表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤
【課題】天然抽出物を含有した表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供する。
【解決手段】表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤に、ワカメ（Undaria pinnatifida）及び／又はヒジキ（Hizikia fusiformis）からの抽出物を有効成分として含有せしめる。
【解決手段】表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤に、ワカメ（Undaria pinnatifida）及び／又はヒジキ（Hizikia fusiformis）からの抽出物を有効成分として含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、角質層に存在する大部分の細胞は、基底層から産まれた角化細胞である。通常、角化細胞は、基底層で産まれ、徐々に分化しながら上層に移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。
【０００３】
角質層は皮膚の最外殻に存在しており、絶えずターンオーバーを繰り返して一定の厚さと水分量を保持して、外界からの刺激に対するバリアとしての役割を果たしている。皮膚では、このバリア機能を維持させるため、角化細胞が基底層で産まれてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層は加齢等によって新陳代謝機能が衰えるため、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を呈することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、皮膚の新陳代謝機能を回復させることにより、これらの皮膚の老化症状を予防・改善できるものと考えられる。
【０００４】
従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有する種々の生薬が知られており（非特許文献１参照）、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、ハス胚芽抽出物（特許文献１参照）等が知られている。
【０００５】
また、基底層、有棘層、顆粒層及び角質層から構成されている表皮は、外部刺激を緩和し、水分等の体内成分の逸失を制御する働きをしている。基底層で分裂し、増殖した細胞は、有棘層、顆粒層を通過しながら分化し、強固な架橋結合をもったケラチン蛋白線維で構成された角質層になり、最終的には垢として角質層から脱落する。特に、顆粒層では、細胞膜が肥厚して肥厚細胞膜を形成するとともに、トランスグルタミナーゼ−１の作用により、蛋白分子間がグルタミル−リジン架橋され、強靭なケラチン蛋白線維が形成される。さらに、その一部にセラミド等が共有結合し、疎水的な構造をとることで、細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能の基礎が形成される。
【０００６】
しかし、加齢とともに表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生量が減少すると、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下するため、肌荒れ、乾燥肌等の皮膚の老化症状を呈したり、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）を発症したりするようになる。そのため、表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生を促進することにより、皮膚の老化症状や乾燥性皮膚疾患等を予防、治療又は改善することができると考えられる。このようなトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有するものとして、ニガリ又はその構成成分である塩化カルシウム等が知られている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００２−６８９９３号公報
【特許文献２】特開２００４−５１５９６号公報
【非特許文献１】「和漢医薬学雑誌」，１９９８年，第１５巻，ｐ．４２６−４２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い天然物の中から表皮角化細胞増殖促進作用及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とする表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、天然物であるワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れた表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について説明する。
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有する。
【００１１】
ここで本発明において「ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物」には、ワカメ及び／又はヒジキを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１２】
本発明において使用する抽出原料は、ワカメ（学名：Undaria pinnatifida）及びヒジキ（学名：Hizikia fusiformis）である。なお、本発明における抽出原料としてのワカメ及びヒジキは、未加工のものであってもよいし、それらの乾燥物等の加工されたものであってもよい。
【００１３】
ワカメ（Undaria pinnatifida）は、チガイソ科ワカメ属に属する一年生の海藻であって、北海道南西部から九州にかけての海岸で、低潮線付近から下に生育しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るワカメの構成部位としては、例えば、葉部（葉体，成葉）、茎部（中芯，中肋）、胞子葉部、全藻、根部等が挙げられるが、好ましくは全藻である。
【００１４】
ヒジキ（Hizikia fusiformis）は、ホンダワラ科ヒジキ属に属する多年生の海藻であって、北海道南部から南西諸島にかけての海岸で、潮間帯下部の岩上に生育しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るヒジキの構成部位としては、例えば、葉部、茎部、全藻、根部等が挙げられるが、好ましくは全藻である。
【００１５】
ワカメ又はヒジキからの抽出物に含有される表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、海藻類の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、ワカメ又はヒジキからこれらの作用を有する抽出物を得ることができる。
【００１６】
例えば、上記海藻類を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する抽出物を得ることができる。上記海藻類の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、ワカメ又はヒジキの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用することのできる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２３】
ワカメ又はヒジキからの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚外用剤等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２４】
以上のようにして得られるワカメ及びヒジキからの抽出物は、表皮角化細胞増殖促進作用及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有しているため、それぞれの作用を利用して表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として用いることができる。なお、本発明においては、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物のうちのいずれか一方を上記有効成分として用いてもよいし、両者を混合して上記有効成分として用いてもよい。ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物を混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００２５】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物のみからなるものであってもよいし、上記抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００２６】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００２７】
なお、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、必要に応じて、表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００２８】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００２９】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、シワ形成、弾力性低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも表皮角化細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。なお、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、それらの表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、例えば、創傷や火傷等を原因とする皮膚疾患における皮膚再生用治療剤等の有効成分としても用いることができる。
【００３０】
