表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体
【課題】簡単に金属薄膜の膜厚のばらつきを補正することが可能なセンサ構造体およびこれを備えた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置を提供すること。
【解決手段】光伝搬領域となるコア層と、コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されている表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体において、領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で領域（Ｑ）を照射するように、領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えている。
【解決手段】光伝搬領域となるコア層と、コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されている表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体において、領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で領域（Ｑ）を照射するように、領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）の測定装置（表面プラズモン励起増強蛍光測定装置）、およびこれに用いられるセンサ構造体に関する。
【０００２】
ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳの測定装置（表面プラズモン励起増強蛍光測定装置）の基本的な態様は、たとえば特許文献１および２に開示されている。
【０００３】
ところで、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたり、蛍光シグナルの測定値についての信頼性を担保する必要があり、そのためには、測定値のばらつき（ＣＶ）を通常は１０％以内、場合によっては１〜２％以内に抑える必要がある。特に、抗体を固定化させたセンサ構造体に検体由来のアナライトを介して蛍光修飾抗体を固定化するサンドイッチ系など、アナライト濃度に応じてシグナルの絶対値が増加する系では、一般にアナライト濃度が低下するとＣＶが悪化し、検出感度および定量感度の低下につながる。そこで、蛍光シグナルの測定値におけるばらつきを減らすためには、表面プラズモン励起増強蛍光測定装置のセンサ構造体間での電場増強のばらつきを減らす必要がある。
【０００４】
ここで、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を考えるにあたって、センサ構造体に形成されている金属薄膜の膜厚のばらつきが問題となる。ところが、すべてのセンサ構造体において金属薄膜の膜厚が寸分の違いもなく完全に同一となるようにセンサ構造体を製造することは現実的ではないことから、電場増強度のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を最小限とするために、センサ構造体で生じる電場増強度を正規化し、これに基づいて測定値を補正することが考えられる。その一方で、臨床検査に用いるセンサ構造体には安価に製造できることも要求される。したがって、センサ構造体に複雑な構造を形成することなく電場増強度を正規化でき、これに基づいて測定値を補正することによって測定データのばらつきを最小限に抑えることが、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するうえで重要となる。
【０００５】
このような背景のもと、センサ構造体に複雑な構造を導入することなく、センサ構造体を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強度のばらつきの影響を排除し、これによりＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を高めることが可能となる、測定データの補正方法、およびこれを用いたアッセイ方法に関する発明を、本出願人は先に出願した（特許文献３。特願２０１０−１８１３６４号。以下「先願」という。）。
【０００６】
この先願に記載した測定データの補正方法は、誘電体部材表面の一部に金属薄膜を形成させた基板に蛍光色素層を形成してなる基板の裏側から全反射条件で励起光を照射したときの、金属薄膜を形成していない領域での蛍光強度と金属薄膜を形成した領域での蛍光強度との関係に基づいて、この金属薄膜の膜厚のばらつきによる電場増強への影響を見積もるというものであり、その具体的な補正方法を、図１０を参照しながら説明する。
【０００７】
図１０は、先願のセンサ構造体を示した断面図である。
このセンサ構造体１００は、図１０に示したように、蛍光色素層１１６ｐだけが形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜１１８を介して蛍光色素層１１６ｑが形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、金属薄膜１１８を介して固定化リガンド含有層１２０が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）とが、それぞれ同一の透明誘電体部材１１２の上に形成されている。この領域（Ｐ）における蛍光色素層１１６ｐと、領域（Ｑ）における蛍光色素層１１６ｑとは、同一の蛍光色素から形成されている。また、透明誘電体部材１１２の上方には、ＣＣＤカメラなどの光検出手段１３０が配置されているとともに、透明誘電体部材１１２の下面側には、不図示のプリズムが配置されている。
【０００８】
また、領域（Ａ）の固定化リガンド含有層１２０には、第１のリガンド１２２が固定されている。この第１のリガンド１２２は、アナライト１２８と特異的に結合する性質を有しており、固定化リガンド含有層１２０にアナライト１２８を含む検体溶液を接触させることで、図１０に示したように、第１のリガンド１２２にアナライト１２８を結合させることができる。また、このアナライト１２８に、第２のリガンド１２４と、この第２のリガンド１２４に結合した蛍光分子１２６とからなる装飾リガンド１２５を接触させることで、図１０に示したように、アナライト１２８に第２のリガンド１２４を介して蛍光分子１２６を結合させることができる。したがって、この領域（Ａ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θａで励起光１４２ａを照射すると、アナライト１２８と結合した蛍光分子１２６が発光するとともに、その蛍光が表面プラズモン現象によって増強される。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａとして光検出手段１３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト１２８を定量化することができる。
【０００９】
このようにして得られる蛍光シグナルＳａについて、異なるセンサ間における金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強への影響を補正するため、先願では、以下のような方法を採っている。
【００１０】
先ず、領域（Ｐ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θｐで、励起光１４２ｐを照射する。そして、蛍光色素層１１６ｐから発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナルＳｐとして、光検出手段１３０にて測定する。
【００１１】
同様に、領域（Ｑ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θｑで、励起光１４２ｑを照射する。そして、蛍光色素層１１６ｑから発光し、表面プラズモン現象によって増強された蛍光の量を電場増強蛍光シグナルＳｑとして、光検出手段１３０にて測定する。ここで、この励起光１４２ｑは、上述した励起光１４２ｐと同一光源から発せられた光であり、励起光１４２ｐと同一波長の光である。
【００１２】
そして、上述の方法で得られた全反射蛍光シグナルＳｐと、電場増強蛍光シグナルＳｑとを用いて、下記式（１）から、センサ構造体１００の電場増強度Ｒを算出する。
Ｒ＝Ｓｑ／Ｓｐ （１）
また、図１０に示したセンサ構造体１００と同様の構成を有する、正規化の基準となるセンサ構造体１００´（不図示）において、上述したセンサ構造体１００の場合と同一波長の励起光を用いて、全反射蛍光シグナルＳｐ´と、電場増強蛍光シグナルＳｑ´とを測定し、上述した式（１）より、電場増強度Ｒ´を算出する。
【００１３】
そして、下記式（２）によって、上述した蛍光シグナルＳａを補正蛍光シグナルＳに変換することで、図１０に示したセンサ構造体１００と、正規化の基準となるセンサ構造体１００´との金属薄膜の膜厚の違いに起因する蛍光シグナルの量を補正する。
【００１４】
Ｓ＝Ｓａ×（Ｒ´／Ｒ） （２）
なお、図１０に示したセンサ構造体１００では、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）が、同一の透明誘電体部材１１２上に一体的に形成されていたが、先願のセンサ構造体１００はこれに限定されない。領域（Ａ）に形成されている金属薄膜１１８と、領域（Ｑ）に形成されている金属薄膜１１８とが、同一の金属で同一の膜厚であり、且つ、両者とも同一の材質からなる透明誘電体部材１１２上に形成されていれば、領域（Ｐ）と領域（Ｑ）だけが形成されているセンサ構造体と、領域（Ａ）だけが形成されているセンサ構造体とを別々に製造し、これらを用いて上記補正を行っても良いものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２１８１６９号公報
【特許文献３】特願２０１０−１８１３６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところで、上述した先願の補正方法では、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）に対して、それぞれ異なる入射角θｐ，θｑで励起光１４２ｐ，１４２ｑを照射する必要がある。このため、例えば同一の光源から領域（Ｐ）および領域（Ｑ）に対して励起光１４２ｐ，１４２ｑを照射する場合には、光源となる投光器において、励起光の照射方向を調整する必要がある。
【００１７】
