規模調整が可能な細胞培養バイオリアクター及び細胞培養方法
本発明は、少なくとも一個の、マニホールド及び中空繊維メンブラン配置を含んでなるカセット、上側ヘッドプレート、及び下側ヘッドプレートを含んでなる、規模を調整できるバイオリアクターであって、該カセットが、相互に、及び該ヘッドプレートと連携し、内部の毛細管外培養空間（ＥＣＳ）を限定するように構築されたモジュール式構成部品であり、該中空繊維メンブラン配置が個別の入口及び出口を包含する、バイオリアクターに関する。本発明は、さらにそのようなバイオリアクターようのキット、そのようなバイオリアクターで使用するカセット、及び細胞及び／または微生物の代謝を利用するための、本発明のバイオリアクターを使用する工程を包含する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、規模を調整できる毛細管（中空繊維）メンブランバイオリアクターに、及びそのバイオリアクターを使用して細胞及び／または微生物を培養及び維持し、高い処理融通性で、これらの細胞の代謝を利用し、生物学的生成物を製造または生物変換する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
毛細管メンブラン、または中空繊維リアクター（ＨＦＲｓ）は、上流及び下流濾過及び精製処理に、廃水処理における微生物または酵素を固定したバイオリアクターとして、及び細胞または組織培養装置として広範囲に使用されている。
【０００３】
ほとんどの細胞培養ＨＦＲ設計は、軸方向流を使用し、そこでは、個別の流体流が、メンブランの両側で、メンブラン表面を横切って流れる（Ｃｈｒｅｓａｎｄら１９８７）。これらのモジュールのスケール−アップは、円筒形マニホールド中に含まれる中空繊維束の中にあるメンブランの数を増加し、活性メンブラン表面積を増加することにより、行われる。材料または栄養交換は、一方の流体流から他方への拡散により、メンブラン表面を横切って行われる。これによって、繊維束を横切って軸方向及び半径方向の栄養勾配が生じるが、これは、細胞成長、バイオプロセス安定性及び生産性に悪影響を及ぼす不均質性をもたらすと理解されている。これらの不均質性は、ＨＦＲのサイズが増加するにつれて、増幅される。
【０００４】
細胞培養ＨＦＲにおける交差（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）（接線）及びデッド−エンド（貫流）濾過は、２つの個別流体流間の材料交換を改良するために使用されているが、そこでは材料が、拡散ではなく、対流により、メンブラン表面を横切って搬送される。これらの２流体供給手段は、灌流（米国特許第４，８０４，６２８号）及び固定（国際公開ＷＯ２００７／００４１７０Ａ２）細胞培養装置にそれぞれ使用されている。それぞれの場合、細胞への栄養供給及び代謝廃物及び／または問題とする生物学的生成物の細胞培養空間からの除去が強化されることが観察されている。それにも関わらず、中空繊維束の中における軸方向勾配及び不均質性は依然として観察されており、ＨＦＲ設計の規模を制限している。
【０００５】
横方向流モジュールは、本来、濾過、透過気化法（ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）及び廃水処理方法のために開発され、軸方向勾配及び不均質性を制限し、メンブラン表面に沿って良く限定された流体力学的供給及び浸透流を可能し、それによって、濃度偏向を制御し、メンブランを横切る濃度ベース駆動液体を最適化する（Ｆｕｔｓｅｌａａｒ，１９９３）。これらのモジュールでは、毛細管メンブランが供給流に対して直角に配置される。規則的な配置により、流れの誤分配が防止されたが、横方向配置が物質移動係数を大きく増加させた（Ｆｕｔｓｅｌａａｒ， １９９３）。この一様な、メンブランの２−Ｄ分配により、規模調整の可能性が改良され、幾つかの設計が開示されている（Ｚｈａｎｇら２００３，Ｓｍａｒｔら１９９８， Ｖｌａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ １９９９）。いずれの場合も、メンブランを通る流体経路は固定されており、全てのメンブランが同じ方向に向いており、単一の流体入口及び出口通路中にマニホールド形成されている（図１Ａ〜Ｃ）。
【０００６】
米国特許第５，５１６，６９１号は、修正された横方向流モジュールを記載しているが、そこでは、メンブランが、細胞を培養及び維持し、それらの代謝（代謝生成物）を利用するための細胞培養装置として使用される３−Ｄ配置に（図１Ｄ）配分されている。このバイオリアクター設計は、交差流及び／またはデッド−エンド（貫流）濾過による改良された物質移動、及び繊維の３−Ｄ網目による改良された基質及び代謝物交換の原理を包含し、それによって、細胞培養空間全体にわたって一貫した流体供給を確保し、代謝及び細胞生存率を改良している。この３−Ｄ配置により、少なくとも３個の独立した、それぞれ複数のメンブランから構成されるメンブラン系も得られる。第一メンブラン系は媒体流入に、第二はＯ２の供給またはＣＯ２の除去に、第三は媒体流出に使用される。メンブラン系同士の間の内側空間及び外側マニホールドは、細胞培養空間として使用される。この設計は、多次元的繊維配置の細胞培養への最初の応用であり、組織培養を、合成器官または肝臓支援装置として概念化しているが、規模調整の可能性は考慮されていない。さらに、同じ方向に向けられた各面層は、単一の流体入口及び出口通路中にマニホールド形成されている（図１Ｄ）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第一態様により、
・少なくとも一個の、マニホールド及び中空繊維メンブラン配置を含んでなるカセット、
・上側ヘッドプレート、及び
・下側ヘッドプレート
を含んでなる規模を調整できるバイオリアクターであって、
該カセットが、相互に、及び該ヘッドプレートと連携し、内部の毛細管外（ｅｘｔｒａｃａｐｉｌｌａｒｙ）培養空間（ＥＣＳ）を限定するように構築されたモジュール式構成部品であり、該中空繊維メンブラン配置が個別の入口及び出口を包含する、バイオリアクターが提供される。
【０００８】
好ましくは、入口及び出口は、中空繊維メンブランを経由して流体連絡している。カセットは、好ましくは（各）マニホールドと流体連絡して配置された入口及び出口貯蔵部を含んでなる。マニホールドは、好ましくはメンブランの各末端に配置され、各貯蔵部は、それぞれの入口及び出口と流体連絡している。
【０００９】
各カセットは、好ましくは貯蔵部と流体連絡している個別の入口及び出口だけを包含する、すなわち、カセットを通したＥＣＳとの流体連絡は無い。
【００１０】
中空繊維メンブランは、実質的に平行なメンブランの列に配置することができる。各カセットは、好ましくはそのような列の一つ以上を包含する。
【００１１】
各カセットが２つ以上のそのような層（列）を包含する場合、中空繊維メンブランの各層は、好ましくは水平または垂直の向きで、その上及び／または下にある層に対して直角に配置される。より好ましくは、中空繊維メンブランの各層は、その上及び／または下にあるメンブラン層に対してずれている。
【００１２】
好ましくは、バイオリアクターは、２個以上のカセットを含んでなる。各カセットは、官能性毎に一つの中空繊維メンブラン層（列）を包含することができる。
【００１３】
ヘッドプレートは、流体が、ＥＣＳ中に導入される、ＥＣＳから排出される、及び／またはＥＣＳを通して自由に流動するように、好ましくはＥＣＳ中への開口部（ポート）を包含する。ヘッドプレートは、ＥＣＳ中にある流体の組成を監視及び／または制御できるように、ＥＣＳ小室中にプローブまたはセンサーを挿入できるようにする少なくとも一個の部品またはポートを包含する。各開口部（ポート）は、閉鎖できるのが好ましい。好ましくは、そのようなＥＣＳと流体連絡するポートは、カセット中ではなく、ヘッドプレート上／中にのみ配置する。
【００１４】
本発明の第二態様により、中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールドを含んでなるカセットであって、該カセットが、中空繊維メンブランの各配置に対して個別の入口及び出口をさらに含んでなり、該カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携し、内部ＥＣＳを限定するように構築される、カセットが提供される。
【００１５】
本発明の第三態様により、バイオリアクター用の、
・中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールド、及び
・上側及び下側ヘッドプレート
を含んでなるキットが提供される。
【００１６】
好ましくは、キットは、マニホールドを受け入れるか、または包含するように構築されたカセットを包含し、カセットは、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携するように構築されている。キットは、所望によりマニホールド中に取り付けた、少なくとも一個の中空繊維メンブランも包含することができる。
【００１７】
中空繊維メンブランは、好ましくは軸方向に引き伸ばした、飲料ストローのような形状の中空チューブである。中空繊維メンブランは、好ましくは選択的に透過性であり、セラミックメンブランでもよい。
【００１８】
マニホールドは、中空繊維メンブランを受け入れるように構築された２個（またはそれ以上）の対向するマニホールドを含んでなるフレーム中に収容することができ、マニホールドを互いに接合し、フレームを形成する。各マニホールドは、中空繊維メンブランを受け入れるように構築された開口部を包含することができる。各カセットは、好ましくはマニホールド（開口部）と流体連絡する（入口または出口の）貯蔵部及びやはり貯蔵部と流体連絡する入口または出口を包含する。
【００１９】
貯蔵部は、フレームと末端プレートの連携により形成することができる。
【００２０】
カセット、フレーム、マニホールド、末端プレート及びヘッドプレートは、ステンレス鋼またはいずれかの好適な形態の重合体／プラスチックから構築することができる。
【００２１】
本明細書では、バイオリアクターの各構成部品、例えばカセット、マニホールド、フレーム及び／または中空繊維メンブラン、の説明は、本発明の全ての態様に適用される。
【００２２】
本発明の第四態様により、細胞及び／または微生物の代謝を利用するための、本発明のバイオリアクターを使用する工程を包含する方法が提供される。
【００２３】
この方法は、上記のバイオリアクターのＥＣＳ中に細胞及び／または微生物を接種することを包含する。好ましくは、細胞及び／または微生物を中空繊維メンブランの外側表面上に固定する、及び／または細胞及び／または微生物をＥＣＳ中に分散させる。無論、ＥＣＳは、ガス及び／または液体を含むことができる。
【００２４】
細胞は、哺乳動物及び昆虫細胞系統から選択することができ、微生物は、細菌、酵母及び菌類から選択することができる。哺乳動物及び昆虫細胞系統は好ましくはアンカレッジ依存型であり、微生物は好ましくは非糸状であるが、これらに限定するものではない。
【００２５】
アンカレッジ依存細胞系統は、典型的には、二倍体細胞株、例えばヒト初期肺（ｅｍｂｒｏｙｏｎｉｃ ｌｙｎｇ）、ヒト包皮、ヒト初期腎臓、ニワトリ、ウサギ、マウス及びラット線維芽細胞、チンパンジー肝臓線維芽細胞、ラット神経膠細胞、ネコ肺線維芽細胞及び二次サル腎臓細胞、一次細胞、例えばサル、イヌ及びウサギ腎臓細胞、マウスマクロファージ、ラット膵臓細胞、ラット肝臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ラット下垂体細胞及び羊水細胞、株及び転換細胞系統、例えばマウス線維芽細胞、正常ラット腎臓、チャイニーズハムスター卵巣及び肺、べービーハムスター腎臓、チンパンジー胚肺、アフリカングリーンモンキー腎臓、マウスＬ細胞、ＨｅＬａ、マウスマクロファージ細胞系統、転換イヌ腎臓、肉腫ウイルス転換ラット腎臓及びマウス線維芽細胞、ヒト膠腫、ヒト骨肉腫、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ犬腎臓、ＫＢ細胞、アカゲザル腎臓、ＭｃＣｏｙ細胞、ヒト甲状腺癌、ヒト某状体癌（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、ラット筋肉由来の線維芽細胞、およびラビット角膜細胞から選択される。
