表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法
【課題】 試料の表面における電荷量を簡便に計測することが可能な表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法を提供すること。
【解決手段】 表面上方を浮遊するプローブ粒子Ｐを用いて試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測する表面電荷量計測装置１Ａであって、光源２と、プローブ粒子Ｐの像（プローブ像）を得る結像光学系３と、プローブ像を撮像してプローブ画像を得る撮像装置４と、プローブ画像からプローブ粒子Ｐの位置分布を取得し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測する画像処理装置１０とを備える。画像処理装置１０は、予め格納されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値である直径とプローブ粒子Ｐの試料Ｓ表面からの距離との関係を示す校正データと撮像装置４によって撮像されたプローブ粒子Ｐの直径とに基づいて、プローブ粒子Ｐの位置分布を得る。
【解決手段】 表面上方を浮遊するプローブ粒子Ｐを用いて試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測する表面電荷量計測装置１Ａであって、光源２と、プローブ粒子Ｐの像（プローブ像）を得る結像光学系３と、プローブ像を撮像してプローブ画像を得る撮像装置４と、プローブ画像からプローブ粒子Ｐの位置分布を取得し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測する画像処理装置１０とを備える。画像処理装置１０は、予め格納されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値である直径とプローブ粒子Ｐの試料Ｓ表面からの距離との関係を示す校正データと撮像装置４によって撮像されたプローブ粒子Ｐの直径とに基づいて、プローブ粒子Ｐの位置分布を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、化学的反応や生物学的反応を検出する方法として、反応に伴う電気信号（例えば電位）の変化を検出する方法が知られている。例えば、特異性の高い生体分子について、当該生体分子と親和性の高い標的分子を検出する場合、この生体分子を半導体基板に固定し標的分子との結合を当該半導体基板から出力される電気信号の変化によって検出する方法が検討されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−３３２４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、試料の表面における電荷量を簡便に計測することが可能な表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ところで、検出の対象が電気信号だけでは、結合反応を検証するのに十分ではない。すなわち、例えば電位の変化等を検出できたとしても、それだけでは反応を定量的に分析することができず、さらには当該電位変化が実際に結合反応によってもたらされたものであることの実証もできない。
【０００５】
通常、結合反応を特定するために、蛍光色素等で測定の対象物質を標識して直接観察されている。しかし、この場合標識操作が非常に煩雑となってしまうという問題があった。
【０００６】
こうした問題に対し、本願発明者等は、基板等の表面における電荷量を測定することで、基板表面での生体反応等を特定することができる上、定量的な分析も可能となることを見出した。そこで、本願発明者等は生物学的反応あるいは化学的反応等についての分析のさらなる発展に貢献すべく、試料表面での電荷量を簡便に計測することができる装置及び方法について鋭意研究を重ねた結果、ついに本願発明に想到するに至った。
【０００７】
かかる研究結果を踏まえ、本発明に係る表面電荷量計測装置は、荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測装置であって、複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出手段と、位置分布に基づいて試料表面での電荷量を算出する電荷量算出手段と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
上記の表面電荷量計測装置では、荷電された試料の表面上方に荷電プローブ粒子を分布させている。荷電されたプローブ粒子は、荷電された試料との間の静電的相互作用による影響を受けて分布する。そのため、プローブ粒子の位置分布を求めることにより、荷電された試料表面の電荷量を算出することが可能となる。また、荷電されたプローブ粒子の位置分布を求めるだけであるため、簡便に且つ低コストで試料表面の電荷量を計測することが可能となる。また、試料表面上に液体あるいは気体が存在し当該液体等が流動している場合であっても、プローブ粒子は浮遊しているため、流動によって妨げられることなく試料表面での電荷量を計測することが可能となる。また、プローブ粒子の大きさを変えることで所望の分解能で電荷量を計測することが可能となる。
【０００９】
プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像に基づいて、試料の表面での電荷量を計測する上記の表面電荷量計測装置であって、プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定手段をさらに備え、位置分布算出手段は、プローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からのプローブ粒子の距離との関係を示す校正データと、大きさ規定値特定手段で求められた測定値と、に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００１０】
この表面電荷量計測装置では、プローブ画像における各プローブ粒子の大きさを規定する測定値さえ求められればそのプローブ粒子の位置分布が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子の数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが可能であり、表面での電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００１１】
あるいは、光の強度を測定する強度測定手段をさらに備え、表面と交差する試料の第１の側面に斜めに入射光を入射させることにより試料の表面での電荷量を計測する上記の表面電荷量計測装置であって、入射光は、試料表面において全反射しながら試料内を伝播した後、表面とは交差する試料の第２の側面から出射光として出射していくよう第１の側面に入射され、位置分布算出手段は、入射光の強度と出射光の強度との強度差に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００１２】
この表面電荷量計測装置では、入射光が表面において全反射しながら試料内を伝播するため、試料表面近傍の試料外側にエバネッセント光が浸透する。エバネッセント光の強度Ｅは、界面（試料表面）での光強度をＥ０とすると、式（１）で表される。
【数１】
X：界面からの距離
dp：エバネッセント光の強度が界面での強度の1/eになるときの界面からの距離
【００１３】
式（１）から理解されるように、エバネッセント光の強度Ｅは、界面から離れるにしたがって指数関数的に減衰する。エバネッセント光の到達距離ｄｐは略波長オーダーとされ、以下の式（２）で表される。
【数２】
λ：入射光の波長
ｎ１：試料の屈折率
ｎ２：試料と界面で接する媒質の屈折率
θ：試料表面の法線に対する入射光の角度
【００１４】
例えば、波長４００ｎｍの光を入射光とし、石英ガラス（ｎ１＝１．４７）を試料として用い、水（ｎ２＝１．３３）を試料と界面で接する媒質として用意し、試料表面の法線に対する入射光の角度を７０°（試料内では６６．８°を用いる。）を用いた場合、式（２）から約２７０ｎｍがエバネッセント光の到達距離ｄｐとして得られる。実際に、吸収に寄与するエバネッセント光の最高到達距離は３ｄｐとされているので、光の吸収は約８１０ｎｍまで起こると考えられる。上記の表面電荷量計測装置は、このエバネッセント光を用いてプローブ粒子の位置分布を算出するため、非常に小さいスケールで試料表面を計測することができる。また、通常、荷電された抗体蛋白質を試料表面に固定化した場合、標的抗原の検出及びその定量分析が可能となる。
【００１５】
プローブ粒子が球体であることが好ましい。この場合、プローブ粒子の扱いが容易となるため、上記表面電荷量計測装置はより一層簡便に試料表面での電荷量を計測することが可能となる。
【００１６】
試料は、荷電物質が表面に固定されることによって荷電されることが好ましい。例えば荷電されたＤＮＡ分子が試料の表面に固定された場合、標的分子の検出だけでなく結合反応の定量的な分析も可能となる。
【００１７】
一方、本発明に係る表面電荷量計測方法は、荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測方法であって、複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出ステップと、位置分布に基づいて試料表面での電荷量を算出する電荷量算出ステップと、を備えることを特徴とする。
【００１８】
上記の表面電荷量計測方法では、荷電された試料の表面上方に荷電プローブ粒子を分布させている。荷電されたプローブ粒子は、荷電された試料との間の静電的相互作用による影響を受けて分布する。そのため、プローブ粒子の位置分布を求めることにより、荷電された試料表面の電荷量を算出することが可能となる。また、荷電されたプローブ粒子の位置分布を求めるだけであるため、簡便に且つ低コストで試料表面の電荷量を計測することが可能となる。また、試料表面上に液体あるいは気体が存在し当該液体等が流動している場合であっても、プローブ粒子は浮遊しているため、流動によって妨げられることなく試料表面での電荷量を計測することが可能となる。また、プローブ粒子の大きさを変えることで所望の分解能で電荷量を計測することが可能となる。
【００１９】
プローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からのプローブ粒子の距離との関係を示す校正データを用意する校正データ準備ステップと、プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定ステップと、をさらに備え、位置分布算出ステップは、校正データと大きさ規定値特定手段で求められた測定値とに基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００２０】
上記表面電荷量計測方法では、プローブ画像における各プローブ粒子の大きさを規定する測定値さえ求められればそのプローブ粒子の位置分布が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子の数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが可能であり、表面での電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００２１】
あるいは、試料表面で全反射しながら試料内を伝播する強度の測定された入射光を、表面と交差する試料の第１の側面に斜めに入射させる光入射ステップと、入射光として入射し試料内を伝播した後、表面と交差する試料の第２の側面から出射する出射光の強度を測定する出射光強度測定ステップと、をさらに備え、位置分布算出ステップは、入射光の強度と出射光の強度との強度差に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００２２】
上記表面電荷量計測方法では、入射光が表面において全反射しながら試料内を伝播するため、試料表面近傍の試料外側にエバネッセント光が浸透する。上記の表面電荷量計測方法は、このエバネッセント光を用いてプローブ粒子の位置分布を算出するため、非常に小さいスケールで試料表面を計測することができる。
【００２３】
プローブ粒子が球体であることが好ましい。この場合、プローブ粒子の扱いが容易となるため、上記表面電荷量計測方法はより一層簡便に試料表面での電荷量を計測することが可能となる。
【００２４】
試料は、荷電物質が表面に固定されることによって荷電されることが好ましい。例えば荷電されたＤＮＡ分子が試料の表面に固定された場合、標的分子の検出だけでなく結合反応の定量的な分析も可能となる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、試料の表面における電荷量を簡便に計測することが可能な表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、添付図面を参照して、好適な実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
【００２７】
（第１実施形態）
図１は第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａの構成を示す図である。図１に示すように表面電荷量計測装置１Ａは、光源２と、水槽２０と、結像光学系（結像手段）３と、撮像装置（撮像手段）４と、画像処理装置（画像処理手段）１０と、表示装置（表示手段）５とを備える。表面電荷量計測装置１Ａは、透明な基板２２と、当該透明基板２２の表面に固定された固定化ＤＮＡ分子２３とで構成される試料２１の表面２１ａの電荷量を計測する。
【００２８】
水槽２０は、一面が開口した透明材質からなる容器である。水槽２０内には、例えば純水２５が満たされている。水槽２０の底面上には、試料２１が、固定化ＤＮＡ分子２３が固定されていない面が水槽２０の底面と接するように載置されている。水槽２０内では、試料２１の表面２１ａ上方において球体のプローブ粒子Ｐが複数浮遊している。必要に応じて、検出ＤＮＡ分子２４も水槽２０内に浮遊させてもよい。プローブ粒子Ｐとして例えば、径が約１μｍのポリスチレンラテックス微粒子を用いる。試料２１、検出ＤＮＡ分子２４、及びプローブ粒子Ｐは、同符号で荷電している。試料２１は、荷電物質である固定化ＤＮＡ分子２３がその表面に固定されることによって荷電する。
【００２９】
光源２は、水槽２０の上方に、すなわち水槽２０の試料２１が載置されている底面とは反対側に位置する。光源２は、試料２１及びプローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する。表面電荷量計測装置１Ａは、光源２に対してさらに集光レンズ２Ａを備えている。集光レンズ２Ａは、光源２から出力された光ｌを集光して、水槽２０内に入射させる。
【００３０】
結像光学系３は、水槽２０の下方に、すなわち水槽２０の底面側に位置する。結像光学系３は、光源２から出力された光ｌによって照射されたプローブ粒子Ｐの像（プローブ像）を撮像装置４の受光面上に結ぶ。試料２１は後述の結像光学系３の焦点面Ｆとは一致せず、本実施形態では試料２１は結像光学系３の焦点面Ｆが水槽２０内に位置するように配置される。
【００３１】
撮像装置４は、結像光学系３によって結像されたプローブ像を撮像するＣＣＤカメラである。撮像装置４は、プローブ像を撮像して得られたプローブ画像を画像処理装置１０に出力する。
【００３２】
画像処理装置１０は、撮像されたプローブ画像を撮像装置４から入力する。画像処理装置１０は、撮像装置４から出力されたプローブ画像からプローブ粒子Ｐの位置分布を算出し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出する。画像処理装置１０は、算出した試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示装置５へ出力する。なお、画像処理装置１０は、必要に応じてプローブ画像も表示装置５へ出力してもよい。
【００３３】
表示装置５は、画像処理装置１０から入力された試料２１の表面２１ａでの電荷量あるいはプローブ画像を表示する。この表示装置５としては、例えば、ＣＲＴモニタや、液晶ディスプレイなどを用いることができる。
【００３４】
次に、図２を参照して画像処理装置１０の機能について説明する。図２に示すように、画像処理装置１０は、校正データ格納部１１と、大きさ規定値特定部１２と、位置分布算出部１３と、電荷量算出部１４とを有する。
【００３５】
校正データ格納部１１には、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値とプローブ粒子Ｐの試料２１の表面２１ａからの距離との関係を示す校正データが格納されている。本実施形態ではプローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ粒子Ｐの大きさを規定する値を、画像上におけるプローブ粒子Ｐの直径とする。
【００３６】
図３に校正データによって得られるグラフを示す。図３のグラフの横軸は試料２１の表面２１ａに直交する方向（以下、ｚ方向という）での結像光学系３の焦点面Ｆからの距離Ｚ（μｍ）を表し、縦軸はプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径の大きさｄ（μｍ）を表す。結像光学系３の焦点面Ｆは、プローブ粒子の位置を特定するための基準面として機能する。図３のグラフにおける円は実際の測定データを表し、曲線はこれらの測定データに対してフィッティングを行った結果である。校正データ格納部１１は、例えばフィッティングによって得られた関係式を校正データとして格納する。あるいは、校正データ格納部１１は、例えば実際の測定データを校正データとして格納する。図４に、校正データ格納部１１が実際の測定データを校正データとして格納する場合における校正データの表を示す。