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物が有するトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、シミ、シワ形成、弾力性低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、これらの用途以外にもトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。なお、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、それらのトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、トランスグルタミナーゼ−１の欠乏に起因する疾患（例えば、魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患）の予防・治療剤の有効成分としても用いることができる。
【００３１】
なお、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３２】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００３３】
〔製造例１〕ワカメ抽出物の製造
ワカメ乾燥物の粗粉砕物１００ｇに抽出溶媒１５００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥してワカメ抽出物を得た（試料１〜３）。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）を用いたときの各抽出物の収量（固形分換算）を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
〔製造例２〕ヒジキ抽出物の製造
ヒジキ乾燥物の粗粉砕物１００ｇに抽出溶媒１５００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥してヒジキ抽出物を得た（試料４〜６）。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）を用いたときの各抽出物の収量（固形分換算）を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
〔試験例１〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例１により得られたワカメ抽出物（試料１〜３）及び製造例２により得られたヒジキ抽出物（試料４〜６）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００３８】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度にEpiLife-KG2にて希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜６）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。
【００３９】
表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定した各吸光度から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００４０】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
表３に示すように、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００４３】
〔試験例２〕トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用試験
製造例１により得られたワカメ抽出物（試料１〜３）及び製造例２により得られたヒジキ抽出物（試料４〜６）について、以下のようにしてトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を試験した。
【００４４】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ）を、正常ヒト新生児表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、２日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した試料溶液（試料１〜６）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ−１の量を、モノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ−１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定結果から、下記式によりトランスグルタミナーゼ−１産生促進率（％）を算出した。
【００４５】
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表す。
試験結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４に示すように、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物は、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、皮膚の老化症状等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、角質層に存在する大部分の細胞は、基底層から産まれた角化細胞である。通常、角化細胞は、基底層で産まれ、徐々に分化しながら上層に移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。
【０００３】
角質層は皮膚の最外殻に存在しており、絶えずターンオーバーを繰り返して一定の厚さと水分量を保持して、外界からの刺激に対するバリアとしての役割を果たしている。皮膚では、このバリア機能を維持させるため、角化細胞が基底層で産まれてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層は加齢等によって新陳代謝機能が衰えるため、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚の老化症状を呈することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、皮膚の新陳代謝機能を回復させることにより、これらの皮膚の老化症状を予防・改善できるものと考えられる。
【０００４】
従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有する種々の生薬が知られており（非特許文献１参照）、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、ハス胚芽抽出物（特許文献１参照）等が知られている。
【０００５】
また、基底層、有棘層、顆粒層及び角質層から構成されている表皮は、外部刺激を緩和し、水分等の体内成分の逸失を制御する働きをしている。基底層で分裂し、増殖した細胞は、有棘層、顆粒層を通過しながら分化し、強固な架橋結合をもったケラチン蛋白線維で構成された角質層になり、最終的には垢として角質層から脱落する。特に、顆粒層では、細胞膜が肥厚して肥厚細胞膜を形成するとともに、トランスグルタミナーゼ−１の作用により、蛋白分子間がグルタミル−リジン架橋され、強靭なケラチン蛋白線維が形成される。さらに、その一部にセラミド等が共有結合し、疎水的な構造をとることで、細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能の基礎が形成される。
【０００６】
しかし、加齢とともに表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生量が減少すると、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下するため、肌荒れ、乾燥肌等の皮膚の老化症状を呈したり、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）を発症したりするようになる。そのため、表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生を促進することにより、皮膚の老化症状や乾燥性皮膚疾患等を予防、治療又は改善することができると考えられる。このようなトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有するものとして、ニガリ又はその構成成分である塩化カルシウム等が知られている（特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００２−６８９９３号公報
【特許文献２】特開２００４−５１５９６号公報
【非特許文献１】「和漢医薬学雑誌」，１９９８年，第１５巻，ｐ．４２６−４２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い天然物の中から表皮角化細胞増殖促進作用及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とする表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、天然物であるワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れた表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について説明する。
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有する。
【００１１】
ここで本発明において「ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物」には、ワカメ及び／又はヒジキを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１２】
本発明において使用する抽出原料は、ワカメ（学名：Undaria pinnatifida）及びヒジキ（学名：Hizikia fusiformis）である。なお、本発明における抽出原料としてのワカメ及びヒジキは、未加工のものであってもよいし、それらの乾燥物等の加工されたものであってもよい。
【００１３】
ワカメ（Undaria pinnatifida）は、チガイソ科ワカメ属に属する一年生の海藻であって、北海道南西部から九州にかけての海岸で、低潮線付近から下に生育しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るワカメの構成部位としては、例えば、葉部（葉体，成葉）、茎部（中芯，中肋）、胞子葉部、全藻、根部等が挙げられるが、好ましくは全藻である。
【００１４】
