霧投与群の４群とした。ラクトバシルス・エスピーの投与は１日齢で１回強制投与し、競合排除製剤は、１日齢で散布投与した。ＥＣ−１２の投与は１日齢から解剖検査時まで、基礎飼料に０．０５％添加したものを与えた。実施例２で腸管への定着が確認できたＶＲＥ株を２日齢ヒナに全羽強制経口投与した。ＶＲＥ攻撃（感染）後１，３，７及び１４日に糞便スワブを採取し、実施例２と同様にＶＲＥ排菌状況を定性評価した。ＶＲＥ攻撃（感染）後１４日に解剖検査を行い、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数を測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、無投与対照群はＶＲＥ攻撃（感染）後１４日まで６羽中３羽が陽性を示したが、ラクトバシルス・エスピー投与群では全羽陰性、ＥＣ−１２投与群では１羽が陽性であった。競合排除製剤投与群は６羽中３羽が陽性であった。盲腸内容物中菌数でも同様の傾向が認められ、ラクトバシルス・エスピー又はＥＣ−１２投与群で全羽検出限界以下となった。このように、ラクトバシルス属や、ＥＣ−１２等の乳酸菌がＶＲＥ定着阻止に有用であることがわかった。
【実施例４】
【００４０】
（腸管内でのＶＲＥ定着抑制効果）
本発明で用いる菌又はその製剤として、乳酸菌としてＥＣ−１２死菌体およびラクトバシルス・エスピー及びエンテロコッカス・エスピーを用い、乳酸利用菌としてブタ大腸より単離された酪酸菌メガスフェラ・エルスデニを用い、混合菌として、ラクトバシルス・エスピー及びメガスフェラ・エルスデニを用いた。対照物質として抗生物質であるアヴィガード（バイエル社製）を用いた。供試動物は、ブロイラーヒナ２４羽（１日齢、雄１２羽、雌１２羽）を用いた。基礎飼料としては、市販試験用配合飼料（試験用標準飼料ブロイラー前期用，ＳＤＢＮｏ．１、日本配合飼料（株）製）を使用した。閉鎖系畜舎に１日齢ヒナを収容し、体重を測定し、できるだけ体重が均一になるように配慮して４群に分け、群ごとにステンレス製ケージに入れた。投与形態として、ＥＣ−１２及びエンテロコッカス・フェシウムは、試験開始（１日齢）から試験終了（１６日齢）までを飼料に添加して投与した。ラクトバシルス・エスピー、及びメガスフェラ・エルスデニ、ラクトバシルス・エスピーとメガスフェラ・エルスデニの混合物は、１日齢のとき、強制経口投与した。アヴィガードはその用法・用量に従って試験開始時（１日齢）に１回投与した。
【００４１】
ＶＲＥ感染は、２日齢ヒナにＶＲＥを強制経口投与した。該菌株はブタ由来の野外分離株Ｅ６株を用い、培養菌液（菌体濃度１０８個／０．５ｍＬ）を０．５ｍＬずつ投与した。該ＶＲＥ投与時に全羽糞便スワブを採取し、バンコマイシン（ＶＣＭ）添加ＥＦ寒天培地に塗抹してＶＲＥフリーであることを予め確認した。
該ＶＲＥ投与後、０,１，３及び７日に滅菌綿棒を用いて糞便を採取し、ＶＣＭ添加ＥＦ寒天培地に塗抹してＶＲＥの定着もしくは通過を確認した。その結果を表２に示す。また、実験終了時（バンコマイシン投与後１４日）に解剖を行った。盲腸を採取し、検体希釈液で１０倍段階希釈を行い、ＶＣＭ添加ＥＦ寒天平板及びＬＢＳ寒天平板に適当な段階の希釈液を塗抹し、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数及びその結果も合わせて表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、乳酸菌自体（エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバシルス・エスピー）、乳酸菌の死菌体（ＥＣ−１２）、メガスフェラ・エルスデニ及びラクトバシルス・エスピーとメガスフェラ・エルスデニの混合菌がＶＲＥに感染した家禽に対し、定着抑制効果があることがわかった。
【実施例５】
【００４４】
（バンコマイシン耐性菌の感染試験）
バンコマイシン耐性菌として、エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９株を用いた。エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９株の各種抗生物質に対するＭＩＣ値は表３に示すとおりである。
【００４５】
【表３】
【００４６】
ＶＲＥフリーのブロイラー１日齢ヒナを、無投与対照群として雄６羽、雌７羽を用意し、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピー強制投与群として雄３羽、雌３羽を用意し、ＥＣ−１２群として雄７羽、雌６羽を用意し、計３群とした。ＥＣ−１２は、乳酸菌死菌体粉末を１日齢から解剖検査時まで（期間中）基礎飼料に０．０５％添加したものを飼料添加投与し、鶏糞便由来ラクトバシルス・エスピーは、１日齢で１回強制経口投与した。ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１，３，７及び１４日目の前記３群について、平均体重、平均増体重を測定した。その結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
次に、ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１、３、７及び１４日の前記３群のそれぞれの糞便スワブを採取し、ＶＲＥの排菌状況を評価した。ＡＴＣＣ５１２９９株攻撃（感染）後１４日に解剖検査を行い、盲腸内容物中のＶＲＥ菌数を測定した。さらに、血液、肝臓、脾臓のＡＴＣＣ５１２９９株のトランスロケーションを調べた。以上の結果を表５に示す。
【００４９】
【表５】
【００５０】
また、前記の３群についての解剖時の盲腸内容物中の総ＩｇＡ濃度及び血清中の総ＩｇＧ濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡはＣｈｉｃｋｅｎＩｇＡ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX）とＣｈｉｃｋｅｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Bethyl Laboratories Inc.）で測定した。結果を表６に示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】
