血管再狹窄予防薬及び予防具
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）を主とする血管形成術後の血管再狹窄、又は冠動脈パイパス手術後の再狹窄を予防する薬品及び予防具に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】一般に経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）は虚血性心疾患（狭心症，心筋梗塞）患者の重要な治療法としてその有用性は広く認められている。しかし、ＰＴＣＡ後に３０〜５０％の割合で再狹窄が生じることが、医学的にも医療費の面でも大きな課題となっている。現在、種々の薬剤や遺伝子導入等の試みがなされているが、未だ有効な予防法がないのが現状である。最近、キチン，キトサンを高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に経口投与すると降圧効果が認められると共に、コレステロール低下作用もあることが明らかにされつつある。そこで、本発明はキトサン又はＮ−アセチルキトサンがヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖や蛋白合成を抑制するか否か、また、血小板凝集能に対する効果等を検討し、この検討に基づきＰＴＣＡを中心とする血管形成術の再狹窄予防薬及び予防のための新デバイス（予防具）を提供せんとするものである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するための本発明の予防薬は、第１にキトサン又はＮ−アセチルキトサンを主成分とする液状又はゲル状物質からなることを特徴としている。
【０００４】第２に主成分が低分子キトサン溶液であることを特徴としている。
【０００５】第３に主成分が高分子キトサンを分解酵素により低分子化した低分子キトサン溶液であることを特徴としている。
【０００６】また本発明の予防具は、第１に少なくとも表面がゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンにより形成固化されたパイプ１からなることを特徴としている。
【０００７】第２に樹脂，金属又はセラミックからなるパイプ状の芯材１ａの表面にゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンで被覆して予防皮膜１ｂを形成してなることを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
I．血管再狹窄の要因に対する予防実験の種類虚血性心疾患に対するＰＴＣＡ治療後の再狹窄の要因として発明者等は、一般に考えられている術後の治療部位における冠動脈平滑筋細胞の増殖，細胞接着，細胞周期，血小板凝集作用，血管肥厚等のほかに血管細胞の蛋白合成能，合成蛋白量，細胞遊走能も深い関係があるものと考えられており、この発明の実施形態においてはできるだけこれらの要因に対する個別のモデル実験とその実験における再狹窄要因の抑制効果を確認することとする。尚、以下の実験及び計測等はいずれも島根医科大学医学部附属実験施設において行われたものである。
【０００９】II．実施に使用するキトサンの種類及び内容本発明は既述のように動物実験でのキチン，キトサンの血圧の降圧作用やコレステロール抑制作用に着目してこれを血管再狹窄の予防に応用するものである。このため本発明の実施に際して使用したキトサンについて予め説明するが、特に以下の実施例では、高濃度低分子キトサン溶液と高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルを用いたので、これらの具体例について詳述する。なおキトサンは一般に分子量２０，０００を目安としてそれ以上のものが高分子、以下のものが低分子と解されている。
【００１０】１．高濃度低分子キトサン溶液このキトサンは図１に示すような方法で製造され、高分子キトサン（粉末）を水に対して１１．１％添加して撹拌混合し、キトサンを低分子化するための分解酵素（後述）粉末を重量比で約０．０５％添加撹拌する。次いで上記混合液にキトサンを溶解させるための加水分解反応促進剤として酢酸（乳酸その他の有機酸でも可）を約３％比で添加撹拌した後、再度上記分解酵素を０．０５％位添加して撹拌する。上記混合液を約３０％前後で概ね２１時間前後反応させてキトサンの低分子化を実現した後、これを濾過してその濾過液から高濃度低分子キトサン溶液を得る。また該溶液を脱水して粉末状のキトサンを得ることができ、この粉末状のキトサンに水を加えて低分子キトサン溶液を作ることも可能であり且つこの溶液を上記濾過液と同様に使用することができる。
