連続的ｉｎｖｉｔｒｏ進化
【課題】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、進化した（突然変異化された）ｍＲＮＡ分子のライブラリーの作製と同様な態様で、複製の間合成されたｍＲＮＡ分子内に突然変異を導入することを見出す。これらの突然変異化ｍＲＮＡ分子は、挿入及び欠失並びに点突然変異のためサイズにおいて様々であり、相当するタンパク質が、例えばリボソーム、ｍＲＮＡ、及びde novo合成されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む３成分複合体上にディスプレーされるように、in vitroで翻訳され得る。リボソームディスプレー法によって生産されたタンパク質の大きな割合が、正確にホールディングされた機能的な形態を有する条件を同定する。
【解決手段】従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規なＣＩＶＥ法の提供を可能にした。
【解決手段】従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規なＣＩＶＥ法の提供を可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳系において標的結合タンパク質を突然変異させ選択する方法、及びこの方法における使用のためのポリヌクレオチド構築物に関する。本発明の方法は、診断上及び治療上の有用性を有する分子の生産に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のin vitro進化は、周知の遺伝子配列に突然変異を導入し、突然変異体配列のライブラリーを生産すること、該配列を翻訳し、突然変異体タンパク質を生産すること、次いで所望の特性を有する突然変異体タンパク質を選択することを含む。この方法は、改良された診断上及び治療上の有用性を有するタンパク質を生産する可能性を有する。しかしながら不幸にも、この方法の可能性は、突然変異体及びライブラリーの生産のために現在利用可能な方法における不完全性によって制限されている。
【０００３】
例えば、独特の個々の遺伝子及びそれらがコードするタンパク質の大きなライブラリー（例えば１０10のライブラリーサイズを超えるもの）の生産は、翻訳効率の制限のため、ファージディスプレー系では困難であると理解されている。更なる欠点は、ファージディスプレー系を利用する方法（図１）が、突然変異、増幅、選択及び更なる突然変異のいくつかの連続的な工程を必要とする点である(Irving等, 1996; Krebber等, 1995; Stemmer, 1994; Winter等, 1994)。
【０００４】
選択されたタンパク質のアフィニティー成熟、特に抗体のアフィニティー成熟のために今日使用されている方法の例が、表１に示される。全てのこれらの方法は、遺伝子の突然変異、引き続きコード化タンパク質のディスプレーと選択に依存する。選択された特定の突然変異体は、生じた遺伝子ライブラリーにおける多様性を決定する。in vitroストラテジー（表１）は、ファージディスプレーライブラリーを形成する際の突然変異化遺伝子のトランスフォーメーションの効率によって厳しく制限される。一つのin vivoサイクリング法（表１のＮｏ．１）において、大腸菌突然変異細胞は、組換え抗体遺伝子の突然変異のためのビヒクルとなった。突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有する大腸菌突然変異化細胞ＭＵＴＤ５−ＦＩＴ(Irving等, 1996)は、Ｓ−３０抽出物のソースとして使用でき、それ故プルーフリーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ中への突然変異の導入を促す。しかしながら、突然変異速度は、必要とされる速度と比較して低い。例えば、２０のアミノ酸の完全な順列を有する２０の残基を突然変異化するために、１×１０26のライブラリーサイズを必要とし、それは現在利用可能なファージディスプレー方法体系では非常に困難な作業である。
【０００５】
【表１】
【０００６】
それ故、継続的に進化（突然変異）され、所望の遺伝子が選択される突然変異体の複雑なライブラリーのin vitro生産を可能にする選択法は、タンパク質のアフィニティー突然変異（増大）の改良された手段を生ずるであろう。
【０００７】
in vitro結合転写及び翻訳系 興味ある遺伝子を含むＤＮＡプラスミドは、Ｔ７プロモーターのようなコントロールエレメントによって制御される場合、転写のための鋳型として機能できることが周知である。結合セルフリー系が、ｍＲＮＡを同時に転写し、ｍＲＮＡをペプチドに翻訳するために使用できることも周知である(Baranov等, 1993; Kudilicki等, 1992; Kolosov等, 1992; Morozov等, 1993; Ryabova等, 1989,1994; Spirin 1990; US 5556769; US 5643768; He及びTaussig 1997)。セルフリー系のソースは一般的に、原核生物について大腸菌Ｓ−３０抽出物(Mattheakis 1994; Zubay 1973)であり、真核生物についてウサギ網状赤血球溶解物である。転写／翻訳結合系は、原核生物セルフリー抽出物(Mattheakis等 1994)及び真核生物セルフリー抽出物(US 5492817; US 5665563)を含むものが報告されており(US 5492817; US 5665563)、それらは有効な転写及び翻訳のための異なる必要性を有する。さらに、原核生物及び真核生物系における翻訳化タンパク質の正確なホールディングのための必要性が存在する。原核生物について、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）及びシャペロンが必要とされ得る。一般的に原核生物においては、翻訳化タンパク質は、リボソームからの放出の後ホールディングされる；しかしながら、リボソームに付着した（つながれた）新たに翻訳されたタンパク質の正確なホールディングのため、Ｃ末端アンカーが必要であろう。アンカーは、新たに翻訳されたタンパク質ドメインをリボソームに結合するためのポリペプチドスペーサーである。該アンカーは、イムノグロブリン定常領域のような完全なタンパク質ドメインでもよい。これとは全く対照的に、真核生物系においては、タンパク質は合成と同時にホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャペロンの添加は必要ない。しかしながらアンカーは、リボソームに結合した（つながれた）新たに翻訳されたタンパク質から空間を空けるため、及び該タンパク質の正確なホールディングのため、真核生物においても有用であろう。
【０００８】
セルフリー結合系においてde novoで合成されたポリペプチドは、例えば停止コドンの不存在下では該ポリペプチドはリボソームから放出されないため、リボソームの表面にディスプレーされている。ｍＲＮＡリボソームタンパク質複合体は、選択の目的のために使用できる。この系は、ファージディスプレー及び選択の方法を模倣し、図１に示される。リボソーム上での最適なディスプレーのために必要とされる特性は、Hanes及びPluckthun (1997)によって記載されている。これらの特性は、停止コドンの除去を含む。しかしながら停止コドンの除去は、ｓｓｒＡ ｔＲＮＡ様構造によってコードされる新たに翻訳されたタンパク質のＣ末端にプロテアーゼ感受性部位の付加を引き起こす。これは、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチドを含ませることによって防止できる(Keiler等 1996)。
【０００９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ Ｑβバクテリオファージは、大腸菌ファージＱβの一本鎖ゲノムを複製するために有効なレプリカーゼを有するＲＮＡファージである（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、レプリカーゼまたはシンセターゼと称する）。Ｑβレプリカーゼはエラーを生じがちであり、１０3−１０4塩基対とin vivoで計算されたＲＮＡ中に突然変異を導入する。Ｑβレプリカーゼの正確性は低く、強力に偏ってその鋳型を複製する(Rohde等 1995)。これらの教示は、長期間に亘る複製により、所望のタンパク質の合成に適さない突然変異された鎖の蓄積を導くことを示す。＋及び−鎖の両者が、レプリカーゼの鋳型として機能する；しかしながら、ウイルスのゲノムについて、＋鎖はＱβレプリカーゼによって結合され、相補的な鎖（−）の鋳型として使用される。ＲＮＡの複製が生じるために、レプリカーゼは、十分に定義されている特異的なＲＮＡ配列／構造エレメントを必要とする(Brown及びGold 1995; Brown及びGold 1996)。組換えＲＮＡの０．１４フェムトグラムを含む反応により、３０分で１２９ナノグラムが生産される(Lizardi等 1988)。
【００１０】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、適合可能な鋳型上に対数増幅的にＲＮＡを複製することが周知である。適合可能な鋳型は、ＭＤＶ−１ ＲＮＡに示されたような二次構造を有するＲＮＡ分子である(Nishihara,T等 1983)。この点で、ベクターは、複製のために必要とされる配列及び二次構造（ＭＤＶ−１ ＲＮＡ）を有し、ＱβゲノムＲＮＡと同様な態様でin vitroで複製されるため、増幅可能なｍＲＮＡを構成するものとして記載されている。ＭＤＶ−１ ＲＮＡ配列（Ｑβレプリカーゼに対する天然で生じる鋳型）は、ＱβレプリカーゼによるＲＮＡの増幅と適合可能な数多くの天然の鋳型の一つである(US-4786600)；それは、組み込まれたｍＲＮＡの配列の安定性を増大する、ほとんどのファージＲＮＡの末端に存在する構造と同様な末端のｔＲＮＡ様構造を有する。プラスミドの直線化により、該プラスミドは、さらなる組換えＭＤＶ−１ ＲＮＡの合成のための鋳型として機能するようになる(Lizardi等 1988)。本分野での教示により、外来遺伝子のＱβレプリカーゼによる長期化した複製は、ＭＤＶ−１ ＲＮＡのような天然で生じる鋳型の一つ内のＲＮＡとして組み込まれることを必要とすることが示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US 5492817
【特許文献２】US 5665563
【特許文献３】US 5492817
【特許文献４】US 5665563
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Irving等, 1996; Krebber等, 1995; Stemmer, 1994; Winter等, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者は、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、進化した（突然変異化された）ｍＲＮＡ分子のライブラリーの作製と同様な態様で、複製の間合成されたｍＲＮＡ分子内に突然変異を導入することを見出した。これらの突然変異化ｍＲＮＡ分子は、挿入及び欠失並びに点突然変異のためサイズにおいて様々であり、相当するタンパク質が、例えばリボソーム、ｍＲＮＡ、及びde novo合成されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む３成分複合体上にディスプレーされるように、in vitroで翻訳され得る。本発明者はまた、リボソームディスプレー法によって生産されたタンパク質の大きな割合が、正確にホールディングされた機能的な形態を有する条件を同定した。さらに本発明者は、ファージＱβレプリカーゼが、ｍＲＮＡ内に突然変異を取り込んでＲＮＡ鋳型を増幅するための真核生物結合転写／翻訳系において機能できる条件を同定した。
【００１４】
本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的なin vitro進化（ＣＩＶＥ）法を導く複製／突然変異／翻訳の連続した周期的な方法に存在する。
【００１５】
このＣＩＶＥ法は、従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、第一の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する：（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；及び（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程。
第二の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；
（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択された複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以上繰り返す工程；
（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程。
【００１７】
工程（ｄ）で得られたｍＲＮＡは、翻訳系から精製または単離することなく工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。
【００１８】
一つの実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが工程（ｃ）で得られた複合体に付着する間、工程（ａ）を経てリサイクルされる。別の実施態様として、ｍＲＮＡは、リサイクルの前に工程（ｃ）で得られた複合体から放出される。ｍＲＮＡは、いずれかの適切な機構によって複合体から放出されてもよい。該機構には、インキュベーションの温度を上昇させること、または複合体を完全なままにするために使用される化合物の濃度を変化することが含まれ得る。
【００１９】
本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一または複数の区画を設けた反応容器において同時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる。
【００２０】
本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一の反応容器において同時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる。
【００２１】
第二の特徴点の別の実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは単離される。単離されたｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに転写されてもよい。生じたｃＤＮＡを、コード化タンパク質の発現に適したベクター内にクローン化してもよい。
【００２２】
いずれかの適切な複合体が、翻訳したタンパク質をそれをコードするｍＲＮＡに結合するために使用されてもよい。例えば該複合体は、タンパク質ディスプレーのために適したミトコンドリアまたは他の細胞オルガネラであってもよい。リボソーム複合体は好ましくは、少なくとも一つのリボソーム、少なくとも一つのｍＲＮＡ分子、及び少なくとも一つの翻訳したポリペプチドを含む。この複合体は、翻訳したタンパク質の「リボソームディスプレー」を可能にする。翻訳に引き続いて３成分のリボソーム複合体を完全なままに維持するために適した条件は周知である。例えば、コードする配列の３’末端からの翻訳停止コドンの欠失または省略により、完全な３成分リボソーム複合体の維持が生ずる。スパルソマイシンまたは類似化合物は、リボソーム複合体の解離を防止するために加えられてもよい。マグネシウム塩の特異的な濃度を維持すること、及びＧＴＰ濃度を下げることもまた、完全なリボソーム複合体の維持に寄与するであろう。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様は、リサイクルバッチプロセス、好ましくは連続的フロープロセスにおける結合した複製−翻訳−選択を含むことは、当業者に予測されるであろう（例えば図４参照）。翻訳または転写−翻訳のための連続したフロー装置及び方法は、本分野で周知であり、材料の組成または反応器の温度のような条件を変化させることによって、本発明の方法に適用できる。いくつかの系及びその操作方法が、Spirin. A.S. (1991)にレビューされており、それは参考としてここに取り込まれる。さらなる関連文献には、Spirin等 (1988); Rattat等 (1990); Baranov等 (1989); Ryabova等 (1989);及びKigawa等 (1991)が含まれ、その全てが参考としてここに取り込まれる。
【００２４】
用語、「翻訳系」は、リボソーム、可溶性酵素、トランスファーＲＮＡ、並びに外因性ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質を合成可能なエネルギー再生産系を含む混合物を意味する。
【００２５】
好ましい実施態様として、該翻訳系は、セルフリー翻訳系である。この実施態様に従った翻訳は、いずれかの特定のセルフリー翻訳系に制限されない。該系は、真核生物、原核生物またはその組み合わせから由来してもよい、粗抽出物、部分的に精製された抽出物または高度に精製された抽出物が使用されてもよい。合成構成成分は、天然の構成成分に置換されてもよい。数多くの代替物が利用可能であり、文献に記載されている。例えば、Spirin (1990B)を参照。この文献は、参考としてここに取り込まれる。セルフリー翻訳系はまた、商業的に入手可能である。本発明の一つの実施態様として、セルフリー翻訳系は、大腸菌からのＳ−３０抽出物を利用する。別の実施態様として、セルフリー翻訳系は、網状赤血球溶解物、好ましくはウサギ網状赤血球溶解物を利用する。
【００２６】
該翻訳系はまた、タンパク質ホールディングを増大する化合物を含んでもよい。この目的のために、本発明者は、リボソームディスプレー法によって生産されるタンパク質の高い割合がホールディングされた機能的な形態で生産される条件を同定した。これらの条件は、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の濃度で翻訳系に対して還元及び／または酸化したグルタチオンの添加を含む。好ましくは該翻訳系は、２ｍＭから５ｍＭの間の濃度で酸化したグルタチオンを含む。好ましくは翻訳系は、約２ｍＭの濃度で酸化したグルタチオンを、及び０．５ｍＭから５ｍＭの間の濃度で還元したグルタチオンを含む。
【００２７】
本発明の別の実施態様として、該翻訳系は、細胞または細胞内の区画より成るまたはそれらを含む。該細胞は、真核生物または原核生物から由来してもよい。
【００２８】
本分野で周知の数多くのＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ（またはレプリカーゼ若しくはＲＮＡシンセターゼとして周知である）が単離されており、本発明の方法における使用に適している。これらの例として、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、植物ウイルスＲＮＡポリメラーゼ及び動物ウイルスＲＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明の好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、比較的高い頻度で複製されたＲＮＡ分子内に突然変異を導入し、好ましくはその頻度は、１０4塩基対に少なくとも１個の突然変異、より好ましくは１０3塩基対に一つの突然変異である。より好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ型肝炎ＲｄＲｐ、水疱性口内炎ウイルスＲｄＲｐ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ(Deiman等 (1997))、並びにＲＮＡバクテリオファージファイ６ ＲＮＡ依存性ＲＮＡ(Qjala及びBamford (1995)より成る群から選択される。最も好ましくは、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβポリメラーゼである。
【００２９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、精製タンパク質として転写／翻訳系に含まれてもよい。別法として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、本発明の第一または第二の特徴点の方法の工程（ａ）と同時に、若しくは工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と同時に発現される、遺伝子鋳型の形態で含まれてもよい。
【００３０】
さらなる好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、標的分子と融合または会合されてもよい。理論的に根拠付けられることを望まないが、ある場合、翻訳タンパク質の結合親和性は、ｍＲＮＡ分子に対するレプリカーゼの親和性より高くてもよい。標的分子／ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ融合構築物に対する突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の結合は、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼの近傍にｍＲＮＡを配置するであろう。これは、興味あるｍＲＮＡ分子の好ましいさらなる複製及び突然変異を生ずるであろう。
【００３１】
各種のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製されるＲＮＡ鋳型が本分野で周知であり、本発明における使用に適した複製可能なｍＲＮＡを生産するためのベクターとして機能できる。Ｑβレプリカーゼに対する周知の鋳型は、ＲＱ１３５ ＲＮＡ、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアントＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ、及びＲＱ１２０ ＲＮＡを含む。これもＱβレプリカーゼによって複製されるＱβ ＲＮＡは、シストロンを含み、該シストロンの生産物がタンパク質合成を調節するため、好ましくはない。好ましいベクターは、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ及びＲＱ１３５ ＲＮＡを含む。両者の配列が印刷されている。Kramer等 (1978)（ＭＤＶ−１ ＲＮＡ）及びMunishkin等 (1991)（ＲＱ１３５）を参照。これら両者が参考としてここに取り込まれる。それらは、周知のＤＮＡ合成法によってＤＮＡ形態に作製される。
【００３２】
本発明の第一の特徴点の好ましい実施態様として、該方法はさらに、複製可能なｍＲＮＡを生産するためにＤＮＡ構築物を転写する工程を含む。組換えｍＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドの形態で存在し得るが、そうである必要はない。プラスミドと、遺伝子配列が組み込まれている複製可能なＲＮＡをコードする配列の末端または近傍で該プラスミドを切断するエンドヌクレアーゼを使用することが好ましい。直線化は個別に実施でき、または転写−複製−翻訳と結びつけることができる。しかしながら好ましくは、直線状ＤＮＡは、多くの利用可能なＤＮＡ複製のいずれか一つ、最も好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産される。いくつかの系について、エンドヌクレアーゼを含まない非直線化プラスミドが好ましい。適切なプラスミドは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによる組換えプラスミドのin vitro転写によってＲＮＡを生産するための方法に関する、Melton等 (1984a,b)の以下の教示に従って調製されてもよい。例えばMelton等 (1984a)及びMelton等 (1984b)を参照。これらの文献は参考としてここに取り込まれる。転写は、複製可能なＲＮＡをコードする配列の第一のヌクレオチドで開始するのが好ましい。
【００３３】
さらに好ましい実施態様として、転写は、本発明の第一または第二の特徴点に従った方法の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で、単一または複数の区画の反応容器若しくは反応器中で同時に実施される。
【００３４】
標的分子は、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスのような、興味あるいずれかの化合物（またはその断片）であってもよい。
【００３５】
好ましい実施態様として、標的分子はマトリックスに結合され、複合体（翻訳タンパク質をディスプレーする）を含む反応混合物に加えられる。標的分子は、例えば磁性ビーズのようなマトリックス上に皮膜されてもよい。磁性ビーズは、Dynabeadであってもよい。翻訳タンパク質は、標的分子に競合的に結合すると予測されるであろう。より高い親和性を有するタンパク質は好ましくは、より低い親和性分子を交換するであろう。かくして、本発明の方法は、興味ある標的分子に対して改良された結合親和性を示す突然変異タンパク質の選択を可能にする。
【００３６】
本発明者はまた、ＭＤＶ−１鋳型のような天然に存在するレプリカーゼの鋳型から由来する最小の配列が、Ｑβレプリカーゼの結合に対して十分であるという驚くべき発見をなした。この発見に基づいて、複製可能なｍＲＮＡの転写に適した新規な構築物が開発された。
【００３７】
従って、本発明の第一及び第二の特徴点の好ましい実施態様として、該方法はさらに、複製可能なｍＲＮＡ分子を生じるためにＤＮＡ構築物を転写することを含み、該ＤＮＡ構築物は以下のものを含む；
（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；並びに（ｉｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置するステム−ループ構造。
【００３８】
第三の特徴点として、本発明は以下のものを含むＤＮＡ構築物を提供する；
（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列。
【００３９】
ここで使用される用語、「レプリカーゼ結合配列」は、レプリカーゼ（特にレプリカーゼホロ酵素）によって認識される「ループ様」二次構造のようなポリヌクレオチド配列を指す。好ましくは、レプリカーゼ結合配列は、レプリカーゼ分子に対する全長ＲＮＡ鋳型を含まない。例えば好ましくは、用語、「レプリカーゼ結合配列」は、全長ＭＤＶ−１ ＲＮＡまたはＲＱ１３５ ＲＮＡ鋳型を含まない。
【００４０】
好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列は、１５から５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは２０から４０ヌクレオチドの長さである。好ましくはレプリカーゼ結合配列は、Ｑβレプリカーゼによって認識される。
【００４１】
