試料中のエクオールの免疫測定法
【課題】試料中のエクオールを測定する方法において、試料の前処理が必須となっており、測定結果を得るまでに多大な時間を要する。
【解決手段】エクオールを認識する抗体の作製において、免疫抗原の合成を適切に行うことにより、親和力が強く、類似物質との交差性が低い、エクオールを特異的に認識する抗体が得られる。この抗体を用いて免疫測定法を構築することにより、脱抱合処理なしに測定できる免疫測定法が確立された。その結果、試料の前処理を実施することなく、短時間でのエクオールの測定が可能となる。
【解決手段】エクオールを認識する抗体の作製において、免疫抗原の合成を適切に行うことにより、親和力が強く、類似物質との交差性が低い、エクオールを特異的に認識する抗体が得られる。この抗体を用いて免疫測定法を構築することにより、脱抱合処理なしに測定できる免疫測定法が確立された。その結果、試料の前処理を実施することなく、短時間でのエクオールの測定が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原抗体反応を利用した、試料中のエクオールの免疫測定法である。
【背景技術】
【０００２】
大豆中に含まれるイソフラボンが、乳癌、前立腺癌などに対する予防効果（抗エストロゲン効果）を有すること、および更年期障害、閉経後の骨粗鬆症・高脂血症・高血圧などに対して改善効果（エストロゲン様効果）を有することは、広く知られている。
【０００３】
最近になって、大豆イソフラボンによる直接の臨床効果が疑問視され、該大豆イソフラボンに代わって大豆イソフラボンの活性代謝物であるエクオールが、臨床応用における有効性の鍵を握ると報告されている。すなわち、乳癌、前立腺癌、更年期障害および閉経後の骨粗鬆症に対して、大豆イソフラボンよりもその代謝物であるエクオールのほうが有効である旨の報告が種々見られ、現在では、エクオールが大豆イソフラボンの有効性の本体であることが支持されている。
【０００４】
また、エクオールは、腸内細菌によって生成されるため、腸内の菌叢によりその生成量に違いがあり、個人差が存在することが報告されている。それゆえ、大豆加工品を摂取しても所望の抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果が期待できないヒトが存在することは否めない。
【０００５】
その後、エクオールを効率的に産生する乳酸菌が単離・同定され（特許文献１）、該乳酸菌製剤を経口摂取して乳酸菌を腸内に定着させることにより、エクオールの体内への効率的な取り込みが期待される。この時、例えば尿中のエクオールを測定することにより、該乳酸菌の腸内での定着の有無を確認することが可能となる。
【０００６】
このエクオールの測定法としては、血液試料では液体クロマトグラフ質量分析装置あるいはガスクロマトグラフ質量分析計を用い、尿試料では高速液体クロマトグラフィー法などの機器分析を用いる方法が知られているが、より簡便な測定系が期待されている。
【０００７】
また、イムノアッセイによるエクオールの測定法としては、時間分解蛍光イムノアッセイ法を用いたＬａｂｍａｓｔｅｒ ＴＲ−ＦＩＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｑｕｏｌ（ＬＡＢＭＡＳＴＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ社）が市販されているが（非特許文献１）、酵素などによる試料の前処理工程が必須となっており、短時間での多検体の測定の障害となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２９６４３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅ. Ｂｒｏｕｗｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、８４巻、ｐ．５７７−５８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
簡便な測定系であるイムノアッセイ法を用いて、エクオールの測定を短時間で行えるようにする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
エクオールの測定において、最も時間を必要とする工程は、試料の酵素などによる前処理工程である。それゆえ、該工程を必要としない測定試薬の組成を考えなければならない。また、測定の簡便性を考慮すると、イムノアッセイ法が望ましい。
【００１２】
また、イムノアッセイ法において、その性能を大きく左右するものとして、抗体がある。この抗体の性質としては、抗原との結合の強さである親和力の他、類似物質との交差反応性の指標となる特異性が知られている。
【００１３】
そこで、エクオールのイムノアッセイ法による測定に用いる抗体の作製法を検討したところ、包接体との結合の有無にかかわらず、同等にエクオールを測定することが可能となった。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において、抱合体からの脱抱合処理なしに測定することを特徴とするエクオールの免疫測定法。
（２）前記抱合体が、硫酸抱合体、グルクロン酸抱合体である（１）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（３）前記免疫測定法がＥＬＩＳＡ法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（４）前記免疫測定法がＲＩＡ法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（５）前記免疫測定法がイムノクロマト法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（６）前記免疫測定法がラテックス凝集法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（７）試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において用いる抗体が、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体である、（１）〜（６）のいずれか一項記載の免疫測定法。