しかしながら、投光器には偏光フィルターやビームエキスパンダーなどの各種光学装置が取り付けられており、複雑な構成となっている。このような投光器において励起光の照射方向を調整しようとすると、投光器にモーター等の駆動手段を付加する必要があり、投光器の構成がさらに複雑になるとともに、サイズも大きくなってしまう。また、励起光の照射方向の調整には高い精度が要求されるため、照射方向を制御するセンサ等も投光器に組み込む必要があり、投光器の構成がさらに複雑になるととともに、コスト高を招いてしまうという問題も考えられる。
【００１８】
本発明はこのような現状に鑑みなされた発明であって、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡便な構造で簡単に補正することができ、これにより所望のアナライトの検出を高精度で行なうことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、上述したような課題を解決するために発明されたものであって、
本発明のセンサ構造体は、
光伝搬領域となるコア層と、該コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、
前記コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、前記領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されており、
前記コア層を伝搬する励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｐ）で前記領域（Ｐ）を照射した場合に、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記領域（Ｐ）を照射する際の励起光の入射角（θｐ）と、前記領域（Ｑ）を照射する際の励起光の入射角（θｑ）とが異なる角度であり、
前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えることを特徴とする。
【００２０】
このように構成することによって、本発明のセンサ構造体は、領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整する入射角調整手段を備えるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がない。また、励起光を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができる。これにより、簡便なセンサ構造で、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡単に補正することができ、所望のアナライトの検出を高精度で行なうことが可能となる。
【００２１】
上記発明において、本発明のセンサ構造体は、
前記入射角調整手段が、
前記コア層の表面に形成された傾斜面であることが望ましい。
【００２２】
このような構成であれば、コア層の表面に設けられた傾斜面によって領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度が調整されるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がなく、本発明のセンサ構造体を極めて簡便なセンサ構造とすることができる。
【００２３】
また、上記発明において、本発明のセンサ構造体は、
前記コア層が、所定の屈折率を有する第１のコアと、該第１のコアとは異なる屈折率を有する第２のコアとが接合されて構成されたものであり、
前記第１のコアと第２のコアとの接合面が、前記入射角調整手段を構成することが望ましい。
【００２４】
このような構成であれば、第１のコアと第２のコアとの接合面によって領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度が調整されるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がなく、本発明のセンサ構造体を極めて簡便なセンサ構造とすることができる。
【００２５】
また、上記発明において、
前記コア層の表面には、蛍光色素層を介することなく、前記領域（Ｑ）に形成された金属薄膜と同一の金属で、同一の膜厚を有する金属薄膜を介して、リガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されていることが望ましい。
【００２６】
このように構成することで、コア層の表面に固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されているため、本発明のセンサ構造体を、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を補正するためだけでなく、実際にアナライトの定量にも用いることができるセンサ構造体とすることができる。
【００２７】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、上述したセンサ構造体を備えている。
このように構成することによって、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整する入射角調整手段を有するセンサ構造体を備えるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がない。また、励起光を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができる。これにより、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置では、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡単に補正することができ、所望のアナライトの検出を高精度で行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡便なセンサ構造によって簡単に補正することができ、これにより所望のアナライトの検出を高精度で行なうことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。
【図２】図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図であって、励起光を幅広の光とした場合について説明するための図である。
【図４】図４の（ａ）は、図３Ａのｂ―ｂ線における断面図、図４の（ｂ）は、図３Ａのｃ−ｃ線における断面図である。
【図５】図５は、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体の変形例を説明するための斜視図である。
【図６】図６の（ａ）は、図５のｄ―ｄ線における断面図、図６の（ｂ）は、図５のｅ−ｅ線における断面図である。
【図７】図７は、本発明のセンサ構造体の変形例を説明するための断面図である。
【図８】図８は、本発明のセンサ構造体の変形例を説明するための断面図である。
【図９】図９は、本発明の第３の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。
【図１０】図１０は、先願のセンサ構造体を示した断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について図面などを基に詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。なお、図２に示すセンサ構造体１０は、図１のａ−ａ線における断面図となっている。なお、本明細書においては、図示したコア層の上側の面を「上面」と称し、同様に、図示したコア層の下側の面を「下面」と称する。
【００３１】
図１および図２に示したように、第１の実施形態のセンサ構造体１０は、コア層１２と、コア層１２の下面１２ｌに積層されたクラッド層１４とを備えている。コア層１２の上面１２ｕには、金属薄膜１８を介することなく蛍光色素層１６ｐが形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）（以下、単に「領域（Ｐ）」と称する場合がある）と、金属薄膜１８を介して蛍光色素層１６ｑが形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）（以下、単に「領域（Ｑ）」と称する場合がある）と、が形成されている。
【００３２】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置１は、図２に示したように、上述したセンサ構造体１０に加えて、少なくとも、励起光４２の光源となる投光器４０と、全反射蛍光シグナルＳｐおよび電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定する光検出手段３０と、を備えている。
【００３３】
本発明においてコア層１２は、コア層１２の入射面１２ｉから入射した励起光４２を領域（Ｐ）および領域（Ｑ）まで導く光伝搬領域となる層である。本実施形態のコア層１２は、水平な面である上面１２ｕと、入射面１２ｉから遠ざかる方向に向かって下るように傾斜している下面１２ｌと、を備えた略平板状に形成されている。
【００３４】
また、コア層１２は透明誘電体部材から構成されている。ここで、コア層１２を構成する透明誘電体部材の材質としては、光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、光学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）であることが望ましい。
【００３５】
本発明においてクラッド層１４は、コア層１２の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層される。本実施形態のクラッド層１４は、上述したように、コア層１２の下面１２ｌに積層されている。また、クラッド層１４は、コア層１２の内部を伝搬する励起光４２が、コア層１２とクラッド層１４との境界面（本実施形態では、コア層１２の下面１２ｌ）で全反射するように、誘電体部材よりも屈折率の低い材質から構成される。
【００３６】
ここで、クラッド層１４に用いられる材質としては、コア層１２を構成する誘電体部材よりも屈折率が低いこと以外は、基本的に誘電体部材と同じ材質を用いることができる。プラスチック材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン、環状オレフィン系樹脂などのポリオレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。また、無機材料としては、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）等を用いることができる。なお、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）が好ましく、取り扱い易さおよびコストの点から、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、トリアセチルセルロースであることが好ましい。