さらに好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列の配列は、以下の配列を含むまたは以下の配列より成る：GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG。
【００４２】
さらに好ましい実施態様として、第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流に含まれる。
【００４３】
いずれかの適したリボソーム結合部位が、本発明の構築物において使用されてもよい。原核生物及び真核生物リボソーム結合配列は、原核生物または真核生物系の何れが使用されるかに依存して取り込まれてもよい。好ましい原核生物リボソーム結合部位は、ＭＳ２ウイルスのものである。
【００４４】
さらに好ましい実施態様として、ＤＮＡ構築物は、翻訳開始配列を含む。好ましくは翻訳開始配列はＡＴＧである。
【００４５】
いずれかの興味ある遺伝子が、ＤＮＡ構築物のクローニング部位内に挿入できることは、当業者によって予測される。好ましい実施態様として、興味ある遺伝子は、（ｉ）標的結合タンパク質のライブラリー、または（ｉｉ）単一の標的結合タンパク質についてコードするヌクレオチド配列であり、ここで該標的はタンパク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、抗体、ホルモン、ウイルス、または他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体のいずれかを含む。
【００４６】
アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味ある遺伝子にフレーム中の３’に融合されてもよい。アンカードメインは、該分子の正確なホールディング及びその同型結合パートナーの接近が可能なリボソームからの十分な距離に、翻訳されたタンパク質を興味ある遺伝子から離すのに十分な長さを有するいずれかのポリペプチド配列であってもよい。好ましくは該ポリペプチドは、複製可能な鋳型のものを模倣した相当するＲＮＡ二次構造を有する。好ましい実施態様として、該ポリペプチドはイムノグロブリン定常ドメインである。好ましくは該ポリペプチドは、定常軽鎖ドメインである。定常軽鎖ドメインは、マウス抗体１Ｃ３の第一の定常軽鎖領域であってもよい。好ましくは定常ドメインは、図５ａに示される配列によってコードされる。別法として該ポリペプチドは、ヒトＩｇＭ定常ドメインであってもよい。別の実施態様として、アンカーは、以下のものより成る群から選択されてもよい：オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ、または任意に翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列が引き続くポリヒスチジン６タグ。翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列は、ＴＡＡまたはＴＡＧであってもよい。本発明のいくつかの構築物において、放出因子による認識、引き続きタンパク質放出を妨げるために、停止コドンは存在しない。これらの構築物において、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチド配列は、引き続く３’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げるために加えられてもよい。
【００４７】
第四の特徴点として、本発明は、本発明の第二の特徴点に従ったＤＮＡ構築物を含む複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキットを提供する。
【００４８】
好ましい実施態様として、該キットは、以下のものから選択される少なくとも一つの他のさらなる構成成分を含む：（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ、またはＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型；
（ｉｉ）セルフリー翻訳系；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ；
（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに（ｖ）制限酵素。
【００４９】
本明細書を通じて、もし文脈が他のものを必要としなければ、用語「含む」またはその変異型「含む」若しくは「含んでいる」は、述べられているエレメントまたは数字またはエレメントの群または数字類を含むものを企図するように理解されるが、いずれかの他のエレメントまたは数字またはエレメントの群または数字類を排除するものとは解されない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）法におけるａ）ファージディスプレー及びｂ）リボソームディスプレーのためのアフィニティー成熟サイクルを示す図である。
【図２】ＣＩＶＥのための興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列）を含む発現ユニットを図式的に表す図である。発現ユニットは、転写開始配列（Ｔ７プロモーター）に沿って上流のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳開始部位（ＡＴＧ）を有する、興味ある遺伝子を含む。該構築物はまた、下流のスペーサー配列を含む。
【図３】in vitroアフィニティー成熟の連続的サイクリング性質を示すＣＩＶＥ法を図式的に表す図である。該方法は、連続的に進化（成熟）し、所望の遺伝子が選択される突然変異体の複合体ライブラリーのin vitro生産を可能にする：本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）を導く再複製／突然変異／翻訳の連続的サイクリング工程中に存在する。
【図４】ＣＩＶＥ法に適した反応容器を表す図である。
【図５Ａ】ａ）マウスモノクローナル抗体１Ｃ３の第一の定常軽鎖領域；ｂ）ヒトＩｇＭ抗体の第三の定常重鎖領域；ｃ）抗グリコホリン（１Ｃ３）ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す図である。
【図５Ｂ】ｄ）抗Ｂ型肝炎表面抗原（４Ｃ２）ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す図である。
【図６Ａ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｂ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｃ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｄ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図７】in vitro転写及び翻訳に使用される鋳型のＰＣＲ合成のために使用される、（ａ）ｐＧＣ０３８ＣＬ（抗グリコホリンｓｃＦｖ（１Ｃ３）及びマウス定常軽鎖領域を含む）及び（ｂ）ｐＧＣ ＣＨ（ヒト定常重鎖領域を含む）のプラスミドを図式的に表す図である。これらのプラスミドは、下流スペーサー配列を提供するために使用された。ほとんどの場合、興味ある遺伝子は、ｐＧＣ ＣＨのＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ部位にクローン化された。
【図８】ステムループ構造を形成するＲＮＡ断片の配列を示す図である。
【図９】ウサギ網状赤血球に結合した転写／翻訳系における、Ｑβレプリカーゼ及びＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現のための真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を示す図である。
【図１０】Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１１】in vitro結合転写／翻訳反応用の鋳型ＤＮＡを生産するためのＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す図である。鋳型の生産及びパンニング後の生産物の回収の両者のために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。配列は数字が付され、５’から３’で記載されている。
【図１２】ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系におけるＱβレプリカーゼの発現を示す図である。
【図１３】抗ＧｌｙＡ １Ｃ３タンパク質合成の結合転写／翻訳に対するＱβレプリカーゼの効果を示す図である。
【図１４】結合転写／翻訳においてＱβレプリカーゼを含ませる効果を示す図である。選択された突然変異体の配列中の突然変異の表を示す。この図は、６のランダムなクローンから得られた配列の２８０のヌクレオチド中に見出される突然変異の位置及びタイプを示す。これらは、Ｑβレプリカーゼの不存在下、精製Ｑβの存在下、またはプラスミドｐＣＤＮＡＱβの存在下のいずれかで、転写及び翻訳の後のＧｌｙＡ皮膜Dynabeadに対する抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖのパンニングから回収された。「検出突然変異」のカラムにおいて、「なし」は、突然変異が見出されないことを意味する：突然変異はＡｘＢの形態で示され、Ａは野生型ヌクレオチドであり、ｘは配列中の位置数であり（図５ｃに示される）、そしてＢは観察された突然変異化ヌクレオチドである。
【図１５】結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系：デンシトメータースキャニングにおいてＱβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ転写産物の複製を示す図である。
【図１６】Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からのＱβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異のＤＮＡ配列分析を示す図である。
【図１７】Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むベクターを示す図である。
【図１８】抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ ＲＮＡの複製に対する、結合転写／翻訳系において発現されるＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの効果を示す図である。エチジウムブロマイドで染色しスキャンしたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明の好ましい態様として、タンパク質の連続的一工程進化のための系は、以下の構成成分を含む：
【００５２】
発現ユニット： 本発明における使用のための好ましい発現ユニットは、図２に表される。この発現ユニットは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するために、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターのようなコントロールエレメントを５’非翻訳領域内に有する３’及び５’非翻訳領域を含む。コンセンサスＤＮＡ配列は、そのポリメラーゼに特異的である：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーター配列は、TAATACGACTCACTATAGGGAGAである。Ｔ７プロモーター配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合配列として機能し得る（即ち、それはＱβレプリカーゼに対する結合配列として機能し得る）。しかしながら好ましくは、該構築物は、プロモーター部位に対する３’側に５’非翻訳領域中に位置するＱβレプリカーゼの結合のためのステムループ構造を含む。好ましくは第二のステムループ構造は、コード配列の下流に含まれ、好ましくは発現ユニットの翻訳終結部位の３’側で約１ｋｂである。好ましいステムループ構造の配列は、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGである。
【００５３】
リボソーム結合部位は、プロモーターの下流の次の領域である。いくつかのリボソーム結合部位のいずれかが、この位置で使用できる。原核生物及び真核生物リボソーム結合配列が、真核生物または原核生物結合系の何れが使用されるかに依存して取り込まれ得る。一つの好ましい原核生物結合部位は、ＭＳ２ウイルスのものである。翻訳開始配列ＡＴＧが好ましくは使用され、それはアミノ酸メチオニンをコードする；これは、in vitro翻訳の開始部位である。
【００５４】
興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列）
興味ある遺伝子が、標準的な遺伝学的方法のいずれかによって非翻訳領域に結合され得ることは、当業者に予測されるであろう。興味ある遺伝子は、遺伝子３’末端までにオープンリーディングフレーム（停止コドンではない）を有するいずれかのヌクレオチド配列を含み、さらに本発明の目的のため、アンカー（スペーシング）配列の末端を含む。
【００５５】
好ましい実施態様として、興味ある遺伝子は、ｉ）標的結合タンパク質のライブラリー、またはｉｉ）単一の標的結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、この場合標的は、タンパク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、抗体、ホルモン、ウイルス、または他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体のいずれかを含む。アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味ある遺伝子の３’及びフレーム中に融合されてもよい。アンカードメインは、分子の正確なホールディング及び同型結合パートナーへの接近を可能にするためにリボソームから十分な距離で、興味ある遺伝子から翻訳されたタンパク質を離す十分な長さの一連のポリペプチド配列のいずれかであってもよい。好ましい実施態様として、アンカーは、オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ：DYKDDDDKまたはヒト若しくはネズミ抗体定常ドメインのいずれかをコードする配列である。好ましくはアンカーは、定常ドメイン１Ｃ３のようなマウスモノクローナル抗体から由来する定常ドメインである（図５ａ参照）。さらに好ましいアンカーは、ヒトＩｇＭ抗体から由来する定常領域である（図５ｂ参照）。
【００５６】
アンカー配列には、例えばTAAまたはTAGといった翻訳終止（停止）ヌクレオチド配列が引き続くであろう。しかしながら、ある構成においては、放出因子による認識及び引き続くタンパク質の放出を妨げるために、停止コドンが存在しないことが考慮され得る。これらにおいて、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチド配列が、引き続く３’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げるために加えられる。スパルソマイシン、他の類似化合物の添加または温度の減少もまた、ｍＲＮＡ及びde novo合成タンパク質からのリボソームの放出を妨げる。
【００５７】
発現システム 発現ユニットのための転写／複製／突然変異は、ウサギ網状赤血球溶解物系(He及びTaussig, 1997)または大腸菌Ｓ−３０転写翻訳混合物(Mattheakis等, 1994; Zubay, 1997)の使用によって達成され得る。例えば、Ｔ７プロモーターを使用したＤＮＡ発現ユニット（上述詳述）を、製造者の説明書に従ってＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで処理する。生じたＲＮＡライブラリーは、コード化遺伝子の多様性を反映する。複製及び突然変異のために添加されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、複製のために加えられ、突然変異が精製酵素として提供され、または別法としてＴ７若しくはＳＰ６のようなプロモーターの制御の下でプラスミド内に別個の発現系としてコードされる。好ましい酵素はＱβレプリカーゼであるが、同様な性質を有するいずれかの酵素が使用されてもよい。この工程は、Ｑβプロテアーゼによる突然変異を通じたライブラリーの複雑性の増大を提供する。真核生物細胞におけるｍＲＮＡ合成のため、ｍＲＮＡは好ましくはキャップされ、それはジグアノシン三リン酸の過剰量の添加によって達成される；しかしながら、商業的な供給者Promega及びNovagenから得たウサギ網状赤血球系は、キャップした化合物の添加を不要にする系中の構成成分を有する。転写／翻訳混合物または結合系は、いずれかの細胞から抽出でき、最も一般的に使用されるものは、コムギ麦芽、ＨｅＬａ細胞のような哺乳動物細胞、大腸菌及びウサギ網状赤血球である。結合転写翻訳系は、大腸菌突然変異細胞ＭＵＴＤ５−ＦＩＴ(Irving等, 1996)から抽出でき、それは突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有し、それ故プルーフリーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ内に導入されるさらなるランダムな突然変異を可能にする。一つの好ましい転写／翻訳混合物は、ウサギ網状赤血球溶解物である。結合系に対するＧＳＳＧの添加は、ディスプレーされたタンパク質の正確なホールディングを増大し、それ故カウンターレセプターまたは抗原に対する後の結合及び選択を促進する。
【００５８】
Ｑβレプリカーゼによる突然変異 Ｑβレプリカーゼは、ランダムな突然変異を取り込んだ高レベルのｍＲＮＡの複製及び生産のために系中に含まれる（図３参照）。複数コピーの一本鎖ＲＮＡ鋳型が、Ｑβレプリカーゼによる突然変異で単一の標準的構成成分に複製される；しかしながら、両方の鎖は、等温条件の下で鋳型として同等に効果的である。
【００５９】
本分野の教示により、Ｑβのようなファージから由来する全長ＲＮＡ中に存在する複合体並びに二次及び三次構造が、タンパク質開始部位へのリボソームの接近を制限することが示されている。しかしながら我々は、より小さいＲＮＡ配列が、レプリカーゼの結合に適しており、それ故全長鋳型の代わりに使用できることを見出した。好ましい配列は、シュードノットとして周知である小さな合成ＲＮＡ(Brown及びGold 1995;1996)であり、それはＱβレプリカーゼによる増幅と適合的である。本発明の文脈において、シュードノットの使用は、ＲＮＡ及びそれに融合した配列のＱβレプリカーゼ増幅に必要かつ十分な結合部位を維持する一方で、タンパク質開始部位へのリボソームの接近の問題を解消できる。
【００６０】
翻訳及びリボソームディスプレー ウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ麦芽のような真核生物、または大腸菌のような原核生物のいずれかであるいくつかのin vitro翻訳法が周知である。これらは商業的に入手可能であり、または周知の印刷された方法によって生産できる。突然変異化ｍＲＮＡの翻訳は、好ましくはde novo合成タンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡを含む３成分リボソーム複合体中のリボソームに結合した、タンパク質分子のライブラリーを生ずる(Mattheakis等, 1994)。タンパク質及びリボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げるためのいくつかの方法が周知である。例えばスパルソマイシンまたは類似化合物が加えられてもよい；スパルソマイシンは、研究された全ての生物においてペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、リボソームとの不活性な複合体の形成によって機能するであろう(Ghee等, 1996)。高濃度のマグネシウム塩を維持すること、及びＧＴＰレベルを低下することもまた、リボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体を維持するのに寄与するであろう；発現ユニットの構造に関しては、上述した。３成分リボソーム複合体を維持する好ましい手段は、コード配列の末端の翻訳停止コドンの省略である。
【００６１】
さらに、二つの系における分子の正確なホールディングのための好ましい必要性が存在する。原核生物については、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）及びシャペロンが、正確なホールディングを確実にするＣ末端アンカードメインと並んで使用され得る。後者は、原核生物タンパク質がホールディングの前にリボソームから放出されるために必要とされ(Ryabova等, 1997)、それ故ペプチドがリボソームに結合される場合に、全体のタンパク質はリボソームから距離を取ることが必要とされる。これとは対照的に、真核生物系においては、タンパク質は合成されながらホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャペロンを加える必要はない；しかしながら我々は、ＧＳＳＧの特定の範囲の濃度の添加が、３成分リボソーム複合体上での正確にホールディングされたタンパク質の増大したディスプレーによるライブラリー選択に対して有益であることを見出した。
【００６２】
選択及び競合的結合 ＲＮＡ複製の連続的な周により、翻訳によってタンパク質のライブラリーを生産するＲＮＡ分子のライブラリーが生じる。標的分子結合マトリックス（例えば抗原皮膜Dynabead）が、３成分リボソーム複合体を捕獲するために反応に加えられる。ライブラリー中の個々のメンバーは、マトリックス(Dynabead)上に固定化された抗原に対して競合する。より高い親和性を有する分子は、より低い親和性分子に置換するであろう。該方法の終結時に、マトリックス(Dynabead)に結合した複合体（ｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質）は回収され得る。ｃＤＮＡが複合体中のｍＲＮＡから合成され、コード化遺伝子配列からの高レベル発現に適したベクター中にクローン化される。
【００６３】
リサイクリングフリーシステム(Spirin等, 1988)は、基質（リボソームを含む）の供給を確実にするための一定温度のチェンバー及び試薬並びに必須でない物質の除去を使用する連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）システムに適用できるであろう。以下のものを含む全てのＣＩＶＥの工程は、このチェンバー内で生じ得る：結合転写及び翻訳、突然変異化複製、３成分リボソーム複合体の表面へのde novo合成タンパク質のディスプレー、及び最高の親和性の結合を有するものを選択するための抗原に対する３成分リボソーム複合体上のディスプレーされたタンパク質の競合的結合（図４）。非結合試薬、物質及びディスプレーされたタンパク質は、洗浄緩衝液ですすぐことによって除去され、結合３成分リボソーム複合体は、温度の上昇及び緩衝液からのマグネシウムの削除によって解離する。この次に、洗浄緩衝液工程を除いて上述の全ての工程を実施するために必要な全ての試薬の添加が行われる。スパルソマイシンまたは類似化合物の添加のようなタンパク質及びリボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げる方法が利用可能であり、マグネシウム塩の特異的濃度の維持及びＧＴＰレベルの低下は、反応温度の減少または停止コドンの削除と並んでリボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体の維持に寄与するであろう。連続的フロー性能と組み合わせた温度が制御される容器を使用することによって、選択されたリボソームから得たｍＲＮＡは、リボソームから解離でき、スパルソマイシン、Ｍｇ等のようなリボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体の維持に重要な試薬の濃度を変化させて、さらに複製、突然変異、及び翻訳されるであろう。図４は、上記装置の設計を表す。
【００６４】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参考としてより十分に記載されるであろう。
【実施例】
【００６５】
実施例１
組換えＱβレプリカーゼ：発現と精製クローニング及び発現 Ｑβレプリカーゼコード配列を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するin vitroでの転写による感染性ＲＮＡの調製を可能にするようにデザインされた、つまりファージＱβのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡコピーである、ｐＢＲ３２２ベース構築物であるプラスミドｐＢＲＴ７ＱβからＰＣＲによって増幅した(Barrera等, 1993に略記されている）。ｐＢＲＴ７Ｑβの配列は、図６に示されている。ヌクレオチド番号１は、Ｑβレプリカーゼセンス鎖の第一のヌクレオチドである。Ｑβレプリカーゼを増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切断のための部位をコードし、その配列は図１１に示されている。
【００６６】
ＰＣＲ産物を、この目的のために利用可能な商業的な製品のいずれか一つを使用して精製した（例えばBresatec)。精製ＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を使用して、ベクターｐＧＣ（図７）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位内にクローン化した。ベクターｐＧＣ及びそれからの組換えタンパク質の発現は、文献に記載されており、参考としてここに取り込まれる(Coia等, 1996)。ＰＣＲ増幅及びベクターへのＱβレプリカーゼ遺伝子のクローニング及び酵素の発現のための大腸菌へのトランスフォーメーションの方法は、培養培地に１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって誘導されるｐＧＣ中のＱβレプリカーゼ遺伝子の発現というように、当業者に周知である。
【００６７】
プロモーターＰＬでのｐＢＲ３２２ベースベクター中のＱβレプリカーゼ遺伝子の発現及び精製は、以下に詳述されるように実施した。rep14 Billeter株を、Christof Biebricher, Max Planck, Gottingenによって入手した。該大腸菌株を、２％栄養ブロス、１．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、０．４％グリセリン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン中の２０ｌ発酵器において、３０℃で良好なエアレーションで光学密度２（６６０ｎＭ）に生育させた。温度を３７℃に上昇させた後、エアレーションを５時間継続した。細胞を氷上で凍結し、遠心分離によって回収した（約１８０ｇの湿潤細胞重量が得られる）。