【００２６】
微生物は、典型的には正常なまたは形質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｃ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ｓｐｐ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから選択される。
【００２７】
本方法は、標準的な交差流操作による、またはデッド−エンド操作による中空繊維メンブランの配置の入口装置を通る流体流を包含することができる。
【００２８】
本方法は、中空繊維メンブランを通る流体供給を調整するための制御手段を包含することができる。好ましくは、制御手段は、圧力制御手段でよい特殊な統合された制御手段である。
【００２９】
本方法は、好ましくは、栄養、ガス、例えば酸素及び二酸化炭素、緩衝剤（酸性または塩基性溶液）、ホルモン、成長調整または代謝改良化合物、使用済み媒体、代謝廃物、重要な生成物、及び熱交換材料を包含する物質の供給及び／または除去を包含する。これらの物質は、細胞及び／または微生物に、カセットの入口または出口装置を経由して（すなわち、中空繊維メンブランを通して）及び／または上側及び下側ヘッドプレート中の開口部（ポート）を通して供給することができる。
【００３０】
本方法は、ＥＣＳを通る流体流を包含することができ、流体流は、さらに再循環させるか、またはデッド−エンド方式によるものでよい。無論、ＥＣＳを通る流体流は、好ましくは下側ヘッドプレートから上側ヘッドプレートへ、またはその逆に行われる横方向流により行う。
【００３１】
下記の文献を、ここに参考として含める。
１．Ｃｈｒｅｓａｎｄ Ｊ．Ｊ．， Ｇｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｊ．及びＤａｌｅ Ｂ．Ｅ． （１９８７）中空繊維バイオリアクターにおける繊維空間の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｆｉｂｒｅ ｓｐａｃｉｎｇ ｉｎ ａ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）。Ｂｉｏｅｎｇ． ３２：９８３−９８２。
２．Ｃｒａｃａｕｅｒ， Ｒ．Ｆ．， Ｗａｌｋｅｒ Ｒ．Ｄ．及びＧｒｕｅｎｂｅｒｇ Ｍ． （１９９６）中空繊維細胞培養装置及び操作方法（Ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。米国特許第４，８０４，６２８号。
３．Ｆｒａｓｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｗ．及びＬｅｕｋｅｓ， Ｗ．Ｄ．（２００７）二次代謝物及び組換え体タンパク質の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｓｙｎｅｘａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （ＰＴＹ．） ＬＴＤ。ＷＯ２００７／００４１７０Ａ２。
４．Ｆｕｔｓｅｌａａｒ Ｈ．（１９９３）横方向流モジュール構築、性能及び用途（Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ−ｆｌｏｗ ｍｏｄｕｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）。ＰＨＤ Ｔｈｅｓｉｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｅｎｔｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
５．Ｇｅｒｌａｃｈ Ｊ．（１９９６） 培養及び代謝を使用するための、及び／または微生物を維持するためのモジュール（Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ ａｎｄ／ｏｒ ｆｏｒ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）。米国特許第５，５１６，６９１号。
６．Ｓｍａｒｔ Ｊ．，Ｓｔａｒｏｖ Ｖ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｃｋｅｒ Ｒ．Ｃ．及びＬｌｏｙｄ Ｄ．Ｒ．（１９９８） 管状横方向流モジュールを使用する、水系からの揮発性有機化合物の透過気化法抽出（Ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｔｕｂｕｌａｒ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｆｌｏｗ ｍｏｄｕｌｅ）。Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｓｃｉ １４３：１５−１７９。
７．Ｖｌａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ Ｇ．Ｔ．及びＭｉｔｒｏｖｉｃ Ｍ．Ｖ．（１９９９）フレーム要素を含む３相中空繊維メンブラン接触装置における圧力低下及び水抵抗Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｒｏｐｓ ａｎｄ ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｔｈｒｅｅ−ｐｈａｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）。Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ４０：３−１１。
８．Ｚｈａｎｇ Ｓ．，ｖａｎ Ｈｏｕｔｅｎ Ｒ．，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ Ｄ．Ｈ．，Ｄｏｄｄｅｍａ Ｈ．，Ｊｉａｎｇ Ｚ．，Ｆａｎ Ｙ．及びＷａｎｇ Ｊ．（２００３）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ １８５−１９２。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】各種の先行技術による配置を示す。
【図２】本発明による完全な可能なバイオリアクター全体の（Ａ）断面図、（Ｂ）上または底面図及び（Ｃ、Ｄ）透視図を示す。
【図３】本発明の規模を調整できるバイオリアクターの分解組立図を示す。
【図４】処理例の概略を示す。
【図５】例１で使用するバイオリアクター配置を示す。
【図６】例１に関するＣＨＯ−Ｋ１プロセスデータを示す。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
下記の本発明を制限しない図面を参照しながら、本発明を、例としてのみ、より詳細に説明する。
【００３４】
現在の設計では、モジュールスケール−アップ及びプロセス融通性の原理を、毛細管メンブランの２−Ｄ及び３−Ｄ網目に取り入れる。規模を調整できるメンブランバイオリアクター装置（図２及び３）は、２個のヘッドプレート（１）及び２個のヘッドプレート間に固定された少なくとも一個のカセット（５）から構成され、効果的に毛細管外空間（ＥＣＳ）を限定し、中空繊維メンブラン中の毛細管内空間（ＩＣＳ）から分離する。図２は、完全な細胞培養モジュールを例示し、例えば７個の個別カセット（５）を固定している２個のヘッドプレート（１）を示す。上側及び／または下側ヘッドプレートは、操作中にモジュール内の状態を観察できる中央の透明な観察パネル（２）を包含する。各ヘッドプレートは、ＥＣＳに対する入口／出口として作用する少なくとも一個のＥＣＳポート（３、４）及びＥＣＳ小室中にプローブまたはセンサーを挿入できるようにする少なくとも一個の部品またはポート、例えばｐＨ（２９）またはＤＯプローブ（３０）用の部品、も包含することができる。各カセット（５）は、Ｏ−リング、ガスケットまたは他の手段（８）を使用し、隣接するカセット（５）及び／またはヘッドプレート（１）に対して密封される。カセット及びヘッドプレートシールは、例えば積み重ねた装置の四隅に配置された４個のロッドまたはピン（６）により、一つに圧迫され、所定の位置に固定される。より大型のバイオリアクターは、圧迫し易くするために追加のピンを必要とする場合がある。
【００３５】
各カセット（図３）は、挿入フレーム（７）を含んでなり、その中に、少なくとも４層の毛細管メンブラン（９）が、樹脂、エポキシまたは他の手段を使用して固定される。好ましい実施態様では、毛細管メンブランは、フレームに剛性、及び重合体メンブランでしばしば観察される構造的歪みに対する耐性を与えるセラミックである。しかし、この設計は、特定寸法、化学的特性または技術的特性の毛細管のどれにも限定されないことに注意すべきである。好ましい実施態様では、各層は、類似した種類のメンブランから構成されるが、異なった層は、製造材料、細孔径及び分布、被覆、選択性、及び／または伝導性を包含する、但し、これらに限定するものではない、異なった化学的または技術的特性を有するメンブランを含んでなることもできる。
【００３６】
２−Ｄメンブラン列（９）により、リアクター中の全ての位置で、メンブランを通して材料が確実に一様に供給及び除去され、それによって、バイオリアクター中における軸方向の勾配及び不均質性が最少に抑えられる。モジュールを加圧下で操作することにより、細胞培養流体中に溶解している栄養及びガスの濃度を高くすることができる。あるメンブラン系（層または列）からＥＣＳ（細胞培養空間）中への、及び第二メンブラン系から出る栄養のデッド−エンド流は、メンブラン表面上に細胞を濃縮及び固定するのに役立ち、確実に物質移動を改良し、バイオフィルム中に固定された全ての細胞に栄養を供給することができる。細胞濃度およびバイオフィルム形成は、細胞−細胞連絡、細胞生存率及び生産性の強化に相関している。
【００３７】
各連続メンブラン層は、マニホールド中の開口部（１０、１１、１２、１３）の列の中に受け入れられ、各層は、その上及び下のメンブラン層に対して直角の方向に向けられている。さらに、同じ方向に向けられた各連続メンブラン層は、上から見た時に、メンブランがジグザグになり、連続的な二軸メンブラン網目（９）を形成するようにずらし、ＥＣＳ中における通路形成を通した流体の誤配分及び重力により支援される細胞の沈降を制限することができる。
【００３８】
各メンブラン層は、フレーム（７）上に包含される流体分配マニホールドにより、他のメンブラン層から効果的に小室に分けられている。メンブラン層中にある各毛細管メンブランの開いた末端は、別の流体分配チャンバー（貯蔵部）（１４、１５）中に開いており、それらのチャンバーにより取り囲まれている。単一カセット（５）中にある異なったメンブラン層及び流体分配チャンバー（１４、１５）は、Ｏ−リング、ガスケットまたは他の手段（１９）により相互に密封されている。４個の個別末端プレート（１８）のそれぞれは、フレーム（７）に対して整列し、密封され、少なくとも２個のネジまたはピン（２０）により所定の位置に固定され、流体分配チャンバー（貯蔵部）を限定する。各メンブラン層は、各対向する流体分配チャンバー中に、ＩＣＳ入口（２１、２３、２５、２７）及びＩＣＳ出口（２２、２４、２６、２８）を有し、それによって、個別の含まれる流体を、各メンブラン層を通して流すことができる。
【００３９】
好ましい実施態様では、少なくとも一個のメンブラン層を使用して栄養溶液をＥＣＳ中の細胞に供給し、少なくとも一層を使用し、問題とする生成物及び／または代謝廃物を含む使用済み媒体を除去する。他の層は、
・ガス透過性メンブランを使用して培養空間に酸素を供給するために、
・ＣＯ２濃度を調整する、酸性または塩基性溶液を導入する、あるいは選択的に透過性のメンブランを使用し、培養空間から有機酸を補集することにより、培養空間の緩衝を行うために、