さらに、前記の３群について血清を２０倍希釈し、ＡＴＣＣ５１２９９株の膜タンパク特異的ＩｇＧを吸光度［４９０ｎｍ］において同様にＥＬＩＳＡで測定した。方法は以下の通りです。ＶＲＥ細胞質の薄膜蛋白質溶液は炭酸塩バッファー［５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６］で薄め、コーティング抗体として使用した。ＶＲＥ細胞質の膜蛋白質溶液は以下のようにして準備した。
１）エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ５１２９９はＧＡＭ培地中でＭＧ期まで培養した。
２）培地を遠心し、ペレットは再懸濁溶液［１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４］で攪拌し、細胞壁が完全に壊れるまで、氷の上で超音波処理した。
３）超音波処理した溶液は細胞内画分を除去するために超遠心した［４７，０００ｘ ｇ、２０分、4℃；日立ｈｉｍａｃＣＰ６５β（日立）、東京（日本）］。
４）超音波処理した溶液（ＶＲＥの細胞質の膜蛋白質）のペレットを２回洗った。（再懸濁溶液によって攪拌し超遠心［４７，０００のｘｇ、２０ｍｉｎ、４℃］）
ＶＲＥ細胞質の膜蛋白質ペレットは、炭酸塩バッファーの中で攪拌し、細胞質の膜蛋白質溶液の１０mｇ／ｍＬになるように調整した。蛋白質の溶液はＶＲＥ特異的なＥＬＩＳＡ分析における抗体のコートのために使用した。その結果を表７に示す。
【００５３】
【表７】
【００５４】
以上、多剤耐性菌の感染試験において、表４から、無投与対照に比べて、本発明の乳酸菌ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）、ＥＣ−１２飼料添加投与(試験期間中)については、平均体重は、無投与対照に比べて、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）ではむしろ劣るが、ＥＣ−１２飼料添加投与(試験期間中)では、１４日後では無投与対照のものより約６％体重が上回っている。
【００５５】
表５からは、７日目の糞便中のＡＴＣＣ５１２９９株の菌は、無投与対照群は、陽性率７７％、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）では１００％、ＥＣ−１２飼料添加投与（試験期間中）では３８％であって、ＥＣ−１２の投与は、ＡＴＣＣ５１２９９株の菌の生育を抑制するか生育を阻止することに大きく寄与することがわかった。また、陽性だった個体の中での盲腸内容物中のＡＴＣＣ５１２９９株の平均菌数は、無投与対照群では、８５６００個であるのに対し、ラクトバシルス・エスピー強制経口投与（１日齢）のものは６５００個、ＥＣ−１２飼料添加投与（試験期間中）では８０００個であり、対照群に比べて、本発明のいずれも、盲腸内容物中、ＡＴＣＣ５１２９９株の菌の存在は格段に低い。
【００５６】
表６からは、盲腸内容物５０倍希釈における総ＩｇＡ濃度［ｎｇ／ｍｌ］は、本発明のものは、共に無投与対照群に比べて、高く、また、総ＩｇＧ濃度［ｎｇ／ｍｌ］では、ＥＣ−１２は、無投与対照に比して、非常に高い。このようにＥＣ−１２は、免疫力を高める作用があり、疾病防御に効果がある。
【００５７】
表７からは、解剖時の血清中のＡＴＣＣ５１２９９株膜タンパク特異的ＩｇＧ（血清２０倍希釈）では、ＥＣ−１２が、無投与対照に比して、非常に高く、このことについても、表６に示す結果と同様である。
【００５８】
以上の実施例５より、宿主動物由来の乳酸菌はＶＲＥ等の薬剤耐性菌よりも先に腸管内に定着し、その後の薬剤耐性菌の定着を抑制すると思われる。これに対して、エンテロコッカス・フェカリス等の死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス等の近縁種であるＶＲＥ等に対して特異的なＩｇＡ，ＩｇＧの産生を促進し、ＶＲＥ等の感染を防御すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の各菌株の投与によるＶＲＥ陽性率の変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分として含有することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項２】
乳酸菌が、エンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項３】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）がＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項５】
ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項４記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項６】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項７】
乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項８】
乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項７記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項９】
薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項１０】
死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項１１】
乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する組成物を、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１２】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１３】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項１２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項１３記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１５】
ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項１４記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１６】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項１２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１７】
乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１８】
乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１９】
薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項２０】
死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１】
乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分として含有することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項２】
乳酸菌が、エンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項３】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）がＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項５】
ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項４記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項６】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項７】
乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項８】
乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項７記載の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項９】
薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項１０】
死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除剤。
【請求項１１】
乳酸菌、その死菌体又はその処理物、あるいはメガスフェラ・エルスデニを有効成分として含有する組成物を、家畜・家禽類又は魚介類に経口投与することを特徴とする家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１２】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１３】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする、請求項１２記載の家畜・家禽類又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）であることを特徴とする請求項１３記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１５】
ＥＣ−１２（ＩＦＯ １６８０３）が、その死菌体であることを特徴とする請求項１４記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１６】
エンテロコッカス属に属する菌が、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であることを特徴とする請求項１２記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１７】
乳酸菌が、ラクトバシルス属に属する菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１８】
乳酸菌が、宿主動物に由来する乳酸菌であることを特徴とする請求項１１記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項１９】
薬剤耐性菌が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）又は多剤耐性菌であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【請求項２０】
死菌体が、加熱処理死菌体であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の家畜・家禽又は魚介類の薬剤耐性菌感染防除方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−８９４２１（Ｐ２００６−８９４２１Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７８５７２（Ｐ２００４−２７８５７２）
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年３月２０日 社団法人日本畜産学会発行の「日本畜産学会 第１０３回大会 講演要旨」に発表
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年３月２０日 社団法人日本畜産学会発行の「日本畜産学会 第１０３回大会 講演要旨」に発表
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
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