融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションを使用するファージディスプレイ
本発明は、ファージ粒子上にディスプレイされた関心のあるポリペプチドを、シグナル認識粒子経路に基づいてグラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションさせる、繊維状ファージディスプレイ方法に関する。この方法は、ファージ上にディスプレイするのが困難であることが知られているポリペプチド、および、特に非常に速く折りたたまれそして安定なタンパク質スカホールドに由来する場合の、ｃＤＮＡライブラリー及び他のコンビナトリアルライブラリーのタンパク質のために特に適当である。本発明は、更に、ファージ粒子上にディスプレイされるべきポリペプチドおよび翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含む、前記方法において有用なファージまたはファージミドベクターに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なファージディスプレイ法、それに使用されるファージまたはファージミドベクターおよびそのようにして得られたファージ粒子に関する。
【０００２】
発明の背景
バクテリオファージ上のポリペプチドのディスプレイ（ファージディスプレイ）は、大集団の変異体から所望の性質を有するポリペプチドを取り出すことを可能とする選択技術である（Russel,M., Lowman,H.B., and Clackson, T., Introduction to phage biology and phage display, in"Phage Display",Clackson, T. and Lowman, H.B., eds., Oxford University Press, 2004, pp.1-26）。ファージディスプレイは、コンビナトリアル抗体またはペプチドライブラリーからの選択のために集中的に研究された。
【０００３】
ファージディスプレイに使用される明らかに最も広く使用されたバクテリオファージは、繊維状ファージである。繊維状ファージは、多くのグラム陰性菌に感染するバクテリアウイルスの大きなファミリーを構成する。最も良く知られている繊維状ファージは、Escherichia coliに感染する繊維状ファージであり；これらはｆ１／Ｍ１３／ｆｄおよびＩＫｅである。ファージｆ１、Ｍ１３およびｆｄは、これまで繊維状ファージディスプレイのために使用されてきた繊維状ファージである。それらのゲノムは９８％より高く同一でありそしてそれらの遺伝子産物は相互に交換可能である。
【０００４】
繊維状ファージアセンブリーの独特の局面は、多くの他のバクテリオファージのアセンブリーと対照的に、それが分泌プロセスであるということである。成長しているファージへのコートポリペプチドの組み込みは、細胞膜において起り、そして新生ファージは、それらがアセンブルされるにつれて細胞から押し出される（Russel et al., loc.cit.）。E.coli細胞はこのプロセスにおいては溶解しない。５つのウイルスコートタンパク質（ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐＩＸ）は、それらがファージ粒子に組み込まれる前に細胞膜に挿入される（図１）。例えば、ｐＩＩＩの主要部は、膜を横切ってペリプラズムにトランスロケーションされ、一方そのＣ末端疎水性テイルはタンパク質を膜内にアンカーする。
【０００５】
繊維状ファージディスプレイのための１つの前提条件は、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）の細胞膜を横切るトランスロケーションである。これは、ファージコートタンパク質にＰＯＩを遺伝子的に融合することおよび対応する融合ポリペプチドのトランスロケーションにより普通は達成される。または、ＰＯＩおよびファージコートタンパク質は独立にトランスロケーションされる。この状況において、ＰＯＩは、例えば対応するファージコートタンパク質とのジスルフイド結合の形成（Ｃｙｓディスプレイ）またはロイシンジッパーの形成（ｐＪｕＦｏシステム）により、ペリプラズムにおいてファージ粒子に安定に連結される。ｐＩＩＩへの融合を使用する慣用の繊維状ファージディスプレイにおいては、ＰＯＩを含む融合ポリペプチドのトランスロケーションのためにＳｅｃ経路が使用される。この経路では、ポリペプチドは、リボソームで最初に合成され、次いでその折りたたまれていない状態で、Ｓｅｃトランスロコンにより翻訳後にトランスロケーションされる（図２、（３）−（４）−（５））。即ち、細胞膜を横切るトランスロケーションは、実質的量のポリペプチド鎖が合成された後にのみ始まる。しかしながら、ファージディスプレイの成功に対するトランスロケーションの機構の寄与は、完全には解明されておらず、そして翻訳と同時のトランスロケーション経路（cotranslational translocation pathway）を使用する可能性は、先行技術では探求されていない。
【０００６】
広い範囲のサイズおよび構造の細胞内および細胞外タンパク質が、繊維状ファージ上に機能的にディスプレイされた（Russel et al., loc. cit.）。それにもかかわらず、あるポリペプチドは、大抵は未知の理由で、個々の性質によりディスプレイに対して抵抗性である。これは、ある種のタンパク質のディスプレイの成功を予測不可能とする。従って、使用されるべき各タンパク質について繊維状ファージ上のディスプレイの効率を最初に試験することが通常推奨されてきた。さらに、ファージディスプレイのためのコンビナトリアルライブラリーが創生されるとき、すべてのクローンが同様な効率でディスプレイされるわけではなく；これはｃＤＮＡから生成されたライブラリーについて特に当てはまる。ポリペプチドのディスプレイ問題は、ファージ産生のそれらの妨害、それらのペリプラズム凝集、それらのプロテオリシス、E.coliに対するそれらの毒性または使用されたトランスロケーション経路とのそれらの不適合性の結果でありうる。特に、トランスロケーションに先立つ工程は、ファージ粒子への融合ポリペプチドの組み込みに影響を与える重要な因子である。ポリペプチドが未熟に折りたたまれるならば、それらはトランスロケーションに対して抵抗性でありうるかまたは細胞質毒性を示すことすらありうる。従って、タンパク質が翻訳後にトランスロケーションされるか（未熟な折りたたみを潜在的に可能とする）または翻訳と同時にトランスロケーションされる（細胞質折りたたみを許容しない）かどうかは重要である。最近の繊維状ファージディスプレイ法は細胞膜を横切る融合ポリペプチドのトランスロケーショのために翻訳後経路を使用する（Russel et al., loc. cit.; Paschke, M. and Hoehne, W., Gene 350, 79-88, 2005）。従って、これらの経路と非適合性のポリペプチドはディスプレイに対して抵抗性であり、ファージディスプレイ選択を非常に非効率的にするかまたは不可能とさえする。例えば、ファージディスプレイにおいて殆ど独占的に使用される翻訳後Ｓｅｃ経路は、細胞質において折りたたまれていない状態のままにあることができないタンパク質をトランスロケーションすることが本質的にできない。何故ならばＳｅｃトランスロケーション自体は折りたたまれていないポリペプチドのみ輸送することができるからである（Huber, D., Boyd, D., Xia, Y., Olma, M.H., Gerstein, M., and Beckwith., J., J.Bacteriol. 187, 2983-2991, 2005; Paschke et al., loc. cit.）。
【０００７】
従って、本発明の基礎をなす技術的問題は、翻訳後トランスロケーションを使用することにより非効率的にディスプレイされる繊維状ファージ上のこれらのポリペプチドの効率的なディスプレイのための新規なトランスロケーションアプローチを確認することである。この技術的問題にたいする解決は特許請求の範囲に特徴付けられた態様を提供することにより達成される。
【０００８】
発明の要約
本発明は、ファージ粒子上にディスプレイされた関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）が、特にシグナル認識粒子経路に基づいて、グラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションされる、繊維状ファージディスプレイ法に関する。
【０００９】
従って、本発明は、ＰＯＩを含む融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションによるファージディスプレイを可能とする。この方法は、ファージ上にディスプレイすることが困難であることが知られているポリペプチドのために、および特に非常に速く折りたたまれる安定なタンパク質スカホールドに由来する場合のｃＤＮＡライブラリーおよび他のコンビナトリアルライブラリーのタンパク質のために特に適当である。
【００１０】
本発明はさらに、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩおよびシグナル認識粒子経路に基づく翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクター、ならびに本発明の方法により得られたファージに関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の状況では、用語「繊維状ファージディスプレイ」は、繊維状ファージに基づいたファージディスプレイを指す。繊維状ファージは、多くのグラム陰性菌に感染するバクテリアウイルスの大きなファミリーを構成する。好ましい繊維状ファージは、E.coliに感染する繊維状ファージ、特にｆ１／Ｍ１３／ｆｄおよびＩＫｅである。繊維状ファージディスプレイを実施するための方法は、当業者に周知である（例えば、Russel et al., loc.cit.）。
【００１２】
本発明の状況では、用語「シグナル配列」は、トランスロカーゼへのポリペプチドのターゲティングをもたらすポリペプチドのアミノ酸のＮ末端ストレッチを指す。E.coliでは、Ｎ末端シグナル配列は、一般に１５〜５２アミノ酸を含む。大部分のシグナル配列は、正に帯電したＮ末端領域（ｎ領域）、非極性疎水性コア（ｈ領域）およびより極性のＣ末端領域（ｃ領域）を含有する。ｃ領域は、シグナルペプチダーゼのための開裂部位を含有する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーション反応期間中ポリペプチドからシグナル配列を除去する膜結合プロテアーゼである。１８〜３０アミノ酸を含むこのようなシグナル配列は好ましい。シグナル配列の決定は、当業者に周知である。例えば、それらは、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔもしくはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースからまたはアノテーションされたゲノムワイドなデータセットを使用して得られうる。
【００１３】
本発明の状況では、用語「プレプロテイン」は、Ｎ末端シグナル配列を含むポリペプチドを指す。シグナル配列は、トランスロケーション反応期間中プレプロテインから開裂されて、成熟タンパク質を生成する。
【００１４】
本発明の状況では、用語「融合ポリペプチド」は、Ｎ末端シグナル配列、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）および繊維状ファージ上のディスプレイを可能とする追加のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。好ましくは、この追加の配列は、繊維状ファージコートポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。または、この配列は、安定な連結の形成により、例えば対応するファージコートタンパク質とのジスルフィド結合の形成（Ｃｙｓディスプレイ）またはロイシンジッパーの形成（ｐＪｕＦｏシステム）によりペリプラズムにおいてファージ粒子にＰＯＩを連結する。この別のストラテジーでは、ＰＯＩおよび対応するファージコートタンパク質は、細胞膜を横切って独立にトランスロケーションされる。
【００１５】
本発明の状況では、用語「トランスロケーション」は、トランスロコンにより媒介される生物学的膜を横切るポリペプチドのトランスロケーションを指す（Holland, I.B. et al., Biochim. Biophys. Acta 1694, 5-16,2004）。トランスロケーションは、翻訳後または翻訳と同時に起る。従って、トランスロカーゼは、トランスロコンを通じてポリペプチドを特異的に輸送する酵素または酵素複合体である（Holland et al., loc. cit.）。
【００１６】
本発明の状況では、用語「Ｓｅｃ経路」は、Ｓｅｃトランスロコンを通じてのグラム陰性菌の細胞膜を横切るプレプロテインの翻訳後のトランスロケーションのためのタンパク質輸送機構を指す（Holland et al., loc.cit.）。Ｓｅｃ経路は、トランスロケーションの前にプレプロテインを折りたたまれていない状態に保つ分子シャペロン、たいていＳｅｃＢにより媒介される。Ｓｅｃ経路は、グラム陰性菌におけるタンパク質トランスロケーションの主要な経路である。
【００１７】
本発明の状況では、用語「ＳＲＰ経路」は、Ｓｅｃトランスロコンを通じてのグラム陰性菌の細胞膜を横切るプレプロテインの翻訳と同時のトランスロケーションのためのタンパク質輸送機構を指す（Schierle, C. F., Berkmen, M., Huber, D., Kumamoto, C., Boyd, D., and Beckwith, J., J.Bacteriol.185,5706-5713,2003; Huber et al., loc. cit.）。ＳＲＰ経路は、５４kDaタンパク質ホモログ（５４ホモログ；Ｆｆｈ）および４．５Ｓ ＲＮＡからなるリボヌクレオタンパク質であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により媒介される。ＳＲＰ経路では、シグナル配列は、それがリボソームから現れるやいなやＳＲＰと相互作用する。次いでＳＲＰ、新生ポリペプチドおよびリボソームからなる複合体は、ＳＲＰレセプターを介してＳｅｃトランスロコンに移送され、そこでポリペプチドはＳｅｃトランスロコンを通じて翻訳と同時にトランスロケーションされる。
【００１８】
ＳｅｃおよびＳＲＰ経路は、膜を通じて折りたたまれていない状態においてタンパク質を輸送するＳｅｃトランスロカーゼに収束する。プレプロテインのトランスロケーションのためにＳｅｃ経路よりもＳＲＰ経路へのプレプロテインのターゲティングを強く選ぶのは、シグナル配列のアミノ酸組成である。（Huber et al., loc. cit.）。
【００１９】
本発明の状況では、用語「ＤｓｂＡ」は、ペリプラズムE.coliチオール：ジスルフィド相互交換タンパク質ＤｓｂＡを指す（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ２４９９１）。ＤｓｂＡは、ＳＲＰ経路の基質である（Huber et al., loc.cit.）。ＤｓｂＡは、翻訳と同時にエキスポートされて、そのエキスポートを抑制する細胞質におけるその折りたたみを回避する。
【００２０】
本発明の状況では、用語「ＴｒｘＡ」は、E.coliタンパク質チオレドキシン１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ００２７４）を指す。ＴｒｘＡは、プレプロテインをＳＲＰ経路またはＳｅｃ経路にターゲティングするシグナル配列を区別するためのレポータータンパク質として使用され得る（Schierle et al., loc. cit.; Huber et al., loc.cit.）。
【００２１】
本発明の状況では、用語「Ｔａｔ経路」は、ツインアルギニンタンパク質トランスロケーション（Ｔａｔ）経路を指す（Paschke et al., loc. cit.）。Ｔａｔ経路は、Ｓｅｃ経路およびＳＲＰ経路とは基本的に異なる。Ｓｅｃトランスロコンと対照的に、Ｔａｔトランスロコンは、完全に折りたたまれたタンパク質のみをエキスポートする。ＳＲＰ経路とは対照的に、Ｔａｔトランスロコンは、膜を通じて翻訳後にタンパク質を通す。
【００２２】
１つの特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列である。
【００２３】
関心のあるシグナル配列が、グラム陰性菌の細胞膜を横切る翻訳と同時のトランスロケーションを促進するかどうかを試験するための方法は、当業者に周知である。例えば、関心のあるシグナル配列は、成熟ＭａｌＥ （Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ０２９２８、残基２７〜３９６） に遺伝子的に融合される。次いでこの人工的プレプロテインは、E.coliにおいて発現されそしてその新生鎖の翻訳と同時のタンパク質分解プロセッシングの収率は、記載されたとおりの二次元ゲル電気泳動により分析される（Josefsson, L-G. and Randall, L.L., Methods Enzymol. 97, 77-85, 1983; Schierle et al., loc. cit.）。プレプロテイン鎖がまだ新生である間に関心のあるＮ末端シグナル配列を除去することは、ポリペプチドの合成が完了する前にトランスロケーションが開始され、従ってトランスロケーションが翻訳と同時であることを示す。好ましいシグナル配列は、成熟ＭａｌＥに融合されるとき、８０％を超える、更に好ましくは９０％を越える翻訳と同時のトランスロケーションの収率を促進するシグナル配列である。最も好ましいシグナル配列は、成熟ＭａｌＥに融合されるとき、翻訳と同時のトランスロケーションのみを促進しそして翻訳後のトランスロケーションを促進しないシグナル配列である。または、ＤｓｂＡからのシグナル配列などの、翻訳と同時のトランスロケーションを促進することが既に知られているシグナル配列を使用することができる。
【００２４】
他の特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、シグナル認識経路をターゲティングするシグナル配列である。
【００２５】
グラム陰性菌のシグナル認識経路および関心のあるシグナル配列がプレプロテインをＳＲＰ経路にターゲティングするかどうかを試験するための方法は、当業者に周知である。例えば、ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列に融合されたＴｒｘＡのトランスロケーションは、ＳＲＰの成分をコードする、遺伝子ｆｆｈに突然変異を有するE.coli（例えば、ｆｆｈ７７またはｆｆｈ８７突然変異体株）において強く阻害される（Schierle et al., loc．cit.; Huber et al., loc. cit.）。従ってＳＲＰ経路をターゲティングするこれらのシグナル配列は、野生型E.coliにおける細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するが、ｆｆｈ突然変異体株においては非常に効率悪く促進する。かくして、シグナル配列は、２つの異なるクラス：ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列およびＳＲＰ経路をターゲティングしないシグナル配列、に分けることができる。Ｓｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列は、シグナル配列の全体の疎水性を増加させることにより、特にそのｈ領域の疎水性を増加させることによりＳＲＰ経路に再指向させることができる。例えば、ｈ領域における極性のまたは小さな（ＧｌｙまたはＡｌａ）アミノ酸を大きな疎水性残基で置換することにより単にその疎水性を増加させるＭａｌＥシグナル配列の適度の変更は、タンパク質をＳｅｃからＳＲＰ経路に経路変更する（reroute）。または、ＳＲＰ経路をターゲティングすることが既に知られているシグナル配列、例えば、ＤｓｂＡからのシグナル配列を使用することができる。ＳＲＰ経路を使用するシグナル配列の他の例は、オートトランスポーター（autotransporters）のサブセットのシグナル配列、例えばヘモグロビンプロテアーゼ（Ｈｂｐ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ アクセッションナンバー Ｏ８８０９３）のそれである。異常なことに、Ｈｂｐシグナル配列は相対的に長く（５２アミノ酸）そして古典的シグナル配列に先行するＮ末端延長部を含有する。さらに、Ｈｂｐシグナル配列のｈ領域は、特に疎水性ではない。ＳｅｃＭのシグナル配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバーＰ６２３９５）は、Ｎ末端延長部およびＳＲＰ経路をターゲティングすることが知られている適度に疎水性のｈ領域を含む長いシグナル配列の他の例である。
