複製可能なＤＮＡ、アミノ酸配列、コリネ型微生物、シャトルベクター及びＬ−アミノ酸の製造方法
【課題】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの改善された発酵による新規の製造方法の提供。
【解決手段】 ａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネバクテリウム由来の、コリネ型微生物中で複製可能な非組換え又は組換えＤＮＡ。
【解決手段】 ａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネバクテリウム由来の、コリネ型微生物中で複製可能な非組換え又は組換えＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の対象はａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び、遺伝子ａｃｃＤＡが強化されたコリネ型バクテリアの使用下にＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンの発酵による製造方法である。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンは動物飼料、医薬品及び製剤工業において使用される。
【０００３】このアミノ酸をコリネ型バクテリア、特にコリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の株の発酵により製造することは公知である。著しく重要なために、常に製造方法の改善がなされている。方法の改善には、発酵工業的手段、例えば撹拌及び酸素の提供又は培養基の組成、例えば発酵の間の糖濃度、又は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる製品形のための後処理又は微生物自体の固有の機能特性が該当する。
【０００４】この微生物の機能特性の改善のために、突然変異、選択及び突然変異体選択の方法を利用する。このように、抗生物質、例えばリシン−類似体のＳ−（２−アミノエチル）−システインに対して耐性であるか又は調節的に重要なアミノ酸に対する栄養要求体であり、かつＬ−アミノ酸を産生する株が得られる。
【０００５】数年来、個々のアミノ酸−生合成を増幅しかつＬ−リシン−産生に関する影響を調査することにより、コリネバクテリウムのアミノ酸産生株の株の改善のために同様に組換えＤＮＡ−技術の方法が用いられた。これについての概要文献は特に、Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology15, 73-103 (1995))及び Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996))である。
【０００６】酵素 アセチル−ＣｏＡ カルボキシラーゼはアセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへのカルボニル化を触媒する。Escherichia coliの酵素は４つのサブユニットからなる。ａｃｃＢ−遺伝子はビオチン−カルボキシル−キャリアタンパク質をコードし、ａｃｃＣ−遺伝子はビオチン−カルボキシラーゼをコードし、遺伝子ａｃｃＡ及びａｃｃＤはトランスカルボキシラーゼ（Cronan and Rock, Biosynthesis of Membrane lipids. in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium (ed F.C. Neidhardt), 1996, pp 612-636, American Society for Microbiology）をコードする。アシル−基をアシル−ＣｏＡの形にカルボキシル化する酵素の特性のために、これはアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼと表される。
【０００７】コリネバクテリウム グルタミクムのａｃｃＢＣ−遺伝子のヌクレオチド配列は、Jaeger et al. (Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996))により決定され、欧州分子生物学ラボラトリーズ（European Molecular Biologies Laboratories, EMBL, Heidelberg, Deutschland）のデータバンクで受入番号Ｕ３５０２３として一般に入手可能である。ａｃｃＢＣ−遺伝子はアセチル−ＣｏＡ カルボキシラーゼのサブユニットをコードし、これはビオチン−カルボキシル−キャリアタンパク質−ドメイン及びビオチン−カルボキシラーゼ−ドメインを有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの改善された発酵による新規の製造方法を提供することであった。
【０００９】Ｌ−アミノ酸は、動物飼料、医薬品及び製剤工業において使用される。従って、Ｌ−アミノ酸の改善された新規の製造方法を提供することは一般的に重要である。
【００１０】以後、Ｌ−リシン又はリシンと述べた場合、塩基だけでなく、塩、例えばリシン−モノヒドロクロリド又はリシン−スルフェートをも意味する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、配列番号１に記載されたａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネ型微生物中で複製可能なコリネバクテリウム由来の有利に組換えられたＤＮＡである。
【００１２】同様に、（ｉ） 配列番号１に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ） 遺伝コードの同義性（Degeneration）の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉｉ） 配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、及び場合により（ｉｖ） （ｉ）において機能的に中立なセンス突然変異（Sinnmutation）を有する請求項１記載の複製可能なＤＮＡも対象である。
【００１３】同様に、前記の複製可能なＤＮＡを導入することにより形質転換された、コリネ型微生物、特にコリネバクテリウム族も本発明の対象である。
【００１４】本発明はさらに、特にＬ−アミノ酸を産生し、かつａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を強化した、特に過剰発現させたコリネ型バクテリアの使用下でのＬ−アミノ酸の発酵による製造方法に関する。
【００１５】最終的に、本発明の対象は、コリネ型バクテリア中でのアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼを、新規の本発明によるａｃｃＤＡ−遺伝子及び公知のａｃｃＢＣ−遺伝子を共通に過剰発現させることにより強化する方法でもある。
【００１６】「強化」の概念は、本願明細書において、相応するＤＮＡによりコードされる微生物中の１以上の酵素の細胞内活性を、例えば１以上の遺伝子のコピー数を高めるか、強力なプロモータを使用するか、又は高い活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子を使用するか、場合によりこれらの手法を組み合わせることにより高めることである。
【００１７】本発明の対象である微生物は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン及びエタノールからＬ−アミノ酸を製造することができる。代表的なコリネ型バクテリア、特にコリネバクテリウム族が挙げられる。コリネバクテリウム族において、特に専門分野においてＬ−アミノ酸を産生する能力が公知であるコリネバクテリウム グルタミクムの種が挙げられる。
【００１８】コリネバクテリウム族、特にコリネバクテリウム グルタミクムの種の適当な株は公知の野生形：Corynebacterium glutamicum ATCC13032Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539Brevibacterium flavum ATCC14067Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 及びBrevibacterium divaricatum ATCC14020及びその野生形から製造されたＬ−アミノ酸を産生する突然変異種並びに株、例えば：Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709Brevibacterium flavum FERM-P 1708Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 及びCorynebacterium glutamicum FERM-P 6464である。