（８）前記試料が、血液試料または尿試料である、（１）〜（７）のいずれか一項記載の免疫測定法。
【００１５】
本発明の測定対象であるエクオールは低分子のハプテン抗原であるため、それ自体では免疫原性を有していない。そのため、免疫測定法に用いる抗体を得るためには、抗原支持物質との結合体を合成し、免疫抗原を作製しなければならばならない。
【００１６】
前記抗原支持物質としては、高分子物質（分子量１万以上、好ましくは５万〜１００万）が好ましく、その中でもタンパク質、脂質等が好ましい。好ましいタンパク質の例として、抗体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、フェリチン等を挙げることができ、脂質の例として、グロポシド型糖脂質、ガングリオシド型糖脂質、リン脂質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１７】
また、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させるには、共有結合が好ましく、公知の技術を適宜用いることができる。例えば、抗原支持物質としてタンパク質を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド活性化エステル法により、ハプテン抗原に導入したサクシイミド基とタンパク質又は糖タンパク質のアミノ基とを反応させ、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させることができる。
【００１８】
さらに、ハプテン抗原と抗原支持物質との結合に際し、ハプテン抗原と抗原支持物資の間の距離を拡げるために、ハプテン抗原にスペーサー化合物を導入してから抗原支持物質と結合させることにより、抗体との親和性、抗体の特異性に変化を与えることができる。
【００１９】
抗体の存在を検出する標識化ハプテン抗原については、前記抗原支持物質の代わりに標識物を用いることにより、同様に作製することができ、ハプテン抗原と標識物の間にスペーサー化合物を導入することにより、検出する抗体との親和性を調整することができる。
【００２０】
本発明においては、エクオール、スペーサーおよび抗原支持物質または標識物質の適合性を検討した結果、抱合体からの脱抱合処理が不要な免疫測定法が可能となった。
【００２１】
免疫測定法に用いるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体については、公知の方法で実施することにより作製することができる。すなわち、ポリクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、ニワトリ等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に得られる抗血清を精製または希釈することで調製できる。
【００２２】
モノクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にマウス、ラット等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に前記免疫抗原を単独で静脈内または腹腔内注射し、数日後に摘出した脾臓より調製した脾細胞とミエローマ細胞を融合して融合細胞を選択培養する。
【００２３】
増殖した融合細胞をクローン化培養し、エクオールに特異的に結合するＩｇＧ抗体を産生する細胞株を選定する。選定した細胞株を培養して得られる培養上清を精製または希釈することで調製できる。
【００２４】
次に、エクオールの免疫測定法の例を以下に示すが、本発明の本質はこれらの例により限定されるものではない。
【００２５】
ＥＬＩＳＡ法による尿中のエクオールの測定については、尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予め抗ウサギヤギ抗体を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールおよび希釈した抗エクオールウサギ抗血清を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄して発色基質液を加えて一定時間反応させ、一定時間後に反応を停止させて吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２６】
ＲＩＡ法による尿中のエクオールの測定については、尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予め抗ウサギヤギ抗体を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、１２５Ｉ標識エクオールおよび希釈した抗エクオール抗体産生細胞培養上清を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄した後にマイクロプレートのウェルの放射線活性を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２７】
イムノクロマト法による血中のエクオールの測定については、血清検体に金コロイド標識抗エクオールマウスモノクローナル抗体を加えて希釈血清検体液を調製し、イムノクロマトストリップのサンプルパッド部に希釈血清検体液を滴下して一定時間反応させる。反応後、エクオールを固定化した捕捉部の金コロイド標識物による着色を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２８】
ラテックス凝集法による血中のエクオールの測定については、吸光度測定用セルに血清検体および抗エクオールウサギポリクローナル抗体と反応して凝集する凝集抗原を加えて一定時間反応させる。反応後、抗エクオールウサギポリクローナル抗体固定化ラテックス溶液を加えて一定時間後に２回吸光度を測定して２回の吸光度差を求め、同様に求めた検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２９】