【００３７】
金属薄膜１８は、一般的な表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体を構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であっても良く、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きいことから、金属薄膜１８の金属として好適である。金属薄膜１８をコア層１２の表面に形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。
【００３８】
蛍光色素層１６ｐ，１６ｑは、所定の励起光を照射することによって蛍光を発光する蛍光色素から構成される層である。本発明のセンサ構造体１０では、上述した領域（Ｐ）における蛍光色素層１６ｐと、領域（Ｑ）における蛍光色素層１６ｑとは、同一の蛍光色素から形成されている。
【００３９】
このような蛍光色素としては、本発明の目的を達せられるものであれば特に限定されないが、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００４０】
全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）は、上述したように、コア層１２の上面１２ｕに蛍光色素層１６ｐが形成されることで構成される領域である。そして図２に示したように、この領域（Ｐ）に対して、コア層１２の内部を伝搬した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｐでコア層１２の内部から照射されると、蛍光色素層１６ｐが発光して全反射蛍光シグナルＳｐが発せられるようになっている。
【００４１】
また、電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）は、上述したように、コア層１２の上面に蛍光色素層１６ｐが、金属薄膜１８を介して形成されることで構成される領域である。そして、この領域（Ｑ）に対して、コア層１２の内部を伝搬した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑでコア層１２の内部から照射されると、蛍光色素層１６ｑが発光するとともに、この蛍光が表面プラズモン現象によって増強されて、電場増強蛍光シグナルＳｑが発せられる。ここで、領域（Ｑ）に対する所定の入射角θｑと、前述した領域（Ｐ）に対する入射角θｐとは、異なる入射角度である。
【００４２】
このように、領域（Ｐ）には、領域（Ｑ）のように金属薄膜１８が形成されていないため、全反射蛍光シグナルＳｐは、表面プラズモン現象による電場増強の影響がない状態における蛍光シグナルとなっている。また、領域（Ｑ）から発せられる電場増強蛍光シグナルＳｑは、表面プラズモン現象によって増強された蛍光シグナルとなっている。したがって、この全反射蛍光シグナルＳｐと、電場増強蛍光シグナルＳｑとを、前述した光検出手段３０によって測定することで、前述した式（１）により、金属薄膜１８による蛍光シグナルの電場増強度Ｒを算定することができる。
【００４３】
したがって、上述した電場増強度Ｒを用いることにより、この領域（Ｑ）の金属薄膜１８と同一金属で同一の膜厚を有する金属薄膜が形成された、後述するＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）を備えるセンサ構造体において、金属薄膜の膜厚のばらつきによる電場増強度への影響を見積もることが可能となる。
【００４４】
また、本発明のセンサ構造体１０は、図２に示したように、投光器４０から発せられた励起光４２が、コア層１２の入射面１２ｉからコア層１２の内部に入射し、先ず、領域（Ｐ）を全反射条件となる所定の入射角θｐで照射するように構成されている。なお、本実施形態では、入射面１２ｉから入射した励起光４２が、直接領域（Ｐ）を照射しているが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されず、例えば、入射面１２ｉから入射した励起光４２を、コア層１２とクラッド層１４との境界面で全反射させ、その全反射した励起光４２が領域（Ｐ）を照射するように構成してもよい。
【００４５】
また、本発明のセンサ構造体１０は、図２に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、コア層１２の下面１２ｌで全反射して、全反射条件となる所定の入射角θｑで、領域（Ｑ）を照射するように構成されている。この際、上述したように、領域（Ｐ）に対する入射角θｐと、領域（Ｑ）に対する入射角θｑとは異なる入射角度となっており、本実施形態では、入射角θｑがθｐよりも２θｉだけ大きい角度となっている。そして、本実施形態のセンサ構造体１０では、これに対応して、コア層１２の下面１２ｌが角度θｉだけ傾斜している。
【００４６】
したがって、領域Ｐで全反射した励起光４２は、上面１２ｕに対してθｉだけ傾斜しているコア層１２の下面１２ｌを入射角（θｐ＋θｉ）で照射する。そして、下面１２ｌで全反射した励起光４２は、上面１２ｕに形成されている領域（Ｑ）を入射角（θｐ＋２θｉ）、すなわち、θｑで照射する。
【００４７】
このように、本実施形態のセンサ構造体１０では、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２の入射角調整手段として、コア層１２の下面１２ｌがθｉだけ傾斜している。すなわち、コア層１２の表面に傾斜面を設けるとの、極めて簡便なセンサ構造で、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整することができるようになっている。
【００４８】
また、本実施形態のセンサ構造体１０では、センサ構造体１０に励起光４２を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができるため、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度の影響を簡単に補正することができるようになっている。
【００４９】
＜第２の実施形態＞
図３Ａは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。図４の（ａ）は、図３Ａのｂ―ｂ線における断面図、図４の（ｂ）は、図３Ａのｃ−ｃ線における断面図である。なお、この第２の実施形態のセンサ構造体１０は、上述した第１の実施形態のセンサ構造体１０と基本的に同様の構成となっており、同一部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００５０】
この第２の実施形態のセンサ構造体１０では、図３Ａおよび図４に示したように、コア層１２の上面１２ｕに、上述した領域（Ｐ）、領域（Ｑ）に加えて、領域（Ｑ）と同一の金属で同一の膜厚である同一の金属薄膜１８を介して固定化リガンド含有層２０が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）（以下、「領域（Ａ）」と称する場合がある）が形成されている点が、上述した第１の実施形態と異なっている。
【００５１】
この領域Ａの固定化リガンド含有層２０は、アナライト２８と特異的に結合する性質を有する第１のリガンド２２を含んでいる。したがって、この固定化リガンド含有層２０にアナライト２８を含む検体溶液を接触させることで、図４に示したように、第１のリガンド２２にアナライト２８を結合させることができる。また、このアナライト２８に、第２のリガンド２４と、この第２のリガンド２４に結合した蛍光分子２６とからなる装飾リガンド２５を接触させることで、図４に示したように、アナライト２８に第２のリガンド２４を介して蛍光分子２６を結合させることができる。なお、蛍光分子２６としては、上述した蛍光色素層１６ｐ，１６ｑを構成する蛍光色素と、同様の蛍光色素を用いることができるが、必ずしも同一の蛍光色素である必要はない。
【００５２】
この領域（Ａ）に対して、コア層１２の内部から、全反射条件となる所定の入射角θａで励起光４２を照射すると、アナライト２８と結合した蛍光分子２６が発光し、その蛍光が表面プラズモン現象によって増強される。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａとして光検出手段３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト２８を定量化することができる。なお、領域（Ａ）に対する所定の入射角θａと、上述した領域（Ｑ）に対する所定の入射角θｑとは、同一の角度である。
【００５３】
このように、本発明のセンサ構造体１０が、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）に加えて領域（Ａ）を備えていれば、本発明のセンサ構造体１０を、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を補正するためだけでなく、実際にアナライトの定量にも用いることができるセンサ構造体１０とすることができる。
【００５４】
また、この第２の実施形態のセンサ構造体１０では、図３Ａに示したように、コア層１２の手前側（入射面１２ｉ側）に領域（Ｐ）が形成されるとともに、その奥側に、領域（Ｑ）と領域（Ａ）とが並列的に形成されている。
【００５５】
したがって、図３Ａの矢印Ｘに示したように、光源である不図示の投光器をコア層１２の入射面１２ｉに対して平行に移動させることで、図４に示したように、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑと、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａとを簡単に測定することができる。
【００５６】
また、図３Ｂに示したように励起光４２を幅広の励起光４２ｗとすれば、図４の（ａ），（ｂ）に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑおよびθａ（本実施形態ではθｑ＝θａ）で、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を同時に照射するため、励起光４２ｗをセンサ構造体１０に１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑと、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａとを簡単に測定することができる。
【００５７】