【００１１】上記分解酵素は例えば特公平６−６０号公報中に示されるように、本発明者等が発見した微生物エントロバクター・Ｇ−１（微工研条寄第３１４０号）によってキチンを分解して得られるもので、約９０％のキチナーゼ，７〜８％のキトサナーゼ，微量のキチン脱アセチラーゼ等からなり、高分子キトサンを低分子化するものである。この酵素を用いて高分子キトサンを低分子化する方法は、従来のＨｃｌ等による化学的薬剤処理に比して危険性がなく且つ環境汚染をもたらす廃液の排出が避けられ、人体その他の生物に対する安全性も高いという利点がある。なお上記方法による高濃度低分子キトサンの成分及び性状は表１に示す通りである。
【００１２】表１
【００１３】２．高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルこのキトサンとしては図２に示す方法によって製造したものを用いた。即ち、図示するように濃度２％の酢酸（乳酸その他の有機酸でも可）溶液１００ｍｌに０．８ｇの高分子キトサンを添加撹拌した後、上記溶媒液の２倍の量のメタノールを投入後再撹拌し、次いで無水酢酸（脂肪酸その他用途等に応じその他の酸でも可）を２〜３％程度加えることによりゲル化させる。
【００１４】続いて上記工程で添加した酢酸，メタノール，無水酢酸等を除去するために流水中に約２４時間前後透析した後、最終的には蒸留水中で透析し、所定形状に整型することによりＮ−アセチルキトサンゲルとして完成する。なおこのＮ−アセチルキトサンゲルを後述するデバイス（予防具）として成形方法によって完成させるには所望の形状に成形後、さらに３０℃前後の温度下で４〜６時間乾燥させ、あるいはさらに切削その他の成形加工を行う。
【００１５】なお図２に示す工程中無水酢酸の添加に際し、下記ａ．〜ｅ．に示す基の試薬を添加するが、このことは次に示すキトサン（グルコサミン）の化学構造式１．中のＲ部分にａ．〜ｅ．を導入することを意味し、これをキトサンのＮ−アシル化と称する。また本実施例ではＲとして下記ａを導入した。
【００１６】化１
【００１７】
Ｒ＝ ａ． ＣＯ３ アセチル基ｂ． ＣＨ２ＣＨ３ プロピオニル基ｃ． （ＣＨ２）２ＣＨ３ ブチノイル基ｄ． （ＣＨ２）６ＣＨ３ ヘキサノイル基ｅ． （ＣＨ２）８ＣＨ３ オクタノイル基（注）ａ．〜ｃ．は分解の容易な順に並べられており、ｄ．は非分解性を、またｅ．は抗血栓性を備えている。
【００１８】III．血管再狹窄の要因に対する予防実験の内容と結果血管再狹窄の要因として前述のI．で述べたものが挙げられるが、このうち下記１．〜７．の実験内容と結果につき以下説明する。なお下記実験中１〜３，５，６，７は「キトサン」として高濃度低分子キトサン溶液を、４は高分子Ｎ−アセチルキトサン（ゲル）を用いた。
【００１９】１．増殖抑制効果の確認：まずヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％の牛の胎児の血清（ＦＣＳ）含有細胞培養液（ＤＭＥＭ）に浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、キトサンを種々の濃度加え、２日間培養し、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（サイミジン）（３Ｈ−Ｔｄｒ）を加え、その取り込み量（核酸形成の有無）で評価した。
【００２０】２．３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ（プロリン）の取り込みに対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、キトサンを種々の濃度を加え、５日間培養し、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅを加え、その取り込み量（蛋白合成の有無）で評価した。
【００２１】３．蛋白合成に対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２０万／ｄｉｓｈの割合で径６０ｍｍのディッシュ（ｄｉｓｈ）に分注する。１日後、キトサンを種々の濃度を加え、６日間培養する。（マイナスイオン干渉液）ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞を回収し、蛋白量をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法にて測定した。
【００２２】［１．〜３．に対する結果］キトサンは表２に示すように、用量依存性にヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖、３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ取り込み（コラーゲン合成の指標）、総蛋白量をそれぞれ顕著に抑制した（結果は％抑制率で表示）。
【００２３】表２
【００２４】４．細胞接着に対する効果の確認：円形に作製したＮ−アセチルキトサンゲルを２４−ｗｅｌｌプレートに挿入し、その上にヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、倒立顕微鏡で写真撮影し、接着細胞密度を見た。