【００６８】
Ｑβレプリカーゼの精製緩衝液Ａ：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、１ｍＭメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン。
緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ．Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン。
５０ｇの回収された大腸菌を、１００ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで、高速ブレンダーでホモゲナイズした。リゾチーム及びＥＤＴＡを、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び０．５ｍＭの最終濃度で加え、該溶液を０℃で３０分穏やかに攪拌した。１２ｍｌの８％デオキシコール酸ナトリウム、０．２４ｍｌのフェニルスルホニルフルオリド（プロパノール−２中に２０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌのバシトラシン（１０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌの０．１Ｍベンズアミジン、３．３ｍｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を加え、溶液を１０ｍＭの最終濃度にＭｇＣｌ2で調節した。高い粘性を高速度でブレンドすることによって減少した。固体のＮａＣｌを、０．５Ｍの最終濃度で加え、４．８ｍｌの０．３％ポリエチレンイミド（ｐＨ８）を攪拌しながら加えた。０℃で２０分の攪拌の後、懸濁液を１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離した（ＧＳＡローター）。上清を５当量のＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．７）で希釈した後、１ｍＭメルカプトエタノール、１００ｍｌＤＥＡＥセルローススラリー(緩衝液Ａで平衡化されたWhatman DE52）を加え、０℃で２０分ゆっくりと攪拌した。攪拌しないで４０分のインキュベーションの後、上清を沈殿物からデキャントし、廃棄した。沈殿物を緩衝液Ａ中に懸濁し、１ｃｍの直径のガラスカラムに注ぎ、４００ｍｌのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで洗浄し、２５０ｍｌの緩衝液Ａ＋１８０ｍＭＮａＣｌで溶出し、分画を回収した。該分画を、次の結合アッセイで使用するＱβレプリカーゼの存在についてアッセイした。
【００６９】
酵素配置アッセイ：Ｑβレプリカーゼに対するビオチニル化ＲＮＡの結合 これは、正に荷電された膜に維持されている酵素に結合するビオチンラベル化ＲＮＡに依存する複製酵素を検出するように開発された非放射性活性アッセイである：一方で、同じ条件の下で遊離ビオチンラベル化ＲＮＡは、膜に維持されない。ＤＮＡ及びＲＮＡは、製造者の説明書に従ってソラレン−ビオチン(Ambion)でラベルされた。次いでラベル化ＲＮＡを、Ｑβレプリカーゼの配置を検出するために以下のアッセイに示されたようにカラム溶出物（サンプル分画）に加えた。
【００７０】
以下の物質をエッペンドルフチューブ中で混合した：１０μｌ カラム溶出分画１０μｌ ０．５Ｍ １２０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１０μｌ ２ｍＭ ＡＴＰ１０μｌ ５ｍＭ ＡＴＰ１０μｌ 〜１００ｎｇ／ｍｌ ソラレン−ビオチンラベル化プローブＲＮＡ５０μｌ 水 反応混合物を３７℃で１分インキュベーションした。
反応混合物を、ナイロン膜、例えばハイボンドＮにドットブロットし（酵素Ｑβレプリカーゼに結合したＲＮＡまたはＤＮＡのみが、膜に維持されるであろう）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、自動セットでStratalinker中でナイロン膜にＵＶ架橋した。BrightStar Biodetectキットを、ナイロン膜上に付着したビオチニル化核酸の検出のために使用した。図１２は、ＤＥ５２カラムからの溶出分画のアッセイを示す。
【００７１】
活性分画をプールし、一当量の緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａ＋０．１Ｍ ＮａＣｌに平衡化されたDEAE-Sepharose FFの３５ｍｌカラムに適用した。酵素を、緩衝液Ａ中の０．１−０．４Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。活性分画をプールし、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）の添加により酵素を沈降し、遠心分離によって回収し、４ｍｌの緩衝液Ｂに溶解した。
【００７２】
酵素を、伝導率が緩衝液Ｂ＋０．２Ｍ ＮａＣｌのもの未満になるまで希釈し、緩衝液Ｂで平衡化されたFractogel EMD SO3の１００ｍｌカラムに適用し、緩衝液Ｂ中の０．２−０．８Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（５００ｍｌで２回）で溶出した。約０．６５Ｍ ＮａＣｌで溶出された活性ピークをプールし、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ3（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）で沈降し、遠心分離によって回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ＋５０％グリセリン中に溶解した。溶液を−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
以下の工程は、Sumper & Luce (1975)に従ってスモールスケールで実施された。４ｍｇのＱβレプリカーゼを、緩衝液Ａ（希釈され塩を除去するように透析された）で平衡化されたQAE-Sephadex〜A-25の１．６×１４．５ｃｍカラムに適用し、緩衝液Ａ中の０．０５−０．２５Ｍ ＮａＣｌの２×２００ｍｌ勾配で溶出した。二つのきれいに分離されたコアとホロ酵素のピークをプールし、緩衝液Ａで１：１に希釈し、QAE-Sephadexカラムに適用した。コアについて２ｍｌ、ホロ酵素について６ｍｌをそれぞれ緩衝液Ａ＋５０％グリセリンで洗浄し、レプリカーゼを緩衝液Ａ＋５０％グリセリン＋０．２Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4で濃縮形態に溶出した。活性分画を−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡによる装置のコンタミネーションを避けるように注意を払った。
【００７４】
実施例２
真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中へのＱβレプリカーゼのクローニング Ｑβレプリカーゼコード配列を、真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図９）中にクローン化し、ｐＣＤＮＡＱβと名付けられたベクターを生産した。このベクターを、結合転写／翻訳系及び付随する標的ＲＮＡの複製／突然変異におけるin situでのＱβレプリカーゼの発現のために使用した。真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニングのためのＱβレプリカーゼのＰＣＲ増幅でのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、以下のものであった：
No.5352 5'TCTGCAGAATTCGCCGCCACCATGTCTAAGACAGCATCTTCG
No.5350 5'TTTATAATCTGCGGCCGCTTACGCCTCGTGTAGAGACGC
【００７５】
Ｑβレプリカーゼｂサブユニットのコード配列を、標準的な分子生物学的方法によってｐＣＤＮＡ３．１中にクローン化した(Sambrook等, 1989)。クローン化配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系におけるＱβレプリカーゼの発現に引き続き、結合転写翻訳キット(Promega及びNovagen)の商業的供給者並びにTranscend(Promega)の供給者によって示唆されたように、標準的転写／翻訳反応におけるde novo合成Ｑβレプリカーゼ内に取り込まれたビオチニル化リシン(TRANSCEND, Promega)の検出を実施した。結合反応のインキュベーション工程の完成時に、２０μｌの反応物を、２ｍｌの１０×ＳＤＳサンプル緩衝液で９０℃に加熱し、サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。これに引き続きウエスタンブロッティングを実施し、de novo合成ビオチニル化Ｑβレプリカーゼバンドを、TRANSCENDキット検出試薬で検出した。この発現の結果が、図１２のゲルのスキャンに示されており、Ｑβレプリカーゼがゲルの正確なサイズでビオチニル化バンドによって示されるように合成されていることが確認できる。
【００７６】
次いで我々は、１Ｃ３鋳型で結合転写／翻訳反応を実施したが、同じ反応でｐｃＤＮＡ３．１からＱβレプリカーゼを発現した。発現ベクターｐＣＤＮＡＱβからin situで合成されたＱβレプリカーゼは、０．５ｍＭ塩化マグネシウムの存在下で結合系で１Ｃ３ ｓｃＦｖの増大した合成を生じた：これは上述のようにビオチニル化リシンの取り込みによって測定された（図１２ｂ）。塩化マグネシウムの存在は、転写／翻訳因子に対するＱβレプリカーゼの活性の依存性をゆるめることが以前に示されている。
【００７７】
実施例３
転写のためのＤＮＡ鋳型のＰＣＲによる構築 ＤＮＡ配列を、ＦＴＳ−１熱シークエンサー(Corbett Research)、ＰＥ２４００(PerkinElmer)またはRobocylcer勾配９６(Stratagene)のいずれかを使用して、製造者の説明書に従ってＴａｑ、Ｔｔｈ、Ｔｆｌ、ＰｗｏまたはＰｆｕポリメラーゼを用いて、標準的かつ十分に記載された方法（特異的にデザインされたオリゴヌクレオチドプライマー、スプライスオーバーラップ伸長、制限酵素切断等を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって増幅した。使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのリストは、図１１に示されている。生産物をBresaClean(Bresa)を使用してゲル精製し、または結合転写及び翻訳反応に直接使用した。
【００７８】
ＤＮＡ配列を、構築物の３’末端に伸長を提供する、ベクターｐＧＣ０３８ＣＬ（図７ａ）またはｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）のいずれか中にクローン化されている開始鋳型から増幅した。この伸長は、マウスモノクローナル（１Ｃ３；配列は図５ａ）から由来する定常領域、またはヒトＩｇＭ抗体（配列は図５ｂ）から由来する定常領域のいずれかであった。増幅のために使用される正方向の（センス）プライマー（抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖについてN5266；抗ＨｅｐＢ ｓｃＦｖについてN5517またはN5384, N5344及びN5343）は、転写開始部位、並びに翻訳開始部位及びリボソーム結合部位を提供した。逆方向の（アンチセンス）プライマー（マウス定常領域についてN5267；ヒト定常領域についてN5385）は、ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を会合したままにするために、停止コドンを含まなかった。正方向及び逆方向のプリマーの両者は、生産断片のクローニングを可能にする制限酵素部位（特異的にそれぞれＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ）を提供した。
【００７９】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するいくつかのプロモーター配列のいずれかが、転写に向けるために使用され得る；しかしながら、以下の配列が好ましい二つのものであった（これらは翻訳開始配列を含む：以下参照）：
ａ） GCGCGAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACCGCCATGGCC
ｂ） GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGCC
【００８０】
これらの配列は、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、結合転写／翻訳系の二つの選択的なフォーマットでＲＮＡ転写産物を生産させるように向けた。
【００８１】
リボソーム結合部位をコードする配列は周知であり、グリコホリンに結合するｓｃＦｖ（１Ｃ３；図５ｃ）またはＢ型肝炎表面抗原を結合するｓｃＦｖ（４Ｃ２；図５ｄ）のいずれかをコードするリボソームディスプレーに対する興味ある分子の配列のいずれか一つの上流で、鋳型中に含まれている。同じ配列は、リボソームディスプレーのために興味あるいずれかの他の配列の上流で、鋳型中に含まれている（例えばＣＴＬＡ−４ベースライブラリー配列）。
【００８２】
実施例４
ウサギ網状赤血球溶解物セルフリー系における結合転写／翻訳及びリボソームディスプレー 転写及び翻訳を、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２ｍＭメチオニン及び３ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むＴＮＴ Ｔ７結合転写／翻訳系(Promega)を使用して、Siliconized Rnase-フリー０．５ｍｌチューブ(Ambion)で実施し（以下の実施例６参照）、混合物を６０℃で９０分インキュベーションした。いくつかの反応においては、１０ｍＭまでの還元グルタチオンもまた加えた。Ｑβポリメラーゼを含む反応において、混合物はまた、０．５ｍＭの最終濃度まで塩化マグネシウムを含んだ。転写及び翻訳の後、混合物をＰＢＳで希釈し、ＤＮアーゼＩで処理していずれかの残存する開始ＤＮＡ鋳型を除去した。これは、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＮａＣｌ及びＤＮアーゼＩ(Promega)の添加、引き続き３０℃でさらに２０分のインキュベーションにより達成された。
【００８３】
実施例５
Dynabeadを使用する抗原に対するリボソーム３成分複合体ディスプレータンパク質の選択 トシル活性化Magneticビーズ(Dynal)を、製造者の説明書に従ってグリコホリンＡ（ＧｌｙＡ；Sigma)、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢ ＳＡ；BiosPacific, Emeryville, CA USA)またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma)に結合した。ストレプタビジン磁性ビーズを使用する場合、これらは製造者の説明書に従って、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)を使用してビオチニル化されている抗原（上述）に結合された（製造者の説明書に従って）。
【００８４】
特異的に結合するｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を選択するために、２−３μｌの抗原結合（トシル活性化またはストレプタビジン皮膜化）磁性ビーズを、最終翻訳混合物に加え、ビーズの鎮静を避けるために穏やかに攪拌しながら室温で９０分プレートシェイカー(Raytek Instruments)に配置した。磁性粒子回収器(Dynal)を使用してビーズを回収し、これらを、１％Ｔｗｅｅｎ及び５ｍＭ酢酸マグネシウムを含む冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で３回洗浄した。次いでビーズを冷却滅菌水で１回洗浄し、最後に１０μｌの滅菌水に懸濁した。
【００８５】
選択された複合体からのｃＤＮＡの合成のため、２μｌの最終ビーズ懸濁液を、製造者の説明書に従ってAccess RT-PCRシステム(Promega)またはTitan One-チューブRT-PCRシステム(Boehringer Mannheim)のいずれかを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。この反応に使用されるプライマーは、オリジナル正方向（センス）プライマー（開始鋳型ＤＮＡ；抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖについてN5266；抗ＨｅｐＢ ｓｃＦｖについてN5517またはN5384, N5344及びN5343を生産するために使用される）、並びにオリジナルプライマーの上流の逆方向（アンチセンス）プライマー（マウス定常領域構築物についてN5268及びN5269；ヒト定常領域構築物についてN5386及びN5387）を含んだ。ある場合、より短いプライマー（抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖ定常軽鎖領域構築物についてN5941及びN5942）を、パンニングされたＲＮＡ鋳型を回収するために使用した。
【００８６】
選択のさらなるサイクルのため、このＤＮＡをゲル精製し（ある場合単純に希釈し）、開始ＤＮＡ鋳型を生産するためにオリジナルのＰＣＲに存在している正方向及び逆方向のプライマーを使用して、さらなるＰＣＲにおいて取り込ませた。次いでこの新たな鋳型は、適切な開始部位を含み、第一の選択中の鋳型と同じ長さを有するために、上述のようにさらなる選択において使用することができた。
【００８７】
上述の方法が、特異的な分子を選択するために使用できることを示すために、ＧｌｙＡに特異的に結合するマウス定常軽鎖領域に融合された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、Ｔ７転写開始部位及びリボソーム結合部位の付加を可能にするプライマーを使用して増幅した。この鋳型（Ｔ７−ｓｃＦｖ）を、上述のような結合転写／翻訳反応で使用し、次いで三つに分割し、ＨｅｐＢ ＳＡ、ＧｌｙＡまたはＢＳＡ結合磁性ビーズのそれぞれと混合した。ビーズを洗浄し（上述の通り）、回収されたｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を、ｃＤＮＡの合成のために使用した。この実験の結果は、各レーンにおいて正確なサイズを有する生産物の存在を示した。ＨｅｐＢ ＳＡ及びＢＳＡレーンで観察された非特異的結合は、おそらく翻訳の間で合成された生産物の凝集のためであろう。網状赤血球溶解物を使用して合成された生産物の一定割合のみが正確にホールディングされ活性形態であることは、他者によって観察されている。この問題は、以下の実施例６で説明する。
【００８８】
この実験から得られたＧｌｙＡ特異的生産物をゲル精製し、さらなる周の選択のためのよりたくさんの鋳型を合成するためにＰＣＲによって再増幅した。第二の周のパンニングにより、ＧｌｙＡ結合磁性ビーズでプローブされたサンプル中に特異的な生産物が優勢に示された。このことは、第二の周の選択によって、回収された生産物がＧｌｙＡに特異的であることを示した。
【００８９】
実施例６
酸化及び／または還元グルタチオンを加える効果 in vitro転写及び翻訳の間でより高い割合の正確にホールディングされた生産物を誘導する試みにおいて、各種の濃度の還元または酸化グルタチオンのそれぞれを反応混合物に加えた。これらの反応に使用される鋳型は、抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖであり（上述の通り）、選択をＧｌｙＡ結合磁性ビーズを使用して実施した。この実験は、回収された生産物の量が、５ｍＭまで増大する濃度の酸化グルタチオンで増加することを示した。１０ｍＭまでのさらなる増加は、回収された生産物の収率に有害な効果を有した。約２ｍＭの酸化グルタチオンの濃度が、ほとんどの転写及び翻訳において含まれた。
【００９０】
すでに２ｍＭの酸化グルタチオンを含む反応に対して５ｍＭ及び１０ｍＭの還元グルタチオンのさらなる添加が、５ｍＭのグルタチオンの添加によりコントロールパンニングに対してＧｌｙＡパンニングから回収された生産物の増大した量を導くディスプレーされた抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖのより適したホールディングを生ずるようであることを示したことが、後者の結果により明らかにされた。還元グルタチオンの濃度を０．５ｍＭまでさらに減少することは、同様な効果を示した。
【００９１】
実施例７
リボソーム上での突然変異ｖ−ドメイン（ＣＴＬＡ−４）ライブラリーのディスプレー リボソームディスプレーが、ポリペプチドライブラリーから結合エレメントを選択するために使用できることを示すため、ＣＴＬＡ４突然変異体のライブラリーを、定常重鎖ドメインの付加が可能であるプラスミドｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）にライゲートし、次いでこのライブラリーをプライマーN5659とN5385を使用するＰＣＲによって増幅した（図１１）。プライマーN5659を、必要な上流転写及び翻訳開始配列を加えるために使用した。次いでこのＰＣＲ ＤＮＡを、実施例４に記載された方法を使用する結合セルフリー翻訳系における転写及び翻訳のための鋳型として使用した。突然変異体ＣＴＬＡリボソーム複合体の結合を示すために、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢＳＡ）、グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）皮膜Dynabeadを使用してパンニングを実施した。次いで結合複合体に付着したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって回収した。パンニング、選択及び回収のために使用された方法は、上記された（実施例５）。
【００９２】
ＣＴＬＡ４ベース突然変異体のサイズにほぼ相当する生産物を回収し、それはＣＴＬＡ４ライブラリーが、ＨＢＳＡ、ＧｌｙＡ及びＢＳＡを特異的に結合するタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを示した。これらの生産物を、可溶性産物のＤＮＡシークエンシング及び発現のために、ベクターｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）内にクローン化した。標準法を使用するシークエンシング(BigDye Teminator Cycle Sequencing; PE Applied Biosystems CA)は、ＣＴＬＡ４ベース特異的インサートが存在することを示した。さらに、ＥＬＩＳＡを使用する実験は、特異的な反応性タンパク質が、組換え培養物によって発現されていることを示した。これらのアッセイにおいて、ＧｌｙＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニング及びＧｌｙＡ皮膜プレートを使用したＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって単離された組換え体が、ＢＳＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニングによって単離された同様に試験された組換え体より、強いシグナルを与えた。
【００９３】
実施例８
結合転写及び翻訳中にＱβレプリカーゼを含ませる効果 生産物の収率の増大、及びin vitro翻訳の間の生産物中の突然変異の速度の増大の両者を試みるために、Ｑβレプリカーゼ（二つの形態のいずれか）を、反応混合物に加えた。レプリカーゼは、精製レプリカーゼタンパク質、または結合転写／翻訳反応の間に同時に合成できるＴ７転写プロモーター（ｐＣＤＮＡＱβ）の制御の下の遺伝子鋳型のそれぞれとして含まれた。この反応のために使用される鋳型は、再び抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖ（上述の通り）であり、選択はＧｌｙＡ結合磁性ビーズを使用して実施された。これらの実験は、回収されたＧｌｙＡ反応性生産物の量が、精製Ｑβレプリカーゼの付加により増大し（Ｑβレプリカーゼを含まないコントロールに対して）、より少ない量でＱβレプリカーゼコードゲノム鋳型（ｐＣＤＮＡＱβ）の付加により増大することを示した。
【００９４】
突然変異がｓｃＦｖ配列中に挿入されているかどうかを測定するために、各レーンから得た主生産物をゲル単離し、精製した。ＤＮＡをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで切断し、同時に切断したｐＧＣベクターにライゲートし、標準的なプロトコールを使用して大腸菌にトランスフォームした。ＤＮＡを各シリーズから得た組換え体から単離し、各シリーズから得た６のランダムなクローンを、標準的な方法を使用してＤＮＡシークエンシングにかけた(BigDye Terminator Cycle Sequencing; PE Applied Biosystems CA)。各レーンに対しおよそ２８０塩基対をシークエンスし、図１４はこれらの配列中の突然変異中の数と位置を示す。この実験は、Ｑβレプリカーゼの存在下での転写及び翻訳の後、増大した数の突然変異の導入を示した（使用された形態のそれぞれで）。
【００９５】
実施例９
人工的Ｑβ配列の添加 Ｑβレプリカーゼ活性の効率を増大する試みにおいて、特異的Ｑβ結合部位を、ＰＣＲによって抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖ鋳型の５’および３’末端の両者に加えた。この新しい鋳型（プライマーN5904及びN5910（センス）並びにN5909（アンチセンス）で増幅された；図１１）を、精製Ｑβレプリカーゼタンパク質、または結合転写／翻訳反応の間同時に合成できるＴ７転写プロモーターの制御の下での遺伝子鋳型としてのいずれかで、Ｑβレプリカーゼを含む結合転写／翻訳反応において使用した。ＨｅｐＢ、ＧｌｙＡまたはＢＳＡ結合磁性ビーズを使用する選択を実施し、生産物をＲＴ−ＰＣＲの後に回収した。人工Ｑβステムループ配列の存在は、（ｉ）結合転写、翻訳及び選択に対して負の影響を有さず、（ｉｉ）ほとんどの場合選択の後のＲＴ−ＰＣＲによって回収された生産物の量を増大した。
【００９６】
実施例１０