【００１９】本発明者はＣ．グルタミクムから新規のａｃｃＤＡ−遺伝子を単離することに成功した。ａｃｃＤＡ−遺伝子又はＣ．グルタミクムの他の遺伝子の単離のために、まずＥ．ｃｏｌｉ中にこの微生物の遺伝子ライブラリーを構築した。遺伝子ライブラリの構築は一般に公知の教書及びハンドブックに記載されている。例として、Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie(Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)の教書又はSambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)のハンドブックが挙げられる。周知の遺伝子ライブラリーはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０であり、この株はKohara et al. （Cell 50, 495 -508 (1987)）によりλ−ベクターに構築された。Bathe et al. (Molecular andGeneral Gentics, 252: 255 - 265, 1996)は、コスミドベクターSuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164)を用いてE. coli K-12株NM554（Raleigh et al., 1988, NucleicAcids Research 16: 1563-1575）中に構築したC. glutamicum ATCC13032の遺伝子ライブラリーを記載している。Boermann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)はコスミドｐＨＣ７９（）の使用下でのC. glutamicum ATCC13032の遺伝子ライブラリーを記載している（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)）。E. coli中でのC. glutamicumの遺伝子ライブラリーの製造のために、プラスミド例えばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)）又はｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 19: 259-268）を使用することもできる。宿主として、特に制限欠損及び組換え欠損のE. coli−株が適している。これについての例はＤＨ５αｍｃｒであり、これはGrant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)により記載されている。コスミドを用いてクローニングした長いＤＮＡ断片は、引き続き再度、配列決定のために通常適したベクター中でサブクローニングされ、引き続き配列決定され、これは例えばSanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977)により記載されている。
【００２０】このように、C. glutamicumの遺伝子ａｃｃＤＡをコードする新規のＤＮＡ配列が得られ、これを配列番号１として本発明の対象である。配列番号２中にａｃｃＤＡ−遺伝子のコード領域（ｃｄｓ）が記載されている。さらに、このＤＮＡ−配列から上記の方法を用いて相応するタンパク質のアミノ酸配列が誘導される。配列番号３中にはａｃｃＤＡ−遺伝子産物の生じるアミノ酸配列が示されている。
【００２１】配列番号１から遺伝コードの同義性により生じるコードするＤＮＡ−配列は同様に本発明の対象である。同様に配列番号１又は配列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の対象である。専門分野において、さらに保存的アミノ酸交換（konservative Aminosaeureaustausche）、例えばグリシンとアラニンとの交換又はアスパラギン酸とグルタミン酸とのタンパク質中での交換がセンス突然変異（sense mutations）として公知であり、これはタンパク質の活性の根本的変化を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さらに、タンパク質のＮ−末端及び／又はＣ−末端での変化はその機能を本質的に損なわないか、それどころか安定化できることは公知である。この記載は、当業者にはBen-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 69: 751-757 (1987))、O' Regan et al.(Gene 77: 237-251 (1989)、Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247(1994))、Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988))及び遺伝子工学及び分子生物学の公知の教書において見出すことができる。相応する方法で配列番号３から得られたアミノ酸配列も本発明の対象である。
【００２２】発明者はコリネ型バクテリアがａｃｃＤＡ−遺伝子の過剰発現により改善された方法でＬ−リシンを産生することを見出した。
【００２３】過剰発現の達成のために、相当する遺伝子のコピー数を高めるか、構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域及びレギュレータ領域又はリボゾーム結合領域を突然変異させることができる。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットも同様に作用する。誘導可能なプロモータによって、付加的に発酵によるＬ−リシン−産生の進行において発現を向上させることもできる。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための措置によって同様に発現は改善される。さらに、酵素タンパク質の分解の阻害により同様に酵素活性が強化される。この遺伝子又は遺伝子構築物はプラスミドの形で多様なコピー数で存在するか、又は染色対中に統合されて増幅されることができる。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は培地組成及び培養操作によって達成することができる。
【００２４】また、これについては、当業者は特にMartin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1998))、欧州特許（ＥＰＳ）第０４７２８６９号明細書、米国特許代４６０１８９３号明細書、Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)、Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994))、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)、特許出願明細書ＷＯ９６／１５２４６、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))、特開平１０−２２９８９１号公報、Jensen and Hammer (Biotechnologyand Bioengineering 58, 191-195 (1998))、Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996))及び遺伝子工学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
【００２５】プラスミドを用いてａｃｃＤＡ−遺伝子を過剰発現させることができるプラスミドの例は、ｐＺ１ａｃｃＤＡ（図１）であり、これはＭＨ２０−２２Ｂ／ｐＺ１ａｃｃＤＡ中に含まれる。プラスミドｐＺ１ａｃｃＤＡはプラスミドｐＺ１（Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology 55(3), 684-688 (1989））に基づく、ａｃｃＤＡ−遺伝子を有するE. col - C. glutamicum シャトルベクターである。C. glutamicum中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)）又はｐＺ８−１（欧州特許第３７５８８９号明細書）も同様に使用可能である。
【００２６】発明者はさらに、本発明による新規のａｃｃＤＡ−遺伝子に対して付加的に公知のａｃｃＢＣ−遺伝子の付加的過剰発現により、コリネ型バクテリアがアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼの産生を改善することを見出した。プラスミドを用いてａｃｃＤＡ−遺伝子及びａｃｃＢＣ−遺伝子を一緒に過剰発現できるプラスミドの例は、ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡ（図２）である。プラスミドｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡは、プラスミドｐＥＫ０（Eikmanns et al., Gene 102,93-98, (1991)）に基づく、ａｃｃＢＣ−遺伝子及びａｃｃＤＡ−遺伝子を有するE. coli - C. glutamicum シャトルベクターである。C. glutamicum中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene102: 93-98 (1991）又はｐＺ８−１（欧州特許第０３７５８８９号明細書）も同様に使用することができる。
【００２７】付加的に、Ｌ−アミノ酸の産生のために、ａｃｃＤＡ−遺伝子の他に生合成経路の１種以上の酵素を過剰発現させることが有利である。
【００２８】・ 同時に、ジヒドロジピコリネート−シンターゼをコードするｄａｐＡ−遺伝子を過剰発現させる（ＥＰ−Ｂ ０１９７３３５）又は・ 同時に、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン−耐性を媒介するＤＮＡ−断片を増幅する（ＥＰ−Ａ ００８８１６６）。
【００２９】さらに、ａｃｃＤＡ−遺伝子の過剰発現の他に不所望の副反応を遮断することがＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンの産生にとって有利である（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００３０】本発明により製造された微生物は連続的又は断続的に、バッチ法（batch）又はフィードバッチ法（fed batch）又は繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch）で、Ｌ−リシンを製造する目的で培養することができる。公知の培養法に関する総括はChmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の教書において又はStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教書において記載されている。