【００２５】［結果］図３（Ａ），（Ｂ）に示すように（Ａ）のコントロール区に比して（Ｂ）のＮ−アセチルキトサンゲル上の平滑筋細胞は接着密度が極めて低いことが明らかであり、細胞接着が強力に抑制されている。
【００２６】５．細胞周期に対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２５万／ｗｅｌｌの割合で径５０ｍｍのディッシュに分注する。２４時間後にキトサン溶液を加え、更に３日間培養する。プロビジウムイオダイドを発光試薬（マーカー）として用い、フローサイトメトリー法で細胞周期に対する効果を測定した。
【００２７】［結果］表３に示すようにキトサンは用量依存性にＧ２＋Ｍ期の細胞をＧ０／Ｇ１期に移行させており、周期は初期段階で長くなり、終期段階で短くなっている事が明らかである。
【００２８】表３
【００２９】６．血小板凝集能に対する効果の確認：ラット血小板（２５万個）のアデノ２隣酸＝凝集促進剤（ＡＤＰ）刺激に対する血小板凝集抑制作用を測定した。
【００３０】［結果］図４，図５はキトサン濃度変化及びＡＤＰ量の変化に対する血小板の凝集能の変化を表しており、両図から明らかなようにキトサンは用量依存性にＡＤＰ刺激（誘導）によるラット血小板凝集を抑制していることが顕著である。
【００３１】７．細胞遊走能に対する効果の確認：実験には発明者等が独自に開発した細胞遊走能測定ディッシュにヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、キトサンによる遊走能抑制作用を確認した。
【００３２】即ち、径５０ｍｍのディッシュの中央を直径６ｍｍの円形のシリコンにてシールしておき、その回りに細胞を培養し、７日後にシリコンを剥離し、同時に培養液中にキトサンを加え、さらに５日間培養後円形の辺縁より中心に向かって遊走する細胞の遊走距離を顕微鏡による無処理区との比較観察をした。
【００３３】［結果］上記観察の結果、ヒト冠動脈平滑筋細胞の遊走能に対し、キトサンは用量依存的な顕著な抑制効果を示した。
【００３４】ちなみに、従来ＰＴＣＡ及び冠動脈バイパス手術後等の血管再狹窄要因については、細胞増殖能のみが主な対象と考えられてきたが、本発明においては、他の要因として細胞遊走能やコラーゲン（蛋白）産生能を考慮した。しかも遊走能に関しては上述した特殊なディッシュを考案して実験に用いた結果、従来平滑筋細胞の遊走や増殖を抑制すると考えられてきた他の薬剤（例えばＣａ拮抗剤やＡＣＥ阻害剤）でもその有効性が認められなかったにもかかわらず、キトサンにより上述のように顕著な効果が確認できた意義は大きいものと考えられる。
【００３５】上記の実験によりキトサンを血管再狹窄の有効な予防薬として使用できることが明らかであり、またキトサンが外科手術用の糸や人工皮膚等に利用されている点から生体に対する安全性はまず問題ないものと解される。
【００３６】また上記キトサンを血管再狹窄の予防薬として使用するには、従来から動物実験によって確認されている経口投与の方法により、あるいは低分子キトサン溶液を用いる場合は患部への集中投与若しくは生体内への静脈注射による治療が可能である。
【００３７】IV．予防用具（デバイス）の実施形態本発明においてはキトサン（高分子Ｎ−アセチルキトサンゲル）を用いて血管を接続し又はその内部に挿入して血管の再狹窄を予防する器具を提案し、以下その内容につき詳述する。この予防具は、図６（Ａ）に示すようにＮ−アセチルキトサンゲルを治療すべき部位の血管の内径に対応した外径の円筒状のパイプ１を形成し、これを乾燥固化することによって製造することができる。パイプ１はＮ−アセチルキトサンゲルを予め型に充填して形成する方法のほか、棒状に形成乾燥したものを切削及び研摩等の加工により管状に仕上げる方法によることも可能である。
【００３８】また予め合成樹脂又は天然樹脂や金属，セラミック等によって薄肉のパイプ状の芯材１ａを形成し、該芯材１ａの内周，外周及び端面等にゲル状のキトサンを塗布又はコーティングして予防皮膜１ｂを付着乾燥させ仕上げ加工することによって形成することもできる。
【００３９】
【発明の効果】以上のように構成される本発明の予防薬は、ヒトの血管を構成する平滑筋細胞の増殖，蛋白質の合成及び増加，血小板の凝集作用及びヒトの血管細胞の遊走能を抑制するほか、細胞の分裂を抑制することにより、ヒトの血管のＰＴＣＡ後の再狹窄、又は冠動脈バイパス手術後の再狹窄を予防する。
【００４０】また本発明の予防具を用いてＰＴＣＡを行った場合、キトサンの作用により治療部位の血管の再狹窄を予防するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】低分子キトサン溶液の製造工程図である。
【図２】高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルの製造工程図である。