・プロセス安定性を高め、制御するために、特定の栄養供給剤、成長段階抑制剤、または誘発剤分子を包含する、但し、これらに限定するものではない、成長調整または代謝改良化合物を調整しながら供給するために、または
・リアクターを一定温度に維持するための熱交手段として、
使用することができる。
【００４０】
細胞培養空間は、ヘッドプレート上に配置された入口または出口を通して栄養溶液で流す、掃除する、または再循環させることができる。
【００４１】
このモジュールアセンブリーにより、同じ設計から規模を増大させる融通性が得られ、少なくとも一個のメンブラン挿入物を含んでなるバイオリアクターでプロセスを最適化した後、必要に応じて追加のメンブラン挿入物を積み重ね、効果的にメンブラン表面積及びリアクター容積を直線的に増加させることができる。特定のプロセスで、異なったメンブラン挿入物から来るメンブラン層を一つにマニホールド化し、モジュール内の全てのメンブラン挿入物への／からの流体供給及び／または除去を一様に分配し易くすることができる。
【００４２】
好ましい実施態様では、バイオリアクター装置を垂直に向け、メンブラン網目を水平に向ける（図２、断面Ａ−Ａ）。この場合、底部ヘッドプレート（１）上に位置するＥＣＳポート（４）は、細胞接種物及び／または流体をＥＣＳ中に導入するように作用し、空気または使用済み媒体を、最上部ヘッドプレート上に位置するＥＣＳポート（３）を通して排出する。このように、ＥＣＳ全体を流体で満たし、エア−ロツクを防止することができる。これは、ｐＨ（２９）またはＤＯプローブ（３０）を包含するが、これらに限定しない、ＥＣＳ中の処理状態を監視するのに使用する全てのプローブを効果的に操作するのに不可欠である。メンブラン網目に対して横方向の流体流は、標準的な交差流操作条件（図１参照、先行技術）を使用し、ＥＣＳを通して再循環させるか、またはＥＣＳ出口（３）を閉じ、流体流をデッド−エンド様式で操作することができる。どちらかの流動様式を使用し、カセット（５）内にあるメンブラン層中に含まれる少なくとも一個の中空繊維の外側表面上に細胞を固定することができる。これは、液体を、選択的透過性の毛細管メンブラン（９）の壁を通してＩＣＳ中に強制的に浸透させ、接種物はＥＣＳ側のメンブラン表面に保持されたまま、少なくとも一個のＩＣＳ出口ポート（２２、２４、２６、２８）を通して外に出るように、ＥＣＳ中の流体に圧力を作用させることにより、容易に行うことができる。
【００４３】
長期間の操作中、ＥＣＳ中に蓄積し、重力の影響下で沈降することがある細胞の屑または材料は、底部ヘッドプレート上に位置するＥＣＳポート（４）を使用してＥＣＳから除去することができる。
【００４４】
接種に続いて、ＥＣＳポート（３、４）を両方の末端で密封し、細胞培養空間をＥＣＳ中に効果的に収容する。例として（図２、３及び４）、栄養溶液は、第一メンブラン層のＩＣＳまたは装置（Ａ）を通過し、メンブラン層ＩＣＳ入口（２１）に入り、入口流体分配チャンバー（入口貯蔵部） 、メンブラン層中にある全毛細管のルーメン、出口（１４）にある流体分配チャンバー（出口貯蔵部） を満たし、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２２）を通って外に出る。操作中、このメンブラン層のＩＣＳ出口（２２）は閉鎖され、媒体供給はデッド−エンド様式で操作される。新しい栄養溶液は、この第一メンブラン層中にある全毛細管のＩＣＳから濾過され（ａ）、メンブラン壁を横切り、バイオリアクターＥＣＳ中に入り、そこで新しい栄養が細胞により代謝される。加圧下で、使用済み媒体／浸透物は、毛細管壁を通して濾過することにより、ＥＣＳから排出され、第二メンブラン層のＩＣＳに入り、第二メンブラン層のＩＣＳ出口（２８）を通ってメンブラン層ＩＣＳの外に出る。使用済み媒体／浸透物は、浸透物採集容器中に集められる。このようにして、新しい栄養は固定された細胞／バイオフィルムに連続的に供給され、細胞成長に悪影響を及ぼすことがある代謝廃物は、細胞培養空間から連続的に除去される。さらに、問題とする生成物の分子特性及び第二メンブラン層中にある毛細管メンブランの物理的特性に応じて、分泌される生成物は、連続的に製造され、浸透物と共にバイオリアクターから除去され、それによって、バイオマスを維持し、毒性代謝生成物、生成物形成の負のフィードバック制御及び／または敏感な生成物の酵素分解による細胞成長阻害を防止する。
【００４５】
連続的操作下では、細胞培養プロセスは、追加の栄養、例えば高密度細胞成長のための溶解酸素（ＤＯ）増加、を必要とすることがある。第二メンブラン層のルーメンは、通気することができ、その際、加湿空気が、第二メンブラン層のＩＣＳ入口（２７）に供給され、入口における流体分配チャンバー（入口貯蔵部）に入り、メンブラン層中の全毛細管のＩＣＳを通って流れ、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）に入り、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２８）から、浸透物と共に排出される。溶解した酸素は、ＩＣＳから拡散し、メンブラン壁を横切ってＥＣＳに向かい（ｂ）、そこで固定された細胞／バイオフィルムにより代謝される。酸素供給速度は、ＤＯプローブを使用する統合されたプロセス制御により、例えば加湿空気流中のＯ２レベルを調整することにより、制御することができる。
【００４６】
第三メンブラン層（Ｃ）を使用し、酸性または塩基性溶液、二酸化炭素（ＣＯ２）または重炭酸塩を調整しながら供給することにより、細胞培養流体のｐＨを制御することができる。これらの溶質または溶解した代謝生成物は、第三メンブラン層のＩＣＳ入口（２３）で、ＩＣＳ入口における流体分配チャンバー（入口貯蔵部）中に供給し、メンブラン層中の全毛細管のルーメンを通して、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）に入り、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２４）から外に出ることができる。緩衝化合物を、ＩＣＳからＥＣＳに、メンブラン壁（ｃ）を通して供給することができる。メンブランを横切り、ＩＣＳからＥＣＳ中の細胞培養流体中への緩衝化合物の供給速度は、ｐＨプローブを使用する統合されたプロセス制御、例えばメンブラン壁を横切るＥＣＳ中への流体供給を調整するための統合された圧力制御により、制御することができる。
【００４７】
第四メンブラン層を使用し、特定の成長調整因子または他の細胞代謝及び／または問題とする化合物の製造に影響を及ぼす化合物（Ｄ）を供給することができる。これらの化合物は、高価であるか、または敏感である。そのような化合物は、加圧下で、第四メンブラン層のＩＣＳ入口（２５）を通して細胞培養空間中に供給し、入口流体分配チャンバー（入口貯蔵部）中に入り、第四メンブラン層中の毛細管のルーメンを通して、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）中に入り、同じメンブラン系のＩＣＳ出口（２６）を通って外に出ることができる。メンブラン壁を横切ってＩＣＳからＥＣＳ中の細胞培養流体中に入る特定代謝生成物（ｄ）の供給速度は、プロセスに特異的な統合された制御戦略、例えばメンブラン壁を横切ってＥＣＳ中に入る流体供給を調整するための統合された圧力制御、を使用して制御することができる。
【００４８】
メンブラン系（層）の数、細胞培養空間に供給される材料の組成及び順序は、異なってもよいが、改良された物質移動、独立した流体供給、及び統合されたプロセス制御の原理は同じであることに注意すべきである。異なったメンブラン系のＩＣＳからＥＣＳ中に供給される全ての化合物は、ＥＣＳ内及び固定された細胞層／バイオフィルムを通して、対流流動により移動する。これらの材料は、固定された細胞層／バイオフィルムを通過する時、細胞により代謝され、バイオフィルムを横切って確立される自己−調整勾配が形成される。これらの勾配の性質は、統合されたプロセスにより十分に制御され、一貫した処理条件を与え、連続処理における代謝に関連する形態学的分化及び成長段階の調整に使用することができ、その規模は、使用するメンブラン挿入物の数及びサイズによって決定される。
【実施例】
【００４９】
＜単一のカセットを有する規模を調整できる細胞培養バイオリアクターのＥＣＳ中に固定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養＞
ＣＨＯ細胞は、毒性スクリーニング、栄養及び遺伝子発現を包含する、生物学及び医学研究に日常的に使用されている。ＣＨＯ細胞は、組換え体タンパク質治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の製造に最も一般的に使用される哺乳動物宿主である。
【００５０】
ＣＨＯ−Ｋ１は、アンカレッジ依存細胞系統であり、好適な細胞培養表面上で単層として典型的に成長し、我々の実験室で日常的に、細胞培養フラスコ中で細胞密度約１×１０５細胞／ｃｍ２表面積に成長する。
【００５１】
系統及び培養条件
密着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、日常的に、Ｔ−７５フラスコ中、２ｍＭグルタミンを含む３０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足、を使用して培養した。細胞は、３〜４日毎に継代接種（ｐａｓｓａｇｅ）した。８０ｍｌ成長媒体を含むＴ−１５０フラスコを株膨脹に使用した。培養は全てＣＯ２培養器中３７℃で行った。
【００５２】
接種用に、細胞を１５〜２０ｍｌの成長媒体中に分散させた。この例では、約２．５×１０７細胞を接種物として使用した。
【００５３】
リアクター設定
ヘッドプレートで固定した単一カセットを含んでなる使い捨てバイオリアクターモジュールをＣＨＯ−Ｋ１培養に使用した。このバイオリアクター設計により、密着性細胞成長用に総毛細管表面積５１９ｃｍ２、作業容積（ＥＣＳ容積）１１９ｃｍ３が得られた。バイオリアクター及び補助設定を図５に示し、ＥＣＳ中のプロセス条件を監視するための、ヘッドプレートの一つに組み込んだｐＨ及び溶解酸素プローブを含む。この例では、カセット中にある４個のセラミックメンブラン層のそれぞれは、同じ化学組成のメンブランを含むが、操作中に各面が以下に記載するような異なった機能を果たすように、細孔径が異なっている。
【００５４】
層１：１４００ｎｍセラミック毛細管−使用済み栄養がルーメンを通して除去される、通気
層２：４０ｎｍセラミック毛細管−１００％酸素がルーメンを通して供給される
層３：１４００ｎｍセラミック毛細管−栄養溶液がルーメンを通して供給される
層４：４０ｎｍセラミック毛細管−１００％酸素がルーメンを通して供給される
【００５５】
成長媒体を、５％二酸化炭素／圧縮空気を使用し、栄養が、媒体供給容器から層３中にある全メンブランのルーメン（ＩＣＳ）を通して流れるように、空気圧により供給した。操作の前に、媒体を、媒体供給容器から、層３のＩＣＳを通して、プライム採集容器中に供給することにより、網目及びメンブランルーメンから空気を排除した。操作の際、層３のＩＣＳ出口をクランプ閉鎖し、媒体供給をデッド−エンド様式で操作し、栄養をＩＣＳから毛細管メンブラン壁を通してＥＣＳまたは細胞成長小室中に押し込んだ。使用済み媒体は、ＥＣＳから排出し、メンブラン層１を通して除去した。
【００５６】
同様に、１００％酸素を、層２及び４に配置された毛細管メンブランのＩＣＳを通して供給する。酸素は、細胞成長小室中の細胞成長に必要な酸素吸収に応じて、媒体供給の圧力以上の圧力で供給した。無気泡酸素供給は、主として拡散により行い、ＩＣＳ表面を横切るガス流により促進する。背圧は、特定の流量を維持することにも使用される流量制御バルブにより維持する。
【００５７】
最後の層は、二重の機能を有し、第一に、圧縮空気は、加湿容器から層１のＩＣＳを通り、採集容器中に流れてから、流量制御バルブを通して放出される。流量制御バルブは、空気流を特定の流量に維持し、さらに操作に必要な背圧を与え、第二に、操作中に、使用済み媒体をＥＣＳから除去し、毛細管壁を横切り、媒体供給速度と等しい速度で、層１のＩＣＳ中に送る。層１中にあるメンブランのルーメンに入る浸透物は、この層を通る空気流と共に、採集容器中に排出される。浸透物は、採集容器から、試料採取ポートを経由して試料採取または除去される。