【００３１】使用すべき培養基は、適当な方法でそれぞれの株の要求を満たさなければならない。多様な微生物の培地の記載は、ハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」, der American Society for Bacteriology (WashingtonD.C., USA, 1981)に記載されている。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。この材料は個々に又は混合して使用することができる。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができる。この窒素源は個々に又は混合して使用することができる。リン源はリン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素にカリウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することができる。この培養基は、さらに成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使用することができる。培養基にさらに適当な前駆物質を添加することもできる。前記の使用物質は１回だけの添加物の形で培養に添加されるか又は適当な方法で培養期間中に供給することができる。
【００３２】培養のｐＨ−コントロールのために塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸を適当な方法で添加する。起泡の発生をコントロールするために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために培地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件下を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を培養中へ導入する。培養の温度は通常２０℃から４５℃、有利に２５℃〜４０℃である。この培養は所望のＬ−アミノ酸の最大値が達成するまで続けられる。この目的は通常１０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００３３】Ｌ−リシンの分析は、Spackman et al.（Analytical Chemistry, 30, (1958),1190）に記載されたように、アニオン交換クロマトグラフィーと、それに引き続くニンヒドリン誘導化によって行われる。
【００３４】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Corynebacterium glutamicum株 DSM5715/pZ1accDAをDSM 12785として、Corynebacterium glutamicum株 DSM5715/pEK0accBCaccDAをDSM 12787として。
【００３５】本発明による方法は、コリネ型バクテリアを用いたＬ−アミノ酸、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンの発酵による製造のために、特にＬ−リシンの製造のために用いられる。
【００３６】
【実施例】本発明を次に実施例により詳説する。
【００３７】例１ａｃｃＤＡ−遺伝子のクローニング及び配列決定C. glutamicum ATCC 13032の遺伝子ライブラリーを、コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)）の使用下で、Boermann et al.（Molecular Microbiology 6(3), 317-326）に記載されたように製造した。
【００３８】選択されたコスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを用いてこの制限酵素の製造元（Boehringer Mannheim）の記載に従って消化させた。生じたＤＮＡ−断片を、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理したベクターｐＵＣ１８（Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106）と混合し、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼで処理した後にE. coli株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4645）中で、Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)に記載されたようにクローニングした。形質転換体の選択は、Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)に記載されているように、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天上で選択することにより行った。形質転換体からプラスミド−ＤＮＡを単離し、これをｐＵＣａｃｃＤＡとした。引き続きPromega社（Heidelberg, Deutschland）のこの目的のために用いるキット（Erase-a-Base）を用いてエキソヌクレアーゼＩＩＩ−消化を介してサブクローンを製造した。これをSanger et al.によるジデオキシ−鎖分解法（Proceeding of the National Academy of Sciences USA (1977) 74: 5463-5467）により配列決定した。その際、オート−リード−シーケンジング−キット（Auto-Read Sequencing kit）を使用した（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden）。ゲル電気泳動による分析を、Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Schweden)社の自動的レーザー−蛍光−シーケンサー装置（A. L. F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列をプログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Heidelberg,Deutschland）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号１に記載した。このヌクレオチド配列の分析は１４７３個の塩基対のオープンリーディングフレームを示し、このフレームをａｃｃＤＡ−遺伝子とした。C. glutamicumからのａｃｃＤＡ−遺伝子は４８４個のアミノ酸のポリペプチドをコードした。
【００３９】例２Corynebacterium glutamicum中のａｃｃＤＡ−遺伝子の発現ａｃｃＤＡ遺伝子をC. glutamicum中の発現のためにベクターｐＺ１（Menkelet al. (1989) Applied and Enviromental Microbiology 55: 684-688）中にサブクローンした。このために、プラスミドｐＵＣａｃｃＤＡ（例１参照）を制限酵素ＣｌａＩで切断した。生じた１．６ｋｂのサイズの断片を例１に記載したと同様に単離し、クレノウ−ポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで処理し、連結のためにｐＺ１を使用した。このベクターをまずＳｃａＩで線状化した。この連結物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4645）を形質転換し、この形質転換体をカナマイシン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ−寒天上で選択した。それにより７．７ｋｂのサイズのシャトルベクターｐＺ１ａｃｃＤＡ（図１）が得られた。これを、Haynes (FEMS Microbiol. Letters (1989) 61: 329-334)に記載されたようにエレクトロポレーションを用いて、株ＤＳＭ５７１５中へ導入し、その際、この形質転換体をＬＢＨＩＳ−寒天上で選択した（Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1989, 65: 299-304）。このように、C. glutamicum株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡが得られた。
【００４０】例３株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡを用いたＬ−リシンの製造株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡを、培地ＣｇＩＩＩ（Keilhauer et al.1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）、生産培地ＣｇＸＩＩ（Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）中で予備培養することにより培養した。４％グルコース及びカナマイシンスルフェート５０ｍｇ／ｌを添加した。
