蛍光タンパク質をマーカーとして用いた感染の画像化
【課題】腫瘍の成長と転移の画像化において開発された技術を感染の研究にまで拡張する方法を提供する。
【解決手段】脊椎動物被験体における感染の進行を追跡する方法は、蛍光タンパク質を発現するよう改変された病原体を利用し、種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察する。この方法はまた、感染過程において病原体と関連する遺伝子の発現をモニターしうる。さらにこの方法は、改変型病原体を用いた腫瘍ターゲティングを含む。
【解決手段】脊椎動物被験体における感染の進行を追跡する方法は、蛍光タンパク質を発現するよう改変された病原体を利用し、種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察する。この方法はまた、感染過程において病原体と関連する遺伝子の発現をモニターしうる。さらにこの方法は、改変型病原体を用いた腫瘍ターゲティングを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物及びウイルス感染の研究に関する。具体的には、本発明は、脊椎動物における感染の進行及び制御を研究するための系、並びに、候補薬物の評価方法及び腫瘍ターゲティング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の進行及び転移を可視化するための緑色蛍光タンパク質の使用は現在十分に確立されている。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９９）３０２：２０−３１（Ｐ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を参照されたい。リアルタイムで進行を記録し、腫瘍治療用に提起されたプロトコールの効力を評価するために全身の画像化を利用することが米国特許第６，２５１，３８４号に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０００３】
緑色蛍光タンパク質の利点は、それが基質や補因子を必要とすることなく、また生細胞におけるその発現が明らかに生物学的な損傷を生じないことにある。さらに、緑色タンパク質は発せられる蛍光のために特に感度の高い技術となっている。実際、単純な装置、例えばキセノン又は水銀灯からの４９０ｎｍ励起とＣＣＤカラービデオカメラによる画像の捕捉を用いて得られる全身の画像は、腫瘍の成長と転移についてのリアルタイムな研究を可能にする。例えば、Ｙａｎｇ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：１２０６−１２１１を参照されたい。
【０００４】
本発明は、腫瘍の成長と転移の画像化において開発された技術を感染の研究にまで拡張するものである。微生物及びウイルス感染は、高輝度蛍光タンパク質で病原体を標識することによりモニター可能であり、また感染の進行がモニターされる。さらに、微生物又はウイルス感染の治療に有用なプロトコールは、この技術を利用して評価されうる。蛍光タンパク質の好適な発現を達成するための材料及び方法は容易に利用可能である。例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４：１０１３−１０２２は、レトロウイルスプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列を有する、造血幹細胞の改変を記載している。この著者らは、増強型のＧＦＰを使用し、この系を用いてヒト幹細胞をトランスフェクトすることにのみ困難があると述べているが、満足のいく輝度を達成できた。Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：１４−１９は、ヒト造血前駆細胞への高効率遺伝子導入を行うためのＧＦＰを発現するハイブリッドＥＢＶ／レトロウイルスベクターの使用を報告している。
【０００５】
種々の色を提供するために種々の改変型ＧＦＰを含むベクターが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより市販されている。哺乳動物細胞での発現を目的としたＣｌｏｎｔｅｃｈベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にＧＦＰを配置している。この発現系はまたウイルス病原体を標識するためにも使用しうる。
【０００６】
哺乳動物被験体においてルシフェラーゼをマーカーとして用いて細菌を可視化するための試みがなされているが、この系は光度が低いために、全身画像化は実用的ではない。例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ，Ｒ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９８）４：２４５−２４７を参照されたい。
【０００７】
ＧＦＰを発現する細菌はいくつかの研究において既に用いられているが、無傷の生存動物においては行われていない（Ｗｕ，Ｈ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）１４６：２４８１−２４９３；Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）１４６：７−１９；Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）３６（１）：１７４−１８２；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００）２６２：１０６０−１０６９；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｇｅｎｅ（１９９６）１７３：４７−５２；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：２００７−２０１１；Ｓｃｏｔｔ，Ｋ．Ｐ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｔｒｓ．（２０００）１８２：２３−２７；Ｐｒａｃｈａｉｙｏ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔ．（２０００）６３：４２７−４３３；Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｍ−Ｃ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：３８３−３９１）。このような研究の例として、病原性大腸菌０１５７Ｈ ＧＦＰによる筋組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染の可視化がある（Ｐｒａｃｈａｉｙｏ，Ｐ．ら，前掲）。また別の手法として、胃腸管組織の採取及び固定化による強制給餌感染後のマウスの胃腸管を調べるものがある（Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｍ−Ｃ．，前掲）。ＧＦＰ形質導入エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）に感染した魚は、その器官が取り出された後にその感染が画像化されている（Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，前掲）。病原性及び他の感染過程に関連する遺伝子はＧＦＰ発現との関係で評価されている（Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，前掲；Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら，前掲；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．ら，前掲；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，前掲（１９９６））。
【０００８】
本発明はまた、蛍光を用いて病原体（微生物など）により腫瘍に治療用産物を送達する腫瘍ターゲティングに関する。腫瘍における壊死領域に対して嫌気性細菌であるノーヴィ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｎｏｖｙｉ）の送達が試みられている（Ｄａｎｇ，Ｌ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００１）９８：１５１５５−１５１６０）。さらに、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を用いて腫瘍の壊死領域にターゲティングが行われている（Ｙａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７（２）：２６９−２７４；及びＹａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（２００１）６６：１６５−１７０）。嫌気性菌に依存するこれらの手法は、壊死組織のみにターゲティングし、及び／又は大きなサイズの腫瘍にのみ用いうる。さらに、トキシンを欠損するサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を用いて腫瘍ターゲティングが行われている（Ｌｏｗ，Ｋ．Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：３７−４１）。別の研究においては、転移性メラノーマ及び腎細胞癌を有するヒト患者におけるサルモネラ菌の腫瘍ターゲティング能が報告されている（Ｔｏｓｏ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０（１）：１４２−１５２）。これらの手法は生存動物において細菌を可視化する方法を提供するものではない。
【０００９】
細菌及び他の微生物は、腫瘍に治療用産物を送達するための多くの特徴を提供する。例えば、これらは、ヒト及び特定の細菌タンパク質の両方を産生するように容易に形質転換することができる。しかしながら、細菌タンパク質は広範な種類及び効力のトキシンを含む。そのような強力な分子を利用するために、本発明により示されるような治療用産物送達細菌の正確な腫瘍ターゲティング機構を有することが有用である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、写実的かつリアルタイムの設定で微生物又はウイルス感染の形成を詳細に研究可能なモデルを提供する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質を安定かつ容易に可視化されるマーカーとして使用することによって、感染の進行をモデル化し、その機構を解明することができる。本発明はまた、部分的には、細菌又は微生物、並びにその治療用分子を可視化する能力に依存する腫瘍ターゲティングに関する。
【００１１】
