赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法
【課題】低コスト、取り扱いが容易であり、かつ環境負担の小さい赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法を提供する。
【解決手段】アオサ類の抽出物を有効成分とする赤潮プランクトン防除剤およびそれを使用する赤潮プランクトンの駆除方法である。前記アオサ類がリボンアオサまたはアナアオサであるものが好適であり、前記抽出物が不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸含有するものが好ましく、ｎ−３系の不飽和脂肪酸を含有するものが好適である。
【解決手段】アオサ類の抽出物を有効成分とする赤潮プランクトン防除剤およびそれを使用する赤潮プランクトンの駆除方法である。前記アオサ類がリボンアオサまたはアナアオサであるものが好適であり、前記抽出物が不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸含有するものが好ましく、ｎ−３系の不飽和脂肪酸を含有するものが好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法に関し、詳しくは、低濃度で効果が現れ、環境に対する負荷が小さい赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、夏場の気温の上昇や河川からの生活排水の流入などによる富栄養化等が原因で起こるプランクトンの大量発生がよく見られる。プランクトンの大量発生による赤潮、青潮は海中の生態系に影響を及ぼし、特に毒性を持つ有害プランクトンの大量発生は養殖漁業において養殖魚、貝の大量死を引き起こし、深刻な問題となっている。
【０００３】
現在までに有害プランクトンの大量発生防止のために、様々な方法が用いられている。例えば、非特許文献１には硫酸銅などの化学物質を使用する方法、非特許文献２等には粘土を使用する方法、非特許文献３には赤潮プランクトンの堆積物である黄土（yellow loess）を使用する方法、非特許文献４および５等にはウィルスやバクテリア等の微生物による方法が知られている。
【０００４】
また、非特許文献６には、オキナワモズク（Cladosiphon akamuranus）のアレロパシー物質を単離し、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸と同定し、赤潮プランクトンに対して活性があることが報告されている。
【非特許文献１】Han, F.X. et.al., J.Env.Qual., 30, 912-919(2001)
【非特許文献２】Bae, H.M. et.al., Control of HABs by yellow loess dispersion: abstract and presentation to the 1st Annual Conference on Harmful Algal Management and Mitigation, 10-14 May 1999, Subic Bay, Philippines, pp.1-28(1999)
【非特許文献３】Choi, H.G. et.al., J. Korean Fish. Soc., 31,109-113(1998)
【非特許文献４】Lovejoy, C., et.al., J. App. Env. Microbiol., 64, 2806-2813(1998)
【非特許文献５】Imai, I., et.al., Fish. Sci., 61, 624-632(1995)
【非特許文献６】Kakisawa, H., et.al., Phytochemistry, 27, 731-735(1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１〜５記載の方法は、高コストである、取り扱いが難しく熟練者が必要である、難分解性である、環境汚染等の二次的な悪影響を与える恐れがある等の問題がある。また、非特許文献６記載の海藻類を使用した方法は、赤潮の原因となる植物プランクトンに対して強い毒性を示すことが確認されているものの、実際の赤潮プランクトンの駆除に関しては検討されていない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、低コストで、取り扱いが容易であり、かつ環境負担の小さい赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、リボンアオサやアナアオサなどのアオサ類が、赤潮の原因となるラフィド藻や渦鞭毛藻に対して殺藻効果がある物質を含有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明の赤潮プランクトン防除剤は、アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。
【０００９】
また、本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、上記本発明の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の赤潮プランクトン防除剤は、極低濃度で効果が現れ、低コストかつ取り扱いが容易であり、また、それを用いた本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、天然素材であるアオサの成分を有効成分としており、環境に対する負荷が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を好適実施形態に基づき、詳細に説明する。
本発明の赤潮プランクトン防除剤は、アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものであるが、本発明に係る「アオサ類」とは、緑藻植物アオサ科に属する海藻アオサ類であり、リボンアオサ、アナアオサ、アミアオサ、オオアオサ、ボタンアオサなどが挙げられ、リボンアオサまたはアナアオサを好適に使用することができ、リボンアオサがより好ましい。アオサ類は１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【００１２】
本発明の赤潮プランクトン防除剤の有効成分であるアオサ類の抽出物を得るための抽出方法は特に制限されるものではなく、抽出溶媒としては、通常天然物成分の抽出に用いられるものを使用することができる。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ポリエチレングリコール、ジクロロエタン、クロロホルム等が挙げられる。エタノールおよびメタノールを好適に用いることができ、より好ましくはメタノールである。
【００１３】
得られた抽出物はそのまま使用することも可能であるが、精製したものを好適に用いることができる。精製することにより、有効成分を高濃度とすることができる。精製方法は特に制限されるものではないが、不溶物を除去後、ゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を好適に用いることができる。各種クロマトグラフィーは市販のものにより、定法に従い精製することができる。なお、精製物を高純度にするためには、上記クロマトグラフィーを上記記載順に順次使用し、精製することが好ましい。
【００１４】
抽出物は、効果の観点から、不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸を含有するものが好ましく、不飽和脂肪酸がｎ−３系であるものを好適に使用することができる。特に不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸（ＯＤＴＡ）およびヘキサデカ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ−テトラエン酸（ＨＤＴＡ）ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種であるものが更に好ましい。なお、不飽和脂肪酸はナトリウム等により塩を形成していてもよい。
【００１５】
本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、上記本発明の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とするものであるが、防除剤の濃度、散布方法等は特に制限されるものではない。例えば、リボンアオサから抽出、精製したα−リノレン酸のナトリウム塩１０グラムを２リットルの水に溶解させた溶液を作製し、赤潮プランクトンを含む海水１トンに加える。これによりサンプル濃度は約１０ｐｐｍとなる。１〜２時間後に赤潮の原因となるラフィド藻や渦鞭毛藻に効果が現れる。また、カプセル化等、施与方法に工夫を凝らすことにより、持続性が高くより効果的な駆除方法へとなる
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
殺藻活性のスクリーニング
まず、下記表１および２に示す各種海藻の抽出物を下記方法により得た。乾燥した各種海藻１００ｍｇを５ｍＬのメタノールに室温下、一日、浸漬した後、減圧下、ろ過した。この抽出工程を三回繰り返し、得られたものを混合させた（メタノール抽出物）。残渣は乾燥させ、室温下、一日、水により抽出した（水抽出物）。得られた各種抽出物の殺藻活性をアカシオモ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）等に対する毒性試験を用い、検討した。バイオアッセイの方法としてＫａｋｉｓａｗａ等の方法を参考にした。約１週間ＥＶ培地でアカシオモを培養し、細胞密度が約０．３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬになるように海水で希釈した。この値は、Ｔｈｏｍａの血球計算盤上にて計算した。マイクロプレート（Ｉｗａｋｉ製：２４穴、径１６ｍｍ、平底）にアカシオモ培養液１ｍＬとサンプルを加え、２０℃、２６７０ｌｘで４時間培養した後、顕微鏡視野内（×４００）で２０細胞中の死細胞数をランダムに計数し、死細胞率を求めた（下記式）。
死細胞率（％）＝（サンプル区の死細胞数）／（サンプル区の計数全細胞数）×１００
得られた結果を下記表１および２に併せて示す。なお、サンプルの濃度は表１記載の結果においては、メタノール抽出液は５μＬ／ｍＬまたは１０μＬ／ｍＬ、水抽出物は２０μＬ／ｍＬまたは４０μＬ／ｍＬであり、表２記載の結果においては、メタノール抽出液は１０μＬ／ｍＬ、水抽出物は４０μＬ／ｍＬである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】
リボンアオサのメタノール抽出物の調製
７月上旬に長崎県牧島で採取したリボンアオサを水洗後、室温で風乾した（風乾重量：４．３６ｋｇ）。得られたリボンアオサを１０．５Ｌのメタノール中で、ミキサーにより細かく砕き、４日間攪拌、抽出した。４日後、抽出液とアオサ残渣をろ紙によりろ別し、抽出液はロータリーエバポレーターで濃縮、アオサ残渣には再び１２．５Ｌのメタノールを加え、２日間再抽出した。再抽出後も同様にろ別し、抽出液を濃縮し１度目の抽出物と混ぜ、抽出分（以下、「リボンアオサメタノール抽出物」という）を得た。