【００４１】４８時間インキュベーションした後、光学密度を６６０ｎｍで及び生成されたＬ−リシンの濃度を測定した。表１中にこの試験の結果を示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】例４ａｃｃＢＣ及びａｃｃＤＡの一緒の発現（ｉ） 発現ベクターｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡの構築ａｃｃＢＣ含有プラスミドｐＷＪ７１（Jaeger et al., Archives of Microbiology (1996) 166: 76-82）を制限酵素ＡｇｅＩ及びＳｍａＩを用いて消化し、引き続きクレノウ−ポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで処理した。これに平行して、プラスミドｐＵＣａｃｃＤＡをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、引き続きクレノウポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで実施した。Sambrook et al.（Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories）に記載されたようにアガロースゲルから分別単離を実施することにより、２．１ｋｂのサイズのａｃｃＤＡを有する断片を単離した。これを、前記したように準備したベクターｐＷＪ７１と連結した。生じたプラスミドから４．６ｋｂのサイズのａｃｃＢＣａｃｃＤＡ−含有断片をＫｐｎＩ／ＳａｌＩ消化により切断し、アガロースゲル電気泳動により分別単離した。この断片をC. glutamicum/E. coli シャトルベクターｐＥＫ０（Eikmanns et al. (1991) Gene 102: 93-98）と連結するために、ｐＥＫ０を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、引き続きクレノウポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼを用いて処理を実施した。こうして準備されたベクターを４．６ｋｂのサイズのａｃｃＢＣａｃｃＤＡ−含有断片と連結した。生じたベクターｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡを図２に記載した。このベクターをエレクトロポレーションを用いて例２に記載したと同様に株ＡＴＣＣ１３０３２中へ導入した。このように、C. glutamicum株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡが得られた。
【００４４】（ｉｉ） アシル−ＣｏＡ カルボキシラーゼ活性の測定株C. glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡを、培地ＣＧＩＩＩ（Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）中での予備培養の後に備置ＣＧＸＩＩ（Kailhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)に記載）中に摂取した。この細胞を遠心分離により収穫し、細胞ペレットを６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄し、セルフ−バッファ（selben Puffer）中に再懸濁させた。細胞分解物に１０分間の超音波処理を行った（Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic PowerCo, Danbury, USA）。引き続き細胞の破片を４℃で３０分間遠心分離することにより分離した。酵素試験の反応バッチは反応容量１ｍｌ中で６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、６５ｍＭのＫＨＣＯ3、１ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、４ｍＭのアシルＣｏＡ（裁量でアセチル−ＣｏＡ又はプロピオニル−ＣｏＡ）及び粗製抽出物４ｍｇを含有した。この試験バッチから３０℃でインキュベートし、１５秒、３０秒、４５秒及び６０秒後に試料１００μｌを取り出し、そのマロニル−ＣｏＡもしくはメチルマロニル−ＣｏＡ濃度をＨＰＬＣ−分析により測定した（Kimura et al. (1997) Journal of Bacteriology 179: 7098-7102）。表２に示したように、株C. glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡは、対照株がアセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡによるわずかなアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−活性を有するのに対して、アセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡにより高いアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−活性を示した。
【００４５】表２：C. glutamicum中のアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ比活性（μｍｏｌ／分及びｍｇタンパク質）
【００４６】
【表２】
【００４７】
配列表＜110＞ Degussa-Huels AGForschungszentrum-Juelich GmbH＜120＞ 複製可能なＤＮＡ、アミノ酸配列、コリネ型微生物、シャトルベクター及びＬ−アミノ酸の製造方法＜130＞ 990042BT＜140＞＜141＞＜160＞ 3＜170＞ PatentIn Ver. 2.1＜210＞ 1＜211＞ 2123＜212＞ DNA＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜220＞＜221＞ gene＜222＞ (508)..(1980)＜223＞ accDA＜400＞ 1
【００４８】
【外１】
【００４９】
【外２】
【００５０】
【外３】
【００５１】
＜210＞ 2＜211＞ 1473＜212＞ DNA＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜220＞＜221＞ CDS＜222＞ (1)..(1473)＜223＞ accDA＜400＞ 2
【００５２】
【外４】
【００５３】
【外５】
【００５４】
【外６】
【００５５】
【外７】
【００５６】
＜210＞ 3＜211＞ 491＜212＞ PRT＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜400＞ 3
【００５７】
【外８】
【００５８】
【外９】
【００５９】
【外１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＺ１ａｃｃＤＡのマップを示す図。
【図２】プラスミドｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡのマップを示す図。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の対象はａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び、遺伝子ａｃｃＤＡが強化されたコリネ型バクテリアの使用下にＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンの発酵による製造方法である。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンは動物飼料、医薬品及び製剤工業において使用される。
【０００３】このアミノ酸をコリネ型バクテリア、特にコリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の株の発酵により製造することは公知である。著しく重要なために、常に製造方法の改善がなされている。方法の改善には、発酵工業的手段、例えば撹拌及び酸素の提供又は培養基の組成、例えば発酵の間の糖濃度、又は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる製品形のための後処理又は微生物自体の固有の機能特性が該当する。
【０００４】この微生物の機能特性の改善のために、突然変異、選択及び突然変異体選択の方法を利用する。このように、抗生物質、例えばリシン−類似体のＳ−（２−アミノエチル）−システインに対して耐性であるか又は調節的に重要なアミノ酸に対する栄養要求体であり、かつＬ−アミノ酸を産生する株が得られる。
【０００５】数年来、個々のアミノ酸−生合成を増幅しかつＬ−リシン−産生に関する影響を調査することにより、コリネバクテリウムのアミノ酸産生株の株の改善のために同様に組換えＤＮＡ−技術の方法が用いられた。これについての概要文献は特に、Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology15, 73-103 (1995))及び Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996))である。
【０００６】酵素 アセチル−ＣｏＡ カルボキシラーゼはアセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへのカルボニル化を触媒する。Escherichia coliの酵素は４つのサブユニットからなる。ａｃｃＢ−遺伝子はビオチン−カルボキシル−キャリアタンパク質をコードし、ａｃｃＣ−遺伝子はビオチン−カルボキシラーゼをコードし、遺伝子ａｃｃＡ及びａｃｃＤはトランスカルボキシラーゼ（Cronan and Rock, Biosynthesis of Membrane lipids. in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium (ed F.C. Neidhardt), 1996, pp 612-636, American Society for Microbiology）をコードする。アシル−基をアシル−ＣｏＡの形にカルボキシル化する酵素の特性のために、これはアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼと表される。
【０００７】コリネバクテリウム グルタミクムのａｃｃＢＣ−遺伝子のヌクレオチド配列は、Jaeger et al. (Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996))により決定され、欧州分子生物学ラボラトリーズ（European Molecular Biologies Laboratories, EMBL, Heidelberg, Deutschland）のデータバンクで受入番号Ｕ３５０２３として一般に入手可能である。ａｃｃＢＣ−遺伝子はアセチル−ＣｏＡ カルボキシラーゼのサブユニットをコードし、これはビオチン−カルボキシル−キャリアタンパク質−ドメイン及びビオチン−カルボキシラーゼ−ドメインを有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの改善された発酵による新規の製造方法を提供することであった。