なお、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）の形成位置は、上述した実施形態の形成位置に限定されない。例えば、コア層１２の手前側（入射面１２ｉ側）に領域（Ｐ）と領域（Ａ）とを並列的に形成し、その奥側に領域（Ｑ）を形成することも可能である。しかしながら、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を照射した励起光は、全反射減衰により光量が著しく減少するため、コア層１２の手前側に領域（Ｑ）および／または領域（Ａ）を形成し、その奥側に領域（Ｐ）を形成することはできない。
【００５８】
また、本発明のセンサ構造体１０は、上述した領域（Ａ）に加えて、例えば図５および図６に示したように、金属薄膜を介することなく、固定化リガンド含有層２０が形成された全反射アッセイ領域（Ａ´）（以下、「領域（Ａ´）」と称する場合がある）を形成することもできる。ここで、図５は、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体の変形例を説明するための斜視図、図６の（ａ）は、図５のｄ―ｄ線における断面図、図６の（ｂ）は、図５のｅ−ｅ線における断面図である。
【００５９】
この領域（Ａ´）に対して、コア層１２の内部から、全反射条件となる所定の入射角θａ´で励起光４２を照射すると、アナライト２８と結合した蛍光分子２６が発光する。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａ´として不図示の光検出手段３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト２８を定量化することができる。なお、領域（Ａ´）に対する入射角θａ´と、上述した領域（Ｐ）に対する所定の入射角θｐとは、同一の角度である。
【００６０】
このように、コア層１２の表面に、上述した領域（Ａ）に加えて領域（Ａ´）が形成されていれば、本発明のセンサ構造体１０を、上述したＳＰＦＳによるアナライト２８の定量だけではなく、全反射蛍光法によるアナライト２８の定量にも用いることが可能となる。
【００６１】
またこの際、図５に示したように励起光４２を幅広の励起光４２ｗとすれば、図６に示したように、領域（Ｐ）および領域（Ａ´）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑおよびθａ（本実施形態ではθｑ＝θａ）で、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を同時に照射するため、励起光４２ｗをセンサ構造体１０に１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐ、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑ、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａ、および領域（Ａ´）の蛍光シグナルＳａ´とを測定することができる。
【００６２】
また、上述した第１の実施形態および第２の実施形態では、そのコア層１２の下面１２ｌは、その全体が傾斜する傾斜面であったが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されない。例えば、図７に示したように、下面１２ｌの一部に角度θｉだけ傾斜している傾斜部１２ｌ´が形成され、これにより、上述した領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように構成することも可能である。
【００６３】
また、上述した第１の実施形態および第２の実施形態では、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）が、いずれもコア層１２の上面１２ｕに形成されていたが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されない。例えば、図８に示したように、上面１２ｕの手前側に領域（Ｐ）を形成し、この領域（Ｐ）よりも奥側の下面１２ｌに領域（Ｑ）を形成することも可能である。またこの際、上述した第２の実施形態と同様に、領域（Ａ）を領域（Ｑ）に対して並列的に形成することも可能である。
【００６４】
しかしながら、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）は、コア層１２の上面１２ｕまたは下面１２ｌのいずれか同じ側の面に形成される方が、全反射蛍光シグナルＳｐ、電場増強蛍光シグナルＳｑ、および蛍光シグナルＳａを一つの光検出手段３０で容易に測定することができるため、好ましい。
【００６５】
＜第３の実施形態＞
図９は、本発明の第３の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。この第３の実施形態のセンサ構造体１０は、上述した第１の実施形態および第２の実施形態のセンサ構造体１０と基本的に同様の構成となっており、同一部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００６６】
この第３の実施形態のセンサ構造体１０では、コア層１２の下面１２ｌが傾斜しておらず水平に形成されている点、およびコア層１２が、第１のコア層１２ａと第２のコア層１２ｂとが接合面１３において接合されて形成されている点が、上述した第１の実施形態および第２の実施形態と異なっている。
【００６７】
第１コア層１２ａおよび第２のコア層１２ｂは、各々異なる屈折率を有する透明誘電体部材から構成される。このように屈折率が異なる２つの透明誘電体部材の接合面１３に励起光４２が入射すると、その接合面１３において励起光４２が屈折する。
【００６８】
したがって、所定の屈折率を有する第１のコア層１２ａと、第１のコア層１２ｂとは異なる適当な屈折率を有する第２のコア層１２ｂとを、接合面１３において接合したコア層１２を用いることで、図９に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２を接合面１３において屈折させて、励起光４２が全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように構成することが可能となる。
【００６９】
このように、本実施形態のセンサ構造体１０では、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が接合面１３において屈折し、全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように、第１のコア層１２ａと第２のコア層１２ｂとの接合面１３が、センサ構造体１０における入射角調整手段を構成している。すなわち、所定の屈折率を有する第１のコア層１２ａと、この第１のコア層とは異なる屈折率を有する第２のコア層１２ｂとが接合面１３において接合されるとの、極めて簡便なセンサ構造で、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整することができるようになっている。
【００７０】
また、上述した実施形態と同様に、センサ構造体１０に励起光４２を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができるため、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度の影響を簡単に補正することができるようになっている。
【００７１】
なお、以上の説明において、励起光の１回照射で各種蛍光シグナルを測定する際には、例えば、各領域にそれぞれの蛍光シグナル（蛍光光）を集光するための集光部材を配置し、ＣＣＤカメラなど光検出手段の受光面を各領域に対応するように分割して利用して、各分割領域から蛍光シグナルを測定するようにすることができる。また、各領域用にそれぞれ光検出手段を設けることも可能である。
【００７２】
以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１ 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置
１０ センサ構造体（センサ構造体）
１２ コア層
１２ａ 第１のコア層
１２ｂ 第２のコア層
１２ｉ 入射面
１２ｕ 上面
１２ｌ 下面
１２ｌ´ 傾斜部
１３ 接合面
１４ クラッド層
１６ｐ，１６ｑ 蛍光色素層
１８ 金属薄膜
２０ 固定化リガンド含有層
２２ 第１のリガンド
２４ 第２のリガンド
２５ 装飾リガンド
２６ 蛍光分子
２８ アナライト
３０ 光検出手段
４０ 投光器
４２ 励起光
１００ センサ構造体
１１２ 透明誘電体部材
１１６ｐ，１１６ｑ 蛍光色素層
１１８ 金属薄膜
１２０ 固定化リガンド含有層
１２２ 第１のリガンド
１２４ 第２のリガンド
１２５ 装飾リガンド
１２６ 蛍光分子
１２８ アナライト
１３０ 光検出手段
１４２ 励起光
Ａ ＳＰＦＳアッセイ領域
Ａ´ 全反射アッセイ領域
Ｐ 全反射蛍光リファレンス領域
Ｑ 電場増強蛍光リファレンス領域
Ｓａ 蛍光シグナル
Ｓｐ 全反射蛍光シグナル
Ｓｑ 電場増強蛍光シグナル
θａ，θｐ，θｑ 入射角
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）の測定装置（表面プラズモン励起増強蛍光測定装置）、およびこれに用いられるセンサ構造体に関する。
【０００２】
ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳの測定装置（表面プラズモン励起増強蛍光測定装置）の基本的な態様は、たとえば特許文献１および２に開示されている。
【０００３】
ところで、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたり、蛍光シグナルの測定値についての信頼性を担保する必要があり、そのためには、測定値のばらつき（ＣＶ）を通常は１０％以内、場合によっては１〜２％以内に抑える必要がある。特に、抗体を固定化させたセンサ構造体に検体由来のアナライトを介して蛍光修飾抗体を固定化するサンドイッチ系など、アナライト濃度に応じてシグナルの絶対値が増加する系では、一般にアナライト濃度が低下するとＣＶが悪化し、検出感度および定量感度の低下につながる。そこで、蛍光シグナルの測定値におけるばらつきを減らすためには、表面プラズモン励起増強蛍光測定装置のセンサ構造体間での電場増強のばらつきを減らす必要がある。
【０００４】