【００５８】
滅菌
網目及び滅菌コネクタを備えた使い捨てバイオリアクターモジュールは、ガンマ線照射した。それぞれ網目及び滅菌コネクタを備えた媒体供給容器、プライム容器、加湿容器、浸透物採集容器及び接種容器は、個別にオートクレーブ処理し、ガンマ線照射したバイオリアクターモジュールに無菌状態で接続してから、接種を行った。
【００５９】
接種
接種の前に、無菌バイオリアクター装置及び成長媒体を３７℃で予備温置した。成長媒体を供給し、５％二酸化炭素／空気でｐＨ７．２に平衡化した。
【００６０】
２．５×１０７のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、バイオリアクターＥＣＳ中に直接接種した。細胞は、ＥＣＳに、２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足、を供給することにより、毛細管メンブランの外側表面上に固定した。操作の前に、接種容器からＥＣＳ中への媒体流を、加圧下で、メンブラン壁を横切り、毛細管ルーメン（ＩＣＳ）中に向け、プライム容器に入れてから、媒体供給容器中に再循環させた。
【００６１】
操作
細胞は、２ｍＭグルタミンを含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足し、５％二酸化炭素／空気でｐＨ７．２に平衡化したＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体を使用し、３７℃で培養した。
【００６２】
接種に続いて、バイオリアクターを、メンブラン層１のＩＣＳを通る一定空気流及び圧力（４０ｋＰａ）で、及びメンブラン層２及び４を通る一定の１００％酸素流及び圧力（５０〜７０ｋＰａ）で操作した。細胞成長及び生存率を高めるために、酸素圧を間欠的に調節し、酸素供給を増加させ、ＥＣＳ中のＤＯ濃度（１０〜３０％）を維持した。これらのメンブラン層中に使用済み媒体が流れ込まないように、酸素圧は、媒体供給容器に加えられる圧力より決して低くならないようにした。
【００６３】
ＣＨＯ細胞が成長するにつれて、細胞代謝により生成する廃物のために、ＥＣＳ（細胞成長環境）中の栄養が減少し、媒体ｐＨが変化する。新しい媒体がメンブラン層３のＩＣＳからＥＣＳに供給されるので、使用済み媒体はＥＣＳから除去され、メンブラン層１のＩＣＳ中に排出される。さらに使用済み媒体は、メンブラン層１のＩＣＳから排出され、メンブラン層１のＩＣＳを通って流れる空気と共に、採集容器中に移動する。新しい媒体がＥＣＳに供給され、使用済み媒体がＥＣＳから除去される速度は、媒体供給容器に作用する空気圧（＞４０ ｋＰａ）と、メンブラン層１のＩＣＳに作用する一定圧（＝４０ｋＰａ）との間の差圧により調整される。流量は、成長している細胞による栄養要求を超えるように調節される（１〜１０ｍｌ／ｈｒ）。
【００６４】
操作中、ＥＣＳ中のｐＨを監視し、間隔を置いて、及び媒体供給速度が細胞成長環境を緩衝できない時に、少量の重炭酸塩を媒体に供給し、高細胞密度における廃物蓄積増加を相殺した。このようにして、ＥＣＳのｐＨを、ｐＨ６．８を超えるように維持した。
【００６５】
バイオリアクター操作は、連続的であり、細胞は、１１日間維持してから、メンブランモジュールを解体し、トリパンブルーを使用してＣＨＯ−Ｋ１を計数した。使用済み媒体を毎日採集容器から試料採取し、器示唆分析を行った。
【００６６】
結果及び考察
ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養は１１日間連続的に操作した。図６から、基質分析により、培養中の全ての時点で栄養供給が要求を超えていることが分かる。接種に続いて、細胞によるグルコース吸収速度は低く、１〜２日間の成長遅延を示している。２日目に続いて、グルコース吸収は、０．１ｍｇ／ｈｒから、４日目の最大１２ｍｇ／ｈｒに増加し、その後、グルコース吸収速度は、平らになり、培養の残りの期間、約８ｍｇ／ｈｒで安定した。最大細胞収率は４日目に得られたことが分かる。
【００６７】
ラクテート生産は、グルコース吸収と類似の傾向を示し、細胞によりラクテートに代謝されたグルコースのレベルは、９日目までは吸収速度を下回っており、この時点で細胞は、ｐＨ ６．８より下に低下した低媒体ｐＨによるストレスを受けている。細胞代謝が最早最適ではないことが明らかになった時、成長実験を停止し、総細胞収率を測定した。
【００６８】
総細胞収率１．５×１０８細胞が得られた。これらの中で、１．５×１０７細胞は、ＥＣＳ中にゆるく密着しているか、または分散しており、１．３×１０８細胞をトリプシン処理後に収穫した。
【００６９】
この実験で、密着性細胞密度２．５×１０５細胞／ｃｍ２が得られたが、これは、Ｓｙｚｍａｎｓｋｉら（２００８）により報告されているＴ１７５フラスコ（１．７×１０５細胞／ｃｍ２）及びＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（２．２×１０５細胞／ｃｍ２）に対する最大ＣＨＯ細胞密度収穫と十分に匹敵する。
【００７０】
参考文献
１．Ｓｙｚｍａｎｓｋｉ，Ｓ．Ｌ，Ｈｕｆｆ，Ｋ．Ｗ，Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｄ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｒ．Ｆｅａｓｂｙ，Ｊ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．Ｖ．，Ｄｅｎｉｓｅ Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｋ．，Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．及びＲｕｓｈ，Ａ．（２００８）新規な高収率、高性能組織培養フラスコの自動化用途（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ，ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ）。ＪＡＬＡ ｖｏｌ．１３（３）：１３６−１４４。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、規模を調整できる毛細管（中空繊維）メンブランバイオリアクターに、及びそのバイオリアクターを使用して細胞及び／または微生物を培養及び維持し、高い処理融通性で、これらの細胞の代謝を利用し、生物学的生成物を製造または生物変換する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
毛細管メンブラン、または中空繊維リアクター（ＨＦＲｓ）は、上流及び下流濾過及び精製処理に、廃水処理における微生物または酵素を固定したバイオリアクターとして、及び細胞または組織培養装置として広範囲に使用されている。
【０００３】
ほとんどの細胞培養ＨＦＲ設計は、軸方向流を使用し、そこでは、個別の流体流が、メンブランの両側で、メンブラン表面を横切って流れる（Ｃｈｒｅｓａｎｄら１９８７）。これらのモジュールのスケール−アップは、円筒形マニホールド中に含まれる中空繊維束の中にあるメンブランの数を増加し、活性メンブラン表面積を増加することにより、行われる。材料または栄養交換は、一方の流体流から他方への拡散により、メンブラン表面を横切って行われる。これによって、繊維束を横切って軸方向及び半径方向の栄養勾配が生じるが、これは、細胞成長、バイオプロセス安定性及び生産性に悪影響を及ぼす不均質性をもたらすと理解されている。これらの不均質性は、ＨＦＲのサイズが増加するにつれて、増幅される。
【０００４】
細胞培養ＨＦＲにおける交差（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）（接線）及びデッド−エンド（貫流）濾過は、２つの個別流体流間の材料交換を改良するために使用されているが、そこでは材料が、拡散ではなく、対流により、メンブラン表面を横切って搬送される。これらの２流体供給手段は、灌流（米国特許第４，８０４，６２８号）及び固定（国際公開ＷＯ２００７／００４１７０Ａ２）細胞培養装置にそれぞれ使用されている。それぞれの場合、細胞への栄養供給及び代謝廃物及び／または問題とする生物学的生成物の細胞培養空間からの除去が強化されることが観察されている。それにも関わらず、中空繊維束の中における軸方向勾配及び不均質性は依然として観察されており、ＨＦＲ設計の規模を制限している。
【０００５】
横方向流モジュールは、本来、濾過、透過気化法（ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）及び廃水処理方法のために開発され、軸方向勾配及び不均質性を制限し、メンブラン表面に沿って良く限定された流体力学的供給及び浸透流を可能し、それによって、濃度偏向を制御し、メンブランを横切る濃度ベース駆動液体を最適化する（Ｆｕｔｓｅｌａａｒ，１９９３）。これらのモジュールでは、毛細管メンブランが供給流に対して直角に配置される。規則的な配置により、流れの誤分配が防止されたが、横方向配置が物質移動係数を大きく増加させた（Ｆｕｔｓｅｌａａｒ， １９９３）。この一様な、メンブランの２−Ｄ分配により、規模調整の可能性が改良され、幾つかの設計が開示されている（Ｚｈａｎｇら２００３，Ｓｍａｒｔら１９９８， Ｖｌａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ １９９９）。いずれの場合も、メンブランを通る流体経路は固定されており、全てのメンブランが同じ方向に向いており、単一の流体入口及び出口通路中にマニホールド形成されている（図１Ａ〜Ｃ）。
【０００６】
米国特許第５，５１６，６９１号は、修正された横方向流モジュールを記載しているが、そこでは、メンブランが、細胞を培養及び維持し、それらの代謝（代謝生成物）を利用するための細胞培養装置として使用される３−Ｄ配置に（図１Ｄ）配分されている。このバイオリアクター設計は、交差流及び／またはデッド−エンド（貫流）濾過による改良された物質移動、及び繊維の３−Ｄ網目による改良された基質及び代謝物交換の原理を包含し、それによって、細胞培養空間全体にわたって一貫した流体供給を確保し、代謝及び細胞生存率を改良している。この３−Ｄ配置により、少なくとも３個の独立した、それぞれ複数のメンブランから構成されるメンブラン系も得られる。第一メンブラン系は媒体流入に、第二はＯ２の供給またはＣＯ２の除去に、第三は媒体流出に使用される。メンブラン系同士の間の内側空間及び外側マニホールドは、細胞培養空間として使用される。この設計は、多次元的繊維配置の細胞培養への最初の応用であり、組織培養を、合成器官または肝臓支援装置として概念化しているが、規模調整の可能性は考慮されていない。さらに、同じ方向に向けられた各面層は、単一の流体入口及び出口通路中にマニホールド形成されている（図１Ｄ）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第一態様により、
・少なくとも一個の、マニホールド及び中空繊維メンブラン配置を含んでなるカセット、
・上側ヘッドプレート、及び
・下側ヘッドプレート
を含んでなる規模を調整できるバイオリアクターであって、
該カセットが、相互に、及び該ヘッドプレートと連携し、内部の毛細管外（ｅｘｔｒａｃａｐｉｌｌａｒｙ）培養空間（ＥＣＳ）を限定するように構築されたモジュール式構成部品であり、該中空繊維メンブラン配置が個別の入口及び出口を包含する、バイオリアクターが提供される。
【０００８】
好ましくは、入口及び出口は、中空繊維メンブランを経由して流体連絡している。カセットは、好ましくは（各）マニホールドと流体連絡して配置された入口及び出口貯蔵部を含んでなる。マニホールドは、好ましくはメンブランの各末端に配置され、各貯蔵部は、それぞれの入口及び出口と流体連絡している。
【０００９】
各カセットは、好ましくは貯蔵部と流体連絡している個別の入口及び出口だけを包含する、すなわち、カセットを通したＥＣＳとの流体連絡は無い。
【００１０】
中空繊維メンブランは、実質的に平行なメンブランの列に配置することができる。各カセットは、好ましくはそのような列の一つ以上を包含する。