【００３７】
試料２１の表面２１ａからの結像光学系３の焦点面Ｆの位置は既知である。したがって図３のグラフから理解されるように、校正データによれば、プローブ粒子Ｐの直径の大きさｄを得ることによって、試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの距離Ｚを求めることができる。ここで、焦点面Ｆからそれぞれ距離Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２だけ離れているプローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の、距離Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２とプローブ画像における直径ｄ０、ｄ１、ｄ２との関係を説明する。説明に際し、図５〜６を参照する。
【００３８】
図５は、プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２と焦点面Ｆとの関係を説明するための図である。図５に示されているように、プローブ粒子Ｐ０は焦点面Ｆに位置し、焦点面ＦからＺ０（Ｚ０＝０）だけ離れている。プローブ粒子Ｐ１は焦点面Ｆに対しＺ１（＜Ｚ０）の位置にある。プローブ粒子Ｐ２は焦点面Ｆに対しＺ２（＞Ｚ０）の位置にある。
【００３９】
図６は、撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の画像である。図６（ａ）はプローブ粒子Ｐ０の、図６（ｂ）はプローブ粒子Ｐ１の、図６（ｃ）はプローブ粒子Ｐ２の画像である。図６に示されるように、焦点面Ｆに位置するプローブ粒子Ｐ０の画像（図６（ｂ））における円の大きさ（直径の大きさ）は、他のプローブ粒子Ｐ１、Ｐ２の画像（図６（ａ）、（ｃ））における円（直径）に比べて小さくなる。図６（ａ）に示された二点鎖線Ｔ２、図６（ｂ）に示された二点鎖線Ｔ０、図６（ｃ）に示された二点鎖線Ｔ１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の中心点を通り、各プローブ粒子の画像を横断する線である。また、図６（ａ）に示された直径ｄ１２、図６（ｂ）に示された直径ｄ１０、図６（ｃ）に示された直径ｄ１１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の白い輪で表される像の直径である。図６（ａ）に示された直径ｄ２２、図６（ｂ）に示された直径ｄ２０、図６（ｃ）に示された直径ｄ２１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の黒い輪で表される像の直径である。
【００４０】
図７は、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の強度を示すグラフである。図７（ａ）はプローブ粒子Ｐ０の、図７（ｂ）はプローブ粒子Ｐ１の、図７（ｃ）はプローブ粒子Ｐ２のグラフである。各グラフの横軸は図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示された横断線Ｔ２、Ｔ０、Ｔ１上の位置Ｔ、縦軸はプローブ画像における強度Ｉ（Ｔ）を表す。各グラフにおける強度Ｉ０は、背景画像の平均強度に相当する。プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の直径ｄ０、ｄ１、ｄ２は、例えば各横断線上であって画像上のプローブ粒子の円内に位置する強度Ｉ（Ｔ）の０次のピーク（凸部）の両脇にある１次のピーク（凸部）の頂点間の距離（図６（ａ）〜（ｃ）の各画像における白い輪の直径）ｄ１０、ｄ１１、ｄ１２とする。あるいは、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の直径ｄ０、ｄ１、ｄ２は、例えば各横断線上であって画像上のプローブ粒子の円内に位置する強度Ｉ（Ｔ）の０次のピーク（凸部）の両脇にある凹部の頂点間の距離（図６（ａ）〜（ｃ）の各画像における黒い輪の直径）ｄ２０、ｄ２１、ｄ２２であってもよい。
【００４１】
また、０次のピークの強度が平均強度Ｉ０より小さい場合というのはプローブ粒子が焦点面Ｆより上に位置することを意味する。一方、０次のピークの強度Ｉ（Ｔ＝０）が平均強度Ｉ０より大きい場合というのはプローブ粒子が焦点面Ｆより下に位置することを意味する。したがって、図７（ａ）〜（ｃ）より、プローブ粒子Ｐ２が焦点面Ｆより上に位置し、プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１が焦点面Ｆより下に位置することが示される。
【００４２】
再び図２を参照して画像情報処理装置１０の機能についての説明を続ける。大きさ規定値特定部１２は、撮像されたプローブ画像を撮像装置４から入力し、プローブ画像における複数のプローブ粒子Ｐそれぞれの大きさを規定する値の測定値である直径ｄを求める。すなわち、直径ｄは、図６に示したような画像に基づいて得られるグラフ（図７参照）に基づき、１次ピーク間の距離として求められる。大きさ規定値特定部１２は、直径ｄを位置分布算出部１３に出力する。
【００４３】
位置分布算出部１３は、大きさ規定値特定部１２からプローブ粒子Ｐの直径ｄを入力する。位置分布算出部１３は、校正データ格納部１１に格納された校正データとプローブ粒子Ｐの直径ｄとに基づいて、試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの位置情報を算出する。すなわち、位置分布算出部１３は、校正データ格納部１１から得た図３に示す校正データに基づき、大きさ規定値特定部１２で求められたプローブ粒子Ｐの直径の大きさがｄの時の焦点面Ｆからの距離（位置情報）Ｚを求める。また、焦点面Ｆの試料２１の表面２１ａからの距離をＺＦとすると、ＺＦは既知であるから、位置分布算出部１３は必要に応じて、ＺＦをこうして求められたＺに加えることにより試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの距離ＺＰを算出する。
【００４４】
位置分布算出部１３は、２次元のプローブ画像から各プローブ粒子の当該２次元上、すなわち試料２１の表面２１ａに投影させた２次元座標（ｘ、ｙ）を得る。そして、位置分布算出部１３は焦点面Ｆからの距離に基づき、所望の位置を原点にとり、各プローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）（例えば、ｚ＝Ｚ、あるいはｚ＝ＺＰ）を得る。
【００４５】
位置分布算出部１３は、複数のプローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）から試料２１の表面２１ａ上方を浮遊している複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。本実施形態における位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、試料２１の表面２１ａ上方であって、座標（ｘ、ｙ、ｚ）の位置におけるプローブ粒子Ｐの個数の分布を表す関数であり、式（３）で表される。
【数３】
A：定数
φ（ｘ、ｙ、ｚ）：静電的相互作用
ｎ０：φ（ｘ、ｙ、ｚ）＝０におけるプローブ粒子の個数（ｚが十分に大きいときに成立）
ｋ：Boltzmann定数
Ｔ：絶対温度
【００４６】
位置分布算出部１３は、こうして得た各プローブ粒子Ｐの位置分布である位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を電荷量算出部１４に出力する。
【００４７】
電荷量算出部１４は、位置分布算出部１３からプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を入力する。電荷量算出部１４は、プローブ粒子Ｐの位置分布に基づき、式（３）からプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。
【００４８】
電荷量算出部１４は、式（３）から求めた静電的相互作用に基づいて、試料２１の表面２１ａでの表面電位を（４）式により求める。
【数４】
【００４９】
電荷量算出部１４は、さらに、式（４）から求めた試料２１の表面電位に基づいて、試料２１の表面２１ａでの単位面積当たりの電荷量σを（５）式により求める。
【数５】
【００５０】
次に、図８及び図９を参照して、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａを用いる表面電荷量計測方法について説明し、併せて表面電荷量計測装置１Ａの動作についても説明する。図８は、表面電荷量計測方法の手順を示す図である。
【００５１】
まず、撮像装置４によって撮像された画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値である直径ｄと、基準面である結像光学系３の焦点面Ｆからのプローブ粒子Ｐの距離Ｚとの関係を示す校正データ（図３及び図４参照）を用意する（校正データ準備ステップＳ０１）。図９は、校正データを求めることについて説明するための図である。校正データは以下の手順で取得される。
【００５２】
すなわち、図９に示されるように、２枚のカバーガラスＧ１、Ｇ２の間に挟まれたプローブ粒子Ｐをｚ方向に移動する。すなわち、焦点面Ｆと一致する場合を基準（Ｚ＝０）とし、当該基準に対して上下方向（Ｚ＜０、Ｚ＞０）にカバーガラスＧ１、Ｇ２に挟まれたプローブ粒子Ｐを移動する。その際、各位置でのプローブ粒子Ｐのプローブ像が撮像装置４によって撮像され、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径ｄが求められる。こうして、焦点面Ｆからの距離Ｚに対するプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径ｄが求められ、校正データが得られる。得られた校正データは、画像処理装置１０の校正データ格納部１１に格納される。
【００５３】
再び図８に戻って、表面電荷量計測方法について説明を続ける。次に、基板２２の一方の表面に固定化ＤＮＡ分子２３を固定して試料２１を用意する。固定化ＤＮＡ分子２３は荷電しているため、固定化ＤＮＡ分子２３が基板２２表面に固定されることによって試料２１は荷電される。
【００５４】
さらに、純水２５で満たされた水槽２０を用意し、固定化ＤＮＡ分子２３が固定された表面と反対側の面が水槽２０の底面と接するように、試料２１を水槽２０の底面上に載置する。試料２１を水槽２０内に入れた後、複数の荷電されたプローブ粒子Ｐを水槽２０の純水２５内に浮遊させる。これにより、試料２１の表面２１ａ上方をプローブ粒子Ｐが浮遊するように、試料２１及びプローブ粒子Ｐが配置される（プローブ粒子準備ステップＳ０２）。また、必要に応じて、水槽２０内に検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させてもよい。
【００５５】
続いて、結像光学系３によって結ばれた複数のプローブ粒子Ｐの像が、撮像装置４によって撮像される（撮像ステップＳ０３）。プローブ画像には様々な位置座表を有する複数のプローブ粒子Ｐが撮像されていてもよい。撮像されたプローブ画像は、撮像装置４から画像処理装置１０の大きさ規定値特定部１２へ出力される。
【００５６】
プローブ画像が入力された大きさ規定値特定部１２では、撮像装置４で撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する測定値である直径ｄが求められる（大きさ規定値特定ステップＳ０４）。複数のプローブ粒子Ｐが撮像されている場合には、それらについての直径ｄが求められる。こうして求められた直径の大きさｄは、大きさ規定値特定部１２から位置分布算出部１３へ出力される。
【００５７】
直径ｄが入力された位置分布算出部１３では、校正データ格納部１１に格納された校正データと、大きさ規定値特定ステップＳ０４で求められたプローブ粒子Ｐの直径ｄと、に基づいて、基準面である焦点面Ｆからのプローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）が算出される。位置情算出部１３は、こうして求められた各プローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて、プローブ粒子Ｐの個数分布である位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する（位置分布算出ステップＳ０５）。こうして求められた各プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、位置分布算出部１３から電荷量算出部１４へ出力される。
【００５８】
プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が入力された電荷量算出部１４では、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される（電荷量算出ステップＳ０６）。電荷量算出部１４では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）から、式（３）によりプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）が算出される。さらに、静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）から、式（４）により試料２１の表面２１ａでの表面電位が算出される。さらに、表面２１ａでの表面電位から、式（５）により、試料２１の表面２１ａの単位面積当たりの電荷量σが算出され、表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００５９】
本実施形態に係る電荷量算出装置１Ａ及び電荷量算出方法では、こうして水槽２０内に複数のプローブ粒子Ｐが浮遊しているときの固定化ＤＮＡ分子２３が固定された基板２２から構成される試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００６０】
次いで、例えば固定化ＤＮＡ分子２３と相補的な親和性を有するＤＮＡ分子の検出する場合には、この計測系での校正データは既に取得されているため、校正データ準備ステップＳ０１を省略することができる。そして、水槽２０内の溶液を廃棄し、上述のプローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返す。すなわち、まず再度試料２１を底面に載置し、水槽２０内を純水２５で満たす。その後、水槽２０内に先ほどと同数のプローブ粒子Ｐ及び検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させ（プローブ粒子準備ステップＳ０２）、撮像ステップＳ０３、大きさ既定値特定ステップＳ０４、位置分布算出ステップＳ０５、及び電荷量算出ステップＳ０６を実行する。こうしてプローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返すことにより、様々なＤＮＡ分子の検出を行うことができる。
【００６１】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるこで、電荷量算出部１４では、試料２１の表面２１ａ電位を求めることが可能となる（式（３）及び（４）参照）。電荷量算出部１４ではさらに、式（５）から、表面電位に基づき試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【００６２】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法は、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【００６３】
すなわち、試料２１の基板２２に固定された固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合した場合、当該結合により試料２１の表面２１ａでの電荷量が変化する。これに伴い、結合箇所における試料２１の表面電位も変化する。そのため、固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合されている箇所の上方では、結合していない場合に比べプローブ粒子Ｐが試料２１から遠ざかる方向に移動する。したがって、結合が起こっている場合と起こっていない場合とでは、プローブ粒子Ｐの位置分布が変化し、電荷量にも変化が現れる。その結果、プローブ粒子Ｐのみであって検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊していない場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量と、プローブ粒子及び検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊している場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量とを比較検討することで反応を特定でき、さらには反応を定量的に分析することが可能となる。
【００６４】