従って、一態様において、本発明は、蛍光タンパク質を発現する微生物又はウイルスによる感染を受けた脊椎動物被験体において蛍光の空間的・時間的進行をモニターすることにより脊椎動物モデル系における感染過程をモニターする方法に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、被験体において感染を阻止するための候補プロトコール又は薬物の評価方法に関し、該方法は、蛍光タンパク質を発現する微生物又はウイルスに感染させた脊椎動物被験体にプロトコール又は薬物を投与し、該感染被験体において種々の位置及び種々の時間における蛍光の存在、不在又は強度を観察することにより時間的・空間的な感染の進行をモニターすることを含む。この方法においては、またさらに、対照被験体において種々の時間及び種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度をモニターし、プロトコール又は薬物による処置を受けた被験体と比較する。時間的・空間的な感染の進行は、処置被験体と対照被験体において比較し、対照被験体と比較した処置被験体における感染の強度の減少は、効果のあるプロトコール又は薬物を同定する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、脊椎動物被験体における治療用病原体を用いた腫瘍ターゲティング方法に関し、該方法は、蛍光タンパク質を発現する病原体を脊椎動物被験体に投与し、被験体における種々の位置での蛍光の存在、不在又は強度を時間との関係で観察することを含む。好ましくは、該治療用病原体は、腫瘍にターゲティングし、治療用産物を腫瘍に送達するものである。
【００１４】
本発明の方法はまた、微生物又はウイルスのゲノムの種々の位置に蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を連結し、該蛍光のモニターにより蛍光タンパク質の発現をモニターすることにより、感染の進行に重要な微生物又はウイルス系の本質をモニターするためにも用いることができる。
【００１５】
最後に、本発明は、蛍光タンパク質を発現し、無傷の生存哺乳動物において正常細胞と比較して腫瘍にターゲティングすることが可能な腫瘍ターゲティング病原体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、強制給餌により１０１１の大腸菌−ＧＦＰを投与したマウスの種々の部位における蛍光の位置を示す。図１Ａは、強制給餌直後の胃における感染の事実を示す。図１Ｂ〜図１Ｇは、それぞれ強制給餌の１０分、２０分、３０分、４０分、５０分及び６０分後の小腸における蛍光の存在を示す。図１Ｈは、強制給餌の１２０分後の大腸における感染の存在を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、１０１１の大腸菌−ＧＦＰによる強制給餌後の大腸菌の生体画像結果を示す。図２Ａに示すように、ＧＦＰ感染は、強制給餌直後の胃及び十二指腸に存在する。図２Ｂは、強制給餌の４０分後の小腸における感染の存在を示す。図２Ｃは、強制給餌の１２０分後の大腸における感染の存在を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、強制給餌後の胃、小腸及び大腸における感染の全身画像及び生体画像を示す。図３Ａは、３×１０１１の大腸菌−ＧＦＰのアリコートを複数回強制給餌した後の胃（矢じり）、小腸（細い矢印）、及び大腸（太い矢印）における全身画像を示す。図３Ｂは、同様に標識された対応の生体画像を示す。
【図４】図４は、１０１１の大腸菌−ＧＦＰの浣腸直後の大腸における感染の全身画像化結果を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、抗生物質応答における腹腔感染の全身画像化結果を示す。図５Ａ及び５Ｃは、１０９の大腸菌−ＧＦＰの腹腔内（ｉｐ）注射直後の腹腔における感染を示す。図５Ｂは、注射の６時間後の未処置マウスを示す。このマウスは６時間後に死亡した。図５Ｄは、腹腔内注射の６時間後のカナマイシン処置マウスを示す。このマウスは生存した。
【図６】図６は、図５に記載したように腹腔内感染の生体画像結果を示す。
【図７】図７Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマの全身画像化を示す。図７Ｂは、ＧＦＰ標識チフス菌を含有するＰＢＳ溶液の蛍光を頼りにした注射を示す。図７Ｃは、注射直後のＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおけるＧＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図７Ｄは、注射後１日目のＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおいて増殖するＧＦＰ標識チフス菌を示す。
【図８】図８Ａは、ヌードマウス（マウス１）におけるＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図８Ｂは、注射直後に画像化した、マウス１の腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌を示す。図８Ｃは、ヌードマウス（マウス２）におけるＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図８Ｄは、マウス２における注射直後に画像化したＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌の結果を示す。
【図９】図９Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識ＭＤＡ ＭＢ−４３５ヒト乳癌の全身画像化を示す。図９Ｂは、注射直後における腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１０】図１０Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１０Ｂは、注射直後に画像化した、腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１０Ｃは、注射後１日目のＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１１】図１１Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１１Ｂは、注射直後におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１１Ｃは、注射後１日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図１１Ｄは、注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１２】図１２Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１２Ｂは、注射直後に画像化された、ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１２Ｃは、注射後１日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図１２Ｄは、注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１３】図１３は、組織学により示された、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍における、ＲＦＰ標識チフス菌のターゲティング及び進行的な増殖を示す。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖する（図１２Ｄ）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、組織学により示された、ヌードマウスにおいて増殖しているＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に対するＲＦＰ標識チフス菌の処置の効果を示す。図１４Ａは、未処置対照である。図１４Ｂは、ＲＦＰ標識チフス菌処置後である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、感染の機構を研究するためのモデル系を提供する。病原体を標識するための可視的なマーカー蛍光タンパク質を利用し、その結果、組織におけるその移動および局在化は、感染の進行として追跡され得る。
【００１８】
本明細書で使用する「感染の進行」とは、病原体及び感染細胞が感染した生物中で移動及び／又は増殖する、一般的な時間依存的様子を意味する。感染の進行は、病原体又は感染細胞の位置の単純な関数であるが、一般的には病原体及び感染細胞の増殖の関数でもある。従って、感染の進行のモニターには蛍光の位置及び強度の両者が重要である。
【００１９】
器官又は組織を切り出すことにより病原体の移動を決定することに加えて、無傷の動物において蛍光細胞の移動を観察するのに十分な強度を達成することができるため、所望により、転移の進行は無傷の被験体において観察することができる。このいずれか又は両方の方法を、感染の進行をモニターするため、及び可能性あるプロトコール又は薬物の効力をモデル系において評価するために用いうる。
【００２０】
さらに、本発明は、病原体により腫瘍に治療用産物を送達することを利用し、正確な腫瘍ターゲティング機構を提供する。腫瘍ターゲティングにおいては、病原体並びにその治療用分子を可視化できることが有利である。腫瘍を蛍光を頼りにして注射することの利点としては、治療可能な腫瘍サイズの下限がないこと、さらにはこの方法は腫瘍壊死とは関係ないことがある。さらに、病原体は、嫌気性細菌にも病原体の非有毒株にも限定されない。本明細書で使用される「治療用産物」「治療用分子」又は「治療剤」とは、病原体に含まれる目的遺伝子、又は病原体から分泌される産物（例えばトキシン若しくは他の治療用タンパク質）、あるいは病原体によって分泌されないが病原体により使用される腫瘍に対する治療効果が影響を受ける産物を意味する。目的遺伝子とは、腫瘍に対する治療効果を有するあらゆる遺伝子を意味し、例えば抗腫瘍剤を発現する遺伝子である。治療用分子の例としては、米国特許第６，２３１，８５４号に開示されるメチオニナーゼを発現する遺伝子又はメチオニナーゼ自体が挙げられる。他の例としては、ｐ５３、ＢＡＸ、トキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、Ｆａｓリガンド、及び細胞死受容体に対する抗体が挙げられる。
【００２１】