なお、エクオールを測定する検体としては、前記尿検体および血清検体の他、血漿検体、便検体、組織抽出物、細胞抽出物、食材等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明を実施することにより、試料中のエクオールの測定が短時間で行われるだけでなく、前処理試薬に含まれる化合物などによる免疫反応の阻害を抑制するために、前処理済検体を希釈することによる低感度化を避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１はＥＬＩＳＡ法の直接法および酵素処理法で測定した結果の相関図である。（実施例５）
【図２】図２はＥＬＩＳＡ法の直接法およびＨＰＬＣ法で測定した結果の相関図である。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００３２】
低分子のエクオールを免疫法によって測定するときに用いる抗体の良否は、合成免疫原に左右される。さらに、包合体との結合の有無にかかわらず、エクオールを同等に測定する抗体の作製が重要となる。
以下に抗体の作製、評価および該抗体を用いた測定について説明する。
【実施例１】
【００３３】
免疫原の合成
１００ｍｇのエクオール（Ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬのＭｅｔｈｙｌ Ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【００３４】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＥｑｕｏｌに１分子のＣＭＥ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【００３５】
回収した１分子ずつ結合したＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ａｃｉｄを得た。
【００３６】
得られたＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＮＨＳを得た。
【００３７】
２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させる。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＢＳＡ抗原の原液とした。
【実施例２】
【００３８】
抗血清の作製
合成した免疫原Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを等量混和し、免疫剤を作製した。該免疫剤を用い、３週間毎に１ｍＬ／回をウサギの背部の数箇所に皮下注射した。免疫開始１２週目から３週間毎に採血を開始し、５回の部分採血の後に全採血を実施した。採血した抗血清の抗体力価を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【実施例３】
【００４０】
エクオール測定ＥＬＩＳＡキットの作製
１．抗ウサギヤギ抗体固相化プレートの作製
９６穴マイクロプレートの各ウェルに１０μｇ／ｍＬの抗ウサギヤギ抗体溶液を１００μＬ加える。４℃で２晩静置した後に抗ウサギヤギ抗体溶液を吸引除去する。
【００４１】
吸引除去した９６穴マイクロプレートの各ウェルに０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液を３００μＬ加える。４℃で１８時間静置した後に、ウシ血清アルブミン溶液を吸引除去し、真空乾燥して抗ウサギヤギ抗体固相化プレートとする。
【００４２】
２．西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールの作製
１００ｍｇのエクオール（Ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬの４−Ｂｒｏｍｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ Ａｃｉｄおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【００４３】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＥｑｕｏｌに１分子のＣＰＥ（ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【００４４】
回収した１分子ずつ結合したＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄを得た。
【００４５】
得られたＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳを得た。
【００４６】
２０ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼ２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳ （１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させる。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液の原液とした。
【００４７】
３．検体希釈液、標準希釈液
１００％ヒトフリー血清（ＳＥＲＡＣＯＮ ＩＩ：ＣＤ ＩＮＴＥＲＧＥＮ社）を用いた。
【００４８】
４．試験緩衝液の組成
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％ｔｗｅｅｎ２０、０．１％プロクリン３００、５０μｇ／ｍＬ塩酸ロメフロキサシン、５μｇ／ｍＬラクトパーオキシダーゼ含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を試験緩衝液とした。
また、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％ｔｗｅｅｎ２０含有０．３ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を洗浄液とした。