【０００９】Ｌ−アミノ酸は、動物飼料、医薬品及び製剤工業において使用される。従って、Ｌ−アミノ酸の改善された新規の製造方法を提供することは一般的に重要である。
【００１０】以後、Ｌ−リシン又はリシンと述べた場合、塩基だけでなく、塩、例えばリシン−モノヒドロクロリド又はリシン−スルフェートをも意味する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、配列番号１に記載されたａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネ型微生物中で複製可能なコリネバクテリウム由来の有利に組換えられたＤＮＡである。
【００１２】同様に、（ｉ） 配列番号１に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ） 遺伝コードの同義性（Degeneration）の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉｉ） 配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、及び場合により（ｉｖ） （ｉ）において機能的に中立なセンス突然変異（Sinnmutation）を有する請求項１記載の複製可能なＤＮＡも対象である。
【００１３】同様に、前記の複製可能なＤＮＡを導入することにより形質転換された、コリネ型微生物、特にコリネバクテリウム族も本発明の対象である。
【００１４】本発明はさらに、特にＬ−アミノ酸を産生し、かつａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を強化した、特に過剰発現させたコリネ型バクテリアの使用下でのＬ−アミノ酸の発酵による製造方法に関する。
【００１５】最終的に、本発明の対象は、コリネ型バクテリア中でのアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼを、新規の本発明によるａｃｃＤＡ−遺伝子及び公知のａｃｃＢＣ−遺伝子を共通に過剰発現させることにより強化する方法でもある。
【００１６】「強化」の概念は、本願明細書において、相応するＤＮＡによりコードされる微生物中の１以上の酵素の細胞内活性を、例えば１以上の遺伝子のコピー数を高めるか、強力なプロモータを使用するか、又は高い活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子を使用するか、場合によりこれらの手法を組み合わせることにより高めることである。
【００１７】本発明の対象である微生物は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン及びエタノールからＬ−アミノ酸を製造することができる。代表的なコリネ型バクテリア、特にコリネバクテリウム族が挙げられる。コリネバクテリウム族において、特に専門分野においてＬ−アミノ酸を産生する能力が公知であるコリネバクテリウム グルタミクムの種が挙げられる。
【００１８】コリネバクテリウム族、特にコリネバクテリウム グルタミクムの種の適当な株は公知の野生形：Corynebacterium glutamicum ATCC13032Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539Brevibacterium flavum ATCC14067Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 及びBrevibacterium divaricatum ATCC14020及びその野生形から製造されたＬ−アミノ酸を産生する突然変異種並びに株、例えば：Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709Brevibacterium flavum FERM-P 1708Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 及びCorynebacterium glutamicum FERM-P 6464である。
【００１９】本発明者はＣ．グルタミクムから新規のａｃｃＤＡ−遺伝子を単離することに成功した。ａｃｃＤＡ−遺伝子又はＣ．グルタミクムの他の遺伝子の単離のために、まずＥ．ｃｏｌｉ中にこの微生物の遺伝子ライブラリーを構築した。遺伝子ライブラリの構築は一般に公知の教書及びハンドブックに記載されている。例として、Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie(Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)の教書又はSambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)のハンドブックが挙げられる。周知の遺伝子ライブラリーはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０であり、この株はKohara et al. （Cell 50, 495 -508 (1987)）によりλ−ベクターに構築された。Bathe et al. (Molecular andGeneral Gentics, 252: 255 - 265, 1996)は、コスミドベクターSuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164)を用いてE. coli K-12株NM554（Raleigh et al., 1988, NucleicAcids Research 16: 1563-1575）中に構築したC. glutamicum ATCC13032の遺伝子ライブラリーを記載している。Boermann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)はコスミドｐＨＣ７９（）の使用下でのC. glutamicum ATCC13032の遺伝子ライブラリーを記載している（Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)）。E. coli中でのC. glutamicumの遺伝子ライブラリーの製造のために、プラスミド例えばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)）又はｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 19: 259-268）を使用することもできる。宿主として、特に制限欠損及び組換え欠損のE. coli−株が適している。これについての例はＤＨ５αｍｃｒであり、これはGrant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)により記載されている。コスミドを用いてクローニングした長いＤＮＡ断片は、引き続き再度、配列決定のために通常適したベクター中でサブクローニングされ、引き続き配列決定され、これは例えばSanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977)により記載されている。
【００２０】このように、C. glutamicumの遺伝子ａｃｃＤＡをコードする新規のＤＮＡ配列が得られ、これを配列番号１として本発明の対象である。配列番号２中にａｃｃＤＡ−遺伝子のコード領域（ｃｄｓ）が記載されている。さらに、このＤＮＡ−配列から上記の方法を用いて相応するタンパク質のアミノ酸配列が誘導される。配列番号３中にはａｃｃＤＡ−遺伝子産物の生じるアミノ酸配列が示されている。
【００２１】配列番号１から遺伝コードの同義性により生じるコードするＤＮＡ−配列は同様に本発明の対象である。同様に配列番号１又は配列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の対象である。専門分野において、さらに保存的アミノ酸交換（konservative Aminosaeureaustausche）、例えばグリシンとアラニンとの交換又はアスパラギン酸とグルタミン酸とのタンパク質中での交換がセンス突然変異（sense mutations）として公知であり、これはタンパク質の活性の根本的変化を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さらに、タンパク質のＮ−末端及び／又はＣ−末端での変化はその機能を本質的に損なわないか、それどころか安定化できることは公知である。この記載は、当業者にはBen-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 69: 751-757 (1987))、O' Regan et al.(Gene 77: 237-251 (1989)、Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247(1994))、Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988))及び遺伝子工学及び分子生物学の公知の教書において見出すことができる。相応する方法で配列番号３から得られたアミノ酸配列も本発明の対象である。
【００２２】発明者はコリネ型バクテリアがａｃｃＤＡ−遺伝子の過剰発現により改善された方法でＬ−リシンを産生することを見出した。
【００２３】過剰発現の達成のために、相当する遺伝子のコピー数を高めるか、構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域及びレギュレータ領域又はリボゾーム結合領域を突然変異させることができる。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットも同様に作用する。誘導可能なプロモータによって、付加的に発酵によるＬ−リシン−産生の進行において発現を向上させることもできる。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための措置によって同様に発現は改善される。さらに、酵素タンパク質の分解の阻害により同様に酵素活性が強化される。この遺伝子又は遺伝子構築物はプラスミドの形で多様なコピー数で存在するか、又は染色対中に統合されて増幅されることができる。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は培地組成及び培養操作によって達成することができる。