本発明の種々の態様において用いられる標識は、緑色蛍光タンパク質である。このクラスの可能性をもったタンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする天然遺伝子は、生物発光クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｒｉａ）からクローニングされた（Ｍｏｒｉｎ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７２）７７：３１３−３１８）。この遺伝子を利用可能となったことにより、遺伝子発現のためのマーカーとしてＧＦＰを用いることが可能となった。天然のＧＦＰ自体は、２７ｋＤの分子量を有する２８３アミノ酸のタンパク質である。それは、蛍光発光するためにその天然供給源からさらなるタンパク質を必要とせず、またその天然供給源においてのみ利用可能な基質または補因子も必要としない（Ｐｒａｓｈｅｒ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１１：２２９−２３３；Ｙａｎｇ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：１２５２−１２５６；Ｃｏｄｙ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２：１２１２−１２１８）。ＧＦＰ遺伝子の変異体は、発現を増強し、そして励起および蛍光を改変して、種々の色（赤及び青を含む）の「ＧＦＰ」を得るために有用であることが見出されている。ＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（６５位のセリンがトレオニンと置換されている）は、本発明方法において特に有用であり、そして４９０ｎｍで単一の励起ピークを有する（Ｈｅｉｍ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７３：６６３−６６４；米国特許第５，６２５，０４８号）。他の変異体がまた、Ｄｅｌａｇｒａｄｅ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：１５１−１５４；Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９６）１７３：３３−３８およびＣｒａｍｅｒ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：３１５−３１９に開示されている。さらなる変異体がまた、米国特許第５，６２５，０４８号に開示されている。適切な改変により、ＧＦＰにより発光される光のスペクトルを変更し得る。従って、用語「ＧＦＰ」を本出願においてしばしば使用するが、この定義の中に含まれるタンパク質は、必ずしも外見が緑色ではない。ＧＦＰの種々の形態が緑色以外の色を示し、そしてこれらは、また、「ＧＦＰ」定義内に含まれ、そして本発明の方法および材料において有用である。さらに、本明細書において、「ＧＦＰ」の定義内にはいる緑色蛍光タンパク質は、他の生物体（例えば、ウミシイタケのレニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））から単離されていることに留意されたい。ＧＦＰの任意の適切かつ便利な形態は、天然及び変異型のいずれも本発明において有用な病原体を改変するために用いうる。
【００２２】
混乱を回避するために、簡単な用語「蛍光タンパク質」を使用するが、これは、一般的にはレニラ属及びエクオレア属などの種々の生物により産生される蛍光タンパク質、並びに、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）によりそれぞれ示される種々の可視色（例えば赤色、黄色及び青色）の蛍光を発しうる、上記天然蛍光タンパク質の改変型を意味するものと理解される。一般的に、用語「蛍光タンパク質」及び「ＧＦＰ」又は「ＲＦＰ」は同じ意味で用いられる。
【００２３】
蛍光タンパク質は種々の色のものが利用可能であるため、１色以上を用いた画像化を同時に行うことができる。例えばそれぞれが特徴的な蛍光を発現する２種の異なる病原体又は３種の異なる病原体を生物に投与し、提案された処置の特定の効果を評価することができる。さらに、単一の感染生物を、単一色及び異なる色で構成的に標識し、これを用いて、細胞内又は分泌型のいずれかの遺伝子産物との融合物を産生しうる。従って、生物自体を標識するために使用した色とは異なる色の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、試験対象の遺伝子座に、又はベクター中に試験対象のタンパク質との融合タンパク質として、挿入しうる。さらなる例示として、トキシン及び他の可能性ある治療用タンパク質は、ＲＦＰと遺伝子として連結し、ＧＦＰ標識細菌の治療用産物を標識及び可視化することができる。二色画像化は、腫瘍に対する細菌及びそれらの分泌された治療用産物のターゲティングを可視化するために使用しうる。これらの腫瘍ターゲティング細菌は、その蛍光によって可視化されるように腫瘍における選択的増殖に適合されている。さらに、１種以上の病原体を、それぞれ単一色で標識し、目的遺伝子を別の色で標識し、そして腫瘍を第３の色で標識しうる。例えば、実験動物において蛍光を発現する腫瘍によって、全身画像化により蛍光標識病原体の腫瘍へのターゲティング及び病原体の治療用産物を可視化することができる。
【００２４】
本明細書において説明するように、ＧＦＰ及びＲＦＰ標識細菌は、ヌードマウスに移植したＧＦＰ及びＲＦＰ標識腫瘍において蛍光を頼りにした注射によって送達され、そして該細菌をＧＦＰ標識腫瘍にターゲティングさせたところ、腫瘍壊死が誘導された。特に、ＧＦＰ及びＲＦＰ標識大腸菌及びネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のマウスにおけるＲＦＰ及びＧＦＰ発現腫瘍に対するターゲティングは、二色全身画像化により可視化された。ターゲティングされたＲＦＰ及びＧＦＰ標識腫瘍において増殖するＧＦＰ及びＲＦＰ標識細菌は、本明細書における実施例に示されるように二色全身画像化により可視化された。従って、蛍光標識微生物の腫瘍ターゲティングが示された。しかしながら、本発明の方法はまた、最終的に腫瘍にターゲティングする細菌を選択するために、病原体のミスターゲティングをモニターするためにも用いることができる。
【００２５】
ＧＦＰを用いた一般的な細胞の標識手法は米国特許第５，４９１，０８４号（前掲）に記載されている。
【００２６】
本発明の方法は、蛍光タンパク質、好ましくは侵襲的な手法のいずれも必要とせずに被験体において蛍光を観察可能な十分な蛍光強度の蛍光タンパク質、をコードするヌクレオチド配列を発現するよう改変した病原体を利用する。全身画像化はリアルタイム観察の可能性のために好ましく、また例えば、内視鏡検査手法、又は、所望であれば、直接観察若しくは組織化学的観察のために切り出した組織若しくは器官を用いることも可能である。
【００２７】
蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、直接改変、例えば、蛍光タンパク質をコードする配列をウイルスの内因性制御配列の制御下の適切な位置に配置するウイルスゲノムの改変などによって病原体に導入することができ、あるいは適当な発現ベクターを用いて微生物系に導入することができる。病原体は、細菌、真核生物（例えば酵母）、原生生物（例えばマラリア）、又はウイルスでありうる。細菌、原生動物及び真核微生物系の特定種のための多くの発現ベクターが当技術分野で周知である。これらの系において機能的な制御配列の例は現時点において十分に理解されている。従って、病原体は、細胞増殖及び再生の定常的な特徴として構成的プロモーターの制御下にて蛍光タンパク質を発現するために最初に改変するか、又は微生物若しくはウイルスゲノムの特定の所望の位置に配置し、内因性配列と置換してもよい。この内因性配列は、病原性又は感染の進行に関与しうるものであり、これらの内因性遺伝子の発現に特徴的な時間的及び空間的パラメータを研究することができる。従って、位置決定を適切に選択することにより、感染の有効性に寄与する微生物又はウイルスの内因性因子の種類を探索することが可能である。同様に、蛍光タンパク質を発現する遺伝子を、実験動物が可視化されうる腫瘍を含むように腫瘍細胞に導入してもよい。蛍光腫瘍を調製するための他の手法は、光線力学的治療（ＰＤＴ）によるものがあり、これは、腫瘍が、蛍光を発する因子（臨床学的に許容された薬剤、例えばヘマトポルフィリンなど）を吸収するものである。
【００２８】
続いて、適切に改変した病原体を、所望であれば、その因子が利用すると考えられる感染経路又は任意の経路を模擬して被験体に投与する。投与は、注射、強制給餌、経口、呼吸器系にはエーロゾルにより、座剤により、一般的には粘膜表面との接触により、又は病原体を導入するために当技術分野で公知の任意の好適な手段により行いうる。腫瘍が蛍光タンパク質を発現する腫瘍ターゲティングにおいては、蛍光を頼りにした注射によって投与を行うことができる。蛍光を用いた腫瘍転移の研究の状況とは異なり、被験体が、免疫能が減弱している必要はない。それは、正常な免疫系を有する生物においては感染が容易に起こるためである。しかしながら、免疫能が減弱している被験体もまた上記症状の進行の研究において有用でありうる。
【００２９】
内視鏡検査、及び個々の組織の切除を用いることもできるが、蛍光光学的腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によって無傷の動物における病原体及び感染細胞の移動を可視化することが特に好都合である。これにより、特にモデル系において、抗感染薬及びプロトコール候補の評価においてリアルタイム観察及び感染の進行の連続的モニターが可能となる。従って、候補薬物又はプロトコールを投与していない対照と比較した場合に、候補薬物又はプロトコールを投与した試験動物において感染の阻止が直接観察されることは、その候補の効力及び治療としての可能性を示す。感染を治療しようとする被験体においては、ＦＯＴＩの利用によって、治療プロトコールを検討する者に対してプロトコールを変更するか又は変更しない当否（妥当性）について連続的に情報を与えることが可能となる。一実施形態においては、蛍光標識した細菌が腫瘍にターゲティングする可能性を解明するために、ＧＦＰ標識細菌をヌードマウスにおいて増殖しているルイス肺腫瘍に注射した。この腫瘍領域は高度に蛍光を発し、ＣＣＤカメラ及びＧＦＰフィルターを備えたライトボックスにおいて青色の励起により容易に可視化された。
【００３０】
モデルとしての使用に適切な脊椎動物被験体は、好ましくは哺乳動物被験体、最も好ましくウサギ、ラット、マウスなどの利用しやすい実験動物である。ヒト被験体により類似するものとして、霊長類も用い得る。任意の適切な脊椎動物被験体を用いることができ、その選択は、主に最終的な目的の系に対する利用しやすさ及び類似性により決定される。最終的には、脊椎動物被験体はヒトでありうる。
【００３１】
腫瘍ターゲティング細菌は、腫瘍選択的遺伝子治療のためのベクターとして腫瘍における選択的増殖に適合させうることが予想される。
【００３２】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
調製Ａ
病原体の改変
レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｌｌｅｒｉ）緑色蛍光タンパク質の変異体（ＲＭＶ−ＧＦＰ）（Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｘｕ，Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，非公表データ）を、ｌａｃプロモーターからＧＦＰを発現するｐＵＣ１９誘導体のｐＰＤ１６．３８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にクローニングした。このベクターをｐＲＭＶ−ＧＦＰと称する。ｐＲＭＶ−ＧＦＰを標準的な方法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にトランスフェクトし、形質転換細胞を寒天プレート上でのアンピシリン耐性により選択した。
【００３４】
高発現大腸菌−ＧＦＰクローンは蛍光顕微鏡で選択した。大腸菌もまたＲＦＰで標識し、さらにネズミチフス菌はＧＦＰ及びＲＦＰの両方で標識した。
【００３５】
実施例１
強制給餌によるマウスの感染
Ｎｕ／ｎｕ／ＣＤ−１マウスの４週令のメスマウスに、２０ゲージのバレル型チップ給餌針（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて０．５ｍｌの大腸菌−ＧＦＰ懸濁液（５×１０１０／ｍｌ）を強制給餌した。
【００３６】