特に、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返すことで、検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊していない場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量、及び検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊している場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量をそれぞれ非常に簡単に計測することができる。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、非常に簡便な方法で反応を特定でき、且つ定量的に分析することが可能となる。
【００６５】
このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法で計測しているのは、試料２１の表面２１ａにおける電気信号（例えば、電位等）ではなく、電荷量である。そのため、試料２１の表面２１ａにおいて固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合したことを特定することが可能となる。さらに、結合反応によって得られる電荷量を特定することもでき、これにより反応についての定量的な分析も可能となる。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法は、バイオセンシング分野への応用において非常に有用である。
【００６６】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【００６７】
試料２１は純水２５内に配置される。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【００６８】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、流動体（この場合、純水２５）に浮遊しているプローブ粒子Ｐを利用して計測がなされるため、血液中、尿中、あるいは脳などの組織液中の生体物質に対して適用できる。そのため、極微量の特定遺伝子や特定蛋白質の検出、さらには細胞の化学物質に対する応答評価や脳を主とする生体組織の機能評価などのライフサイエンス研究及び医療計測、あるいは農・水産物などの食品分析等に極めて役立つと考えられる。そして、その結果、従来に比べ迅速且つ簡便な標的遺伝子・蛋白質のセンシングシステムの開発につながり、ライフサイエンス研究、医療診断等に大きく寄与するほか、新規薬剤や環境汚染物質のハイスループットスクリーニングなどにも応用が期待される。
【００６９】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。
【００７０】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法それぞれでは、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐの直径ｄさえ求められればそのプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子Ｐの数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出することが可能であり、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００７１】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ画像によって得られるプローブ粒子Ｐの直径（プローブ粒子Ｐの大きさを規定する値）はプローブ粒子Ｐを撮像する方向に依存しない。その結果、プローブ粒子Ｐを如何なる方向からも撮像でき、電荷量の計測が容易になる。
【００７２】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する光源２を備えているため、自身で光を発しないプローブ粒子Ｐを用いて電荷量を計測することが可能となる。
【００７３】
（第２実施形態）
図１０は第２実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂの構成を示す図である。図１０に示すように表面電荷量計測装置１Ｂは、光源２と、水槽２０と、強度測定装置（強度測定手段）６と、演算処理装置（演算処理手段）３０と、表示装置（表示手段）５とを備える。表面電荷量計測装置１Ｂは、透明な基板２２と、当該透明基板２２の表面に固定された固定化ＤＮＡ分子２３とで構成される試料２１の表面２１ａの電荷量を計測する。
【００７４】
水槽２０の底面上には、試料２１が載置されている。水槽２０内では、試料２１の表面２１ａ上方において球体のプローブ粒子Ｐが複数浮遊している。必要に応じて、検出ＤＮＡ分子２４も水槽２０内に浮遊させてもよい。プローブ粒子Ｐとして例えば、径が約４０ｎｍの金のコロイド粒子を用いる。試料２１、検出ＤＮＡ分子２４、及びプローブ粒子Ｐは、同符号で荷電している。また、基板２２の屈折率は、基板２２と接する純水２５及び水槽２０のいずれの屈折率よりも高い。
【００７５】
光源２は、試料２１の表面２１ａと交差する試料２１の第１の側面２１ｂに斜めに入射光ｌ１を入射する。入射光ｌ１は、試料２１の表面２１ａ及び当該表面２１ａに対向する面において全反射しながら試料２１の基板２２内を伝播する。すなわち、基板２２は入射光ｌ１に対し光導波路として機能する。基板２２内を伝播した入射光ｌ１は、表面２１ａとは交差する試料２１の第２の側面２１ｃから出射光ｌ２として出射し、強度測定装置６に入射する。また、光源２は、入射光ｌ１の強度を測定し、測定された強度を演算処理装置３０へ出力する。
【００７６】
強度測定装置６は、試料２１の基板２２から出射された出射光ｌ２を入力とする。強度測定装置６は、出射光ｌ２の強度を測定し、測定された強度を演算処理装置３０へ出力する。
【００７７】
演算処理装置３０は、光源２から出力された入射光ｌ１の強度を、さらに強度測定装置６から出力された出射光ｌ２の強度をそれぞれ入力とする。演算処理装置３０は、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差からプローブ粒子Ｐの位置分布を算出し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出する。演算処理装置３０は、算出した試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示装置５へ出力する。
【００７８】
表示装置５は、演算処理装置３０から入力された試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示する。この表示装置５としては、例えば、ＣＲＴモニタや、液晶ディスプレイなどを用いることができる。
【００７９】
次に、図１１を参照して演算処理装置３０の機能について説明する。図１１に示すように、演算処理装置３０は、位置分布算出部（位置分布算出手段）３１と、電荷量算出部（電荷量算出手段）３２とを有する。
【００８０】
位置分布算出部３１は、光源２から入射光ｌ１の強度を、強度測定装置６から出射光ｌ２の強度を入力する。位置分布算出部３１は、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差に基づいて、式（６）より、複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【数６】
Ｉ１：入射光ｌ１の強度
Ｉ２：出射光ｌ２の強度
εｚ：試料表面（界面）からの距離zにおけるプローブ粒子の吸光係数
Ｃ：プローブ粒子の数密度（濃度）
ｌｚ：全反射光の試料表面（界面）からの距離ｚにおける光路長
ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）：試料表面（界面）からの距離ｚに分布するプローブ粒子の数
ｎ０：全プローブ粒子数
ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）／ｎ０：界面からの距離zにおけるプローブ粒子の分布関数
【００８１】
電荷量算出部１４は、位置分布算出部１３からプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を入力する。電荷量算出部１４は、プローブ粒子Ｐの位置分布に基づき、式（３）からプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。
【００８２】
電荷量算出部１４は、式（３）から求めた静電的相互作用に基づいて、試料２１の表面２１ａでの表面電位を（４）式により求める。電荷量算出部１４は、さらに、式（４）から求めた試料２１の表面電位に基づいて、試料２１の表面２１ａでの電荷量を（５）式により求める。
【００８３】
こうして、電荷量算出部１４が、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することで、表面電荷量計測装置１Ｂでは試料２１の表面２１ａでの電荷量が計測される。
【００８４】
次に、図１２を参照して、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂを用いる表面電荷量計測方法について説明し、併せて表面電荷量計測装置１Ｂの動作についても説明する。図１２は、表面電荷量計測方法の手順を示す図である。
【００８５】
まず、基板２２の一方の表面に固定化ＤＮＡ分子２３を固定して試料２１を用意する。 さらに、純水２５で満たされた水槽２０を用意し、固定化ＤＮＡ分子２３が固定された表面と反対側の面が水槽２０の底面と接するように、試料２１を水槽２０の底面上に載置する。試料２１を水槽２０内に入れた後、複数の荷電されたプローブ粒子Ｐを水槽２０の純水２５内に浮遊させる。これにより、試料２１の表面２１ａ上方をプローブ粒子Ｐが浮遊するように、試料２１及びプローブ粒子Ｐが配置される（プローブ粒子準備ステップＳ１２）。
【００８６】
次に、試料２１の表面２１ａで全反射しながら試料２１の基板２２内を伝播する入射光ｌ１を、表面２１ａと交差する試料２１の第１の側面２１ｂに斜めに入射させる（光入射ステップＳ１２）。基板２２の屈折率は、基板２２が接している純水２５及び水槽２０の何れよりも屈折率が高い。そのため、入射光を斜めに入れることで、試料２１の表面、すなわち基板２２の表面において入射光ｌ１が全反射を起こしながら、第２の側面２１ｃに向かって伝播する。
【００８７】
入射光ｌ１が基板２２の表面で全反射を起こすとき、その表面から外側にはエバネッセント光が浸みだしている。固定化ＤＮＡ分子２３の厚さは、エバネッセント光が浸みだす範囲（例えば、基板２２の外側に向かって約２００ｎｍの範囲）に比較して極めて薄い。また、プローブ粒子Ｐの径も例えば約４０ｎｍと非常に小さい。そのため、エバネッセント光が浸みだす範囲内にプローブ粒子Ｐは十分分布している。
【００８８】
プローブ粒子Ｐは、浸みだしたエバネッセント光を吸収する。そのため、入射光ｌ１が全反射を起こしながら、基板２２内を第２の側面２１ｃに向かって伝播している間にプローブ粒子Ｐに吸収された分だけ光の強度が減少している。
【００８９】
続いて、強度測定装置６において、表面２１ａと交差する試料２１の第２の側面２１ｃから出射する出射光ｌ２の強度が測定される（出射光強度測定ステップＳ１３）。光源２で測定された入射光ｌ１の強度及び強度測定装置６において測定された出射光ｌ２の強度が、演算処理装置３０に出力される。
【００９０】
入射光ｌ１の強度及び出射光ｌ２の強度が入力された演算処理装置３０の位置分布算出部３１では、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差に基づいて複数のプローブ粒子Ｐの位置分布が算出される（位置分布算出ステップＳ１４）。式（６）に基づき算出されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、位置分布算出部３１から電荷量算出部３２へ出力される。
【００９１】
プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が入力された電荷量算出部３２では、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される（電荷量算出ステップＳ１５）。電荷量算出部３２では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づき、式（３）〜（５）によって、試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００９２】
次いで、例えば固定化ＤＮＡ分子２３と相補的な親和性を有するＤＮＡ分子の検出する場合には、水槽２０内の溶液を廃棄し、上述のプローブ粒子準備ステップＳ１１〜電荷量算出ステップＳ１５を繰り返す。すなわち、まず再度試料２１を底面に載置し、水槽２０内を純水２５で満たす。その後、水槽２０内に先ほどと同数のプローブ粒子Ｐ及び検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させ（プローブ粒子準備ステップＳ１１）、光入射ステップＳ１２、位置分布算出ステップＳ１３、及び電荷量算出ステップＳ１４を実行する。こうしてプローブ粒子準備ステップＳ１２〜電荷量算出ステップＳ１６を繰り返すことにより、様々なＤＮＡ分子の検出を行うことができる。
【００９３】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めることで、式（３）〜（５）から、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【００９４】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法も、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法同様、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【００９５】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【００９６】
試料２１は純水２５内に載置されている。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【００９７】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。特に、本実施形態ではプローブ粒子Ｐとして非常に径の小さいもの（例えば約４０ｎｍ）を用い、さらに試料２１を光導波路として利用して計測にエバネッセント光を用いている。そのため、非常にミクロのスケールでの反応も検出することが可能となる。
【００９８】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法それぞれでは、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差さえ求められれば、そのプローブ粒子Ｐの位置分布（ｘ、ｙ、ｚ）が算出できる。そのため、プローブ粒子Ｐを複数用いる場合であっても、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）の算出に要する時間は非常に短いものとなる。その結果、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００９９】
ここで、エバネッセント光が浸みだす範囲にプローブ粒子が存在する場合に、プローブ粒子Ｐがエバネッセント光を吸収することを実証するための実施例をデータとともに示す。厚みの薄いガラス基板を光導波路として用い、径が４０ｎｍの金コロイド粒子（負電荷に荷電）をプローブ粒子Ｐとして利用した。
【０１００】
まず、図１７に、未処理のガラス基板（表面が負電荷に荷電）及び表面をアミノ化処理されたガラス基板（表面が正電荷に荷電）それぞれを金コロイド粒子が浮遊している純水中に配置し、ガラス基板への入射光と出射光との強度差を測定したグラフを示す。図１７のグラフＡが未処理のガラス基板の結果を表し、グラフＢがアミノ化処理されたガラス基板の結果を表す。図１７のグラフの横軸は吸収スペクトル（λ／ｎｍ）を表し、縦軸は入射光と出射光との強度差（A.U.）、すなわちエバネッセント光の吸収量を表す。図１７のグラフから、未処理のガラス基板では、エバネッセント光の吸収量がアミノ化処理されたガラス基板に比べ少ないことがわかる。これは、未処理のガラス基板表面がもつ負電荷と金コロイド粒子がもつ負電荷とが反発しあい、金コロイド粒子がガラス表面に近づきにくいことを示す。さらには、アミノ化処理されたガラス基板では、金コロイド粒子との間に静電的引力が働き、金コロイド粒子がガラス表面近傍に近づきやすくなることも理解される。
【０１０１】
図１８に、金コロイド粒子が浮遊しているイオン交換蒸留水中及び金コロイド粒子が浮遊しているリン酸緩衝液中それぞれに、未処理のガラス基板（表面が負電荷に荷電）を配置し、ガラス基板への入射光と出射光との強度差を測定したグラフを示す。図１８のグラフCがイオン交換蒸留水中に配置された結果を表し、グラフDがリン酸緩衝液中に配置された結果を表す。図１８のグラフの横軸は吸収スペクトル（λ／ｎｍ）を表し、縦軸は入射光と出射光との強度差（A.U.）、すなわちエバネッセント光の吸収量を表す。図１８のグラスから、リン酸緩衝液中の方がイオン交換蒸留水中に比べ、金コロイド粒子がガラス基板に近づきやすくなることが理解される。