【００１１】
各カセットが２つ以上のそのような層（列）を包含する場合、中空繊維メンブランの各層は、好ましくは水平または垂直の向きで、その上及び／または下にある層に対して直角に配置される。より好ましくは、中空繊維メンブランの各層は、その上及び／または下にあるメンブラン層に対してずれている。
【００１２】
好ましくは、バイオリアクターは、２個以上のカセットを含んでなる。各カセットは、官能性毎に一つの中空繊維メンブラン層（列）を包含することができる。
【００１３】
ヘッドプレートは、流体が、ＥＣＳ中に導入される、ＥＣＳから排出される、及び／またはＥＣＳを通して自由に流動するように、好ましくはＥＣＳ中への開口部（ポート）を包含する。ヘッドプレートは、ＥＣＳ中にある流体の組成を監視及び／または制御できるように、ＥＣＳ小室中にプローブまたはセンサーを挿入できるようにする少なくとも一個の部品またはポートを包含する。各開口部（ポート）は、閉鎖できるのが好ましい。好ましくは、そのようなＥＣＳと流体連絡するポートは、カセット中ではなく、ヘッドプレート上／中にのみ配置する。
【００１４】
本発明の第二態様により、中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールドを含んでなるカセットであって、該カセットが、中空繊維メンブランの各配置に対して個別の入口及び出口をさらに含んでなり、該カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携し、内部ＥＣＳを限定するように構築される、カセットが提供される。
【００１５】
本発明の第三態様により、バイオリアクター用の、
・中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールド、及び
・上側及び下側ヘッドプレート
を含んでなるキットが提供される。
【００１６】
好ましくは、キットは、マニホールドを受け入れるか、または包含するように構築されたカセットを包含し、カセットは、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携するように構築されている。キットは、所望によりマニホールド中に取り付けた、少なくとも一個の中空繊維メンブランも包含することができる。
【００１７】
中空繊維メンブランは、好ましくは軸方向に引き伸ばした、飲料ストローのような形状の中空チューブである。中空繊維メンブランは、好ましくは選択的に透過性であり、セラミックメンブランでもよい。
【００１８】
マニホールドは、中空繊維メンブランを受け入れるように構築された２個（またはそれ以上）の対向するマニホールドを含んでなるフレーム中に収容することができ、マニホールドを互いに接合し、フレームを形成する。各マニホールドは、中空繊維メンブランを受け入れるように構築された開口部を包含することができる。各カセットは、好ましくはマニホールド（開口部）と流体連絡する（入口または出口の）貯蔵部及びやはり貯蔵部と流体連絡する入口または出口を包含する。
【００１９】
貯蔵部は、フレームと末端プレートの連携により形成することができる。
【００２０】
カセット、フレーム、マニホールド、末端プレート及びヘッドプレートは、ステンレス鋼またはいずれかの好適な形態の重合体／プラスチックから構築することができる。
【００２１】
本明細書では、バイオリアクターの各構成部品、例えばカセット、マニホールド、フレーム及び／または中空繊維メンブラン、の説明は、本発明の全ての態様に適用される。
【００２２】
本発明の第四態様により、細胞及び／または微生物の代謝を利用するための、本発明のバイオリアクターを使用する工程を包含する方法が提供される。
【００２３】
この方法は、上記のバイオリアクターのＥＣＳ中に細胞及び／または微生物を接種することを包含する。好ましくは、細胞及び／または微生物を中空繊維メンブランの外側表面上に固定する、及び／または細胞及び／または微生物をＥＣＳ中に分散させる。無論、ＥＣＳは、ガス及び／または液体を含むことができる。
【００２４】
細胞は、哺乳動物及び昆虫細胞系統から選択することができ、微生物は、細菌、酵母及び菌類から選択することができる。哺乳動物及び昆虫細胞系統は好ましくはアンカレッジ依存型であり、微生物は好ましくは非糸状であるが、これらに限定するものではない。
【００２５】
アンカレッジ依存細胞系統は、典型的には、二倍体細胞株、例えばヒト初期肺（ｅｍｂｒｏｙｏｎｉｃ ｌｙｎｇ）、ヒト包皮、ヒト初期腎臓、ニワトリ、ウサギ、マウス及びラット線維芽細胞、チンパンジー肝臓線維芽細胞、ラット神経膠細胞、ネコ肺線維芽細胞及び二次サル腎臓細胞、一次細胞、例えばサル、イヌ及びウサギ腎臓細胞、マウスマクロファージ、ラット膵臓細胞、ラット肝臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ラット下垂体細胞及び羊水細胞、株及び転換細胞系統、例えばマウス線維芽細胞、正常ラット腎臓、チャイニーズハムスター卵巣及び肺、べービーハムスター腎臓、チンパンジー胚肺、アフリカングリーンモンキー腎臓、マウスＬ細胞、ＨｅＬａ、マウスマクロファージ細胞系統、転換イヌ腎臓、肉腫ウイルス転換ラット腎臓及びマウス線維芽細胞、ヒト膠腫、ヒト骨肉腫、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ犬腎臓、ＫＢ細胞、アカゲザル腎臓、ＭｃＣｏｙ細胞、ヒト甲状腺癌、ヒト某状体癌（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、ラット筋肉由来の線維芽細胞、およびラビット角膜細胞から選択される。
【００２６】
微生物は、典型的には正常なまたは形質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｃ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ｓｐｐ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから選択される。
【００２７】
本方法は、標準的な交差流操作による、またはデッド−エンド操作による中空繊維メンブランの配置の入口装置を通る流体流を包含することができる。
【００２８】
本方法は、中空繊維メンブランを通る流体供給を調整するための制御手段を包含することができる。好ましくは、制御手段は、圧力制御手段でよい特殊な統合された制御手段である。
【００２９】
本方法は、好ましくは、栄養、ガス、例えば酸素及び二酸化炭素、緩衝剤（酸性または塩基性溶液）、ホルモン、成長調整または代謝改良化合物、使用済み媒体、代謝廃物、重要な生成物、及び熱交換材料を包含する物質の供給及び／または除去を包含する。これらの物質は、細胞及び／または微生物に、カセットの入口または出口装置を経由して（すなわち、中空繊維メンブランを通して）及び／または上側及び下側ヘッドプレート中の開口部（ポート）を通して供給することができる。
【００３０】
本方法は、ＥＣＳを通る流体流を包含することができ、流体流は、さらに再循環させるか、またはデッド−エンド方式によるものでよい。無論、ＥＣＳを通る流体流は、好ましくは下側ヘッドプレートから上側ヘッドプレートへ、またはその逆に行われる横方向流により行う。
【００３１】
下記の文献を、ここに参考として含める。
１．Ｃｈｒｅｓａｎｄ Ｊ．Ｊ．， Ｇｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｊ．及びＤａｌｅ Ｂ．Ｅ． （１９８７）中空繊維バイオリアクターにおける繊維空間の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｆｉｂｒｅ ｓｐａｃｉｎｇ ｉｎ ａ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）。Ｂｉｏｅｎｇ． ３２：９８３−９８２。
２．Ｃｒａｃａｕｅｒ， Ｒ．Ｆ．， Ｗａｌｋｅｒ Ｒ．Ｄ．及びＧｒｕｅｎｂｅｒｇ Ｍ． （１９９６）中空繊維細胞培養装置及び操作方法（Ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。米国特許第４，８０４，６２８号。
３．Ｆｒａｓｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｗ．及びＬｅｕｋｅｓ， Ｗ．Ｄ．（２００７）二次代謝物及び組換え体タンパク質の製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｓｙｎｅｘａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （ＰＴＹ．） ＬＴＤ。ＷＯ２００７／００４１７０Ａ２。
４．Ｆｕｔｓｅｌａａｒ Ｈ．（１９９３）横方向流モジュール構築、性能及び用途（Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ−ｆｌｏｗ ｍｏｄｕｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）。ＰＨＤ Ｔｈｅｓｉｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｅｎｔｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
５．Ｇｅｒｌａｃｈ Ｊ．（１９９６） 培養及び代謝を使用するための、及び／または微生物を維持するためのモジュール（Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ ａｎｄ／ｏｒ ｆｏｒ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）。米国特許第５，５１６，６９１号。
６．Ｓｍａｒｔ Ｊ．，Ｓｔａｒｏｖ Ｖ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｃｋｅｒ Ｒ．Ｃ．及びＬｌｏｙｄ Ｄ．Ｒ．（１９９８） 管状横方向流モジュールを使用する、水系からの揮発性有機化合物の透過気化法抽出（Ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｔｕｂｕｌａｒ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｆｌｏｗ ｍｏｄｕｌｅ）。Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｓｃｉ １４３：１５−１７９。
７．Ｖｌａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ Ｇ．Ｔ．及びＭｉｔｒｏｖｉｃ Ｍ．Ｖ．（１９９９）フレーム要素を含む３相中空繊維メンブラン接触装置における圧力低下及び水抵抗Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｒｏｐｓ ａｎｄ ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａ ｔｈｒｅｅ−ｐｈａｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｆｒａｍｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）。Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ４０：３−１１。
８．Ｚｈａｎｇ Ｓ．，ｖａｎ Ｈｏｕｔｅｎ Ｒ．，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ Ｄ．Ｈ．，Ｄｏｄｄｅｍａ Ｈ．，Ｊｉａｎｇ Ｚ．，Ｆａｎ Ｙ．及びＷａｎｇ Ｊ．（２００３）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ １８５−１９２。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】各種の先行技術による配置を示す。
【図２】本発明による完全な可能なバイオリアクター全体の（Ａ）断面図、（Ｂ）上または底面図及び（Ｃ、Ｄ）透視図を示す。