【００４９】
５．基質
０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭくえん酸緩衝液（ｐＨ５．５）を基質とした。
【００５０】
６．反応停止液
３Ｎ硫酸を反応停止液とした。
【００５１】
７．酵素液
検体の前処理用の酵素液として、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍＬに、β−グルクロニダーゼ（ＲＯＣＨＥ社）２．４８μＬおよび精製水で１００ｍｇ／ｍＬに溶解したスルファターゼ（ＳＩＧＭＡ社）２６．４μＬ加えて調製した。
【実施例４】
【００５２】
ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定（直接法）
尿検体２０μＬに検体希釈液２００μＬ加えて、１１倍希釈尿検体を調製する。抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに、１１倍希釈尿検体２０μＬ、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液５０μＬおよび抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置する。
【００５３】
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄する。洗浄後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置する。その後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００５４】
ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定（酵素処理法）
尿検体２０μＬに検体希釈液２００μＬ加えて、１１倍希釈尿検体を調製する。１１倍希釈尿検体５０μＬに酵素液５０μＬ加え、攪拌後に３７℃で１晩静置する。その後、中和液（０．５Ｍりん酸２Ｎａ（ｐＨ８．８））を５０μＬ加えて、酵素処理検体とする。
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに、該酵素処理検体２０μＬ、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液５０μＬおよび抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置する。
【００５５】
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄する。洗浄後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置する。その後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【実施例５】
【００５６】
酵素処理の有無によるエクオールのＥＬＩＳＡ測定値の比較
尿検体９例について、ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定を、直接法および酵素処理法を用いて実施した。得られた測定値の比較を図１に示すが、直接法では酵素処理法と比較して測定値が約１／３と低値を示したが、相関係数ｒ＝０．９９３と高い相関性を示した。
【実施例６】
【００５７】
ＨＰＬＣ法との相関
ＨＰＬＣ法による測定結果が得られている尿検体１２例について、エクオールの直接法によるＥＬＩＳＡ測定を実施した。得られた測定値とＨＰＬＣ法での測定値の比較を図２に示すが、ＥＩＳＡ法の測定値はＨＰＬＣ法と比較して測定値が約１／４と低値を示したが、相関係数ｒ＝０．９７９と高い相関性を示した。
【実施例７】
【００５８】
交差反応性
エクオールの希釈系列及び、交差反応性確認用抗原希釈系列を測定し、標準０の５０％の吸光度を示す濃度（５０％抑制濃度：ＩＣ５０）を比較し、エクオールの希釈系列のＩＣ５０に対する比率を交差反応率とした。
【００５９】
結果を表２に示すが、エクオールの前駆物質であるダイゼインをはじめとして、類似構造を有する他の物質との交差性は１％以下であった。
【００６０】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６１】
抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果を期待して、大豆加工品を摂取する際に、尿中、血液中のエクオール濃度を測定することにより、その効果の有無が判断されるが、その測定には長時間を要し、日常の測定には適さない。
【００６２】
しかし、本発明により、尿中、血液中のエクオールを短時間で測定することが可能となり、エクオールを産生する安全な乳酸菌製剤の投与の効果の判断も含め、大豆加工品の摂取の効果を類推することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原抗体反応を利用した、試料中のエクオールの免疫測定法である。
【背景技術】
【０００２】
大豆中に含まれるイソフラボンが、乳癌、前立腺癌などに対する予防効果（抗エストロゲン効果）を有すること、および更年期障害、閉経後の骨粗鬆症・高脂血症・高血圧などに対して改善効果（エストロゲン様効果）を有することは、広く知られている。
【０００３】
最近になって、大豆イソフラボンによる直接の臨床効果が疑問視され、該大豆イソフラボンに代わって大豆イソフラボンの活性代謝物であるエクオールが、臨床応用における有効性の鍵を握ると報告されている。すなわち、乳癌、前立腺癌、更年期障害および閉経後の骨粗鬆症に対して、大豆イソフラボンよりもその代謝物であるエクオールのほうが有効である旨の報告が種々見られ、現在では、エクオールが大豆イソフラボンの有効性の本体であることが支持されている。
【０００４】
また、エクオールは、腸内細菌によって生成されるため、腸内の菌叢によりその生成量に違いがあり、個人差が存在することが報告されている。それゆえ、大豆加工品を摂取しても所望の抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果が期待できないヒトが存在することは否めない。