【０１０２】
図１７のグラフから、ガラス基板表面の荷電状態を反映して入射光の強度に対する出射光の強度の比が変化する（プローブ粒子と基板表面に静電的引力が働く場合、この比は低下する）ことが実証された。また、図１８のグラフから、ガラス基板を配置する溶液によって、プローブ粒子である金コロイド粒子をガラス基板に近づきやすくさせることができることが実証された。これらの結果から、ガラス基板を光導波路として用い、エバネッセント光を利用した計測により、電荷量の測定をより一層簡便に行うことが可能なことが理解される。
【０１０３】
（第３実施形態）
図１３を参照して、第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃの構成について説明する。図１１は第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃの構成を示す図である。第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃは、試料２１の基板２２が不透明な基板２２Ａであって、当該不透明基板２２Ａに対する反射型の顕微鏡として構成されている点で第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと異なる。
【０１０４】
不透明な基板２２Ａは、例えば半導体デバイス、あるいは着色されたガラス基板等である。
【０１０５】
光源２は、水槽２０の斜め上方に位置する。光源２は、試料２１及びプローブ粒子Ｐを照射する光ｌを、その光軸が基板２２Ａに対して傾きを有するように出力する。
【０１０６】
一方、結像光学系３も、水槽２０の斜め上方に位置する。結像光学系３は、基板２２Ａ表面で反射された光の像を撮像装置４の受光面上に結ぶように、基板２２Ａに対して傾きを有して配置される。このように、表面電荷量計測装置１Ｃは、限外照明系を採用する。また、限外照明系を用いる場合、例えば作動距離の長い高倍率対物レンズを用いる方法、あるいは低倍率対物レンズにズーム光学系を組み合わせる方法、あるいは暗視野対物レンズを用いる方法などがある。
【０１０７】
本実施形態に係る表面電荷量算出装置１Ｃを用いる表面電荷量算出方法も、表面電荷量算出装置１Ａを用いる表面電荷量算出方法と同様、図８に示すような校正データ準備ステップＳ０１、プローブ粒子準備ステップＳ０２、撮像ステップＳ０３、大きさ規定値特定ステップＳ０４、位置分布算出ステップＳ０５、及び表面電荷量算出ステップＳ０６を備える。
【０１０８】
反射型の顕微鏡に同軸（明視野）照明系を用いると背景反射が対物レンズに入射されてしまいプローブ粒子の像が不明瞭となってしまう。表面電荷量算出装置１Ｃでは、限外（暗視野）照明系を用いているため、不透明な基板２２から構成される試料２１を計測する場合であっても、プローブ粒子Ｐの像を撮像することができる。これにより、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径を特定することが可能となるため、試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測することが可能となる。このように、本実施形態に係る表面電荷量算出装置１Ｃ及び表面電荷量算出方法では不透明な試料２１に対しても表面２１ａでの電荷量を計測することが可能となる。
【０１０９】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めることで、式（３）〜（５）から、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【０１１０】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法も、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法同様、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【０１１１】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【０１１２】
試料２１は純水２５内に載置されている。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【０１１３】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。
【０１１４】
また、一度の撮像で複数のプローブ粒子について位置を算出することができるため、実際の計測が容易となり、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【０１１５】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ粒子Ｐを如何なる方向からも撮像でき、実際の計測が容易になる。その結果、電荷量の計測が容易になる。
【０１１６】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する光源２を備えているため、自身で光を発しないプローブ粒子Ｐを用いて電荷量を算出することが可能となる。
【０１１７】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々なリアルタイムセンシング測定システムに応用することが可能である。例えば、図１４に示す測定システムのように、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと電気化学的測定装置４０とをともに備えていてもよい。すなわち、図１４に示す測定システムでは、表面電荷量計測装置１Ａにより試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測し、同時に電気化学的測定装置４０により試料２１で発生する電気信号を検出することができる。電気化学的測定装置４０は、参照電極４１、対向電極４２、ポテンシオスタット４３、及び電気信号表示装置４４を備える。基板２２上には、透明電極層（図示を省略）が形成されており、当該透明電極層が電気化学的測定装置４０の作用電極として機能する。
【０１１８】
あるいは、例えば、図１５に示す測定システムのように、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと物理的現象あるいは化学的現象を測定する半導体測定装置５０とをともに備えていてもよい。すなわち、図１５に示す測定システムでは、表面電荷量計測装置１Ａにより試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測し、同時に半導体測定装置５０により試料２１で発生する電気信号を検出することができる。半導体測定装置５０は、参照電極６１、半導体装置ＳＣ、及び電気信号表示装置６２を備える。半導体装置ＳＣは、ｎ＋層５１ａを有するＳｉ基板５１と、ＳｉＯ２層５２と、Ｓｉ３Ｎ４層５３と、Ｐｏｌｙ−Ｓｉ層５４と、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２層５５と、Ａｌ導体部５６と、Ａｕ／Ｔｉ層５７とを有する。また、半導体装置ＳＣは、拡張ゲート型（Extended Gate型）の電極部６３を有する。半導体装置ＳＣの電極部６３は、基板２２上に形成された透明電極層として形成される。電極部６３は、Ａｕ／Ｔｉ層５７と導線によって接続されている。
【０１１９】
図１６を参照して、半導体測定装置５０の半導体装置ＳＣの測定動作を説明する。図１６は、半導体測定装置５０の半導体装置ＳＣの測定動作を説明するための図である。半導体装置ＳＣは、機能的に、電荷供給部７１、電荷注入調節部７２、センシング部（電荷変換部）７３、障壁部７４、フローティングディフュージョン部７５、リセットゲート７６、及びリセットドレイン７７を備える。測定に際し、電荷供給部７１、障壁部７４およびリセットゲート７６にパルス電圧が印加され、フローティングディフュージョン部７５を除く他の電極に直流電圧が印加される。
【０１２０】
まず、図１６（ａ）に示すように、電荷供給部７１の電位を高く設定する。次に図１６（ｂ）に示すように、電荷供給部７１の電位を下げ、センシング部７３に電荷７８が注入されるようにする。続いて図１６（ｃ）に示すように、電荷供給部７１の電位を再び高く設定する。これにより、電荷７８は電荷注入調節部７２によってすりきられ、センシング部７３に蓄積される。
【０１２１】
続いて図１６（ｄ）に示すように、障壁部７４の電位を上げる。これにより、センシング部７３に蓄積されていた電荷７８がフローティングディフュージョン部７５に転送される。センシング部７３に蓄積されていた電荷７８が全てフローティングディフュージョン部７５に転送された後、図１６（ｅ）に示すように、障壁部７４の電位を下げて、電荷７８の転送を止める。フローティングディフュージョン部７５の電位は、転送されてきた電荷７８の量で決まり、この電位を出力として測定がなされる。
【０１２２】
その後、図１６（ｆ）に示すように、リセットゲート７６をオンし、リセットドレイン７７の電位にリセットし、図１６（ａ）に戻る。図１６（ａ）〜（ｆ）に示される動作を繰り返すことにより、電荷が外に出力され、測定がなされる。
【０１２３】
また、本発明は上記実施形態及び応用例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態では、生物学的反応であるＤＮＡ反応に適用した場合を例示したが、様々な分野に適用可能である。例えば、ＤＮＡ反応以外であっても、抗体や受容体、結合性蛋白質を用いることによる標的となる蛋白質、糖類等のバイオ分子の検出にも応用できる。さらには、生物学的反応に限らず、例えば化学的反応に適用してもよい。
【０１２４】
また、プローブ粒子Ｐの形状は球状に限らず、例えば棒状であってもよい。棒状プローブ粒子を用いた場合における、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値というのは、プローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さとなる。すなわち、例えば、プローブ画像においてプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さが同じである場合には、棒状のプローブ粒子は、長手方向と試料表面とが平行になるように分布している。一方、プローブ画像においてプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さが異なる場合には、棒状のプローブ粒子は、長手方向が試料表面に対して角度を有して分布している。したがって、プローブ画像におけるプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さを求めることによって、プローブ粒子Ｐの試料表面に対する位置情報としてプローブ粒子Ｐの試料表面に対する傾きが得られる。棒状のプローブ粒子Ｐは、試料表面と有機的に関連することによりその傾きが決定する。したがって、プローブ粒子Ｐの試料表面に対する傾きに基づいて、表面電位を算出することができる。
【０１２５】
また、プローブ粒子Ｐはポリスチレンラテックスあるいは金に限らず、他の材料からなるものであってもよい。また、プローブ粒子は液体に限らず、例えば気体中に浮遊していても、あるいは真空中に浮遊していてもよい。
【０１２６】
また、光源を有さず、例えばプローブ粒子Ｐ自身が蛍光を発光し、その像を撮像して試料２１の表面での電荷量を計測してもよい。光源に限定はなく、可視光、紫外線、赤外線、Ｘ線、電子線、あるいは中性子線など、どのような波長の光を出す光源であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図２】画像処理部の機能について説明するための図である。
【図３】校正データによって得られるグラフの図である。
【図４】実際の測定データを校正データとする場合における校正データの表を示す。
【図５】プローブ粒子と結像光学系の焦点面との関係を説明するための図である。
【図６】撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子の画像を表す図である。
【図７】プローブ画像における各プローブ粒子の強度を示すグラフの図である。
【図８】第１実施形態に係る表面電荷量算出方法の手順を示す図である。
【図９】校正データを求めることについて説明するための図である。
【図１０】第２実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図１１】演算処理部の機能について説明するための図である。
【図１２】第２実施形態に係る表面電荷量算出方法の手順を示す図である。
【図１３】第３実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図１４】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置を応用した測定システムの構成を示す図である。
【図１５】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置を応用した測定システムの構成を示す図である。
【図１６】半導体測定装置の半導体装置の測定動作を説明するための図である。
【図１７】ガラス基板への入射光とガラス基板からの出射光との強度差を測定したグラフを示す。
【図１８】ガラス基板への入射光とガラス基板からの出射光との強度差を測定したグラフを示す。
【符号の説明】
【０１２８】
１Ａ、１Ｂ、１Ｃ…表面電荷量計測装置、Ｐ…プローブ粒子、２…光源、３…結像光学系、４…撮像装置、５…表示装置、６…強度測定装置、１０…画像処理装置、１１…校正データ格納部、１２…大きさ規定値特定部、１３、３１…位置分布算出部、１４、３２…電荷量算出部、３０…演算処理装置、４０…電気化学的測定装置、４１…参照電極、４２…対向電極、４３…ポテンシオスタット、４４、６２…電気信号表示装置、５０…半導体測定装置、ＳＣ…半導体装置、６１…参照電極
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、化学的反応や生物学的反応を検出する方法として、反応に伴う電気信号（例えば電位）の変化を検出する方法が知られている。例えば、特異性の高い生体分子について、当該生体分子と親和性の高い標的分子を検出する場合、この生体分子を半導体基板に固定し標的分子との結合を当該半導体基板から出力される電気信号の変化によって検出する方法が検討されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−３３２４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、試料の表面における電荷量を簡便に計測することが可能な表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ところで、検出の対象が電気信号だけでは、結合反応を検証するのに十分ではない。すなわち、例えば電位の変化等を検出できたとしても、それだけでは反応を定量的に分析することができず、さらには当該電位変化が実際に結合反応によってもたらされたものであることの実証もできない。
【０００５】
通常、結合反応を特定するために、蛍光色素等で測定の対象物質を標識して直接観察されている。しかし、この場合標識操作が非常に煩雑となってしまうという問題があった。
【０００６】
こうした問題に対し、本願発明者等は、基板等の表面における電荷量を測定することで、基板表面での生体反応等を特定することができる上、定量的な分析も可能となることを見出した。そこで、本願発明者等は生物学的反応あるいは化学的反応等についての分析のさらなる発展に貢献すべく、試料表面での電荷量を簡便に計測することができる装置及び方法について鋭意研究を重ねた結果、ついに本願発明に想到するに至った。
【０００７】
かかる研究結果を踏まえ、本発明に係る表面電荷量計測装置は、荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測装置であって、複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出手段と、位置分布に基づいて試料表面での電荷量を算出する電荷量算出手段と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
上記の表面電荷量計測装置では、荷電された試料の表面上方に荷電プローブ粒子を分布させている。荷電されたプローブ粒子は、荷電された試料との間の静電的相互作用による影響を受けて分布する。そのため、プローブ粒子の位置分布を求めることにより、荷電された試料表面の電荷量を算出することが可能となる。また、荷電されたプローブ粒子の位置分布を求めるだけであるため、簡便に且つ低コストで試料表面の電荷量を計測することが可能となる。また、試料表面上に液体あるいは気体が存在し当該液体等が流動している場合であっても、プローブ粒子は浮遊しているため、流動によって妨げられることなく試料表面での電荷量を計測することが可能となる。また、プローブ粒子の大きさを変えることで所望の分解能で電荷量を計測することが可能となる。
【０００９】
プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像に基づいて、試料の表面での電荷量を計測する上記の表面電荷量計測装置であって、プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定手段をさらに備え、位置分布算出手段は、プローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からのプローブ粒子の距離との関係を示す校正データと、大きさ規定値特定手段で求められた測定値と、に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００１０】
