遺伝子クラスターまたはその一部分をクローニングするためのベクターおよび方法
本発明は、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）の二次代謝物の生合成遺伝子クラスターのクローニング、伝達および異種発現を容易にするための、シャトルＢＡＣベクターに関する。本発明はまた、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、二次代謝物の生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングするプロセスを増強するための、このベクターを用いたプラスミドレスキュー方法にも関する。その後、クローニングしたＤＮＡを、推定上の二次代謝物の遺伝子クラスターの配列決定または異種発現に使用することができる。
【図１】
【図１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子クラスターの全体または一部分を含有する大きな核酸断片を、１つの原核生物から別の原核生物へとクローニングまたは移すためのベクターおよび方法に関する。本発明はまた、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するためのプラスミドレスキュー方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含めた放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のグラム陽性細菌は、巨大な量の有用な薬学的活性を有する天然物を産生する。これらの天然物の多くは、非常に多様な化学構造および生物活性を有するポリケチドまたは非リボソームペプチドのファミリーのどちらかに属する。ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）および非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）は、対応する化学物質の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイム（ｍｅｇａｎｚｙｍｅ）である（Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｊ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｋ．Ｊ．、２００４、Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ、２００１、１８：３８０〜４１６；Ｆｉｎｋｉｎｇ Ｒ、Ｍａｒａｈｉｅｌ ＭＡ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５８：４５３〜４８８；Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、２００４；５８：４５３〜８８）。多酵素系をコードする遺伝子は、通常、染色体上でグループを作っており、明確な生合成遺伝子クラスターを形成している。最終産物次第では、遺伝子クラスターの大きさは１００ｋｂの規模であることができる（Ａｕｇｕｓｔ，Ｐ．Ｒ．、Ｔａｎｇ，Ｌ．、Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、Ｎｉｎｇ，Ｓ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．、Ｙｕ，Ｔ．Ｗ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｄ．、Ｋｉｍ，Ｃ．Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ，Ｃ．Ｒ．、およびＦｌｏｓｓ，Ｈ．Ｇ．、１９９８、Ｓ６９９、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５：６９〜７９）。この現象は、異種発現の研究に特に有用である、１つのクローン内に大きな遺伝子クラスターをクローニングすることに対する挑戦を提示している。細菌人工染色体（ＢＡＣ）の適用によりクローニングプロセスが容易になるが、任意の大きな遺伝子クラスターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達することは、依然として挑戦を要する。最近、この挑戦を乗り越えるために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルＢＡＣベクターが構築された（Ｓｏｓｉｏ，Ｍ．、Ｆ．Ｇｉｕｓｉｎｏ、Ｃ．Ｃａｐｐｅｌｌａｎｏ、Ｅ．Ｂｏｓｓｉ、Ａ．Ｍ．Ｐｕｇｌｉａ、およびＳ．Ｄｏｎａｄｉｏ、２０００、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ．、１８：３４３〜３４５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．他、２００４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７０（４）：２４５２〜６３）。どちらの研究においても、染色体内にベクターを部位特異的に組み込むために、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系を利用した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
大きな遺伝子クラスターをストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングするために使用する慣用方法は、通常、コスミドまたはＢＡＣのライブラリのどちらかの複雑かつ困難な構築およびスクリーニングを含む。現在、全ゲノム配列決定データが数々のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）株について利用可能である。さらに、天然物の生合成経路のさらなる特徴づけは、益々興味が持たれている領域である。
【０００４】
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂ．Ａ．、Ｚｉｎｎ，Ｋ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４４：８１〜９４；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｕ．、Ｐｌａｔｚｅｒ，Ｍ．、およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍ．、１９８４、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、１９３：５１２〜５１９；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，Ｙ．、およびＤｕｂｎａｕ，Ｄ．、１９８３、Ｊ Ｂａｃｔ．、１５４：１０７７〜１０８７；ＭｃＭａｈｏｎ Ｔ．Ｌ．、Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋａ，Ｚ．、Ｂａｒｔｈ，Ｃ．、Ｆｒａｓｅｒ，Ｂ．Ｄ．、Ｐｏｎｔｅｓ，Ｌ．、およびＦｉｓｈｅｒ Ｐ．Ｒ．、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４：４０９６〜４０９７）。この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は、主に挿入部位に直接隣接した領域のクローニングおよび同定に使用されている。
【０００５】