強制給餌後、種々の時点において、マウスの画像化を実施した。この画像化は、青色光ファイバー光源（Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）により照明されるライトボックスにおいて行った。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ５８１０ ３−ｃｈｉｐ ｃｏｏｌｅｄ ｃｏｌｏｒ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を用いて記録した。１０２４×７２４ピクセルの画像を、ＩＢＭ ＰＣに直接記録するか又は高解像能ＳｏｎｙＶＣＲ ｍｏｄｅｌ ＳＬＶ−Ｒ１０００（Ｓｏｎｙ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でのビデオ出力により連続的に記録した。この画像は、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ３．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）を用いてコントラスト及び明度について処理し、解析した。
【００３７】
強制給餌によりマウスＧＩ管に導入された大腸菌−ＧＦＰは、そのほぼ直後に全身画像において胃部に可視化された（図１Ａ）。強制給餌後１０分以内に胃は空になり、続いて大腸菌−ＧＦＰは小腸において見られた（図１Ｂ〜Ｇ）。小腸における細菌集団は、強制給餌後４０分にピークに達して観察され（図１Ｅ）、１２０分で消失した（図１Ｇ）。１２０分後には大腸において大腸菌−ＧＦＰが観察された（図１Ｈ）。
【００３８】
強制給餌後の適当な時点において、腹腔を開腹し、大腸菌−ＧＦＰ蛍光の生体画像を作成した。胃（図２Ａ）、小腸（図２Ｂ）及び大腸（図２Ｃ）は、生体画像で観察されるように大腸菌−ＧＦＰにより明るい蛍光を発した。大腸菌−ＧＦＰによる複数回の強制給餌によって、胃、小腸及び大腸の同時摂取を行うことができ、これを全身（図３Ａ）及び生体手法（図３Ｂ）により画像化した。胃、小腸及び大腸における大腸菌−ＧＦＰの全身画像及び生体画像の比較によって、対応関係の程度が高いことが示された。
【００３９】
実施例２
大腸菌−ＧＦＰの直接腸感染
２０ゲージのバレル型チップ給餌針（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＴｏｏｌｓＩｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、マウス１匹当たり１．５ｍｌの大腸菌−ＧＦＰ（３×１０１０／ｍｌを含む）を浣腸で腸に投与した。これらのマウスはまた、実施例１の手法を用いて画像化に供した。結果を図４に示す。
【００４０】
実施例３
大腸菌−ＧＦＰの腹腔内感染及び抗生物質に対する応答
各グループのマウスには、１ｍｌ ２９Ｇ１ラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて１０９〜１０１０の大腸菌−ＧＦＰを腹腔内（ｉｐ）注射した。蛍光細菌は、注射直後に外部全身画像化によって注射部位の周囲に位置することが観察された（図５Ａ、Ｃ）。その６時間後には、大腸菌−ＧＦＰは腹膜全体に広がって観察され（図５Ｂ）、これは動物の死亡と一致していた。６時間での開腹腔における大腸菌−ＧＦＰの生体画像（図６）は、外部全身画像化により観察されたものと同様の細菌分布を示した。
【００４１】
腹腔内経路で感染させた動物の別のグループは、接種後１００μｌ中の２ｍｇカナマイシンで処置した。感染マウスの対照グループには、抗生物質の代わりに１００μｌのＰＢＳを腹腔内（ｉｐ）注射した。処置マウスの全身画像化によって、次の６時間において細菌集団の顕著な低減が示された（図５Ｃ及びＤ）。
【００４２】
実施例４
全身画像化を用いた脳癌のターゲティング
１×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含有するＰＢＳ溶液（１０μｌ）を、蛍光を頼りにした注射を利用して（図７Ｂ）ヌードマウスにおけるＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマに注射した（図７Ａ）。ＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおけるＧＦＰ標識チフス菌を、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図７Ｃ）。ＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおいて増殖するＧＦＰ標識チフス菌は、注射後１日目において、腫瘍周囲におけるＧＦＰ標識チフス菌の局在化、並びに腫瘍サイズの低減を示した（図７Ｄ）。
【００４３】
実施例５
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
ＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍を有する第１のヌードマウス（図８Ａ）において、１×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌をＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射し、注射直後に全身画像化を用いて画像化した（図８Ｂ）。腫瘍の周囲にＧＦＰ標識チフス菌の局在化が観察された（図８Ｂ）。蛍光を頼りにした注射の１つの利点は、毒性のサルモネラ菌を用いることができ、またあらゆるサイズの腫瘍をターゲティング可能なことである。
【００４４】
ＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍を有する第２のヌードマウス（図８Ｃ）においては、２×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射し、注射直後に全身画像化を用いて画像化した。腫瘍の周囲におけるＧＦＰ標識ネズミチフス菌の局在化が観察された（図８Ｄ）。
【００４５】
実施例６
全身画像化を用いた乳癌のターゲティング
２×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液を、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識ＭＤＡ ＭＢ−４３５ヒト乳癌（図９Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化したところ、腫瘍の周囲における局在化（図９Ｂ）と腫瘍サイズの明らかな低減が示された。このことは腫瘍の壊死を示している。
【００４６】
実施例７
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
３×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１０Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１０Ｂ）。ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍におけるＲＦＰ標識ネズミチフス菌の増殖は、注射後１日目に観察され（図１０Ｃ）、これは腫瘍の周囲におけるＲＦＰ標識チフス菌の増殖と腫瘍サイズの低減を示している。
【００４７】
実施例８
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
２×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１１Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１１Ｂ）。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後１日目にＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖として検出され（図１１Ｃ）、これは注射後４日目における腫瘍の増殖が継続したことを示したが、腫瘍サイズの低減が示される。
【００４８】
実施例９
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
２×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１２Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１２Ｂ）。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後１日目（図１２Ｃ）及び注射後４日目（図１２Ｄ）にＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖として検出され、これは目に見える腫瘍サイズの低減を示している。
【００４９】
注射後４日目に、ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌に対して組織学的試験を行った（図１２Ｄ）。この試験は、１０％緩衝化ホルマリンで腫瘍組織を固定し、パラフィン切片処理を行い、標準的な方法でＨＥ染色することにより行った。ＲＦＰ標識チフス菌（図１３において白い矢印で示す小さな青色スポット、倍率４００×）は、ＰＣ−３腫瘍組織において徐々に増殖し、腫瘍細胞にターゲティングした。
【００５０】
組織学的試験（ＨＥ染色、倍率２００×）を用いて、ヌードマウスにおいて増殖しているＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍構造を維持する未処置対照（図１４Ａ）と、ＲＦＰ標識チフス菌で処置したヌードマウスにおいて増殖している注射後４日目のＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１４Ｂ）との比較を行った。腫瘍組織の大部分は破壊されており、腫瘍には広範囲の壊死（図１４Ｂ中の矢印）が示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物及びウイルス感染の研究に関する。具体的には、本発明は、脊椎動物における感染の進行及び制御を研究するための系、並びに、候補薬物の評価方法及び腫瘍ターゲティング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の進行及び転移を可視化するための緑色蛍光タンパク質の使用は現在十分に確立されている。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９９）３０２：２０−３１（Ｐ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を参照されたい。リアルタイムで進行を記録し、腫瘍治療用に提起されたプロトコールの効力を評価するために全身の画像化を利用することが米国特許第６，２５１，３８４号に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０００３】
緑色蛍光タンパク質の利点は、それが基質や補因子を必要とすることなく、また生細胞におけるその発現が明らかに生物学的な損傷を生じないことにある。さらに、緑色タンパク質は発せられる蛍光のために特に感度の高い技術となっている。実際、単純な装置、例えばキセノン又は水銀灯からの４９０ｎｍ励起とＣＣＤカラービデオカメラによる画像の捕捉を用いて得られる全身の画像は、腫瘍の成長と転移についてのリアルタイムな研究を可能にする。例えば、Ｙａｎｇ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：１２０６−１２１１を参照されたい。
【０００４】