【図３】本発明の規模を調整できるバイオリアクターの分解組立図を示す。
【図４】処理例の概略を示す。
【図５】例１で使用するバイオリアクター配置を示す。
【図６】例１に関するＣＨＯ−Ｋ１プロセスデータを示す。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
下記の本発明を制限しない図面を参照しながら、本発明を、例としてのみ、より詳細に説明する。
【００３４】
現在の設計では、モジュールスケール−アップ及びプロセス融通性の原理を、毛細管メンブランの２−Ｄ及び３−Ｄ網目に取り入れる。規模を調整できるメンブランバイオリアクター装置（図２及び３）は、２個のヘッドプレート（１）及び２個のヘッドプレート間に固定された少なくとも一個のカセット（５）から構成され、効果的に毛細管外空間（ＥＣＳ）を限定し、中空繊維メンブラン中の毛細管内空間（ＩＣＳ）から分離する。図２は、完全な細胞培養モジュールを例示し、例えば７個の個別カセット（５）を固定している２個のヘッドプレート（１）を示す。上側及び／または下側ヘッドプレートは、操作中にモジュール内の状態を観察できる中央の透明な観察パネル（２）を包含する。各ヘッドプレートは、ＥＣＳに対する入口／出口として作用する少なくとも一個のＥＣＳポート（３、４）及びＥＣＳ小室中にプローブまたはセンサーを挿入できるようにする少なくとも一個の部品またはポート、例えばｐＨ（２９）またはＤＯプローブ（３０）用の部品、も包含することができる。各カセット（５）は、Ｏ−リング、ガスケットまたは他の手段（８）を使用し、隣接するカセット（５）及び／またはヘッドプレート（１）に対して密封される。カセット及びヘッドプレートシールは、例えば積み重ねた装置の四隅に配置された４個のロッドまたはピン（６）により、一つに圧迫され、所定の位置に固定される。より大型のバイオリアクターは、圧迫し易くするために追加のピンを必要とする場合がある。
【００３５】
各カセット（図３）は、挿入フレーム（７）を含んでなり、その中に、少なくとも４層の毛細管メンブラン（９）が、樹脂、エポキシまたは他の手段を使用して固定される。好ましい実施態様では、毛細管メンブランは、フレームに剛性、及び重合体メンブランでしばしば観察される構造的歪みに対する耐性を与えるセラミックである。しかし、この設計は、特定寸法、化学的特性または技術的特性の毛細管のどれにも限定されないことに注意すべきである。好ましい実施態様では、各層は、類似した種類のメンブランから構成されるが、異なった層は、製造材料、細孔径及び分布、被覆、選択性、及び／または伝導性を包含する、但し、これらに限定するものではない、異なった化学的または技術的特性を有するメンブランを含んでなることもできる。
【００３６】
２−Ｄメンブラン列（９）により、リアクター中の全ての位置で、メンブランを通して材料が確実に一様に供給及び除去され、それによって、バイオリアクター中における軸方向の勾配及び不均質性が最少に抑えられる。モジュールを加圧下で操作することにより、細胞培養流体中に溶解している栄養及びガスの濃度を高くすることができる。あるメンブラン系（層または列）からＥＣＳ（細胞培養空間）中への、及び第二メンブラン系から出る栄養のデッド−エンド流は、メンブラン表面上に細胞を濃縮及び固定するのに役立ち、確実に物質移動を改良し、バイオフィルム中に固定された全ての細胞に栄養を供給することができる。細胞濃度およびバイオフィルム形成は、細胞−細胞連絡、細胞生存率及び生産性の強化に相関している。
【００３７】
各連続メンブラン層は、マニホールド中の開口部（１０、１１、１２、１３）の列の中に受け入れられ、各層は、その上及び下のメンブラン層に対して直角の方向に向けられている。さらに、同じ方向に向けられた各連続メンブラン層は、上から見た時に、メンブランがジグザグになり、連続的な二軸メンブラン網目（９）を形成するようにずらし、ＥＣＳ中における通路形成を通した流体の誤配分及び重力により支援される細胞の沈降を制限することができる。
【００３８】
各メンブラン層は、フレーム（７）上に包含される流体分配マニホールドにより、他のメンブラン層から効果的に小室に分けられている。メンブラン層中にある各毛細管メンブランの開いた末端は、別の流体分配チャンバー（貯蔵部）（１４、１５）中に開いており、それらのチャンバーにより取り囲まれている。単一カセット（５）中にある異なったメンブラン層及び流体分配チャンバー（１４、１５）は、Ｏ−リング、ガスケットまたは他の手段（１９）により相互に密封されている。４個の個別末端プレート（１８）のそれぞれは、フレーム（７）に対して整列し、密封され、少なくとも２個のネジまたはピン（２０）により所定の位置に固定され、流体分配チャンバー（貯蔵部）を限定する。各メンブラン層は、各対向する流体分配チャンバー中に、ＩＣＳ入口（２１、２３、２５、２７）及びＩＣＳ出口（２２、２４、２６、２８）を有し、それによって、個別の含まれる流体を、各メンブラン層を通して流すことができる。
【００３９】
好ましい実施態様では、少なくとも一個のメンブラン層を使用して栄養溶液をＥＣＳ中の細胞に供給し、少なくとも一層を使用し、問題とする生成物及び／または代謝廃物を含む使用済み媒体を除去する。他の層は、
・ガス透過性メンブランを使用して培養空間に酸素を供給するために、
・ＣＯ２濃度を調整する、酸性または塩基性溶液を導入する、あるいは選択的に透過性のメンブランを使用し、培養空間から有機酸を補集することにより、培養空間の緩衝を行うために、
・プロセス安定性を高め、制御するために、特定の栄養供給剤、成長段階抑制剤、または誘発剤分子を包含する、但し、これらに限定するものではない、成長調整または代謝改良化合物を調整しながら供給するために、または
・リアクターを一定温度に維持するための熱交手段として、
使用することができる。
【００４０】
細胞培養空間は、ヘッドプレート上に配置された入口または出口を通して栄養溶液で流す、掃除する、または再循環させることができる。
【００４１】
このモジュールアセンブリーにより、同じ設計から規模を増大させる融通性が得られ、少なくとも一個のメンブラン挿入物を含んでなるバイオリアクターでプロセスを最適化した後、必要に応じて追加のメンブラン挿入物を積み重ね、効果的にメンブラン表面積及びリアクター容積を直線的に増加させることができる。特定のプロセスで、異なったメンブラン挿入物から来るメンブラン層を一つにマニホールド化し、モジュール内の全てのメンブラン挿入物への／からの流体供給及び／または除去を一様に分配し易くすることができる。
【００４２】
好ましい実施態様では、バイオリアクター装置を垂直に向け、メンブラン網目を水平に向ける（図２、断面Ａ−Ａ）。この場合、底部ヘッドプレート（１）上に位置するＥＣＳポート（４）は、細胞接種物及び／または流体をＥＣＳ中に導入するように作用し、空気または使用済み媒体を、最上部ヘッドプレート上に位置するＥＣＳポート（３）を通して排出する。このように、ＥＣＳ全体を流体で満たし、エア−ロツクを防止することができる。これは、ｐＨ（２９）またはＤＯプローブ（３０）を包含するが、これらに限定しない、ＥＣＳ中の処理状態を監視するのに使用する全てのプローブを効果的に操作するのに不可欠である。メンブラン網目に対して横方向の流体流は、標準的な交差流操作条件（図１参照、先行技術）を使用し、ＥＣＳを通して再循環させるか、またはＥＣＳ出口（３）を閉じ、流体流をデッド−エンド様式で操作することができる。どちらかの流動様式を使用し、カセット（５）内にあるメンブラン層中に含まれる少なくとも一個の中空繊維の外側表面上に細胞を固定することができる。これは、液体を、選択的透過性の毛細管メンブラン（９）の壁を通してＩＣＳ中に強制的に浸透させ、接種物はＥＣＳ側のメンブラン表面に保持されたまま、少なくとも一個のＩＣＳ出口ポート（２２、２４、２６、２８）を通して外に出るように、ＥＣＳ中の流体に圧力を作用させることにより、容易に行うことができる。
【００４３】
長期間の操作中、ＥＣＳ中に蓄積し、重力の影響下で沈降することがある細胞の屑または材料は、底部ヘッドプレート上に位置するＥＣＳポート（４）を使用してＥＣＳから除去することができる。
【００４４】
接種に続いて、ＥＣＳポート（３、４）を両方の末端で密封し、細胞培養空間をＥＣＳ中に効果的に収容する。例として（図２、３及び４）、栄養溶液は、第一メンブラン層のＩＣＳまたは装置（Ａ）を通過し、メンブラン層ＩＣＳ入口（２１）に入り、入口流体分配チャンバー（入口貯蔵部） 、メンブラン層中にある全毛細管のルーメン、出口（１４）にある流体分配チャンバー（出口貯蔵部） を満たし、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２２）を通って外に出る。操作中、このメンブラン層のＩＣＳ出口（２２）は閉鎖され、媒体供給はデッド−エンド様式で操作される。新しい栄養溶液は、この第一メンブラン層中にある全毛細管のＩＣＳから濾過され（ａ）、メンブラン壁を横切り、バイオリアクターＥＣＳ中に入り、そこで新しい栄養が細胞により代謝される。加圧下で、使用済み媒体／浸透物は、毛細管壁を通して濾過することにより、ＥＣＳから排出され、第二メンブラン層のＩＣＳに入り、第二メンブラン層のＩＣＳ出口（２８）を通ってメンブラン層ＩＣＳの外に出る。使用済み媒体／浸透物は、浸透物採集容器中に集められる。このようにして、新しい栄養は固定された細胞／バイオフィルムに連続的に供給され、細胞成長に悪影響を及ぼすことがある代謝廃物は、細胞培養空間から連続的に除去される。さらに、問題とする生成物の分子特性及び第二メンブラン層中にある毛細管メンブランの物理的特性に応じて、分泌される生成物は、連続的に製造され、浸透物と共にバイオリアクターから除去され、それによって、バイオマスを維持し、毒性代謝生成物、生成物形成の負のフィードバック制御及び／または敏感な生成物の酵素分解による細胞成長阻害を防止する。
【００４５】
連続的操作下では、細胞培養プロセスは、追加の栄養、例えば高密度細胞成長のための溶解酸素（ＤＯ）増加、を必要とすることがある。第二メンブラン層のルーメンは、通気することができ、その際、加湿空気が、第二メンブラン層のＩＣＳ入口（２７）に供給され、入口における流体分配チャンバー（入口貯蔵部）に入り、メンブラン層中の全毛細管のＩＣＳを通って流れ、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）に入り、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２８）から、浸透物と共に排出される。溶解した酸素は、ＩＣＳから拡散し、メンブラン壁を横切ってＥＣＳに向かい（ｂ）、そこで固定された細胞／バイオフィルムにより代謝される。酸素供給速度は、ＤＯプローブを使用する統合されたプロセス制御により、例えば加湿空気流中のＯ２レベルを調整することにより、制御することができる。
【００４６】
第三メンブラン層（Ｃ）を使用し、酸性または塩基性溶液、二酸化炭素（ＣＯ２）または重炭酸塩を調整しながら供給することにより、細胞培養流体のｐＨを制御することができる。これらの溶質または溶解した代謝生成物は、第三メンブラン層のＩＣＳ入口（２３）で、ＩＣＳ入口における流体分配チャンバー（入口貯蔵部）中に供給し、メンブラン層中の全毛細管のルーメンを通して、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）に入り、同じメンブラン層のＩＣＳ出口（２４）から外に出ることができる。緩衝化合物を、ＩＣＳからＥＣＳに、メンブラン壁（ｃ）を通して供給することができる。メンブランを横切り、ＩＣＳからＥＣＳ中の細胞培養流体中への緩衝化合物の供給速度は、ｐＨプローブを使用する統合されたプロセス制御、例えばメンブラン壁を横切るＥＣＳ中への流体供給を調整するための統合された圧力制御により、制御することができる。
【００４７】