本明細書中で参考文献の引用する際はすべて、そのような参考文献が本発明の従来技術として利用可能であることの承認ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさの遺伝子クラスターを直接クローニングするためのシャトルＢＡＣベクターを提供する。ベクターは、クローニングしたＤＮＡを原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の株内へと伝達して組み込むために用いる。クローニングしたＤＮＡの組込みは、レシピエントの染色体のφＢＴ１ ａｔｔＢ部位で起こる。本発明はまた、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの作製およびスクリーニングを必要とせずに、大きなＤＮＡ断片を指定した放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）株から直接クローニングするために使用することができるプラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法も提供する。これらの大きなＤＮＡ断片は、インタクトな遺伝子クラスターまたは遺伝子クラスターの主要部分を含有し得る。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、少なくとも２つの複製起点、原核Ｆ因子分配系、伝達起点、ベクターをレシピエント細胞内に組み込むことを可能にする部位特異的組換え系、および選択マーカーを含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、少なくとも２つの複製起点、原核Ｆ因子分配系、伝達起点、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系、および選択マーカーを含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、遺伝子クラスターの全体または一部分をさらに含む、本明細書中に記載のベクターを提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明のベクターをその中から伝達する原核生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。他の実施形態では、原核生物は、同じもしくは異なる放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の株、または遺伝物質を１つの生物から別の生物へと伝達するために当業者に知られている任意の他の原核生物であり得る。遺伝物質のドナーは原核または真核生物であり得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明のベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである。一実施形態では、ＢＡＣベクターはシャトルＢＡＣベクターである。一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクター、ｐＳＢＡＣ（配列番号１）である。
【００１２】
一実施形態では、本発明のベクターの少なくとも２つの複製起点は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点である。一実施形態では、２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点は、ｏｒｉ２およびｏｒｉＶである。一実施形態では、複製起点の少なくとも１つはｏｒｉ２およびｏｒｉＶから選択される。一実施形態では、複製起点の少なくとも１つは、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｏｒｉ２核酸配列は、配列番号２に記載されている。一実施形態では、ｏｒｉＶ核酸配列は配列番号３に記載されている。
【００１３】
一実施形態では、本発明のベクターの原核Ｆ因子分配系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系である。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系の核酸配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明のベクターの伝達起点はｏｒｉＴである。一実施形態では、伝達起点は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明のベクターは、二次代謝物の特異的な生合成経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、大きなＤＮＡ断片のクローニングまたは伝達を提供する。一実施形態では、遺伝子産物は、ポリケチドおよび非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）から選択される。一実施形態では、ポリケチドは、抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、抗真菌剤およびコレステロール降下剤からなる群から選択される。一実施形態では、本発明のポリケチドは、マクロライド抗生物質またはテトラサイクリン抗生物質である。一実施形態では、マクロライド抗生物質は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシンおよびトロレアンドマイシンからなる群から選択される。一実施形態では、テトラサイクリンは、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびデメクロサイクリンからなる群から選択される。一実施形態では、本発明のポリケチドは、ラパマイシン、アスコマイシン（ＦＫ５２０）およびタクロリムス（ＦＫ−５０６）からなる群から選択される免疫抑制剤である。一実施形態では、本発明のポリケチドは、抗癌剤ドキソルビシンである。一実施形態では、本発明のポリケチドは、抗真菌剤アムホテリシンＢである。一実施形態では、本発明のポリケチドは、コレステロール降下剤ロバスタチンである。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、免疫抑制剤または抗生物質である。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、免疫抑制剤シクロスポリンＡである。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、抗生物質ペニシリンである。一実施形態では、本発明のベクターは、アクチノロージンまたはメリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片の、クローニングまたは伝達を提供する。一実施形態では、本発明のベクターは、メリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片の、クローニングまたは伝達を提供し、遺伝子クラスターは、配列番号３１の核酸配列を含むｍｅｒ遺伝子クラスターである。
【００１７】