本発明は、腫瘍の成長と転移の画像化において開発された技術を感染の研究にまで拡張するものである。微生物及びウイルス感染は、高輝度蛍光タンパク質で病原体を標識することによりモニター可能であり、また感染の進行がモニターされる。さらに、微生物又はウイルス感染の治療に有用なプロトコールは、この技術を利用して評価されうる。蛍光タンパク質の好適な発現を達成するための材料及び方法は容易に利用可能である。例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４：１０１３−１０２２は、レトロウイルスプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列を有する、造血幹細胞の改変を記載している。この著者らは、増強型のＧＦＰを使用し、この系を用いてヒト幹細胞をトランスフェクトすることにのみ困難があると述べているが、満足のいく輝度を達成できた。Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９８）５８：１４−１９は、ヒト造血前駆細胞への高効率遺伝子導入を行うためのＧＦＰを発現するハイブリッドＥＢＶ／レトロウイルスベクターの使用を報告している。
【０００５】
種々の色を提供するために種々の改変型ＧＦＰを含むベクターが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより市販されている。哺乳動物細胞での発現を目的としたＣｌｏｎｔｅｃｈベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にＧＦＰを配置している。この発現系はまたウイルス病原体を標識するためにも使用しうる。
【０００６】
哺乳動物被験体においてルシフェラーゼをマーカーとして用いて細菌を可視化するための試みがなされているが、この系は光度が低いために、全身画像化は実用的ではない。例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ，Ｒ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９８）４：２４５−２４７を参照されたい。
【０００７】
ＧＦＰを発現する細菌はいくつかの研究において既に用いられているが、無傷の生存動物においては行われていない（Ｗｕ，Ｈ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）１４６：２４８１−２４９３；Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）１４６：７−１９；Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）３６（１）：１７４−１８２；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００）２６２：１０６０−１０６９；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｇｅｎｅ（１９９６）１７３：４７−５２；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：２００７−２０１１；Ｓｃｏｔｔ，Ｋ．Ｐ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｔｒｓ．（２０００）１８２：２３−２７；Ｐｒａｃｈａｉｙｏ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔ．（２０００）６３：４２７−４３３；Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｍ−Ｃ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：３８３−３９１）。このような研究の例として、病原性大腸菌０１５７Ｈ ＧＦＰによる筋組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染の可視化がある（Ｐｒａｃｈａｉｙｏ，Ｐ．ら，前掲）。また別の手法として、胃腸管組織の採取及び固定化による強制給餌感染後のマウスの胃腸管を調べるものがある（Ｇｅｏｆｆｒｏｙ，Ｍ−Ｃ．，前掲）。ＧＦＰ形質導入エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）に感染した魚は、その器官が取り出された後にその感染が画像化されている（Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，前掲）。病原性及び他の感染過程に関連する遺伝子はＧＦＰ発現との関係で評価されている（Ｌｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．Ｍ．ら，前掲；Ｂａｄｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら，前掲；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．ら，前掲；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｒ．Ｈ．ら，前掲（１９９６））。
【０００８】
本発明はまた、蛍光を用いて病原体（微生物など）により腫瘍に治療用産物を送達する腫瘍ターゲティングに関する。腫瘍における壊死領域に対して嫌気性細菌であるノーヴィ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｎｏｖｙｉ）の送達が試みられている（Ｄａｎｇ，Ｌ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００１）９８：１５１５５−１５１６０）。さらに、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を用いて腫瘍の壊死領域にターゲティングが行われている（Ｙａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７（２）：２６９−２７４；及びＹａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（２００１）６６：１６５−１７０）。嫌気性菌に依存するこれらの手法は、壊死組織のみにターゲティングし、及び／又は大きなサイズの腫瘍にのみ用いうる。さらに、トキシンを欠損するサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を用いて腫瘍ターゲティングが行われている（Ｌｏｗ，Ｋ．Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）１７：３７−４１）。別の研究においては、転移性メラノーマ及び腎細胞癌を有するヒト患者におけるサルモネラ菌の腫瘍ターゲティング能が報告されている（Ｔｏｓｏ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０（１）：１４２−１５２）。これらの手法は生存動物において細菌を可視化する方法を提供するものではない。
【０００９】
細菌及び他の微生物は、腫瘍に治療用産物を送達するための多くの特徴を提供する。例えば、これらは、ヒト及び特定の細菌タンパク質の両方を産生するように容易に形質転換することができる。しかしながら、細菌タンパク質は広範な種類及び効力のトキシンを含む。そのような強力な分子を利用するために、本発明により示されるような治療用産物送達細菌の正確な腫瘍ターゲティング機構を有することが有用である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、写実的かつリアルタイムの設定で微生物又はウイルス感染の形成を詳細に研究可能なモデルを提供する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質を安定かつ容易に可視化されるマーカーとして使用することによって、感染の進行をモデル化し、その機構を解明することができる。本発明はまた、部分的には、細菌又は微生物、並びにその治療用分子を可視化する能力に依存する腫瘍ターゲティングに関する。
【００１１】
従って、一態様において、本発明は、蛍光タンパク質を発現する微生物又はウイルスによる感染を受けた脊椎動物被験体において蛍光の空間的・時間的進行をモニターすることにより脊椎動物モデル系における感染過程をモニターする方法に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、被験体において感染を阻止するための候補プロトコール又は薬物の評価方法に関し、該方法は、蛍光タンパク質を発現する微生物又はウイルスに感染させた脊椎動物被験体にプロトコール又は薬物を投与し、該感染被験体において種々の位置及び種々の時間における蛍光の存在、不在又は強度を観察することにより時間的・空間的な感染の進行をモニターすることを含む。この方法においては、またさらに、対照被験体において種々の時間及び種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度をモニターし、プロトコール又は薬物による処置を受けた被験体と比較する。時間的・空間的な感染の進行は、処置被験体と対照被験体において比較し、対照被験体と比較した処置被験体における感染の強度の減少は、効果のあるプロトコール又は薬物を同定する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、脊椎動物被験体における治療用病原体を用いた腫瘍ターゲティング方法に関し、該方法は、蛍光タンパク質を発現する病原体を脊椎動物被験体に投与し、被験体における種々の位置での蛍光の存在、不在又は強度を時間との関係で観察することを含む。好ましくは、該治療用病原体は、腫瘍にターゲティングし、治療用産物を腫瘍に送達するものである。
【００１４】
本発明の方法はまた、微生物又はウイルスのゲノムの種々の位置に蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を連結し、該蛍光のモニターにより蛍光タンパク質の発現をモニターすることにより、感染の進行に重要な微生物又はウイルス系の本質をモニターするためにも用いることができる。
【００１５】
最後に、本発明は、蛍光タンパク質を発現し、無傷の生存哺乳動物において正常細胞と比較して腫瘍にターゲティングすることが可能な腫瘍ターゲティング病原体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、強制給餌により１０１１の大腸菌−ＧＦＰを投与したマウスの種々の部位における蛍光の位置を示す。図１Ａは、強制給餌直後の胃における感染の事実を示す。図１Ｂ〜図１Ｇは、それぞれ強制給餌の１０分、２０分、３０分、４０分、５０分及び６０分後の小腸における蛍光の存在を示す。図１Ｈは、強制給餌の１２０分後の大腸における感染の存在を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、１０１１の大腸菌−ＧＦＰによる強制給餌後の大腸菌の生体画像結果を示す。図２Ａに示すように、ＧＦＰ感染は、強制給餌直後の胃及び十二指腸に存在する。図２Ｂは、強制給餌の４０分後の小腸における感染の存在を示す。図２Ｃは、強制給餌の１２０分後の大腸における感染の存在を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、強制給餌後の胃、小腸及び大腸における感染の全身画像及び生体画像を示す。図３Ａは、３×１０１１の大腸菌−ＧＦＰのアリコートを複数回強制給餌した後の胃（矢じり）、小腸（細い矢印）、及び大腸（太い矢印）における全身画像を示す。図３Ｂは、同様に標識された対応の生体画像を示す。
【図４】図４は、１０１１の大腸菌−ＧＦＰの浣腸直後の大腸における感染の全身画像化結果を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、抗生物質応答における腹腔感染の全身画像化結果を示す。図５Ａ及び５Ｃは、１０９の大腸菌−ＧＦＰの腹腔内（ｉｐ）注射直後の腹腔における感染を示す。図５Ｂは、注射の６時間後の未処置マウスを示す。このマウスは６時間後に死亡した。図５Ｄは、腹腔内注射の６時間後のカナマイシン処置マウスを示す。このマウスは生存した。