第四メンブラン層を使用し、特定の成長調整因子または他の細胞代謝及び／または問題とする化合物の製造に影響を及ぼす化合物（Ｄ）を供給することができる。これらの化合物は、高価であるか、または敏感である。そのような化合物は、加圧下で、第四メンブラン層のＩＣＳ入口（２５）を通して細胞培養空間中に供給し、入口流体分配チャンバー（入口貯蔵部）中に入り、第四メンブラン層中の毛細管のルーメンを通して、出口における流体分配チャンバー（出口貯蔵部）中に入り、同じメンブラン系のＩＣＳ出口（２６）を通って外に出ることができる。メンブラン壁を横切ってＩＣＳからＥＣＳ中の細胞培養流体中に入る特定代謝生成物（ｄ）の供給速度は、プロセスに特異的な統合された制御戦略、例えばメンブラン壁を横切ってＥＣＳ中に入る流体供給を調整するための統合された圧力制御、を使用して制御することができる。
【００４８】
メンブラン系（層）の数、細胞培養空間に供給される材料の組成及び順序は、異なってもよいが、改良された物質移動、独立した流体供給、及び統合されたプロセス制御の原理は同じであることに注意すべきである。異なったメンブラン系のＩＣＳからＥＣＳ中に供給される全ての化合物は、ＥＣＳ内及び固定された細胞層／バイオフィルムを通して、対流流動により移動する。これらの材料は、固定された細胞層／バイオフィルムを通過する時、細胞により代謝され、バイオフィルムを横切って確立される自己−調整勾配が形成される。これらの勾配の性質は、統合されたプロセスにより十分に制御され、一貫した処理条件を与え、連続処理における代謝に関連する形態学的分化及び成長段階の調整に使用することができ、その規模は、使用するメンブラン挿入物の数及びサイズによって決定される。
【実施例】
【００４９】
＜単一のカセットを有する規模を調整できる細胞培養バイオリアクターのＥＣＳ中に固定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養＞
ＣＨＯ細胞は、毒性スクリーニング、栄養及び遺伝子発現を包含する、生物学及び医学研究に日常的に使用されている。ＣＨＯ細胞は、組換え体タンパク質治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の製造に最も一般的に使用される哺乳動物宿主である。
【００５０】
ＣＨＯ−Ｋ１は、アンカレッジ依存細胞系統であり、好適な細胞培養表面上で単層として典型的に成長し、我々の実験室で日常的に、細胞培養フラスコ中で細胞密度約１×１０５細胞／ｃｍ２表面積に成長する。
【００５１】
系統及び培養条件
密着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、日常的に、Ｔ−７５フラスコ中、２ｍＭグルタミンを含む３０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足、を使用して培養した。細胞は、３〜４日毎に継代接種（ｐａｓｓａｇｅ）した。８０ｍｌ成長媒体を含むＴ−１５０フラスコを株膨脹に使用した。培養は全てＣＯ２培養器中３７℃で行った。
【００５２】
接種用に、細胞を１５〜２０ｍｌの成長媒体中に分散させた。この例では、約２．５×１０７細胞を接種物として使用した。
【００５３】
リアクター設定
ヘッドプレートで固定した単一カセットを含んでなる使い捨てバイオリアクターモジュールをＣＨＯ−Ｋ１培養に使用した。このバイオリアクター設計により、密着性細胞成長用に総毛細管表面積５１９ｃｍ２、作業容積（ＥＣＳ容積）１１９ｃｍ３が得られた。バイオリアクター及び補助設定を図５に示し、ＥＣＳ中のプロセス条件を監視するための、ヘッドプレートの一つに組み込んだｐＨ及び溶解酸素プローブを含む。この例では、カセット中にある４個のセラミックメンブラン層のそれぞれは、同じ化学組成のメンブランを含むが、操作中に各面が以下に記載するような異なった機能を果たすように、細孔径が異なっている。
【００５４】
層１：１４００ｎｍセラミック毛細管−使用済み栄養がルーメンを通して除去される、通気
層２：４０ｎｍセラミック毛細管−１００％酸素がルーメンを通して供給される
層３：１４００ｎｍセラミック毛細管−栄養溶液がルーメンを通して供給される
層４：４０ｎｍセラミック毛細管−１００％酸素がルーメンを通して供給される
【００５５】
成長媒体を、５％二酸化炭素／圧縮空気を使用し、栄養が、媒体供給容器から層３中にある全メンブランのルーメン（ＩＣＳ）を通して流れるように、空気圧により供給した。操作の前に、媒体を、媒体供給容器から、層３のＩＣＳを通して、プライム採集容器中に供給することにより、網目及びメンブランルーメンから空気を排除した。操作の際、層３のＩＣＳ出口をクランプ閉鎖し、媒体供給をデッド−エンド様式で操作し、栄養をＩＣＳから毛細管メンブラン壁を通してＥＣＳまたは細胞成長小室中に押し込んだ。使用済み媒体は、ＥＣＳから排出し、メンブラン層１を通して除去した。
【００５６】
同様に、１００％酸素を、層２及び４に配置された毛細管メンブランのＩＣＳを通して供給する。酸素は、細胞成長小室中の細胞成長に必要な酸素吸収に応じて、媒体供給の圧力以上の圧力で供給した。無気泡酸素供給は、主として拡散により行い、ＩＣＳ表面を横切るガス流により促進する。背圧は、特定の流量を維持することにも使用される流量制御バルブにより維持する。
【００５７】
最後の層は、二重の機能を有し、第一に、圧縮空気は、加湿容器から層１のＩＣＳを通り、採集容器中に流れてから、流量制御バルブを通して放出される。流量制御バルブは、空気流を特定の流量に維持し、さらに操作に必要な背圧を与え、第二に、操作中に、使用済み媒体をＥＣＳから除去し、毛細管壁を横切り、媒体供給速度と等しい速度で、層１のＩＣＳ中に送る。層１中にあるメンブランのルーメンに入る浸透物は、この層を通る空気流と共に、採集容器中に排出される。浸透物は、採集容器から、試料採取ポートを経由して試料採取または除去される。
【００５８】
滅菌
網目及び滅菌コネクタを備えた使い捨てバイオリアクターモジュールは、ガンマ線照射した。それぞれ網目及び滅菌コネクタを備えた媒体供給容器、プライム容器、加湿容器、浸透物採集容器及び接種容器は、個別にオートクレーブ処理し、ガンマ線照射したバイオリアクターモジュールに無菌状態で接続してから、接種を行った。
【００５９】
接種
接種の前に、無菌バイオリアクター装置及び成長媒体を３７℃で予備温置した。成長媒体を供給し、５％二酸化炭素／空気でｐＨ７．２に平衡化した。
【００６０】
２．５×１０７のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、バイオリアクターＥＣＳ中に直接接種した。細胞は、ＥＣＳに、２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足、を供給することにより、毛細管メンブランの外側表面上に固定した。操作の前に、接種容器からＥＣＳ中への媒体流を、加圧下で、メンブラン壁を横切り、毛細管ルーメン（ＩＣＳ）中に向け、プライム容器に入れてから、媒体供給容器中に再循環させた。
【００６１】
操作
細胞は、２ｍＭグルタミンを含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ．を補足し、５％二酸化炭素／空気でｐＨ７．２に平衡化したＤＭＥＭ−Ｆ１２成長媒体を使用し、３７℃で培養した。
【００６２】
接種に続いて、バイオリアクターを、メンブラン層１のＩＣＳを通る一定空気流及び圧力（４０ｋＰａ）で、及びメンブラン層２及び４を通る一定の１００％酸素流及び圧力（５０〜７０ｋＰａ）で操作した。細胞成長及び生存率を高めるために、酸素圧を間欠的に調節し、酸素供給を増加させ、ＥＣＳ中のＤＯ濃度（１０〜３０％）を維持した。これらのメンブラン層中に使用済み媒体が流れ込まないように、酸素圧は、媒体供給容器に加えられる圧力より決して低くならないようにした。
【００６３】
ＣＨＯ細胞が成長するにつれて、細胞代謝により生成する廃物のために、ＥＣＳ（細胞成長環境）中の栄養が減少し、媒体ｐＨが変化する。新しい媒体がメンブラン層３のＩＣＳからＥＣＳに供給されるので、使用済み媒体はＥＣＳから除去され、メンブラン層１のＩＣＳ中に排出される。さらに使用済み媒体は、メンブラン層１のＩＣＳから排出され、メンブラン層１のＩＣＳを通って流れる空気と共に、採集容器中に移動する。新しい媒体がＥＣＳに供給され、使用済み媒体がＥＣＳから除去される速度は、媒体供給容器に作用する空気圧（＞４０ ｋＰａ）と、メンブラン層１のＩＣＳに作用する一定圧（＝４０ｋＰａ）との間の差圧により調整される。流量は、成長している細胞による栄養要求を超えるように調節される（１〜１０ｍｌ／ｈｒ）。
【００６４】
操作中、ＥＣＳ中のｐＨを監視し、間隔を置いて、及び媒体供給速度が細胞成長環境を緩衝できない時に、少量の重炭酸塩を媒体に供給し、高細胞密度における廃物蓄積増加を相殺した。このようにして、ＥＣＳのｐＨを、ｐＨ６．８を超えるように維持した。
【００６５】
バイオリアクター操作は、連続的であり、細胞は、１１日間維持してから、メンブランモジュールを解体し、トリパンブルーを使用してＣＨＯ−Ｋ１を計数した。使用済み媒体を毎日採集容器から試料採取し、器示唆分析を行った。
【００６６】
結果及び考察
ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養は１１日間連続的に操作した。図６から、基質分析により、培養中の全ての時点で栄養供給が要求を超えていることが分かる。接種に続いて、細胞によるグルコース吸収速度は低く、１〜２日間の成長遅延を示している。２日目に続いて、グルコース吸収は、０．１ｍｇ／ｈｒから、４日目の最大１２ｍｇ／ｈｒに増加し、その後、グルコース吸収速度は、平らになり、培養の残りの期間、約８ｍｇ／ｈｒで安定した。最大細胞収率は４日目に得られたことが分かる。
【００６７】
ラクテート生産は、グルコース吸収と類似の傾向を示し、細胞によりラクテートに代謝されたグルコースのレベルは、９日目までは吸収速度を下回っており、この時点で細胞は、ｐＨ ６．８より下に低下した低媒体ｐＨによるストレスを受けている。細胞代謝が最早最適ではないことが明らかになった時、成長実験を停止し、総細胞収率を測定した。
【００６８】
総細胞収率１．５×１０８細胞が得られた。これらの中で、１．５×１０７細胞は、ＥＣＳ中にゆるく密着しているか、または分散しており、１．３×１０８細胞をトリプシン処理後に収穫した。
【００６９】
この実験で、密着性細胞密度２．５×１０５細胞／ｃｍ２が得られたが、これは、Ｓｙｚｍａｎｓｋｉら（２００８）により報告されているＴ１７５フラスコ（１．７×１０５細胞／ｃｍ２）及びＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（２．２×１０５細胞／ｃｍ２）に対する最大ＣＨＯ細胞密度収穫と十分に匹敵する。
【００７０】
参考文献
１．Ｓｙｚｍａｎｓｋｉ，Ｓ．Ｌ，Ｈｕｆｆ，Ｋ．Ｗ，Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｄ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｒ．Ｆｅａｓｂｙ，Ｊ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．Ｖ．，Ｄｅｎｉｓｅ Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｋ．，Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．及びＲｕｓｈ，Ａ．（２００８）新規な高収率、高性能組織培養フラスコの自動化用途（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ，ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ）。ＪＡＬＡ ｖｏｌ．１３（３）：１３６−１４４。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一個の、マニホールド及び中空繊維メンブラン配置を含んでなるカセット、
上側ヘッドプレート、及び
下側ヘッドプレート
を含んでなる、規模を調整できるバイオリアクターであって、
前記カセットが、相互に、及び前記ヘッドプレートと連携し、内部の毛細管外培養空間（ＥＣＳ）を限定するように構築されたモジュール式構成部品であり、前記中空繊維メンブラン配置が個別の入口及び出口を包含する、バイオリアクター。
【請求項２】