ここで、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を考えるにあたって、センサ構造体に形成されている金属薄膜の膜厚のばらつきが問題となる。ところが、すべてのセンサ構造体において金属薄膜の膜厚が寸分の違いもなく完全に同一となるようにセンサ構造体を製造することは現実的ではないことから、電場増強度のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を最小限とするために、センサ構造体で生じる電場増強度を正規化し、これに基づいて測定値を補正することが考えられる。その一方で、臨床検査に用いるセンサ構造体には安価に製造できることも要求される。したがって、センサ構造体に複雑な構造を形成することなく電場増強度を正規化でき、これに基づいて測定値を補正することによって測定データのばらつきを最小限に抑えることが、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するうえで重要となる。
【０００５】
このような背景のもと、センサ構造体に複雑な構造を導入することなく、センサ構造体を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強度のばらつきの影響を排除し、これによりＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を高めることが可能となる、測定データの補正方法、およびこれを用いたアッセイ方法に関する発明を、本出願人は先に出願した（特許文献３。特願２０１０−１８１３６４号。以下「先願」という。）。
【０００６】
この先願に記載した測定データの補正方法は、誘電体部材表面の一部に金属薄膜を形成させた基板に蛍光色素層を形成してなる基板の裏側から全反射条件で励起光を照射したときの、金属薄膜を形成していない領域での蛍光強度と金属薄膜を形成した領域での蛍光強度との関係に基づいて、この金属薄膜の膜厚のばらつきによる電場増強への影響を見積もるというものであり、その具体的な補正方法を、図１０を参照しながら説明する。
【０００７】
図１０は、先願のセンサ構造体を示した断面図である。
このセンサ構造体１００は、図１０に示したように、蛍光色素層１１６ｐだけが形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜１１８を介して蛍光色素層１１６ｑが形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、金属薄膜１１８を介して固定化リガンド含有層１２０が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）とが、それぞれ同一の透明誘電体部材１１２の上に形成されている。この領域（Ｐ）における蛍光色素層１１６ｐと、領域（Ｑ）における蛍光色素層１１６ｑとは、同一の蛍光色素から形成されている。また、透明誘電体部材１１２の上方には、ＣＣＤカメラなどの光検出手段１３０が配置されているとともに、透明誘電体部材１１２の下面側には、不図示のプリズムが配置されている。
【０００８】
また、領域（Ａ）の固定化リガンド含有層１２０には、第１のリガンド１２２が固定されている。この第１のリガンド１２２は、アナライト１２８と特異的に結合する性質を有しており、固定化リガンド含有層１２０にアナライト１２８を含む検体溶液を接触させることで、図１０に示したように、第１のリガンド１２２にアナライト１２８を結合させることができる。また、このアナライト１２８に、第２のリガンド１２４と、この第２のリガンド１２４に結合した蛍光分子１２６とからなる装飾リガンド１２５を接触させることで、図１０に示したように、アナライト１２８に第２のリガンド１２４を介して蛍光分子１２６を結合させることができる。したがって、この領域（Ａ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θａで励起光１４２ａを照射すると、アナライト１２８と結合した蛍光分子１２６が発光するとともに、その蛍光が表面プラズモン現象によって増強される。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａとして光検出手段１３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト１２８を定量化することができる。
【０００９】
このようにして得られる蛍光シグナルＳａについて、異なるセンサ間における金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強への影響を補正するため、先願では、以下のような方法を採っている。
【００１０】
先ず、領域（Ｐ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θｐで、励起光１４２ｐを照射する。そして、蛍光色素層１１６ｐから発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナルＳｐとして、光検出手段１３０にて測定する。
【００１１】
同様に、領域（Ｑ）に対して、透明誘電体部材１１２の下面側から、全反射条件となる所定の入射角θｑで、励起光１４２ｑを照射する。そして、蛍光色素層１１６ｑから発光し、表面プラズモン現象によって増強された蛍光の量を電場増強蛍光シグナルＳｑとして、光検出手段１３０にて測定する。ここで、この励起光１４２ｑは、上述した励起光１４２ｐと同一光源から発せられた光であり、励起光１４２ｐと同一波長の光である。
【００１２】
そして、上述の方法で得られた全反射蛍光シグナルＳｐと、電場増強蛍光シグナルＳｑとを用いて、下記式（１）から、センサ構造体１００の電場増強度Ｒを算出する。
Ｒ＝Ｓｑ／Ｓｐ （１）
また、図１０に示したセンサ構造体１００と同様の構成を有する、正規化の基準となるセンサ構造体１００´（不図示）において、上述したセンサ構造体１００の場合と同一波長の励起光を用いて、全反射蛍光シグナルＳｐ´と、電場増強蛍光シグナルＳｑ´とを測定し、上述した式（１）より、電場増強度Ｒ´を算出する。
【００１３】
そして、下記式（２）によって、上述した蛍光シグナルＳａを補正蛍光シグナルＳに変換することで、図１０に示したセンサ構造体１００と、正規化の基準となるセンサ構造体１００´との金属薄膜の膜厚の違いに起因する蛍光シグナルの量を補正する。
【００１４】
Ｓ＝Ｓａ×（Ｒ´／Ｒ） （２）
なお、図１０に示したセンサ構造体１００では、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）が、同一の透明誘電体部材１１２上に一体的に形成されていたが、先願のセンサ構造体１００はこれに限定されない。領域（Ａ）に形成されている金属薄膜１１８と、領域（Ｑ）に形成されている金属薄膜１１８とが、同一の金属で同一の膜厚であり、且つ、両者とも同一の材質からなる透明誘電体部材１１２上に形成されていれば、領域（Ｐ）と領域（Ｑ）だけが形成されているセンサ構造体と、領域（Ａ）だけが形成されているセンサ構造体とを別々に製造し、これらを用いて上記補正を行っても良いものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２１８１６９号公報
【特許文献３】特願２０１０−１８１３６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところで、上述した先願の補正方法では、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）に対して、それぞれ異なる入射角θｐ，θｑで励起光１４２ｐ，１４２ｑを照射する必要がある。このため、例えば同一の光源から領域（Ｐ）および領域（Ｑ）に対して励起光１４２ｐ，１４２ｑを照射する場合には、光源となる投光器において、励起光の照射方向を調整する必要がある。
【００１７】
しかしながら、投光器には偏光フィルターやビームエキスパンダーなどの各種光学装置が取り付けられており、複雑な構成となっている。このような投光器において励起光の照射方向を調整しようとすると、投光器にモーター等の駆動手段を付加する必要があり、投光器の構成がさらに複雑になるとともに、サイズも大きくなってしまう。また、励起光の照射方向の調整には高い精度が要求されるため、照射方向を制御するセンサ等も投光器に組み込む必要があり、投光器の構成がさらに複雑になるととともに、コスト高を招いてしまうという問題も考えられる。
【００１８】
本発明はこのような現状に鑑みなされた発明であって、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡便な構造で簡単に補正することができ、これにより所望のアナライトの検出を高精度で行なうことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、上述したような課題を解決するために発明されたものであって、
本発明のセンサ構造体は、
光伝搬領域となるコア層と、該コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、
前記コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、前記領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されており、
前記コア層を伝搬する励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｐ）で前記領域（Ｐ）を照射した場合に、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記領域（Ｐ）を照射する際の励起光の入射角（θｐ）と、前記領域（Ｑ）を照射する際の励起光の入射角（θｑ）とが異なる角度であり、
前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えることを特徴とする。
【００２０】
このように構成することによって、本発明のセンサ構造体は、領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整する入射角調整手段を備えるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がない。また、励起光を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができる。これにより、簡便なセンサ構造で、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡単に補正することができ、所望のアナライトの検出を高精度で行なうことが可能となる。
【００２１】
上記発明において、本発明のセンサ構造体は、
前記入射角調整手段が、
前記コア層の表面に形成された傾斜面であることが望ましい。
【００２２】
このような構成であれば、コア層の表面に設けられた傾斜面によって領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度が調整されるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がなく、本発明のセンサ構造体を極めて簡便なセンサ構造とすることができる。