【００２４】また、これについては、当業者は特にMartin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1998))、欧州特許（ＥＰＳ）第０４７２８６９号明細書、米国特許代４６０１８９３号明細書、Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)、Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994))、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)、特許出願明細書ＷＯ９６／１５２４６、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))、特開平１０−２２９８９１号公報、Jensen and Hammer (Biotechnologyand Bioengineering 58, 191-195 (1998))、Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996))及び遺伝子工学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
【００２５】プラスミドを用いてａｃｃＤＡ−遺伝子を過剰発現させることができるプラスミドの例は、ｐＺ１ａｃｃＤＡ（図１）であり、これはＭＨ２０−２２Ｂ／ｐＺ１ａｃｃＤＡ中に含まれる。プラスミドｐＺ１ａｃｃＤＡはプラスミドｐＺ１（Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology 55(3), 684-688 (1989））に基づく、ａｃｃＤＡ−遺伝子を有するE. col - C. glutamicum シャトルベクターである。C. glutamicum中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)）又はｐＺ８−１（欧州特許第３７５８８９号明細書）も同様に使用可能である。
【００２６】発明者はさらに、本発明による新規のａｃｃＤＡ−遺伝子に対して付加的に公知のａｃｃＢＣ−遺伝子の付加的過剰発現により、コリネ型バクテリアがアシル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼの産生を改善することを見出した。プラスミドを用いてａｃｃＤＡ−遺伝子及びａｃｃＢＣ−遺伝子を一緒に過剰発現できるプラスミドの例は、ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡ（図２）である。プラスミドｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡは、プラスミドｐＥＫ０（Eikmanns et al., Gene 102,93-98, (1991)）に基づく、ａｃｃＢＣ−遺伝子及びａｃｃＤＡ−遺伝子を有するE. coli - C. glutamicum シャトルベクターである。C. glutamicum中で複製可能な他のプラスミドベクター、例えばｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene102: 93-98 (1991）又はｐＺ８−１（欧州特許第０３７５８８９号明細書）も同様に使用することができる。
【００２７】付加的に、Ｌ−アミノ酸の産生のために、ａｃｃＤＡ−遺伝子の他に生合成経路の１種以上の酵素を過剰発現させることが有利である。
【００２８】・ 同時に、ジヒドロジピコリネート−シンターゼをコードするｄａｐＡ−遺伝子を過剰発現させる（ＥＰ−Ｂ ０１９７３３５）又は・ 同時に、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン−耐性を媒介するＤＮＡ−断片を増幅する（ＥＰ−Ａ ００８８１６６）。
【００２９】さらに、ａｃｃＤＡ−遺伝子の過剰発現の他に不所望の副反応を遮断することがＬ−アミノ酸、特にＬ−リシンの産生にとって有利である（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００３０】本発明により製造された微生物は連続的又は断続的に、バッチ法（batch）又はフィードバッチ法（fed batch）又は繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch）で、Ｌ−リシンを製造する目的で培養することができる。公知の培養法に関する総括はChmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の教書において又はStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教書において記載されている。
【００３１】使用すべき培養基は、適当な方法でそれぞれの株の要求を満たさなければならない。多様な微生物の培地の記載は、ハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」, der American Society for Bacteriology (WashingtonD.C., USA, 1981)に記載されている。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。この材料は個々に又は混合して使用することができる。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができる。この窒素源は個々に又は混合して使用することができる。リン源はリン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素にカリウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することができる。この培養基は、さらに成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使用することができる。培養基にさらに適当な前駆物質を添加することもできる。前記の使用物質は１回だけの添加物の形で培養に添加されるか又は適当な方法で培養期間中に供給することができる。
【００３２】培養のｐＨ−コントロールのために塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸を適当な方法で添加する。起泡の発生をコントロールするために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために培地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件下を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を培養中へ導入する。培養の温度は通常２０℃から４５℃、有利に２５℃〜４０℃である。この培養は所望のＬ−アミノ酸の最大値が達成するまで続けられる。この目的は通常１０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００３３】Ｌ−リシンの分析は、Spackman et al.（Analytical Chemistry, 30, (1958),1190）に記載されたように、アニオン交換クロマトグラフィーと、それに引き続くニンヒドリン誘導化によって行われる。
【００３４】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Corynebacterium glutamicum株 DSM5715/pZ1accDAをDSM 12785として、Corynebacterium glutamicum株 DSM5715/pEK0accBCaccDAをDSM 12787として。
【００３５】本発明による方法は、コリネ型バクテリアを用いたＬ−アミノ酸、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンの発酵による製造のために、特にＬ−リシンの製造のために用いられる。
【００３６】
【実施例】本発明を次に実施例により詳説する。
【００３７】例１ａｃｃＤＡ−遺伝子のクローニング及び配列決定C. glutamicum ATCC 13032の遺伝子ライブラリーを、コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)）の使用下で、Boermann et al.（Molecular Microbiology 6(3), 317-326）に記載されたように製造した。