【０００５】
その後、エクオールを効率的に産生する乳酸菌が単離・同定され（特許文献１）、該乳酸菌製剤を経口摂取して乳酸菌を腸内に定着させることにより、エクオールの体内への効率的な取り込みが期待される。この時、例えば尿中のエクオールを測定することにより、該乳酸菌の腸内での定着の有無を確認することが可能となる。
【０００６】
このエクオールの測定法としては、血液試料では液体クロマトグラフ質量分析装置あるいはガスクロマトグラフ質量分析計を用い、尿試料では高速液体クロマトグラフィー法などの機器分析を用いる方法が知られているが、より簡便な測定系が期待されている。
【０００７】
また、イムノアッセイによるエクオールの測定法としては、時間分解蛍光イムノアッセイ法を用いたＬａｂｍａｓｔｅｒ ＴＲ−ＦＩＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｑｕｏｌ（ＬＡＢＭＡＳＴＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ社）が市販されているが（非特許文献１）、酵素などによる試料の前処理工程が必須となっており、短時間での多検体の測定の障害となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２９６４３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅ. Ｂｒｏｕｗｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、８４巻、ｐ．５７７−５８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
簡便な測定系であるイムノアッセイ法を用いて、エクオールの測定を短時間で行えるようにする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
エクオールの測定において、最も時間を必要とする工程は、試料の酵素などによる前処理工程である。それゆえ、該工程を必要としない測定試薬の組成を考えなければならない。また、測定の簡便性を考慮すると、イムノアッセイ法が望ましい。
【００１２】
また、イムノアッセイ法において、その性能を大きく左右するものとして、抗体がある。この抗体の性質としては、抗原との結合の強さである親和力の他、類似物質との交差反応性の指標となる特異性が知られている。
【００１３】
そこで、エクオールのイムノアッセイ法による測定に用いる抗体の作製法を検討したところ、包接体との結合の有無にかかわらず、同等にエクオールを測定することが可能となった。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において、抱合体からの脱抱合処理なしに測定することを特徴とするエクオールの免疫測定法。
（２）前記抱合体が、硫酸抱合体、グルクロン酸抱合体である（１）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（３）前記免疫測定法がＥＬＩＳＡ法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（４）前記免疫測定法がＲＩＡ法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（５）前記免疫測定法がイムノクロマト法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（６）前記免疫測定法がラテックス凝集法である（１）または（２）記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
（７）試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において用いる抗体が、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体である、（１）〜（６）のいずれか一項記載の免疫測定法。
（８）前記試料が、血液試料または尿試料である、（１）〜（７）のいずれか一項記載の免疫測定法。
【００１５】
本発明の測定対象であるエクオールは低分子のハプテン抗原であるため、それ自体では免疫原性を有していない。そのため、免疫測定法に用いる抗体を得るためには、抗原支持物質との結合体を合成し、免疫抗原を作製しなければならばならない。
【００１６】
前記抗原支持物質としては、高分子物質（分子量１万以上、好ましくは５万〜１００万）が好ましく、その中でもタンパク質、脂質等が好ましい。好ましいタンパク質の例として、抗体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、フェリチン等を挙げることができ、脂質の例として、グロポシド型糖脂質、ガングリオシド型糖脂質、リン脂質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１７】
また、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させるには、共有結合が好ましく、公知の技術を適宜用いることができる。例えば、抗原支持物質としてタンパク質を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド活性化エステル法により、ハプテン抗原に導入したサクシイミド基とタンパク質又は糖タンパク質のアミノ基とを反応させ、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させることができる。
【００１８】
さらに、ハプテン抗原と抗原支持物質との結合に際し、ハプテン抗原と抗原支持物資の間の距離を拡げるために、ハプテン抗原にスペーサー化合物を導入してから抗原支持物質と結合させることにより、抗体との親和性、抗体の特異性に変化を与えることができる。
【００１９】
抗体の存在を検出する標識化ハプテン抗原については、前記抗原支持物質の代わりに標識物を用いることにより、同様に作製することができ、ハプテン抗原と標識物の間にスペーサー化合物を導入することにより、検出する抗体との親和性を調整することができる。