【００２６】
更に他の特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、グラム陰性菌の細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するシグナル配列である。
【００２７】
多くの良く使用されるシグナル配列、例えば、ＰｈｏＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ００６３４）およびＭａｌＥ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ０２９２８）のシグナル配列は、細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを非効率的にのみ促進する（Schierle et al., loc. cit.）。対照的に、ＤｓｂＡからのシグナル配列は、ＴｒｘＡの効率的なトランスロケーションを促進する。関心のあるシグナル配列に融合されたＴｒｘＡを発現するホスト細胞の細胞内分画（subcellular fractionation）は、ペリプラズムへの細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進することができるこれらのシグナル配列を、促進できないシグナル配列から区別することを可能とする（Huber et al., loc. cit.）。ペリプラズム画分におけるＴｒｘＡの量は、ＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するシグナル配列の効率を説明する。または、ＴｒｘＡのトランスロケーションを促進することが既に知られているシグナル配列、例えばＤｓｂＡからのシグナル配列を使用することができる。
【００２８】
好ましい態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡからなる群より選ばれるシグナル配列およびそのホモログである。
【００２９】
特に好ましい態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡからなる群より選ばれるシグナル配列である。
【００３０】
本発明の状況では、用語シグナル配列の「ホモログ」は、それぞれ、シグナル配列のｎ領域、ｈ領域およびｃ領域の全体の電荷、疎水性および開裂特性を保存しながら、前記したシグナル配列のいずれかとの７０％以上、好ましくは８０％以上、特に９０％以上のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を意味する。このようなホモログの例は、１つ、２つ、３つまたは４つ、特に１つまたは２つのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸が欠失しているか、または１つまたは２つのアミノ酸が付加されているアミノ酸配列または、前記した置換、欠失および付加の組み合わせである。アミノ酸の置換においては、非極性アミノ酸が、好ましくは、他の非極性アミノ酸により置換され、例えば、ＩｌｅがＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＭｅｔにより置換されるか、またはその逆もあり、極性アミノ酸が他の極性アミノ酸により置換され、例えばＴｈｒがＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎにより置換されるかまたはその逆もあり、負に帯電したアミノ酸が他の負に帯電したアミノ酸により置換され、例えばＡｓｐがＧｌｕにより置換されるかまたはその逆もあり、または正に帯電したアミノ酸が他の正に帯電したアミノ酸により置換され、例えばＬｙｓがＡｒｇまたはＨｉｓにより置換されるかまたはその逆もある。
【００３１】
例えば、アミノ酸配列、
【表１】
を有するＤｓｂＡの好ましいシグナル配列では、アミノ酸Ｌｙｓ２のＡｒｇによる置換、Ａｌａ９のＬｅｕによる置換、Ａｌａ１４のＶａｌによる置換およびＳｅｒ１６のＴｈｒによる置換が可能である。
【００３２】
ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列は、ＳＲＰ経路をターゲティングすることによりＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進することが知られており、そして大部分の場合に、Ｓｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列に比べてより高い全体の疎水性を有することが知られている（Huber et al., loc. cit.）。前記タンパク質は、下記のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー：ＴｏｒＴ Ｐ３８６８３、ＳｆｍＣ Ｐ７７２４９、ＦｏｃＣ Ｐ６２６０９、ＣｃｍＨ Ｐ３３９２５、ＹｒａＩ Ｐ４２９１４、ＴｏｌＢ Ｐ０Ａ８５５、ＮｉｋＡ Ｐ３３５９０、ＦｌｇＩ Ｐ０Ａ６Ｓ３およびＤｓｂＡ Ｐ２４９９１を有する。
【００３３】
疎水性の計算だけでは、高い疎水性範囲においてを）ＳＲＰ依存性シグナル配列およびＳＲＰ非依存性シグナル配列を区別することを可能としない（Huber et al., loc. cit. ）。従って疎水性以外の特徴（例えば、シグナルペプチドの構造）は、１つのトランスロケーション経路に対する優先に影響を与える。
【００３４】
特に好ましい態様では、シグナル配列は、ＤｓｂＡシグナル配列またはＤｓｂＡシグナル配列と９０％一致を有する任意のアミノ酸配列である。
【００３５】
この方法は、例えばファージｆ１、Ｍ１３、ｆｄ等、特にｆ１、Ｍ１３およびｆｄによる、繊維状ファージディスプレイ法のいずれかに適用可能である。
【００３６】
特に、本発明の方法は、
（ａ）グラム陰性菌の細胞膜を横切る融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する繊維状ファージもしくはファージミドベクターを構築する工程；
（ｂ）関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーを工程（ａ）のベクターの発現カセットにクローニングすることによりファージまたはファージミドベクターのコンビナトリアルライブラリーを構築する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のベクターのライブラリーにより適当なグラム陰性菌をトランスフォーメーションする工程；および
（ｄ）ファージディスプレイ選択サイクルを行って、ディスプレイされた関心のあるタンパク質の性質に基づいてファージ粒子を分離する工程、
を含む。
【００３７】
工程（ａ）では、繊維状ファージまたはファージミドベクターは、遺伝子技術の標準方法を使用して構築される。例えば、確立されたファージまたはファージミドベクターの融合ポリペプチドのための発現カセットのシグナル配列コード部分は、標準ＤＮＡ技術を使用して該シグナル配列のコード配列により置換される。または、該シグナル配列を含有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する新規なファージまたはファージミドベクターは、このようなベクターの組成に関する一般的知識（例えば、Russel et al., loc. cit）および標準ＤＮＡ合成およびアセンブリー方法を使用して新規に構築される。その目的に有用なファージまたはファージミドベクターは、例えば、ｐＡＫ１００、ｐＣｏｍｂ３、ｐＥＸｍｉｄｅ３、ｐＨＥＮ１、ｐＪｕＦｏまたはｐＳＥＸである。このようなファージミドベクターの例（ｐＤＳＴ２３）は、この特定の態様に本発明を限定することなく本発明を説明するものとして、図３および付随する実施例に記載されている。
【００３８】
好ましくは、工程（ａ）における融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＳＲＰ経路を通じての融合ポリペプチドのトランスロケーションを促進する。
【００３９】
更に好ましくは、工程（ａ）における融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進する。
【００４０】
工程（ｂ）において、ベクターのコンビナトリアルライブラリーの調製のための標準方法が使用される。例えば、関心のあるタンパク質をコードするコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡシャフリングにより、細胞ｍＲＮＡの増幅によるｃＤＮＡの調製によりまたはコンセンサスデザインにより生成され、次いで標準ＤＮＡ技術により該ベクターの発現カセットにライゲーションされる。
【００４１】
工程（ｃ）において、グラム陰性菌のトランスロケーションのための標準方法が使用される。例えば、バクテリアは、エレクトロポレーションもしくは化学的手段により工程（ｂ）のベクターのコンビナトリアルライブラリーによりトランスフォーメーションされる。このような方法は当業者に周知である。
【００４２】
工程（ｄ）において、標準ファージディスプレイ選択サイクルが行われる。このようなファージディスプレイ選択サイクルは当業者に周知である（例えば、Russel et al., loc.cit.）。
【００４３】
好ましくは、工程（ｄ）のディスプレイされた関心のあるポリペプチドの性質は、関心のあるターゲット分子への特異的結合である。この場合に、ターゲット分子へのＰＯＩ結合をディスプレイするファージ粒子は、各選択サイクルにおいて増幅されたファージ粒子を表面に機能的に固定化されたターゲット分子に適用し、結合しなかったファージ粒子を洗い落とし、結合したファージ粒子を溶離し、そして溶離したファージ粒子を次の選択サイクルのファージ粒子の増幅のためのインプットとして使用することにより、無関係なポリペプチドをディスプレイするファージ粒子から分離される。
【００４４】
本発明の状況において、「シグナル配列」と記載されている場合には、このような表現は、「１つ以上」の、例えば１つ、２つ、３つもしくは４つの異なる組成のシグナル配列も意味することは理解される。１つより多くのシグナル配列を使用することは、特定の用途に有利であり得、そしてやはり本発明の範囲内にある。
【００４５】
本発明は、更に、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列、特にＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡからのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列、好ましくはＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡから選ばれるシグナル配列、に融合されたＰＯＩを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクターに関する。最も好ましいのは、シグナル配列ＤｓｂＡまたはそのホモログを含むファージまたはファージミドベクターである。
【００４６】
好ましくは、融合ポリペプチドは、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩに、またはコートタンパク質ｐＩＩＩのフラグメントに融合されたＰＯＩを含む。このようなフラグメントは、例えば、ｐＩＩＩのアミノ酸２５０〜４０６を含むフラグメントである。
【００４７】
ペリプラズム酵素ＤｓｂＡのシグナル配列は、融合したレポータータンパク質をＳＲＰ経路に指向させ、従ってそれらの翻訳と同時のエキスポートを増強させる。これは、相対的に疎水性のＤｓｂＡシグナルペプチドがＳＲＰと相互作用しそしてＤｓｂＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進することを示す。従って、ＤｓｂＡのシグナル配列は、実施例で下記に示されるとおり、他のタンパク質のための一般的シグナル配列として使用することもできる。
【００４８】
同様に、ＤｓｂＡのシグナル配列のホモログおよびＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡおよびＦｌｇＩのシグナル配列およびそのホモログを使用することができる。
【００４９】
本発明の方法は、化合物のライブラリー、例えばＤＮＡライブラリー、特にｃＤＮＡライブラリーを伴う用途に特に適当である。ファージディスプレイにおいてこれまでに使用された方法と対照的に、本発明の方法は、このようなライブラリーの発現により得られたポリペプチドの信頼性のある提示を可能とする。
【００５０】
本発明の特定の態様は、ＤＮＡライブラリーによりコードされたＰＯＩがファージ粒子上にディスプレイされる前記した繊維状ファージディスプレイ法である。好ましくは、ＤＮＡライブラリーによりコードされたＰＯＩのための翻訳と同時のトランスロケーションは、シグナル認識粒子経路に基づいて、例えばＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列に基づいて達成される。最も好ましいのは、リピートタンパク質のファージディスプレイについて本明細書で説明したとおりの方法である。
【００５１】
任意の選択技術の場合と同じく、ファージディスプレイ選択の成功は、ディスプレイされたライブラリーメンバーの多様性に強く依存する。大きなコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ライブラリーメンバーの大きな多様性がディスプレイされうることをそれ自体は保証しない。ファージディスプレイにおいて、ディスプレイされるべきポリペプチドは、それらのファージ粒子への組み込みの前に細胞膜を横切ってトランスロケーションされなければならない。最近の繊維状ファージディスプレイ法は、すべて、細胞膜を横切る融合ポリペプチドのトランスロケーションのための翻訳後の経路を使用する（Russel et al., loc. cit.; Paschke et al., loc. cit.）。従ってこれらの経路と非適合性のライブラリーメンバーは、ディスプレイに対して抵抗性であろうし、従って、ディスプレイされたライブラリー多様性を明らかに減少する。
【００５２】
考慮されるＤＮＡライブラリーは、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡシャフリングによりまたはコンセンサスデザインにより産生されたＤＮＡライブラリーを含むすべての可能なコンビナトリアルライブラリーである。このような方法は、新規な性質、例えば結合特性を有するライブラリーメンバーを生じるであろう；それらのいくらかはＳｅｃ経路を使用するトランスロケーションと非適合性であろう。このようなライブラリーは、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリーまたはオルタナティブスカホールド（alternative scaffold）に基づいたライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーを含む（Russel et al., loc. cit.; Nygren, P.A. and Skerra, A., J. Immunol. Methods, 290, 3-28, 2004）。
【００５３】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、特に真核生物起源のｃＤＮＡライブラリーである。ｃＤＮＡライブラリーは、細胞質タンパク質、膜タンパク質および細胞外タンパク質を含む非常に多様な天然に存在する細胞タンパク質をコードする。これらの天然に存在するライブラリーメンバーのいくらかは、Ｓｅｃ経路を使用するトランスロケーションと非適合性であろう。
【００５４】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、細胞内で活性なｓｃＦｖフラグメント（イントラボディ）を選択するのに使用される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーである。イントラボディのための前提要件は、それらが良く折りたたまれそしてE.coliの細胞質中で安定であると言うことである。かくして、細胞質で安定な且つ良く折りたたまれたイントラボディは、Ｓｅｃ経路の翻訳後の機構により非効率的にトランスロケーションされる。
【００５５】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、アンキリンリピートタンパク質、ロイシンリッチリピートタンパク質、テトラトリコペプチドリピートタンパク質、ペンタトリコペプチドリピートタンパク質またはアルマジロ／ＨＥＡＴリピートタンパク質を含む、リピートタンパク質に基づくオルタナティブスカホールドライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーである。
【００５６】
好ましいＤＮＡライブラリーは、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）をコードするライブラリーである（Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol., 22,575-582,2004）。ファージ粒子上にディスプレイされたＤＡＲＰｉｎの例は、実施例に示される。
【００５７】
本発明は、更に本発明の方法により産生されたファージに関する。
【００５８】
本発明は、更に、非常に速く折りたたまれそして細胞質内で安定なタンパク質のペリプラズム発現、特に、ＤＡＲＰｉｎのペリプラズム発現に関する。実施例のＤｓｂＡｓｓおよびＤＡＲＰｉｎコード化ファージミドは、非サプレスE.coli（non-suppressing E. coli）でのＤＡＲＰｉｎの効率的なペリプラズム発現のために直接使用されうる。または、標準ペリプラズム発現ベクターは、ペリプラズム発現のために使用されるシグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明のシグナル配列をコードするＤＮＡにより、特にＤｓｂＡｓｓをコードするＤＮＡにより置換することにより適合させることができる。例えば、ＤＡＲＰｉｎの効率的なペリプラズム発現は、エフェクタータンパク質、特に細胞質で発現することが非常に困難である毒素またはサイトカイン、に融合されたＤＡＲＰｉｎの発現に役立つ。
【００５９】
下記に例示された新規なファージディスプレイ法は、非常に広い範囲のディスプレイされるべきＰＯＩをファージ粒子に効率的に組み込むことを可能とし、従って効率的なファージディスプレイを可能とする。従来のファージディスプレイ法に比べてのこの新規な方法の重要な差は、ディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドを翻訳と同時のＳＲＰ経路に指向させるシグナル配列の使用である（図２、（１）〜（２））。この方法では、ディスプレイされるべきＰＯＩは、細胞膜を横切ってペリプラズムに効率的にトランスロケーションされ、従ってファージ粒子へのＰＯＩの効率的な組み込みを可能とする。好ましい融合タンパク質は、繊維状ファージコートタンパク質または該コートタンパク質のトランケーションされたバージョンの１つも含む。この場合に、ＰＯＩは、トランスロケーション後（図１）におよびファージ粒子への組み込みの前に、ファージコートタンパク質の疎水性延長部により細胞膜にアンカーされる。
【００６０】
ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列の１つの特定の例は、E.coliタンパク質ＤｓｂＡのシグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ）である。例示されたｐＤＳＴファージミドのすべての他のエレメントは、古典的ファージミド、例えばｐＡＫ１００シリーズに由来し、このｐＡＫ１００シリーズは、関心のあるポリペプチドの翻訳後のＳｅｃ経路を介したディスプレイを指向させるＰｅｌＢのシグナル配列（ＰｅｌＢｓｓ）またはＰｈｏＡのシグナル配列（ＰｈｏＡｓｓ）を有する（図２、（３）−（４）−（５））。