【図６】図６は、図５に記載したように腹腔内感染の生体画像結果を示す。
【図７】図７Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマの全身画像化を示す。図７Ｂは、ＧＦＰ標識チフス菌を含有するＰＢＳ溶液の蛍光を頼りにした注射を示す。図７Ｃは、注射直後のＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおけるＧＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図７Ｄは、注射後１日目のＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおいて増殖するＧＦＰ標識チフス菌を示す。
【図８】図８Ａは、ヌードマウス（マウス１）におけるＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図８Ｂは、注射直後に画像化した、マウス１の腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌を示す。図８Ｃは、ヌードマウス（マウス２）におけるＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図８Ｄは、マウス２における注射直後に画像化したＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌の結果を示す。
【図９】図９Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識ＭＤＡ ＭＢ−４３５ヒト乳癌の全身画像化を示す。図９Ｂは、注射直後における腫瘍に注射したＧＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１０】図１０Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１０Ｂは、注射直後に画像化した、腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１０Ｃは、注射後１日目のＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１１】図１１Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１１Ｂは、注射直後におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１１Ｃは、注射後１日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図１１Ｄは、注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１２】図１２Ａは、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の全身画像化を示す。図１２Ｂは、注射直後に画像化された、ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に注射したＲＦＰ標識チフス菌の結果を示す。図１２Ｃは、注射後１日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。図１２Ｄは、注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖するＲＦＰ標識チフス菌の全身画像化を示す。
【図１３】図１３は、組織学により示された、ヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍における、ＲＦＰ標識チフス菌のターゲティング及び進行的な増殖を示す。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後４日目におけるＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍で増殖する（図１２Ｄ）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、組織学により示された、ヌードマウスにおいて増殖しているＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍に対するＲＦＰ標識チフス菌の処置の効果を示す。図１４Ａは、未処置対照である。図１４Ｂは、ＲＦＰ標識チフス菌処置後である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、感染の機構を研究するためのモデル系を提供する。病原体を標識するための可視的なマーカー蛍光タンパク質を利用し、その結果、組織におけるその移動および局在化は、感染の進行として追跡され得る。
【００１８】
本明細書で使用する「感染の進行」とは、病原体及び感染細胞が感染した生物中で移動及び／又は増殖する、一般的な時間依存的様子を意味する。感染の進行は、病原体又は感染細胞の位置の単純な関数であるが、一般的には病原体及び感染細胞の増殖の関数でもある。従って、感染の進行のモニターには蛍光の位置及び強度の両者が重要である。
【００１９】
器官又は組織を切り出すことにより病原体の移動を決定することに加えて、無傷の動物において蛍光細胞の移動を観察するのに十分な強度を達成することができるため、所望により、転移の進行は無傷の被験体において観察することができる。このいずれか又は両方の方法を、感染の進行をモニターするため、及び可能性あるプロトコール又は薬物の効力をモデル系において評価するために用いうる。
【００２０】
さらに、本発明は、病原体により腫瘍に治療用産物を送達することを利用し、正確な腫瘍ターゲティング機構を提供する。腫瘍ターゲティングにおいては、病原体並びにその治療用分子を可視化できることが有利である。腫瘍を蛍光を頼りにして注射することの利点としては、治療可能な腫瘍サイズの下限がないこと、さらにはこの方法は腫瘍壊死とは関係ないことがある。さらに、病原体は、嫌気性細菌にも病原体の非有毒株にも限定されない。本明細書で使用される「治療用産物」「治療用分子」又は「治療剤」とは、病原体に含まれる目的遺伝子、又は病原体から分泌される産物（例えばトキシン若しくは他の治療用タンパク質）、あるいは病原体によって分泌されないが病原体により使用される腫瘍に対する治療効果が影響を受ける産物を意味する。目的遺伝子とは、腫瘍に対する治療効果を有するあらゆる遺伝子を意味し、例えば抗腫瘍剤を発現する遺伝子である。治療用分子の例としては、米国特許第６，２３１，８５４号に開示されるメチオニナーゼを発現する遺伝子又はメチオニナーゼ自体が挙げられる。他の例としては、ｐ５３、ＢＡＸ、トキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、Ｆａｓリガンド、及び細胞死受容体に対する抗体が挙げられる。
【００２１】
本発明の種々の態様において用いられる標識は、緑色蛍光タンパク質である。このクラスの可能性をもったタンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする天然遺伝子は、生物発光クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｒｉａ）からクローニングされた（Ｍｏｒｉｎ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７２）７７：３１３−３１８）。この遺伝子を利用可能となったことにより、遺伝子発現のためのマーカーとしてＧＦＰを用いることが可能となった。天然のＧＦＰ自体は、２７ｋＤの分子量を有する２８３アミノ酸のタンパク質である。それは、蛍光発光するためにその天然供給源からさらなるタンパク質を必要とせず、またその天然供給源においてのみ利用可能な基質または補因子も必要としない（Ｐｒａｓｈｅｒ、Ｄ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１１１：２２９−２３３；Ｙａｎｇ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：１２５２−１２５６；Ｃｏｄｙ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２：１２１２−１２１８）。ＧＦＰ遺伝子の変異体は、発現を増強し、そして励起および蛍光を改変して、種々の色（赤及び青を含む）の「ＧＦＰ」を得るために有用であることが見出されている。ＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（６５位のセリンがトレオニンと置換されている）は、本発明方法において特に有用であり、そして４９０ｎｍで単一の励起ピークを有する（Ｈｅｉｍ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７３：６６３−６６４；米国特許第５，６２５，０４８号）。他の変異体がまた、Ｄｅｌａｇｒａｄｅ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：１５１−１５４；Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９６）１７３：３３−３８およびＣｒａｍｅｒ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９６）１４：３１５−３１９に開示されている。さらなる変異体がまた、米国特許第５，６２５，０４８号に開示されている。適切な改変により、ＧＦＰにより発光される光のスペクトルを変更し得る。従って、用語「ＧＦＰ」を本出願においてしばしば使用するが、この定義の中に含まれるタンパク質は、必ずしも外見が緑色ではない。ＧＦＰの種々の形態が緑色以外の色を示し、そしてこれらは、また、「ＧＦＰ」定義内に含まれ、そして本発明の方法および材料において有用である。さらに、本明細書において、「ＧＦＰ」の定義内にはいる緑色蛍光タンパク質は、他の生物体（例えば、ウミシイタケのレニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））から単離されていることに留意されたい。ＧＦＰの任意の適切かつ便利な形態は、天然及び変異型のいずれも本発明において有用な病原体を改変するために用いうる。
【００２２】
混乱を回避するために、簡単な用語「蛍光タンパク質」を使用するが、これは、一般的にはレニラ属及びエクオレア属などの種々の生物により産生される蛍光タンパク質、並びに、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）によりそれぞれ示される種々の可視色（例えば赤色、黄色及び青色）の蛍光を発しうる、上記天然蛍光タンパク質の改変型を意味するものと理解される。一般的に、用語「蛍光タンパク質」及び「ＧＦＰ」又は「ＲＦＰ」は同じ意味で用いられる。
【００２３】