【図３】（Ａ），（Ｂ）はコントロール区とＮ−アセチルキトサンゲル製のプレート上へのヒトの冠動脈平滑筋細胞の接着密度の違いを表す顕微鏡写真図である。
【図４】ラット血小板のＡＤＰ誘導に対するキトサン溶液の濃度変化と血小板凝集抑制作用を表すグラフである。
【図５】ラット血小板のＡＤＰ誘導に対するキトサン溶液のＡＤＰ量に応じた血小板凝集抑制作用の変化を表すグラフである。
【図６】（Ａ），（Ｂ）は本発明の予防具の異なる２つの実施例を示す一部断面図である。
【符号の説明】
１ パイプ
１ａ 芯材
１ｂ 予防皮膜
【表１】
【化１】
【表２】
【表３】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）を主とする血管形成術後の血管再狹窄、又は冠動脈パイパス手術後の再狹窄を予防する薬品及び予防具に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】一般に経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）は虚血性心疾患（狭心症，心筋梗塞）患者の重要な治療法としてその有用性は広く認められている。しかし、ＰＴＣＡ後に３０〜５０％の割合で再狹窄が生じることが、医学的にも医療費の面でも大きな課題となっている。現在、種々の薬剤や遺伝子導入等の試みがなされているが、未だ有効な予防法がないのが現状である。最近、キチン，キトサンを高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に経口投与すると降圧効果が認められると共に、コレステロール低下作用もあることが明らかにされつつある。そこで、本発明はキトサン又はＮ−アセチルキトサンがヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖や蛋白合成を抑制するか否か、また、血小板凝集能に対する効果等を検討し、この検討に基づきＰＴＣＡを中心とする血管形成術の再狹窄予防薬及び予防のための新デバイス（予防具）を提供せんとするものである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するための本発明の予防薬は、第１にキトサン又はＮ−アセチルキトサンを主成分とする液状又はゲル状物質からなることを特徴としている。
【０００４】第２に主成分が低分子キトサン溶液であることを特徴としている。
【０００５】第３に主成分が高分子キトサンを分解酵素により低分子化した低分子キトサン溶液であることを特徴としている。
【０００６】また本発明の予防具は、第１に少なくとも表面がゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンにより形成固化されたパイプ１からなることを特徴としている。
【０００７】第２に樹脂，金属又はセラミックからなるパイプ状の芯材１ａの表面にゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンで被覆して予防皮膜１ｂを形成してなることを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
I．血管再狹窄の要因に対する予防実験の種類虚血性心疾患に対するＰＴＣＡ治療後の再狹窄の要因として発明者等は、一般に考えられている術後の治療部位における冠動脈平滑筋細胞の増殖，細胞接着，細胞周期，血小板凝集作用，血管肥厚等のほかに血管細胞の蛋白合成能，合成蛋白量，細胞遊走能も深い関係があるものと考えられており、この発明の実施形態においてはできるだけこれらの要因に対する個別のモデル実験とその実験における再狹窄要因の抑制効果を確認することとする。尚、以下の実験及び計測等はいずれも島根医科大学医学部附属実験施設において行われたものである。
【０００９】II．実施に使用するキトサンの種類及び内容本発明は既述のように動物実験でのキチン，キトサンの血圧の降圧作用やコレステロール抑制作用に着目してこれを血管再狹窄の予防に応用するものである。このため本発明の実施に際して使用したキトサンについて予め説明するが、特に以下の実施例では、高濃度低分子キトサン溶液と高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルを用いたので、これらの具体例について詳述する。なおキトサンは一般に分子量２０，０００を目安としてそれ以上のものが高分子、以下のものが低分子と解されている。
【００１０】１．高濃度低分子キトサン溶液このキトサンは図１に示すような方法で製造され、高分子キトサン（粉末）を水に対して１１．１％添加して撹拌混合し、キトサンを低分子化するための分解酵素（後述）粉末を重量比で約０．０５％添加撹拌する。次いで上記混合液にキトサンを溶解させるための加水分解反応促進剤として酢酸（乳酸その他の有機酸でも可）を約３％比で添加撹拌した後、再度上記分解酵素を０．０５％位添加して撹拌する。上記混合液を約３０％前後で概ね２１時間前後反応させてキトサンの低分子化を実現した後、これを濾過してその濾過液から高濃度低分子キトサン溶液を得る。また該溶液を脱水して粉末状のキトサンを得ることができ、この粉末状のキトサンに水を加えて低分子キトサン溶液を作ることも可能であり且つこの溶液を上記濾過液と同様に使用することができる。