【００６１】
１つのシリーズの実験において、ＰｈｏＡｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドおよびＤｓｂＡｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドから産生されたファージ粒子間でディスプレイ収率を比較した。ファージ粒子は、下記の標準プロトコールにより産生されそしてＣｓＣｌ勾配遠心により精製された。ウエスタンブロット法は、単鎖Ｆｖ抗体のディスプレイのために、ｐＤＳＴファージミドが、使用したシグナル配列に無関係にＰＯＩのほぼ同じディスプレイ収率を有するファージ粒子を産生することを示した（図４Ａ、ｓｃＦｖ）。しかしながらまったく対照的に、すべての４つの試験されたＤＡＲＰｉｎは、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用するときにのみ効率的にディスプレイされ得、そしてＰｈｏＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用するときはディスプレイされたタンパク質は殆ど検出できなかった（図４Ａ、ＤＡＲＰｉｎｓ）。同様に、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドは、ポリペプチドＧＣＮ４（図４Ａ）、ラムダヘッドタンパク質Ｄ、ＴｒｘＡおよびＡＰＨ（図４Ｂ）の場合に、相当より高いディスプレイ収率をもたらした。タンパク質Ｔａｑポリメラーゼ、ファージλプロテインホスファターゼ（λＰＰ）では僅かにより高いディスプレイ収率しか観察されず、そしてｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２、図４Ｂ）の場合にはディスプレイされたタンパク質は検出できなかった。これは、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用することにより産生されたファージ粒子上のディスプレイ収率は、ＰｈｏＡｓｓを使用する古典的ファージミドにより産生されたファージ粒子上のディスプレイ収率に少なくとも匹敵することを示すが、ＤＡＲＰｉｎおよび他の速く折りたたまれ且つ熱力学的に安定なタンパク質をディスプレイするときには顕著に増加したディスプレイ収率を示す。
【００６２】
この差を定量するために、ファージ粒子をファージＥＬＩＳＡ実験において使用した。タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子を、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドまたはＰｈｏＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドからの産生後に比較した。抗Ｍ１３抗体で定量された結合したファージ粒子の検出に基づいて、１００倍より多くの増加したディスプレイ収率が観察された（図５）。
【００６３】
ＤｓｂＡｓｓを使用することにより得られたより高いディスプレイ収率が選択実験も益することを証明するために、ＤｓｂＡｓｓまたはＰｈｏＡｓｓをコードするファージミドから産生された３つの異なるタイプのファージ粒子を含有する２つの試験混合物を種々の希釈率で混合した。両試験混合物について、タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子を、選ばれなかったＤＡＲＰｉｎ Ｅ３＿５およびＥ３＿１９をディスプレイするファージ粒子中に１：１０７希釈率でスパイクした。これらの２つの試験混合物は、ターゲットタンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に対する標準ファージディスプレイ選択のためのインプットライブラリーとして使用された（表２）。ＡＰＨおよびＪＮＫ２特異的ファージ粒子は、ＤｓｂＡｓｓコードファージミドから産生された試験混合物から選択サイクル当たり約１０００倍濃縮され得た（既に１０％より多くの試験されたクローンが２サイクルのみの選択の後にそれらのターゲットに対して特異的であった）が、ＰｈｏＡｓｓ含有ファージミドから産生された試験ライブラリーからの濃縮は、５選択サイクルの後にすら観察できなかつた（特異的クローンは観察されなかった）。
【００６４】
他のシリーズの実験では、ＰｈｏＡｓｓ、ＰｅｌＢｓｓ、ＤｓｂＡｓｓ、ＴｏｒＴｓｓ、ＴｏｌＢｓｓまたはＳｆｍＣｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドから産生されたファージ粒子間でファージＥＬＩＳＡによりディスプレイ収率を比較した。タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子は、個々のｐＤＳＴファージミドからの産生の後に比較された。抗Ｍ１３抗体で定量された結合したファージ粒子の検出に基づいて、Ｓｅｃ依存性シグナル配列ＰｈｏＡｓｓに比較してＳＲＰ依存性シグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ、ＴｏｒＴｓｓ、ＴｏｌＢｓｓまたはＳｆｍＣｓｓ）で、７００倍までの増加したディスプレイ収率が観察された（図６）。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
実施例
材料
化学品は、Ｆｌｕｋａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素およびバッファーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）またはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）からのものであった。ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）からのものであった。すべてのクローニングおよびファージ増幅は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）からのE.coliＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて行った。
【００６９】
分子生物学
特記しない限り、すべての分子生物学方法は、説明されたプロトコールに従って行われた（Ausubel, F.M., Brent,R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Sedman, J.G., Smith, J.A. and Stuhl, K.eds., Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Weley and Sons,1998）。簡単なプロトコールは下記に示される。
【００７０】
ファージディスプレイ関連方法
特記しない限り、すべてのファージディスプレイ関連方法は、説明されたプロトコールに従って行われた（Clackson, T. and Lowman, H.B. eds., Phage Display A Practical Approach, New York: Oxford University Press, 2004; Barbas III, C.F., Burton, D.R., Scott, J.K.eds.,Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。簡単なプロトコールは下記に示される。
【００７１】
クローニング
ＤＡＲＰｉｎ３ａをコードするファージミドｐＡＫ１００の誘導体（Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H.R., and Pluckthun, A., J.Immunol. Methods 201, 35-55, 1997）は、ｐＤＳＴ２３と呼ばれる、この研究の最初のファージミドのクローニングのための出発点であった。
【００７２】
このｐＡＫ１００誘導体のシグナル配列を置換するために、オリゴヌクレオチドｏＤＳＴ４（配列番号５）、ｏＤＳＴ５（配列番号６）、ｏＤＳＴ６（配列番号７）およびｏＤＳＴ８（配列番号８）をデザインした。これらの４つのオリゴヌクレオチドは、E.coliＤｓｂＡシグナル配列をコードする。E.coliＤｓｂＡタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに見出されうる（アクセッションナンバーＰ２４９９１）。そのシグナル配列は、ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号１）である。オリゴヌクレオチドｏＤＳＴ４、ｏＤＳＴ５、ｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８をアニーリングしそしてＰＣＲによりオリゴヌクレオチドｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８を用いて増幅した。得られるＤＮＡフラグメントは、ＤｓｂＡシグナル配列をコードしており、そして制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより隣接されている。このＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化しそして、同様に処理されそして脱リン酸化されたｐＡＫ１００誘導体にライゲーションした。得られるファージミドｐＤＳＴ２３（図３）を単離しそして正しい配列をＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７３】
ＰｈｏＡのシグナル配列（配列番号９）をコードするファージミドとの直接実験比較を可能とするために、ｐＤＳＴ２２と呼ばれる第２ファージミドを生じさせた。再び、ｏＤＳＴ４ｐ（配列番号１０）、ｏＤＳＴ５ｐ（配列番号１１）、ｏＤＳＴ６（配列番号７）およびｏＤＳＴ８ｐ（配列番号１２）と呼ばれる４つのオリゴヌクレオチドをアニーリングしそしてＰＣＲによりｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８ｐを用いて増幅した。得られるＤＮＡフラグメントは、ＰｈｏＡシグナル配列をコードしており、そして制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより隣接されている。このＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化しそして、同様に処理されそして脱リン酸化されたｐＤＳＴ２３にライゲーションした。得られるファージミドｐＤＳＴ２２を単離しそして正しい配列をＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７４】
この研究で使用した他のファージミドは表１に列挙されておりそして下記のとおりに得られた：関心のあるタンパク質のコード配列を適切なデザインされたＰＣＲプライマーおよびテンプレートＤＮＡ、例えば、調製されたｃＤＮＡもしくは公的に入手可能なプラスミドＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅した。それにより、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩ制限部位が、コード配列の各々の５‘側に導入され、そして２つの制限部位（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）はコード配列の各々の３’側に導入された。これらのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩIならびにＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩで消化し、次いで同様に処理されそして脱リン酸化されたファージミドｐＤＳＴ２３またはｐＤＳＴ２２にライゲーションした。クローニングされたＰＣＲ産物を含む融合ポリペプチドのための発現カセットのオープンリーディグフレームをすべての構築物について維持し、特にファージタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴｐ３）へのＣ末端融合のための正しいリーディングフレームを維持した。関心のあるクローニングされたタンパク質の最初のアミノ酸および最後のアミノ酸は表１に与えられ、そしてＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースについての参照ナンバーまたはアクセッションナンバーも与えられる。すべてのファージミドの正しい配列はＤＮＡ配列決定により証明された。
【００７５】
デザインされたアンキリンタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）３ａおよび２＿３について、 ＤｓｂＡｓｓおよびＰｈｏＡｓｓについて上記したのと同じクローニングストラテジーを使用して、ＰｅｌＢｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８０およびｐＤＳＴ８１）、ＳｆｍＣｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８６およびｐＤＳＴ８７）、ＴｏｌＢｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８４およびｐＤＳＴ８５）およびＴｏｒＴｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８８およびｐＤＳＴ８９）をコードするファージミドを生成した。
【００７６】
ファージ産生および精製
１％グルコース、３４μg／mlクロラムフェニコール（ｃａｍ）および１５μg／mlテトラサイクリン（ｔｅｔ）を含有する５ml ２×ＹＴ培地に、関心のあるファージミドを含んでいるE.coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅの単一コロニーを接種し、そして細胞を、振とうしながら３０℃で一夜成長させた。１％グルコース、３４μg／ml ｃａｍおよび１５μg／ml ｔｅｔを含有する新鮮な５ml ２×ＹＴ培地に、一夜培養物を１：１００の比で
【表５】
接種し、そして振とうしながら０．５のＯＤ６００となるまで３７℃で成長させた。培養物に１ml当たり４×１０１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）でＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージを感染させ（感染多重度〜２０）そして細胞を攪拌しないで３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで振とうしながら３７℃で３０分間インキュベーションした。遠心（３５００ｇ、２４℃、１０分）により細胞を回収し、そして３４μg／ml ｃａｍ、５０μg／mlカナマイシン（ｋａｎ）および０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する２×ＹＴ培地５０ml中にペレットを再懸濁させることにより、培地を変えた。振とうしながらの３０℃で１４〜１６時間の成長の後に、細胞を遠心（５６００ｇ、４℃、１０分）により除去した。培養上清を１／４容積の氷冷ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）と１時間氷上でインキュベーションした。次いで沈殿したファージ粒子を遠心（５６００ｇ、４℃、１５分）により集めそしてＴＢＳ１５０（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１ml中に再溶解した。ファージ粒子の更なる精製を、下記のとおりＣｓＣｌ勾配遠心により行った。ＣｓＣｌ １．６ｇの添加後に、ＴＢＳ１５０により容積を４mlに調節した。ＣｓＣｌ溶液を１／２×１／２インチポリアロマーチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，ＵＳＡ，Ｎｏ３５８９８０）に移し、そして４℃でＴＬＮ−１００ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において１０００００r.p.m.で４時間遠心した。遠心の後に、ファージバンドを回収した。ファージを１／２×２インチのポリカーボネートチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，ＵＳＡ，Ｎｏ３４９６２２）に移し、これにＴＢＳ１５０を充填して３mlとした。４℃でＴＬＡ−１００．３ロータにおいて５００００r.p.m.で１時間遠心した後、ペレット化されたファージを３mlＴＢＳ中に再溶解した。４℃でＴＬＮ−１００．３ロータにおいて５０，０００r.p.m.で１時間追加の遠心をした後、ファージを１mlＴＢＳ中に溶解した。ファージ粒子の総濃度を分光光度法により定量した。ファージサンプルの感染力価は、１％グルコースおよび３４μg／ml ｃａｍを含有する２×ＹＴ寒天プレートを使用してE.coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞でのタイトレーションにより決定した。３７℃で一夜インキュベーション後に、コロニーを計数した。
【００７７】
ファージブロット
ＣｓＣｌ勾配により精製された５×１０11個のファージ粒子を、還元条件下に１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、そしてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）にエレクトロブロッティングにより移した。この膜をＭＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％脱脂乳）により室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングし、そしてｐＩＩＩのＣ末端ドメインを認識する一次抗体としてのマウス抗ｐＩＩＩ抗体（ＭｏＭｉＴｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＮＯ．ＰＳＫＡＮ３）とインキュベーションした（ＭＴＴＢＳ150中１：１０００、ＲＴで２０分）。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ，Ｎｏ．３１４３８）を二次抗体として使用した（ＭＴＴＢＳ150中１：１００００、ＲＴで１時間）。タンパク質をＣｈｅｍｉＧｌｏｗ Ｗｅｓｔ基質（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）により検出した。
【００７８】
第２の実験では、ブロッキングされた膜を、一次抗体としてのマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ１抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｎｏ．Ｆ３０４０）とインキュベーションした（ＭＴＴＢＳ150中１：５０００、ＲＴで１時間）。ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｎｏ．Ａ３５６２）を二次抗体として使用した（ＭＴＴＢＳ150中１：１００００、ＲＴで１時間）。タンパク質を基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により検出した。
【００７９】
ファージＥＬＩＳＡ
ファージＥＬＩＳＡを行って、Ｍ１３ファージ粒子上の機能的にディスプレイされたＤＡＲＰｉｎの量をアッセイした。ビオチン化されたＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質（Binz et al., loc. cit）を下記のとおりに固定化した：ＴＢＳ150中のＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（６６nM、１００μl／ウエル；Ｓｏｃｏｃｈｉｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４℃での一夜インキュベーションによりＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｎｏ．４４２４０４）上に固定化した。ウエルを室温で１時間３００μl ＢＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）でブロッキングした。ＢＴＴＢＳ150中のビオチン化ＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質（１００μl、１μM）の結合を４℃で１時間行った。