蛍光タンパク質は種々の色のものが利用可能であるため、１色以上を用いた画像化を同時に行うことができる。例えばそれぞれが特徴的な蛍光を発現する２種の異なる病原体又は３種の異なる病原体を生物に投与し、提案された処置の特定の効果を評価することができる。さらに、単一の感染生物を、単一色及び異なる色で構成的に標識し、これを用いて、細胞内又は分泌型のいずれかの遺伝子産物との融合物を産生しうる。従って、生物自体を標識するために使用した色とは異なる色の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、試験対象の遺伝子座に、又はベクター中に試験対象のタンパク質との融合タンパク質として、挿入しうる。さらなる例示として、トキシン及び他の可能性ある治療用タンパク質は、ＲＦＰと遺伝子として連結し、ＧＦＰ標識細菌の治療用産物を標識及び可視化することができる。二色画像化は、腫瘍に対する細菌及びそれらの分泌された治療用産物のターゲティングを可視化するために使用しうる。これらの腫瘍ターゲティング細菌は、その蛍光によって可視化されるように腫瘍における選択的増殖に適合されている。さらに、１種以上の病原体を、それぞれ単一色で標識し、目的遺伝子を別の色で標識し、そして腫瘍を第３の色で標識しうる。例えば、実験動物において蛍光を発現する腫瘍によって、全身画像化により蛍光標識病原体の腫瘍へのターゲティング及び病原体の治療用産物を可視化することができる。
【００２４】
本明細書において説明するように、ＧＦＰ及びＲＦＰ標識細菌は、ヌードマウスに移植したＧＦＰ及びＲＦＰ標識腫瘍において蛍光を頼りにした注射によって送達され、そして該細菌をＧＦＰ標識腫瘍にターゲティングさせたところ、腫瘍壊死が誘導された。特に、ＧＦＰ及びＲＦＰ標識大腸菌及びネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のマウスにおけるＲＦＰ及びＧＦＰ発現腫瘍に対するターゲティングは、二色全身画像化により可視化された。ターゲティングされたＲＦＰ及びＧＦＰ標識腫瘍において増殖するＧＦＰ及びＲＦＰ標識細菌は、本明細書における実施例に示されるように二色全身画像化により可視化された。従って、蛍光標識微生物の腫瘍ターゲティングが示された。しかしながら、本発明の方法はまた、最終的に腫瘍にターゲティングする細菌を選択するために、病原体のミスターゲティングをモニターするためにも用いることができる。
【００２５】
ＧＦＰを用いた一般的な細胞の標識手法は米国特許第５，４９１，０８４号（前掲）に記載されている。
【００２６】
本発明の方法は、蛍光タンパク質、好ましくは侵襲的な手法のいずれも必要とせずに被験体において蛍光を観察可能な十分な蛍光強度の蛍光タンパク質、をコードするヌクレオチド配列を発現するよう改変した病原体を利用する。全身画像化はリアルタイム観察の可能性のために好ましく、また例えば、内視鏡検査手法、又は、所望であれば、直接観察若しくは組織化学的観察のために切り出した組織若しくは器官を用いることも可能である。
【００２７】
蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、直接改変、例えば、蛍光タンパク質をコードする配列をウイルスの内因性制御配列の制御下の適切な位置に配置するウイルスゲノムの改変などによって病原体に導入することができ、あるいは適当な発現ベクターを用いて微生物系に導入することができる。病原体は、細菌、真核生物（例えば酵母）、原生生物（例えばマラリア）、又はウイルスでありうる。細菌、原生動物及び真核微生物系の特定種のための多くの発現ベクターが当技術分野で周知である。これらの系において機能的な制御配列の例は現時点において十分に理解されている。従って、病原体は、細胞増殖及び再生の定常的な特徴として構成的プロモーターの制御下にて蛍光タンパク質を発現するために最初に改変するか、又は微生物若しくはウイルスゲノムの特定の所望の位置に配置し、内因性配列と置換してもよい。この内因性配列は、病原性又は感染の進行に関与しうるものであり、これらの内因性遺伝子の発現に特徴的な時間的及び空間的パラメータを研究することができる。従って、位置決定を適切に選択することにより、感染の有効性に寄与する微生物又はウイルスの内因性因子の種類を探索することが可能である。同様に、蛍光タンパク質を発現する遺伝子を、実験動物が可視化されうる腫瘍を含むように腫瘍細胞に導入してもよい。蛍光腫瘍を調製するための他の手法は、光線力学的治療（ＰＤＴ）によるものがあり、これは、腫瘍が、蛍光を発する因子（臨床学的に許容された薬剤、例えばヘマトポルフィリンなど）を吸収するものである。
【００２８】
続いて、適切に改変した病原体を、所望であれば、その因子が利用すると考えられる感染経路又は任意の経路を模擬して被験体に投与する。投与は、注射、強制給餌、経口、呼吸器系にはエーロゾルにより、座剤により、一般的には粘膜表面との接触により、又は病原体を導入するために当技術分野で公知の任意の好適な手段により行いうる。腫瘍が蛍光タンパク質を発現する腫瘍ターゲティングにおいては、蛍光を頼りにした注射によって投与を行うことができる。蛍光を用いた腫瘍転移の研究の状況とは異なり、被験体が、免疫能が減弱している必要はない。それは、正常な免疫系を有する生物においては感染が容易に起こるためである。しかしながら、免疫能が減弱している被験体もまた上記症状の進行の研究において有用でありうる。
【００２９】
内視鏡検査、及び個々の組織の切除を用いることもできるが、蛍光光学的腫瘍画像化（ＦＯＴＩ）によって無傷の動物における病原体及び感染細胞の移動を可視化することが特に好都合である。これにより、特にモデル系において、抗感染薬及びプロトコール候補の評価においてリアルタイム観察及び感染の進行の連続的モニターが可能となる。従って、候補薬物又はプロトコールを投与していない対照と比較した場合に、候補薬物又はプロトコールを投与した試験動物において感染の阻止が直接観察されることは、その候補の効力及び治療としての可能性を示す。感染を治療しようとする被験体においては、ＦＯＴＩの利用によって、治療プロトコールを検討する者に対してプロトコールを変更するか又は変更しない当否（妥当性）について連続的に情報を与えることが可能となる。一実施形態においては、蛍光標識した細菌が腫瘍にターゲティングする可能性を解明するために、ＧＦＰ標識細菌をヌードマウスにおいて増殖しているルイス肺腫瘍に注射した。この腫瘍領域は高度に蛍光を発し、ＣＣＤカメラ及びＧＦＰフィルターを備えたライトボックスにおいて青色の励起により容易に可視化された。
【００３０】
モデルとしての使用に適切な脊椎動物被験体は、好ましくは哺乳動物被験体、最も好ましくウサギ、ラット、マウスなどの利用しやすい実験動物である。ヒト被験体により類似するものとして、霊長類も用い得る。任意の適切な脊椎動物被験体を用いることができ、その選択は、主に最終的な目的の系に対する利用しやすさ及び類似性により決定される。最終的には、脊椎動物被験体はヒトでありうる。
【００３１】
腫瘍ターゲティング細菌は、腫瘍選択的遺伝子治療のためのベクターとして腫瘍における選択的増殖に適合させうることが予想される。
【００３２】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
調製Ａ
病原体の改変
レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｍｕｌｌｅｒｉ）緑色蛍光タンパク質の変異体（ＲＭＶ−ＧＦＰ）（Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｘｕ，Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，非公表データ）を、ｌａｃプロモーターからＧＦＰを発現するｐＵＣ１９誘導体のｐＰＤ１６．３８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にクローニングした。このベクターをｐＲＭＶ−ＧＦＰと称する。ｐＲＭＶ−ＧＦＰを標準的な方法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にトランスフェクトし、形質転換細胞を寒天プレート上でのアンピシリン耐性により選択した。
【００３４】
高発現大腸菌−ＧＦＰクローンは蛍光顕微鏡で選択した。大腸菌もまたＲＦＰで標識し、さらにネズミチフス菌はＧＦＰ及びＲＦＰの両方で標識した。
【００３５】
実施例１
強制給餌によるマウスの感染
Ｎｕ／ｎｕ／ＣＤ−１マウスの４週令のメスマウスに、２０ゲージのバレル型チップ給餌針（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて０．５ｍｌの大腸菌−ＧＦＰ懸濁液（５×１０１０／ｍｌ）を強制給餌した。
【００３６】
強制給餌後、種々の時点において、マウスの画像化を実施した。この画像化は、青色光ファイバー光源（Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）により照明されるライトボックスにおいて行った。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ５８１０ ３−ｃｈｉｐ ｃｏｏｌｅｄ ｃｏｌｏｒ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を用いて記録した。１０２４×７２４ピクセルの画像を、ＩＢＭ ＰＣに直接記録するか又は高解像能ＳｏｎｙＶＣＲ ｍｏｄｅｌ ＳＬＶ−Ｒ１０００（Ｓｏｎｙ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でのビデオ出力により連続的に記録した。この画像は、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ３．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）を用いてコントラスト及び明度について処理し、解析した。
【００３７】
強制給餌によりマウスＧＩ管に導入された大腸菌−ＧＦＰは、そのほぼ直後に全身画像において胃部に可視化された（図１Ａ）。強制給餌後１０分以内に胃は空になり、続いて大腸菌−ＧＦＰは小腸において見られた（図１Ｂ〜Ｇ）。小腸における細菌集団は、強制給餌後４０分にピークに達して観察され（図１Ｅ）、１２０分で消失した（図１Ｇ）。１２０分後には大腸において大腸菌−ＧＦＰが観察された（図１Ｈ）。
【００３８】
強制給餌後の適当な時点において、腹腔を開腹し、大腸菌−ＧＦＰ蛍光の生体画像を作成した。胃（図２Ａ）、小腸（図２Ｂ）及び大腸（図２Ｃ）は、生体画像で観察されるように大腸菌−ＧＦＰにより明るい蛍光を発した。大腸菌−ＧＦＰによる複数回の強制給餌によって、胃、小腸及び大腸の同時摂取を行うことができ、これを全身（図３Ａ）及び生体手法（図３Ｂ）により画像化した。胃、小腸及び大腸における大腸菌−ＧＦＰの全身画像及び生体画像の比較によって、対応関係の程度が高いことが示された。
【００３９】
実施例２
大腸菌−ＧＦＰの直接腸感染
２０ゲージのバレル型チップ給餌針（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＴｏｏｌｓＩｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、マウス１匹当たり１．５ｍｌの大腸菌−ＧＦＰ（３×１０１０／ｍｌを含む）を浣腸で腸に投与した。これらのマウスはまた、実施例１の手法を用いて画像化に供した。結果を図４に示す。
【００４０】
実施例３
大腸菌−ＧＦＰの腹腔内感染及び抗生物質に対する応答
各グループのマウスには、１ｍｌ ２９Ｇ１ラテックス非含有シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて１０９〜１０１０の大腸菌−ＧＦＰを腹腔内（ｉｐ）注射した。蛍光細菌は、注射直後に外部全身画像化によって注射部位の周囲に位置することが観察された（図５Ａ、Ｃ）。その６時間後には、大腸菌−ＧＦＰは腹膜全体に広がって観察され（図５Ｂ）、これは動物の死亡と一致していた。６時間での開腹腔における大腸菌−ＧＦＰの生体画像（図６）は、外部全身画像化により観察されたものと同様の細菌分布を示した。
【００４１】