結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系における、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ転写産物の複製 リボソームディスプレーのためのＴ７−１Ｃ３及びＴ７−４Ｃ２ ｓｃＦｖ鋳型を、実施例３に記載されたように構築し、以下の条件の下で結合転写／翻訳にかけた。標準的な結合転写／翻訳反応を、Ｑβレプリカーゼの添加によって修飾した（実施例１に記載されたように精製されたもの）。標準的な２０μｌ反応物において、２０μｇ／ｍｌの酵素の１ｍｌを加えた。以前に我々は、結合系において抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖと抗Ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦｖの複製に対するＱβレプリカーゼの効果を比較し、１ｍｌのこのサンプルが最適な複製を提供することを観察した。塩化マグネシウムを、０．５ｍＭの最終濃度で加え、これは転写／翻訳因子に対する必要性を減少することが印刷されたレポートに示されている。反応を３７℃で２時間継続させた。３０℃で２０分での４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＮａＣｌ中のＤＮＡアーゼＩ切断によってＤＮＡ鋳型を除去した後、複製転写産物をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＤＮＡアーゼＩ及び他のタンパク質を除去するために、標準的なフェノール抽出を使用した。サンプルをエタノール沈降し、ＲＮＡ沈降物をＲＮＡアーゼを含まない水中に溶解した。各鋳型に特異的なプライマー（実施例３参照）を使用してＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、ＰＣＲ生成物（ＤＮＡ）をアガロースゲル電気泳動によって比較した。ＤＮＡバンドを、エチジウムブロマイドで染色することによって顕視化した。アガロースゲルを、ゲルプロ分析器の商業的なソフトウェアーでデジタル化したイメージをスキャンすることによってデンシトメトリーにかけた。図１３は、アガロースゲルのデンシトメータートレースを示し、これから精製Ｑβレプリカーゼを含むサンプル中で、生産された鋳型の量の増大が存在することが示される。
【００９７】
実施例１１
Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からの、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異；Ｑβレプリカーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製の間で転写産物を突然変異する。
上述の実施例において記載された結合転写／翻訳反応に、Ｑβレプリカーゼ精製酵素を補い、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写された抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ ＲＮＡを複製し突然変異した。転写／複製／突然変異／翻訳インキュベーションに引き続き、サンプルをＤＮＡアーゼＩで処理し、この酵素を実施例１０に記載されたように除去した。次いで精製ＲＮＡを、実施例３に記載された反応において抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖ特異的プライマーと共に、ＲＴ−ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。これらの反応で使用された熱安定性ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用される高性能vent, pfuポリメラーゼ酵素の一つである。ＰＣＲ反応生産物を、上述の商業的に入手可能なキットの一つで精製し、精製ＤＮＡを、商業的に入手可能なプラスミドpCRscriptにライゲートし、標準的な分子生物学的方法を使用してコンピーテント大腸菌XL1Blue細胞にトランスフォームした。トランスフォーメーション反応物を、X-galを含むＹＴアガープレート上に配置した。一晩のインキュベーションの後、コロニー（複数クローニング部位にＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを有する大腸菌）を拾い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＴブロスの５ｍｌ中で３７℃で一晩生育させた。ＤＮＡを、製造者の説明書に従って、商業的なキット(Quiagen)で培養物のそれぞれから抽出した。精製ＤＮＡを、ＤＮＡシークエンシングにより分析した：シークエンシングの結果が図１６に記載されている。この表は、突然変異体の数分のサンプリングを表す配列のランダムなサンプル中の突然変異と、全体のＱβレプリカーゼ複製／突然変異反応の配列変化を示す。
【００９８】
実施例図１２
鋳型ＲＮＡの予測二次構造 ＲＮＡ鋳型についてＱβレプリカーゼによって好まれるＲＮＡ配列及び推定の二次構造が報告されている(Zamora等, 1995)。これらまたは関連する好ましい構造が、連続的in vitro進化のための鋳型中に存在するかどうかを測定するために、上流非翻訳配列、Ｔ７プロモーター配列、１Ｃ３遺伝子をコードする配列、定常軽鎖アンカー領域遺伝子、抗ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦｖ遺伝子及びＩｇＭヒト定常重鎖アンカー領域遺伝子を、Ｍｆｏｌｄプログラムで分析し(Zucker等, 1991)、Ｑβレプリカーゼが好む構造と比較した（図８に示されている）。この比較から、１Ｃ３ ｓｃＦｖは、ＣＬアンカー領域と同様に、ＱβレプリカーゼのＭ部位構造を模倣した内部ＲＮＡ二次構造を有することが同定され、Zamora等, 1995によって報告された好ましい合成配列との類似性が示された。これは、Ｑβレプリカーゼによる抗Ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦＶＣＨ３のものに対して、ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ CL鋳型の好ましい複製を説明する（実施例３参照）。それ故、この領域をコードするＲＮＡは、Ｑβレプリカーゼ複製、並びにこの領域とその遺伝学的融合物の関連する突然変異を促進し増大するために、ＣＬ領域遺伝子は、結合転写／翻訳ディスプレーといずれかの突然変異誘発のためのディスプレーされた分子に対するアンカー領域として提案される。
【００９９】
実施例１３
pLysN-NS5B(83kDa, pI〜9.05)のための発現プロトコール pLysN-NS5Bは、Ｔ７プロモーターを有する細菌（細胞質性）発現ベクターである。NS5Bは、非構造的ＨｅｐＣ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。NS5Bを、Gly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカー、１０のHis残基並びにAsp-Asp-Asp-Asp-Lysリンカーが引き続くもの(GSGSGH10D4K)によって分離されたＮ末端でLysN部分に融合する。
【０１００】
このプラスミドを、大腸菌株HMS174(DE3)pLysS中にトランスフォームし、1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/mlアガープレートで３７℃で培養した。単一のコロニーを選択し、ブロス1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/ml中で３７℃で一晩培養した。発現のため、一晩の開始培養物を、１２０ｒｐｍで２Ｌ攪拌フラスコ中で３７℃で1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/ml中にＡ６００＝０．１に希釈してサブカルチャーした。培養物を、Ａ６００が０．８−１．０になるまで生育させ、次いで１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、Ａｍｐ１００μｇ／ｍｌを補い、３７℃で４−５時間発現を進行させた。
【０１０１】
培養物を回収し、事前に冷やしたローターで４℃で５０００ｇで遠心分離した。回収された培養物の湿潤重量を測定し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。約３−４グラムが、細胞培養物のリットル当たり生産された（湿潤重量）。
【０１０２】
溶解及び精製プロトコール HepC RdRp(NS5B)の抽出を、細胞を溶解し、引き続き従来のタンパク質化学法によって達成した。
【０１０３】
凍結した細胞ペレットに対し、細胞ペレットのグラム当たり４℃で５ｍｌの緩衝液Ｃ（新たに作製された）を加えた。培養物が完全に懸濁されるまで、混合物を磁性ビーズを使用して４℃で攪拌した。次いで培養物を、各破壊の間で１分の間隔で、それぞれ１０秒間の１１回の破壊を使用してソニケートし、ソニケーション工程の間で磁性ビーズを使用した攪拌を継続した。ソニケートされた細胞を、４℃で２０分の７５０００ｇで遠心分離し、上清（溶解物）を回収した。
【０１０４】
３０％の飽和ＡｍＳＯ4を溶解物に加え、次いで１５分間１００００ｇで遠心分離した。これは、いくらかの細菌タンパク質を除去するように機能した。ペレットを捨て、上清に５０％の飽和ＡｍＳＯ4を加え、１５分間１００００ｇで再び遠心分離した。これは、高い割合の大腸菌タンパク質からNS5Bを沈降するように機能した。上清を捨て、ペレットを緩衝液Ｃの初めの量の半分に再懸濁した。これを４℃で一晩緩衝液Ｃにおいて透析した。
【０１０５】
各工程から得た等量物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、〜90kDaのHepC RdRpバンドの部分的精製を確認した。
【０１０６】
透析抽出物を、緩衝液Ｃで事前に平衡化されたHyper D"S"樹脂を有するカチオン交換カラムに乗せた。次いでカラムを、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ｃで洗浄した。１Ｍ ＮａＣｌでの緩衝液Ｃの段階的勾配で溶出を実施した。NS5Bは、６００ｍＭのＮａＣｌ濃度に相当する５０％のＮａＣｌ比で溶出することが見出された。
【０１０７】
溶出分画を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、精製を確認した。NS5Bはこの工程により、マイナーなより小さい分子量の混在タンパク質を含む９０％の均一性まで精製された。
【０１０８】
精製NS5Bを、５０％の飽和ＡｍＳＯ4で濃縮し、ペレットを再溶解するのに十分な緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４を有する）中に再懸濁した。次いでこれを同じ緩衝液で透析し、ＡｍＳＯ4を除去した。
【０１０９】
この純度のNS5Bは、緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ）中の予備的Superose 12カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製が、任意ではあるが必要とされない程度であった。
【０１１０】
緩衝液（ソニケーション、溶解、溶出、透析） 緩衝液Ｃ
５０ｍＭ Na-PO4 pH6.8 Na2HPO4 ２．３２ｍｌ
（またはTris pH6.8 NaH2PO4について置換 ２．６９ｍｌ）
１００ｍＭ ＮａＣｌ ０．５８４４ｇ
１０％グリセリン １０ｍｌ
１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール ７０μｌ
０．０２％ ＮａＮ３ ８０μｌ
０．２５Ｍ ショ糖 ８．５６ｇ
０．１％ 界面活性剤（β−オクチルグルコピラノシド） ０．１ｇ
１ｍＭ Pefe-Bloc ０．１ｇ
Complete（商標）錠剤(No EDTA) ２錠
Ｈ２Ｏ １００ｍｌまで
【０１１１】
精製タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％アクリルアミド）及びタンパク質のクマシーブルー染色により、約７０ｋＤａの単一のバンドが示された。
【０１１２】
HepC RdRp(NS5B)を数多くのプロトコールによってアッセイした。最も単純な方法は、Novagen Large Scale Transcription Kit(TB069)に依存する。このプロトコールの修正した形態は、成功して使用されている。この方法は、以下のように略記される。
【０１１３】
Ｔ７／Ｔ３／ＳＰ６プロモーターの上流で切断された二本鎖ＤＮＡ鋳型を、ＲＮＡ鋳型を作製するためにＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下で使用する。次いで同じ混合物中でHepC RdRp(NS5B)は、Ｔ７ポリメラーゼによって生産されたＲＮＡを増幅する。
【０１１４】
ＤＮＡ鋳型（０．５μｇ／ｍｌ） １μｌ（０．５ｎｇ）
ＡＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＣＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＧＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＵＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
５×転写緩衝液（４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、 ６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ） ２０μｌ
１Ｍ ＤＴＴ（１Ｍ） １μｌ
Ｔ７ポリメラーゼ（１００Ｕ／ｍｌ） １μｌ
HepC RdRp(NS5B) ｘμｌ
ヌクレアーゼを含まない水 ｙμｌ
【０１１５】
この方法は、キット中のコントロールＤＮＡ鋳型、並びにＴ７プロモーターの上流で成功して切断されたプラスミドＤＮＡを利用する。使用されるＤＮＡの量は、０．１ｎｇ程度の低さがうまくいくであろう。使用されるＴ７ポリメラーゼの量は、０．１μｌ程度の低さである。
【０１１６】
興味深いことに、これらの実験においてHepC RdRp(NS5B)は、オリゴヌクレオチドプライマーの不存在下でｄｓＤＮＡを与える能力、及びＲＮＡを増幅する能力を有することが示されている。
【０１１７】
実施例１４
真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中への、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列のクローニング Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列（図１０）を、結合転写／翻訳系におけるin situ発現、並びに標的ＲＮＡの同時的複製／突然変異のために、ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図９）内にクローン化した。真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニングのための、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下のものである：
5' GTGGTGGAATTCGCCGCCACCTCTATGTCGTACTCTTGGACC
5' GCACGGGCTTGGGCGATAATCCGCCGGCGAGCTCAGATC
【０１１８】
図１７に示されたベクターからＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅において、上述のオリゴヌクレオチドを使用した点を除いて、実施例２に記載されたものと同様のストラテジーを使用して、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐＣＤＮＡＨＥＰＣと命名）内にクローン化した。Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、in situで合成されていることを示すために使用された方法は、実施例２に記載されたものと全く同じであった。ｐＣＤＮＡＨＥＰＣ中のＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ鋳型を使用する結合反応から生じた結果は、図１８に示された。この図に示された結果は、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼ単独よりも多くの量の転写産物（スキャンｂ）を生ずることを示す。ここでバンドは、より強い強度を有し、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含まないバンドよりも広く、ＲＮＡに対する効果を示す。
【０１１９】
数多くの変形例及び／または修飾が、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特異的な実施態様に示されたような本発明になすことができることは、当業者によって予測されるであろう。従って本実施態様は、あらゆる点において説明的なものであり、制限するものではないと考慮される。
［参考文献］
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳系において標的結合タンパク質を突然変異させ選択する方法、及びこの方法における使用のためのポリヌクレオチド構築物に関する。本発明の方法は、診断上及び治療上の有用性を有する分子の生産に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のin vitro進化は、周知の遺伝子配列に突然変異を導入し、突然変異体配列のライブラリーを生産すること、該配列を翻訳し、突然変異体タンパク質を生産すること、次いで所望の特性を有する突然変異体タンパク質を選択することを含む。この方法は、改良された診断上及び治療上の有用性を有するタンパク質を生産する可能性を有する。しかしながら不幸にも、この方法の可能性は、突然変異体及びライブラリーの生産のために現在利用可能な方法における不完全性によって制限されている。
【０００３】
例えば、独特の個々の遺伝子及びそれらがコードするタンパク質の大きなライブラリー（例えば１０10のライブラリーサイズを超えるもの）の生産は、翻訳効率の制限のため、ファージディスプレー系では困難であると理解されている。更なる欠点は、ファージディスプレー系を利用する方法（図１）が、突然変異、増幅、選択及び更なる突然変異のいくつかの連続的な工程を必要とする点である(Irving等, 1996; Krebber等, 1995; Stemmer, 1994; Winter等, 1994)。
【０００４】
選択されたタンパク質のアフィニティー成熟、特に抗体のアフィニティー成熟のために今日使用されている方法の例が、表１に示される。全てのこれらの方法は、遺伝子の突然変異、引き続きコード化タンパク質のディスプレーと選択に依存する。選択された特定の突然変異体は、生じた遺伝子ライブラリーにおける多様性を決定する。in vitroストラテジー（表１）は、ファージディスプレーライブラリーを形成する際の突然変異化遺伝子のトランスフォーメーションの効率によって厳しく制限される。一つのin vivoサイクリング法（表１のＮｏ．１）において、大腸菌突然変異細胞は、組換え抗体遺伝子の突然変異のためのビヒクルとなった。突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有する大腸菌突然変異化細胞ＭＵＴＤ５−ＦＩＴ(Irving等, 1996)は、Ｓ−３０抽出物のソースとして使用でき、それ故プルーフリーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ中への突然変異の導入を促す。しかしながら、突然変異速度は、必要とされる速度と比較して低い。例えば、２０のアミノ酸の完全な順列を有する２０の残基を突然変異化するために、１×１０26のライブラリーサイズを必要とし、それは現在利用可能なファージディスプレー方法体系では非常に困難な作業である。
【０００５】
【表１】
【０００６】
それ故、継続的に進化（突然変異）され、所望の遺伝子が選択される突然変異体の複雑なライブラリーのin vitro生産を可能にする選択法は、タンパク質のアフィニティー突然変異（増大）の改良された手段を生ずるであろう。
【０００７】
in vitro結合転写及び翻訳系 興味ある遺伝子を含むＤＮＡプラスミドは、Ｔ７プロモーターのようなコントロールエレメントによって制御される場合、転写のための鋳型として機能できることが周知である。結合セルフリー系が、ｍＲＮＡを同時に転写し、ｍＲＮＡをペプチドに翻訳するために使用できることも周知である(Baranov等, 1993; Kudilicki等, 1992; Kolosov等, 1992; Morozov等, 1993; Ryabova等, 1989,1994; Spirin 1990; US 5556769; US 5643768; He及びTaussig 1997)。セルフリー系のソースは一般的に、原核生物について大腸菌Ｓ−３０抽出物(Mattheakis 1994; Zubay 1973)であり、真核生物についてウサギ網状赤血球溶解物である。転写／翻訳結合系は、原核生物セルフリー抽出物(Mattheakis等 1994)及び真核生物セルフリー抽出物(US 5492817; US 5665563)を含むものが報告されており(US 5492817; US 5665563)、それらは有効な転写及び翻訳のための異なる必要性を有する。さらに、原核生物及び真核生物系における翻訳化タンパク質の正確なホールディングのための必要性が存在する。原核生物について、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）及びシャペロンが必要とされ得る。一般的に原核生物においては、翻訳化タンパク質は、リボソームからの放出の後ホールディングされる；しかしながら、リボソームに付着した（つながれた）新たに翻訳されたタンパク質の正確なホールディングのため、Ｃ末端アンカーが必要であろう。アンカーは、新たに翻訳されたタンパク質ドメインをリボソームに結合するためのポリペプチドスペーサーである。該アンカーは、イムノグロブリン定常領域のような完全なタンパク質ドメインでもよい。これとは全く対照的に、真核生物系においては、タンパク質は合成と同時にホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャペロンの添加は必要ない。しかしながらアンカーは、リボソームに結合した（つながれた）新たに翻訳されたタンパク質から空間を空けるため、及び該タンパク質の正確なホールディングのため、真核生物においても有用であろう。
【０００８】
セルフリー結合系においてde novoで合成されたポリペプチドは、例えば停止コドンの不存在下では該ポリペプチドはリボソームから放出されないため、リボソームの表面にディスプレーされている。ｍＲＮＡリボソームタンパク質複合体は、選択の目的のために使用できる。この系は、ファージディスプレー及び選択の方法を模倣し、図１に示される。リボソーム上での最適なディスプレーのために必要とされる特性は、Hanes及びPluckthun (1997)によって記載されている。これらの特性は、停止コドンの除去を含む。しかしながら停止コドンの除去は、ｓｓｒＡ ｔＲＮＡ様構造によってコードされる新たに翻訳されたタンパク質のＣ末端にプロテアーゼ感受性部位の付加を引き起こす。これは、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチドを含ませることによって防止できる(Keiler等 1996)。
【０００９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ Ｑβバクテリオファージは、大腸菌ファージＱβの一本鎖ゲノムを複製するために有効なレプリカーゼを有するＲＮＡファージである（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、レプリカーゼまたはシンセターゼと称する）。Ｑβレプリカーゼはエラーを生じがちであり、１０3−１０4塩基対とin vivoで計算されたＲＮＡ中に突然変異を導入する。Ｑβレプリカーゼの正確性は低く、強力に偏ってその鋳型を複製する(Rohde等 1995)。これらの教示は、長期間に亘る複製により、所望のタンパク質の合成に適さない突然変異された鎖の蓄積を導くことを示す。＋及び−鎖の両者が、レプリカーゼの鋳型として機能する；しかしながら、ウイルスのゲノムについて、＋鎖はＱβレプリカーゼによって結合され、相補的な鎖（−）の鋳型として使用される。ＲＮＡの複製が生じるために、レプリカーゼは、十分に定義されている特異的なＲＮＡ配列／構造エレメントを必要とする(Brown及びGold 1995; Brown及びGold 1996)。組換えＲＮＡの０．１４フェムトグラムを含む反応により、３０分で１２９ナノグラムが生産される(Lizardi等 1988)。
【００１０】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、適合可能な鋳型上に対数増幅的にＲＮＡを複製することが周知である。適合可能な鋳型は、ＭＤＶ−１ ＲＮＡに示されたような二次構造を有するＲＮＡ分子である(Nishihara,T等 1983)。この点で、ベクターは、複製のために必要とされる配列及び二次構造（ＭＤＶ−１ ＲＮＡ）を有し、ＱβゲノムＲＮＡと同様な態様でin vitroで複製されるため、増幅可能なｍＲＮＡを構成するものとして記載されている。ＭＤＶ−１ ＲＮＡ配列（Ｑβレプリカーゼに対する天然で生じる鋳型）は、ＱβレプリカーゼによるＲＮＡの増幅と適合可能な数多くの天然の鋳型の一つである(US-4786600)；それは、組み込まれたｍＲＮＡの配列の安定性を増大する、ほとんどのファージＲＮＡの末端に存在する構造と同様な末端のｔＲＮＡ様構造を有する。プラスミドの直線化により、該プラスミドは、さらなる組換えＭＤＶ−１ ＲＮＡの合成のための鋳型として機能するようになる(Lizardi等 1988)。本分野での教示により、外来遺伝子のＱβレプリカーゼによる長期化した複製は、ＭＤＶ−１ ＲＮＡのような天然で生じる鋳型の一つ内のＲＮＡとして組み込まれることを必要とすることが示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US 5492817
【特許文献２】US 5665563
【特許文献３】US 5492817
【特許文献４】US 5665563
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Irving等, 1996; Krebber等, 1995; Stemmer, 1994; Winter等, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者は、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、進化した（突然変異化された）ｍＲＮＡ分子のライブラリーの作製と同様な態様で、複製の間合成されたｍＲＮＡ分子内に突然変異を導入することを見出した。これらの突然変異化ｍＲＮＡ分子は、挿入及び欠失並びに点突然変異のためサイズにおいて様々であり、相当するタンパク質が、例えばリボソーム、ｍＲＮＡ、及びde novo合成されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む３成分複合体上にディスプレーされるように、in vitroで翻訳され得る。本発明者はまた、リボソームディスプレー法によって生産されたタンパク質の大きな割合が、正確にホールディングされた機能的な形態を有する条件を同定した。さらに本発明者は、ファージＱβレプリカーゼが、ｍＲＮＡ内に突然変異を取り込んでＲＮＡ鋳型を増幅するための真核生物結合転写／翻訳系において機能できる条件を同定した。