【００３８】選択されたコスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを用いてこの制限酵素の製造元（Boehringer Mannheim）の記載に従って消化させた。生じたＤＮＡ−断片を、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理したベクターｐＵＣ１８（Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106）と混合し、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼで処理した後にE. coli株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4645）中で、Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)に記載されたようにクローニングした。形質転換体の選択は、Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)に記載されているように、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天上で選択することにより行った。形質転換体からプラスミド−ＤＮＡを単離し、これをｐＵＣａｃｃＤＡとした。引き続きPromega社（Heidelberg, Deutschland）のこの目的のために用いるキット（Erase-a-Base）を用いてエキソヌクレアーゼＩＩＩ−消化を介してサブクローンを製造した。これをSanger et al.によるジデオキシ−鎖分解法（Proceeding of the National Academy of Sciences USA (1977) 74: 5463-5467）により配列決定した。その際、オート−リード−シーケンジング−キット（Auto-Read Sequencing kit）を使用した（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden）。ゲル電気泳動による分析を、Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Schweden)社の自動的レーザー−蛍光−シーケンサー装置（A. L. F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列をプログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Heidelberg,Deutschland）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号１に記載した。このヌクレオチド配列の分析は１４７３個の塩基対のオープンリーディングフレームを示し、このフレームをａｃｃＤＡ−遺伝子とした。C. glutamicumからのａｃｃＤＡ−遺伝子は４８４個のアミノ酸のポリペプチドをコードした。
【００３９】例２Corynebacterium glutamicum中のａｃｃＤＡ−遺伝子の発現ａｃｃＤＡ遺伝子をC. glutamicum中の発現のためにベクターｐＺ１（Menkelet al. (1989) Applied and Enviromental Microbiology 55: 684-688）中にサブクローンした。このために、プラスミドｐＵＣａｃｃＤＡ（例１参照）を制限酵素ＣｌａＩで切断した。生じた１．６ｋｂのサイズの断片を例１に記載したと同様に単離し、クレノウ−ポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで処理し、連結のためにｐＺ１を使用した。このベクターをまずＳｃａＩで線状化した。この連結物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4645）を形質転換し、この形質転換体をカナマイシン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ−寒天上で選択した。それにより７．７ｋｂのサイズのシャトルベクターｐＺ１ａｃｃＤＡ（図１）が得られた。これを、Haynes (FEMS Microbiol. Letters (1989) 61: 329-334)に記載されたようにエレクトロポレーションを用いて、株ＤＳＭ５７１５中へ導入し、その際、この形質転換体をＬＢＨＩＳ−寒天上で選択した（Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1989, 65: 299-304）。このように、C. glutamicum株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡが得られた。
【００４０】例３株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡを用いたＬ−リシンの製造株ＤＳＭ５７１５／ｐＺ１ａｃｃＤＡを、培地ＣｇＩＩＩ（Keilhauer et al.1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）、生産培地ＣｇＸＩＩ（Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）中で予備培養することにより培養した。４％グルコース及びカナマイシンスルフェート５０ｍｇ／ｌを添加した。
【００４１】４８時間インキュベーションした後、光学密度を６６０ｎｍで及び生成されたＬ−リシンの濃度を測定した。表１中にこの試験の結果を示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】例４ａｃｃＢＣ及びａｃｃＤＡの一緒の発現（ｉ） 発現ベクターｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡの構築ａｃｃＢＣ含有プラスミドｐＷＪ７１（Jaeger et al., Archives of Microbiology (1996) 166: 76-82）を制限酵素ＡｇｅＩ及びＳｍａＩを用いて消化し、引き続きクレノウ−ポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで処理した。これに平行して、プラスミドｐＵＣａｃｃＤＡをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、引き続きクレノウポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼで実施した。Sambrook et al.（Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories）に記載されたようにアガロースゲルから分別単離を実施することにより、２．１ｋｂのサイズのａｃｃＤＡを有する断片を単離した。これを、前記したように準備したベクターｐＷＪ７１と連結した。生じたプラスミドから４．６ｋｂのサイズのａｃｃＢＣａｃｃＤＡ−含有断片をＫｐｎＩ／ＳａｌＩ消化により切断し、アガロースゲル電気泳動により分別単離した。この断片をC. glutamicum/E. coli シャトルベクターｐＥＫ０（Eikmanns et al. (1991) Gene 102: 93-98）と連結するために、ｐＥＫ０を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、引き続きクレノウポリメラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼを用いて処理を実施した。こうして準備されたベクターを４．６ｋｂのサイズのａｃｃＢＣａｃｃＤＡ−含有断片と連結した。生じたベクターｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡを図２に記載した。このベクターをエレクトロポレーションを用いて例２に記載したと同様に株ＡＴＣＣ１３０３２中へ導入した。このように、C. glutamicum株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡが得られた。
【００４４】（ｉｉ） アシル−ＣｏＡ カルボキシラーゼ活性の測定株C. glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡを、培地ＣＧＩＩＩ（Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603）中での予備培養の後に備置ＣＧＸＩＩ（Kailhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)に記載）中に摂取した。この細胞を遠心分離により収穫し、細胞ペレットを６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄し、セルフ−バッファ（selben Puffer）中に再懸濁させた。細胞分解物に１０分間の超音波処理を行った（Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic PowerCo, Danbury, USA）。引き続き細胞の破片を４℃で３０分間遠心分離することにより分離した。酵素試験の反応バッチは反応容量１ｍｌ中で６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、６５ｍＭのＫＨＣＯ3、１ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、４ｍＭのアシルＣｏＡ（裁量でアセチル−ＣｏＡ又はプロピオニル−ＣｏＡ）及び粗製抽出物４ｍｇを含有した。この試験バッチから３０℃でインキュベートし、１５秒、３０秒、４５秒及び６０秒後に試料１００μｌを取り出し、そのマロニル−ＣｏＡもしくはメチルマロニル−ＣｏＡ濃度をＨＰＬＣ−分析により測定した（Kimura et al. (1997) Journal of Bacteriology 179: 7098-7102）。表２に示したように、株C. glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡは、対照株がアセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡによるわずかなアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−活性を有するのに対して、アセチル−ＣｏＡ及びプロピオニル−ＣｏＡにより高いアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−活性を示した。
【００４５】表２：C. glutamicum中のアシル−ＣｏＡカルボキシラーゼ比活性（μｍｏｌ／分及びｍｇタンパク質）
【００４６】
【表２】
【００４７】
配列表＜110＞ Degussa-Huels AGForschungszentrum-Juelich GmbH＜120＞ 複製可能なＤＮＡ、アミノ酸配列、コリネ型微生物、シャトルベクター及びＬ−アミノ酸の製造方法＜130＞ 990042BT＜140＞＜141＞＜160＞ 3＜170＞ PatentIn Ver. 2.1＜210＞ 1＜211＞ 2123＜212＞ DNA＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜220＞＜221＞ gene＜222＞ (508)..(1980)＜223＞ accDA＜400＞ 1