【００８０】
ＢＴＴＢＳ150中のファージ粒子の希釈シリーズをウエルに加えそして２時間ＲＴでインキュベーションした。ウエルを３００μl ＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間５回洗浄した後、結合したファージ粒子を、抗Ｍ１３セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ，Ｎｏ．２７−９４２１−０１）および可溶性ＢＭ ＢｌｕｅＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｎｏ．１４８４２８１）により検出した。
【００８１】
ファージパニング
それぞれ、ＰｈｏＡシグナル配列をコードするファージミド（ｐＤＳＴ３０、ｐＤＳＴ６５、ｐＤＳＴ２２、ｐＤＳＴ３４）またはＤｓｂＡシグナル配列をコードするファージミド（ｐＤＳＴ３２、ｐＤＳＴ６６、ｐＤＳＴ２３、ｐＤＳＴ３７）から、Ｅ３＿５、Ｅ３＿１９、３ａおよび２＿３をディスプレイするファージ粒子を産生した。これらのファージ粒子を使用して、ＰｈｏＡｓｓまたはＤｓｂＡｓｓをコードするファージミドから産生されたファージ粒子の混合物を調製した。結合していないＤＡＲＰｉｎ Ｅ３＿５およびＥ３＿１９をディスプレイしているファージ粒子の１：１混合物に、ターゲット特異的ＤＡＲＰｉｎ ３ａまたは２＿３をディスプレイしているファージ粒子を１：１０７希釈で加えた。ビオチン化ＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質をファージＥＬＩＳＡについて記載のとおりにコーティングした。各ウエルに、０．１mlのファージ粒子混合物（１０13ｃｆｕ／ml）を０．１ml ＢＴＴＢＳ150に加え、そして２時間インキュベーションした。ＴＴＢＳ150による洗浄（第１選択サイクルで３回、第２サイクルで４回および追加のサイクルで５回）およびＴＢＳ150による洗浄（第１選択サイクルで３回、第２サイクルで４回および追加のサイクルで５回）後に、０．２ml溶離バッファー（０．２Mグリシン／ＨＣｌ、pH２．２）と約２２℃で１５分間インキュベーションし、次いで０．２ｍｌトリプシン（ＴＢＳ150中１０mg/ml）により３７℃で３０分間溶離することによって、ファージ粒子を溶離した。一緒にした溶離液（２M Ｔｒｉｓベース１０μlで中和された）を、対数成長しているE.coliＸＬ１−Ｂｌｕｅ ４mlの感染のために使用した。攪拌しないで３７℃で３０分および振とうしながら３７℃で３０分の後に、細胞を、１％グルコースおよび３４μg/ml ｃａｍおよび１５μg/ml ｔｅｔを含有する２×ＹＴ寒天プレート上に広げそして３７℃で一夜成長させた。細胞を、１％グルコース、１５％グリセロール、３４μg/ml ｃａｍおよび１５μg/ml ｔｅｔを含有する２×ＹＴを有するプレートから洗浄し、そして次のサイクルのパニングのためのファージ産生のために使用した。各パニングサイクルの後に、９〜１６の溶離されたファージ粒子のアイデンティティーを決定した。これは、これらのファージ粒子をE.coliに感染させることおよびクローン特異的プライマーを用いるＰＣＲによりコロニーをスクリーニングすることにより行われた。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】関心のあるポリペプチドの膜挿入およびディスプレイＮ末端（Ｎ）、Ｃ末端（Ｃ）、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）；ｐＩＩＩのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）ｐＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴ）。 Ａ）繊維状ファージ粒子上の関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）のポリペプチドのディスプレイは、ペリプラズム（ｐｐ）への細胞膜（ｃｍ）を横切るＰＯＩのトランスロケーションを常に含む。たいてい、ＰＯＩは、コートタンパク質ＩＩＩ（ｐＩＩＩ）またはそのフラグメントを含む融合ポリペプチドとしてトランスロケーションされる。ｐＩＩＩは、２つのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）およびＣ末端ドメイン（ＣＴ）含む。この特定の例では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端ＰＯＩおよびＣ末端ＣＴからなる。融合ポリペプチドおよびｐＩＩＩは、トランスロケーション後に且つファージ粒子へのそれらの組み込みの前にＣＴ部分でＣ末端疎水性ストレッチにより細胞膜にアンカーされる。細胞質（ｃｐ）、外膜（ｏｍ）、細胞外空間（ｅｘ）。 Ｂ）Ａ）のｐｌｌｌおよび融合ポリペプチドをディスプレイする繊維状ファージ粒子の単純化された図。ｐｌｌｌのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）およびＰＯＩは、ＣＴ部分を介してファージ粒子に組み込まれる。
【図２】グラム陰性菌の細胞膜を横切るポリペプチドのトランスロケーション。 グラム陰性菌のペリプラズム（ｐｐ）への細胞膜（ｃｍ）を横切るポリペプチドのトランスロケーションについて知られている３つの主要な経路の単純化された図。これらの経路は、ＳＲＰ経路、Ｓｅｃ経路およびＴａｔ経路である。ＳｅｃおよびＳＲＰ経路の両方とも、Ｓｅｃトランスロコン（ＳｅｃＴＲ）に頼っているが、これに対してＴａｔ経路は、Ｔａｔトランスロコン（ＴａｔＴＲ）に頼っている。ＳｅｃおよびＴａｔ経路の両方とも、ポリペプチドを翻訳後にトランスロケーションするが、これに対してＳＲＰ経路は、ポリペプチドを翻訳と同時にトランスロケーションする。ＳｅｃおよびＳＲＰ経路は、折りたたまれていない（ｕｆ）状態でタンパク質を前記膜を通して輸送するＳｅｃトランスロカーゼに収束する。対照的に、Ｔａｔトランスロコンは折りたたまれた（ｆ）タンパク質のみをトランスロケーションする。シグナル配列（ｓｓ）のアミノ酸組成は、これらの経路の１つへのプレプロテインのターゲティングを強く選ぶ。トランスロケーションの後に、シグナル配列は、ペプチダーゼによりプレプロテインから開裂除去される。ＳＲＰ経路は、５４kDaタンパク質ホモログおよび４．５Ｓ ＲＮＡからなるリボヌクレオタンパク質であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により媒介される。この経路では、ＳｅｃトランスロコンにプレプロテインをターゲティングするのはＳＲＰである。ＳＲＰはリボソーム（Ｒ）から現れる対応するシグナル配列を認識しそしてそれに結合し、リボソーム−新生鎖複合体をＳＲＰレセプター（ＳＲ）に送達し、次いでプレプロテインはＳｅｃトランスロコンを通じて翻訳と同時にトランスロケーションされる。従って、ポリペプチドの未熟な細胞質折りたたみの故にＳｅｃ経路と非適合性であるポリペプチドは、翻訳されている間にＳＲＰ経路により効率的にトランスロケーションされうる。（１）ＳＲＰはリボソームから現れる新生タンパク質の特に疎水性のシグナル配列に結合する。（２）ＳＲＰは、リボソーム新生鎖複合体をＳＲＰレセプターを介してＳｅｃトランスロコンに指向させ、そこで翻訳と同時のトランスロケーションが行われる。大部分のプレプロテインは、より少なく疎水性のシグナル配列を有し、そしてＳｅｃＢ依存性エキスポートを受ける。（３）新生ポリペプチドに対する一般的アフィニティーを有する細胞質ゾルシャペロンであるトリガー因子（ＴＦ）は、新生プレプロテインの成熟領域に結合し、そして翻訳が殆ど終了するまで有効に結合したままである。（４）ＴＦ解離に続いて、細胞質ゾル因子、例えばＳｅｃＢは、プレプロテインを伸張した折りたたまれていないコンホメーションに維持するのを助ける。（５）伸張したコンホメーションを保持するプレプロテインは、Ｓｅｃトランスロコンを通じて効率的に輸送される。（６）しかしながら、プレプロテインの折りたたみが細胞質において起るならば、このタンパク質は通常分解されるか（１０）またはＳｅｃトランスロコンをふさぐことすらありうる。ツインアルギニンモチーフを含有するシグナル配列を有するプレプロテインは、Ｔａｔトランスロコンに運命付けられている（destined）。（７）シャペロン（ＴＣ）、例えばＤｎａＫまたは他のＴａｔ特異的因子との会合は、多分折りたたみが完了するまでシグナル配列をシールドする（８）。この同じ因子または追加の因子は、正しい折りたたみを促進することもありうる。Ｔａｔトランスロケーションは、プレプロテインが正しく折りたたまれる場合にのみ進行し；そうでなければ、プレプロテインは細胞のタンパク質分解装置により分解される（９、１０）。
【図３】ｐＤＳＴファージミドベクターシリーズの模式図。 Ａ）ｐＤＳＴファージミドベクターシリーズの発現カセットの拡大図である。この発現カセットは、E.coliのｌａｃＺ遺伝子のプロモーター／オペレーターエレメント（ｌａｃＺｐ／ｏ）、リボソーム結合部位（示されていない）、シグナル配列（ｓｓ）およびディスプレイされるべき関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）のためのコード配列、サプレッサーストップコドン（ＴＡＧ）、可動性グリシン／セリンリンカー（Ｇ／Ｓ）およびファージ粒子への融合ポリペプチドの組み込みを媒介する繊維状ファージのタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメイン（アミノ酸２５０〜４０６）（ＣＴｐＩＩＩ）のためのコード配列、２つのストップコドン（ＴＧＡＴＡＡ、示されていない）および転写ターミネーターエレメント（示されていない）を含む。ＰＯＩのコード配列は、Ｆｌａｇタグ（Ｆｌａｇ）およびｃｍｙｃタグ（ｃ−ｍｙｃ）をコードするＤＮＡ配列により隣接されている。ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列を代表するものとしてのＤｓｂＡシグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ）およびＳｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列を代表するものとしてのＰｈｏＡシグナル配列（ＰｈｏＡｓｓ）のための一文字アミノ酸配列が示される。これらのシグナル配列は、正に帯電したＮ末端領域（ｎ領域）、非極性疎水性コア（ｈ領域）およびより極性の高いＣ末端領域（ｃ領域）を含有する。 Ｂ）ファージミドｐＤＳＴ２３の模式図。Ａ）に示されたエレメントに加えて、繊維状ファージ複製起点（Ｆｆ ｏｒｉ）、ｌａｃＺｐ／ｏの厳重なコントロールのために必要なｌａｃリプレッサーを産生するE.coliからのｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃｌ）、ベクターのバクテリア複製のためのＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、クロラムフェニコール耐性を媒介するクロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼをコードする抗生物質耐性遺伝子（ｃａｔ）および制限部位ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩが示される。ｐＤＳＴ２３においてコードされたＰＯＩは、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）３ａである。
【図４】ウエスタンブロット分析によるディスプレイ収率比較 Ａ）およびＢ）それぞれのファージミドの使用により産生されたＣｓＣｌ精製されたファージ粒子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、そしてタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメインに特異的な抗体（抗ｐＩＩＩ）またはＦｌａｇタグに対して特異的な抗体（抗ＦｌａｇＭ１）により検出した。１レーン当たりに適用されたアリコートは標準化されておりそして５×１０１１個のファージ粒子に相当している。種々のポリペプチドについてファージ粒子上のディスプレイ収率を分析する。ポリペプチドの略称は、レーンの上部に示されそして表１に列挙されたポリペプチドを指す。さらに、表１は、ファージ粒子を産生するために使用された対応するファージミドを示しそして発現カセットの略図は、図３Ａに示される。ＰｈｏＡシグナル配列（「ｐ」と表示されたレーン）またはＤｓｂＡシグナル配列（「ｄ」と表示されたレーン）を使用して、それぞれ、Ｓｅｃ経路またはＳＲＰ経路による対応する融合ポリペプチドをトランスロケーションして、各ポリペプチドについてディスプレイ収率を比較した。より強いバンドは、より高いディスプレイ収率を示す。kDaで示されたマーカータンパク質の分子量は、ブロットの両側に示される。抗ｐＩＩＩブロットにおける６２kDaでのバンドは、ｐＩＩＩ野生型タンパク質に対応する。
【図５】ＥＬＩＳＡ分析によるディスプレイ収率比較 ２＿３と呼ばれるｃＪｕｎＮ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２）結合ＤＡＲＰｉｎ（白記号）または３ａと呼ばれるアミノグリコシドキナーゼＡＰＨ（３’）−ＩＩＩａ（ＡＰＨ）結合ＤＡＲＰｉｎ（黒記号）をディスプレイするファージ粒子を、それぞれ固定化されたビオチン化ＪＮＫ２またはＡＰＨタンパク質を含有する、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコーティングされそしてＢＳＡでブロックされたウエルにおいてインキュベーションした。洗浄の後に、結合したファージ粒子は、セイヨウワサビペルオキシダーゼにカップリングされた抗Ｍ１３抗体で検出されそして可溶性ＢＭ ＢｌｕｅＰＯＤ基質で可視化された。プロットされたデータは、ｘ軸上の１ウエル当たりに適用されたファージ粒子（ｐｐ）の数に対する３９２ｎｍで測定されたバックグラウントを差し引いた後の３６０nmで測定されたｙ座標上の吸光度（Ａｂｓ）を示す。ＤｓｂＡシグナル配列コード化ファージミド変異体を使用して産生されたファージ粒子（三角形記号）は、１ウエル当たり約８×１０８個のファージで既に最大値の半分のシグナルを示したが、これに対してＰｈｏＡシグナル配列コード化変異体から産生されたファージ粒子（四角形記号）は、１ウエル当たり約２×１０１１個のファージ粒子でのみ最大値の半分のシグナルを示し、これは１００倍より多く低いディスプレイ収率を示す。従って、融合ポリペプチドのトランスロケーションのためのＤｓｂＡシグナル配列媒介ＳＲＰ経路の使用は、ＰｈｏＡシグナル配列媒介Ｓｅｃ経路を使用することに比較してディスプレイ収率を強く増加させた。
【図６】ＥＬＩＳＡ分析によるディスプレイ収率の定量 ＤＡＲＰｉｎ２＿３または３ａをディスプレイするファージ粒子を、図５について記載したとおりに分析した。結果は、ＰｈｏＡｓｓディスプレイ収率を１にセットして、棒グラフ（対数スケール）で示される。使用された各シグナル配列についてのディスプレイレベル（増加倍数）は、ＯＤ４５０＝０．５のシグナルを与えるＰｈｏＡｓｓ含有ファージ粒子の数に対して相対的なＯＤ４５０＝０．５のシグナルを与えるファージ粒子の数に対応する。ＰｅｌＢｓｓ：Erwinia carotovora ＰｅｌＢのシグナル配列（推定Ｓｅｃ依存性シグナル配列）。ＤｓｂＡｓｓの外に、E.coliタンパク質ＴｏｒＴのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＴｏｒＴｓｓ）、ＴｏｌＢのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＴｏｌＢｓｓ）およびＳｆｍＣのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＳｆｍＣｓｓ）を試験した。Ｓｅｃ依存性ＰｈｏＡｓｓに比較して、ＳＲＰ依存性ＴｏｒＴｓｓで７００倍までの増加したディスプレイ収率が観察された。ＳＲＰ依存性ＴｏｌＢｓｓおよびＳｆｍＣｓｓは、３００倍までの増加したディスプレイ収率を与えた。推定Ｓｅｃ依存性ＰｅｌＢｓｓは、２〜６倍の増加したディスプレイ収率を示したにすぎない。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なファージディスプレイ法、それに使用されるファージまたはファージミドベクターおよびそのようにして得られたファージ粒子に関する。
【０００２】
発明の背景
バクテリオファージ上のポリペプチドのディスプレイ（ファージディスプレイ）は、大集団の変異体から所望の性質を有するポリペプチドを取り出すことを可能とする選択技術である（Russel,M., Lowman,H.B., and Clackson, T., Introduction to phage biology and phage display, in"Phage Display",Clackson, T. and Lowman, H.B., eds., Oxford University Press, 2004, pp.1-26）。ファージディスプレイは、コンビナトリアル抗体またはペプチドライブラリーからの選択のために集中的に研究された。
【０００３】
ファージディスプレイに使用される明らかに最も広く使用されたバクテリオファージは、繊維状ファージである。繊維状ファージは、多くのグラム陰性菌に感染するバクテリアウイルスの大きなファミリーを構成する。最も良く知られている繊維状ファージは、Escherichia coliに感染する繊維状ファージであり；これらはｆ１／Ｍ１３／ｆｄおよびＩＫｅである。ファージｆ１、Ｍ１３およびｆｄは、これまで繊維状ファージディスプレイのために使用されてきた繊維状ファージである。それらのゲノムは９８％より高く同一でありそしてそれらの遺伝子産物は相互に交換可能である。
【０００４】
繊維状ファージアセンブリーの独特の局面は、多くの他のバクテリオファージのアセンブリーと対照的に、それが分泌プロセスであるということである。成長しているファージへのコートポリペプチドの組み込みは、細胞膜において起り、そして新生ファージは、それらがアセンブルされるにつれて細胞から押し出される（Russel et al., loc.cit.）。E.coli細胞はこのプロセスにおいては溶解しない。５つのウイルスコートタンパク質（ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐＩＸ）は、それらがファージ粒子に組み込まれる前に細胞膜に挿入される（図１）。例えば、ｐＩＩＩの主要部は、膜を横切ってペリプラズムにトランスロケーションされ、一方そのＣ末端疎水性テイルはタンパク質を膜内にアンカーする。
【０００５】
繊維状ファージディスプレイのための１つの前提条件は、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）の細胞膜を横切るトランスロケーションである。これは、ファージコートタンパク質にＰＯＩを遺伝子的に融合することおよび対応する融合ポリペプチドのトランスロケーションにより普通は達成される。または、ＰＯＩおよびファージコートタンパク質は独立にトランスロケーションされる。この状況において、ＰＯＩは、例えば対応するファージコートタンパク質とのジスルフイド結合の形成（Ｃｙｓディスプレイ）またはロイシンジッパーの形成（ｐＪｕＦｏシステム）により、ペリプラズムにおいてファージ粒子に安定に連結される。ｐＩＩＩへの融合を使用する慣用の繊維状ファージディスプレイにおいては、ＰＯＩを含む融合ポリペプチドのトランスロケーションのためにＳｅｃ経路が使用される。この経路では、ポリペプチドは、リボソームで最初に合成され、次いでその折りたたまれていない状態で、Ｓｅｃトランスロコンにより翻訳後にトランスロケーションされる（図２、（３）−（４）−（５））。即ち、細胞膜を横切るトランスロケーションは、実質的量のポリペプチド鎖が合成された後にのみ始まる。しかしながら、ファージディスプレイの成功に対するトランスロケーションの機構の寄与は、完全には解明されておらず、そして翻訳と同時のトランスロケーション経路（cotranslational translocation pathway）を使用する可能性は、先行技術では探求されていない。