【００１４】
本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的なin vitro進化（ＣＩＶＥ）法を導く複製／突然変異／翻訳の連続した周期的な方法に存在する。
【００１５】
このＣＩＶＥ法は、従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、第一の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する：（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；及び（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程。
第二の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；
（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択された複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以上繰り返す工程；
（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程。
【００１７】
工程（ｄ）で得られたｍＲＮＡは、翻訳系から精製または単離することなく工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。
【００１８】
一つの実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが工程（ｃ）で得られた複合体に付着する間、工程（ａ）を経てリサイクルされる。別の実施態様として、ｍＲＮＡは、リサイクルの前に工程（ｃ）で得られた複合体から放出される。ｍＲＮＡは、いずれかの適切な機構によって複合体から放出されてもよい。該機構には、インキュベーションの温度を上昇させること、または複合体を完全なままにするために使用される化合物の濃度を変化することが含まれ得る。
【００１９】
本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一または複数の区画を設けた反応容器において同時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる。
【００２０】
本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一の反応容器において同時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる。
【００２１】
第二の特徴点の別の実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは単離される。単離されたｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに転写されてもよい。生じたｃＤＮＡを、コード化タンパク質の発現に適したベクター内にクローン化してもよい。
【００２２】
いずれかの適切な複合体が、翻訳したタンパク質をそれをコードするｍＲＮＡに結合するために使用されてもよい。例えば該複合体は、タンパク質ディスプレーのために適したミトコンドリアまたは他の細胞オルガネラであってもよい。リボソーム複合体は好ましくは、少なくとも一つのリボソーム、少なくとも一つのｍＲＮＡ分子、及び少なくとも一つの翻訳したポリペプチドを含む。この複合体は、翻訳したタンパク質の「リボソームディスプレー」を可能にする。翻訳に引き続いて３成分のリボソーム複合体を完全なままに維持するために適した条件は周知である。例えば、コードする配列の３’末端からの翻訳停止コドンの欠失または省略により、完全な３成分リボソーム複合体の維持が生ずる。スパルソマイシンまたは類似化合物は、リボソーム複合体の解離を防止するために加えられてもよい。マグネシウム塩の特異的な濃度を維持すること、及びＧＴＰ濃度を下げることもまた、完全なリボソーム複合体の維持に寄与するであろう。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様は、リサイクルバッチプロセス、好ましくは連続的フロープロセスにおける結合した複製−翻訳−選択を含むことは、当業者に予測されるであろう（例えば図４参照）。翻訳または転写−翻訳のための連続したフロー装置及び方法は、本分野で周知であり、材料の組成または反応器の温度のような条件を変化させることによって、本発明の方法に適用できる。いくつかの系及びその操作方法が、Spirin. A.S. (1991)にレビューされており、それは参考としてここに取り込まれる。さらなる関連文献には、Spirin等 (1988); Rattat等 (1990); Baranov等 (1989); Ryabova等 (1989);及びKigawa等 (1991)が含まれ、その全てが参考としてここに取り込まれる。
【００２４】
用語、「翻訳系」は、リボソーム、可溶性酵素、トランスファーＲＮＡ、並びに外因性ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質を合成可能なエネルギー再生産系を含む混合物を意味する。
【００２５】
好ましい実施態様として、該翻訳系は、セルフリー翻訳系である。この実施態様に従った翻訳は、いずれかの特定のセルフリー翻訳系に制限されない。該系は、真核生物、原核生物またはその組み合わせから由来してもよい、粗抽出物、部分的に精製された抽出物または高度に精製された抽出物が使用されてもよい。合成構成成分は、天然の構成成分に置換されてもよい。数多くの代替物が利用可能であり、文献に記載されている。例えば、Spirin (1990B)を参照。この文献は、参考としてここに取り込まれる。セルフリー翻訳系はまた、商業的に入手可能である。本発明の一つの実施態様として、セルフリー翻訳系は、大腸菌からのＳ−３０抽出物を利用する。別の実施態様として、セルフリー翻訳系は、網状赤血球溶解物、好ましくはウサギ網状赤血球溶解物を利用する。
【００２６】
該翻訳系はまた、タンパク質ホールディングを増大する化合物を含んでもよい。この目的のために、本発明者は、リボソームディスプレー法によって生産されるタンパク質の高い割合がホールディングされた機能的な形態で生産される条件を同定した。これらの条件は、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の濃度で翻訳系に対して還元及び／または酸化したグルタチオンの添加を含む。好ましくは該翻訳系は、２ｍＭから５ｍＭの間の濃度で酸化したグルタチオンを含む。好ましくは翻訳系は、約２ｍＭの濃度で酸化したグルタチオンを、及び０．５ｍＭから５ｍＭの間の濃度で還元したグルタチオンを含む。
【００２７】
本発明の別の実施態様として、該翻訳系は、細胞または細胞内の区画より成るまたはそれらを含む。該細胞は、真核生物または原核生物から由来してもよい。
【００２８】
本分野で周知の数多くのＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ（またはレプリカーゼ若しくはＲＮＡシンセターゼとして周知である）が単離されており、本発明の方法における使用に適している。これらの例として、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、植物ウイルスＲＮＡポリメラーゼ及び動物ウイルスＲＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明の好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、比較的高い頻度で複製されたＲＮＡ分子内に突然変異を導入し、好ましくはその頻度は、１０4塩基対に少なくとも１個の突然変異、より好ましくは１０3塩基対に一つの突然変異である。より好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ型肝炎ＲｄＲｐ、水疱性口内炎ウイルスＲｄＲｐ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ(Deiman等 (1997))、並びにＲＮＡバクテリオファージファイ６ ＲＮＡ依存性ＲＮＡ(Qjala及びBamford (1995)より成る群から選択される。最も好ましくは、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβポリメラーゼである。
【００２９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、精製タンパク質として転写／翻訳系に含まれてもよい。別法として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、本発明の第一または第二の特徴点の方法の工程（ａ）と同時に、若しくは工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と同時に発現される、遺伝子鋳型の形態で含まれてもよい。
【００３０】
さらなる好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、標的分子と融合または会合されてもよい。理論的に根拠付けられることを望まないが、ある場合、翻訳タンパク質の結合親和性は、ｍＲＮＡ分子に対するレプリカーゼの親和性より高くてもよい。標的分子／ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ融合構築物に対する突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の結合は、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼの近傍にｍＲＮＡを配置するであろう。これは、興味あるｍＲＮＡ分子の好ましいさらなる複製及び突然変異を生ずるであろう。
【００３１】
各種のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製されるＲＮＡ鋳型が本分野で周知であり、本発明における使用に適した複製可能なｍＲＮＡを生産するためのベクターとして機能できる。Ｑβレプリカーゼに対する周知の鋳型は、ＲＱ１３５ ＲＮＡ、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアントＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ、及びＲＱ１２０ ＲＮＡを含む。これもＱβレプリカーゼによって複製されるＱβ ＲＮＡは、シストロンを含み、該シストロンの生産物がタンパク質合成を調節するため、好ましくはない。好ましいベクターは、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ及びＲＱ１３５ ＲＮＡを含む。両者の配列が印刷されている。Kramer等 (1978)（ＭＤＶ−１ ＲＮＡ）及びMunishkin等 (1991)（ＲＱ１３５）を参照。これら両者が参考としてここに取り込まれる。それらは、周知のＤＮＡ合成法によってＤＮＡ形態に作製される。
【００３２】
本発明の第一の特徴点の好ましい実施態様として、該方法はさらに、複製可能なｍＲＮＡを生産するためにＤＮＡ構築物を転写する工程を含む。組換えｍＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドの形態で存在し得るが、そうである必要はない。プラスミドと、遺伝子配列が組み込まれている複製可能なＲＮＡをコードする配列の末端または近傍で該プラスミドを切断するエンドヌクレアーゼを使用することが好ましい。直線化は個別に実施でき、または転写−複製−翻訳と結びつけることができる。しかしながら好ましくは、直線状ＤＮＡは、多くの利用可能なＤＮＡ複製のいずれか一つ、最も好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産される。いくつかの系について、エンドヌクレアーゼを含まない非直線化プラスミドが好ましい。適切なプラスミドは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによる組換えプラスミドのin vitro転写によってＲＮＡを生産するための方法に関する、Melton等 (1984a,b)の以下の教示に従って調製されてもよい。例えばMelton等 (1984a)及びMelton等 (1984b)を参照。これらの文献は参考としてここに取り込まれる。転写は、複製可能なＲＮＡをコードする配列の第一のヌクレオチドで開始するのが好ましい。
【００３３】
さらに好ましい実施態様として、転写は、本発明の第一または第二の特徴点に従った方法の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で、単一または複数の区画の反応容器若しくは反応器中で同時に実施される。
【００３４】
標的分子は、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスのような、興味あるいずれかの化合物（またはその断片）であってもよい。
【００３５】
好ましい実施態様として、標的分子はマトリックスに結合され、複合体（翻訳タンパク質をディスプレーする）を含む反応混合物に加えられる。標的分子は、例えば磁性ビーズのようなマトリックス上に皮膜されてもよい。磁性ビーズは、Dynabeadであってもよい。翻訳タンパク質は、標的分子に競合的に結合すると予測されるであろう。より高い親和性を有するタンパク質は好ましくは、より低い親和性分子を交換するであろう。かくして、本発明の方法は、興味ある標的分子に対して改良された結合親和性を示す突然変異タンパク質の選択を可能にする。
【００３６】
本発明者はまた、ＭＤＶ−１鋳型のような天然に存在するレプリカーゼの鋳型から由来する最小の配列が、Ｑβレプリカーゼの結合に対して十分であるという驚くべき発見をなした。この発見に基づいて、複製可能なｍＲＮＡの転写に適した新規な構築物が開発された。
【００３７】
従って、本発明の第一及び第二の特徴点の好ましい実施態様として、該方法はさらに、複製可能なｍＲＮＡ分子を生じるためにＤＮＡ構築物を転写することを含み、該ＤＮＡ構築物は以下のものを含む；
（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；並びに（ｉｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置するステム−ループ構造。
【００３８】
第三の特徴点として、本発明は以下のものを含むＤＮＡ構築物を提供する；
（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列。
【００３９】
ここで使用される用語、「レプリカーゼ結合配列」は、レプリカーゼ（特にレプリカーゼホロ酵素）によって認識される「ループ様」二次構造のようなポリヌクレオチド配列を指す。好ましくは、レプリカーゼ結合配列は、レプリカーゼ分子に対する全長ＲＮＡ鋳型を含まない。例えば好ましくは、用語、「レプリカーゼ結合配列」は、全長ＭＤＶ−１ ＲＮＡまたはＲＱ１３５ ＲＮＡ鋳型を含まない。
【００４０】
好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列は、１５から５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは２０から４０ヌクレオチドの長さである。好ましくはレプリカーゼ結合配列は、Ｑβレプリカーゼによって認識される。
【００４１】
さらに好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列の配列は、以下の配列を含むまたは以下の配列より成る：GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG。
【００４２】
さらに好ましい実施態様として、第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流に含まれる。
【００４３】
いずれかの適したリボソーム結合部位が、本発明の構築物において使用されてもよい。原核生物及び真核生物リボソーム結合配列は、原核生物または真核生物系の何れが使用されるかに依存して取り込まれてもよい。好ましい原核生物リボソーム結合部位は、ＭＳ２ウイルスのものである。
【００４４】
さらに好ましい実施態様として、ＤＮＡ構築物は、翻訳開始配列を含む。好ましくは翻訳開始配列はＡＴＧである。
【００４５】
いずれかの興味ある遺伝子が、ＤＮＡ構築物のクローニング部位内に挿入できることは、当業者によって予測される。好ましい実施態様として、興味ある遺伝子は、（ｉ）標的結合タンパク質のライブラリー、または（ｉｉ）単一の標的結合タンパク質についてコードするヌクレオチド配列であり、ここで該標的はタンパク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、抗体、ホルモン、ウイルス、または他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体のいずれかを含む。
【００４６】
アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味ある遺伝子にフレーム中の３’に融合されてもよい。アンカードメインは、該分子の正確なホールディング及びその同型結合パートナーの接近が可能なリボソームからの十分な距離に、翻訳されたタンパク質を興味ある遺伝子から離すのに十分な長さを有するいずれかのポリペプチド配列であってもよい。好ましくは該ポリペプチドは、複製可能な鋳型のものを模倣した相当するＲＮＡ二次構造を有する。好ましい実施態様として、該ポリペプチドはイムノグロブリン定常ドメインである。好ましくは該ポリペプチドは、定常軽鎖ドメインである。定常軽鎖ドメインは、マウス抗体１Ｃ３の第一の定常軽鎖領域であってもよい。好ましくは定常ドメインは、図５ａに示される配列によってコードされる。別法として該ポリペプチドは、ヒトＩｇＭ定常ドメインであってもよい。別の実施態様として、アンカーは、以下のものより成る群から選択されてもよい：オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ、または任意に翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列が引き続くポリヒスチジン６タグ。翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列は、ＴＡＡまたはＴＡＧであってもよい。本発明のいくつかの構築物において、放出因子による認識、引き続きタンパク質放出を妨げるために、停止コドンは存在しない。これらの構築物において、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチド配列は、引き続く３’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げるために加えられてもよい。
【００４７】
第四の特徴点として、本発明は、本発明の第二の特徴点に従ったＤＮＡ構築物を含む複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキットを提供する。
【００４８】
好ましい実施態様として、該キットは、以下のものから選択される少なくとも一つの他のさらなる構成成分を含む：（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ、またはＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型；
（ｉｉ）セルフリー翻訳系；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ；
（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに（ｖ）制限酵素。
【００４９】
本明細書を通じて、もし文脈が他のものを必要としなければ、用語「含む」またはその変異型「含む」若しくは「含んでいる」は、述べられているエレメントまたは数字またはエレメントの群または数字類を含むものを企図するように理解されるが、いずれかの他のエレメントまたは数字またはエレメントの群または数字類を排除するものとは解されない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）法におけるａ）ファージディスプレー及びｂ）リボソームディスプレーのためのアフィニティー成熟サイクルを示す図である。
【図２】ＣＩＶＥのための興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列）を含む発現ユニットを図式的に表す図である。発現ユニットは、転写開始配列（Ｔ７プロモーター）に沿って上流のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳開始部位（ＡＴＧ）を有する、興味ある遺伝子を含む。該構築物はまた、下流のスペーサー配列を含む。
【図３】in vitroアフィニティー成熟の連続的サイクリング性質を示すＣＩＶＥ法を図式的に表す図である。該方法は、連続的に進化（成熟）し、所望の遺伝子が選択される突然変異体の複合体ライブラリーのin vitro生産を可能にする：本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）を導く再複製／突然変異／翻訳の連続的サイクリング工程中に存在する。
【図４】ＣＩＶＥ法に適した反応容器を表す図である。
【図５Ａ】ａ）マウスモノクローナル抗体１Ｃ３の第一の定常軽鎖領域；ｂ）ヒトＩｇＭ抗体の第三の定常重鎖領域；ｃ）抗グリコホリン（１Ｃ３）ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す図である。
【図５Ｂ】ｄ）抗Ｂ型肝炎表面抗原（４Ｃ２）ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す図である。
【図６Ａ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｂ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｃ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６Ｄ】ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。
【図７】in vitro転写及び翻訳に使用される鋳型のＰＣＲ合成のために使用される、（ａ）ｐＧＣ０３８ＣＬ（抗グリコホリンｓｃＦｖ（１Ｃ３）及びマウス定常軽鎖領域を含む）及び（ｂ）ｐＧＣ ＣＨ（ヒト定常重鎖領域を含む）のプラスミドを図式的に表す図である。これらのプラスミドは、下流スペーサー配列を提供するために使用された。ほとんどの場合、興味ある遺伝子は、ｐＧＣ ＣＨのＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ部位にクローン化された。
【図８】ステムループ構造を形成するＲＮＡ断片の配列を示す図である。
【図９】ウサギ網状赤血球に結合した転写／翻訳系における、Ｑβレプリカーゼ及びＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現のための真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を示す図である。
【図１０】Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１１】in vitro結合転写／翻訳反応用の鋳型ＤＮＡを生産するためのＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す図である。鋳型の生産及びパンニング後の生産物の回収の両者のために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。配列は数字が付され、５’から３’で記載されている。
【図１２】ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系におけるＱβレプリカーゼの発現を示す図である。
【図１３】抗ＧｌｙＡ １Ｃ３タンパク質合成の結合転写／翻訳に対するＱβレプリカーゼの効果を示す図である。
【図１４】結合転写／翻訳においてＱβレプリカーゼを含ませる効果を示す図である。選択された突然変異体の配列中の突然変異の表を示す。この図は、６のランダムなクローンから得られた配列の２８０のヌクレオチド中に見出される突然変異の位置及びタイプを示す。これらは、Ｑβレプリカーゼの不存在下、精製Ｑβの存在下、またはプラスミドｐＣＤＮＡＱβの存在下のいずれかで、転写及び翻訳の後のＧｌｙＡ皮膜Dynabeadに対する抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖのパンニングから回収された。「検出突然変異」のカラムにおいて、「なし」は、突然変異が見出されないことを意味する：突然変異はＡｘＢの形態で示され、Ａは野生型ヌクレオチドであり、ｘは配列中の位置数であり（図５ｃに示される）、そしてＢは観察された突然変異化ヌクレオチドである。
【図１５】結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系：デンシトメータースキャニングにおいてＱβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ転写産物の複製を示す図である。
【図１６】Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からのＱβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異のＤＮＡ配列分析を示す図である。
【図１７】Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むベクターを示す図である。
【図１８】抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ ＲＮＡの複製に対する、結合転写／翻訳系において発現されるＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの効果を示す図である。エチジウムブロマイドで染色しスキャンしたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明の好ましい態様として、タンパク質の連続的一工程進化のための系は、以下の構成成分を含む：
【００５２】
発現ユニット： 本発明における使用のための好ましい発現ユニットは、図２に表される。この発現ユニットは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するために、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターのようなコントロールエレメントを５’非翻訳領域内に有する３’及び５’非翻訳領域を含む。コンセンサスＤＮＡ配列は、そのポリメラーゼに特異的である：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーター配列は、TAATACGACTCACTATAGGGAGAである。Ｔ７プロモーター配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合配列として機能し得る（即ち、それはＱβレプリカーゼに対する結合配列として機能し得る）。しかしながら好ましくは、該構築物は、プロモーター部位に対する３’側に５’非翻訳領域中に位置するＱβレプリカーゼの結合のためのステムループ構造を含む。好ましくは第二のステムループ構造は、コード配列の下流に含まれ、好ましくは発現ユニットの翻訳終結部位の３’側で約１ｋｂである。好ましいステムループ構造の配列は、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGである。