【００２０】
リボンアオサメタノール抽出物の液−液溶媒分配
リボンアオサメタノール抽出物（含水）を減圧下でセライトろ過した後、ヘキサン８００ｍＬ、水７００ｍＬになるようにろ液にヘキサンと水を加え、分液漏斗により分配した。水層をヘキサンにより２回（２００ｍＬ×２）再度抽出し、ヘキサン層を混ぜ濃縮し、ヘキサン抽出物（以下、「リボンアオサメタノール抽出ヘキサン可溶部」という）を得た。
【００２１】
リボンアオサメタノール抽出ヘキサン可溶部をヘキサン３５０ｍＬに溶解させ、４Ｍ塩酸で３回（１００ｍＬ×３）抽出した。ＨＣｌ層を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９付近となるように調整し、ジクロロメタンで３回（１００ｍＬ×３）抽出し、ジクロロメタン層を濃縮し、塩基性画分（以下、「Ｍ−ＲＨＢ」という）を０．０１６ｇ得た。ヘキサン層は、再度セライトろ過し、６００ｍＬになるようにフィルアップした後、５０％メタノール約６００ｍＬにより抽出し、ヘキサン層はそのまま濃縮し中性画分（以下、「Ｍ−ＲＨＮ」という）を１２．９５０ｇ得た。５０％メタノール層はメタノールを濃縮した後、酢酸エチルで３回（２００ｍＬ×３）抽出し、酢酸エチル層を濃縮し５０％メタノール可溶画分（以下、「Ｍ−ＲＨＭ」という）を０．４５７ｇ得た。
【００２２】
メタノール抽出物の殺藻活性試験
得られたＭ−ＲＨＮ、Ｍ−ＲＨＭ、Ｍ−ＲＨＢをサンプル濃度２０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し、殺藻活性値を求めた。なお、殺藻活性値は、上記スクリーニングの際と同様の方法により、死細胞率を求め、この値からコントロールの死細胞率を差し引いたものを殺藻活性値として表した（下記式）。
殺藻活性値（％）＝（4時間後のサンプル区の死細胞率）−（4時間後の対照区の死細胞率）
その結果、殺藻活性値は、Ｍ−ＲＨＮが９２％、Ｍ−ＲＨＭが９１％、Ｍ−ＲＨＢが５８％であった。
【００２３】
各種クロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮの分離および殺藻活性評価
（１）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮの分離
溶媒分配で得られた中性画分Ｍ−ＲＨＮを湿式法で作成したシリカゲルカラム（担体：２４０ｇ、関東化学株式会社製、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０、６３〜２１０μｍ、カラム：直径５．５ｃｍ、高さ３０ｃｍ、ｂｅｄ容積約３５０ｍＬ）によってクロマトグラフィーを行った。移動層として、ヘキサン：酢酸エチル＝９：１、ヘキサン：酢酸エチル＝５：１、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１００％酢酸エチルを使用し、順次１Ｌずつ流し、約１Ｌずつ分画した。溶出液をそれぞれ濃縮し、Ｍ−ＲＨＮから４つのフラクション（Ｍ−ＲＨＮ１〜４）を得た。重量はＭ−ＲＨＮ１が１．８３９６ｇ、Ｍ−ＲＨＮ２が４．２４７５ｇ、Ｍ−ＲＨＮ３が２．３４８０ｇ、Ｍ−ＲＨＮ４が０．４８９６ｇであった。濃縮途中でＭ−ＲＨＮ２は結晶となったので再結晶化し、結晶Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）を０．０２１９ｇ得た。Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）は1Ｈ−ＮＭＲにより、パルミチン酸（不飽和結合０個、炭素１６の飽和脂肪酸）と同定した。
【００２４】
（２）中性画分の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ１〜４およびＭ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）をサンプル濃度１０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し殺藻活性値を求めた。なお、コントロール、サンプル溶解溶媒としてアカシオモに対して影響が少ないメタノールを用い、その濃度はアカシオモ培養液の０．２％以下とした。その結果、殺藻活性値は、Ｍ−ＲＨＮ１が３％、Ｍ−ＲＨＮ２が１００％、Ｍ−ＲＨＮ３が１００％、Ｍ−ＲＨＮ４が６８％、Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）が１％であった。Ｍ−ＲＨＮ２および３が高い殺層活性を示したが、結晶が析出しなかったＭ−ＲＨＮ３の分離を以降、行うこととした。
【００２５】
（３）ＯＤＳカラムクロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮ３の分離
Ｍ−ＲＨＮ３（２．３５ｇ）をアセトンに溶解させ、少量のＯＤＳを加え濃縮し吸着させた後、湿式法で調整したＯＤＳカラム（担体：山善株式会社製、ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｗ−Ｍ、ｓｉｚｅ Ｍ、５０μｍ、３８ｇ）に供しクロマトグラフィーを行った。９０％メタノール溶液で溶出し、初流１００ｍＬを分取し、次のフラクションから６０ｍＬずつ分取し、８つのフラクションを得た（それぞれフラクション１〜８とする）。その後、ＯＤＳ ＴＬＣ（展開溶媒＝９０％メタノール）により分画を分析し、類似したプロフィールを示したフラクションをまとめ、濃縮した（フラクション１を濃縮したものを「Ｍ−ＲＨＮ３−１」と称し、フラクション２〜５を濃縮したものを「Ｍ−ＲＨＮ３−２」と称する）。得られた重量はＭ−ＲＨＮ３−１が３１９．４ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２が５４８．８ｍｇであった。
【００２６】
（４）Ｍ−ＲＨＮ３の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ３−１および３−２をサンプル濃度１０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し殺藻活性値を求めた。その結果、殺藻活性値は、ともに１００％であり、高い殺層活性がみられた。
【００２７】
（５）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＭ−ＲＨＮ３−２の分離
ＯＤＳ ＴＬＣにより複数のスポットが確認されたため、Ｍ−ＲＨＮ３−２について次の分離を行うこととした。Ｍ−ＲＨＮ３−２（５４８．８ｍｇ）を８０％アセトニトリル５ｍＬに溶解させ、そのうちの０．７５ｍＬをＨＰＬＣに供与した。即ち、約８２ｍｇのサンプルをＨＰＬＣで分離を行ったことになる。ＨＰＬＣカラムにはナカライテスク製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（２０×２５０ｍｍ）を用い、溶出溶媒には８０％アセトニトリル、流速５ｍＬ／ｍｉｎで分離した。フラクションコレクターを用い１分（５ｍＬ）ずつ、合計６６フラクションに分画した。すべてのフラクションをＯＤＳ ＴＬＣで分析し、そのプロフィールにより、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１〜３−２−４の４つの画分に精製した。得られた重量はＭ−ＲＨＮ３−２−１（フラクション１９〜２６）が１３．１ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−２（フラクション３４〜４３）が２１．４ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−３（フラクション４６〜５０）が４．８ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−４（フラクション５２〜６６）が２２．１ｍｇであった。
【００２８】
（６）Ｍ−ＲＨＮ３−２の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ３−２−１〜３−２−４をサンプル濃度０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬに調整し、１時間毎に４時間後まで細胞数を計数し殺藻活性値を求め、ＬＴ50とＬＣ50値を算出した。得られた結果を、下記表３に示す。すべての画分に高い殺藻活性がみられた。
【００２９】
【表３】
【００３０】
活性物質の構造決定
それぞれの画分の化合物に関し、ＨＲ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析装置： JEOL JMS-700N）、ＦＴ−ＩＲ（赤外吸収スペクトル装置： Perkin Elmer System 2000）、13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹスペクトル（超伝導多核種磁気共鳴装置： JOEL JNM-AL400、超伝導核磁気共鳴装置： Varian UNITY plus 500）を測定し構造解析を行った。なお、Ｍ−ＲＨＮ３−２−３に関しては、ODS TLCにより非常に近い場所にいくつかのスポットがみられ複数の物質が混入していることが分かったため、これ以上の精製、機器分析による構造解析は行わなかった。
【００３１】
（１）Ｍ−ＲＨＮ３−２−１の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.97 (t, 3H, J = 7.6 Hz, -CH3), 2.08 (m, 2H, -CH2-CH3), 2.41 (m, 4H, -CH=CH-CH2-CH2-COOH), 2.80-2.85 (m, 6H, -CH=CH-CH2-CH=CH- x 3), 5.32-5.43 (m, 8H, -CH=CH- x 4), 6.10-6.33 (br, 1H, COOH).
13C‐NMR (125 MHz, CDCl3)δ：14.3 (CH3CH2-), 20.6 (CH3CH2-), 22.5 (CH=CH-CH2-), 25.5 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 33.8 (-CH2-COOH), 127.1 (_CH=CH-), 127.5 (_CH=CH-) , 127.9 (_CH=CH-), 127.9(_CH=CH-) , 128.4 (_CH=CH-), 128.6 (-CH=CH-), 129.6 (_CH=CH-), 132.1(_CH=CH-), 178.3 (-COOH ).
IR νmax (KBr) cm-1: 3200-3400 (OH), 1713 (C=O), 712 (C=C).
EIMS m/z：248 (M+), 226, 219, 205, 119, 108, 105, 93, 91, 79 (base), 67, 55.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C16H24O2: 248.1776, Found: 248.1768.