【００２３】
また、上記発明において、本発明のセンサ構造体は、
前記コア層が、所定の屈折率を有する第１のコアと、該第１のコアとは異なる屈折率を有する第２のコアとが接合されて構成されたものであり、
前記第１のコアと第２のコアとの接合面が、前記入射角調整手段を構成することが望ましい。
【００２４】
このような構成であれば、第１のコアと第２のコアとの接合面によって領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度が調整されるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がなく、本発明のセンサ構造体を極めて簡便なセンサ構造とすることができる。
【００２５】
また、上記発明において、
前記コア層の表面には、蛍光色素層を介することなく、前記領域（Ｑ）に形成された金属薄膜と同一の金属で、同一の膜厚を有する金属薄膜を介して、リガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されていることが望ましい。
【００２６】
このように構成することで、コア層の表面に固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されているため、本発明のセンサ構造体を、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を補正するためだけでなく、実際にアナライトの定量にも用いることができるセンサ構造体とすることができる。
【００２７】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、上述したセンサ構造体を備えている。
このように構成することによって、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、領域（Ｐ）で全反射した励起光が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整する入射角調整手段を有するセンサ構造体を備えるため、投光器において励起光の照射方向の調整を行なう必要がない。また、励起光を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができる。これにより、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置では、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡単に補正することができ、所望のアナライトの検出を高精度で行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を簡便なセンサ構造によって簡単に補正することができ、これにより所望のアナライトの検出を高精度で行なうことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。
【図２】図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図であって、励起光を幅広の光とした場合について説明するための図である。
【図４】図４の（ａ）は、図３Ａのｂ―ｂ線における断面図、図４の（ｂ）は、図３Ａのｃ−ｃ線における断面図である。
【図５】図５は、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体の変形例を説明するための斜視図である。
【図６】図６の（ａ）は、図５のｄ―ｄ線における断面図、図６の（ｂ）は、図５のｅ−ｅ線における断面図である。
【図７】図７は、本発明のセンサ構造体の変形例を説明するための断面図である。
【図８】図８は、本発明のセンサ構造体の変形例を説明するための断面図である。
【図９】図９は、本発明の第３の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。
【図１０】図１０は、先願のセンサ構造体を示した断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について図面などを基に詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および第１の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。なお、図２に示すセンサ構造体１０は、図１のａ−ａ線における断面図となっている。なお、本明細書においては、図示したコア層の上側の面を「上面」と称し、同様に、図示したコア層の下側の面を「下面」と称する。
【００３１】
図１および図２に示したように、第１の実施形態のセンサ構造体１０は、コア層１２と、コア層１２の下面１２ｌに積層されたクラッド層１４とを備えている。コア層１２の上面１２ｕには、金属薄膜１８を介することなく蛍光色素層１６ｐが形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）（以下、単に「領域（Ｐ）」と称する場合がある）と、金属薄膜１８を介して蛍光色素層１６ｑが形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）（以下、単に「領域（Ｑ）」と称する場合がある）と、が形成されている。
【００３２】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置１は、図２に示したように、上述したセンサ構造体１０に加えて、少なくとも、励起光４２の光源となる投光器４０と、全反射蛍光シグナルＳｐおよび電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定する光検出手段３０と、を備えている。
【００３３】
本発明においてコア層１２は、コア層１２の入射面１２ｉから入射した励起光４２を領域（Ｐ）および領域（Ｑ）まで導く光伝搬領域となる層である。本実施形態のコア層１２は、水平な面である上面１２ｕと、入射面１２ｉから遠ざかる方向に向かって下るように傾斜している下面１２ｌと、を備えた略平板状に形成されている。
【００３４】
また、コア層１２は透明誘電体部材から構成されている。ここで、コア層１２を構成する透明誘電体部材の材質としては、光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、光学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）であることが望ましい。
【００３５】
本発明においてクラッド層１４は、コア層１２の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層される。本実施形態のクラッド層１４は、上述したように、コア層１２の下面１２ｌに積層されている。また、クラッド層１４は、コア層１２の内部を伝搬する励起光４２が、コア層１２とクラッド層１４との境界面（本実施形態では、コア層１２の下面１２ｌ）で全反射するように、誘電体部材よりも屈折率の低い材質から構成される。
【００３６】
ここで、クラッド層１４に用いられる材質としては、コア層１２を構成する誘電体部材よりも屈折率が低いこと以外は、基本的に誘電体部材と同じ材質を用いることができる。プラスチック材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン、環状オレフィン系樹脂などのポリオレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。また、無機材料としては、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）等を用いることができる。なお、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）が好ましく、取り扱い易さおよびコストの点から、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、トリアセチルセルロースであることが好ましい。
【００３７】
金属薄膜１８は、一般的な表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体を構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であっても良く、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きいことから、金属薄膜１８の金属として好適である。金属薄膜１８をコア層１２の表面に形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。
【００３８】
蛍光色素層１６ｐ，１６ｑは、所定の励起光を照射することによって蛍光を発光する蛍光色素から構成される層である。本発明のセンサ構造体１０では、上述した領域（Ｐ）における蛍光色素層１６ｐと、領域（Ｑ）における蛍光色素層１６ｑとは、同一の蛍光色素から形成されている。
【００３９】
このような蛍光色素としては、本発明の目的を達せられるものであれば特に限定されないが、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００４０】
全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）は、上述したように、コア層１２の上面１２ｕに蛍光色素層１６ｐが形成されることで構成される領域である。そして図２に示したように、この領域（Ｐ）に対して、コア層１２の内部を伝搬した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｐでコア層１２の内部から照射されると、蛍光色素層１６ｐが発光して全反射蛍光シグナルＳｐが発せられるようになっている。
【００４１】
また、電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）は、上述したように、コア層１２の上面に蛍光色素層１６ｐが、金属薄膜１８を介して形成されることで構成される領域である。そして、この領域（Ｑ）に対して、コア層１２の内部を伝搬した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑでコア層１２の内部から照射されると、蛍光色素層１６ｑが発光するとともに、この蛍光が表面プラズモン現象によって増強されて、電場増強蛍光シグナルＳｑが発せられる。ここで、領域（Ｑ）に対する所定の入射角θｑと、前述した領域（Ｐ）に対する入射角θｐとは、異なる入射角度である。
【００４２】