【００５３】
リボソーム結合部位は、プロモーターの下流の次の領域である。いくつかのリボソーム結合部位のいずれかが、この位置で使用できる。原核生物及び真核生物リボソーム結合配列が、真核生物または原核生物結合系の何れが使用されるかに依存して取り込まれ得る。一つの好ましい原核生物結合部位は、ＭＳ２ウイルスのものである。翻訳開始配列ＡＴＧが好ましくは使用され、それはアミノ酸メチオニンをコードする；これは、in vitro翻訳の開始部位である。
【００５４】
興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列）
興味ある遺伝子が、標準的な遺伝学的方法のいずれかによって非翻訳領域に結合され得ることは、当業者に予測されるであろう。興味ある遺伝子は、遺伝子３’末端までにオープンリーディングフレーム（停止コドンではない）を有するいずれかのヌクレオチド配列を含み、さらに本発明の目的のため、アンカー（スペーシング）配列の末端を含む。
【００５５】
好ましい実施態様として、興味ある遺伝子は、ｉ）標的結合タンパク質のライブラリー、またはｉｉ）単一の標的結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、この場合標的は、タンパク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、抗体、ホルモン、ウイルス、または他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体のいずれかを含む。アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味ある遺伝子の３’及びフレーム中に融合されてもよい。アンカードメインは、分子の正確なホールディング及び同型結合パートナーへの接近を可能にするためにリボソームから十分な距離で、興味ある遺伝子から翻訳されたタンパク質を離す十分な長さの一連のポリペプチド配列のいずれかであってもよい。好ましい実施態様として、アンカーは、オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ：DYKDDDDKまたはヒト若しくはネズミ抗体定常ドメインのいずれかをコードする配列である。好ましくはアンカーは、定常ドメイン１Ｃ３のようなマウスモノクローナル抗体から由来する定常ドメインである（図５ａ参照）。さらに好ましいアンカーは、ヒトＩｇＭ抗体から由来する定常領域である（図５ｂ参照）。
【００５６】
アンカー配列には、例えばTAAまたはTAGといった翻訳終止（停止）ヌクレオチド配列が引き続くであろう。しかしながら、ある構成においては、放出因子による認識及び引き続くタンパク質の放出を妨げるために、停止コドンが存在しないことが考慮され得る。これらにおいて、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチド配列が、引き続く３’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げるために加えられる。スパルソマイシン、他の類似化合物の添加または温度の減少もまた、ｍＲＮＡ及びde novo合成タンパク質からのリボソームの放出を妨げる。
【００５７】
発現システム 発現ユニットのための転写／複製／突然変異は、ウサギ網状赤血球溶解物系(He及びTaussig, 1997)または大腸菌Ｓ−３０転写翻訳混合物(Mattheakis等, 1994; Zubay, 1997)の使用によって達成され得る。例えば、Ｔ７プロモーターを使用したＤＮＡ発現ユニット（上述詳述）を、製造者の説明書に従ってＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで処理する。生じたＲＮＡライブラリーは、コード化遺伝子の多様性を反映する。複製及び突然変異のために添加されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、複製のために加えられ、突然変異が精製酵素として提供され、または別法としてＴ７若しくはＳＰ６のようなプロモーターの制御の下でプラスミド内に別個の発現系としてコードされる。好ましい酵素はＱβレプリカーゼであるが、同様な性質を有するいずれかの酵素が使用されてもよい。この工程は、Ｑβプロテアーゼによる突然変異を通じたライブラリーの複雑性の増大を提供する。真核生物細胞におけるｍＲＮＡ合成のため、ｍＲＮＡは好ましくはキャップされ、それはジグアノシン三リン酸の過剰量の添加によって達成される；しかしながら、商業的な供給者Promega及びNovagenから得たウサギ網状赤血球系は、キャップした化合物の添加を不要にする系中の構成成分を有する。転写／翻訳混合物または結合系は、いずれかの細胞から抽出でき、最も一般的に使用されるものは、コムギ麦芽、ＨｅＬａ細胞のような哺乳動物細胞、大腸菌及びウサギ網状赤血球である。結合転写翻訳系は、大腸菌突然変異細胞ＭＵＴＤ５−ＦＩＴ(Irving等, 1996)から抽出でき、それは突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有し、それ故プルーフリーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ内に導入されるさらなるランダムな突然変異を可能にする。一つの好ましい転写／翻訳混合物は、ウサギ網状赤血球溶解物である。結合系に対するＧＳＳＧの添加は、ディスプレーされたタンパク質の正確なホールディングを増大し、それ故カウンターレセプターまたは抗原に対する後の結合及び選択を促進する。
【００５８】
Ｑβレプリカーゼによる突然変異 Ｑβレプリカーゼは、ランダムな突然変異を取り込んだ高レベルのｍＲＮＡの複製及び生産のために系中に含まれる（図３参照）。複数コピーの一本鎖ＲＮＡ鋳型が、Ｑβレプリカーゼによる突然変異で単一の標準的構成成分に複製される；しかしながら、両方の鎖は、等温条件の下で鋳型として同等に効果的である。
【００５９】
本分野の教示により、Ｑβのようなファージから由来する全長ＲＮＡ中に存在する複合体並びに二次及び三次構造が、タンパク質開始部位へのリボソームの接近を制限することが示されている。しかしながら我々は、より小さいＲＮＡ配列が、レプリカーゼの結合に適しており、それ故全長鋳型の代わりに使用できることを見出した。好ましい配列は、シュードノットとして周知である小さな合成ＲＮＡ(Brown及びGold 1995;1996)であり、それはＱβレプリカーゼによる増幅と適合的である。本発明の文脈において、シュードノットの使用は、ＲＮＡ及びそれに融合した配列のＱβレプリカーゼ増幅に必要かつ十分な結合部位を維持する一方で、タンパク質開始部位へのリボソームの接近の問題を解消できる。
【００６０】
翻訳及びリボソームディスプレー ウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ麦芽のような真核生物、または大腸菌のような原核生物のいずれかであるいくつかのin vitro翻訳法が周知である。これらは商業的に入手可能であり、または周知の印刷された方法によって生産できる。突然変異化ｍＲＮＡの翻訳は、好ましくはde novo合成タンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡを含む３成分リボソーム複合体中のリボソームに結合した、タンパク質分子のライブラリーを生ずる(Mattheakis等, 1994)。タンパク質及びリボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げるためのいくつかの方法が周知である。例えばスパルソマイシンまたは類似化合物が加えられてもよい；スパルソマイシンは、研究された全ての生物においてペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、リボソームとの不活性な複合体の形成によって機能するであろう(Ghee等, 1996)。高濃度のマグネシウム塩を維持すること、及びＧＴＰレベルを低下することもまた、リボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体を維持するのに寄与するであろう；発現ユニットの構造に関しては、上述した。３成分リボソーム複合体を維持する好ましい手段は、コード配列の末端の翻訳停止コドンの省略である。
【００６１】
さらに、二つの系における分子の正確なホールディングのための好ましい必要性が存在する。原核生物については、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）及びシャペロンが、正確なホールディングを確実にするＣ末端アンカードメインと並んで使用され得る。後者は、原核生物タンパク質がホールディングの前にリボソームから放出されるために必要とされ(Ryabova等, 1997)、それ故ペプチドがリボソームに結合される場合に、全体のタンパク質はリボソームから距離を取ることが必要とされる。これとは対照的に、真核生物系においては、タンパク質は合成されながらホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャペロンを加える必要はない；しかしながら我々は、ＧＳＳＧの特定の範囲の濃度の添加が、３成分リボソーム複合体上での正確にホールディングされたタンパク質の増大したディスプレーによるライブラリー選択に対して有益であることを見出した。
【００６２】
選択及び競合的結合 ＲＮＡ複製の連続的な周により、翻訳によってタンパク質のライブラリーを生産するＲＮＡ分子のライブラリーが生じる。標的分子結合マトリックス（例えば抗原皮膜Dynabead）が、３成分リボソーム複合体を捕獲するために反応に加えられる。ライブラリー中の個々のメンバーは、マトリックス(Dynabead)上に固定化された抗原に対して競合する。より高い親和性を有する分子は、より低い親和性分子に置換するであろう。該方法の終結時に、マトリックス(Dynabead)に結合した複合体（ｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質）は回収され得る。ｃＤＮＡが複合体中のｍＲＮＡから合成され、コード化遺伝子配列からの高レベル発現に適したベクター中にクローン化される。
【００６３】
リサイクリングフリーシステム(Spirin等, 1988)は、基質（リボソームを含む）の供給を確実にするための一定温度のチェンバー及び試薬並びに必須でない物質の除去を使用する連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）システムに適用できるであろう。以下のものを含む全てのＣＩＶＥの工程は、このチェンバー内で生じ得る：結合転写及び翻訳、突然変異化複製、３成分リボソーム複合体の表面へのde novo合成タンパク質のディスプレー、及び最高の親和性の結合を有するものを選択するための抗原に対する３成分リボソーム複合体上のディスプレーされたタンパク質の競合的結合（図４）。非結合試薬、物質及びディスプレーされたタンパク質は、洗浄緩衝液ですすぐことによって除去され、結合３成分リボソーム複合体は、温度の上昇及び緩衝液からのマグネシウムの削除によって解離する。この次に、洗浄緩衝液工程を除いて上述の全ての工程を実施するために必要な全ての試薬の添加が行われる。スパルソマイシンまたは類似化合物の添加のようなタンパク質及びリボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げる方法が利用可能であり、マグネシウム塩の特異的濃度の維持及びＧＴＰレベルの低下は、反応温度の減少または停止コドンの削除と並んでリボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体の維持に寄与するであろう。連続的フロー性能と組み合わせた温度が制御される容器を使用することによって、選択されたリボソームから得たｍＲＮＡは、リボソームから解離でき、スパルソマイシン、Ｍｇ等のようなリボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体の維持に重要な試薬の濃度を変化させて、さらに複製、突然変異、及び翻訳されるであろう。図４は、上記装置の設計を表す。
【００６４】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参考としてより十分に記載されるであろう。
【実施例】
【００６５】
実施例１
組換えＱβレプリカーゼ：発現と精製クローニング及び発現 Ｑβレプリカーゼコード配列を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するin vitroでの転写による感染性ＲＮＡの調製を可能にするようにデザインされた、つまりファージＱβのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡコピーである、ｐＢＲ３２２ベース構築物であるプラスミドｐＢＲＴ７ＱβからＰＣＲによって増幅した(Barrera等, 1993に略記されている）。ｐＢＲＴ７Ｑβの配列は、図６に示されている。ヌクレオチド番号１は、Ｑβレプリカーゼセンス鎖の第一のヌクレオチドである。Ｑβレプリカーゼを増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切断のための部位をコードし、その配列は図１１に示されている。
【００６６】
ＰＣＲ産物を、この目的のために利用可能な商業的な製品のいずれか一つを使用して精製した（例えばBresatec)。精製ＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を使用して、ベクターｐＧＣ（図７）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位内にクローン化した。ベクターｐＧＣ及びそれからの組換えタンパク質の発現は、文献に記載されており、参考としてここに取り込まれる(Coia等, 1996)。ＰＣＲ増幅及びベクターへのＱβレプリカーゼ遺伝子のクローニング及び酵素の発現のための大腸菌へのトランスフォーメーションの方法は、培養培地に１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって誘導されるｐＧＣ中のＱβレプリカーゼ遺伝子の発現というように、当業者に周知である。
【００６７】
プロモーターＰＬでのｐＢＲ３２２ベースベクター中のＱβレプリカーゼ遺伝子の発現及び精製は、以下に詳述されるように実施した。rep14 Billeter株を、Christof Biebricher, Max Planck, Gottingenによって入手した。該大腸菌株を、２％栄養ブロス、１．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、０．４％グリセリン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン中の２０ｌ発酵器において、３０℃で良好なエアレーションで光学密度２（６６０ｎＭ）に生育させた。温度を３７℃に上昇させた後、エアレーションを５時間継続した。細胞を氷上で凍結し、遠心分離によって回収した（約１８０ｇの湿潤細胞重量が得られる）。
【００６８】
Ｑβレプリカーゼの精製緩衝液Ａ：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、１ｍＭメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン。
緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ．Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン。
５０ｇの回収された大腸菌を、１００ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで、高速ブレンダーでホモゲナイズした。リゾチーム及びＥＤＴＡを、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び０．５ｍＭの最終濃度で加え、該溶液を０℃で３０分穏やかに攪拌した。１２ｍｌの８％デオキシコール酸ナトリウム、０．２４ｍｌのフェニルスルホニルフルオリド（プロパノール−２中に２０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌのバシトラシン（１０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌの０．１Ｍベンズアミジン、３．３ｍｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を加え、溶液を１０ｍＭの最終濃度にＭｇＣｌ2で調節した。高い粘性を高速度でブレンドすることによって減少した。固体のＮａＣｌを、０．５Ｍの最終濃度で加え、４．８ｍｌの０．３％ポリエチレンイミド（ｐＨ８）を攪拌しながら加えた。０℃で２０分の攪拌の後、懸濁液を１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離した（ＧＳＡローター）。上清を５当量のＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．７）で希釈した後、１ｍＭメルカプトエタノール、１００ｍｌＤＥＡＥセルローススラリー(緩衝液Ａで平衡化されたWhatman DE52）を加え、０℃で２０分ゆっくりと攪拌した。攪拌しないで４０分のインキュベーションの後、上清を沈殿物からデキャントし、廃棄した。沈殿物を緩衝液Ａ中に懸濁し、１ｃｍの直径のガラスカラムに注ぎ、４００ｍｌのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで洗浄し、２５０ｍｌの緩衝液Ａ＋１８０ｍＭＮａＣｌで溶出し、分画を回収した。該分画を、次の結合アッセイで使用するＱβレプリカーゼの存在についてアッセイした。
【００６９】
酵素配置アッセイ：Ｑβレプリカーゼに対するビオチニル化ＲＮＡの結合 これは、正に荷電された膜に維持されている酵素に結合するビオチンラベル化ＲＮＡに依存する複製酵素を検出するように開発された非放射性活性アッセイである：一方で、同じ条件の下で遊離ビオチンラベル化ＲＮＡは、膜に維持されない。ＤＮＡ及びＲＮＡは、製造者の説明書に従ってソラレン−ビオチン(Ambion)でラベルされた。次いでラベル化ＲＮＡを、Ｑβレプリカーゼの配置を検出するために以下のアッセイに示されたようにカラム溶出物（サンプル分画）に加えた。
【００７０】
以下の物質をエッペンドルフチューブ中で混合した：１０μｌ カラム溶出分画１０μｌ ０．５Ｍ １２０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）
１０μｌ ２ｍＭ ＡＴＰ１０μｌ ５ｍＭ ＡＴＰ１０μｌ 〜１００ｎｇ／ｍｌ ソラレン−ビオチンラベル化プローブＲＮＡ５０μｌ 水 反応混合物を３７℃で１分インキュベーションした。
反応混合物を、ナイロン膜、例えばハイボンドＮにドットブロットし（酵素Ｑβレプリカーゼに結合したＲＮＡまたはＤＮＡのみが、膜に維持されるであろう）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、自動セットでStratalinker中でナイロン膜にＵＶ架橋した。BrightStar Biodetectキットを、ナイロン膜上に付着したビオチニル化核酸の検出のために使用した。図１２は、ＤＥ５２カラムからの溶出分画のアッセイを示す。
【００７１】
活性分画をプールし、一当量の緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａ＋０．１Ｍ ＮａＣｌに平衡化されたDEAE-Sepharose FFの３５ｍｌカラムに適用した。酵素を、緩衝液Ａ中の０．１−０．４Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。活性分画をプールし、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）の添加により酵素を沈降し、遠心分離によって回収し、４ｍｌの緩衝液Ｂに溶解した。
【００７２】
酵素を、伝導率が緩衝液Ｂ＋０．２Ｍ ＮａＣｌのもの未満になるまで希釈し、緩衝液Ｂで平衡化されたFractogel EMD SO3の１００ｍｌカラムに適用し、緩衝液Ｂ中の０．２−０．８Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（５００ｍｌで２回）で溶出した。約０．６５Ｍ ＮａＣｌで溶出された活性ピークをプールし、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ3（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）で沈降し、遠心分離によって回収し、１０ｍｌの緩衝液Ａ＋５０％グリセリン中に溶解した。溶液を−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
以下の工程は、Sumper & Luce (1975)に従ってスモールスケールで実施された。４ｍｇのＱβレプリカーゼを、緩衝液Ａ（希釈され塩を除去するように透析された）で平衡化されたQAE-Sephadex〜A-25の１．６×１４．５ｃｍカラムに適用し、緩衝液Ａ中の０．０５−０．２５Ｍ ＮａＣｌの２×２００ｍｌ勾配で溶出した。二つのきれいに分離されたコアとホロ酵素のピークをプールし、緩衝液Ａで１：１に希釈し、QAE-Sephadexカラムに適用した。コアについて２ｍｌ、ホロ酵素について６ｍｌをそれぞれ緩衝液Ａ＋５０％グリセリンで洗浄し、レプリカーゼを緩衝液Ａ＋５０％グリセリン＋０．２Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4で濃縮形態に溶出した。活性分画を−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡによる装置のコンタミネーションを避けるように注意を払った。
【００７４】
実施例２
真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中へのＱβレプリカーゼのクローニング Ｑβレプリカーゼコード配列を、真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図９）中にクローン化し、ｐＣＤＮＡＱβと名付けられたベクターを生産した。このベクターを、結合転写／翻訳系及び付随する標的ＲＮＡの複製／突然変異におけるin situでのＱβレプリカーゼの発現のために使用した。真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニングのためのＱβレプリカーゼのＰＣＲ増幅でのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、以下のものであった：
No.5352 5'TCTGCAGAATTCGCCGCCACCATGTCTAAGACAGCATCTTCG
No.5350 5'TTTATAATCTGCGGCCGCTTACGCCTCGTGTAGAGACGC
【００７５】
Ｑβレプリカーゼｂサブユニットのコード配列を、標準的な分子生物学的方法によってｐＣＤＮＡ３．１中にクローン化した(Sambrook等, 1989)。クローン化配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系におけるＱβレプリカーゼの発現に引き続き、結合転写翻訳キット(Promega及びNovagen)の商業的供給者並びにTranscend(Promega)の供給者によって示唆されたように、標準的転写／翻訳反応におけるde novo合成Ｑβレプリカーゼ内に取り込まれたビオチニル化リシン(TRANSCEND, Promega)の検出を実施した。結合反応のインキュベーション工程の完成時に、２０μｌの反応物を、２ｍｌの１０×ＳＤＳサンプル緩衝液で９０℃に加熱し、サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。これに引き続きウエスタンブロッティングを実施し、de novo合成ビオチニル化Ｑβレプリカーゼバンドを、TRANSCENDキット検出試薬で検出した。この発現の結果が、図１２のゲルのスキャンに示されており、Ｑβレプリカーゼがゲルの正確なサイズでビオチニル化バンドによって示されるように合成されていることが確認できる。
【００７６】
次いで我々は、１Ｃ３鋳型で結合転写／翻訳反応を実施したが、同じ反応でｐｃＤＮＡ３．１からＱβレプリカーゼを発現した。発現ベクターｐＣＤＮＡＱβからin situで合成されたＱβレプリカーゼは、０．５ｍＭ塩化マグネシウムの存在下で結合系で１Ｃ３ ｓｃＦｖの増大した合成を生じた：これは上述のようにビオチニル化リシンの取り込みによって測定された（図１２ｂ）。塩化マグネシウムの存在は、転写／翻訳因子に対するＱβレプリカーゼの活性の依存性をゆるめることが以前に示されている。
【００７７】
実施例３
転写のためのＤＮＡ鋳型のＰＣＲによる構築 ＤＮＡ配列を、ＦＴＳ−１熱シークエンサー(Corbett Research)、ＰＥ２４００(PerkinElmer)またはRobocylcer勾配９６(Stratagene)のいずれかを使用して、製造者の説明書に従ってＴａｑ、Ｔｔｈ、Ｔｆｌ、ＰｗｏまたはＰｆｕポリメラーゼを用いて、標準的かつ十分に記載された方法（特異的にデザインされたオリゴヌクレオチドプライマー、スプライスオーバーラップ伸長、制限酵素切断等を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって増幅した。使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのリストは、図１１に示されている。生産物をBresaClean(Bresa)を使用してゲル精製し、または結合転写及び翻訳反応に直接使用した。
【００７８】
ＤＮＡ配列を、構築物の３’末端に伸長を提供する、ベクターｐＧＣ０３８ＣＬ（図７ａ）またはｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）のいずれか中にクローン化されている開始鋳型から増幅した。この伸長は、マウスモノクローナル（１Ｃ３；配列は図５ａ）から由来する定常領域、またはヒトＩｇＭ抗体（配列は図５ｂ）から由来する定常領域のいずれかであった。増幅のために使用される正方向の（センス）プライマー（抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖについてN5266；抗ＨｅｐＢ ｓｃＦｖについてN5517またはN5384, N5344及びN5343）は、転写開始部位、並びに翻訳開始部位及びリボソーム結合部位を提供した。逆方向の（アンチセンス）プライマー（マウス定常領域についてN5267；ヒト定常領域についてN5385）は、ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を会合したままにするために、停止コドンを含まなかった。正方向及び逆方向のプリマーの両者は、生産断片のクローニングを可能にする制限酵素部位（特異的にそれぞれＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ）を提供した。