本発明の第３の態様は、大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、ベクターの組込みを可能にする部位特異的組込み配列を有する核酸を含有する本発明のベクターのうちの任意のものをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞へと伝達するステップと、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、ＤＮＡをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞の染色体から単離するステップと、ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、ベクターのうちの任意のものを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、大きなＤＮＡ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、ベクターの組込みを可能にする相同配列を含有する本発明のベクターのうちの任意のものをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞へと伝達するステップと、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、ＤＮＡをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞の染色体から単離するステップと、前のステップからの単離したＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、本発明のベクターのうちの任意のものを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、大きなＤＮＡ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、遺伝子クラスターの全体または一部分である大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングすることを提供する。一実施形態では、遺伝子クラスターは、アクチノロージンまたはメリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする。
【００２０】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、レシピエント細胞内に部位特異的組込み配列を提供し、これはａｔｔ部位である。一実施形態では、レシピエント細胞内のａｔｔ部位は、配列番号６のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位である。
【００２１】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される生物学的活性または酵素活性について選択することを含む選択ステップを提供する。
【００２２】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、ベクターの伝達が、ベクターを含有するドナー細胞をレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞と接合させることを含むことを提供する。
【００２３】
本発明の第５の態様は、配列番号３１のｍｅｒ遺伝子クラスターによってコードされているアミノ酸を発現させることを含む、メリダマイシンの産生方法を提供する。
【００２４】
一実施形態では、ｍｅｒ遺伝子クラスターは、配列番号１のｐＳＢＡＣベクター内に取り込まれている。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することでより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子クラスターの全体または一部分を含有する大きな核酸断片を、１つの原核生物から別の原核生物へとクローニングまたは移すためのベクターおよび方法に関する。本発明はまた、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するためのプラスミドレスキュー方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含めた放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のグラム陽性細菌は、巨大な量の有用な薬学的活性を有する天然物を産生する。これらの天然物の多くは、非常に多様な化学構造および生物活性を有するポリケチドまたは非リボソームペプチドのファミリーのどちらかに属する。ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）および非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）は、対応する化学物質の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイム（ｍｅｇａｎｚｙｍｅ）である（Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｊ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ Ｋ．Ｊ．、２００４、Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ、２００１、１８：３８０〜４１６；Ｆｉｎｋｉｎｇ Ｒ、Ｍａｒａｈｉｅｌ ＭＡ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５８：４５３〜４８８；Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、２００４；５８：４５３〜８８）。多酵素系をコードする遺伝子は、通常、染色体上でグループを作っており、明確な生合成遺伝子クラスターを形成している。最終産物次第では、遺伝子クラスターの大きさは１００ｋｂの規模であることができる（Ａｕｇｕｓｔ，Ｐ．Ｒ．、Ｔａｎｇ，Ｌ．、Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、Ｎｉｎｇ，Ｓ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．、Ｙｕ，Ｔ．Ｗ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｄ．、Ｋｉｍ，Ｃ．Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ，Ｃ．Ｒ．、およびＦｌｏｓｓ，Ｈ．Ｇ．、１９９８、Ｓ６９９、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５：６９〜７９）。この現象は、異種発現の研究に特に有用である、１つのクローン内に大きな遺伝子クラスターをクローニングすることに対する挑戦を提示している。細菌人工染色体（ＢＡＣ）の適用によりクローニングプロセスが容易になるが、任意の大きな遺伝子クラスターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達することは、依然として挑戦を要する。最近、この挑戦を乗り越えるために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルＢＡＣベクターが構築された（Ｓｏｓｉｏ，Ｍ．、Ｆ．Ｇｉｕｓｉｎｏ、Ｃ．Ｃａｐｐｅｌｌａｎｏ、Ｅ．Ｂｏｓｓｉ、Ａ．Ｍ．Ｐｕｇｌｉａ、およびＳ．Ｄｏｎａｄｉｏ、２０００、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ．、１８：３４３〜３４５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．他、２００４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７０（４）：２４５２〜６３）。どちらの研究においても、染色体内にベクターを部位特異的に組み込むために、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系を利用した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