【００２０】
本発明においては、エクオール、スペーサーおよび抗原支持物質または標識物質の適合性を検討した結果、抱合体からの脱抱合処理が不要な免疫測定法が可能となった。
【００２１】
免疫測定法に用いるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体については、公知の方法で実施することにより作製することができる。すなわち、ポリクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、ニワトリ等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に得られる抗血清を精製または希釈することで調製できる。
【００２２】
モノクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にマウス、ラット等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に前記免疫抗原を単独で静脈内または腹腔内注射し、数日後に摘出した脾臓より調製した脾細胞とミエローマ細胞を融合して融合細胞を選択培養する。
【００２３】
増殖した融合細胞をクローン化培養し、エクオールに特異的に結合するＩｇＧ抗体を産生する細胞株を選定する。選定した細胞株を培養して得られる培養上清を精製または希釈することで調製できる。
【００２４】
次に、エクオールの免疫測定法の例を以下に示すが、本発明の本質はこれらの例により限定されるものではない。
【００２５】
ＥＬＩＳＡ法による尿中のエクオールの測定については、尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予め抗ウサギヤギ抗体を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールおよび希釈した抗エクオールウサギ抗血清を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄して発色基質液を加えて一定時間反応させ、一定時間後に反応を停止させて吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２６】
ＲＩＡ法による尿中のエクオールの測定については、尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予め抗ウサギヤギ抗体を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、１２５Ｉ標識エクオールおよび希釈した抗エクオール抗体産生細胞培養上清を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄した後にマイクロプレートのウェルの放射線活性を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２７】
イムノクロマト法による血中のエクオールの測定については、血清検体に金コロイド標識抗エクオールマウスモノクローナル抗体を加えて希釈血清検体液を調製し、イムノクロマトストリップのサンプルパッド部に希釈血清検体液を滴下して一定時間反応させる。反応後、エクオールを固定化した捕捉部の金コロイド標識物による着色を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２８】
ラテックス凝集法による血中のエクオールの測定については、吸光度測定用セルに血清検体および抗エクオールウサギポリクローナル抗体と反応して凝集する凝集抗原を加えて一定時間反応させる。反応後、抗エクオールウサギポリクローナル抗体固定化ラテックス溶液を加えて一定時間後に２回吸光度を測定して２回の吸光度差を求め、同様に求めた検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００２９】
なお、エクオールを測定する検体としては、前記尿検体および血清検体の他、血漿検体、便検体、組織抽出物、細胞抽出物、食材等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明を実施することにより、試料中のエクオールの測定が短時間で行われるだけでなく、前処理試薬に含まれる化合物などによる免疫反応の阻害を抑制するために、前処理済検体を希釈することによる低感度化を避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１はＥＬＩＳＡ法の直接法および酵素処理法で測定した結果の相関図である。（実施例５）
【図２】図２はＥＬＩＳＡ法の直接法およびＨＰＬＣ法で測定した結果の相関図である。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００３２】
低分子のエクオールを免疫法によって測定するときに用いる抗体の良否は、合成免疫原に左右される。さらに、包合体との結合の有無にかかわらず、エクオールを同等に測定する抗体の作製が重要となる。
以下に抗体の作製、評価および該抗体を用いた測定について説明する。
【実施例１】
【００３３】
免疫原の合成
１００ｍｇのエクオール（Ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬのＭｅｔｈｙｌ Ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【００３４】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＥｑｕｏｌに１分子のＣＭＥ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【００３５】
回収した１分子ずつ結合したＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ａｃｉｄを得た。
【００３６】
得られたＥｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＮＨＳを得た。
【００３７】