【００７９】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するいくつかのプロモーター配列のいずれかが、転写に向けるために使用され得る；しかしながら、以下の配列が好ましい二つのものであった（これらは翻訳開始配列を含む：以下参照）：
ａ） GCGCGAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACCGCCATGGCC
ｂ） GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGCC
【００８０】
これらの配列は、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、結合転写／翻訳系の二つの選択的なフォーマットでＲＮＡ転写産物を生産させるように向けた。
【００８１】
リボソーム結合部位をコードする配列は周知であり、グリコホリンに結合するｓｃＦｖ（１Ｃ３；図５ｃ）またはＢ型肝炎表面抗原を結合するｓｃＦｖ（４Ｃ２；図５ｄ）のいずれかをコードするリボソームディスプレーに対する興味ある分子の配列のいずれか一つの上流で、鋳型中に含まれている。同じ配列は、リボソームディスプレーのために興味あるいずれかの他の配列の上流で、鋳型中に含まれている（例えばＣＴＬＡ−４ベースライブラリー配列）。
【００８２】
実施例４
ウサギ網状赤血球溶解物セルフリー系における結合転写／翻訳及びリボソームディスプレー 転写及び翻訳を、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２ｍＭメチオニン及び３ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むＴＮＴ Ｔ７結合転写／翻訳系(Promega)を使用して、Siliconized Rnase-フリー０．５ｍｌチューブ(Ambion)で実施し（以下の実施例６参照）、混合物を６０℃で９０分インキュベーションした。いくつかの反応においては、１０ｍＭまでの還元グルタチオンもまた加えた。Ｑβポリメラーゼを含む反応において、混合物はまた、０．５ｍＭの最終濃度まで塩化マグネシウムを含んだ。転写及び翻訳の後、混合物をＰＢＳで希釈し、ＤＮアーゼＩで処理していずれかの残存する開始ＤＮＡ鋳型を除去した。これは、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＮａＣｌ及びＤＮアーゼＩ(Promega)の添加、引き続き３０℃でさらに２０分のインキュベーションにより達成された。
【００８３】
実施例５
Dynabeadを使用する抗原に対するリボソーム３成分複合体ディスプレータンパク質の選択 トシル活性化Magneticビーズ(Dynal)を、製造者の説明書に従ってグリコホリンＡ（ＧｌｙＡ；Sigma)、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢ ＳＡ；BiosPacific, Emeryville, CA USA)またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma)に結合した。ストレプタビジン磁性ビーズを使用する場合、これらは製造者の説明書に従って、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)を使用してビオチニル化されている抗原（上述）に結合された（製造者の説明書に従って）。
【００８４】
特異的に結合するｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を選択するために、２−３μｌの抗原結合（トシル活性化またはストレプタビジン皮膜化）磁性ビーズを、最終翻訳混合物に加え、ビーズの鎮静を避けるために穏やかに攪拌しながら室温で９０分プレートシェイカー(Raytek Instruments)に配置した。磁性粒子回収器(Dynal)を使用してビーズを回収し、これらを、１％Ｔｗｅｅｎ及び５ｍＭ酢酸マグネシウムを含む冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で３回洗浄した。次いでビーズを冷却滅菌水で１回洗浄し、最後に１０μｌの滅菌水に懸濁した。
【００８５】
選択された複合体からのｃＤＮＡの合成のため、２μｌの最終ビーズ懸濁液を、製造者の説明書に従ってAccess RT-PCRシステム(Promega)またはTitan One-チューブRT-PCRシステム(Boehringer Mannheim)のいずれかを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。この反応に使用されるプライマーは、オリジナル正方向（センス）プライマー（開始鋳型ＤＮＡ；抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖについてN5266；抗ＨｅｐＢ ｓｃＦｖについてN5517またはN5384, N5344及びN5343を生産するために使用される）、並びにオリジナルプライマーの上流の逆方向（アンチセンス）プライマー（マウス定常領域構築物についてN5268及びN5269；ヒト定常領域構築物についてN5386及びN5387）を含んだ。ある場合、より短いプライマー（抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖ定常軽鎖領域構築物についてN5941及びN5942）を、パンニングされたＲＮＡ鋳型を回収するために使用した。
【００８６】
選択のさらなるサイクルのため、このＤＮＡをゲル精製し（ある場合単純に希釈し）、開始ＤＮＡ鋳型を生産するためにオリジナルのＰＣＲに存在している正方向及び逆方向のプライマーを使用して、さらなるＰＣＲにおいて取り込ませた。次いでこの新たな鋳型は、適切な開始部位を含み、第一の選択中の鋳型と同じ長さを有するために、上述のようにさらなる選択において使用することができた。
【００８７】
上述の方法が、特異的な分子を選択するために使用できることを示すために、ＧｌｙＡに特異的に結合するマウス定常軽鎖領域に融合された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、Ｔ７転写開始部位及びリボソーム結合部位の付加を可能にするプライマーを使用して増幅した。この鋳型（Ｔ７−ｓｃＦｖ）を、上述のような結合転写／翻訳反応で使用し、次いで三つに分割し、ＨｅｐＢ ＳＡ、ＧｌｙＡまたはＢＳＡ結合磁性ビーズのそれぞれと混合した。ビーズを洗浄し（上述の通り）、回収されたｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を、ｃＤＮＡの合成のために使用した。この実験の結果は、各レーンにおいて正確なサイズを有する生産物の存在を示した。ＨｅｐＢ ＳＡ及びＢＳＡレーンで観察された非特異的結合は、おそらく翻訳の間で合成された生産物の凝集のためであろう。網状赤血球溶解物を使用して合成された生産物の一定割合のみが正確にホールディングされ活性形態であることは、他者によって観察されている。この問題は、以下の実施例６で説明する。
【００８８】
この実験から得られたＧｌｙＡ特異的生産物をゲル精製し、さらなる周の選択のためのよりたくさんの鋳型を合成するためにＰＣＲによって再増幅した。第二の周のパンニングにより、ＧｌｙＡ結合磁性ビーズでプローブされたサンプル中に特異的な生産物が優勢に示された。このことは、第二の周の選択によって、回収された生産物がＧｌｙＡに特異的であることを示した。
【００８９】
実施例６
酸化及び／または還元グルタチオンを加える効果 in vitro転写及び翻訳の間でより高い割合の正確にホールディングされた生産物を誘導する試みにおいて、各種の濃度の還元または酸化グルタチオンのそれぞれを反応混合物に加えた。これらの反応に使用される鋳型は、抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖであり（上述の通り）、選択をＧｌｙＡ結合磁性ビーズを使用して実施した。この実験は、回収された生産物の量が、５ｍＭまで増大する濃度の酸化グルタチオンで増加することを示した。１０ｍＭまでのさらなる増加は、回収された生産物の収率に有害な効果を有した。約２ｍＭの酸化グルタチオンの濃度が、ほとんどの転写及び翻訳において含まれた。
【００９０】
すでに２ｍＭの酸化グルタチオンを含む反応に対して５ｍＭ及び１０ｍＭの還元グルタチオンのさらなる添加が、５ｍＭのグルタチオンの添加によりコントロールパンニングに対してＧｌｙＡパンニングから回収された生産物の増大した量を導くディスプレーされた抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖのより適したホールディングを生ずるようであることを示したことが、後者の結果により明らかにされた。還元グルタチオンの濃度を０．５ｍＭまでさらに減少することは、同様な効果を示した。
【００９１】
実施例７
リボソーム上での突然変異ｖ−ドメイン（ＣＴＬＡ−４）ライブラリーのディスプレー リボソームディスプレーが、ポリペプチドライブラリーから結合エレメントを選択するために使用できることを示すため、ＣＴＬＡ４突然変異体のライブラリーを、定常重鎖ドメインの付加が可能であるプラスミドｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）にライゲートし、次いでこのライブラリーをプライマーN5659とN5385を使用するＰＣＲによって増幅した（図１１）。プライマーN5659を、必要な上流転写及び翻訳開始配列を加えるために使用した。次いでこのＰＣＲ ＤＮＡを、実施例４に記載された方法を使用する結合セルフリー翻訳系における転写及び翻訳のための鋳型として使用した。突然変異体ＣＴＬＡリボソーム複合体の結合を示すために、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢＳＡ）、グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）皮膜Dynabeadを使用してパンニングを実施した。次いで結合複合体に付着したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって回収した。パンニング、選択及び回収のために使用された方法は、上記された（実施例５）。
【００９２】
ＣＴＬＡ４ベース突然変異体のサイズにほぼ相当する生産物を回収し、それはＣＴＬＡ４ライブラリーが、ＨＢＳＡ、ＧｌｙＡ及びＢＳＡを特異的に結合するタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを示した。これらの生産物を、可溶性産物のＤＮＡシークエンシング及び発現のために、ベクターｐＧＣ ＣＨ（図７ｂ）内にクローン化した。標準法を使用するシークエンシング(BigDye Teminator Cycle Sequencing; PE Applied Biosystems CA)は、ＣＴＬＡ４ベース特異的インサートが存在することを示した。さらに、ＥＬＩＳＡを使用する実験は、特異的な反応性タンパク質が、組換え培養物によって発現されていることを示した。これらのアッセイにおいて、ＧｌｙＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニング及びＧｌｙＡ皮膜プレートを使用したＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって単離された組換え体が、ＢＳＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニングによって単離された同様に試験された組換え体より、強いシグナルを与えた。
【００９３】
実施例８
結合転写及び翻訳中にＱβレプリカーゼを含ませる効果 生産物の収率の増大、及びin vitro翻訳の間の生産物中の突然変異の速度の増大の両者を試みるために、Ｑβレプリカーゼ（二つの形態のいずれか）を、反応混合物に加えた。レプリカーゼは、精製レプリカーゼタンパク質、または結合転写／翻訳反応の間に同時に合成できるＴ７転写プロモーター（ｐＣＤＮＡＱβ）の制御の下の遺伝子鋳型のそれぞれとして含まれた。この反応のために使用される鋳型は、再び抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖ（上述の通り）であり、選択はＧｌｙＡ結合磁性ビーズを使用して実施された。これらの実験は、回収されたＧｌｙＡ反応性生産物の量が、精製Ｑβレプリカーゼの付加により増大し（Ｑβレプリカーゼを含まないコントロールに対して）、より少ない量でＱβレプリカーゼコードゲノム鋳型（ｐＣＤＮＡＱβ）の付加により増大することを示した。
【００９４】
突然変異がｓｃＦｖ配列中に挿入されているかどうかを測定するために、各レーンから得た主生産物をゲル単離し、精製した。ＤＮＡをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで切断し、同時に切断したｐＧＣベクターにライゲートし、標準的なプロトコールを使用して大腸菌にトランスフォームした。ＤＮＡを各シリーズから得た組換え体から単離し、各シリーズから得た６のランダムなクローンを、標準的な方法を使用してＤＮＡシークエンシングにかけた(BigDye Terminator Cycle Sequencing; PE Applied Biosystems CA)。各レーンに対しおよそ２８０塩基対をシークエンスし、図１４はこれらの配列中の突然変異中の数と位置を示す。この実験は、Ｑβレプリカーゼの存在下での転写及び翻訳の後、増大した数の突然変異の導入を示した（使用された形態のそれぞれで）。
【００９５】
実施例９
人工的Ｑβ配列の添加 Ｑβレプリカーゼ活性の効率を増大する試みにおいて、特異的Ｑβ結合部位を、ＰＣＲによって抗ＧｌｙＡ Ｔ７−ｓｃＦｖ鋳型の５’および３’末端の両者に加えた。この新しい鋳型（プライマーN5904及びN5910（センス）並びにN5909（アンチセンス）で増幅された；図１１）を、精製Ｑβレプリカーゼタンパク質、または結合転写／翻訳反応の間同時に合成できるＴ７転写プロモーターの制御の下での遺伝子鋳型としてのいずれかで、Ｑβレプリカーゼを含む結合転写／翻訳反応において使用した。ＨｅｐＢ、ＧｌｙＡまたはＢＳＡ結合磁性ビーズを使用する選択を実施し、生産物をＲＴ−ＰＣＲの後に回収した。人工Ｑβステムループ配列の存在は、（ｉ）結合転写、翻訳及び選択に対して負の影響を有さず、（ｉｉ）ほとんどの場合選択の後のＲＴ−ＰＣＲによって回収された生産物の量を増大した。
【００９６】
実施例１０
結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系における、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ転写産物の複製 リボソームディスプレーのためのＴ７−１Ｃ３及びＴ７−４Ｃ２ ｓｃＦｖ鋳型を、実施例３に記載されたように構築し、以下の条件の下で結合転写／翻訳にかけた。標準的な結合転写／翻訳反応を、Ｑβレプリカーゼの添加によって修飾した（実施例１に記載されたように精製されたもの）。標準的な２０μｌ反応物において、２０μｇ／ｍｌの酵素の１ｍｌを加えた。以前に我々は、結合系において抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖと抗Ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦｖの複製に対するＱβレプリカーゼの効果を比較し、１ｍｌのこのサンプルが最適な複製を提供することを観察した。塩化マグネシウムを、０．５ｍＭの最終濃度で加え、これは転写／翻訳因子に対する必要性を減少することが印刷されたレポートに示されている。反応を３７℃で２時間継続させた。３０℃で２０分での４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＮａＣｌ中のＤＮＡアーゼＩ切断によってＤＮＡ鋳型を除去した後、複製転写産物をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＤＮＡアーゼＩ及び他のタンパク質を除去するために、標準的なフェノール抽出を使用した。サンプルをエタノール沈降し、ＲＮＡ沈降物をＲＮＡアーゼを含まない水中に溶解した。各鋳型に特異的なプライマー（実施例３参照）を使用してＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、ＰＣＲ生成物（ＤＮＡ）をアガロースゲル電気泳動によって比較した。ＤＮＡバンドを、エチジウムブロマイドで染色することによって顕視化した。アガロースゲルを、ゲルプロ分析器の商業的なソフトウェアーでデジタル化したイメージをスキャンすることによってデンシトメトリーにかけた。図１３は、アガロースゲルのデンシトメータートレースを示し、これから精製Ｑβレプリカーゼを含むサンプル中で、生産された鋳型の量の増大が存在することが示される。
【００９７】
実施例１１
Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からの、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異；Ｑβレプリカーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製の間で転写産物を突然変異する。
上述の実施例において記載された結合転写／翻訳反応に、Ｑβレプリカーゼ精製酵素を補い、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写された抗ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ ＲＮＡを複製し突然変異した。転写／複製／突然変異／翻訳インキュベーションに引き続き、サンプルをＤＮＡアーゼＩで処理し、この酵素を実施例１０に記載されたように除去した。次いで精製ＲＮＡを、実施例３に記載された反応において抗ＧｌｙＡ ｓｃＦｖ特異的プライマーと共に、ＲＴ−ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。これらの反応で使用された熱安定性ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用される高性能vent, pfuポリメラーゼ酵素の一つである。ＰＣＲ反応生産物を、上述の商業的に入手可能なキットの一つで精製し、精製ＤＮＡを、商業的に入手可能なプラスミドpCRscriptにライゲートし、標準的な分子生物学的方法を使用してコンピーテント大腸菌XL1Blue細胞にトランスフォームした。トランスフォーメーション反応物を、X-galを含むＹＴアガープレート上に配置した。一晩のインキュベーションの後、コロニー（複数クローニング部位にＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを有する大腸菌）を拾い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＴブロスの５ｍｌ中で３７℃で一晩生育させた。ＤＮＡを、製造者の説明書に従って、商業的なキット(Quiagen)で培養物のそれぞれから抽出した。精製ＤＮＡを、ＤＮＡシークエンシングにより分析した：シークエンシングの結果が図１６に記載されている。この表は、突然変異体の数分のサンプリングを表す配列のランダムなサンプル中の突然変異と、全体のＱβレプリカーゼ複製／突然変異反応の配列変化を示す。
【００９８】
実施例図１２
鋳型ＲＮＡの予測二次構造 ＲＮＡ鋳型についてＱβレプリカーゼによって好まれるＲＮＡ配列及び推定の二次構造が報告されている(Zamora等, 1995)。これらまたは関連する好ましい構造が、連続的in vitro進化のための鋳型中に存在するかどうかを測定するために、上流非翻訳配列、Ｔ７プロモーター配列、１Ｃ３遺伝子をコードする配列、定常軽鎖アンカー領域遺伝子、抗ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦｖ遺伝子及びＩｇＭヒト定常重鎖アンカー領域遺伝子を、Ｍｆｏｌｄプログラムで分析し(Zucker等, 1991)、Ｑβレプリカーゼが好む構造と比較した（図８に示されている）。この比較から、１Ｃ３ ｓｃＦｖは、ＣＬアンカー領域と同様に、ＱβレプリカーゼのＭ部位構造を模倣した内部ＲＮＡ二次構造を有することが同定され、Zamora等, 1995によって報告された好ましい合成配列との類似性が示された。これは、Ｑβレプリカーゼによる抗Ｈｅｐｂ ４Ｃ２ ｓｃＦＶＣＨ３のものに対して、ＧｌｙＡ １Ｃ３ ｓｃＦｖ CL鋳型の好ましい複製を説明する（実施例３参照）。それ故、この領域をコードするＲＮＡは、Ｑβレプリカーゼ複製、並びにこの領域とその遺伝学的融合物の関連する突然変異を促進し増大するために、ＣＬ領域遺伝子は、結合転写／翻訳ディスプレーといずれかの突然変異誘発のためのディスプレーされた分子に対するアンカー領域として提案される。
【００９９】
実施例１３
pLysN-NS5B(83kDa, pI〜9.05)のための発現プロトコール pLysN-NS5Bは、Ｔ７プロモーターを有する細菌（細胞質性）発現ベクターである。NS5Bは、非構造的ＨｅｐＣ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。NS5Bを、Gly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカー、１０のHis残基並びにAsp-Asp-Asp-Asp-Lysリンカーが引き続くもの(GSGSGH10D4K)によって分離されたＮ末端でLysN部分に融合する。
【０１００】
このプラスミドを、大腸菌株HMS174(DE3)pLysS中にトランスフォームし、1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/mlアガープレートで３７℃で培養した。単一のコロニーを選択し、ブロス1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/ml中で３７℃で一晩培養した。発現のため、一晩の開始培養物を、１２０ｒｐｍで２Ｌ攪拌フラスコ中で３７℃で1YT/Amp100μg/ml／クロラムフェニコール34μg/ml中にＡ６００＝０．１に希釈してサブカルチャーした。培養物を、Ａ６００が０．８−１．０になるまで生育させ、次いで１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、Ａｍｐ１００μｇ／ｍｌを補い、３７℃で４−５時間発現を進行させた。
【０１０１】
培養物を回収し、事前に冷やしたローターで４℃で５０００ｇで遠心分離した。回収された培養物の湿潤重量を測定し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。約３−４グラムが、細胞培養物のリットル当たり生産された（湿潤重量）。
【０１０２】
溶解及び精製プロトコール HepC RdRp(NS5B)の抽出を、細胞を溶解し、引き続き従来のタンパク質化学法によって達成した。
【０１０３】
凍結した細胞ペレットに対し、細胞ペレットのグラム当たり４℃で５ｍｌの緩衝液Ｃ（新たに作製された）を加えた。培養物が完全に懸濁されるまで、混合物を磁性ビーズを使用して４℃で攪拌した。次いで培養物を、各破壊の間で１分の間隔で、それぞれ１０秒間の１１回の破壊を使用してソニケートし、ソニケーション工程の間で磁性ビーズを使用した攪拌を継続した。ソニケートされた細胞を、４℃で２０分の７５０００ｇで遠心分離し、上清（溶解物）を回収した。
【０１０４】
３０％の飽和ＡｍＳＯ4を溶解物に加え、次いで１５分間１００００ｇで遠心分離した。これは、いくらかの細菌タンパク質を除去するように機能した。ペレットを捨て、上清に５０％の飽和ＡｍＳＯ4を加え、１５分間１００００ｇで再び遠心分離した。これは、高い割合の大腸菌タンパク質からNS5Bを沈降するように機能した。上清を捨て、ペレットを緩衝液Ｃの初めの量の半分に再懸濁した。これを４℃で一晩緩衝液Ｃにおいて透析した。
【０１０５】
各工程から得た等量物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、〜90kDaのHepC RdRpバンドの部分的精製を確認した。
【０１０６】
透析抽出物を、緩衝液Ｃで事前に平衡化されたHyper D"S"樹脂を有するカチオン交換カラムに乗せた。次いでカラムを、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ｃで洗浄した。１Ｍ ＮａＣｌでの緩衝液Ｃの段階的勾配で溶出を実施した。NS5Bは、６００ｍＭのＮａＣｌ濃度に相当する５０％のＮａＣｌ比で溶出することが見出された。
【０１０７】
溶出分画を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、精製を確認した。NS5Bはこの工程により、マイナーなより小さい分子量の混在タンパク質を含む９０％の均一性まで精製された。
【０１０８】
精製NS5Bを、５０％の飽和ＡｍＳＯ4で濃縮し、ペレットを再溶解するのに十分な緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４を有する）中に再懸濁した。次いでこれを同じ緩衝液で透析し、ＡｍＳＯ4を除去した。
【０１０９】
この純度のNS5Bは、緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ）中の予備的Superose 12カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製が、任意ではあるが必要とされない程度であった。
【０１１０】
緩衝液（ソニケーション、溶解、溶出、透析） 緩衝液Ｃ
５０ｍＭ Na-PO4 pH6.8 Na2HPO4 ２．３２ｍｌ
（またはTris pH6.8 NaH2PO4について置換 ２．６９ｍｌ）
１００ｍＭ ＮａＣｌ ０．５８４４ｇ
１０％グリセリン １０ｍｌ
１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール ７０μｌ
０．０２％ ＮａＮ３ ８０μｌ
０．２５Ｍ ショ糖 ８．５６ｇ
０．１％ 界面活性剤（β−オクチルグルコピラノシド） ０．１ｇ
１ｍＭ Pefe-Bloc ０．１ｇ
Complete（商標）錠剤(No EDTA) ２錠
Ｈ２Ｏ １００ｍｌまで
【０１１１】
精製タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％アクリルアミド）及びタンパク質のクマシーブルー染色により、約７０ｋＤａの単一のバンドが示された。
【０１１２】
HepC RdRp(NS5B)を数多くのプロトコールによってアッセイした。最も単純な方法は、Novagen Large Scale Transcription Kit(TB069)に依存する。このプロトコールの修正した形態は、成功して使用されている。この方法は、以下のように略記される。
【０１１３】
Ｔ７／Ｔ３／ＳＰ６プロモーターの上流で切断された二本鎖ＤＮＡ鋳型を、ＲＮＡ鋳型を作製するためにＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下で使用する。次いで同じ混合物中でHepC RdRp(NS5B)は、Ｔ７ポリメラーゼによって生産されたＲＮＡを増幅する。