大きな遺伝子クラスターをストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングするために使用する慣用方法は、通常、コスミドまたはＢＡＣのライブラリのどちらかの複雑かつ困難な構築およびスクリーニングを含む。現在、全ゲノム配列決定データが数々のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）株について利用可能である。さらに、天然物の生合成経路のさらなる特徴づけは、益々興味が持たれている領域である。
【０００４】
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｂ．Ａ．、Ｚｉｎｎ，Ｋ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４４：８１〜９４；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｕ．、Ｐｌａｔｚｅｒ，Ｍ．、およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍ．、１９８４、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、１９３：５１２〜５１９；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，Ｙ．、およびＤｕｂｎａｕ，Ｄ．、１９８３、Ｊ Ｂａｃｔ．、１５４：１０７７〜１０８７；ＭｃＭａｈｏｎ Ｔ．Ｌ．、Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋａ，Ｚ．、Ｂａｒｔｈ，Ｃ．、Ｆｒａｓｅｒ，Ｂ．Ｄ．、Ｐｏｎｔｅｓ，Ｌ．、およびＦｉｓｈｅｒ Ｐ．Ｒ．、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４：４０９６〜４０９７）。この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は、主に挿入部位に直接隣接した領域のクローニングおよび同定に使用されている。
【０００５】
本明細書中で参考文献の引用する際はすべて、そのような参考文献が本発明の従来技術として利用可能であることの承認ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさの遺伝子クラスターを直接クローニングするためのシャトルＢＡＣベクターを提供する。ベクターは、クローニングしたＤＮＡを原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の株内へと伝達して組み込むために用いる。クローニングしたＤＮＡの組込みは、レシピエントの染色体のφＢＴ１ ａｔｔＢ部位で起こる。本発明はまた、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの作製およびスクリーニングを必要とせずに、大きなＤＮＡ断片を指定した放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）株から直接クローニングするために使用することができるプラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法も提供する。これらの大きなＤＮＡ断片は、インタクトな遺伝子クラスターまたは遺伝子クラスターの主要部分を含有し得る。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、少なくとも２つの複製起点、原核Ｆ因子分配系、伝達起点、ベクターをレシピエント細胞内に組み込むことを可能にする部位特異的組換え系、および選択マーカーを含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、少なくとも２つの複製起点、原核Ｆ因子分配系、伝達起点、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系、および選択マーカーを含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、遺伝子クラスターの全体または一部分をさらに含む、本明細書中に記載のベクターを提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明のベクターをその中から伝達する原核生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。他の実施形態では、原核生物は、同じもしくは異なる放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の株、または遺伝物質を１つの生物から別の生物へと伝達するために当業者に知られている任意の他の原核生物であり得る。遺伝物質のドナーは原核または真核生物であり得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明のベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである。一実施形態では、ＢＡＣベクターはシャトルＢＡＣベクターである。一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクター、ｐＳＢＡＣ（配列番号１）である。
【００１２】
一実施形態では、本発明のベクターの少なくとも２つの複製起点は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点である。一実施形態では、２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点は、ｏｒｉ２およびｏｒｉＶである。一実施形態では、複製起点の少なくとも１つはｏｒｉ２およびｏｒｉＶから選択される。一実施形態では、複製起点の少なくとも１つは、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｏｒｉ２核酸配列は、配列番号２に記載されている。一実施形態では、ｏｒｉＶ核酸配列は配列番号３に記載されている。
【００１３】