【０００６】
広い範囲のサイズおよび構造の細胞内および細胞外タンパク質が、繊維状ファージ上に機能的にディスプレイされた（Russel et al., loc. cit.）。それにもかかわらず、あるポリペプチドは、大抵は未知の理由で、個々の性質によりディスプレイに対して抵抗性である。これは、ある種のタンパク質のディスプレイの成功を予測不可能とする。従って、使用されるべき各タンパク質について繊維状ファージ上のディスプレイの効率を最初に試験することが通常推奨されてきた。さらに、ファージディスプレイのためのコンビナトリアルライブラリーが創生されるとき、すべてのクローンが同様な効率でディスプレイされるわけではなく；これはｃＤＮＡから生成されたライブラリーについて特に当てはまる。ポリペプチドのディスプレイ問題は、ファージ産生のそれらの妨害、それらのペリプラズム凝集、それらのプロテオリシス、E.coliに対するそれらの毒性または使用されたトランスロケーション経路とのそれらの不適合性の結果でありうる。特に、トランスロケーションに先立つ工程は、ファージ粒子への融合ポリペプチドの組み込みに影響を与える重要な因子である。ポリペプチドが未熟に折りたたまれるならば、それらはトランスロケーションに対して抵抗性でありうるかまたは細胞質毒性を示すことすらありうる。従って、タンパク質が翻訳後にトランスロケーションされるか（未熟な折りたたみを潜在的に可能とする）または翻訳と同時にトランスロケーションされる（細胞質折りたたみを許容しない）かどうかは重要である。最近の繊維状ファージディスプレイ法は細胞膜を横切る融合ポリペプチドのトランスロケーショのために翻訳後経路を使用する（Russel et al., loc. cit.; Paschke, M. and Hoehne, W., Gene 350, 79-88, 2005）。従って、これらの経路と非適合性のポリペプチドはディスプレイに対して抵抗性であり、ファージディスプレイ選択を非常に非効率的にするかまたは不可能とさえする。例えば、ファージディスプレイにおいて殆ど独占的に使用される翻訳後Ｓｅｃ経路は、細胞質において折りたたまれていない状態のままにあることができないタンパク質をトランスロケーションすることが本質的にできない。何故ならばＳｅｃトランスロケーション自体は折りたたまれていないポリペプチドのみ輸送することができるからである（Huber, D., Boyd, D., Xia, Y., Olma, M.H., Gerstein, M., and Beckwith., J., J.Bacteriol. 187, 2983-2991, 2005; Paschke et al., loc. cit.）。
【０００７】
従って、本発明の基礎をなす技術的問題は、翻訳後トランスロケーションを使用することにより非効率的にディスプレイされる繊維状ファージ上のこれらのポリペプチドの効率的なディスプレイのための新規なトランスロケーションアプローチを確認することである。この技術的問題にたいする解決は特許請求の範囲に特徴付けられた態様を提供することにより達成される。
【０００８】
発明の要約
本発明は、ファージ粒子上にディスプレイされた関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）が、特にシグナル認識粒子経路に基づいて、グラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションされる、繊維状ファージディスプレイ法に関する。
【０００９】
従って、本発明は、ＰＯＩを含む融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションによるファージディスプレイを可能とする。この方法は、ファージ上にディスプレイすることが困難であることが知られているポリペプチドのために、および特に非常に速く折りたたまれる安定なタンパク質スカホールドに由来する場合のｃＤＮＡライブラリーおよび他のコンビナトリアルライブラリーのタンパク質のために特に適当である。
【００１０】
本発明はさらに、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩおよびシグナル認識粒子経路に基づく翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクター、ならびに本発明の方法により得られたファージに関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の状況では、用語「繊維状ファージディスプレイ」は、繊維状ファージに基づいたファージディスプレイを指す。繊維状ファージは、多くのグラム陰性菌に感染するバクテリアウイルスの大きなファミリーを構成する。好ましい繊維状ファージは、E.coliに感染する繊維状ファージ、特にｆ１／Ｍ１３／ｆｄおよびＩＫｅである。繊維状ファージディスプレイを実施するための方法は、当業者に周知である（例えば、Russel et al., loc.cit.）。
【００１２】
本発明の状況では、用語「シグナル配列」は、トランスロカーゼへのポリペプチドのターゲティングをもたらすポリペプチドのアミノ酸のＮ末端ストレッチを指す。E.coliでは、Ｎ末端シグナル配列は、一般に１５〜５２アミノ酸を含む。大部分のシグナル配列は、正に帯電したＮ末端領域（ｎ領域）、非極性疎水性コア（ｈ領域）およびより極性のＣ末端領域（ｃ領域）を含有する。ｃ領域は、シグナルペプチダーゼのための開裂部位を含有する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーション反応期間中ポリペプチドからシグナル配列を除去する膜結合プロテアーゼである。１８〜３０アミノ酸を含むこのようなシグナル配列は好ましい。シグナル配列の決定は、当業者に周知である。例えば、それらは、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔもしくはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースからまたはアノテーションされたゲノムワイドなデータセットを使用して得られうる。
【００１３】
本発明の状況では、用語「プレプロテイン」は、Ｎ末端シグナル配列を含むポリペプチドを指す。シグナル配列は、トランスロケーション反応期間中プレプロテインから開裂されて、成熟タンパク質を生成する。
【００１４】
本発明の状況では、用語「融合ポリペプチド」は、Ｎ末端シグナル配列、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）および繊維状ファージ上のディスプレイを可能とする追加のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。好ましくは、この追加の配列は、繊維状ファージコートポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。または、この配列は、安定な連結の形成により、例えば対応するファージコートタンパク質とのジスルフィド結合の形成（Ｃｙｓディスプレイ）またはロイシンジッパーの形成（ｐＪｕＦｏシステム）によりペリプラズムにおいてファージ粒子にＰＯＩを連結する。この別のストラテジーでは、ＰＯＩおよび対応するファージコートタンパク質は、細胞膜を横切って独立にトランスロケーションされる。
【００１５】
本発明の状況では、用語「トランスロケーション」は、トランスロコンにより媒介される生物学的膜を横切るポリペプチドのトランスロケーションを指す（Holland, I.B. et al., Biochim. Biophys. Acta 1694, 5-16,2004）。トランスロケーションは、翻訳後または翻訳と同時に起る。従って、トランスロカーゼは、トランスロコンを通じてポリペプチドを特異的に輸送する酵素または酵素複合体である（Holland et al., loc. cit.）。
【００１６】
本発明の状況では、用語「Ｓｅｃ経路」は、Ｓｅｃトランスロコンを通じてのグラム陰性菌の細胞膜を横切るプレプロテインの翻訳後のトランスロケーションのためのタンパク質輸送機構を指す（Holland et al., loc.cit.）。Ｓｅｃ経路は、トランスロケーションの前にプレプロテインを折りたたまれていない状態に保つ分子シャペロン、たいていＳｅｃＢにより媒介される。Ｓｅｃ経路は、グラム陰性菌におけるタンパク質トランスロケーションの主要な経路である。
【００１７】
本発明の状況では、用語「ＳＲＰ経路」は、Ｓｅｃトランスロコンを通じてのグラム陰性菌の細胞膜を横切るプレプロテインの翻訳と同時のトランスロケーションのためのタンパク質輸送機構を指す（Schierle, C. F., Berkmen, M., Huber, D., Kumamoto, C., Boyd, D., and Beckwith, J., J.Bacteriol.185,5706-5713,2003; Huber et al., loc. cit.）。ＳＲＰ経路は、５４kDaタンパク質ホモログ（５４ホモログ；Ｆｆｈ）および４．５Ｓ ＲＮＡからなるリボヌクレオタンパク質であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により媒介される。ＳＲＰ経路では、シグナル配列は、それがリボソームから現れるやいなやＳＲＰと相互作用する。次いでＳＲＰ、新生ポリペプチドおよびリボソームからなる複合体は、ＳＲＰレセプターを介してＳｅｃトランスロコンに移送され、そこでポリペプチドはＳｅｃトランスロコンを通じて翻訳と同時にトランスロケーションされる。
【００１８】
ＳｅｃおよびＳＲＰ経路は、膜を通じて折りたたまれていない状態においてタンパク質を輸送するＳｅｃトランスロカーゼに収束する。プレプロテインのトランスロケーションのためにＳｅｃ経路よりもＳＲＰ経路へのプレプロテインのターゲティングを強く選ぶのは、シグナル配列のアミノ酸組成である。（Huber et al., loc. cit.）。
【００１９】
本発明の状況では、用語「ＤｓｂＡ」は、ペリプラズムE.coliチオール：ジスルフィド相互交換タンパク質ＤｓｂＡを指す（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ２４９９１）。ＤｓｂＡは、ＳＲＰ経路の基質である（Huber et al., loc.cit.）。ＤｓｂＡは、翻訳と同時にエキスポートされて、そのエキスポートを抑制する細胞質におけるその折りたたみを回避する。
【００２０】
本発明の状況では、用語「ＴｒｘＡ」は、E.coliタンパク質チオレドキシン１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ００２７４）を指す。ＴｒｘＡは、プレプロテインをＳＲＰ経路またはＳｅｃ経路にターゲティングするシグナル配列を区別するためのレポータータンパク質として使用され得る（Schierle et al., loc. cit.; Huber et al., loc.cit.）。
【００２１】
本発明の状況では、用語「Ｔａｔ経路」は、ツインアルギニンタンパク質トランスロケーション（Ｔａｔ）経路を指す（Paschke et al., loc. cit.）。Ｔａｔ経路は、Ｓｅｃ経路およびＳＲＰ経路とは基本的に異なる。Ｓｅｃトランスロコンと対照的に、Ｔａｔトランスロコンは、完全に折りたたまれたタンパク質のみをエキスポートする。ＳＲＰ経路とは対照的に、Ｔａｔトランスロコンは、膜を通じて翻訳後にタンパク質を通す。
【００２２】
１つの特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列である。
【００２３】
関心のあるシグナル配列が、グラム陰性菌の細胞膜を横切る翻訳と同時のトランスロケーションを促進するかどうかを試験するための方法は、当業者に周知である。例えば、関心のあるシグナル配列は、成熟ＭａｌＥ （Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ０２９２８、残基２７〜３９６） に遺伝子的に融合される。次いでこの人工的プレプロテインは、E.coliにおいて発現されそしてその新生鎖の翻訳と同時のタンパク質分解プロセッシングの収率は、記載されたとおりの二次元ゲル電気泳動により分析される（Josefsson, L-G. and Randall, L.L., Methods Enzymol. 97, 77-85, 1983; Schierle et al., loc. cit.）。プレプロテイン鎖がまだ新生である間に関心のあるＮ末端シグナル配列を除去することは、ポリペプチドの合成が完了する前にトランスロケーションが開始され、従ってトランスロケーションが翻訳と同時であることを示す。好ましいシグナル配列は、成熟ＭａｌＥに融合されるとき、８０％を超える、更に好ましくは９０％を越える翻訳と同時のトランスロケーションの収率を促進するシグナル配列である。最も好ましいシグナル配列は、成熟ＭａｌＥに融合されるとき、翻訳と同時のトランスロケーションのみを促進しそして翻訳後のトランスロケーションを促進しないシグナル配列である。または、ＤｓｂＡからのシグナル配列などの、翻訳と同時のトランスロケーションを促進することが既に知られているシグナル配列を使用することができる。
【００２４】
他の特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、シグナル認識経路をターゲティングするシグナル配列である。
【００２５】
グラム陰性菌のシグナル認識経路および関心のあるシグナル配列がプレプロテインをＳＲＰ経路にターゲティングするかどうかを試験するための方法は、当業者に周知である。例えば、ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列に融合されたＴｒｘＡのトランスロケーションは、ＳＲＰの成分をコードする、遺伝子ｆｆｈに突然変異を有するE.coli（例えば、ｆｆｈ７７またはｆｆｈ８７突然変異体株）において強く阻害される（Schierle et al., loc．cit.; Huber et al., loc. cit.）。従ってＳＲＰ経路をターゲティングするこれらのシグナル配列は、野生型E.coliにおける細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するが、ｆｆｈ突然変異体株においては非常に効率悪く促進する。かくして、シグナル配列は、２つの異なるクラス：ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列およびＳＲＰ経路をターゲティングしないシグナル配列、に分けることができる。Ｓｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列は、シグナル配列の全体の疎水性を増加させることにより、特にそのｈ領域の疎水性を増加させることによりＳＲＰ経路に再指向させることができる。例えば、ｈ領域における極性のまたは小さな（ＧｌｙまたはＡｌａ）アミノ酸を大きな疎水性残基で置換することにより単にその疎水性を増加させるＭａｌＥシグナル配列の適度の変更は、タンパク質をＳｅｃからＳＲＰ経路に経路変更する（reroute）。または、ＳＲＰ経路をターゲティングすることが既に知られているシグナル配列、例えば、ＤｓｂＡからのシグナル配列を使用することができる。ＳＲＰ経路を使用するシグナル配列の他の例は、オートトランスポーター（autotransporters）のサブセットのシグナル配列、例えばヘモグロビンプロテアーゼ（Ｈｂｐ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ アクセッションナンバー Ｏ８８０９３）のそれである。異常なことに、Ｈｂｐシグナル配列は相対的に長く（５２アミノ酸）そして古典的シグナル配列に先行するＮ末端延長部を含有する。さらに、Ｈｂｐシグナル配列のｈ領域は、特に疎水性ではない。ＳｅｃＭのシグナル配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバーＰ６２３９５）は、Ｎ末端延長部およびＳＲＰ経路をターゲティングすることが知られている適度に疎水性のｈ領域を含む長いシグナル配列の他の例である。
【００２６】
更に他の特定の態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、グラム陰性菌の細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するシグナル配列である。
【００２７】
多くの良く使用されるシグナル配列、例えば、ＰｈｏＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ００６３４）およびＭａｌＥ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー Ｐ０２９２８）のシグナル配列は、細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを非効率的にのみ促進する（Schierle et al., loc. cit.）。対照的に、ＤｓｂＡからのシグナル配列は、ＴｒｘＡの効率的なトランスロケーションを促進する。関心のあるシグナル配列に融合されたＴｒｘＡを発現するホスト細胞の細胞内分画（subcellular fractionation）は、ペリプラズムへの細胞膜を横切るＴｒｘＡのトランスロケーションを促進することができるこれらのシグナル配列を、促進できないシグナル配列から区別することを可能とする（Huber et al., loc. cit.）。ペリプラズム画分におけるＴｒｘＡの量は、ＴｒｘＡのトランスロケーションを促進するシグナル配列の効率を説明する。または、ＴｒｘＡのトランスロケーションを促進することが既に知られているシグナル配列、例えばＤｓｂＡからのシグナル配列を使用することができる。
【００２８】
好ましい態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡからなる群より選ばれるシグナル配列およびそのホモログである。
【００２９】
特に好ましい態様では、ファージ粒子上にディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡからなる群より選ばれるシグナル配列である。
【００３０】
本発明の状況では、用語シグナル配列の「ホモログ」は、それぞれ、シグナル配列のｎ領域、ｈ領域およびｃ領域の全体の電荷、疎水性および開裂特性を保存しながら、前記したシグナル配列のいずれかとの７０％以上、好ましくは８０％以上、特に９０％以上のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を意味する。このようなホモログの例は、１つ、２つ、３つまたは４つ、特に１つまたは２つのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているか、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸が欠失しているか、または１つまたは２つのアミノ酸が付加されているアミノ酸配列または、前記した置換、欠失および付加の組み合わせである。アミノ酸の置換においては、非極性アミノ酸が、好ましくは、他の非極性アミノ酸により置換され、例えば、ＩｌｅがＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＭｅｔにより置換されるか、またはその逆もあり、極性アミノ酸が他の極性アミノ酸により置換され、例えばＴｈｒがＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎにより置換されるかまたはその逆もあり、負に帯電したアミノ酸が他の負に帯電したアミノ酸により置換され、例えばＡｓｐがＧｌｕにより置換されるかまたはその逆もあり、または正に帯電したアミノ酸が他の正に帯電したアミノ酸により置換され、例えばＬｙｓがＡｒｇまたはＨｉｓにより置換されるかまたはその逆もある。
【００３１】
例えば、アミノ酸配列、
【表１】
を有するＤｓｂＡの好ましいシグナル配列では、アミノ酸Ｌｙｓ２のＡｒｇによる置換、Ａｌａ９のＬｅｕによる置換、Ａｌａ１４のＶａｌによる置換およびＳｅｒ１６のＴｈｒによる置換が可能である。
【００３２】
ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列は、ＳＲＰ経路をターゲティングすることによりＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進することが知られており、そして大部分の場合に、Ｓｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列に比べてより高い全体の疎水性を有することが知られている（Huber et al., loc. cit.）。前記タンパク質は、下記のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ アクセッションナンバー：ＴｏｒＴ Ｐ３８６８３、ＳｆｍＣ Ｐ７７２４９、ＦｏｃＣ Ｐ６２６０９、ＣｃｍＨ Ｐ３３９２５、ＹｒａＩ Ｐ４２９１４、ＴｏｌＢ Ｐ０Ａ８５５、ＮｉｋＡ Ｐ３３５９０、ＦｌｇＩ Ｐ０Ａ６Ｓ３およびＤｓｂＡ Ｐ２４９９１を有する。
【００３３】
疎水性の計算だけでは、高い疎水性範囲においてを）ＳＲＰ依存性シグナル配列およびＳＲＰ非依存性シグナル配列を区別することを可能としない（Huber et al., loc. cit. ）。従って疎水性以外の特徴（例えば、シグナルペプチドの構造）は、１つのトランスロケーション経路に対する優先に影響を与える。
【００３４】
特に好ましい態様では、シグナル配列は、ＤｓｂＡシグナル配列またはＤｓｂＡシグナル配列と９０％一致を有する任意のアミノ酸配列である。
【００３５】
この方法は、例えばファージｆ１、Ｍ１３、ｆｄ等、特にｆ１、Ｍ１３およびｆｄによる、繊維状ファージディスプレイ法のいずれかに適用可能である。
【００３６】
特に、本発明の方法は、
（ａ）グラム陰性菌の細胞膜を横切る融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する繊維状ファージもしくはファージミドベクターを構築する工程；
（ｂ）関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーを工程（ａ）のベクターの発現カセットにクローニングすることによりファージまたはファージミドベクターのコンビナトリアルライブラリーを構築する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のベクターのライブラリーにより適当なグラム陰性菌をトランスフォーメーションする工程；および
（ｄ）ファージディスプレイ選択サイクルを行って、ディスプレイされた関心のあるタンパク質の性質に基づいてファージ粒子を分離する工程、
を含む。
【００３７】
工程（ａ）では、繊維状ファージまたはファージミドベクターは、遺伝子技術の標準方法を使用して構築される。例えば、確立されたファージまたはファージミドベクターの融合ポリペプチドのための発現カセットのシグナル配列コード部分は、標準ＤＮＡ技術を使用して該シグナル配列のコード配列により置換される。または、該シグナル配列を含有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する新規なファージまたはファージミドベクターは、このようなベクターの組成に関する一般的知識（例えば、Russel et al., loc. cit）および標準ＤＮＡ合成およびアセンブリー方法を使用して新規に構築される。その目的に有用なファージまたはファージミドベクターは、例えば、ｐＡＫ１００、ｐＣｏｍｂ３、ｐＥＸｍｉｄｅ３、ｐＨＥＮ１、ｐＪｕＦｏまたはｐＳＥＸである。このようなファージミドベクターの例（ｐＤＳＴ２３）は、この特定の態様に本発明を限定することなく本発明を説明するものとして、図３および付随する実施例に記載されている。
【００３８】
好ましくは、工程（ａ）における融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＳＲＰ経路を通じての融合ポリペプチドのトランスロケーションを促進する。
【００３９】
更に好ましくは、工程（ａ）における融合ポリペプチドのシグナル配列は、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進する。
【００４０】
工程（ｂ）において、ベクターのコンビナトリアルライブラリーの調製のための標準方法が使用される。例えば、関心のあるタンパク質をコードするコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡシャフリングにより、細胞ｍＲＮＡの増幅によるｃＤＮＡの調製によりまたはコンセンサスデザインにより生成され、次いで標準ＤＮＡ技術により該ベクターの発現カセットにライゲーションされる。
【００４１】
工程（ｃ）において、グラム陰性菌のトランスロケーションのための標準方法が使用される。例えば、バクテリアは、エレクトロポレーションもしくは化学的手段により工程（ｂ）のベクターのコンビナトリアルライブラリーによりトランスフォーメーションされる。このような方法は当業者に周知である。
【００４２】
工程（ｄ）において、標準ファージディスプレイ選択サイクルが行われる。このようなファージディスプレイ選択サイクルは当業者に周知である（例えば、Russel et al., loc.cit.）。
【００４３】
好ましくは、工程（ｄ）のディスプレイされた関心のあるポリペプチドの性質は、関心のあるターゲット分子への特異的結合である。この場合に、ターゲット分子へのＰＯＩ結合をディスプレイするファージ粒子は、各選択サイクルにおいて増幅されたファージ粒子を表面に機能的に固定化されたターゲット分子に適用し、結合しなかったファージ粒子を洗い落とし、結合したファージ粒子を溶離し、そして溶離したファージ粒子を次の選択サイクルのファージ粒子の増幅のためのインプットとして使用することにより、無関係なポリペプチドをディスプレイするファージ粒子から分離される。
【００４４】
本発明の状況において、「シグナル配列」と記載されている場合には、このような表現は、「１つ以上」の、例えば１つ、２つ、３つもしくは４つの異なる組成のシグナル配列も意味することは理解される。１つより多くのシグナル配列を使用することは、特定の用途に有利であり得、そしてやはり本発明の範囲内にある。
【００４５】
本発明は、更に、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列、特にＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡからのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列、好ましくはＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡから選ばれるシグナル配列、に融合されたＰＯＩを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクターに関する。最も好ましいのは、シグナル配列ＤｓｂＡまたはそのホモログを含むファージまたはファージミドベクターである。
【００４６】
好ましくは、融合ポリペプチドは、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩに、またはコートタンパク質ｐＩＩＩのフラグメントに融合されたＰＯＩを含む。このようなフラグメントは、例えば、ｐＩＩＩのアミノ酸２５０〜４０６を含むフラグメントである。
【００４７】
ペリプラズム酵素ＤｓｂＡのシグナル配列は、融合したレポータータンパク質をＳＲＰ経路に指向させ、従ってそれらの翻訳と同時のエキスポートを増強させる。これは、相対的に疎水性のＤｓｂＡシグナルペプチドがＳＲＰと相互作用しそしてＤｓｂＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進することを示す。従って、ＤｓｂＡのシグナル配列は、実施例で下記に示されるとおり、他のタンパク質のための一般的シグナル配列として使用することもできる。
【００４８】
同様に、ＤｓｂＡのシグナル配列のホモログおよびＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡおよびＦｌｇＩのシグナル配列およびそのホモログを使用することができる。
【００４９】
本発明の方法は、化合物のライブラリー、例えばＤＮＡライブラリー、特にｃＤＮＡライブラリーを伴う用途に特に適当である。ファージディスプレイにおいてこれまでに使用された方法と対照的に、本発明の方法は、このようなライブラリーの発現により得られたポリペプチドの信頼性のある提示を可能とする。
【００５０】
本発明の特定の態様は、ＤＮＡライブラリーによりコードされたＰＯＩがファージ粒子上にディスプレイされる前記した繊維状ファージディスプレイ法である。好ましくは、ＤＮＡライブラリーによりコードされたＰＯＩのための翻訳と同時のトランスロケーションは、シグナル認識粒子経路に基づいて、例えばＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列に基づいて達成される。最も好ましいのは、リピートタンパク質のファージディスプレイについて本明細書で説明したとおりの方法である。
【００５１】
任意の選択技術の場合と同じく、ファージディスプレイ選択の成功は、ディスプレイされたライブラリーメンバーの多様性に強く依存する。大きなコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ライブラリーメンバーの大きな多様性がディスプレイされうることをそれ自体は保証しない。ファージディスプレイにおいて、ディスプレイされるべきポリペプチドは、それらのファージ粒子への組み込みの前に細胞膜を横切ってトランスロケーションされなければならない。最近の繊維状ファージディスプレイ法は、すべて、細胞膜を横切る融合ポリペプチドのトランスロケーションのための翻訳後の経路を使用する（Russel et al., loc. cit.; Paschke et al., loc. cit.）。従ってこれらの経路と非適合性のライブラリーメンバーは、ディスプレイに対して抵抗性であろうし、従って、ディスプレイされたライブラリー多様性を明らかに減少する。
【００５２】
考慮されるＤＮＡライブラリーは、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により、ＤＮＡシャフリングによりまたはコンセンサスデザインにより産生されたＤＮＡライブラリーを含むすべての可能なコンビナトリアルライブラリーである。このような方法は、新規な性質、例えば結合特性を有するライブラリーメンバーを生じるであろう；それらのいくらかはＳｅｃ経路を使用するトランスロケーションと非適合性であろう。このようなライブラリーは、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリーまたはオルタナティブスカホールド（alternative scaffold）に基づいたライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーを含む（Russel et al., loc. cit.; Nygren, P.A. and Skerra, A., J. Immunol. Methods, 290, 3-28, 2004）。
【００５３】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、特に真核生物起源のｃＤＮＡライブラリーである。ｃＤＮＡライブラリーは、細胞質タンパク質、膜タンパク質および細胞外タンパク質を含む非常に多様な天然に存在する細胞タンパク質をコードする。これらの天然に存在するライブラリーメンバーのいくらかは、Ｓｅｃ経路を使用するトランスロケーションと非適合性であろう。
【００５４】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、細胞内で活性なｓｃＦｖフラグメント（イントラボディ）を選択するのに使用される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーである。イントラボディのための前提要件は、それらが良く折りたたまれそしてE.coliの細胞質中で安定であると言うことである。かくして、細胞質で安定な且つ良く折りたたまれたイントラボディは、Ｓｅｃ経路の翻訳後の機構により非効率的にトランスロケーションされる。
【００５５】
考慮される更なるＤＮＡライブラリーは、アンキリンリピートタンパク質、ロイシンリッチリピートタンパク質、テトラトリコペプチドリピートタンパク質、ペンタトリコペプチドリピートタンパク質またはアルマジロ／ＨＥＡＴリピートタンパク質を含む、リピートタンパク質に基づくオルタナティブスカホールドライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーである。
【００５６】
好ましいＤＮＡライブラリーは、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）をコードするライブラリーである（Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C., Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol., 22,575-582,2004）。ファージ粒子上にディスプレイされたＤＡＲＰｉｎの例は、実施例に示される。
【００５７】
本発明は、更に本発明の方法により産生されたファージに関する。
【００５８】
本発明は、更に、非常に速く折りたたまれそして細胞質内で安定なタンパク質のペリプラズム発現、特に、ＤＡＲＰｉｎのペリプラズム発現に関する。実施例のＤｓｂＡｓｓおよびＤＡＲＰｉｎコード化ファージミドは、非サプレスE.coli（non-suppressing E. coli）でのＤＡＲＰｉｎの効率的なペリプラズム発現のために直接使用されうる。または、標準ペリプラズム発現ベクターは、ペリプラズム発現のために使用されるシグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明のシグナル配列をコードするＤＮＡにより、特にＤｓｂＡｓｓをコードするＤＮＡにより置換することにより適合させることができる。例えば、ＤＡＲＰｉｎの効率的なペリプラズム発現は、エフェクタータンパク質、特に細胞質で発現することが非常に困難である毒素またはサイトカイン、に融合されたＤＡＲＰｉｎの発現に役立つ。
【００５９】
下記に例示された新規なファージディスプレイ法は、非常に広い範囲のディスプレイされるべきＰＯＩをファージ粒子に効率的に組み込むことを可能とし、従って効率的なファージディスプレイを可能とする。従来のファージディスプレイ法に比べてのこの新規な方法の重要な差は、ディスプレイされるべきＰＯＩを含む融合ポリペプチドを翻訳と同時のＳＲＰ経路に指向させるシグナル配列の使用である（図２、（１）〜（２））。この方法では、ディスプレイされるべきＰＯＩは、細胞膜を横切ってペリプラズムに効率的にトランスロケーションされ、従ってファージ粒子へのＰＯＩの効率的な組み込みを可能とする。好ましい融合タンパク質は、繊維状ファージコートタンパク質または該コートタンパク質のトランケーションされたバージョンの１つも含む。この場合に、ＰＯＩは、トランスロケーション後（図１）におよびファージ粒子への組み込みの前に、ファージコートタンパク質の疎水性延長部により細胞膜にアンカーされる。
【００６０】
ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列の１つの特定の例は、E.coliタンパク質ＤｓｂＡのシグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ）である。例示されたｐＤＳＴファージミドのすべての他のエレメントは、古典的ファージミド、例えばｐＡＫ１００シリーズに由来し、このｐＡＫ１００シリーズは、関心のあるポリペプチドの翻訳後のＳｅｃ経路を介したディスプレイを指向させるＰｅｌＢのシグナル配列（ＰｅｌＢｓｓ）またはＰｈｏＡのシグナル配列（ＰｈｏＡｓｓ）を有する（図２、（３）−（４）−（５））。
【００６１】
１つのシリーズの実験において、ＰｈｏＡｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドおよびＤｓｂＡｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドから産生されたファージ粒子間でディスプレイ収率を比較した。ファージ粒子は、下記の標準プロトコールにより産生されそしてＣｓＣｌ勾配遠心により精製された。ウエスタンブロット法は、単鎖Ｆｖ抗体のディスプレイのために、ｐＤＳＴファージミドが、使用したシグナル配列に無関係にＰＯＩのほぼ同じディスプレイ収率を有するファージ粒子を産生することを示した（図４Ａ、ｓｃＦｖ）。しかしながらまったく対照的に、すべての４つの試験されたＤＡＲＰｉｎは、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用するときにのみ効率的にディスプレイされ得、そしてＰｈｏＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用するときはディスプレイされたタンパク質は殆ど検出できなかった（図４Ａ、ＤＡＲＰｉｎｓ）。同様に、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドは、ポリペプチドＧＣＮ４（図４Ａ）、ラムダヘッドタンパク質Ｄ、ＴｒｘＡおよびＡＰＨ（図４Ｂ）の場合に、相当より高いディスプレイ収率をもたらした。タンパク質Ｔａｑポリメラーゼ、ファージλプロテインホスファターゼ（λＰＰ）では僅かにより高いディスプレイ収率しか観察されず、そしてｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２、図４Ｂ）の場合にはディスプレイされたタンパク質は検出できなかった。これは、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドを使用することにより産生されたファージ粒子上のディスプレイ収率は、ＰｈｏＡｓｓを使用する古典的ファージミドにより産生されたファージ粒子上のディスプレイ収率に少なくとも匹敵することを示すが、ＤＡＲＰｉｎおよび他の速く折りたたまれ且つ熱力学的に安定なタンパク質をディスプレイするときには顕著に増加したディスプレイ収率を示す。
【００６２】
この差を定量するために、ファージ粒子をファージＥＬＩＳＡ実験において使用した。タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子を、ＤｓｂＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドまたはＰｈｏＡｓｓ含有ｐＤＳＴファージミドからの産生後に比較した。抗Ｍ１３抗体で定量された結合したファージ粒子の検出に基づいて、１００倍より多くの増加したディスプレイ収率が観察された（図５）。
【００６３】
ＤｓｂＡｓｓを使用することにより得られたより高いディスプレイ収率が選択実験も益することを証明するために、ＤｓｂＡｓｓまたはＰｈｏＡｓｓをコードするファージミドから産生された３つの異なるタイプのファージ粒子を含有する２つの試験混合物を種々の希釈率で混合した。両試験混合物について、タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子を、選ばれなかったＤＡＲＰｉｎ Ｅ３＿５およびＥ３＿１９をディスプレイするファージ粒子中に１：１０７希釈率でスパイクした。これらの２つの試験混合物は、ターゲットタンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に対する標準ファージディスプレイ選択のためのインプットライブラリーとして使用された（表２）。ＡＰＨおよびＪＮＫ２特異的ファージ粒子は、ＤｓｂＡｓｓコードファージミドから産生された試験混合物から選択サイクル当たり約１０００倍濃縮され得た（既に１０％より多くの試験されたクローンが２サイクルのみの選択の後にそれらのターゲットに対して特異的であった）が、ＰｈｏＡｓｓ含有ファージミドから産生された試験ライブラリーからの濃縮は、５選択サイクルの後にすら観察できなかつた（特異的クローンは観察されなかった）。
【００６４】
他のシリーズの実験では、ＰｈｏＡｓｓ、ＰｅｌＢｓｓ、ＤｓｂＡｓｓ、ＴｏｒＴｓｓ、ＴｏｌＢｓｓまたはＳｆｍＣｓｓをコードするｐＤＳＴファージミドから産生されたファージ粒子間でファージＥＬＩＳＡによりディスプレイ収率を比較した。タンパク質ＡＰＨおよびＪＮＫ２に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎをディスプレイするファージ粒子は、個々のｐＤＳＴファージミドからの産生の後に比較された。抗Ｍ１３抗体で定量された結合したファージ粒子の検出に基づいて、Ｓｅｃ依存性シグナル配列ＰｈｏＡｓｓに比較してＳＲＰ依存性シグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ、ＴｏｒＴｓｓ、ＴｏｌＢｓｓまたはＳｆｍＣｓｓ）で、７００倍までの増加したディスプレイ収率が観察された（図６）。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