【００１１】上記分解酵素は例えば特公平６−６０号公報中に示されるように、本発明者等が発見した微生物エントロバクター・Ｇ−１（微工研条寄第３１４０号）によってキチンを分解して得られるもので、約９０％のキチナーゼ，７〜８％のキトサナーゼ，微量のキチン脱アセチラーゼ等からなり、高分子キトサンを低分子化するものである。この酵素を用いて高分子キトサンを低分子化する方法は、従来のＨｃｌ等による化学的薬剤処理に比して危険性がなく且つ環境汚染をもたらす廃液の排出が避けられ、人体その他の生物に対する安全性も高いという利点がある。なお上記方法による高濃度低分子キトサンの成分及び性状は表１に示す通りである。
【００１２】表１
【００１３】２．高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルこのキトサンとしては図２に示す方法によって製造したものを用いた。即ち、図示するように濃度２％の酢酸（乳酸その他の有機酸でも可）溶液１００ｍｌに０．８ｇの高分子キトサンを添加撹拌した後、上記溶媒液の２倍の量のメタノールを投入後再撹拌し、次いで無水酢酸（脂肪酸その他用途等に応じその他の酸でも可）を２〜３％程度加えることによりゲル化させる。
【００１４】続いて上記工程で添加した酢酸，メタノール，無水酢酸等を除去するために流水中に約２４時間前後透析した後、最終的には蒸留水中で透析し、所定形状に整型することによりＮ−アセチルキトサンゲルとして完成する。なおこのＮ−アセチルキトサンゲルを後述するデバイス（予防具）として成形方法によって完成させるには所望の形状に成形後、さらに３０℃前後の温度下で４〜６時間乾燥させ、あるいはさらに切削その他の成形加工を行う。
【００１５】なお図２に示す工程中無水酢酸の添加に際し、下記ａ．〜ｅ．に示す基の試薬を添加するが、このことは次に示すキトサン（グルコサミン）の化学構造式１．中のＲ部分にａ．〜ｅ．を導入することを意味し、これをキトサンのＮ−アシル化と称する。また本実施例ではＲとして下記ａを導入した。
【００１６】化１
【００１７】
Ｒ＝ ａ． ＣＯ３ アセチル基ｂ． ＣＨ２ＣＨ３ プロピオニル基ｃ． （ＣＨ２）２ＣＨ３ ブチノイル基ｄ． （ＣＨ２）６ＣＨ３ ヘキサノイル基ｅ． （ＣＨ２）８ＣＨ３ オクタノイル基（注）ａ．〜ｃ．は分解の容易な順に並べられており、ｄ．は非分解性を、またｅ．は抗血栓性を備えている。
【００１８】III．血管再狹窄の要因に対する予防実験の内容と結果血管再狹窄の要因として前述のI．で述べたものが挙げられるが、このうち下記１．〜７．の実験内容と結果につき以下説明する。なお下記実験中１〜３，５，６，７は「キトサン」として高濃度低分子キトサン溶液を、４は高分子Ｎ−アセチルキトサン（ゲル）を用いた。
【００１９】１．増殖抑制効果の確認：まずヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％の牛の胎児の血清（ＦＣＳ）含有細胞培養液（ＤＭＥＭ）に浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、キトサンを種々の濃度加え、２日間培養し、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（サイミジン）（３Ｈ−Ｔｄｒ）を加え、その取り込み量（核酸形成の有無）で評価した。
【００２０】２．３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ（プロリン）の取り込みに対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、キトサンを種々の濃度を加え、５日間培養し、１μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅを加え、その取り込み量（蛋白合成の有無）で評価した。
【００２１】３．蛋白合成に対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２０万／ｄｉｓｈの割合で径６０ｍｍのディッシュ（ｄｉｓｈ）に分注する。１日後、キトサンを種々の濃度を加え、６日間培養する。（マイナスイオン干渉液）ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞を回収し、蛋白量をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法にて測定した。