２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させる。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＢＳＡ抗原の原液とした。
【実施例２】
【００３８】
抗血清の作製
合成した免疫原Ｅｑｕｏｌ−ＣＭＥ−ＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを等量混和し、免疫剤を作製した。該免疫剤を用い、３週間毎に１ｍＬ／回をウサギの背部の数箇所に皮下注射した。免疫開始１２週目から３週間毎に採血を開始し、５回の部分採血の後に全採血を実施した。採血した抗血清の抗体力価を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【実施例３】
【００４０】
エクオール測定ＥＬＩＳＡキットの作製
１．抗ウサギヤギ抗体固相化プレートの作製
９６穴マイクロプレートの各ウェルに１０μｇ／ｍＬの抗ウサギヤギ抗体溶液を１００μＬ加える。４℃で２晩静置した後に抗ウサギヤギ抗体溶液を吸引除去する。
【００４１】
吸引除去した９６穴マイクロプレートの各ウェルに０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液を３００μＬ加える。４℃で１８時間静置した後に、ウシ血清アルブミン溶液を吸引除去し、真空乾燥して抗ウサギヤギ抗体固相化プレートとする。
【００４２】
２．西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールの作製
１００ｍｇのエクオール（Ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬの４−Ｂｒｏｍｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ Ａｃｉｄおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【００４３】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＥｑｕｏｌに１分子のＣＰＥ（ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【００４４】
回収した１分子ずつ結合したＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄを得た。
【００４５】
得られたＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳを得た。
【００４６】
２０ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼ２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳ （１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させる。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液の原液とした。
【００４７】
３．検体希釈液、標準希釈液
１００％ヒトフリー血清（ＳＥＲＡＣＯＮ ＩＩ：ＣＤ ＩＮＴＥＲＧＥＮ社）を用いた。
【００４８】
４．試験緩衝液の組成
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％ｔｗｅｅｎ２０、０．１％プロクリン３００、５０μｇ／ｍＬ塩酸ロメフロキサシン、５μｇ／ｍＬラクトパーオキシダーゼ含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を試験緩衝液とした。
また、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％ｔｗｅｅｎ２０含有０．３ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を洗浄液とした。
【００４９】
５．基質
０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭくえん酸緩衝液（ｐＨ５．５）を基質とした。
【００５０】
６．反応停止液
３Ｎ硫酸を反応停止液とした。
【００５１】
７．酵素液
検体の前処理用の酵素液として、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍＬに、β−グルクロニダーゼ（ＲＯＣＨＥ社）２．４８μＬおよび精製水で１００ｍｇ／ｍＬに溶解したスルファターゼ（ＳＩＧＭＡ社）２６．４μＬ加えて調製した。
【実施例４】
【００５２】
ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定（直接法）
尿検体２０μＬに検体希釈液２００μＬ加えて、１１倍希釈尿検体を調製する。抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに、１１倍希釈尿検体２０μＬ、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液５０μＬおよび抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置する。
【００５３】
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄する。洗浄後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置する。その後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００５４】
ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定（酵素処理法）
尿検体２０μＬに検体希釈液２００μＬ加えて、１１倍希釈尿検体を調製する。１１倍希釈尿検体５０μＬに酵素液５０μＬ加え、攪拌後に３７℃で１晩静置する。その後、中和液（０．５Ｍりん酸２Ｎａ（ｐＨ８．８））を５０μＬ加えて、酵素処理検体とする。