この表面電荷量計測装置では、プローブ画像における各プローブ粒子の大きさを規定する測定値さえ求められればそのプローブ粒子の位置分布が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子の数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが可能であり、表面での電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００１１】
あるいは、光の強度を測定する強度測定手段をさらに備え、表面と交差する試料の第１の側面に斜めに入射光を入射させることにより試料の表面での電荷量を計測する上記の表面電荷量計測装置であって、入射光は、試料表面において全反射しながら試料内を伝播した後、表面とは交差する試料の第２の側面から出射光として出射していくよう第１の側面に入射され、位置分布算出手段は、入射光の強度と出射光の強度との強度差に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００１２】
この表面電荷量計測装置では、入射光が表面において全反射しながら試料内を伝播するため、試料表面近傍の試料外側にエバネッセント光が浸透する。エバネッセント光の強度Ｅは、界面（試料表面）での光強度をＥ０とすると、式（１）で表される。
【数１】
X：界面からの距離
dp：エバネッセント光の強度が界面での強度の1/eになるときの界面からの距離
【００１３】
式（１）から理解されるように、エバネッセント光の強度Ｅは、界面から離れるにしたがって指数関数的に減衰する。エバネッセント光の到達距離ｄｐは略波長オーダーとされ、以下の式（２）で表される。
【数２】
λ：入射光の波長
ｎ１：試料の屈折率
ｎ２：試料と界面で接する媒質の屈折率
θ：試料表面の法線に対する入射光の角度
【００１４】
例えば、波長４００ｎｍの光を入射光とし、石英ガラス（ｎ１＝１．４７）を試料として用い、水（ｎ２＝１．３３）を試料と界面で接する媒質として用意し、試料表面の法線に対する入射光の角度を７０°（試料内では６６．８°を用いる。）を用いた場合、式（２）から約２７０ｎｍがエバネッセント光の到達距離ｄｐとして得られる。実際に、吸収に寄与するエバネッセント光の最高到達距離は３ｄｐとされているので、光の吸収は約８１０ｎｍまで起こると考えられる。上記の表面電荷量計測装置は、このエバネッセント光を用いてプローブ粒子の位置分布を算出するため、非常に小さいスケールで試料表面を計測することができる。また、通常、荷電された抗体蛋白質を試料表面に固定化した場合、標的抗原の検出及びその定量分析が可能となる。
【００１５】
プローブ粒子が球体であることが好ましい。この場合、プローブ粒子の扱いが容易となるため、上記表面電荷量計測装置はより一層簡便に試料表面での電荷量を計測することが可能となる。
【００１６】
試料は、荷電物質が表面に固定されることによって荷電されることが好ましい。例えば荷電されたＤＮＡ分子が試料の表面に固定された場合、標的分子の検出だけでなく結合反応の定量的な分析も可能となる。
【００１７】
一方、本発明に係る表面電荷量計測方法は、荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測方法であって、複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出ステップと、位置分布に基づいて試料表面での電荷量を算出する電荷量算出ステップと、を備えることを特徴とする。
【００１８】
上記の表面電荷量計測方法では、荷電された試料の表面上方に荷電プローブ粒子を分布させている。荷電されたプローブ粒子は、荷電された試料との間の静電的相互作用による影響を受けて分布する。そのため、プローブ粒子の位置分布を求めることにより、荷電された試料表面の電荷量を算出することが可能となる。また、荷電されたプローブ粒子の位置分布を求めるだけであるため、簡便に且つ低コストで試料表面の電荷量を計測することが可能となる。また、試料表面上に液体あるいは気体が存在し当該液体等が流動している場合であっても、プローブ粒子は浮遊しているため、流動によって妨げられることなく試料表面での電荷量を計測することが可能となる。また、プローブ粒子の大きさを変えることで所望の分解能で電荷量を計測することが可能となる。
【００１９】
プローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からのプローブ粒子の距離との関係を示す校正データを用意する校正データ準備ステップと、プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像におけるプローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定ステップと、をさらに備え、位置分布算出ステップは、校正データと大きさ規定値特定手段で求められた測定値とに基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００２０】
上記表面電荷量計測方法では、プローブ画像における各プローブ粒子の大きさを規定する測定値さえ求められればそのプローブ粒子の位置分布が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子の数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが可能であり、表面での電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００２１】
あるいは、試料表面で全反射しながら試料内を伝播する強度の測定された入射光を、表面と交差する試料の第１の側面に斜めに入射させる光入射ステップと、入射光として入射し試料内を伝播した後、表面と交差する試料の第２の側面から出射する出射光の強度を測定する出射光強度測定ステップと、をさらに備え、位置分布算出ステップは、入射光の強度と出射光の強度との強度差に基づいて、複数のプローブ粒子の位置分布を算出することが好ましい。
【００２２】
上記表面電荷量計測方法では、入射光が表面において全反射しながら試料内を伝播するため、試料表面近傍の試料外側にエバネッセント光が浸透する。上記の表面電荷量計測方法は、このエバネッセント光を用いてプローブ粒子の位置分布を算出するため、非常に小さいスケールで試料表面を計測することができる。
【００２３】
プローブ粒子が球体であることが好ましい。この場合、プローブ粒子の扱いが容易となるため、上記表面電荷量計測方法はより一層簡便に試料表面での電荷量を計測することが可能となる。
【００２４】
試料は、荷電物質が表面に固定されることによって荷電されることが好ましい。例えば荷電されたＤＮＡ分子が試料の表面に固定された場合、標的分子の検出だけでなく結合反応の定量的な分析も可能となる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、試料の表面における電荷量を簡便に計測することが可能な表面電荷量計測装置及び表面電荷量計測方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、添付図面を参照して、好適な実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
【００２７】
（第１実施形態）
図１は第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａの構成を示す図である。図１に示すように表面電荷量計測装置１Ａは、光源２と、水槽２０と、結像光学系（結像手段）３と、撮像装置（撮像手段）４と、画像処理装置（画像処理手段）１０と、表示装置（表示手段）５とを備える。表面電荷量計測装置１Ａは、透明な基板２２と、当該透明基板２２の表面に固定された固定化ＤＮＡ分子２３とで構成される試料２１の表面２１ａの電荷量を計測する。
【００２８】
水槽２０は、一面が開口した透明材質からなる容器である。水槽２０内には、例えば純水２５が満たされている。水槽２０の底面上には、試料２１が、固定化ＤＮＡ分子２３が固定されていない面が水槽２０の底面と接するように載置されている。水槽２０内では、試料２１の表面２１ａ上方において球体のプローブ粒子Ｐが複数浮遊している。必要に応じて、検出ＤＮＡ分子２４も水槽２０内に浮遊させてもよい。プローブ粒子Ｐとして例えば、径が約１μｍのポリスチレンラテックス微粒子を用いる。試料２１、検出ＤＮＡ分子２４、及びプローブ粒子Ｐは、同符号で荷電している。試料２１は、荷電物質である固定化ＤＮＡ分子２３がその表面に固定されることによって荷電する。
【００２９】
光源２は、水槽２０の上方に、すなわち水槽２０の試料２１が載置されている底面とは反対側に位置する。光源２は、試料２１及びプローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する。表面電荷量計測装置１Ａは、光源２に対してさらに集光レンズ２Ａを備えている。集光レンズ２Ａは、光源２から出力された光ｌを集光して、水槽２０内に入射させる。
【００３０】
結像光学系３は、水槽２０の下方に、すなわち水槽２０の底面側に位置する。結像光学系３は、光源２から出力された光ｌによって照射されたプローブ粒子Ｐの像（プローブ像）を撮像装置４の受光面上に結ぶ。試料２１は後述の結像光学系３の焦点面Ｆとは一致せず、本実施形態では試料２１は結像光学系３の焦点面Ｆが水槽２０内に位置するように配置される。
【００３１】
撮像装置４は、結像光学系３によって結像されたプローブ像を撮像するＣＣＤカメラである。撮像装置４は、プローブ像を撮像して得られたプローブ画像を画像処理装置１０に出力する。
【００３２】
画像処理装置１０は、撮像されたプローブ画像を撮像装置４から入力する。画像処理装置１０は、撮像装置４から出力されたプローブ画像からプローブ粒子Ｐの位置分布を算出し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出する。画像処理装置１０は、算出した試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示装置５へ出力する。なお、画像処理装置１０は、必要に応じてプローブ画像も表示装置５へ出力してもよい。
【００３３】
表示装置５は、画像処理装置１０から入力された試料２１の表面２１ａでの電荷量あるいはプローブ画像を表示する。この表示装置５としては、例えば、ＣＲＴモニタや、液晶ディスプレイなどを用いることができる。
【００３４】
次に、図２を参照して画像処理装置１０の機能について説明する。図２に示すように、画像処理装置１０は、校正データ格納部１１と、大きさ規定値特定部１２と、位置分布算出部１３と、電荷量算出部１４とを有する。
【００３５】
校正データ格納部１１には、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値とプローブ粒子Ｐの試料２１の表面２１ａからの距離との関係を示す校正データが格納されている。本実施形態ではプローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ粒子Ｐの大きさを規定する値を、画像上におけるプローブ粒子Ｐの直径とする。
【００３６】
図３に校正データによって得られるグラフを示す。図３のグラフの横軸は試料２１の表面２１ａに直交する方向（以下、ｚ方向という）での結像光学系３の焦点面Ｆからの距離Ｚ（μｍ）を表し、縦軸はプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径の大きさｄ（μｍ）を表す。結像光学系３の焦点面Ｆは、プローブ粒子の位置を特定するための基準面として機能する。図３のグラフにおける円は実際の測定データを表し、曲線はこれらの測定データに対してフィッティングを行った結果である。校正データ格納部１１は、例えばフィッティングによって得られた関係式を校正データとして格納する。あるいは、校正データ格納部１１は、例えば実際の測定データを校正データとして格納する。図４に、校正データ格納部１１が実際の測定データを校正データとして格納する場合における校正データの表を示す。
【００３７】
試料２１の表面２１ａからの結像光学系３の焦点面Ｆの位置は既知である。したがって図３のグラフから理解されるように、校正データによれば、プローブ粒子Ｐの直径の大きさｄを得ることによって、試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの距離Ｚを求めることができる。ここで、焦点面Ｆからそれぞれ距離Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２だけ離れているプローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の、距離Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２とプローブ画像における直径ｄ０、ｄ１、ｄ２との関係を説明する。説明に際し、図５〜６を参照する。
【００３８】
図５は、プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２と焦点面Ｆとの関係を説明するための図である。図５に示されているように、プローブ粒子Ｐ０は焦点面Ｆに位置し、焦点面ＦからＺ０（Ｚ０＝０）だけ離れている。プローブ粒子Ｐ１は焦点面Ｆに対しＺ１（＜Ｚ０）の位置にある。プローブ粒子Ｐ２は焦点面Ｆに対しＺ２（＞Ｚ０）の位置にある。
【００３９】
図６は、撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の画像である。図６（ａ）はプローブ粒子Ｐ０の、図６（ｂ）はプローブ粒子Ｐ１の、図６（ｃ）はプローブ粒子Ｐ２の画像である。図６に示されるように、焦点面Ｆに位置するプローブ粒子Ｐ０の画像（図６（ｂ））における円の大きさ（直径の大きさ）は、他のプローブ粒子Ｐ１、Ｐ２の画像（図６（ａ）、（ｃ））における円（直径）に比べて小さくなる。図６（ａ）に示された二点鎖線Ｔ２、図６（ｂ）に示された二点鎖線Ｔ０、図６（ｃ）に示された二点鎖線Ｔ１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の中心点を通り、各プローブ粒子の画像を横断する線である。また、図６（ａ）に示された直径ｄ１２、図６（ｂ）に示された直径ｄ１０、図６（ｃ）に示された直径ｄ１１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の白い輪で表される像の直径である。図６（ａ）に示された直径ｄ２２、図６（ｂ）に示された直径ｄ２０、図６（ｃ）に示された直径ｄ２１はそれぞれプローブ画像におけるプローブ粒子の黒い輪で表される像の直径である。
【００４０】
図７は、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の強度を示すグラフである。図７（ａ）はプローブ粒子Ｐ０の、図７（ｂ）はプローブ粒子Ｐ１の、図７（ｃ）はプローブ粒子Ｐ２のグラフである。各グラフの横軸は図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示された横断線Ｔ２、Ｔ０、Ｔ１上の位置Ｔ、縦軸はプローブ画像における強度Ｉ（Ｔ）を表す。各グラフにおける強度Ｉ０は、背景画像の平均強度に相当する。プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の直径ｄ０、ｄ１、ｄ２は、例えば各横断線上であって画像上のプローブ粒子の円内に位置する強度Ｉ（Ｔ）の０次のピーク（凸部）の両脇にある１次のピーク（凸部）の頂点間の距離（図６（ａ）〜（ｃ）の各画像における白い輪の直径）ｄ１０、ｄ１１、ｄ１２とする。あるいは、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２の直径ｄ０、ｄ１、ｄ２は、例えば各横断線上であって画像上のプローブ粒子の円内に位置する強度Ｉ（Ｔ）の０次のピーク（凸部）の両脇にある凹部の頂点間の距離（図６（ａ）〜（ｃ）の各画像における黒い輪の直径）ｄ２０、ｄ２１、ｄ２２であってもよい。
【００４１】
また、０次のピークの強度が平均強度Ｉ０より小さい場合というのはプローブ粒子が焦点面Ｆより上に位置することを意味する。一方、０次のピークの強度Ｉ（Ｔ＝０）が平均強度Ｉ０より大きい場合というのはプローブ粒子が焦点面Ｆより下に位置することを意味する。したがって、図７（ａ）〜（ｃ）より、プローブ粒子Ｐ２が焦点面Ｆより上に位置し、プローブ粒子Ｐ０、Ｐ１が焦点面Ｆより下に位置することが示される。
【００４２】
再び図２を参照して画像情報処理装置１０の機能についての説明を続ける。大きさ規定値特定部１２は、撮像されたプローブ画像を撮像装置４から入力し、プローブ画像における複数のプローブ粒子Ｐそれぞれの大きさを規定する値の測定値である直径ｄを求める。すなわち、直径ｄは、図６に示したような画像に基づいて得られるグラフ（図７参照）に基づき、１次ピーク間の距離として求められる。大きさ規定値特定部１２は、直径ｄを位置分布算出部１３に出力する。
【００４３】