このように、領域（Ｐ）には、領域（Ｑ）のように金属薄膜１８が形成されていないため、全反射蛍光シグナルＳｐは、表面プラズモン現象による電場増強の影響がない状態における蛍光シグナルとなっている。また、領域（Ｑ）から発せられる電場増強蛍光シグナルＳｑは、表面プラズモン現象によって増強された蛍光シグナルとなっている。したがって、この全反射蛍光シグナルＳｐと、電場増強蛍光シグナルＳｑとを、前述した光検出手段３０によって測定することで、前述した式（１）により、金属薄膜１８による蛍光シグナルの電場増強度Ｒを算定することができる。
【００４３】
したがって、上述した電場増強度Ｒを用いることにより、この領域（Ｑ）の金属薄膜１８と同一金属で同一の膜厚を有する金属薄膜が形成された、後述するＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）を備えるセンサ構造体において、金属薄膜の膜厚のばらつきによる電場増強度への影響を見積もることが可能となる。
【００４４】
また、本発明のセンサ構造体１０は、図２に示したように、投光器４０から発せられた励起光４２が、コア層１２の入射面１２ｉからコア層１２の内部に入射し、先ず、領域（Ｐ）を全反射条件となる所定の入射角θｐで照射するように構成されている。なお、本実施形態では、入射面１２ｉから入射した励起光４２が、直接領域（Ｐ）を照射しているが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されず、例えば、入射面１２ｉから入射した励起光４２を、コア層１２とクラッド層１４との境界面で全反射させ、その全反射した励起光４２が領域（Ｐ）を照射するように構成してもよい。
【００４５】
また、本発明のセンサ構造体１０は、図２に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、コア層１２の下面１２ｌで全反射して、全反射条件となる所定の入射角θｑで、領域（Ｑ）を照射するように構成されている。この際、上述したように、領域（Ｐ）に対する入射角θｐと、領域（Ｑ）に対する入射角θｑとは異なる入射角度となっており、本実施形態では、入射角θｑがθｐよりも２θｉだけ大きい角度となっている。そして、本実施形態のセンサ構造体１０では、これに対応して、コア層１２の下面１２ｌが角度θｉだけ傾斜している。
【００４６】
したがって、領域Ｐで全反射した励起光４２は、上面１２ｕに対してθｉだけ傾斜しているコア層１２の下面１２ｌを入射角（θｐ＋θｉ）で照射する。そして、下面１２ｌで全反射した励起光４２は、上面１２ｕに形成されている領域（Ｑ）を入射角（θｐ＋２θｉ）、すなわち、θｑで照射する。
【００４７】
このように、本実施形態のセンサ構造体１０では、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２の入射角調整手段として、コア層１２の下面１２ｌがθｉだけ傾斜している。すなわち、コア層１２の表面に傾斜面を設けるとの、極めて簡便なセンサ構造で、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整することができるようになっている。
【００４８】
また、本実施形態のセンサ構造体１０では、センサ構造体１０に励起光４２を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができるため、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度の影響を簡単に補正することができるようになっている。
【００４９】
＜第２の実施形態＞
図３Ａは、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体を説明するための斜視図である。図４の（ａ）は、図３Ａのｂ―ｂ線における断面図、図４の（ｂ）は、図３Ａのｃ−ｃ線における断面図である。なお、この第２の実施形態のセンサ構造体１０は、上述した第１の実施形態のセンサ構造体１０と基本的に同様の構成となっており、同一部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００５０】
この第２の実施形態のセンサ構造体１０では、図３Ａおよび図４に示したように、コア層１２の上面１２ｕに、上述した領域（Ｐ）、領域（Ｑ）に加えて、領域（Ｑ）と同一の金属で同一の膜厚である同一の金属薄膜１８を介して固定化リガンド含有層２０が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）（以下、「領域（Ａ）」と称する場合がある）が形成されている点が、上述した第１の実施形態と異なっている。
【００５１】
この領域Ａの固定化リガンド含有層２０は、アナライト２８と特異的に結合する性質を有する第１のリガンド２２を含んでいる。したがって、この固定化リガンド含有層２０にアナライト２８を含む検体溶液を接触させることで、図４に示したように、第１のリガンド２２にアナライト２８を結合させることができる。また、このアナライト２８に、第２のリガンド２４と、この第２のリガンド２４に結合した蛍光分子２６とからなる装飾リガンド２５を接触させることで、図４に示したように、アナライト２８に第２のリガンド２４を介して蛍光分子２６を結合させることができる。なお、蛍光分子２６としては、上述した蛍光色素層１６ｐ，１６ｑを構成する蛍光色素と、同様の蛍光色素を用いることができるが、必ずしも同一の蛍光色素である必要はない。
【００５２】
この領域（Ａ）に対して、コア層１２の内部から、全反射条件となる所定の入射角θａで励起光４２を照射すると、アナライト２８と結合した蛍光分子２６が発光し、その蛍光が表面プラズモン現象によって増強される。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａとして光検出手段３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト２８を定量化することができる。なお、領域（Ａ）に対する所定の入射角θａと、上述した領域（Ｑ）に対する所定の入射角θｑとは、同一の角度である。
【００５３】
このように、本発明のセンサ構造体１０が、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）に加えて領域（Ａ）を備えていれば、本発明のセンサ構造体１０を、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度への影響を補正するためだけでなく、実際にアナライトの定量にも用いることができるセンサ構造体１０とすることができる。
【００５４】
また、この第２の実施形態のセンサ構造体１０では、図３Ａに示したように、コア層１２の手前側（入射面１２ｉ側）に領域（Ｐ）が形成されるとともに、その奥側に、領域（Ｑ）と領域（Ａ）とが並列的に形成されている。
【００５５】
したがって、図３Ａの矢印Ｘに示したように、光源である不図示の投光器をコア層１２の入射面１２ｉに対して平行に移動させることで、図４に示したように、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑと、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａとを簡単に測定することができる。
【００５６】
また、図３Ｂに示したように励起光４２を幅広の励起光４２ｗとすれば、図４の（ａ），（ｂ）に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑおよびθａ（本実施形態ではθｑ＝θａ）で、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を同時に照射するため、励起光４２ｗをセンサ構造体１０に１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑと、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａとを簡単に測定することができる。
【００５７】
なお、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）の形成位置は、上述した実施形態の形成位置に限定されない。例えば、コア層１２の手前側（入射面１２ｉ側）に領域（Ｐ）と領域（Ａ）とを並列的に形成し、その奥側に領域（Ｑ）を形成することも可能である。しかしながら、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を照射した励起光は、全反射減衰により光量が著しく減少するため、コア層１２の手前側に領域（Ｑ）および／または領域（Ａ）を形成し、その奥側に領域（Ｐ）を形成することはできない。
【００５８】
また、本発明のセンサ構造体１０は、上述した領域（Ａ）に加えて、例えば図５および図６に示したように、金属薄膜を介することなく、固定化リガンド含有層２０が形成された全反射アッセイ領域（Ａ´）（以下、「領域（Ａ´）」と称する場合がある）を形成することもできる。ここで、図５は、本発明の第２の実施形態のセンサ構造体の変形例を説明するための斜視図、図６の（ａ）は、図５のｄ―ｄ線における断面図、図６の（ｂ）は、図５のｅ−ｅ線における断面図である。
【００５９】
この領域（Ａ´）に対して、コア層１２の内部から、全反射条件となる所定の入射角θａ´で励起光４２を照射すると、アナライト２８と結合した蛍光分子２６が発光する。そして、この増強された蛍光の量を蛍光シグナルＳａ´として不図示の光検出手段３０にて測定することで、検体溶液中に含まれるアナライト２８を定量化することができる。なお、領域（Ａ´）に対する入射角θａ´と、上述した領域（Ｐ）に対する所定の入射角θｐとは、同一の角度である。
【００６０】
このように、コア層１２の表面に、上述した領域（Ａ）に加えて領域（Ａ´）が形成されていれば、本発明のセンサ構造体１０を、上述したＳＰＦＳによるアナライト２８の定量だけではなく、全反射蛍光法によるアナライト２８の定量にも用いることが可能となる。
【００６１】
またこの際、図５に示したように励起光４２を幅広の励起光４２ｗとすれば、図６に示したように、領域（Ｐ）および領域（Ａ´）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑおよびθａ（本実施形態ではθｑ＝θａ）で、領域（Ｑ）および領域（Ａ）を同時に照射するため、励起光４２ｗをセンサ構造体１０に１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐ、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑ、領域（Ａ）の蛍光シグナルＳａ、および領域（Ａ´）の蛍光シグナルＳａ´とを測定することができる。
【００６２】