一実施形態では、本発明のベクターの原核Ｆ因子分配系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系である。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系の核酸配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明のベクターの伝達起点はｏｒｉＴである。一実施形態では、伝達起点は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明のベクターは、二次代謝物の特異的な生合成経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、大きなＤＮＡ断片のクローニングまたは伝達を提供する。一実施形態では、遺伝子産物は、ポリケチドおよび非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）から選択される。一実施形態では、ポリケチドは、抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、抗真菌剤およびコレステロール降下剤からなる群から選択される。一実施形態では、本発明のポリケチドは、マクロライド抗生物質またはテトラサイクリン抗生物質である。一実施形態では、マクロライド抗生物質は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシンおよびトロレアンドマイシンからなる群から選択される。一実施形態では、テトラサイクリンは、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびデメクロサイクリンからなる群から選択される。一実施形態では、本発明のポリケチドは、ラパマイシン、アスコマイシン（ＦＫ５２０）およびタクロリムス（ＦＫ−５０６）からなる群から選択される免疫抑制剤である。一実施形態では、本発明のポリケチドは、抗癌剤ドキソルビシンである。一実施形態では、本発明のポリケチドは、抗真菌剤アムホテリシンＢである。一実施形態では、本発明のポリケチドは、コレステロール降下剤ロバスタチンである。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、免疫抑制剤または抗生物質である。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、免疫抑制剤シクロスポリンＡである。一実施形態では、本発明の非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）は、抗生物質ペニシリンである。一実施形態では、本発明のベクターは、アクチノロージンまたはメリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片の、クローニングまたは伝達を提供する。一実施形態では、本発明のベクターは、メリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片の、クローニングまたは伝達を提供し、遺伝子クラスターは、配列番号３１の核酸配列を含むｍｅｒ遺伝子クラスターである。
【００１７】
本発明の第３の態様は、大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、ベクターの組込みを可能にする部位特異的組込み配列を有する核酸を含有する本発明のベクターのうちの任意のものをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞へと伝達するステップと、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、ＤＮＡをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞の染色体から単離するステップと、ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、ベクターのうちの任意のものを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、大きなＤＮＡ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、ベクターの組込みを可能にする相同配列を含有する本発明のベクターのうちの任意のものをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞へと伝達するステップと、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、ＤＮＡをレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞の染色体から単離するステップと、前のステップからの単離したＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、本発明のベクターのうちの任意のものを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、大きなＤＮＡ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、遺伝子クラスターの全体または一部分である大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングすることを提供する。一実施形態では、遺伝子クラスターは、アクチノロージンまたはメリダマイシンの生合成に関与しているタンパク質をコードする。
【００２０】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、レシピエント細胞内に部位特異的組込み配列を提供し、これはａｔｔ部位である。一実施形態では、レシピエント細胞内のａｔｔ部位は、配列番号６のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位である。
【００２１】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される生物学的活性または酵素活性について選択することを含む選択ステップを提供する。
【００２２】
一実施形態では、本発明のプラスミドレスキュー方法は、ベクターの伝達が、ベクターを含有するドナー細胞をレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞と接合させることを含むことを提供する。
【００２３】
本発明の第５の態様は、配列番号３１のｍｅｒ遺伝子クラスターによってコードされているアミノ酸を発現させることを含む、メリダマイシンの産生方法を提供する。
【００２４】
一実施形態では、ｍｅｒ遺伝子クラスターは、配列番号１のｐＳＢＡＣベクター内に取り込まれている。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することでより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも２つの複製起点、
（ｂ）原核Ｆ因子分配系、
（ｃ）伝達起点、
（ｄ）ベクターをレシピエント細胞内に組み込むことを可能にする部位特異的組換え系、および
（ｅ）選択マーカー
を含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクター。
【請求項２】
大きなＤＮＡ断片をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
（ａ）少なくとも２つの複製起点、
（ｂ）原核Ｆ因子分配系、
（ｃ）伝達起点、
（ｄ）φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系、および
（ｅ）選択マーカー
を含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へとクローニングまたは伝達するためのベクター。
【請求項５】
大きなＤＮＡ断片をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
原核生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１から６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである、請求項１から７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
ＢＡＣベクターがシャトルＢＡＣベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