【０１１４】
ＤＮＡ鋳型（０．５μｇ／ｍｌ） １μｌ（０．５ｎｇ）
ＡＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＣＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＧＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
ＵＴＰ（２０ｍＭ） １０μｌ
５×転写緩衝液（４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、 ６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ） ２０μｌ
１Ｍ ＤＴＴ（１Ｍ） １μｌ
Ｔ７ポリメラーゼ（１００Ｕ／ｍｌ） １μｌ
HepC RdRp(NS5B) ｘμｌ
ヌクレアーゼを含まない水 ｙμｌ
【０１１５】
この方法は、キット中のコントロールＤＮＡ鋳型、並びにＴ７プロモーターの上流で成功して切断されたプラスミドＤＮＡを利用する。使用されるＤＮＡの量は、０．１ｎｇ程度の低さがうまくいくであろう。使用されるＴ７ポリメラーゼの量は、０．１μｌ程度の低さである。
【０１１６】
興味深いことに、これらの実験においてHepC RdRp(NS5B)は、オリゴヌクレオチドプライマーの不存在下でｄｓＤＮＡを与える能力、及びＲＮＡを増幅する能力を有することが示されている。
【０１１７】
実施例１４
真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中への、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列のクローニング Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列（図１０）を、結合転写／翻訳系におけるin situ発現、並びに標的ＲＮＡの同時的複製／突然変異のために、ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図９）内にクローン化した。真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニングのための、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下のものである：
5' GTGGTGGAATTCGCCGCCACCTCTATGTCGTACTCTTGGACC
5' GCACGGGCTTGGGCGATAATCCGCCGGCGAGCTCAGATC
【０１１８】
図１７に示されたベクターからＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅において、上述のオリゴヌクレオチドを使用した点を除いて、実施例２に記載されたものと同様のストラテジーを使用して、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐＣＤＮＡＨＥＰＣと命名）内にクローン化した。Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、in situで合成されていることを示すために使用された方法は、実施例２に記載されたものと全く同じであった。ｐＣＤＮＡＨＥＰＣ中のＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ鋳型を使用する結合反応から生じた結果は、図１８に示された。この図に示された結果は、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼ単独よりも多くの量の転写産物（スキャンｂ）を生ずることを示す。ここでバンドは、より強い強度を有し、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含まないバンドよりも広く、ＲＮＡに対する効果を示す。
【０１１９】
数多くの変形例及び／または修飾が、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特異的な実施態様に示されたような本発明になすことができることは、当業者によって予測されるであろう。従って本実施態様は、あらゆる点において説明的なものであり、制限するものではないと考慮される。
［参考文献］
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；及び
（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程；
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。
【請求項２】
（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；
（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択された複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以上繰り返す工程；
（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び
（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程；
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が一回より多く繰り返される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異体タンパク質が、それをコードするｍＲＮＡ分子にリボソーム複合体を経て結合される、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）から（ｄ）が、単一または複数の区画の容器のいずれかにおいて同時に実施され、複数の区画の容器が区画の間で液体の輸送を可能にする、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、
（ｉ）１０4塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ分子中に突然変異を導入する；または
（ｉｉ）１０-4の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；
請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、
（ｉ）１０3塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ分子中に突然変異を導入する；または
（ｉｉ）１０-3の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；
請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ型肝炎ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、水疱性口内炎ウイルスＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ、並びにＲＮＡバクテリオファージファイ６ ＲＮＡ依存性ＲＮＡより成る群から選択される、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼである、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
翻訳系が、セルフリー翻訳系である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
セルフリー翻訳系が、大腸菌由来のＳ−３０抽出物を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
セルフリー翻訳系が、網状赤血球溶解物を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
翻訳系が、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の全体の濃度で、酸化及び／または還元グルタチオンを含む、請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン濃度が、２ｍＭから７ｍＭの間である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
翻訳系が、約２ｍＭの濃度で酸化グルタチオンを、０．５ｍＭから５ｍＭの間の濃度で還元グルタチオンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＲＱ１３５ ＲＮＡ、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアントＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ、及びＲＱ１２０ ＲＮＡより成る群から選択された鋳型に由来する、請求項１から１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ及びＲＱ１３５ ＲＮＡから選択された鋳型を含むベクターに由来する、請求項１から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ鋳型を転写して、複製可能なｍＲＮＡを生産する工程をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ鋳型が、直線状ＤＮＡ分子である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ鋳型が：
（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；並びに
（ｉｉｉ）オープンリーディングフレームの上流に位置するステムループ構造；を含む、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
ステムループ構造が、レプリカーゼ結合配列である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識される、請求項２１から２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項２１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
第二のステムループ構造が、オープンリーディングフレームの下流に含まれる、請求項２０から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請求項２０から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする配列が、オープンリーディングフレームの３’及びフレーム中に融合される、請求項２０から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定常軽鎖ドメインである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
標的分子が、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスから選択される、請求項１から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
標的分子が、マトリックスに結合する、請求項１から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
マトリックスが、磁性ビーズを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに
（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列；
を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長さである、請求項３４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長さである、請求項３５記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３７】
レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識される、請求項３４から３６のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３８】
レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項３７記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３９】
第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流に含まれる、請求項３４から３８のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４０】
リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請求項３４から３９のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４１】
ポリペプチドをコードする配列が、クローニング部位に対して３’に位置する、請求項３４から４０のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４２】
ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項４１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４３】
イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定常軽鎖ドメインである、請求項４２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４４】
請求項３４から４３のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物を含む、複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキット。
【請求項４５】
（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ、またはＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型；
（ｉｉ）セルフリー翻訳系；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ；
（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに
（ｖ）一つ以上の制限酵素；
より成る群から選択される少なくとも一つの構成成分をさらに含む、請求項４４記載のキット。
【請求項１】
（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；及び
（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程；
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。
【請求項２】
（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択する工程；
（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択された複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以上繰り返す工程；
（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び
（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程；
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が一回より多く繰り返される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異体タンパク質が、それをコードするｍＲＮＡ分子にリボソーム複合体を経て結合される、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）から（ｄ）が、単一または複数の区画の容器のいずれかにおいて同時に実施され、複数の区画の容器が区画の間で液体の輸送を可能にする、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、
（ｉ）１０4塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ分子中に突然変異を導入する；または
（ｉｉ）１０-4の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；
請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、
（ｉ）１０3塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ分子中に突然変異を導入する；または
（ｉｉ）１０-3の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；
請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ型肝炎ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、水疱性口内炎ウイルスＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ、並びにＲＮＡバクテリオファージファイ６ ＲＮＡ依存性ＲＮＡより成る群から選択される、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼである、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
翻訳系が、セルフリー翻訳系である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
セルフリー翻訳系が、大腸菌由来のＳ−３０抽出物を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
セルフリー翻訳系が、網状赤血球溶解物を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
翻訳系が、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の全体の濃度で、酸化及び／または還元グルタチオンを含む、請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン濃度が、２ｍＭから７ｍＭの間である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
翻訳系が、約２ｍＭの濃度で酸化グルタチオンを、０．５ｍＭから５ｍＭの間の濃度で還元グルタチオンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＲＱ１３５ ＲＮＡ、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアントＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ、及びＲＱ１２０ ＲＮＡより成る群から選択された鋳型に由来する、請求項１から１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ及びＲＱ１３５ ＲＮＡから選択された鋳型を含むベクターに由来する、請求項１から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ鋳型を転写して、複製可能なｍＲＮＡを生産する工程をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ鋳型が、直線状ＤＮＡ分子である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ鋳型が：
（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム；並びに
（ｉｉｉ）オープンリーディングフレームの上流に位置するステムループ構造；を含む、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
ステムループ構造が、レプリカーゼ結合配列である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識される、請求項２１から２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項２１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
第二のステムループ構造が、オープンリーディングフレームの下流に含まれる、請求項２０から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請求項２０から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする配列が、オープンリーディングフレームの３’及びフレーム中に融合される、請求項２０から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定常軽鎖ドメインである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
標的分子が、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスから選択される、請求項１から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
標的分子が、マトリックスに結合する、請求項１から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
マトリックスが、磁性ビーズを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；
（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに
（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列；
を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長さである、請求項３４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長さである、請求項３５記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３７】
レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識される、請求項３４から３６のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３８】
レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項３７記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３９】
第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流に含まれる、請求項３４から３８のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４０】
リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請求項３４から３９のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４１】
ポリペプチドをコードする配列が、クローニング部位に対して３’に位置する、請求項３４から４０のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４２】
ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項４１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４３】
イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定常軽鎖ドメインである、請求項４２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４４】
請求項３４から４３のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物を含む、複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキット。
【請求項４５】
（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ、またはＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型；
（ｉｉ）セルフリー翻訳系；
（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ；
（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに
（ｖ）一つ以上の制限酵素；
より成る群から選択される少なくとも一つの構成成分をさらに含む、請求項４４記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１０−１１９３９６（Ｐ２０１０−１１９３９６Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４５３（Ｐ２０１０−５３４５３）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【分割の表示】特願２０００−５４８４５２（Ｐ２０００−５４８４５２）の分割
【原出願日】平成１１年５月７日（１９９９．５．７）
【出願人】（５００２８８５２２）ダイアテック・ピーティワイ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【分割の表示】特願２０００−５４８４５２（Ｐ２０００−５４８４５２）の分割
【原出願日】平成１１年５月７日（１９９９．５．７）
【出願人】（５００２８８５２２）ダイアテック・ピーティワイ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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