【００３２】
また、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）の測定結果は、ケミカルシフトδ：０．９７４ｐｐｍと２．０７５ｐｐｍのピークがカップリングしており、更に２．０７５ｐｐｍのメチレン（ＣＨ2）のピークは５．３２２−５．４２６ｐｐｍの二重結合のプロトンともカップリングしており末端のエチル基が二重結合に隣接していることが明らかとなった。また、２．４１０ｐｐｍ付近の２つのメチレンについても二重結合のピークとカップリングしており、二重結合のもう１端に−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨが結合していることは明らかである。
【００３３】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１は不飽和結合４個、炭素１６の不飽和脂肪酸ヘキサデカ−４，７，１０，１３−テトラエン酸（ＨＤＴＡ）であると決定された。機器分析では二重結合の幾何に関する情報は得られなかった。この物質は市販品がないため、アルキンのクロスカップリング反応鍵反応とする合成反応により合成し、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較し、立体構造を確認することにした。なお、合成法の確立は今後これらの化学物質を赤潮防除剤の開発へと展開する上でも重要である。ＨＤＴＡはアルキンのクロスカップリング反応を鍵反応として次のようなスキムで合成した。
【００３４】
まず、下記反応式に示すように、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１のメチルエステル化を行った。塩化アセチル（ＣＨ3ＣＯＣｌ）とメタノール（ＣＨ3ＯＨ）より、ＨＣｌメタノール溶液を調製し、この溶液中にヘキサデカ−４，７，１０，１３−テトラエン酸メタノール溶液（ＨＤＴＡ６．７ｍｇ）を滴下し、一晩冷蔵庫中で反応させた。溶液の色は黄色から茶褐色に変化した。反応物を５％炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、ジエチルエーテルで抽出、濃縮し、ＨＤＴＡメチルエステル（天然物由来）６．３ｍｇを得た。
【００３５】
次に、下記手順によりＨＤＴＡのメチルエステルを合成した。
まず、下記反応式に従い、２，５−オクタジイン−１−オール（ＯＤＯＨ）を合成した。ＤＭＦ２００ｍＬ中にＣｕＩ（４６．４３ｇ，０．２４３８ｍｏｌ）、ＮａＩ（３６．５４ｇ，０．２４３８ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（２５．２７ｇ，０．１８２９ｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。得られた溶液中に１−クロロ−２−ペンチン（１２．５０ｇ，０．１２１９ｍｏｌ）１、プロパルギルアルコール（ｌ６．８３ｇ，０．１２１９ｍｏｌ）２を順次滴下し、アルゴン雰囲気下、２０時間攪拌した。得られた反応溶液を、１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液８００ｍＬでクエンチした後、不溶性の物質をろ過し、ジエチルエーテルにより不溶性物質を洗浄した。ろ液をエーテルで３回抽出し、エーテル層を飽和食塩水により２回洗浄、Ｎａ2ＳＯ4による脱水を行った後、濃縮し、粗ＯＤＯＨを得た。得られた粗ＯＤＯＨを蒸留（１８ｍｍＨｇ／１１２℃）によって精製し、茶褐色の油状ＯＤＯＨ７．５２ｇ（収率５０％）３を得た。
【００３６】
1H‐NMR(300 MHz, CD2Cl2)δ：1.125 (t, 3H, J=7.5 Hz, -CH2-CH3), 2.179(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.121-2.532(br, 1H, -OH), 3.167-3.215(m, 2H, C三C-CH2- C三C), 4.270(triple doublet, 2H, -CH2-OH)
【００３７】
次に下記反応式に従い、ブロモ−２，５−オクタジイン（ＢＯＤ）の合成を行った。３口フラスコにＣＢｒ4（３０．５４ｇ，９２．１ｍｍｏｌ）入れ、ジクロロメタン１００ｍＬに溶解させたＯＤＯＨ（７．５０ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）３を加え、スターラーで攪拌した。ジクロロメタン１００ｍＬに溶解させたＰＰｈ3（２４．１６ｇ，９２．１ｍｍｏｌ）を１０℃以下で、攪拌しながら滴下した。滴下２時間後、メタノール３０ｍＬを滴下し、クエンチした。濃縮後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により高極性物質を取り除いた後、蒸留（６４℃／３００Ｐａ）による精製を行い、茶褐色の油状ＢＯＤ７．８８８４ｇ（収率６９％）４を得た。
【００３８】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.125 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.119(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.118-3.168(m, 2H, C三C-CH2- C三C), 3.878(t, 2H, -CH2-Br)
13C‐NMR(400 MHz, CD2CL2)δ：10.287(-CH2-), 12.564(-CH2-), 14.082(-CH3), 72.348(-C三C-), 75.425(-C三C-), 82.165(-C三C-), 82.742(-C三C-)
【００３９】
次に、下記反応式に従い、２，５，８−ウンデカトリイン−１−オール（ＵＤＴＯＨ）を合成した。ＤＭＦ５０ｍＬ中にＣｕＩ（８．３８ｇ，４４ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（６．６０ｇ，４４ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４．５６ｇ，３３ｍｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。得られた溶液中にＢＯＤ（４．０７ｇ，２１．９９ｍｍｏｌ）４、プロパルギルアルコール（１．２３ｇ，２２ｍｍｏｌ）２を順次滴下し、アルゴン雰囲気下、４０時間攪拌した。１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液２００ｍｌでクエンチ後、不溶性の物質をろ過し、ジエチルエーテルで不溶性物質を洗浄し、ろ液をエーテルにより３回抽出した。エーテル層を飽和食塩水で２回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、茶褐色の油状ＵＤＴＯＨ２．１４６０ｇ（収率６１％）５を得た。
【００４０】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.121 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 1.645-1.844(br, 1H, -OH), 2.174(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.138(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.210(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 4.262(t, 2H, -CH2-OH)
【００４１】
次に、下記反応式に従い、ブロモ−２，５，８−ウンデカトリイン（ＢＵＤＴ）を合成した。丸底フラスコ（１００ｍＬ）にＣＢｒ4（２．９８４７ｇ，９ｍｍｏｌ）入れ、ジクロロメタン１０ｍＬに溶解させたＵＤＴＯＨ（０．９６１３ｇ，６ｍｍｏｌ）６を加え、スターラーで攪拌した。その後、ジクロロメタン１５ｍＬに溶解させたＰＰｈ3（２．３６０６ｇ，９ｍｍｏｌ）を１０℃以下で、攪拌しながら滴下した。滴下１時間後、メタノール５ｍＬを滴下し、クエンチした。濃縮後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（乾式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）によって高極性物質を取り除いた後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式， ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→５：１）によって精製し、茶褐色の油状ＢＵＤＴ０．７８６２ｇ（収率５９％）６を得た。
【００４２】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.123 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.175(triple quartet, 2H, J=2.4 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.135(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.234(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.907(t, 2H, -CH2-Br)
【００４３】
次に、下記反応式に従い、ジメチル−２−プロパルギルマロネート（Ｄ２ＰＭ）を合成した。３口フラスコに乾燥メタノール（８４ｍＬ，約８４．１ｍｍｏｌ）とナトリウム（１．９３ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）を細かく徐々に入れスターラーで攪拌しナトリウムメチラートを生成させた後、マロン酸ジメチル（１１．１１ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）７、プロパルギルブロミド（１２．５ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）８を順次滴下し、４時間加熱還流した。反応後、放冷、濃縮し濃縮物に蒸留水、飽和食塩水を加え、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を再度塩水で洗浄し、エーテル層をＮａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。濃縮物を蒸留による精製を行ったが、途中で結晶が析出（モノアルキル体とジアルキル体が混在）した。９７〜１１２℃／２５ｍｍＨｇにて得られた５．３９ｇはモノアルキル体：ジアルキル体＝８４：１６であり、Ｄ２ＰＭとして精製せずそのまま使用した。１１２℃／２２ｍｍＨｇにて得られた５．９５ｇは、モノアルキル体：ジアルキル体＝７０：３０であり、モノアルキル体の比率が高いので再結晶（エーテル：ヘキサン＝１：１）によって結晶性のジアルキル体を取り除くことによりモノアルキル体４．１７ｇ（モノアルキル体：ジアルキル体＝９１：９）を精製し、茶褐色の油状Ｄ２ＰＭ９．５６ｇ（収率６７％）９を得た。
【００４４】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：2.028(t, 1H, J=2.6 Hz, -CH2-C三CH), 2.795(double doublet, 2H, J=2.6 Hz,7.6 Hz, , -CH2-C三CH), 3.618(t, 1H, J=7.6 Hz, C2-CH-CH2-C三CH), 3.777(s, 6H, -CO2-CH3)
【００４５】
次に、下記反応式に従い、２−（プロプ−２−イニル）マロン酸（２ＰＭＡ）を合成した。Ｄ２ＭＰ（９．５６ｇ，５６．０２ｍｍｏｌ）９を少量のエタノールに溶解させ、１００ｍＬの水に溶解させた水酸化ナトリウム（６．５６ｇ，１６９ｍｍｏｌ）水溶液も加え、１晩スターラーにより攪拌した。エタノールを濃縮した後、ジカルボン酸ナトリウム塩に１２Ｍ ＨＣｌ（１６ｍＬ，２００ｍｍｏｌ）を加えた。中和熱がおさまったら酢酸エチルで３回（１５０ｍＬ×３）抽出し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮し、白い結晶２ＰＭＡを得た。