【００４８】
【外１】
【００４９】
【外２】
【００５０】
【外３】
【００５１】
＜210＞ 2＜211＞ 1473＜212＞ DNA＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜220＞＜221＞ CDS＜222＞ (1)..(1473)＜223＞ accDA＜400＞ 2
【００５２】
【外４】
【００５３】
【外５】
【００５４】
【外６】
【００５５】
【外７】
【００５６】
＜210＞ 3＜211＞ 491＜212＞ PRT＜213＞ Corynebacterium glutamicum＜400＞ 3
【００５７】
【外８】
【００５８】
【外９】
【００５９】
【外１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＺ１ａｃｃＤＡのマップを示す図。
【図２】プラスミドｐＥＫ０ａｃｃＢＣａｃｃＤＡのマップを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１に記載されたａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネバクテリウム由来の、コリネ型微生物中で複製可能な非組換え又は組換えＤＮＡ。
【請求項２】（ｉ） 配列番号１に記載されたヌクレオチド配列、（ｉｉ） 遺伝コードの同義性の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉｉ） 配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、及び場合により（ｉｖ） （ｉ）において機能的に中立なセンス突然変異を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡ。
【請求項３】 請求項１又は２記載のヌクレオチド配列から誘導される、配列番号３に記載されたタンパク質のアミノ酸配列。
【請求項４】 請求項１又は２記載の１種以上の複製可能なＤＮＡを導入することにより形質転換されたコリネ型微生物。
【請求項５】 コリネバクテリウム グルタミクム中でＤＳＭ１２７８５の名称のもとで寄託された図１に記載された制限マップを特徴とするシャトルベクター ｐＺ１ａｃｃＤＡ。
【請求項６】 ａｃｃＤＡ−遺伝子又はこれをコードするヌクレオチド配列を強化した、特に過剰発現させたバクテリアを使用することを特徴とするコリネ型バクテリアの発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】 さらに、所望のＬ−アミノ酸の生合成経路の他の遺伝子を強化したバクテリアを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】 所望のＬ−アミノ酸の生成を減少させる物質代謝経路の少なくとも一部が遮断されているバクテリアを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項９】 プラスミドベクターで形質転換された株を使用し、このプラスミドベクターがａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項６又は７記載の方法。
【請求項１０】 コリネバクテリウム グルタミクム中でＤＳＭ１２７８５の名称のもとで寄託されたプラスミドベクター ｐＺ１ａｃｃＤＡで形質転換されたバクテリアを使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】 Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンを製造するコリネ型バクテリアを使用する、請求項６から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】 Ｌ−リシンを製造するコリネ型バクテリアを使用する、請求項６から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】 ａｃｃＡＤ遺伝子に対して付加的にａｃｃＢＣ−遺伝子を過剰発現させる、請求項６から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】 ジヒドロジピコリネート−シンターゼをコードするｄａｐＡ−遺伝子を同時に過剰発現させる、請求項６記載の方法。
【請求項１５】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン−耐性を媒介するＤＮＡ−断片を同時に増幅する、請求項６記載の方法。
【請求項１６】 次の工程：ａ） 少なくともａｃｃＤＡ−遺伝子を強化した、所望のＬ−アミノ酸を産生するコリネ型バクテリアを発酵させる工程、ｂ） 培地中で又はバクテリアの細胞中で所望のＬ−アミノ酸を富化させる工程、及びｃ） 所望のＬ−アミノ酸を単離する工程、を実施することを特徴とする請求項６から１５までのいずれか１項記載のＬアミノ酸の発酵による製造方法。
【請求項１】 配列番号１に記載されたａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含有する、コリネバクテリウム由来の、コリネ型微生物中で複製可能な非組換え又は組換えＤＮＡ。
【請求項２】（ｉ） 配列番号１に記載されたヌクレオチド配列、（ｉｉ） 遺伝コードの同義性の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも１つの配列、又は（ｉｉｉ） 配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイズする少なくとも１つの配列、及び場合により（ｉｖ） （ｉ）において機能的に中立なセンス突然変異を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡ。
【請求項３】 請求項１又は２記載のヌクレオチド配列から誘導される、配列番号３に記載されたタンパク質のアミノ酸配列。
【請求項４】 請求項１又は２記載の１種以上の複製可能なＤＮＡを導入することにより形質転換されたコリネ型微生物。
【請求項５】 コリネバクテリウム グルタミクム中でＤＳＭ１２７８５の名称のもとで寄託された図１に記載された制限マップを特徴とするシャトルベクター ｐＺ１ａｃｃＤＡ。
【請求項６】 ａｃｃＤＡ−遺伝子又はこれをコードするヌクレオチド配列を強化した、特に過剰発現させたバクテリアを使用することを特徴とするコリネ型バクテリアの発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】 さらに、所望のＬ−アミノ酸の生合成経路の他の遺伝子を強化したバクテリアを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】 所望のＬ−アミノ酸の生成を減少させる物質代謝経路の少なくとも一部が遮断されているバクテリアを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項９】 プラスミドベクターで形質転換された株を使用し、このプラスミドベクターがａｃｃＤＡ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項６又は７記載の方法。
【請求項１０】 コリネバクテリウム グルタミクム中でＤＳＭ１２７８５の名称のもとで寄託されたプラスミドベクター ｐＺ１ａｃｃＤＡで形質転換されたバクテリアを使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】 Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンを製造するコリネ型バクテリアを使用する、請求項６から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】 Ｌ−リシンを製造するコリネ型バクテリアを使用する、請求項６から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】 ａｃｃＡＤ遺伝子に対して付加的にａｃｃＢＣ−遺伝子を過剰発現させる、請求項６から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】 ジヒドロジピコリネート−シンターゼをコードするｄａｐＡ−遺伝子を同時に過剰発現させる、請求項６記載の方法。
【請求項１５】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン−耐性を媒介するＤＮＡ−断片を同時に増幅する、請求項６記載の方法。
【請求項１６】 次の工程：ａ） 少なくともａｃｃＤＡ−遺伝子を強化した、所望のＬ−アミノ酸を産生するコリネ型バクテリアを発酵させる工程、ｂ） 培地中で又はバクテリアの細胞中で所望のＬ−アミノ酸を富化させる工程、及びｃ） 所望のＬ−アミノ酸を単離する工程、を実施することを特徴とする請求項６から１５までのいずれか１項記載のＬアミノ酸の発酵による製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００１−８６９３（Ｐ２００１−８６９３Ａ）
【公開日】平成１３年１月１６日（２００１．１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０００−１５３５４７（Ｐ２０００−１５３５４７）
【出願日】平成１２年５月２４日（２０００．５．２４）
【出願人】（５９９０２０００３）デグサ−ヒュルス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【公開日】平成１３年１月１６日（２００１．１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１２年５月２４日（２０００．５．２４）
【出願人】（５９９０２０００３）デグサ−ヒュルス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
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