ヒジキ（Hizikia fusiformis）は、ホンダワラ科ヒジキ属に属する多年生の海藻であって、北海道南部から南西諸島にかけての海岸で、潮間帯下部の岩上に生育しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るヒジキの構成部位としては、例えば、葉部、茎部、全藻、根部等が挙げられるが、好ましくは全藻である。
【００１５】
ワカメ又はヒジキからの抽出物に含有される表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、海藻類の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、ワカメ又はヒジキからこれらの作用を有する抽出物を得ることができる。
【００１６】
例えば、上記海藻類を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する抽出物を得ることができる。上記海藻類の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、ワカメ又はヒジキの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用することのできる親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２３】
ワカメ又はヒジキからの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚外用剤等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２４】
以上のようにして得られるワカメ及びヒジキからの抽出物は、表皮角化細胞増殖促進作用及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有しているため、それぞれの作用を利用して表皮角化細胞増殖促進剤及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として用いることができる。なお、本発明においては、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物のうちのいずれか一方を上記有効成分として用いてもよいし、両者を混合して上記有効成分として用いてもよい。ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物を混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００２５】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物のみからなるものであってもよいし、上記抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００２６】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００２７】
なお、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、必要に応じて、表皮角化細胞増殖促進作用又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００２８】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００２９】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、表皮角化細胞の増殖を促進し、シワ形成、弾力性低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも表皮角化細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。なお、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、それらの表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、例えば、創傷や火傷等を原因とする皮膚疾患における皮膚再生用治療剤等の有効成分としても用いることができる。
【００３０】
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物が有するトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、シミ、シワ形成、弾力性低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、これらの用途以外にもトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。なお、ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物は、それらのトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、トランスグルタミナーゼ−１の欠乏に起因する疾患（例えば、魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患）の予防・治療剤の有効成分としても用いることができる。
【００３１】
なお、本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３２】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００３３】
〔製造例１〕ワカメ抽出物の製造
ワカメ乾燥物の粗粉砕物１００ｇに抽出溶媒１５００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥してワカメ抽出物を得た（試料１〜３）。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）を用いたときの各抽出物の収量（固形分換算）を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
〔製造例２〕ヒジキ抽出物の製造
ヒジキ乾燥物の粗粉砕物１００ｇに抽出溶媒１５００ｍＬを加え、穏やかに攪拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥してヒジキ抽出物を得た（試料４〜６）。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：４）を用いたときの各抽出物の収量（固形分換算）を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
〔試験例１〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例１により得られたワカメ抽出物（試料１〜３）及び製造例２により得られたヒジキ抽出物（試料４〜６）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００３８】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度にEpiLife-KG2にて希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜６）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。
【００３９】
表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定した各吸光度から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００４０】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
表３に示すように、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００４３】
〔試験例２〕トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用試験
製造例１により得られたワカメ抽出物（試料１〜３）及び製造例２により得られたヒジキ抽出物（試料４〜６）について、以下のようにしてトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を試験した。
【００４４】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ）を、正常ヒト新生児表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、２日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した試料溶液（試料１〜６）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ−１の量を、モノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ−１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定結果から、下記式によりトランスグルタミナーゼ−１産生促進率（％）を算出した。
【００４５】
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表す。
試験結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４に示すように、ワカメ抽出物及びヒジキ抽出物は、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の表皮角化細胞増殖促進剤又はトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、皮膚の老化症状等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤。
【請求項１】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ワカメ及び／又はヒジキからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤。
【公開番号】特開２００９−６７７０１（Ｐ２００９−６７７０１Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３５８８４（Ｐ２００７−２３５８８４）
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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