また、上述した第１の実施形態および第２の実施形態では、そのコア層１２の下面１２ｌは、その全体が傾斜する傾斜面であったが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されない。例えば、図７に示したように、下面１２ｌの一部に角度θｉだけ傾斜している傾斜部１２ｌ´が形成され、これにより、上述した領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が、全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように構成することも可能である。
【００６３】
また、上述した第１の実施形態および第２の実施形態では、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）が、いずれもコア層１２の上面１２ｕに形成されていたが、本発明のセンサ構造体１０はこれに限定されない。例えば、図８に示したように、上面１２ｕの手前側に領域（Ｐ）を形成し、この領域（Ｐ）よりも奥側の下面１２ｌに領域（Ｑ）を形成することも可能である。またこの際、上述した第２の実施形態と同様に、領域（Ａ）を領域（Ｑ）に対して並列的に形成することも可能である。
【００６４】
しかしながら、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）および領域（Ａ）は、コア層１２の上面１２ｕまたは下面１２ｌのいずれか同じ側の面に形成される方が、全反射蛍光シグナルＳｐ、電場増強蛍光シグナルＳｑ、および蛍光シグナルＳａを一つの光検出手段３０で容易に測定することができるため、好ましい。
【００６５】
＜第３の実施形態＞
図９は、本発明の第３の実施形態のセンサ構造体を説明するための断面図である。この第３の実施形態のセンサ構造体１０は、上述した第１の実施形態および第２の実施形態のセンサ構造体１０と基本的に同様の構成となっており、同一部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００６６】
この第３の実施形態のセンサ構造体１０では、コア層１２の下面１２ｌが傾斜しておらず水平に形成されている点、およびコア層１２が、第１のコア層１２ａと第２のコア層１２ｂとが接合面１３において接合されて形成されている点が、上述した第１の実施形態および第２の実施形態と異なっている。
【００６７】
第１コア層１２ａおよび第２のコア層１２ｂは、各々異なる屈折率を有する透明誘電体部材から構成される。このように屈折率が異なる２つの透明誘電体部材の接合面１３に励起光４２が入射すると、その接合面１３において励起光４２が屈折する。
【００６８】
したがって、所定の屈折率を有する第１のコア層１２ａと、第１のコア層１２ｂとは異なる適当な屈折率を有する第２のコア層１２ｂとを、接合面１３において接合したコア層１２を用いることで、図９に示したように、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２を接合面１３において屈折させて、励起光４２が全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように構成することが可能となる。
【００６９】
このように、本実施形態のセンサ構造体１０では、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が接合面１３において屈折し、全反射条件となる所定の入射角θｑで領域（Ｑ）を照射するように、第１のコア層１２ａと第２のコア層１２ｂとの接合面１３が、センサ構造体１０における入射角調整手段を構成している。すなわち、所定の屈折率を有する第１のコア層１２ａと、この第１のコア層とは異なる屈折率を有する第２のコア層１２ｂとが接合面１３において接合されるとの、極めて簡便なセンサ構造で、領域（Ｐ）で全反射した励起光４２が領域（Ｑ）を照射する際の入射角度を調整することができるようになっている。
【００７０】
また、上述した実施形態と同様に、センサ構造体１０に励起光４２を１回照射するだけで、領域（Ｐ）の全反射蛍光シグナルＳｐと、領域（Ｑ）の電場増強蛍光シグナルＳｑとを測定することができるため、金属薄膜の膜厚のばらつきに起因する電場増強度の影響を簡単に補正することができるようになっている。
【００７１】
なお、以上の説明において、励起光の１回照射で各種蛍光シグナルを測定する際には、例えば、各領域にそれぞれの蛍光シグナル（蛍光光）を集光するための集光部材を配置し、ＣＣＤカメラなど光検出手段の受光面を各領域に対応するように分割して利用して、各分割領域から蛍光シグナルを測定するようにすることができる。また、各領域用にそれぞれ光検出手段を設けることも可能である。
【００７２】
以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１ 表面プラズモン励起増強蛍光測定装置
１０ センサ構造体（センサ構造体）
１２ コア層
１２ａ 第１のコア層
１２ｂ 第２のコア層
１２ｉ 入射面
１２ｕ 上面
１２ｌ 下面
１２ｌ´ 傾斜部
１３ 接合面
１４ クラッド層
１６ｐ，１６ｑ 蛍光色素層
１８ 金属薄膜
２０ 固定化リガンド含有層
２２ 第１のリガンド
２４ 第２のリガンド
２５ 装飾リガンド
２６ 蛍光分子
２８ アナライト
３０ 光検出手段
４０ 投光器
４２ 励起光
１００ センサ構造体
１１２ 透明誘電体部材
１１６ｐ，１１６ｑ 蛍光色素層
１１８ 金属薄膜
１２０ 固定化リガンド含有層
１２２ 第１のリガンド
１２４ 第２のリガンド
１２５ 装飾リガンド
１２６ 蛍光分子
１２８ アナライト
１３０ 光検出手段
１４２ 励起光
Ａ ＳＰＦＳアッセイ領域
Ａ´ 全反射アッセイ領域
Ｐ 全反射蛍光リファレンス領域
Ｑ 電場増強蛍光リファレンス領域
Ｓａ 蛍光シグナル
Ｓｐ 全反射蛍光シグナル
Ｓｑ 電場増強蛍光シグナル
θａ，θｐ，θｑ 入射角
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光伝搬領域となるコア層と、該コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、
前記コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、前記領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されており、
前記コア層を伝搬する励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｐ）で前記領域（Ｐ）を照射した場合に、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記領域（Ｐ）を照射する際の励起光の入射角（θｐ）と、前記領域（Ｑ）を照射する際の励起光の入射角（θｑ）とが異なる角度であり、
前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えることを特徴とするセンサ構造体。
【請求項２】
前記入射角調整手段が、
前記コア層の表面に形成された傾斜面であることを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項３】
前記コア層が、所定の屈折率を有する第１のコアと、該第１のコアとは異なる屈折率を有する第２のコアとが接合されて構成されたものであり、
前記第１のコアと第２のコアとの接合面が、前記入射角調整手段を構成することを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項４】
前記コア層の表面には、蛍光色素層を介することなく、前記領域（Ｑ）に形成された金属薄膜と同一の金属で、同一の膜厚を有する金属薄膜を介して、リガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のセンサ構造体を備えることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項１】
光伝搬領域となるコア層と、該コア層の上面または下面の少なくともいずれか一方に積層されるクラッド層と、を備え、
前記コア層の表面には、少なくとも、金属薄膜を介することなく蛍光色素層が形成された全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）と、金属薄膜を介して、前記領域（Ｐ）に形成された蛍光色素層と同一の蛍光色素からなる蛍光色素層が形成された電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）と、が形成されており、
前記コア層を伝搬する励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｐ）で前記領域（Ｐ）を照射した場合に、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記領域（Ｐ）を照射する際の励起光の入射角（θｐ）と、前記領域（Ｑ）を照射する際の励起光の入射角（θｑ）とが異なる角度であり、
前記領域（Ｐ）で全反射した励起光が、全反射条件となる所定の入射角（θｑ）で前記領域（Ｑ）を照射するように、前記領域（Ｐ）で全反射した励起光の入射角度を調整する入射角調整手段を備えることを特徴とするセンサ構造体。
【請求項２】
前記入射角調整手段が、
前記コア層の表面に形成された傾斜面であることを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項３】
前記コア層が、所定の屈折率を有する第１のコアと、該第１のコアとは異なる屈折率を有する第２のコアとが接合されて構成されたものであり、
前記第１のコアと第２のコアとの接合面が、前記入射角調整手段を構成することを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項４】
前記コア層の表面には、蛍光色素層を介することなく、前記領域（Ｑ）に形成された金属薄膜と同一の金属で、同一の膜厚を有する金属薄膜を介して、リガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）が形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のセンサ構造体を備えることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【図２】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−５２９１７（Ｐ２０１２−５２９１７Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９５８９７（Ｐ２０１０−１９５８９７）
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]