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに、該酵素処理検体２０μＬ、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液５０μＬおよび抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置する。
【００５５】
抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄する。洗浄後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置する。その後、抗ウサギヤギ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【実施例５】
【００５６】
酵素処理の有無によるエクオールのＥＬＩＳＡ測定値の比較
尿検体９例について、ＥＬＩＳＡキットによるエクオールの測定を、直接法および酵素処理法を用いて実施した。得られた測定値の比較を図１に示すが、直接法では酵素処理法と比較して測定値が約１／３と低値を示したが、相関係数ｒ＝０．９９３と高い相関性を示した。
【実施例６】
【００５７】
ＨＰＬＣ法との相関
ＨＰＬＣ法による測定結果が得られている尿検体１２例について、エクオールの直接法によるＥＬＩＳＡ測定を実施した。得られた測定値とＨＰＬＣ法での測定値の比較を図２に示すが、ＥＩＳＡ法の測定値はＨＰＬＣ法と比較して測定値が約１／４と低値を示したが、相関係数ｒ＝０．９７９と高い相関性を示した。
【実施例７】
【００５８】
交差反応性
エクオールの希釈系列及び、交差反応性確認用抗原希釈系列を測定し、標準０の５０％の吸光度を示す濃度（５０％抑制濃度：ＩＣ５０）を比較し、エクオールの希釈系列のＩＣ５０に対する比率を交差反応率とした。
【００５９】
結果を表２に示すが、エクオールの前駆物質であるダイゼインをはじめとして、類似構造を有する他の物質との交差性は１％以下であった。
【００６０】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６１】
抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果を期待して、大豆加工品を摂取する際に、尿中、血液中のエクオール濃度を測定することにより、その効果の有無が判断されるが、その測定には長時間を要し、日常の測定には適さない。
【００６２】
しかし、本発明により、尿中、血液中のエクオールを短時間で測定することが可能となり、エクオールを産生する安全な乳酸菌製剤の投与の効果の判断も含め、大豆加工品の摂取の効果を類推することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において、抱合体からの脱抱合処理なしに測定することを特徴とするエクオールの免疫測定法。
【請求項２】
前記抱合体が、硫酸抱合体、グルクロン酸抱合体である請求項１記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項３】
前記免疫測定法がＥＬＩＳＡ法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項４】
前記免疫測定法がＲＩＡ法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項５】
前記免疫測定法がイムノクロマト法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項６】
前記免疫測定法がラテックス凝集法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項７】
試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において用いる抗体が、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫測定法。
【請求項８】
前記試料が、血液試料または尿試料である、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫測定法。
【請求項１】
試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において、抱合体からの脱抱合処理なしに測定することを特徴とするエクオールの免疫測定法。
【請求項２】
前記抱合体が、硫酸抱合体、グルクロン酸抱合体である請求項１記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項３】
前記免疫測定法がＥＬＩＳＡ法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項４】
前記免疫測定法がＲＩＡ法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項５】
前記免疫測定法がイムノクロマト法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項６】
前記免疫測定法がラテックス凝集法である請求項１または２記載の試料中のエクオールの免疫測定法。
【請求項７】
試料中のエクオールを免疫法によって測定する方法において用いる抗体が、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫測定法。
【請求項８】
前記試料が、血液試料または尿試料である、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫測定法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１６９５０７（Ｐ２０１０−１６９５０７Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１６６８（Ｐ２００９−１１６６８）
【出願日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
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