【００２２】［１．〜３．に対する結果］キトサンは表２に示すように、用量依存性にヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖、３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ取り込み（コラーゲン合成の指標）、総蛋白量をそれぞれ顕著に抑制した（結果は％抑制率で表示）。
【００２３】表２
【００２４】４．細胞接着に対する効果の確認：円形に作製したＮ−アセチルキトサンゲルを２４−ｗｅｌｌプレートに挿入し、その上にヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２万／ｗｅｌｌの割合で２４−ｗｅｌｌプレートに分注する。１日後、倒立顕微鏡で写真撮影し、接着細胞密度を見た。
【００２５】［結果］図３（Ａ），（Ｂ）に示すように（Ａ）のコントロール区に比して（Ｂ）のＮ−アセチルキトサンゲル上の平滑筋細胞は接着密度が極めて低いことが明らかであり、細胞接着が強力に抑制されている。
【００２６】５．細胞周期に対する効果の確認：ヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、２５万／ｗｅｌｌの割合で径５０ｍｍのディッシュに分注する。２４時間後にキトサン溶液を加え、更に３日間培養する。プロビジウムイオダイドを発光試薬（マーカー）として用い、フローサイトメトリー法で細胞周期に対する効果を測定した。
【００２７】［結果］表３に示すようにキトサンは用量依存性にＧ２＋Ｍ期の細胞をＧ０／Ｇ１期に移行させており、周期は初期段階で長くなり、終期段階で短くなっている事が明らかである。
【００２８】表３
【００２９】６．血小板凝集能に対する効果の確認：ラット血小板（２５万個）のアデノ２隣酸＝凝集促進剤（ＡＤＰ）刺激に対する血小板凝集抑制作用を測定した。
【００３０】［結果］図４，図５はキトサン濃度変化及びＡＤＰ量の変化に対する血小板の凝集能の変化を表しており、両図から明らかなようにキトサンは用量依存性にＡＤＰ刺激（誘導）によるラット血小板凝集を抑制していることが顕著である。
【００３１】７．細胞遊走能に対する効果の確認：実験には発明者等が独自に開発した細胞遊走能測定ディッシュにヒト冠動脈平滑筋細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに浮遊させ、キトサンによる遊走能抑制作用を確認した。
【００３２】即ち、径５０ｍｍのディッシュの中央を直径６ｍｍの円形のシリコンにてシールしておき、その回りに細胞を培養し、７日後にシリコンを剥離し、同時に培養液中にキトサンを加え、さらに５日間培養後円形の辺縁より中心に向かって遊走する細胞の遊走距離を顕微鏡による無処理区との比較観察をした。
【００３３】［結果］上記観察の結果、ヒト冠動脈平滑筋細胞の遊走能に対し、キトサンは用量依存的な顕著な抑制効果を示した。
【００３４】ちなみに、従来ＰＴＣＡ及び冠動脈バイパス手術後等の血管再狹窄要因については、細胞増殖能のみが主な対象と考えられてきたが、本発明においては、他の要因として細胞遊走能やコラーゲン（蛋白）産生能を考慮した。しかも遊走能に関しては上述した特殊なディッシュを考案して実験に用いた結果、従来平滑筋細胞の遊走や増殖を抑制すると考えられてきた他の薬剤（例えばＣａ拮抗剤やＡＣＥ阻害剤）でもその有効性が認められなかったにもかかわらず、キトサンにより上述のように顕著な効果が確認できた意義は大きいものと考えられる。
【００３５】上記の実験によりキトサンを血管再狹窄の有効な予防薬として使用できることが明らかであり、またキトサンが外科手術用の糸や人工皮膚等に利用されている点から生体に対する安全性はまず問題ないものと解される。
【００３６】また上記キトサンを血管再狹窄の予防薬として使用するには、従来から動物実験によって確認されている経口投与の方法により、あるいは低分子キトサン溶液を用いる場合は患部への集中投与若しくは生体内への静脈注射による治療が可能である。
【００３７】IV．予防用具（デバイス）の実施形態本発明においてはキトサン（高分子Ｎ−アセチルキトサンゲル）を用いて血管を接続し又はその内部に挿入して血管の再狹窄を予防する器具を提案し、以下その内容につき詳述する。この予防具は、図６（Ａ）に示すようにＮ−アセチルキトサンゲルを治療すべき部位の血管の内径に対応した外径の円筒状のパイプ１を形成し、これを乾燥固化することによって製造することができる。パイプ１はＮ−アセチルキトサンゲルを予め型に充填して形成する方法のほか、棒状に形成乾燥したものを切削及び研摩等の加工により管状に仕上げる方法によることも可能である。
【００３８】また予め合成樹脂又は天然樹脂や金属，セラミック等によって薄肉のパイプ状の芯材１ａを形成し、該芯材１ａの内周，外周及び端面等にゲル状のキトサンを塗布又はコーティングして予防皮膜１ｂを付着乾燥させ仕上げ加工することによって形成することもできる。
【００３９】