実施例
材料
化学品は、Ｆｌｕｋａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのものであった。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素およびバッファーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）またはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）からのものであった。ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）からのものであった。すべてのクローニングおよびファージ増幅は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）からのE.coliＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて行った。
【００６９】
分子生物学
特記しない限り、すべての分子生物学方法は、説明されたプロトコールに従って行われた（Ausubel, F.M., Brent,R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Sedman, J.G., Smith, J.A. and Stuhl, K.eds., Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Weley and Sons,1998）。簡単なプロトコールは下記に示される。
【００７０】
ファージディスプレイ関連方法
特記しない限り、すべてのファージディスプレイ関連方法は、説明されたプロトコールに従って行われた（Clackson, T. and Lowman, H.B. eds., Phage Display A Practical Approach, New York: Oxford University Press, 2004; Barbas III, C.F., Burton, D.R., Scott, J.K.eds.,Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。簡単なプロトコールは下記に示される。
【００７１】
クローニング
ＤＡＲＰｉｎ３ａをコードするファージミドｐＡＫ１００の誘導体（Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H.R., and Pluckthun, A., J.Immunol. Methods 201, 35-55, 1997）は、ｐＤＳＴ２３と呼ばれる、この研究の最初のファージミドのクローニングのための出発点であった。
【００７２】
このｐＡＫ１００誘導体のシグナル配列を置換するために、オリゴヌクレオチドｏＤＳＴ４（配列番号５）、ｏＤＳＴ５（配列番号６）、ｏＤＳＴ６（配列番号７）およびｏＤＳＴ８（配列番号８）をデザインした。これらの４つのオリゴヌクレオチドは、E.coliＤｓｂＡシグナル配列をコードする。E.coliＤｓｂＡタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに見出されうる（アクセッションナンバーＰ２４９９１）。そのシグナル配列は、ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号１）である。オリゴヌクレオチドｏＤＳＴ４、ｏＤＳＴ５、ｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８をアニーリングしそしてＰＣＲによりオリゴヌクレオチドｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８を用いて増幅した。得られるＤＮＡフラグメントは、ＤｓｂＡシグナル配列をコードしており、そして制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより隣接されている。このＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化しそして、同様に処理されそして脱リン酸化されたｐＡＫ１００誘導体にライゲーションした。得られるファージミドｐＤＳＴ２３（図３）を単離しそして正しい配列をＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７３】
ＰｈｏＡのシグナル配列（配列番号９）をコードするファージミドとの直接実験比較を可能とするために、ｐＤＳＴ２２と呼ばれる第２ファージミドを生じさせた。再び、ｏＤＳＴ４ｐ（配列番号１０）、ｏＤＳＴ５ｐ（配列番号１１）、ｏＤＳＴ６（配列番号７）およびｏＤＳＴ８ｐ（配列番号１２）と呼ばれる４つのオリゴヌクレオチドをアニーリングしそしてＰＣＲによりｏＤＳＴ６およびｏＤＳＴ８ｐを用いて増幅した。得られるＤＮＡフラグメントは、ＰｈｏＡシグナル配列をコードしており、そして制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより隣接されている。このＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化しそして、同様に処理されそして脱リン酸化されたｐＤＳＴ２３にライゲーションした。得られるファージミドｐＤＳＴ２２を単離しそして正しい配列をＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７４】
この研究で使用した他のファージミドは表１に列挙されておりそして下記のとおりに得られた：関心のあるタンパク質のコード配列を適切なデザインされたＰＣＲプライマーおよびテンプレートＤＮＡ、例えば、調製されたｃＤＮＡもしくは公的に入手可能なプラスミドＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅した。それにより、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩ制限部位が、コード配列の各々の５‘側に導入され、そして２つの制限部位（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）はコード配列の各々の３’側に導入された。これらのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩIならびにＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩで消化し、次いで同様に処理されそして脱リン酸化されたファージミドｐＤＳＴ２３またはｐＤＳＴ２２にライゲーションした。クローニングされたＰＣＲ産物を含む融合ポリペプチドのための発現カセットのオープンリーディグフレームをすべての構築物について維持し、特にファージタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴｐ３）へのＣ末端融合のための正しいリーディングフレームを維持した。関心のあるクローニングされたタンパク質の最初のアミノ酸および最後のアミノ酸は表１に与えられ、そしてＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースについての参照ナンバーまたはアクセッションナンバーも与えられる。すべてのファージミドの正しい配列はＤＮＡ配列決定により証明された。
【００７５】
デザインされたアンキリンタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）３ａおよび２＿３について、 ＤｓｂＡｓｓおよびＰｈｏＡｓｓについて上記したのと同じクローニングストラテジーを使用して、ＰｅｌＢｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８０およびｐＤＳＴ８１）、ＳｆｍＣｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８６およびｐＤＳＴ８７）、ＴｏｌＢｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８４およびｐＤＳＴ８５）およびＴｏｒＴｓｓ（それぞれ、ｐＤＳＴ８８およびｐＤＳＴ８９）をコードするファージミドを生成した。
【００７６】
ファージ産生および精製
１％グルコース、３４μg／mlクロラムフェニコール（ｃａｍ）および１５μg／mlテトラサイクリン（ｔｅｔ）を含有する５ml ２×ＹＴ培地に、関心のあるファージミドを含んでいるE.coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅの単一コロニーを接種し、そして細胞を、振とうしながら３０℃で一夜成長させた。１％グルコース、３４μg／ml ｃａｍおよび１５μg／ml ｔｅｔを含有する新鮮な５ml ２×ＹＴ培地に、一夜培養物を１：１００の比で
【表５】
接種し、そして振とうしながら０．５のＯＤ６００となるまで３７℃で成長させた。培養物に１ml当たり４×１０１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）でＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージを感染させ（感染多重度〜２０）そして細胞を攪拌しないで３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで振とうしながら３７℃で３０分間インキュベーションした。遠心（３５００ｇ、２４℃、１０分）により細胞を回収し、そして３４μg／ml ｃａｍ、５０μg／mlカナマイシン（ｋａｎ）および０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する２×ＹＴ培地５０ml中にペレットを再懸濁させることにより、培地を変えた。振とうしながらの３０℃で１４〜１６時間の成長の後に、細胞を遠心（５６００ｇ、４℃、１０分）により除去した。培養上清を１／４容積の氷冷ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）と１時間氷上でインキュベーションした。次いで沈殿したファージ粒子を遠心（５６００ｇ、４℃、１５分）により集めそしてＴＢＳ１５０（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１ml中に再溶解した。ファージ粒子の更なる精製を、下記のとおりＣｓＣｌ勾配遠心により行った。ＣｓＣｌ １．６ｇの添加後に、ＴＢＳ１５０により容積を４mlに調節した。ＣｓＣｌ溶液を１／２×１／２インチポリアロマーチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，ＵＳＡ，Ｎｏ３５８９８０）に移し、そして４℃でＴＬＮ−１００ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において１０００００r.p.m.で４時間遠心した。遠心の後に、ファージバンドを回収した。ファージを１／２×２インチのポリカーボネートチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，ＵＳＡ，Ｎｏ３４９６２２）に移し、これにＴＢＳ１５０を充填して３mlとした。４℃でＴＬＡ−１００．３ロータにおいて５００００r.p.m.で１時間遠心した後、ペレット化されたファージを３mlＴＢＳ中に再溶解した。４℃でＴＬＮ−１００．３ロータにおいて５０，０００r.p.m.で１時間追加の遠心をした後、ファージを１mlＴＢＳ中に溶解した。ファージ粒子の総濃度を分光光度法により定量した。ファージサンプルの感染力価は、１％グルコースおよび３４μg／ml ｃａｍを含有する２×ＹＴ寒天プレートを使用してE.coli ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞でのタイトレーションにより決定した。３７℃で一夜インキュベーション後に、コロニーを計数した。
【００７７】
ファージブロット
ＣｓＣｌ勾配により精製された５×１０11個のファージ粒子を、還元条件下に１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、そしてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）にエレクトロブロッティングにより移した。この膜をＭＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％脱脂乳）により室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングし、そしてｐＩＩＩのＣ末端ドメインを認識する一次抗体としてのマウス抗ｐＩＩＩ抗体（ＭｏＭｉＴｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＮＯ．ＰＳＫＡＮ３）とインキュベーションした（ＭＴＴＢＳ150中１：１０００、ＲＴで２０分）。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ，Ｎｏ．３１４３８）を二次抗体として使用した（ＭＴＴＢＳ150中１：１００００、ＲＴで１時間）。タンパク質をＣｈｅｍｉＧｌｏｗ Ｗｅｓｔ基質（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）により検出した。
【００７８】
第２の実験では、ブロッキングされた膜を、一次抗体としてのマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ１抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｎｏ．Ｆ３０４０）とインキュベーションした（ＭＴＴＢＳ150中１：５０００、ＲＴで１時間）。ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｎｏ．Ａ３５６２）を二次抗体として使用した（ＭＴＴＢＳ150中１：１００００、ＲＴで１時間）。タンパク質を基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により検出した。
【００７９】
ファージＥＬＩＳＡ
ファージＥＬＩＳＡを行って、Ｍ１３ファージ粒子上の機能的にディスプレイされたＤＡＲＰｉｎの量をアッセイした。ビオチン化されたＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質（Binz et al., loc. cit）を下記のとおりに固定化した：ＴＢＳ150中のＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（６６nM、１００μl／ウエル；Ｓｏｃｏｃｈｉｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４℃での一夜インキュベーションによりＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｎｏ．４４２４０４）上に固定化した。ウエルを室温で１時間３００μl ＢＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）でブロッキングした。ＢＴＴＢＳ150中のビオチン化ＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質（１００μl、１μM）の結合を４℃で１時間行った。
【００８０】
ＢＴＴＢＳ150中のファージ粒子の希釈シリーズをウエルに加えそして２時間ＲＴでインキュベーションした。ウエルを３００μl ＴＴＢＳ150（ＴＢＳ150、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間５回洗浄した後、結合したファージ粒子を、抗Ｍ１３セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ，Ｎｏ．２７−９４２１−０１）および可溶性ＢＭ ＢｌｕｅＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｎｏ．１４８４２８１）により検出した。
【００８１】
ファージパニング
それぞれ、ＰｈｏＡシグナル配列をコードするファージミド（ｐＤＳＴ３０、ｐＤＳＴ６５、ｐＤＳＴ２２、ｐＤＳＴ３４）またはＤｓｂＡシグナル配列をコードするファージミド（ｐＤＳＴ３２、ｐＤＳＴ６６、ｐＤＳＴ２３、ｐＤＳＴ３７）から、Ｅ３＿５、Ｅ３＿１９、３ａおよび２＿３をディスプレイするファージ粒子を産生した。これらのファージ粒子を使用して、ＰｈｏＡｓｓまたはＤｓｂＡｓｓをコードするファージミドから産生されたファージ粒子の混合物を調製した。結合していないＤＡＲＰｉｎ Ｅ３＿５およびＥ３＿１９をディスプレイしているファージ粒子の１：１混合物に、ターゲット特異的ＤＡＲＰｉｎ ３ａまたは２＿３をディスプレイしているファージ粒子を１：１０７希釈で加えた。ビオチン化ＡＰＨおよびＪＮＫ２タンパク質をファージＥＬＩＳＡについて記載のとおりにコーティングした。各ウエルに、０．１mlのファージ粒子混合物（１０13ｃｆｕ／ml）を０．１ml ＢＴＴＢＳ150に加え、そして２時間インキュベーションした。ＴＴＢＳ150による洗浄（第１選択サイクルで３回、第２サイクルで４回および追加のサイクルで５回）およびＴＢＳ150による洗浄（第１選択サイクルで３回、第２サイクルで４回および追加のサイクルで５回）後に、０．２ml溶離バッファー（０．２Mグリシン／ＨＣｌ、pH２．２）と約２２℃で１５分間インキュベーションし、次いで０．２ｍｌトリプシン（ＴＢＳ150中１０mg/ml）により３７℃で３０分間溶離することによって、ファージ粒子を溶離した。一緒にした溶離液（２M Ｔｒｉｓベース１０μlで中和された）を、対数成長しているE.coliＸＬ１−Ｂｌｕｅ ４mlの感染のために使用した。攪拌しないで３７℃で３０分および振とうしながら３７℃で３０分の後に、細胞を、１％グルコースおよび３４μg/ml ｃａｍおよび１５μg/ml ｔｅｔを含有する２×ＹＴ寒天プレート上に広げそして３７℃で一夜成長させた。細胞を、１％グルコース、１５％グリセロール、３４μg/ml ｃａｍおよび１５μg/ml ｔｅｔを含有する２×ＹＴを有するプレートから洗浄し、そして次のサイクルのパニングのためのファージ産生のために使用した。各パニングサイクルの後に、９〜１６の溶離されたファージ粒子のアイデンティティーを決定した。これは、これらのファージ粒子をE.coliに感染させることおよびクローン特異的プライマーを用いるＰＣＲによりコロニーをスクリーニングすることにより行われた。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】関心のあるポリペプチドの膜挿入およびディスプレイＮ末端（Ｎ）、Ｃ末端（Ｃ）、関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）；ｐＩＩＩのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）ｐＩＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴ）。 Ａ）繊維状ファージ粒子上の関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）のポリペプチドのディスプレイは、ペリプラズム（ｐｐ）への細胞膜（ｃｍ）を横切るＰＯＩのトランスロケーションを常に含む。たいてい、ＰＯＩは、コートタンパク質ＩＩＩ（ｐＩＩＩ）またはそのフラグメントを含む融合ポリペプチドとしてトランスロケーションされる。ｐＩＩＩは、２つのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）およびＣ末端ドメイン（ＣＴ）含む。この特定の例では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端ＰＯＩおよびＣ末端ＣＴからなる。融合ポリペプチドおよびｐＩＩＩは、トランスロケーション後に且つファージ粒子へのそれらの組み込みの前にＣＴ部分でＣ末端疎水性ストレッチにより細胞膜にアンカーされる。細胞質（ｃｐ）、外膜（ｏｍ）、細胞外空間（ｅｘ）。 Ｂ）Ａ）のｐｌｌｌおよび融合ポリペプチドをディスプレイする繊維状ファージ粒子の単純化された図。ｐｌｌｌのＮ末端ドメイン（Ｎ１、Ｎ２）およびＰＯＩは、ＣＴ部分を介してファージ粒子に組み込まれる。