【００４６】
次に、下記反応式に従い、２−ペンチン酸（２ＰＡ）を合成した。白い結晶２ＰＭＡが入ったナス型フラスコをオイルバスで、１６０〜１７０℃で１．５時間加熱し脱炭酸させ、ＣＯ2の発生がなくなるまで反応させた。放冷後、白い結晶２ＰＡが析出した。
【００４７】
次に、下記反応式に従い、得られた２ＰＡのメチルエステル化、即ち、メチル４−ペンチル酸エステル（Ｍ４Ｐ）を合成した。２ＰＡにメタノール（５０ｍＬ，１ｅｑ）を入れ、ＣｌＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ（１５０ｍＬ，３ｅｑ）、濃硫酸を一滴加え、８３℃付近で８時間加熱還流した。冷却後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液にてｐＨ８付近に調整し、溶媒を少量残し濃縮した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液を１００ｍＬ加え１度抽出した。その後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出し、有機層をＮａ2ＳＯ4により脱水し、濃縮した。濃縮物をシリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）によって精製し、無色の油状Ｍ４Ｐ１．００ｇ（収率１６％）１０を得た。
【００４８】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.606(s, 1H, -CH2-C三CH), 2.004(triple doublet, 2H, J=2.4 Hz,17.2 Hz, , -CH2-C三CH), 2.551(t, 2H, J=7.6 Hz, -C-CH2-CH2-C三CH), 3.710(s, 3H, -CO2-CH3)
【００４９】
次に、下記反応式に従い、メチル４，７，１０，１３−ヘキサデカテトライノエート（ＭＨＤＴＹ）を合成した。ＤＭＦ１０ｍＬ中にＣｕＩ（１１４２．７ｍｇ，６ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（８９９．３ｍｇ，６ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（６２２．０ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。その溶液中にＭ４Ｐ（２９７．９ｍｇ，２．６６ｍｍｏｌ）１０、ＢＵＤＴ（６６９．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）６を加え（ＤＭＦ５ｍＬで洗い）、アルゴン雰囲気下、２４時間攪拌した。１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液２０ｍＬでクエンチ後、不溶性の物質をろ過しジエチルエーテルにより不溶性物質を洗浄した。ろ液をエーテルで３回抽出し、エーテル層を飽和食塩水で２回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。シリカゲル吸着クロマトグラフィー（乾式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により高極性物質を取り除いた後、中圧液体クロマトグラフィー（ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：４０〜５０μｍ 球状，ＵＶ→２５４μｍ， 流速→７．５ｍＬ／ｍｉｎ，ｐｒｅｓｓｕｒｅ→０．１Ｍｐａ，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色の油状ＭＨＤＴＹ９３．７ｍｇ（収率１４％）１１を得た。
【００５０】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ： 1.119 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 1.516-1.734(br, 1H, -OH), 2.171(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.443-2.553(m, 4H, -C三C-CH2-CH2-COOCH3), 3.094-3.164 (m, 6H, C三C-CH2-C三C×3), 3.698 (s, 3H, -COOCH3)
13C‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：9.710(-C三C -CH2- C三C-), 9.734(-C三C -CH2- C三C-), 9.800(-C三C -CH2- C三C-), 12.349(-CH2-CH3), 13.826 (-CH2-CH3), 14.618(-C三C -CH2- CH2-), 33.311(-C三C -CH2- CH2-), 51.732(-COO-CH3), 72.942(-C三C-), 73.981(-C三C-), 74.245(-C三C-), 74.575(-C三C-), 74.707(-C三C-), 75.128(-C三C-), 78.617(-C三C-), 82.099 (-C三C-), 172.274(-COO-CH3)
【００５１】
次に、下記反応式に従い、ＨＤＴＡメチルエステル（ＭＨＤＴＥ）を合成した。Ｌｉｎｄｌａｒ試薬２００ｍｇ、乾燥ベンゼン６ｍＬを入れ、５０ｍＬの三角フラスコにセットし、Ｈ2で飽和し、Ｌｉｎｄｌａｒ試薬にＨ2を吸収させた。Ｈ2吸収後、三角フラスコ内にＭＨＤＴＹ溶液（ＭＨＤＴＹ：９２．７ｍｇ，０．３６４５ｍｍｏｌ１１、乾燥ベンゼン１０ｍＬ、キノリン０．２ｍＬ）を加え、再びＨ2で飽和させ、１時間スターラーで攪拌し４つの三重結合にＨ2を付加させた。Ｌｉｎｄｌａｒ試薬をろ過し、ベンゼンで洗い、２ＭＨＣｌにより２回（１５ｍＬ×２）抽出し、ＨＣｌ層をエーテルで１回抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。ＴＬＣプレート（ＴＬＣｐｌａｔｅ→シリカゲルＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０ ：Ｆ254，０．５ｍｍ）×３， 展開溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１，ＵＶ，ヨウ素にて分析）により精製し、黄色の油状ＭＨＤＴＥ７．３ｍｇ（収率８％）１２を得た。
【００５２】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：0.976 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.024-2.123(m, 2H, -CH2-COOH), 2.333-2.440(m, 4H, -C=C-CH2-CH2- or -C=C-CH2-CH3), 2.786-2.869 (m, 6H, C=C-CH2- C=C×3), 3.673 (s, 3H, -COOCH3), 5.273-5.452(m, 8H, -CH=CH-)
【００５３】
反応させた天然物由来のＨＤＴＡメチルエステルは1Ｈ‐ＮＭＲ、13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルを測定し、合成したＨＤＴＡメチルエステル（ＭＨＤＴＥ）の1Ｈ‐ＮＭＲスペクトルデータと比較し、単離したＨＤＴＡの二重結合がオールシス体であることが確認された。
【００５４】
（２）Ｍ−ＲＨＮ３−２−２の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400MHz, CDCl3)δ：0.97 (t, 3H, J = 7.6 Hz, -CH2CH3), 1.42 (quint., 2H, J = 7.6 Hz, 4-H), 1.61-1.71 (m, 2H, 3-H), 2.03-2.12 (m, 4H, -CH=CH-CH2- x 2), 2.35 (t, 2H, J = 7.6 Hz, -CH2-COOH), 2.77-2.87 (m, 6H, -CH=CH-CH2-CH=CH- x 3), 5.28-5.43 (m, 8H, -CH=CH- x 4), 6.65-7.59 (br, 1H, COOH).
13C‐NMR (75MHz, CDCl3)δ：14.4 (-CH3), 20.6 (-CH2-CH3), 24.4 (-CH2-CH2COOH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.7 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.7 (CH=CH-CH2-CH=CH), 26.9 (CH=CH-CH2-CH2-), 29.0 (CH=CH-CH2-CH2-), 33.8 (-CH2-COOH), 127.0 (-CH=CH-), 127.8 (-CH=CH-), 128.0 (-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 128.5 (-CH=CH-), 129.5(-CH=CH-), 132.0 (-CH=CH-), 178.8 (COOH).
EIMS m/z: 276 (M+, base), 247, 220, 207, 180, 161, 147, 135, 119, 108, 93, 79, 67, 55, 41.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C18H28O2: 276.2089, Found: 276.2082.
【００５５】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−２は、不飽和結合４個、炭素１８の不飽和脂肪酸オクタデカ−６，９，１２，１５−テトラデカトリエン酸（ＯＤＴＡ）と決定した。なお、この物質は前記したように、Ｋａｋｉｓａｗａらにより１９８８年オキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）のアレロパシー物質として既に単離が報告されている。
【００５６】
（３）Ｍ−ＲＨＮ３−２−３の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400MHz, CDCl3)δ：0.98 (t, 3H, J = 7.6 Hz , -CH2CH3), 1.27-1.37 (m, 8H , _CH2- x 4), 1.59-1.67 (m, 2H, -CH2-CH2-COOH), 2.01-2.11 (m , 4H , CH=CH-CH2- x 2), 2.35 (t, 2H, J = 7.2 Hz, -CH2-COOH), 2.77-2.85 (m, 4H, CH=CH-CH2-CH=CH x 2), 5.28-5.43 (m, 6H, -CH=CH- x 3), 7.26 (br. s, 1H, -COOH).
13C‐NMR (100 MHz, CDCl3): 14.3 (-CH3), 20.6 (-CH2-CH3), 24.8 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 27.2 (-CH2-CH=CH), 29.1 (-CH2-CH2COOH), 29.1 (-CH2-), 29.2 (-CH2-), 29.6 (-CH2-), 29.7 (-CH2-), 34.0 (-CH2-COOH), 127.0 (-CH=CH-), 127.6 (-CH=CH-), 128.1(-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 130.1 (-CH=CH-), 131.9 (-CH=CH-), 180.6 (COOH).
EIMS m/z: 278 (M+, base), 228, 222, 108, 95, 79, 75, 67, 55.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C18H30O2: 278.2246, Found: 278.2229.