位置分布算出部１３は、大きさ規定値特定部１２からプローブ粒子Ｐの直径ｄを入力する。位置分布算出部１３は、校正データ格納部１１に格納された校正データとプローブ粒子Ｐの直径ｄとに基づいて、試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの位置情報を算出する。すなわち、位置分布算出部１３は、校正データ格納部１１から得た図３に示す校正データに基づき、大きさ規定値特定部１２で求められたプローブ粒子Ｐの直径の大きさがｄの時の焦点面Ｆからの距離（位置情報）Ｚを求める。また、焦点面Ｆの試料２１の表面２１ａからの距離をＺＦとすると、ＺＦは既知であるから、位置分布算出部１３は必要に応じて、ＺＦをこうして求められたＺに加えることにより試料２１の表面２１ａからのプローブ粒子Ｐの距離ＺＰを算出する。
【００４４】
位置分布算出部１３は、２次元のプローブ画像から各プローブ粒子の当該２次元上、すなわち試料２１の表面２１ａに投影させた２次元座標（ｘ、ｙ）を得る。そして、位置分布算出部１３は焦点面Ｆからの距離に基づき、所望の位置を原点にとり、各プローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）（例えば、ｚ＝Ｚ、あるいはｚ＝ＺＰ）を得る。
【００４５】
位置分布算出部１３は、複数のプローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）から試料２１の表面２１ａ上方を浮遊している複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。本実施形態における位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、試料２１の表面２１ａ上方であって、座標（ｘ、ｙ、ｚ）の位置におけるプローブ粒子Ｐの個数の分布を表す関数であり、式（３）で表される。
【数３】
A：定数
φ（ｘ、ｙ、ｚ）：静電的相互作用
ｎ０：φ（ｘ、ｙ、ｚ）＝０におけるプローブ粒子の個数（ｚが十分に大きいときに成立）
ｋ：Boltzmann定数
Ｔ：絶対温度
【００４６】
位置分布算出部１３は、こうして得た各プローブ粒子Ｐの位置分布である位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を電荷量算出部１４に出力する。
【００４７】
電荷量算出部１４は、位置分布算出部１３からプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を入力する。電荷量算出部１４は、プローブ粒子Ｐの位置分布に基づき、式（３）からプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。
【００４８】
電荷量算出部１４は、式（３）から求めた静電的相互作用に基づいて、試料２１の表面２１ａでの表面電位を（４）式により求める。
【数４】
【００４９】
電荷量算出部１４は、さらに、式（４）から求めた試料２１の表面電位に基づいて、試料２１の表面２１ａでの単位面積当たりの電荷量σを（５）式により求める。
【数５】
【００５０】
次に、図８及び図９を参照して、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａを用いる表面電荷量計測方法について説明し、併せて表面電荷量計測装置１Ａの動作についても説明する。図８は、表面電荷量計測方法の手順を示す図である。
【００５１】
まず、撮像装置４によって撮像された画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値である直径ｄと、基準面である結像光学系３の焦点面Ｆからのプローブ粒子Ｐの距離Ｚとの関係を示す校正データ（図３及び図４参照）を用意する（校正データ準備ステップＳ０１）。図９は、校正データを求めることについて説明するための図である。校正データは以下の手順で取得される。
【００５２】
すなわち、図９に示されるように、２枚のカバーガラスＧ１、Ｇ２の間に挟まれたプローブ粒子Ｐをｚ方向に移動する。すなわち、焦点面Ｆと一致する場合を基準（Ｚ＝０）とし、当該基準に対して上下方向（Ｚ＜０、Ｚ＞０）にカバーガラスＧ１、Ｇ２に挟まれたプローブ粒子Ｐを移動する。その際、各位置でのプローブ粒子Ｐのプローブ像が撮像装置４によって撮像され、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径ｄが求められる。こうして、焦点面Ｆからの距離Ｚに対するプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径ｄが求められ、校正データが得られる。得られた校正データは、画像処理装置１０の校正データ格納部１１に格納される。
【００５３】
再び図８に戻って、表面電荷量計測方法について説明を続ける。次に、基板２２の一方の表面に固定化ＤＮＡ分子２３を固定して試料２１を用意する。固定化ＤＮＡ分子２３は荷電しているため、固定化ＤＮＡ分子２３が基板２２表面に固定されることによって試料２１は荷電される。
【００５４】
さらに、純水２５で満たされた水槽２０を用意し、固定化ＤＮＡ分子２３が固定された表面と反対側の面が水槽２０の底面と接するように、試料２１を水槽２０の底面上に載置する。試料２１を水槽２０内に入れた後、複数の荷電されたプローブ粒子Ｐを水槽２０の純水２５内に浮遊させる。これにより、試料２１の表面２１ａ上方をプローブ粒子Ｐが浮遊するように、試料２１及びプローブ粒子Ｐが配置される（プローブ粒子準備ステップＳ０２）。また、必要に応じて、水槽２０内に検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させてもよい。
【００５５】
続いて、結像光学系３によって結ばれた複数のプローブ粒子Ｐの像が、撮像装置４によって撮像される（撮像ステップＳ０３）。プローブ画像には様々な位置座表を有する複数のプローブ粒子Ｐが撮像されていてもよい。撮像されたプローブ画像は、撮像装置４から画像処理装置１０の大きさ規定値特定部１２へ出力される。
【００５６】
プローブ画像が入力された大きさ規定値特定部１２では、撮像装置４で撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する測定値である直径ｄが求められる（大きさ規定値特定ステップＳ０４）。複数のプローブ粒子Ｐが撮像されている場合には、それらについての直径ｄが求められる。こうして求められた直径の大きさｄは、大きさ規定値特定部１２から位置分布算出部１３へ出力される。
【００５７】
直径ｄが入力された位置分布算出部１３では、校正データ格納部１１に格納された校正データと、大きさ規定値特定ステップＳ０４で求められたプローブ粒子Ｐの直径ｄと、に基づいて、基準面である焦点面Ｆからのプローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）が算出される。位置情算出部１３は、こうして求められた各プローブ粒子Ｐの３次元座標（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて、プローブ粒子Ｐの個数分布である位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する（位置分布算出ステップＳ０５）。こうして求められた各プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、位置分布算出部１３から電荷量算出部１４へ出力される。
【００５８】
プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が入力された電荷量算出部１４では、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される（電荷量算出ステップＳ０６）。電荷量算出部１４では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）から、式（３）によりプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）が算出される。さらに、静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）から、式（４）により試料２１の表面２１ａでの表面電位が算出される。さらに、表面２１ａでの表面電位から、式（５）により、試料２１の表面２１ａの単位面積当たりの電荷量σが算出され、表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００５９】
本実施形態に係る電荷量算出装置１Ａ及び電荷量算出方法では、こうして水槽２０内に複数のプローブ粒子Ｐが浮遊しているときの固定化ＤＮＡ分子２３が固定された基板２２から構成される試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００６０】
次いで、例えば固定化ＤＮＡ分子２３と相補的な親和性を有するＤＮＡ分子の検出する場合には、この計測系での校正データは既に取得されているため、校正データ準備ステップＳ０１を省略することができる。そして、水槽２０内の溶液を廃棄し、上述のプローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返す。すなわち、まず再度試料２１を底面に載置し、水槽２０内を純水２５で満たす。その後、水槽２０内に先ほどと同数のプローブ粒子Ｐ及び検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させ（プローブ粒子準備ステップＳ０２）、撮像ステップＳ０３、大きさ既定値特定ステップＳ０４、位置分布算出ステップＳ０５、及び電荷量算出ステップＳ０６を実行する。こうしてプローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返すことにより、様々なＤＮＡ分子の検出を行うことができる。
【００６１】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるこで、電荷量算出部１４では、試料２１の表面２１ａ電位を求めることが可能となる（式（３）及び（４）参照）。電荷量算出部１４ではさらに、式（５）から、表面電位に基づき試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【００６２】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法は、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【００６３】
すなわち、試料２１の基板２２に固定された固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合した場合、当該結合により試料２１の表面２１ａでの電荷量が変化する。これに伴い、結合箇所における試料２１の表面電位も変化する。そのため、固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合されている箇所の上方では、結合していない場合に比べプローブ粒子Ｐが試料２１から遠ざかる方向に移動する。したがって、結合が起こっている場合と起こっていない場合とでは、プローブ粒子Ｐの位置分布が変化し、電荷量にも変化が現れる。その結果、プローブ粒子Ｐのみであって検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊していない場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量と、プローブ粒子及び検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊している場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量とを比較検討することで反応を特定でき、さらには反応を定量的に分析することが可能となる。
【００６４】
特に、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子準備ステップＳ０２〜電荷量算出ステップＳ０６を繰り返すことで、検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊していない場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量、及び検出ＤＮＡ分子２４が水槽２０内に浮遊している場合における試料２１の表面２１ａでの電荷量をそれぞれ非常に簡単に計測することができる。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、非常に簡便な方法で反応を特定でき、且つ定量的に分析することが可能となる。
【００６５】
このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法で計測しているのは、試料２１の表面２１ａにおける電気信号（例えば、電位等）ではなく、電荷量である。そのため、試料２１の表面２１ａにおいて固定化ＤＮＡ分子２３と検出ＤＮＡ分子２４とが結合したことを特定することが可能となる。さらに、結合反応によって得られる電荷量を特定することもでき、これにより反応についての定量的な分析も可能となる。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法は、バイオセンシング分野への応用において非常に有用である。
【００６６】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【００６７】
試料２１は純水２５内に配置される。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【００６８】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、流動体（この場合、純水２５）に浮遊しているプローブ粒子Ｐを利用して計測がなされるため、血液中、尿中、あるいは脳などの組織液中の生体物質に対して適用できる。そのため、極微量の特定遺伝子や特定蛋白質の検出、さらには細胞の化学物質に対する応答評価や脳を主とする生体組織の機能評価などのライフサイエンス研究及び医療計測、あるいは農・水産物などの食品分析等に極めて役立つと考えられる。そして、その結果、従来に比べ迅速且つ簡便な標的遺伝子・蛋白質のセンシングシステムの開発につながり、ライフサイエンス研究、医療診断等に大きく寄与するほか、新規薬剤や環境汚染物質のハイスループットスクリーニングなどにも応用が期待される。
【００６９】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。
【００７０】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法それぞれでは、プローブ画像における各プローブ粒子Ｐの直径ｄさえ求められればそのプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が算出できる。そのため、プローブ画像に撮像されたプローブ粒子Ｐの数が複数であっても、当該撮像された複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出することが可能であり、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００７１】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ画像によって得られるプローブ粒子Ｐの直径（プローブ粒子Ｐの大きさを規定する値）はプローブ粒子Ｐを撮像する方向に依存しない。その結果、プローブ粒子Ｐを如何なる方向からも撮像でき、電荷量の計測が容易になる。
【００７２】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する光源２を備えているため、自身で光を発しないプローブ粒子Ｐを用いて電荷量を計測することが可能となる。
【００７３】
（第２実施形態）
図１０は第２実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂの構成を示す図である。図１０に示すように表面電荷量計測装置１Ｂは、光源２と、水槽２０と、強度測定装置（強度測定手段）６と、演算処理装置（演算処理手段）３０と、表示装置（表示手段）５とを備える。表面電荷量計測装置１Ｂは、透明な基板２２と、当該透明基板２２の表面に固定された固定化ＤＮＡ分子２３とで構成される試料２１の表面２１ａの電荷量を計測する。
【００７４】
水槽２０の底面上には、試料２１が載置されている。水槽２０内では、試料２１の表面２１ａ上方において球体のプローブ粒子Ｐが複数浮遊している。必要に応じて、検出ＤＮＡ分子２４も水槽２０内に浮遊させてもよい。プローブ粒子Ｐとして例えば、径が約４０ｎｍの金のコロイド粒子を用いる。試料２１、検出ＤＮＡ分子２４、及びプローブ粒子Ｐは、同符号で荷電している。また、基板２２の屈折率は、基板２２と接する純水２５及び水槽２０のいずれの屈折率よりも高い。
【００７５】
光源２は、試料２１の表面２１ａと交差する試料２１の第１の側面２１ｂに斜めに入射光ｌ１を入射する。入射光ｌ１は、試料２１の表面２１ａ及び当該表面２１ａに対向する面において全反射しながら試料２１の基板２２内を伝播する。すなわち、基板２２は入射光ｌ１に対し光導波路として機能する。基板２２内を伝播した入射光ｌ１は、表面２１ａとは交差する試料２１の第２の側面２１ｃから出射光ｌ２として出射し、強度測定装置６に入射する。また、光源２は、入射光ｌ１の強度を測定し、測定された強度を演算処理装置３０へ出力する。
【００７６】