【図２】グラム陰性菌の細胞膜を横切るポリペプチドのトランスロケーション。 グラム陰性菌のペリプラズム（ｐｐ）への細胞膜（ｃｍ）を横切るポリペプチドのトランスロケーションについて知られている３つの主要な経路の単純化された図。これらの経路は、ＳＲＰ経路、Ｓｅｃ経路およびＴａｔ経路である。ＳｅｃおよびＳＲＰ経路の両方とも、Ｓｅｃトランスロコン（ＳｅｃＴＲ）に頼っているが、これに対してＴａｔ経路は、Ｔａｔトランスロコン（ＴａｔＴＲ）に頼っている。ＳｅｃおよびＴａｔ経路の両方とも、ポリペプチドを翻訳後にトランスロケーションするが、これに対してＳＲＰ経路は、ポリペプチドを翻訳と同時にトランスロケーションする。ＳｅｃおよびＳＲＰ経路は、折りたたまれていない（ｕｆ）状態でタンパク質を前記膜を通して輸送するＳｅｃトランスロカーゼに収束する。対照的に、Ｔａｔトランスロコンは折りたたまれた（ｆ）タンパク質のみをトランスロケーションする。シグナル配列（ｓｓ）のアミノ酸組成は、これらの経路の１つへのプレプロテインのターゲティングを強く選ぶ。トランスロケーションの後に、シグナル配列は、ペプチダーゼによりプレプロテインから開裂除去される。ＳＲＰ経路は、５４kDaタンパク質ホモログおよび４．５Ｓ ＲＮＡからなるリボヌクレオタンパク質であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により媒介される。この経路では、ＳｅｃトランスロコンにプレプロテインをターゲティングするのはＳＲＰである。ＳＲＰはリボソーム（Ｒ）から現れる対応するシグナル配列を認識しそしてそれに結合し、リボソーム−新生鎖複合体をＳＲＰレセプター（ＳＲ）に送達し、次いでプレプロテインはＳｅｃトランスロコンを通じて翻訳と同時にトランスロケーションされる。従って、ポリペプチドの未熟な細胞質折りたたみの故にＳｅｃ経路と非適合性であるポリペプチドは、翻訳されている間にＳＲＰ経路により効率的にトランスロケーションされうる。（１）ＳＲＰはリボソームから現れる新生タンパク質の特に疎水性のシグナル配列に結合する。（２）ＳＲＰは、リボソーム新生鎖複合体をＳＲＰレセプターを介してＳｅｃトランスロコンに指向させ、そこで翻訳と同時のトランスロケーションが行われる。大部分のプレプロテインは、より少なく疎水性のシグナル配列を有し、そしてＳｅｃＢ依存性エキスポートを受ける。（３）新生ポリペプチドに対する一般的アフィニティーを有する細胞質ゾルシャペロンであるトリガー因子（ＴＦ）は、新生プレプロテインの成熟領域に結合し、そして翻訳が殆ど終了するまで有効に結合したままである。（４）ＴＦ解離に続いて、細胞質ゾル因子、例えばＳｅｃＢは、プレプロテインを伸張した折りたたまれていないコンホメーションに維持するのを助ける。（５）伸張したコンホメーションを保持するプレプロテインは、Ｓｅｃトランスロコンを通じて効率的に輸送される。（６）しかしながら、プレプロテインの折りたたみが細胞質において起るならば、このタンパク質は通常分解されるか（１０）またはＳｅｃトランスロコンをふさぐことすらありうる。ツインアルギニンモチーフを含有するシグナル配列を有するプレプロテインは、Ｔａｔトランスロコンに運命付けられている（destined）。（７）シャペロン（ＴＣ）、例えばＤｎａＫまたは他のＴａｔ特異的因子との会合は、多分折りたたみが完了するまでシグナル配列をシールドする（８）。この同じ因子または追加の因子は、正しい折りたたみを促進することもありうる。Ｔａｔトランスロケーションは、プレプロテインが正しく折りたたまれる場合にのみ進行し；そうでなければ、プレプロテインは細胞のタンパク質分解装置により分解される（９、１０）。
【図３】ｐＤＳＴファージミドベクターシリーズの模式図。 Ａ）ｐＤＳＴファージミドベクターシリーズの発現カセットの拡大図である。この発現カセットは、E.coliのｌａｃＺ遺伝子のプロモーター／オペレーターエレメント（ｌａｃＺｐ／ｏ）、リボソーム結合部位（示されていない）、シグナル配列（ｓｓ）およびディスプレイされるべき関心のあるポリペプチド（ＰＯＩ）のためのコード配列、サプレッサーストップコドン（ＴＡＧ）、可動性グリシン／セリンリンカー（Ｇ／Ｓ）およびファージ粒子への融合ポリペプチドの組み込みを媒介する繊維状ファージのタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメイン（アミノ酸２５０〜４０６）（ＣＴｐＩＩＩ）のためのコード配列、２つのストップコドン（ＴＧＡＴＡＡ、示されていない）および転写ターミネーターエレメント（示されていない）を含む。ＰＯＩのコード配列は、Ｆｌａｇタグ（Ｆｌａｇ）およびｃｍｙｃタグ（ｃ−ｍｙｃ）をコードするＤＮＡ配列により隣接されている。ＳＲＰ経路をターゲティングするシグナル配列を代表するものとしてのＤｓｂＡシグナル配列（ＤｓｂＡｓｓ）およびＳｅｃ経路をターゲティングするシグナル配列を代表するものとしてのＰｈｏＡシグナル配列（ＰｈｏＡｓｓ）のための一文字アミノ酸配列が示される。これらのシグナル配列は、正に帯電したＮ末端領域（ｎ領域）、非極性疎水性コア（ｈ領域）およびより極性の高いＣ末端領域（ｃ領域）を含有する。 Ｂ）ファージミドｐＤＳＴ２３の模式図。Ａ）に示されたエレメントに加えて、繊維状ファージ複製起点（Ｆｆ ｏｒｉ）、ｌａｃＺｐ／ｏの厳重なコントロールのために必要なｌａｃリプレッサーを産生するE.coliからのｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃｌ）、ベクターのバクテリア複製のためのＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、クロラムフェニコール耐性を媒介するクロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼをコードする抗生物質耐性遺伝子（ｃａｔ）および制限部位ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩが示される。ｐＤＳＴ２３においてコードされたＰＯＩは、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）３ａである。
【図４】ウエスタンブロット分析によるディスプレイ収率比較 Ａ）およびＢ）それぞれのファージミドの使用により産生されたＣｓＣｌ精製されたファージ粒子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、そしてタンパク質ＩＩＩのＣ末端ドメインに特異的な抗体（抗ｐＩＩＩ）またはＦｌａｇタグに対して特異的な抗体（抗ＦｌａｇＭ１）により検出した。１レーン当たりに適用されたアリコートは標準化されておりそして５×１０１１個のファージ粒子に相当している。種々のポリペプチドについてファージ粒子上のディスプレイ収率を分析する。ポリペプチドの略称は、レーンの上部に示されそして表１に列挙されたポリペプチドを指す。さらに、表１は、ファージ粒子を産生するために使用された対応するファージミドを示しそして発現カセットの略図は、図３Ａに示される。ＰｈｏＡシグナル配列（「ｐ」と表示されたレーン）またはＤｓｂＡシグナル配列（「ｄ」と表示されたレーン）を使用して、それぞれ、Ｓｅｃ経路またはＳＲＰ経路による対応する融合ポリペプチドをトランスロケーションして、各ポリペプチドについてディスプレイ収率を比較した。より強いバンドは、より高いディスプレイ収率を示す。kDaで示されたマーカータンパク質の分子量は、ブロットの両側に示される。抗ｐＩＩＩブロットにおける６２kDaでのバンドは、ｐＩＩＩ野生型タンパク質に対応する。
【図５】ＥＬＩＳＡ分析によるディスプレイ収率比較 ２＿３と呼ばれるｃＪｕｎＮ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２）結合ＤＡＲＰｉｎ（白記号）または３ａと呼ばれるアミノグリコシドキナーゼＡＰＨ（３’）−ＩＩＩａ（ＡＰＨ）結合ＤＡＲＰｉｎ（黒記号）をディスプレイするファージ粒子を、それぞれ固定化されたビオチン化ＪＮＫ２またはＡＰＨタンパク質を含有する、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコーティングされそしてＢＳＡでブロックされたウエルにおいてインキュベーションした。洗浄の後に、結合したファージ粒子は、セイヨウワサビペルオキシダーゼにカップリングされた抗Ｍ１３抗体で検出されそして可溶性ＢＭ ＢｌｕｅＰＯＤ基質で可視化された。プロットされたデータは、ｘ軸上の１ウエル当たりに適用されたファージ粒子（ｐｐ）の数に対する３９２ｎｍで測定されたバックグラウントを差し引いた後の３６０nmで測定されたｙ座標上の吸光度（Ａｂｓ）を示す。ＤｓｂＡシグナル配列コード化ファージミド変異体を使用して産生されたファージ粒子（三角形記号）は、１ウエル当たり約８×１０８個のファージで既に最大値の半分のシグナルを示したが、これに対してＰｈｏＡシグナル配列コード化変異体から産生されたファージ粒子（四角形記号）は、１ウエル当たり約２×１０１１個のファージ粒子でのみ最大値の半分のシグナルを示し、これは１００倍より多く低いディスプレイ収率を示す。従って、融合ポリペプチドのトランスロケーションのためのＤｓｂＡシグナル配列媒介ＳＲＰ経路の使用は、ＰｈｏＡシグナル配列媒介Ｓｅｃ経路を使用することに比較してディスプレイ収率を強く増加させた。
【図６】ＥＬＩＳＡ分析によるディスプレイ収率の定量 ＤＡＲＰｉｎ２＿３または３ａをディスプレイするファージ粒子を、図５について記載したとおりに分析した。結果は、ＰｈｏＡｓｓディスプレイ収率を１にセットして、棒グラフ（対数スケール）で示される。使用された各シグナル配列についてのディスプレイレベル（増加倍数）は、ＯＤ４５０＝０．５のシグナルを与えるＰｈｏＡｓｓ含有ファージ粒子の数に対して相対的なＯＤ４５０＝０．５のシグナルを与えるファージ粒子の数に対応する。ＰｅｌＢｓｓ：Erwinia carotovora ＰｅｌＢのシグナル配列（推定Ｓｅｃ依存性シグナル配列）。ＤｓｂＡｓｓの外に、E.coliタンパク質ＴｏｒＴのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＴｏｒＴｓｓ）、ＴｏｌＢのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＴｏｌＢｓｓ）およびＳｆｍＣのＳＲＰ依存性シグナル配列（ＳｆｍＣｓｓ）を試験した。Ｓｅｃ依存性ＰｈｏＡｓｓに比較して、ＳＲＰ依存性ＴｏｒＴｓｓで７００倍までの増加したディスプレイ収率が観察された。ＳＲＰ依存性ＴｏｌＢｓｓおよびＳｆｍＣｓｓは、３００倍までの増加したディスプレイ収率を与えた。推定Ｓｅｃ依存性ＰｅｌＢｓｓは、２〜６倍の増加したディスプレイ収率を示したにすぎない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡライブラリーによりコードされた関心のあるポリペプチドをファージ粒子上にディスプレイし、そして該関心のあるポリペプチドをグラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションさせる、繊維状ファージディスプレイ方法。
【請求項２】
翻訳と同時のトランスロケーションがシグナル認識粒子経路に基づいて達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドがリピートタンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）グラム陰性菌の細胞膜を横切る融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する繊維状ファージもしくはファージミドベクターを構築する工程；
（ｂ）関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーを工程（ａ）のベクターの発現カセットにクローニングすることによりファージまたはファージミドベクターのコンビナトリアルライブラリーを構築する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のベクターのライブラリーにより適当なグラム陰性菌をトランスフォーメーションする工程；および
（ｄ）ファージディスプレイ選択サイクルを行って、ディスプレイされた関心のあるポリペプチドの性質に基づいてファージ粒子を分離する工程、
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ファージ粒子上にディスプレイされた関心のあるポリペプチドを、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列を使用して、グラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションさせる、繊維状ファージディスプレイ方法。
【請求項９】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチド、およびＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクター。
【請求項１１】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
融合タンパク質の各々がＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列およびファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドを含み、関心のあるポリペプチドの各々がＤＮＡライブラリーのメンバーによりコードされている、融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクターのライブラリー。
【請求項１３】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれる、請求項１２に記載のベクターのライブラリー。
【請求項１４】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項１２に記載のベクターのライブラリー。
【請求項１５】
関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーが、リピートタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーである、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターのライブラリー。
【請求項１】
ＤＮＡライブラリーによりコードされた関心のあるポリペプチドをファージ粒子上にディスプレイし、そして該関心のあるポリペプチドをグラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションさせる、繊維状ファージディスプレイ方法。
【請求項２】
翻訳と同時のトランスロケーションがシグナル認識粒子経路に基づいて達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドのトランスロケーションのために使用されるシグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドがリピートタンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ａ）グラム陰性菌の細胞膜を横切る融合ポリペプチドの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するＮ末端シグナル配列を有する融合ポリペプチドのための発現カセットを含有する繊維状ファージもしくはファージミドベクターを構築する工程；
（ｂ）関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーを工程（ａ）のベクターの発現カセットにクローニングすることによりファージまたはファージミドベクターのコンビナトリアルライブラリーを構築する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のベクターのライブラリーにより適当なグラム陰性菌をトランスフォーメーションする工程；および
（ｄ）ファージディスプレイ選択サイクルを行って、ディスプレイされた関心のあるポリペプチドの性質に基づいてファージ粒子を分離する工程、
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ファージ粒子上にディスプレイされた関心のあるポリペプチドを、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列を使用して、グラム陰性菌の細胞膜を横切って翻訳と同時にトランスロケーションさせる、繊維状ファージディスプレイ方法。
【請求項９】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチド、およびＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれるシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクター。
【請求項１１】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
融合タンパク質の各々がＴｒｘＡの翻訳と同時のトランスロケーションを促進するシグナル配列およびファージ粒子上にディスプレイされるべき関心のあるポリペプチドを含み、関心のあるポリペプチドの各々がＤＮＡライブラリーのメンバーによりコードされている、融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むファージまたはファージミドベクターのライブラリー。
【請求項１３】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＦｏｃＣ、ＣｃｍＨ、ＹｒａＩ、ＴｏｌＢ、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩおよびＤｓｂＡのシグナル配列およびそのホモログからなる群より選ばれる、請求項１２に記載のベクターのライブラリー。
【請求項１４】
シグナル配列が、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢおよびＤｓｂＡのシグナル配列からなる群より選ばれる、請求項１２に記載のベクターのライブラリー。
【請求項１５】
関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーが、リピートタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーである、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクターのライブラリー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５０００２７（Ｐ２００９−５０００２７Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９９１３（Ｐ２００８−５１９９１３）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３７２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００６６６５
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０７３２４６８１）ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＺＵＲＩＣＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３７２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００６６６５
【国際公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【出願人】（５０７３２４６８１）ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＺＵＲＩＣＨ
【Ｆターム（参考）】
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