【００５７】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−４は、不飽和結合３個、炭素１８の不飽和脂肪酸オクタデカ−９，１２，１５−トリエン酸（α−リノレン酸）と決定した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法に関し、詳しくは、低濃度で効果が現れ、環境に対する負荷が小さい赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、夏場の気温の上昇や河川からの生活排水の流入などによる富栄養化等が原因で起こるプランクトンの大量発生がよく見られる。プランクトンの大量発生による赤潮、青潮は海中の生態系に影響を及ぼし、特に毒性を持つ有害プランクトンの大量発生は養殖漁業において養殖魚、貝の大量死を引き起こし、深刻な問題となっている。
【０００３】
現在までに有害プランクトンの大量発生防止のために、様々な方法が用いられている。例えば、非特許文献１には硫酸銅などの化学物質を使用する方法、非特許文献２等には粘土を使用する方法、非特許文献３には赤潮プランクトンの堆積物である黄土（yellow loess）を使用する方法、非特許文献４および５等にはウィルスやバクテリア等の微生物による方法が知られている。
【０００４】
また、非特許文献６には、オキナワモズク（Cladosiphon akamuranus）のアレロパシー物質を単離し、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸と同定し、赤潮プランクトンに対して活性があることが報告されている。
【非特許文献１】Han, F.X. et.al., J.Env.Qual., 30, 912-919(2001)
【非特許文献２】Bae, H.M. et.al., Control of HABs by yellow loess dispersion: abstract and presentation to the 1st Annual Conference on Harmful Algal Management and Mitigation, 10-14 May 1999, Subic Bay, Philippines, pp.1-28(1999)
【非特許文献３】Choi, H.G. et.al., J. Korean Fish. Soc., 31,109-113(1998)
【非特許文献４】Lovejoy, C., et.al., J. App. Env. Microbiol., 64, 2806-2813(1998)
【非特許文献５】Imai, I., et.al., Fish. Sci., 61, 624-632(1995)
【非特許文献６】Kakisawa, H., et.al., Phytochemistry, 27, 731-735(1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１〜５記載の方法は、高コストである、取り扱いが難しく熟練者が必要である、難分解性である、環境汚染等の二次的な悪影響を与える恐れがある等の問題がある。また、非特許文献６記載の海藻類を使用した方法は、赤潮の原因となる植物プランクトンに対して強い毒性を示すことが確認されているものの、実際の赤潮プランクトンの駆除に関しては検討されていない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、低コストで、取り扱いが容易であり、かつ環境負担の小さい赤潮プランクトン防除剤およびそれを用いた赤潮プランクトンの駆除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、リボンアオサやアナアオサなどのアオサ類が、赤潮の原因となるラフィド藻や渦鞭毛藻に対して殺藻効果がある物質を含有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明の赤潮プランクトン防除剤は、アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。
【０００９】
また、本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、上記本発明の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の赤潮プランクトン防除剤は、極低濃度で効果が現れ、低コストかつ取り扱いが容易であり、また、それを用いた本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、天然素材であるアオサの成分を有効成分としており、環境に対する負荷が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を好適実施形態に基づき、詳細に説明する。
本発明の赤潮プランクトン防除剤は、アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものであるが、本発明に係る「アオサ類」とは、緑藻植物アオサ科に属する海藻アオサ類であり、リボンアオサ、アナアオサ、アミアオサ、オオアオサ、ボタンアオサなどが挙げられ、リボンアオサまたはアナアオサを好適に使用することができ、リボンアオサがより好ましい。アオサ類は１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【００１２】
本発明の赤潮プランクトン防除剤の有効成分であるアオサ類の抽出物を得るための抽出方法は特に制限されるものではなく、抽出溶媒としては、通常天然物成分の抽出に用いられるものを使用することができる。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ポリエチレングリコール、ジクロロエタン、クロロホルム等が挙げられる。エタノールおよびメタノールを好適に用いることができ、より好ましくはメタノールである。
【００１３】
得られた抽出物はそのまま使用することも可能であるが、精製したものを好適に用いることができる。精製することにより、有効成分を高濃度とすることができる。精製方法は特に制限されるものではないが、不溶物を除去後、ゲルクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を好適に用いることができる。各種クロマトグラフィーは市販のものにより、定法に従い精製することができる。なお、精製物を高純度にするためには、上記クロマトグラフィーを上記記載順に順次使用し、精製することが好ましい。
【００１４】
抽出物は、効果の観点から、不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸を含有するものが好ましく、不飽和脂肪酸がｎ−３系であるものを好適に使用することができる。特に不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸（ＯＤＴＡ）およびヘキサデカ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ−テトラエン酸（ＨＤＴＡ）ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種であるものが更に好ましい。なお、不飽和脂肪酸はナトリウム等により塩を形成していてもよい。
【００１５】
本発明の赤潮プランクトンの駆除方法は、上記本発明の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とするものであるが、防除剤の濃度、散布方法等は特に制限されるものではない。例えば、リボンアオサから抽出、精製したα−リノレン酸のナトリウム塩１０グラムを２リットルの水に溶解させた溶液を作製し、赤潮プランクトンを含む海水１トンに加える。これによりサンプル濃度は約１０ｐｐｍとなる。１〜２時間後に赤潮の原因となるラフィド藻や渦鞭毛藻に効果が現れる。また、カプセル化等、施与方法に工夫を凝らすことにより、持続性が高くより効果的な駆除方法へとなる
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
殺藻活性のスクリーニング
まず、下記表１および２に示す各種海藻の抽出物を下記方法により得た。乾燥した各種海藻１００ｍｇを５ｍＬのメタノールに室温下、一日、浸漬した後、減圧下、ろ過した。この抽出工程を三回繰り返し、得られたものを混合させた（メタノール抽出物）。残渣は乾燥させ、室温下、一日、水により抽出した（水抽出物）。得られた各種抽出物の殺藻活性をアカシオモ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）等に対する毒性試験を用い、検討した。バイオアッセイの方法としてＫａｋｉｓａｗａ等の方法を参考にした。約１週間ＥＶ培地でアカシオモを培養し、細胞密度が約０．３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬになるように海水で希釈した。この値は、Ｔｈｏｍａの血球計算盤上にて計算した。マイクロプレート（Ｉｗａｋｉ製：２４穴、径１６ｍｍ、平底）にアカシオモ培養液１ｍＬとサンプルを加え、２０℃、２６７０ｌｘで４時間培養した後、顕微鏡視野内（×４００）で２０細胞中の死細胞数をランダムに計数し、死細胞率を求めた（下記式）。
死細胞率（％）＝（サンプル区の死細胞数）／（サンプル区の計数全細胞数）×１００
得られた結果を下記表１および２に併せて示す。なお、サンプルの濃度は表１記載の結果においては、メタノール抽出液は５μＬ／ｍＬまたは１０μＬ／ｍＬ、水抽出物は２０μＬ／ｍＬまたは４０μＬ／ｍＬであり、表２記載の結果においては、メタノール抽出液は１０μＬ／ｍＬ、水抽出物は４０μＬ／ｍＬである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】
リボンアオサのメタノール抽出物の調製
７月上旬に長崎県牧島で採取したリボンアオサを水洗後、室温で風乾した（風乾重量：４．３６ｋｇ）。得られたリボンアオサを１０．５Ｌのメタノール中で、ミキサーにより細かく砕き、４日間攪拌、抽出した。４日後、抽出液とアオサ残渣をろ紙によりろ別し、抽出液はロータリーエバポレーターで濃縮、アオサ残渣には再び１２．５Ｌのメタノールを加え、２日間再抽出した。再抽出後も同様にろ別し、抽出液を濃縮し１度目の抽出物と混ぜ、抽出分（以下、「リボンアオサメタノール抽出物」という）を得た。
【００２０】
リボンアオサメタノール抽出物の液−液溶媒分配