強度測定装置６は、試料２１の基板２２から出射された出射光ｌ２を入力とする。強度測定装置６は、出射光ｌ２の強度を測定し、測定された強度を演算処理装置３０へ出力する。
【００７７】
演算処理装置３０は、光源２から出力された入射光ｌ１の強度を、さらに強度測定装置６から出力された出射光ｌ２の強度をそれぞれ入力とする。演算処理装置３０は、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差からプローブ粒子Ｐの位置分布を算出し、当該位置分布から試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出する。演算処理装置３０は、算出した試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示装置５へ出力する。
【００７８】
表示装置５は、演算処理装置３０から入力された試料２１の表面２１ａでの電荷量を表示する。この表示装置５としては、例えば、ＣＲＴモニタや、液晶ディスプレイなどを用いることができる。
【００７９】
次に、図１１を参照して演算処理装置３０の機能について説明する。図１１に示すように、演算処理装置３０は、位置分布算出部（位置分布算出手段）３１と、電荷量算出部（電荷量算出手段）３２とを有する。
【００８０】
位置分布算出部３１は、光源２から入射光ｌ１の強度を、強度測定装置６から出射光ｌ２の強度を入力する。位置分布算出部３１は、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差に基づいて、式（６）より、複数のプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【数６】
Ｉ１：入射光ｌ１の強度
Ｉ２：出射光ｌ２の強度
εｚ：試料表面（界面）からの距離zにおけるプローブ粒子の吸光係数
Ｃ：プローブ粒子の数密度（濃度）
ｌｚ：全反射光の試料表面（界面）からの距離ｚにおける光路長
ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）：試料表面（界面）からの距離ｚに分布するプローブ粒子の数
ｎ０：全プローブ粒子数
ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）／ｎ０：界面からの距離zにおけるプローブ粒子の分布関数
【００８１】
電荷量算出部１４は、位置分布算出部１３からプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を入力する。電荷量算出部１４は、プローブ粒子Ｐの位置分布に基づき、式（３）からプローブ粒子Ｐと試料２１の表面２１ａとの間の静電的相互作用φ（ｘ、ｙ、ｚ）を求める。
【００８２】
電荷量算出部１４は、式（３）から求めた静電的相互作用に基づいて、試料２１の表面２１ａでの表面電位を（４）式により求める。電荷量算出部１４は、さらに、式（４）から求めた試料２１の表面電位に基づいて、試料２１の表面２１ａでの電荷量を（５）式により求める。
【００８３】
こうして、電荷量算出部１４が、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することで、表面電荷量計測装置１Ｂでは試料２１の表面２１ａでの電荷量が計測される。
【００８４】
次に、図１２を参照して、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂを用いる表面電荷量計測方法について説明し、併せて表面電荷量計測装置１Ｂの動作についても説明する。図１２は、表面電荷量計測方法の手順を示す図である。
【００８５】
まず、基板２２の一方の表面に固定化ＤＮＡ分子２３を固定して試料２１を用意する。 さらに、純水２５で満たされた水槽２０を用意し、固定化ＤＮＡ分子２３が固定された表面と反対側の面が水槽２０の底面と接するように、試料２１を水槽２０の底面上に載置する。試料２１を水槽２０内に入れた後、複数の荷電されたプローブ粒子Ｐを水槽２０の純水２５内に浮遊させる。これにより、試料２１の表面２１ａ上方をプローブ粒子Ｐが浮遊するように、試料２１及びプローブ粒子Ｐが配置される（プローブ粒子準備ステップＳ１２）。
【００８６】
次に、試料２１の表面２１ａで全反射しながら試料２１の基板２２内を伝播する入射光ｌ１を、表面２１ａと交差する試料２１の第１の側面２１ｂに斜めに入射させる（光入射ステップＳ１２）。基板２２の屈折率は、基板２２が接している純水２５及び水槽２０の何れよりも屈折率が高い。そのため、入射光を斜めに入れることで、試料２１の表面、すなわち基板２２の表面において入射光ｌ１が全反射を起こしながら、第２の側面２１ｃに向かって伝播する。
【００８７】
入射光ｌ１が基板２２の表面で全反射を起こすとき、その表面から外側にはエバネッセント光が浸みだしている。固定化ＤＮＡ分子２３の厚さは、エバネッセント光が浸みだす範囲（例えば、基板２２の外側に向かって約２００ｎｍの範囲）に比較して極めて薄い。また、プローブ粒子Ｐの径も例えば約４０ｎｍと非常に小さい。そのため、エバネッセント光が浸みだす範囲内にプローブ粒子Ｐは十分分布している。
【００８８】
プローブ粒子Ｐは、浸みだしたエバネッセント光を吸収する。そのため、入射光ｌ１が全反射を起こしながら、基板２２内を第２の側面２１ｃに向かって伝播している間にプローブ粒子Ｐに吸収された分だけ光の強度が減少している。
【００８９】
続いて、強度測定装置６において、表面２１ａと交差する試料２１の第２の側面２１ｃから出射する出射光ｌ２の強度が測定される（出射光強度測定ステップＳ１３）。光源２で測定された入射光ｌ１の強度及び強度測定装置６において測定された出射光ｌ２の強度が、演算処理装置３０に出力される。
【００９０】
入射光ｌ１の強度及び出射光ｌ２の強度が入力された演算処理装置３０の位置分布算出部３１では、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差に基づいて複数のプローブ粒子Ｐの位置分布が算出される（位置分布算出ステップＳ１４）。式（６）に基づき算出されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）は、位置分布算出部３１から電荷量算出部３２へ出力される。
【００９１】
プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）が入力された電荷量算出部３２では、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づいて試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される（電荷量算出ステップＳ１５）。電荷量算出部３２では、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）に基づき、式（３）〜（５）によって、試料２１の表面２１ａでの電荷量が算出される。
【００９２】
次いで、例えば固定化ＤＮＡ分子２３と相補的な親和性を有するＤＮＡ分子の検出する場合には、水槽２０内の溶液を廃棄し、上述のプローブ粒子準備ステップＳ１１〜電荷量算出ステップＳ１５を繰り返す。すなわち、まず再度試料２１を底面に載置し、水槽２０内を純水２５で満たす。その後、水槽２０内に先ほどと同数のプローブ粒子Ｐ及び検出ＤＮＡ分子２４を浮遊させ（プローブ粒子準備ステップＳ１１）、光入射ステップＳ１２、位置分布算出ステップＳ１３、及び電荷量算出ステップＳ１４を実行する。こうしてプローブ粒子準備ステップＳ１２〜電荷量算出ステップＳ１６を繰り返すことにより、様々なＤＮＡ分子の検出を行うことができる。
【００９３】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めることで、式（３）〜（５）から、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【００９４】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法も、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法同様、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【００９５】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【００９６】
試料２１は純水２５内に載置されている。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【００９７】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。特に、本実施形態ではプローブ粒子Ｐとして非常に径の小さいもの（例えば約４０ｎｍ）を用い、さらに試料２１を光導波路として利用して計測にエバネッセント光を用いている。そのため、非常にミクロのスケールでの反応も検出することが可能となる。
【００９８】
また、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｂ及び表面電荷量計測方法それぞれでは、入射光ｌ１の強度と出射光ｌ２の強度との強度差さえ求められれば、そのプローブ粒子Ｐの位置分布（ｘ、ｙ、ｚ）が算出できる。そのため、プローブ粒子Ｐを複数用いる場合であっても、位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）の算出に要する時間は非常に短いものとなる。その結果、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【００９９】
ここで、エバネッセント光が浸みだす範囲にプローブ粒子が存在する場合に、プローブ粒子Ｐがエバネッセント光を吸収することを実証するための実施例をデータとともに示す。厚みの薄いガラス基板を光導波路として用い、径が４０ｎｍの金コロイド粒子（負電荷に荷電）をプローブ粒子Ｐとして利用した。
【０１００】
まず、図１７に、未処理のガラス基板（表面が負電荷に荷電）及び表面をアミノ化処理されたガラス基板（表面が正電荷に荷電）それぞれを金コロイド粒子が浮遊している純水中に配置し、ガラス基板への入射光と出射光との強度差を測定したグラフを示す。図１７のグラフＡが未処理のガラス基板の結果を表し、グラフＢがアミノ化処理されたガラス基板の結果を表す。図１７のグラフの横軸は吸収スペクトル（λ／ｎｍ）を表し、縦軸は入射光と出射光との強度差（A.U.）、すなわちエバネッセント光の吸収量を表す。図１７のグラフから、未処理のガラス基板では、エバネッセント光の吸収量がアミノ化処理されたガラス基板に比べ少ないことがわかる。これは、未処理のガラス基板表面がもつ負電荷と金コロイド粒子がもつ負電荷とが反発しあい、金コロイド粒子がガラス表面に近づきにくいことを示す。さらには、アミノ化処理されたガラス基板では、金コロイド粒子との間に静電的引力が働き、金コロイド粒子がガラス表面近傍に近づきやすくなることも理解される。
【０１０１】
図１８に、金コロイド粒子が浮遊しているイオン交換蒸留水中及び金コロイド粒子が浮遊しているリン酸緩衝液中それぞれに、未処理のガラス基板（表面が負電荷に荷電）を配置し、ガラス基板への入射光と出射光との強度差を測定したグラフを示す。図１８のグラフCがイオン交換蒸留水中に配置された結果を表し、グラフDがリン酸緩衝液中に配置された結果を表す。図１８のグラフの横軸は吸収スペクトル（λ／ｎｍ）を表し、縦軸は入射光と出射光との強度差（A.U.）、すなわちエバネッセント光の吸収量を表す。図１８のグラスから、リン酸緩衝液中の方がイオン交換蒸留水中に比べ、金コロイド粒子がガラス基板に近づきやすくなることが理解される。
【０１０２】
図１７のグラフから、ガラス基板表面の荷電状態を反映して入射光の強度に対する出射光の強度の比が変化する（プローブ粒子と基板表面に静電的引力が働く場合、この比は低下する）ことが実証された。また、図１８のグラフから、ガラス基板を配置する溶液によって、プローブ粒子である金コロイド粒子をガラス基板に近づきやすくさせることができることが実証された。これらの結果から、ガラス基板を光導波路として用い、エバネッセント光を利用した計測により、電荷量の測定をより一層簡便に行うことが可能なことが理解される。
【０１０３】
（第３実施形態）
図１３を参照して、第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃの構成について説明する。図１１は第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃの構成を示す図である。第３実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃは、試料２１の基板２２が不透明な基板２２Ａであって、当該不透明基板２２Ａに対する反射型の顕微鏡として構成されている点で第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと異なる。
【０１０４】
不透明な基板２２Ａは、例えば半導体デバイス、あるいは着色されたガラス基板等である。
【０１０５】
光源２は、水槽２０の斜め上方に位置する。光源２は、試料２１及びプローブ粒子Ｐを照射する光ｌを、その光軸が基板２２Ａに対して傾きを有するように出力する。
【０１０６】
一方、結像光学系３も、水槽２０の斜め上方に位置する。結像光学系３は、基板２２Ａ表面で反射された光の像を撮像装置４の受光面上に結ぶように、基板２２Ａに対して傾きを有して配置される。このように、表面電荷量計測装置１Ｃは、限外照明系を採用する。また、限外照明系を用いる場合、例えば作動距離の長い高倍率対物レンズを用いる方法、あるいは低倍率対物レンズにズーム光学系を組み合わせる方法、あるいは暗視野対物レンズを用いる方法などがある。
【０１０７】
本実施形態に係る表面電荷量算出装置１Ｃを用いる表面電荷量算出方法も、表面電荷量算出装置１Ａを用いる表面電荷量算出方法と同様、図８に示すような校正データ準備ステップＳ０１、プローブ粒子準備ステップＳ０２、撮像ステップＳ０３、大きさ規定値特定ステップＳ０４、位置分布算出ステップＳ０５、及び表面電荷量算出ステップＳ０６を備える。
【０１０８】
反射型の顕微鏡に同軸（明視野）照明系を用いると背景反射が対物レンズに入射されてしまいプローブ粒子の像が不明瞭となってしまう。表面電荷量算出装置１Ｃでは、限外（暗視野）照明系を用いているため、不透明な基板２２から構成される試料２１を計測する場合であっても、プローブ粒子Ｐの像を撮像することができる。これにより、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの直径を特定することが可能となるため、試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測することが可能となる。このように、本実施形態に係る表面電荷量算出装置１Ｃ及び表面電荷量算出方法では不透明な試料２１に対しても表面２１ａでの電荷量を計測することが可能となる。
【０１０９】
本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐ及び試料２１はいずれも荷電しており、互いに静電的相互作用を及ぼし合っている。したがって、プローブ粒子Ｐはこの静電的相互作用の影響を受けて分布することとなり、プローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めることで、式（３）〜（５）から、試料２１の表面２１ａでの電荷量を算出することができる。このように、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、プローブ粒子Ｐの位置分布から試料２１の表面２１での電荷量を算出することが可能となる。
【０１１０】
また、試料２１表面での電荷量が計測可能である本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法も、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａ及び表面電荷量計測方法同様、バイオセンシング分野への応用において非常に有用であると考えられる。
【０１１１】
また、本実施形態では荷電されたプローブ粒子Ｐの位置分布ｎ（ｘ、ｙ、ｚ）を求めるだけで電荷量が計測される。そのため、本実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ｃ及び表面電荷量計測方法では、簡便且つ低コストで電荷量を計測することができる。
【０１１２】
試料２１は純水２５内に載置されている。しかし、浮遊しているプローブ粒子Ｐによって計測がなされるため、当該純水２５が流動している場合であっても、流動によって計測が妨げられることはない。
【０１１３】
また、プローブ粒子Ｐの大きさを変えることで、例えばより局所的な領域での電荷量を計測することも可能となる。
【０１１４】
また、一度の撮像で複数のプローブ粒子について位置を算出することができるため、実際の計測が容易となり、電荷量の計測に要する時間を短縮することが可能となる。
【０１１５】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐは球体であるため、プローブ粒子Ｐを如何なる方向からも撮像でき、実際の計測が容易になる。その結果、電荷量の計測が容易になる。
【０１１６】
本実施形態では、プローブ粒子Ｐを照射する光ｌを出力する光源２を備えているため、自身で光を発しないプローブ粒子Ｐを用いて電荷量を算出することが可能となる。