各中空繊維メンブランの配置が、前記メンブランの各末端にあるマニホールドに配置された入口及び出口貯蔵部を含んでなり、各貯蔵部が、前記それぞれの入口及び出口と流体連絡している、請求項１に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項３】
前記中空繊維メンブランが、実質的に平行なメンブランの層（列）に配置されている、請求項１または２に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項４】
各カセットが一個以上の層（列）を包含する、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項５】
各カセットが二個以上の層（列）を包含する場合、中空繊維メンブランの各層が、水平または垂直の向きで、各層の上及び／または下にある前記層に対して直角に配置される、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項６】
中空繊維メンブランの各列が、各列の上及び／または下にあるメンブラン列に対してずれている、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項７】
各カセットが、官能性毎に一個の中空繊維メンブラン層（列）を包含する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項８】
中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールドを含んでなるカセットであって、前記カセットが、中空繊維メンブランの各配置に対して個別の入口及び出口を含んでなり、前記カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携し、内部ＥＣＳを限定するように構築されている、カセット。
【請求項９】
バイオリアクター用の、中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールド、及び上側及び下側ヘッドプレートを含んでなる、キット。
【請求項１０】
前記マニホールドを受け入れるように構築されたカセットを包含し、前記カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携するように構築されている、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記マニホールド中に取り付けられるか、または取り付けられない、少なくとも一個の中空繊維メンブランを包含する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記カセットが、前記中空繊維メンブランを受け入れるように構築された２個の対向するマニホールドを包含し、前記マニホールドが、側方支持体により互いに接合され、フレームを形成する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
細胞及び／または微生物の代謝を利用するための方法であって、請求項１に記載のバイオリアクターを使用する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記バイオリアクターの前記ＥＣＳ中に前記細胞及び／または微生物を接種することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞及び／または微生物が、前記中空繊維メンブランの外側表面上に固定される、及び／または前記細胞及び／または微生物が前記ＥＣＳ中に分散される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
標準的な交差流操作によるか、またはデッド−エンド操作による、前記中空繊維メンブラン配置の入口装置を通る流体流を包含する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記中空繊維メンブランを通る流体供給を調整するための制御手段を包含する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
栄養、ガス、例えば酸素及び二酸化炭素、緩衝剤（酸性または塩基性溶液）、ホルモン、成長調整または代謝改良化合物、使用済み媒体、代謝廃物、重要な生成物、及び熱交換材料を包含する物質の供給及び／または除去を包含し、前記物質が、前記カセットの入口または出口装置を経由して、及び／または前記上側及び下側ヘッドプレート中の前記開口部（ポート）を通して前記バイオリアクターに供給される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＳを通る流体流を包含し、前記流体流が、さらに再循環されるか、またはデッド−エンド様式で循環される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも一個の、マニホールド及び中空繊維メンブラン配置を含んでなるカセット、
上側ヘッドプレート、及び
下側ヘッドプレート
を含んでなる、規模を調整できるバイオリアクターであって、
前記カセットが、相互に、及び前記ヘッドプレートと連携し、内部の毛細管外培養空間（ＥＣＳ）を限定するように構築されたモジュール式構成部品であり、前記中空繊維メンブラン配置が個別の入口及び出口を包含する、バイオリアクター。
【請求項２】
各中空繊維メンブランの配置が、前記メンブランの各末端にあるマニホールドに配置された入口及び出口貯蔵部を含んでなり、各貯蔵部が、前記それぞれの入口及び出口と流体連絡している、請求項１に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項３】
前記中空繊維メンブランが、実質的に平行なメンブランの層（列）に配置されている、請求項１または２に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項４】
各カセットが一個以上の層（列）を包含する、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項５】
各カセットが二個以上の層（列）を包含する場合、中空繊維メンブランの各層が、水平または垂直の向きで、各層の上及び／または下にある前記層に対して直角に配置される、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項６】
中空繊維メンブランの各列が、各列の上及び／または下にあるメンブラン列に対してずれている、請求項３に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項７】
各カセットが、官能性毎に一個の中空繊維メンブラン層（列）を包含する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の規模を調整できるバイオリアクター。
【請求項８】
中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールドを含んでなるカセットであって、前記カセットが、中空繊維メンブランの各配置に対して個別の入口及び出口を含んでなり、前記カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携し、内部ＥＣＳを限定するように構築されている、カセット。
【請求項９】
バイオリアクター用の、中空繊維メンブランの配置を受け入れるように構築されたマニホールド、及び上側及び下側ヘッドプレートを含んでなる、キット。
【請求項１０】
前記マニホールドを受け入れるように構築されたカセットを包含し、前記カセットが、別のカセット及び／または上側及び下側ヘッドプレートと連携するように構築されている、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記マニホールド中に取り付けられるか、または取り付けられない、少なくとも一個の中空繊維メンブランを包含する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記カセットが、前記中空繊維メンブランを受け入れるように構築された２個の対向するマニホールドを包含し、前記マニホールドが、側方支持体により互いに接合され、フレームを形成する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
細胞及び／または微生物の代謝を利用するための方法であって、請求項１に記載のバイオリアクターを使用する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記バイオリアクターの前記ＥＣＳ中に前記細胞及び／または微生物を接種することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞及び／または微生物が、前記中空繊維メンブランの外側表面上に固定される、及び／または前記細胞及び／または微生物が前記ＥＣＳ中に分散される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
標準的な交差流操作によるか、またはデッド−エンド操作による、前記中空繊維メンブラン配置の入口装置を通る流体流を包含する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記中空繊維メンブランを通る流体供給を調整するための制御手段を包含する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
栄養、ガス、例えば酸素及び二酸化炭素、緩衝剤（酸性または塩基性溶液）、ホルモン、成長調整または代謝改良化合物、使用済み媒体、代謝廃物、重要な生成物、及び熱交換材料を包含する物質の供給及び／または除去を包含し、前記物質が、前記カセットの入口または出口装置を経由して、及び／または前記上側及び下側ヘッドプレート中の前記開口部（ポート）を通して前記バイオリアクターに供給される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＳを通る流体流を包含し、前記流体流が、さらに再循環されるか、またはデッド−エンド様式で循環される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１９５７５（Ｐ２０１１−５１９５７５Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８０４６（Ｐ２０１１−５０８０４６）
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１９２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６３８４
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２９７０３７）シネクサ、ライフ、サイエンシズ、（プロプライエタリー）、リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＥＸＡ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （ＰＴＹ） ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１９２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６３８４
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２９７０３７）シネクサ、ライフ、サイエンシズ、（プロプライエタリー）、リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＥＸＡ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （ＰＴＹ） ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
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