リボンアオサメタノール抽出物（含水）を減圧下でセライトろ過した後、ヘキサン８００ｍＬ、水７００ｍＬになるようにろ液にヘキサンと水を加え、分液漏斗により分配した。水層をヘキサンにより２回（２００ｍＬ×２）再度抽出し、ヘキサン層を混ぜ濃縮し、ヘキサン抽出物（以下、「リボンアオサメタノール抽出ヘキサン可溶部」という）を得た。
【００２１】
リボンアオサメタノール抽出ヘキサン可溶部をヘキサン３５０ｍＬに溶解させ、４Ｍ塩酸で３回（１００ｍＬ×３）抽出した。ＨＣｌ層を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９付近となるように調整し、ジクロロメタンで３回（１００ｍＬ×３）抽出し、ジクロロメタン層を濃縮し、塩基性画分（以下、「Ｍ−ＲＨＢ」という）を０．０１６ｇ得た。ヘキサン層は、再度セライトろ過し、６００ｍＬになるようにフィルアップした後、５０％メタノール約６００ｍＬにより抽出し、ヘキサン層はそのまま濃縮し中性画分（以下、「Ｍ−ＲＨＮ」という）を１２．９５０ｇ得た。５０％メタノール層はメタノールを濃縮した後、酢酸エチルで３回（２００ｍＬ×３）抽出し、酢酸エチル層を濃縮し５０％メタノール可溶画分（以下、「Ｍ−ＲＨＭ」という）を０．４５７ｇ得た。
【００２２】
メタノール抽出物の殺藻活性試験
得られたＭ−ＲＨＮ、Ｍ−ＲＨＭ、Ｍ−ＲＨＢをサンプル濃度２０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し、殺藻活性値を求めた。なお、殺藻活性値は、上記スクリーニングの際と同様の方法により、死細胞率を求め、この値からコントロールの死細胞率を差し引いたものを殺藻活性値として表した（下記式）。
殺藻活性値（％）＝（4時間後のサンプル区の死細胞率）−（4時間後の対照区の死細胞率）
その結果、殺藻活性値は、Ｍ−ＲＨＮが９２％、Ｍ−ＲＨＭが９１％、Ｍ−ＲＨＢが５８％であった。
【００２３】
各種クロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮの分離および殺藻活性評価
（１）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮの分離
溶媒分配で得られた中性画分Ｍ−ＲＨＮを湿式法で作成したシリカゲルカラム（担体：２４０ｇ、関東化学株式会社製、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０、６３〜２１０μｍ、カラム：直径５．５ｃｍ、高さ３０ｃｍ、ｂｅｄ容積約３５０ｍＬ）によってクロマトグラフィーを行った。移動層として、ヘキサン：酢酸エチル＝９：１、ヘキサン：酢酸エチル＝５：１、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１００％酢酸エチルを使用し、順次１Ｌずつ流し、約１Ｌずつ分画した。溶出液をそれぞれ濃縮し、Ｍ−ＲＨＮから４つのフラクション（Ｍ−ＲＨＮ１〜４）を得た。重量はＭ−ＲＨＮ１が１．８３９６ｇ、Ｍ−ＲＨＮ２が４．２４７５ｇ、Ｍ−ＲＨＮ３が２．３４８０ｇ、Ｍ−ＲＨＮ４が０．４８９６ｇであった。濃縮途中でＭ−ＲＨＮ２は結晶となったので再結晶化し、結晶Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）を０．０２１９ｇ得た。Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）は1Ｈ−ＮＭＲにより、パルミチン酸（不飽和結合０個、炭素１６の飽和脂肪酸）と同定した。
【００２４】
（２）中性画分の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ１〜４およびＭ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）をサンプル濃度１０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し殺藻活性値を求めた。なお、コントロール、サンプル溶解溶媒としてアカシオモに対して影響が少ないメタノールを用い、その濃度はアカシオモ培養液の０．２％以下とした。その結果、殺藻活性値は、Ｍ−ＲＨＮ１が３％、Ｍ−ＲＨＮ２が１００％、Ｍ−ＲＨＮ３が１００％、Ｍ−ＲＨＮ４が６８％、Ｍ−ＲＨＮ２（ｃｒｙ）が１％であった。Ｍ−ＲＨＮ２および３が高い殺層活性を示したが、結晶が析出しなかったＭ−ＲＨＮ３の分離を以降、行うこととした。
【００２５】
（３）ＯＤＳカラムクロマトグラフィーによるＭ−ＲＨＮ３の分離
Ｍ−ＲＨＮ３（２．３５ｇ）をアセトンに溶解させ、少量のＯＤＳを加え濃縮し吸着させた後、湿式法で調整したＯＤＳカラム（担体：山善株式会社製、ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｗ−Ｍ、ｓｉｚｅ Ｍ、５０μｍ、３８ｇ）に供しクロマトグラフィーを行った。９０％メタノール溶液で溶出し、初流１００ｍＬを分取し、次のフラクションから６０ｍＬずつ分取し、８つのフラクションを得た（それぞれフラクション１〜８とする）。その後、ＯＤＳ ＴＬＣ（展開溶媒＝９０％メタノール）により分画を分析し、類似したプロフィールを示したフラクションをまとめ、濃縮した（フラクション１を濃縮したものを「Ｍ−ＲＨＮ３−１」と称し、フラクション２〜５を濃縮したものを「Ｍ−ＲＨＮ３−２」と称する）。得られた重量はＭ−ＲＨＮ３−１が３１９．４ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２が５４８．８ｍｇであった。
【００２６】
（４）Ｍ−ＲＨＮ３の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ３−１および３−２をサンプル濃度１０μｇ／ｍＬに調整し、４時間後の細胞数を計数し殺藻活性値を求めた。その結果、殺藻活性値は、ともに１００％であり、高い殺層活性がみられた。
【００２７】
（５）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＭ−ＲＨＮ３−２の分離
ＯＤＳ ＴＬＣにより複数のスポットが確認されたため、Ｍ−ＲＨＮ３−２について次の分離を行うこととした。Ｍ−ＲＨＮ３−２（５４８．８ｍｇ）を８０％アセトニトリル５ｍＬに溶解させ、そのうちの０．７５ｍＬをＨＰＬＣに供与した。即ち、約８２ｍｇのサンプルをＨＰＬＣで分離を行ったことになる。ＨＰＬＣカラムにはナカライテスク製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（２０×２５０ｍｍ）を用い、溶出溶媒には８０％アセトニトリル、流速５ｍＬ／ｍｉｎで分離した。フラクションコレクターを用い１分（５ｍＬ）ずつ、合計６６フラクションに分画した。すべてのフラクションをＯＤＳ ＴＬＣで分析し、そのプロフィールにより、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１〜３−２−４の４つの画分に精製した。得られた重量はＭ−ＲＨＮ３−２−１（フラクション１９〜２６）が１３．１ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−２（フラクション３４〜４３）が２１．４ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−３（フラクション４６〜５０）が４．８ｍｇ、Ｍ−ＲＨＮ３−２−４（フラクション５２〜６６）が２２．１ｍｇであった。
【００２８】
（６）Ｍ−ＲＨＮ３−２の殺藻活性試験
Ｍ−ＲＨＮ３−２−１〜３−２−４をサンプル濃度０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬに調整し、１時間毎に４時間後まで細胞数を計数し殺藻活性値を求め、ＬＴ50とＬＣ50値を算出した。得られた結果を、下記表３に示す。すべての画分に高い殺藻活性がみられた。
【００２９】
【表３】
【００３０】
活性物質の構造決定
それぞれの画分の化合物に関し、ＨＲ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析装置： JEOL JMS-700N）、ＦＴ−ＩＲ（赤外吸収スペクトル装置： Perkin Elmer System 2000）、13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹスペクトル（超伝導多核種磁気共鳴装置： JOEL JNM-AL400、超伝導核磁気共鳴装置： Varian UNITY plus 500）を測定し構造解析を行った。なお、Ｍ−ＲＨＮ３−２−３に関しては、ODS TLCにより非常に近い場所にいくつかのスポットがみられ複数の物質が混入していることが分かったため、これ以上の精製、機器分析による構造解析は行わなかった。
【００３１】
（１）Ｍ−ＲＨＮ３−２−１の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.97 (t, 3H, J = 7.6 Hz, -CH3), 2.08 (m, 2H, -CH2-CH3), 2.41 (m, 4H, -CH=CH-CH2-CH2-COOH), 2.80-2.85 (m, 6H, -CH=CH-CH2-CH=CH- x 3), 5.32-5.43 (m, 8H, -CH=CH- x 4), 6.10-6.33 (br, 1H, COOH).
13C‐NMR (125 MHz, CDCl3)δ：14.3 (CH3CH2-), 20.6 (CH3CH2-), 22.5 (CH=CH-CH2-), 25.5 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 33.8 (-CH2-COOH), 127.1 (_CH=CH-), 127.5 (_CH=CH-) , 127.9 (_CH=CH-), 127.9(_CH=CH-) , 128.4 (_CH=CH-), 128.6 (-CH=CH-), 129.6 (_CH=CH-), 132.1(_CH=CH-), 178.3 (-COOH ).
IR νmax (KBr) cm-1: 3200-3400 (OH), 1713 (C=O), 712 (C=C).
EIMS m/z：248 (M+), 226, 219, 205, 119, 108, 105, 93, 91, 79 (base), 67, 55.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C16H24O2: 248.1776, Found: 248.1768.