【０１１７】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々なリアルタイムセンシング測定システムに応用することが可能である。例えば、図１４に示す測定システムのように、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと電気化学的測定装置４０とをともに備えていてもよい。すなわち、図１４に示す測定システムでは、表面電荷量計測装置１Ａにより試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測し、同時に電気化学的測定装置４０により試料２１で発生する電気信号を検出することができる。電気化学的測定装置４０は、参照電極４１、対向電極４２、ポテンシオスタット４３、及び電気信号表示装置４４を備える。基板２２上には、透明電極層（図示を省略）が形成されており、当該透明電極層が電気化学的測定装置４０の作用電極として機能する。
【０１１８】
あるいは、例えば、図１５に示す測定システムのように、第１実施形態に係る表面電荷量計測装置１Ａと物理的現象あるいは化学的現象を測定する半導体測定装置５０とをともに備えていてもよい。すなわち、図１５に示す測定システムでは、表面電荷量計測装置１Ａにより試料２１の表面２１ａでの電荷量を計測し、同時に半導体測定装置５０により試料２１で発生する電気信号を検出することができる。半導体測定装置５０は、参照電極６１、半導体装置ＳＣ、及び電気信号表示装置６２を備える。半導体装置ＳＣは、ｎ＋層５１ａを有するＳｉ基板５１と、ＳｉＯ２層５２と、Ｓｉ３Ｎ４層５３と、Ｐｏｌｙ−Ｓｉ層５４と、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２層５５と、Ａｌ導体部５６と、Ａｕ／Ｔｉ層５７とを有する。また、半導体装置ＳＣは、拡張ゲート型（Extended Gate型）の電極部６３を有する。半導体装置ＳＣの電極部６３は、基板２２上に形成された透明電極層として形成される。電極部６３は、Ａｕ／Ｔｉ層５７と導線によって接続されている。
【０１１９】
図１６を参照して、半導体測定装置５０の半導体装置ＳＣの測定動作を説明する。図１６は、半導体測定装置５０の半導体装置ＳＣの測定動作を説明するための図である。半導体装置ＳＣは、機能的に、電荷供給部７１、電荷注入調節部７２、センシング部（電荷変換部）７３、障壁部７４、フローティングディフュージョン部７５、リセットゲート７６、及びリセットドレイン７７を備える。測定に際し、電荷供給部７１、障壁部７４およびリセットゲート７６にパルス電圧が印加され、フローティングディフュージョン部７５を除く他の電極に直流電圧が印加される。
【０１２０】
まず、図１６（ａ）に示すように、電荷供給部７１の電位を高く設定する。次に図１６（ｂ）に示すように、電荷供給部７１の電位を下げ、センシング部７３に電荷７８が注入されるようにする。続いて図１６（ｃ）に示すように、電荷供給部７１の電位を再び高く設定する。これにより、電荷７８は電荷注入調節部７２によってすりきられ、センシング部７３に蓄積される。
【０１２１】
続いて図１６（ｄ）に示すように、障壁部７４の電位を上げる。これにより、センシング部７３に蓄積されていた電荷７８がフローティングディフュージョン部７５に転送される。センシング部７３に蓄積されていた電荷７８が全てフローティングディフュージョン部７５に転送された後、図１６（ｅ）に示すように、障壁部７４の電位を下げて、電荷７８の転送を止める。フローティングディフュージョン部７５の電位は、転送されてきた電荷７８の量で決まり、この電位を出力として測定がなされる。
【０１２２】
その後、図１６（ｆ）に示すように、リセットゲート７６をオンし、リセットドレイン７７の電位にリセットし、図１６（ａ）に戻る。図１６（ａ）〜（ｆ）に示される動作を繰り返すことにより、電荷が外に出力され、測定がなされる。
【０１２３】
また、本発明は上記実施形態及び応用例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態では、生物学的反応であるＤＮＡ反応に適用した場合を例示したが、様々な分野に適用可能である。例えば、ＤＮＡ反応以外であっても、抗体や受容体、結合性蛋白質を用いることによる標的となる蛋白質、糖類等のバイオ分子の検出にも応用できる。さらには、生物学的反応に限らず、例えば化学的反応に適用してもよい。
【０１２４】
また、プローブ粒子Ｐの形状は球状に限らず、例えば棒状であってもよい。棒状プローブ粒子を用いた場合における、プローブ画像におけるプローブ粒子Ｐの大きさを規定する値というのは、プローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さとなる。すなわち、例えば、プローブ画像においてプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さが同じである場合には、棒状のプローブ粒子は、長手方向と試料表面とが平行になるように分布している。一方、プローブ画像においてプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さが異なる場合には、棒状のプローブ粒子は、長手方向が試料表面に対して角度を有して分布している。したがって、プローブ画像におけるプローブ粒子の長手方向の両端での短手方向の長さを求めることによって、プローブ粒子Ｐの試料表面に対する位置情報としてプローブ粒子Ｐの試料表面に対する傾きが得られる。棒状のプローブ粒子Ｐは、試料表面と有機的に関連することによりその傾きが決定する。したがって、プローブ粒子Ｐの試料表面に対する傾きに基づいて、表面電位を算出することができる。
【０１２５】
また、プローブ粒子Ｐはポリスチレンラテックスあるいは金に限らず、他の材料からなるものであってもよい。また、プローブ粒子は液体に限らず、例えば気体中に浮遊していても、あるいは真空中に浮遊していてもよい。
【０１２６】
また、光源を有さず、例えばプローブ粒子Ｐ自身が蛍光を発光し、その像を撮像して試料２１の表面での電荷量を計測してもよい。光源に限定はなく、可視光、紫外線、赤外線、Ｘ線、電子線、あるいは中性子線など、どのような波長の光を出す光源であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図２】画像処理部の機能について説明するための図である。
【図３】校正データによって得られるグラフの図である。
【図４】実際の測定データを校正データとする場合における校正データの表を示す。
【図５】プローブ粒子と結像光学系の焦点面との関係を説明するための図である。
【図６】撮像されたプローブ画像におけるプローブ粒子の画像を表す図である。
【図７】プローブ画像における各プローブ粒子の強度を示すグラフの図である。
【図８】第１実施形態に係る表面電荷量算出方法の手順を示す図である。
【図９】校正データを求めることについて説明するための図である。
【図１０】第２実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図１１】演算処理部の機能について説明するための図である。
【図１２】第２実施形態に係る表面電荷量算出方法の手順を示す図である。
【図１３】第３実施形態に係る表面電荷量算出装置の構成を示す図である。
【図１４】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置を応用した測定システムの構成を示す図である。
【図１５】第１実施形態に係る表面電荷量算出装置を応用した測定システムの構成を示す図である。
【図１６】半導体測定装置の半導体装置の測定動作を説明するための図である。
【図１７】ガラス基板への入射光とガラス基板からの出射光との強度差を測定したグラフを示す。
【図１８】ガラス基板への入射光とガラス基板からの出射光との強度差を測定したグラフを示す。
【符号の説明】
【０１２８】
１Ａ、１Ｂ、１Ｃ…表面電荷量計測装置、Ｐ…プローブ粒子、２…光源、３…結像光学系、４…撮像装置、５…表示装置、６…強度測定装置、１０…画像処理装置、１１…校正データ格納部、１２…大きさ規定値特定部、１３、３１…位置分布算出部、１４、３２…電荷量算出部、３０…演算処理装置、４０…電気化学的測定装置、４１…参照電極、４２…対向電極、４３…ポテンシオスタット、４４、６２…電気信号表示装置、５０…半導体測定装置、ＳＣ…半導体装置、６１…参照電極
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測装置であって、
前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出手段と、
前記位置分布に基づいて前記試料表面での電荷量を算出する電荷量算出手段と、を備えることを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項２】
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像に基づいて、前記試料の表面での前記電荷量を計測する請求項１記載の表面電荷量計測装置であって、
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定手段をさらに備え、
前記位置分布算出手段は、前記プローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からの前記プローブ粒子の距離との関係を示す校正データと、前記大きさ規定値特定手段で求められた前記測定値と、に基づいて、前記複数のプローブ粒子の前記位置分布を算出することを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項３】
光の強度を測定する強度測定手段をさらに備え、前記表面と交差する前記試料の第１の側面に斜めに入射光を入射させることにより前記試料の表面での前記電荷量を計測する請求項１記載の表面電荷量計測装置であって、
前記入射光は、前記試料表面において全反射しながら前記試料内を伝播した後、前記表面とは交差する前記試料の第２の側面から出射光として出射していくよう前記第１の側面に入射され、
前記位置分布算出手段は、前記入射光の強度と前記出射光の強度との強度差に基づいて、前記複数のプローブ粒子の前記位置分布を算出することを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項４】
前記プローブ粒子が球体であることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項記載の表面電荷量計測装置。
【請求項５】
前記試料は、荷電物質が前記表面に固定されることによって荷電されることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項記載の表面電荷量計測装置。
【請求項６】
荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測方法であって、
前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出ステップと、
前記位置分布に基づいて前記試料表面での電荷量を算出する電荷量算出ステップと、を備えることを特徴とする表面電荷量計測方法。
【請求項７】
前記プローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からの前記プローブ粒子の距離との関係を示す校正データを用意する校正データ準備ステップと、
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定ステップと、をさらに備え、
前記位置分布算出ステップは、前記校正データと前記大きさ規定値特定手段で求められた前記測定値とに基づいて、前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出することを特徴とする請求項６記載の表面電荷量計測方法。
【請求項８】
前記試料表面で全反射しながら前記試料内を伝播する強度の測定された入射光を、前記表面と交差する前記試料の第１の側面に斜めに入射させる光入射ステップと、
前記入射光として入射し前記試料内を伝播した後、前記表面と交差する前記試料の第２の側面から出射する出射光の強度を測定する出射光強度測定ステップと、をさらに備え、
前記位置分布算出ステップは、前記入射光の強度と前記出射光の強度との強度差に基づいて、前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出することを特徴とする請求項６記載の表面電荷量計測方法。
【請求項９】
前記プローブ粒子が球体であることを特徴とする請求項６〜８の何れか一項記載の表面電荷量計測方法。
【請求項１０】
前記試料は、荷電物質が前記表面に固定されることによって荷電されることを特徴とする請求項６〜９の何れか一項記載の表面電荷量計測方法。
【請求項１】
荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測装置であって、
前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出手段と、
前記位置分布に基づいて前記試料表面での電荷量を算出する電荷量算出手段と、を備えることを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項２】
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像に基づいて、前記試料の表面での前記電荷量を計測する請求項１記載の表面電荷量計測装置であって、
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定手段をさらに備え、
前記位置分布算出手段は、前記プローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からの前記プローブ粒子の距離との関係を示す校正データと、前記大きさ規定値特定手段で求められた前記測定値と、に基づいて、前記複数のプローブ粒子の前記位置分布を算出することを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項３】
光の強度を測定する強度測定手段をさらに備え、前記表面と交差する前記試料の第１の側面に斜めに入射光を入射させることにより前記試料の表面での前記電荷量を計測する請求項１記載の表面電荷量計測装置であって、
前記入射光は、前記試料表面において全反射しながら前記試料内を伝播した後、前記表面とは交差する前記試料の第２の側面から出射光として出射していくよう前記第１の側面に入射され、
前記位置分布算出手段は、前記入射光の強度と前記出射光の強度との強度差に基づいて、前記複数のプローブ粒子の前記位置分布を算出することを特徴とする表面電荷量計測装置。
【請求項４】
前記プローブ粒子が球体であることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項記載の表面電荷量計測装置。
【請求項５】
前記試料は、荷電物質が前記表面に固定されることによって荷電されることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項記載の表面電荷量計測装置。
【請求項６】
荷電した複数のプローブ粒子を上方に浮遊させて荷電試料の表面での電荷量を計測する表面電荷量計測方法であって、
前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出する位置分布算出ステップと、
前記位置分布に基づいて前記試料表面での電荷量を算出する電荷量算出ステップと、を備えることを特徴とする表面電荷量計測方法。
【請求項７】
前記プローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する値と基準面からの前記プローブ粒子の距離との関係を示す校正データを用意する校正データ準備ステップと、
前記プローブ粒子の像を撮像して得られたプローブ画像における前記プローブ粒子の大きさを規定する測定値を求める大きさ規定値特定ステップと、をさらに備え、
前記位置分布算出ステップは、前記校正データと前記大きさ規定値特定手段で求められた前記測定値とに基づいて、前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出することを特徴とする請求項６記載の表面電荷量計測方法。
【請求項８】
前記試料表面で全反射しながら前記試料内を伝播する強度の測定された入射光を、前記表面と交差する前記試料の第１の側面に斜めに入射させる光入射ステップと、
前記入射光として入射し前記試料内を伝播した後、前記表面と交差する前記試料の第２の側面から出射する出射光の強度を測定する出射光強度測定ステップと、をさらに備え、
前記位置分布算出ステップは、前記入射光の強度と前記出射光の強度との強度差に基づいて、前記複数のプローブ粒子の位置分布を算出することを特徴とする請求項６記載の表面電荷量計測方法。
【請求項９】
前記プローブ粒子が球体であることを特徴とする請求項６〜８の何れか一項記載の表面電荷量計測方法。
【請求項１０】
前記試料は、荷電物質が前記表面に固定されることによって荷電されることを特徴とする請求項６〜９の何れか一項記載の表面電荷量計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００８−１４８３２（Ｐ２００８−１４８３２Ａ）
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８７１０５（Ｐ２００６−１８７１０５）
【出願日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
[ Back to top ]