腹腔内経路で感染させた動物の別のグループは、接種後１００μｌ中の２ｍｇカナマイシンで処置した。感染マウスの対照グループには、抗生物質の代わりに１００μｌのＰＢＳを腹腔内（ｉｐ）注射した。処置マウスの全身画像化によって、次の６時間において細菌集団の顕著な低減が示された（図５Ｃ及びＤ）。
【００４２】
実施例４
全身画像化を用いた脳癌のターゲティング
１×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含有するＰＢＳ溶液（１０μｌ）を、蛍光を頼りにした注射を利用して（図７Ｂ）ヌードマウスにおけるＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマに注射した（図７Ａ）。ＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおけるＧＦＰ標識チフス菌を、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図７Ｃ）。ＲＦＰ標識Ｕ−８７ヒトグリオーマにおいて増殖するＧＦＰ標識チフス菌は、注射後１日目において、腫瘍周囲におけるＧＦＰ標識チフス菌の局在化、並びに腫瘍サイズの低減を示した（図７Ｄ）。
【００４３】
実施例５
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
ＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍を有する第１のヌードマウス（図８Ａ）において、１×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌をＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射し、注射直後に全身画像化を用いて画像化した（図８Ｂ）。腫瘍の周囲にＧＦＰ標識チフス菌の局在化が観察された（図８Ｂ）。蛍光を頼りにした注射の１つの利点は、毒性のサルモネラ菌を用いることができ、またあらゆるサイズの腫瘍をターゲティング可能なことである。
【００４４】
ＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍を有する第２のヌードマウス（図８Ｃ）においては、２×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をＲＦＰ標識ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍に注射し、注射直後に全身画像化を用いて画像化した。腫瘍の周囲におけるＧＦＰ標識ネズミチフス菌の局在化が観察された（図８Ｄ）。
【００４５】
実施例６
全身画像化を用いた乳癌のターゲティング
２×１０８のＧＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液を、ヌードマウスにおいて増殖しているＲＦＰ標識ＭＤＡ ＭＢ−４３５ヒト乳癌（図９Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化したところ、腫瘍の周囲における局在化（図９Ｂ）と腫瘍サイズの明らかな低減が示された。このことは腫瘍の壊死を示している。
【００４６】
実施例７
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
３×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１０Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１０Ｂ）。ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍におけるＲＦＰ標識ネズミチフス菌の増殖は、注射後１日目に観察され（図１０Ｃ）、これは腫瘍の周囲におけるＲＦＰ標識チフス菌の増殖と腫瘍サイズの低減を示している。
【００４７】
実施例８
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
２×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１１Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１１Ｂ）。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後１日目にＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖として検出され（図１１Ｃ）、これは注射後４日目における腫瘍の増殖が継続したことを示したが、腫瘍サイズの低減が示される。
【００４８】
実施例９
全身画像化を用いた前立腺腫瘍のターゲティング
２×１０８のＲＦＰ標識ネズミチフス菌を含む溶液をヌードマウスにおいて増殖しているＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１２Ａ）に注射し、注射直後に実施例１と同様の手法を用いて画像化した（図１２Ｂ）。ＲＦＰ標識チフス菌は注射後１日目（図１２Ｃ）及び注射後４日目（図１２Ｄ）にＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖として検出され、これは目に見える腫瘍サイズの低減を示している。
【００４９】
注射後４日目に、ＧＦＰ標識ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍において増殖するＲＦＰ標識チフス菌に対して組織学的試験を行った（図１２Ｄ）。この試験は、１０％緩衝化ホルマリンで腫瘍組織を固定し、パラフィン切片処理を行い、標準的な方法でＨＥ染色することにより行った。ＲＦＰ標識チフス菌（図１３において白い矢印で示す小さな青色スポット、倍率４００×）は、ＰＣ−３腫瘍組織において徐々に増殖し、腫瘍細胞にターゲティングした。
【００５０】
組織学的試験（ＨＥ染色、倍率２００×）を用いて、ヌードマウスにおいて増殖しているＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍構造を維持する未処置対照（図１４Ａ）と、ＲＦＰ標識チフス菌で処置したヌードマウスにおいて増殖している注射後４日目のＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍（図１４Ｂ）との比較を行った。腫瘍組織の大部分は破壊されており、腫瘍には広範囲の壊死（図１４Ｂ中の矢印）が示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存非ヒト脊椎動物被験体における感染の進行をモニターする方法であって、
蛍光タンパク質を発現する病原体で処置された前記脊椎動物被験体において、種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察することを含む、上記方法。
【請求項２】
感染を阻止するための候補プロトコール又は薬剤を評価する方法であって、
蛍光タンパク質を発現する病原体で処置された非ヒト脊椎動物被験体に対し前記プロトコール又は薬剤を投与し、前記処置被験体において種々の位置で蛍光の存在、不在又は強度を観察することによって感染の進行を経時的にモニターし、
蛍光タンパク質を発現する病原体で同様に処置された対照非ヒト被験体において感染の進行を経時的にモニターし、
前記処置被験体における感染の進行と、前記対照被験体における感染の進行とを比較する、
ことを含み、前記対照被験体と比較した前記処置被験体における感染の進行の減少は、前記プロトコール又は薬剤が感染の阻止に有効であると同定するものである、上記方法。
【請求項３】
感染と関連した遺伝子を同定する方法であって、改変型ゲノムを有する病原体に感染させた生存非ヒト被験体における蛍光の存在、不在又は強度を、時間及び該被験体における位置の関数として観察することを含み、該ゲノムの改変が、決定しようとする機能を有するヌクレオチド配列の、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列による置換を含む、上記方法。
【請求項４】
生存非ヒト脊椎動物被験体における治療用病原体を用いた腫瘍ターゲティング方法であって、
腫瘍細胞を含む前記脊椎動物被験体に対し、蛍光タンパク質を発現する病原体を投与し、
前記被験体における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察する、
ことを含み、前記腫瘍の周囲における蛍光の存在は、腫瘍にターゲティングする病原体であることを示す、上記方法。
【請求項１】
生存非ヒト脊椎動物被験体における感染の進行をモニターする方法であって、
蛍光タンパク質を発現する病原体で処置された前記脊椎動物被験体において、種々の位置における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察することを含む、上記方法。
【請求項２】
感染を阻止するための候補プロトコール又は薬剤を評価する方法であって、
蛍光タンパク質を発現する病原体で処置された非ヒト脊椎動物被験体に対し前記プロトコール又は薬剤を投与し、前記処置被験体において種々の位置で蛍光の存在、不在又は強度を観察することによって感染の進行を経時的にモニターし、
蛍光タンパク質を発現する病原体で同様に処置された対照非ヒト被験体において感染の進行を経時的にモニターし、
前記処置被験体における感染の進行と、前記対照被験体における感染の進行とを比較する、
ことを含み、前記対照被験体と比較した前記処置被験体における感染の進行の減少は、前記プロトコール又は薬剤が感染の阻止に有効であると同定するものである、上記方法。
【請求項３】
感染と関連した遺伝子を同定する方法であって、改変型ゲノムを有する病原体に感染させた生存非ヒト被験体における蛍光の存在、不在又は強度を、時間及び該被験体における位置の関数として観察することを含み、該ゲノムの改変が、決定しようとする機能を有するヌクレオチド配列の、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列による置換を含む、上記方法。
【請求項４】
生存非ヒト脊椎動物被験体における治療用病原体を用いた腫瘍ターゲティング方法であって、
腫瘍細胞を含む前記脊椎動物被験体に対し、蛍光タンパク質を発現する病原体を投与し、
前記被験体における蛍光の存在、不在又は強度を時間の関数として観察する、
ことを含み、前記腫瘍の周囲における蛍光の存在は、腫瘍にターゲティングする病原体であることを示す、上記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１７７０６（Ｐ２０１１−１７７０６Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６５４８０（Ｐ２０１０−１６５４８０）
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【分割の表示】特願２００３−５１１８７４（Ｐ２００３−５１１８７４）の分割
【原出願日】平成１４年７月９日（２００２．７．９）
【出願人】（５０２３２６７７２）アンチキャンサー インコーポレーテッド (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２３日（２０１０．７．２３）
【分割の表示】特願２００３−５１１８７４（Ｐ２００３−５１１８７４）の分割
【原出願日】平成１４年７月９日（２００２．７．９）
【出願人】（５０２３２６７７２）アンチキャンサー インコーポレーテッド (23)
【Ｆターム（参考）】
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