【００３２】
また、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）の測定結果は、ケミカルシフトδ：０．９７４ｐｐｍと２．０７５ｐｐｍのピークがカップリングしており、更に２．０７５ｐｐｍのメチレン（ＣＨ2）のピークは５．３２２−５．４２６ｐｐｍの二重結合のプロトンともカップリングしており末端のエチル基が二重結合に隣接していることが明らかとなった。また、２．４１０ｐｐｍ付近の２つのメチレンについても二重結合のピークとカップリングしており、二重結合のもう１端に−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨが結合していることは明らかである。
【００３３】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１は不飽和結合４個、炭素１６の不飽和脂肪酸ヘキサデカ−４，７，１０，１３−テトラエン酸（ＨＤＴＡ）であると決定された。機器分析では二重結合の幾何に関する情報は得られなかった。この物質は市販品がないため、アルキンのクロスカップリング反応鍵反応とする合成反応により合成し、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較し、立体構造を確認することにした。なお、合成法の確立は今後これらの化学物質を赤潮防除剤の開発へと展開する上でも重要である。ＨＤＴＡはアルキンのクロスカップリング反応を鍵反応として次のようなスキムで合成した。
【００３４】
まず、下記反応式に示すように、Ｍ−ＲＨＮ３−２−１のメチルエステル化を行った。塩化アセチル（ＣＨ3ＣＯＣｌ）とメタノール（ＣＨ3ＯＨ）より、ＨＣｌメタノール溶液を調製し、この溶液中にヘキサデカ−４，７，１０，１３−テトラエン酸メタノール溶液（ＨＤＴＡ６．７ｍｇ）を滴下し、一晩冷蔵庫中で反応させた。溶液の色は黄色から茶褐色に変化した。反応物を５％炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、ジエチルエーテルで抽出、濃縮し、ＨＤＴＡメチルエステル（天然物由来）６．３ｍｇを得た。
【００３５】
次に、下記手順によりＨＤＴＡのメチルエステルを合成した。
まず、下記反応式に従い、２，５−オクタジイン−１−オール（ＯＤＯＨ）を合成した。ＤＭＦ２００ｍＬ中にＣｕＩ（４６．４３ｇ，０．２４３８ｍｏｌ）、ＮａＩ（３６．５４ｇ，０．２４３８ｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（２５．２７ｇ，０．１８２９ｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。得られた溶液中に１−クロロ−２−ペンチン（１２．５０ｇ，０．１２１９ｍｏｌ）１、プロパルギルアルコール（ｌ６．８３ｇ，０．１２１９ｍｏｌ）２を順次滴下し、アルゴン雰囲気下、２０時間攪拌した。得られた反応溶液を、１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液８００ｍＬでクエンチした後、不溶性の物質をろ過し、ジエチルエーテルにより不溶性物質を洗浄した。ろ液をエーテルで３回抽出し、エーテル層を飽和食塩水により２回洗浄、Ｎａ2ＳＯ4による脱水を行った後、濃縮し、粗ＯＤＯＨを得た。得られた粗ＯＤＯＨを蒸留（１８ｍｍＨｇ／１１２℃）によって精製し、茶褐色の油状ＯＤＯＨ７．５２ｇ（収率５０％）３を得た。
【００３６】
1H‐NMR(300 MHz, CD2Cl2)δ：1.125 (t, 3H, J=7.5 Hz, -CH2-CH3), 2.179(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.121-2.532(br, 1H, -OH), 3.167-3.215(m, 2H, C三C-CH2- C三C), 4.270(triple doublet, 2H, -CH2-OH)
【００３７】
次に下記反応式に従い、ブロモ−２，５−オクタジイン（ＢＯＤ）の合成を行った。３口フラスコにＣＢｒ4（３０．５４ｇ，９２．１ｍｍｏｌ）入れ、ジクロロメタン１００ｍＬに溶解させたＯＤＯＨ（７．５０ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）３を加え、スターラーで攪拌した。ジクロロメタン１００ｍＬに溶解させたＰＰｈ3（２４．１６ｇ，９２．１ｍｍｏｌ）を１０℃以下で、攪拌しながら滴下した。滴下２時間後、メタノール３０ｍＬを滴下し、クエンチした。濃縮後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により高極性物質を取り除いた後、蒸留（６４℃／３００Ｐａ）による精製を行い、茶褐色の油状ＢＯＤ７．８８８４ｇ（収率６９％）４を得た。
【００３８】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.125 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.119(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.118-3.168(m, 2H, C三C-CH2- C三C), 3.878(t, 2H, -CH2-Br)
13C‐NMR(400 MHz, CD2CL2)δ：10.287(-CH2-), 12.564(-CH2-), 14.082(-CH3), 72.348(-C三C-), 75.425(-C三C-), 82.165(-C三C-), 82.742(-C三C-)
【００３９】
次に、下記反応式に従い、２，５，８−ウンデカトリイン−１−オール（ＵＤＴＯＨ）を合成した。ＤＭＦ５０ｍＬ中にＣｕＩ（８．３８ｇ，４４ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（６．６０ｇ，４４ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（４．５６ｇ，３３ｍｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。得られた溶液中にＢＯＤ（４．０７ｇ，２１．９９ｍｍｏｌ）４、プロパルギルアルコール（１．２３ｇ，２２ｍｍｏｌ）２を順次滴下し、アルゴン雰囲気下、４０時間攪拌した。１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液２００ｍｌでクエンチ後、不溶性の物質をろ過し、ジエチルエーテルで不溶性物質を洗浄し、ろ液をエーテルにより３回抽出した。エーテル層を飽和食塩水で２回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、茶褐色の油状ＵＤＴＯＨ２．１４６０ｇ（収率６１％）５を得た。
【００４０】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.121 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 1.645-1.844(br, 1H, -OH), 2.174(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.138(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.210(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 4.262(t, 2H, -CH2-OH)
【００４１】
次に、下記反応式に従い、ブロモ−２，５，８−ウンデカトリイン（ＢＵＤＴ）を合成した。丸底フラスコ（１００ｍＬ）にＣＢｒ4（２．９８４７ｇ，９ｍｍｏｌ）入れ、ジクロロメタン１０ｍＬに溶解させたＵＤＴＯＨ（０．９６１３ｇ，６ｍｍｏｌ）６を加え、スターラーで攪拌した。その後、ジクロロメタン１５ｍＬに溶解させたＰＰｈ3（２．３６０６ｇ，９ｍｍｏｌ）を１０℃以下で、攪拌しながら滴下した。滴下１時間後、メタノール５ｍＬを滴下し、クエンチした。濃縮後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（乾式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）によって高極性物質を取り除いた後、シリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式， ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→５：１）によって精製し、茶褐色の油状ＢＵＤＴ０．７８６２ｇ（収率５９％）６を得た。
【００４２】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.123 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.175(triple quartet, 2H, J=2.4 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 3.135(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.234(quintet, 2H, J=2.0 Hz, C三C-CH2- C三C), 3.907(t, 2H, -CH2-Br)
【００４３】
次に、下記反応式に従い、ジメチル−２−プロパルギルマロネート（Ｄ２ＰＭ）を合成した。３口フラスコに乾燥メタノール（８４ｍＬ，約８４．１ｍｍｏｌ）とナトリウム（１．９３ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）を細かく徐々に入れスターラーで攪拌しナトリウムメチラートを生成させた後、マロン酸ジメチル（１１．１１ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）７、プロパルギルブロミド（１２．５ｇ，８４．１ｍｍｏｌ）８を順次滴下し、４時間加熱還流した。反応後、放冷、濃縮し濃縮物に蒸留水、飽和食塩水を加え、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を再度塩水で洗浄し、エーテル層をＮａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。濃縮物を蒸留による精製を行ったが、途中で結晶が析出（モノアルキル体とジアルキル体が混在）した。９７〜１１２℃／２５ｍｍＨｇにて得られた５．３９ｇはモノアルキル体：ジアルキル体＝８４：１６であり、Ｄ２ＰＭとして精製せずそのまま使用した。１１２℃／２２ｍｍＨｇにて得られた５．９５ｇは、モノアルキル体：ジアルキル体＝７０：３０であり、モノアルキル体の比率が高いので再結晶（エーテル：ヘキサン＝１：１）によって結晶性のジアルキル体を取り除くことによりモノアルキル体４．１７ｇ（モノアルキル体：ジアルキル体＝９１：９）を精製し、茶褐色の油状Ｄ２ＰＭ９．５６ｇ（収率６７％）９を得た。
【００４４】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：2.028(t, 1H, J=2.6 Hz, -CH2-C三CH), 2.795(double doublet, 2H, J=2.6 Hz,7.6 Hz, , -CH2-C三CH), 3.618(t, 1H, J=7.6 Hz, C2-CH-CH2-C三CH), 3.777(s, 6H, -CO2-CH3)
【００４５】
次に、下記反応式に従い、２−（プロプ−２−イニル）マロン酸（２ＰＭＡ）を合成した。Ｄ２ＭＰ（９．５６ｇ，５６．０２ｍｍｏｌ）９を少量のエタノールに溶解させ、１００ｍＬの水に溶解させた水酸化ナトリウム（６．５６ｇ，１６９ｍｍｏｌ）水溶液も加え、１晩スターラーにより攪拌した。エタノールを濃縮した後、ジカルボン酸ナトリウム塩に１２Ｍ ＨＣｌ（１６ｍＬ，２００ｍｍｏｌ）を加えた。中和熱がおさまったら酢酸エチルで３回（１５０ｍＬ×３）抽出し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮し、白い結晶２ＰＭＡを得た。
【００４６】
次に、下記反応式に従い、２−ペンチン酸（２ＰＡ）を合成した。白い結晶２ＰＭＡが入ったナス型フラスコをオイルバスで、１６０〜１７０℃で１．５時間加熱し脱炭酸させ、ＣＯ2の発生がなくなるまで反応させた。放冷後、白い結晶２ＰＡが析出した。
【００４７】
次に、下記反応式に従い、得られた２ＰＡのメチルエステル化、即ち、メチル４−ペンチル酸エステル（Ｍ４Ｐ）を合成した。２ＰＡにメタノール（５０ｍＬ，１ｅｑ）を入れ、ＣｌＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ（１５０ｍＬ，３ｅｑ）、濃硫酸を一滴加え、８３℃付近で８時間加熱還流した。冷却後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液にてｐＨ８付近に調整し、溶媒を少量残し濃縮した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液を１００ｍＬ加え１度抽出した。その後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出し、有機層をＮａ2ＳＯ4により脱水し、濃縮した。濃縮物をシリカゲル吸着クロマトグラフィー（湿式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）によって精製し、無色の油状Ｍ４Ｐ１．００ｇ（収率１６％）１０を得た。
【００４８】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：1.606(s, 1H, -CH2-C三CH), 2.004(triple doublet, 2H, J=2.4 Hz,17.2 Hz, , -CH2-C三CH), 2.551(t, 2H, J=7.6 Hz, -C-CH2-CH2-C三CH), 3.710(s, 3H, -CO2-CH3)
【００４９】