【発明の効果】以上のように構成される本発明の予防薬は、ヒトの血管を構成する平滑筋細胞の増殖，蛋白質の合成及び増加，血小板の凝集作用及びヒトの血管細胞の遊走能を抑制するほか、細胞の分裂を抑制することにより、ヒトの血管のＰＴＣＡ後の再狹窄、又は冠動脈バイパス手術後の再狹窄を予防する。
【００４０】また本発明の予防具を用いてＰＴＣＡを行った場合、キトサンの作用により治療部位の血管の再狹窄を予防するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】低分子キトサン溶液の製造工程図である。
【図２】高分子Ｎ−アセチルキトサンゲルの製造工程図である。
【図３】（Ａ），（Ｂ）はコントロール区とＮ−アセチルキトサンゲル製のプレート上へのヒトの冠動脈平滑筋細胞の接着密度の違いを表す顕微鏡写真図である。
【図４】ラット血小板のＡＤＰ誘導に対するキトサン溶液の濃度変化と血小板凝集抑制作用を表すグラフである。
【図５】ラット血小板のＡＤＰ誘導に対するキトサン溶液のＡＤＰ量に応じた血小板凝集抑制作用の変化を表すグラフである。
【図６】（Ａ），（Ｂ）は本発明の予防具の異なる２つの実施例を示す一部断面図である。
【符号の説明】
１ パイプ
１ａ 芯材
１ｂ 予防皮膜
【表１】
【化１】
【表２】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 キトサン又はＮ−アセチルキトサンを主成分とする液状又はゲル状物質からなる血管再狹窄予防薬。
【請求項２】 主成分が低分子キトサン溶液である請求項１の血管再狹窄予防薬。
【請求項３】 主成分が高分子キトサンを分解酵素により低分子化した低分子キトサン溶液である請求項１又は２の血管再狹窄予防薬。
【請求項４】 少なくとも表面がゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンにより形成固化されたパイプ（１）からなる血管再狹窄予防具。
【請求項５】 樹脂，金属又はセラミックからなるパイプ状の芯材（１ａ）の表面にゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンで被覆して予防皮膜（１ｂ）を形成してなる請求項４の血管再狹窄予防具。
【請求項１】 キトサン又はＮ−アセチルキトサンを主成分とする液状又はゲル状物質からなる血管再狹窄予防薬。
【請求項２】 主成分が低分子キトサン溶液である請求項１の血管再狹窄予防薬。
【請求項３】 主成分が高分子キトサンを分解酵素により低分子化した低分子キトサン溶液である請求項１又は２の血管再狹窄予防薬。
【請求項４】 少なくとも表面がゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンにより形成固化されたパイプ（１）からなる血管再狹窄予防具。
【請求項５】 樹脂，金属又はセラミックからなるパイプ状の芯材（１ａ）の表面にゲル状のキトサン又はＮ−アセチルキトサンで被覆して予防皮膜（１ｂ）を形成してなる請求項４の血管再狹窄予防具。
【図１】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【特許番号】第２９４９２８０号
【登録日】平成１１年（１９９９）７月９日
【発行日】平成１１年（１９９９）９月１３日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−３５５５６３
【出願日】平成８年（１９９６）１２月２４日
【公開番号】特開平１０−１８２４７０
【公開日】平成１０年（１９９８）７月７日
【審査請求日】平成８年（１９９６）１２月２４日
【出願人】（０００１７７７０４）山陰建設工業株式会社 (10)
【参考文献】
【文献】特開 昭６２−１９２１７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開 昭６３−９０５０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開 平４−４０９７２６（ＪＰ，Ａ）
【登録日】平成１１年（１９９９）７月９日
【発行日】平成１１年（１９９９）９月１３日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）１２月２４日
【公開番号】特開平１０−１８２４７０
【公開日】平成１０年（１９９８）７月７日
【審査請求日】平成８年（１９９６）１２月２４日
【出願人】（０００１７７７０４）山陰建設工業株式会社 (10)
【参考文献】
【文献】特開 昭６２−１９２１７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開 昭６３−９０５０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開 平４−４０９７２６（ＪＰ，Ａ）
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