次に、下記反応式に従い、メチル４，７，１０，１３−ヘキサデカテトライノエート（ＭＨＤＴＹ）を合成した。ＤＭＦ１０ｍＬ中にＣｕＩ（１１４２．７ｍｇ，６ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（８９９．３ｍｇ，６ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（６２２．０ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）を加え、スターラーで激しく攪拌した。その溶液中にＭ４Ｐ（２９７．９ｍｇ，２．６６ｍｍｏｌ）１０、ＢＵＤＴ（６６９．３ｍｇ，３ｍｍｏｌ）６を加え（ＤＭＦ５ｍＬで洗い）、アルゴン雰囲気下、２４時間攪拌した。１０％ＮＨ4Ｃｌ溶液２０ｍＬでクエンチ後、不溶性の物質をろ過しジエチルエーテルにより不溶性物質を洗浄した。ろ液をエーテルで３回抽出し、エーテル層を飽和食塩水で２回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。シリカゲル吸着クロマトグラフィー（乾式，ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：６３〜２１０μｍ 球状， 溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により高極性物質を取り除いた後、中圧液体クロマトグラフィー（ｐａｃｋｉｎｇ→Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０：４０〜５０μｍ 球状，ＵＶ→２５４μｍ， 流速→７．５ｍＬ／ｍｉｎ，ｐｒｅｓｓｕｒｅ→０．１Ｍｐａ，溶出溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色の油状ＭＨＤＴＹ９３．７ｍｇ（収率１４％）１１を得た。
【００５０】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ： 1.119 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 1.516-1.734(br, 1H, -OH), 2.171(triple quartet, 2H, J=2.0 Hz,7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.443-2.553(m, 4H, -C三C-CH2-CH2-COOCH3), 3.094-3.164 (m, 6H, C三C-CH2-C三C×3), 3.698 (s, 3H, -COOCH3)
13C‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：9.710(-C三C -CH2- C三C-), 9.734(-C三C -CH2- C三C-), 9.800(-C三C -CH2- C三C-), 12.349(-CH2-CH3), 13.826 (-CH2-CH3), 14.618(-C三C -CH2- CH2-), 33.311(-C三C -CH2- CH2-), 51.732(-COO-CH3), 72.942(-C三C-), 73.981(-C三C-), 74.245(-C三C-), 74.575(-C三C-), 74.707(-C三C-), 75.128(-C三C-), 78.617(-C三C-), 82.099 (-C三C-), 172.274(-COO-CH3)
【００５１】
次に、下記反応式に従い、ＨＤＴＡメチルエステル（ＭＨＤＴＥ）を合成した。Ｌｉｎｄｌａｒ試薬２００ｍｇ、乾燥ベンゼン６ｍＬを入れ、５０ｍＬの三角フラスコにセットし、Ｈ2で飽和し、Ｌｉｎｄｌａｒ試薬にＨ2を吸収させた。Ｈ2吸収後、三角フラスコ内にＭＨＤＴＹ溶液（ＭＨＤＴＹ：９２．７ｍｇ，０．３６４５ｍｍｏｌ１１、乾燥ベンゼン１０ｍＬ、キノリン０．２ｍＬ）を加え、再びＨ2で飽和させ、１時間スターラーで攪拌し４つの三重結合にＨ2を付加させた。Ｌｉｎｄｌａｒ試薬をろ過し、ベンゼンで洗い、２ＭＨＣｌにより２回（１５ｍＬ×２）抽出し、ＨＣｌ層をエーテルで１回抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4により脱水した後、濃縮した。ＴＬＣプレート（ＴＬＣｐｌａｔｅ→シリカゲルＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０ ：Ｆ254，０．５ｍｍ）×３， 展開溶媒→ヘキサン：酢酸エチル＝３：１，ＵＶ，ヨウ素にて分析）により精製し、黄色の油状ＭＨＤＴＥ７．３ｍｇ（収率８％）１２を得た。
【００５２】
1H‐NMR(400 MHz, CD2Cl2)δ：0.976 (t, 3H, J=7.6 Hz, -CH2-CH3), 2.024-2.123(m, 2H, -CH2-COOH), 2.333-2.440(m, 4H, -C=C-CH2-CH2- or -C=C-CH2-CH3), 2.786-2.869 (m, 6H, C=C-CH2- C=C×3), 3.673 (s, 3H, -COOCH3), 5.273-5.452(m, 8H, -CH=CH-)
【００５３】
反応させた天然物由来のＨＤＴＡメチルエステルは1Ｈ‐ＮＭＲ、13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルを測定し、合成したＨＤＴＡメチルエステル（ＭＨＤＴＥ）の1Ｈ‐ＮＭＲスペクトルデータと比較し、単離したＨＤＴＡの二重結合がオールシス体であることが確認された。
【００５４】
（２）Ｍ−ＲＨＮ３−２−２の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400MHz, CDCl3)δ：0.97 (t, 3H, J = 7.6 Hz, -CH2CH3), 1.42 (quint., 2H, J = 7.6 Hz, 4-H), 1.61-1.71 (m, 2H, 3-H), 2.03-2.12 (m, 4H, -CH=CH-CH2- x 2), 2.35 (t, 2H, J = 7.6 Hz, -CH2-COOH), 2.77-2.87 (m, 6H, -CH=CH-CH2-CH=CH- x 3), 5.28-5.43 (m, 8H, -CH=CH- x 4), 6.65-7.59 (br, 1H, COOH).
13C‐NMR (75MHz, CDCl3)δ：14.4 (-CH3), 20.6 (-CH2-CH3), 24.4 (-CH2-CH2COOH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.7 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.7 (CH=CH-CH2-CH=CH), 26.9 (CH=CH-CH2-CH2-), 29.0 (CH=CH-CH2-CH2-), 33.8 (-CH2-COOH), 127.0 (-CH=CH-), 127.8 (-CH=CH-), 128.0 (-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 128.5 (-CH=CH-), 129.5(-CH=CH-), 132.0 (-CH=CH-), 178.8 (COOH).
EIMS m/z: 276 (M+, base), 247, 220, 207, 180, 161, 147, 135, 119, 108, 93, 79, 67, 55, 41.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C18H28O2: 276.2089, Found: 276.2082.
【００５５】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−２は、不飽和結合４個、炭素１８の不飽和脂肪酸オクタデカ−６，９，１２，１５−テトラデカトリエン酸（ＯＤＴＡ）と決定した。なお、この物質は前記したように、Ｋａｋｉｓａｗａらにより１９８８年オキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）のアレロパシー物質として既に単離が報告されている。
【００５６】
（３）Ｍ−ＲＨＮ３−２−３の各種機器分析による構造解析
得られた結果を下記する。
1H‐NMR (400MHz, CDCl3)δ：0.98 (t, 3H, J = 7.6 Hz , -CH2CH3), 1.27-1.37 (m, 8H , _CH2- x 4), 1.59-1.67 (m, 2H, -CH2-CH2-COOH), 2.01-2.11 (m , 4H , CH=CH-CH2- x 2), 2.35 (t, 2H, J = 7.2 Hz, -CH2-COOH), 2.77-2.85 (m, 4H, CH=CH-CH2-CH=CH x 2), 5.28-5.43 (m, 6H, -CH=CH- x 3), 7.26 (br. s, 1H, -COOH).
13C‐NMR (100 MHz, CDCl3): 14.3 (-CH3), 20.6 (-CH2-CH3), 24.8 (CH=CH-CH2-CH=CH), 25.6 (CH=CH-CH2-CH=CH), 27.2 (-CH2-CH=CH), 29.1 (-CH2-CH2COOH), 29.1 (-CH2-), 29.2 (-CH2-), 29.6 (-CH2-), 29.7 (-CH2-), 34.0 (-CH2-COOH), 127.0 (-CH=CH-), 127.6 (-CH=CH-), 128.1(-CH=CH-), 128.2 (-CH=CH-), 130.1 (-CH=CH-), 131.9 (-CH=CH-), 180.6 (COOH).
EIMS m/z: 278 (M+, base), 228, 222, 108, 95, 79, 75, 67, 55.
HRMS m/z (M+): Calcd. for C18H30O2: 278.2246, Found: 278.2229.
【００５７】
以上の結果より、Ｍ−ＲＨＮ３−２−４は、不飽和結合３個、炭素１８の不飽和脂肪酸オクタデカ−９，１２，１５−トリエン酸（α−リノレン酸）と決定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とする赤潮プランクトン防除剤。
【請求項２】
前記アオサ類がリボンアオサまたはアナアオサである請求項１記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項３】
前記抽出物が不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸を含有する請求項１または２記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸がｎ−３系である請求項３記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項５】
前記不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸およびヘキサデカ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ−テトラエン酸ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種である請求項４記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項６】
請求項１〜５記載の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とする赤潮プランクトンの駆除方法。
【請求項１】
アオサ類の抽出物を有効成分とすることを特徴とする赤潮プランクトン防除剤。
【請求項２】
前記アオサ類がリボンアオサまたはアナアオサである請求項１記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項３】
前記抽出物が不飽和度２以上、炭素数１６以上の不飽和脂肪酸を含有する請求項１または２記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸がｎ−３系である請求項３記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項５】
前記不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、オクタデカ−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ−テトラエン酸およびヘキサデカ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ−テトラエン酸ならびにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種である請求項４記載の赤潮プランクトン防除剤。
【請求項６】
請求項１〜５記載の赤潮プランクトン防除剤を使用することを特徴とする赤潮プランクトンの駆除方法。
【公開番号】特開２００７−１４５７３７（Ｐ２００７−１４５７３７Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４００６１（Ｐ２００５−３４００６１）
【出願日】平成１７年１１月２５日（２００５．１１．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年５月２８日 第８回マリンバイオテクノロジー学会大会大会実行委員会発行の「第８回マリンバイオテクノロジー学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２５日（２００５．１１．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年５月２８日 第８回マリンバイオテクノロジー学会大会大会実行委員会発行の「第８回マリンバイオテクノロジー学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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