シャトルＢＡＣベクターが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクター、ｐＳＢＡＣである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
２つの複製起点が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点である、請求項１から１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
複製起点の少なくとも１つがｏｒｉ２およびｏｒｉＶから選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
複製起点の少なくとも１つが配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
原核Ｆ因子分配系が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系である、請求項１から１３のいずれかに記載のベクター。
【請求項１５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系が配列番号４の核酸配列を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
伝達起点がｏｒｉＴである、請求項１から１５のいずれかに記載のベクター。
【請求項１７】
伝達起点が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
遺伝子クラスターが、二次代謝物の特異的な生合成経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、請求項３または請求項６から１７のいずれかに記載のベクター。
【請求項１９】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
二次代謝物のための生合成経路の遺伝子産物（複数可）がポリケチドまたは非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
ポリケチドが、抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、抗真菌剤およびコレステロール降下剤からなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片が約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、
（ａ）請求項１から２１のいずれかに記載のいずれかのベクターを、ベクターの組込みを可能にする部位特異的組込み配列を有する核酸を含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞に伝達するステップと、
（ｂ）放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＤＮＡをレシピエント細胞の染色体から単離するステップと、
（ｄ）ステップｃ）からのＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、
（ｅ）請求項２０に記載のいずれかのベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、
（ｆ）ステップｅ）のベクターから大きなＤＮＡ断片を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
レシピエント細胞内の部位特異的組込み配列がａｔｔ部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
レシピエント細胞内のａｔｔ部位が、配列番号６のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、ＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、
（ａ）請求項１から２１のいずれかに記載のいずれかのベクターを、ベクターの相同組換えを可能にする相同配列を含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞に伝達するステップと、
（ｂ）放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＤＮＡをレシピエント細胞の染色体から単離するステップと、
（ｄ）ステップｃ）からのＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、
（ｅ）請求項２０に記載のいずれかのベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、
（ｆ）ステップｅ）のベクターからＤＮＡ断片を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
選択するステップが、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される生物学的活性または酵素活性について選択することを含む、請求項２２または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ベクターの伝達が、ベクターを含有するドナー細胞をレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞と接合させることを含む、請求項２２または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
配列番号３１のｍｅｒ遺伝子クラスターによってコードされているアミノ酸を発現させることを含む、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中でメリダマイシンを産生する方法。
【請求項３３】
ｍｅｒ遺伝子クラスターが配列番号１のｐＳＢＡＣベクター内に取り込まれている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子クラスターが配列番号３１を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項１】
（ａ）少なくとも２つの複製起点、
（ｂ）原核Ｆ因子分配系、
（ｃ）伝達起点、
（ｄ）ベクターをレシピエント細胞内に組み込むことを可能にする部位特異的組換え系、および
（ｅ）選択マーカー
を含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へクローニングまたは伝達するためのベクター。
【請求項２】
大きなＤＮＡ断片をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
（ａ）少なくとも２つの複製起点、
（ｂ）原核Ｆ因子分配系、
（ｃ）伝達起点、
（ｄ）φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系、および
（ｅ）選択マーカー
を含む、遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種へとクローニングまたは伝達するためのベクター。
【請求項５】
大きなＤＮＡ断片をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
原核生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１から６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである、請求項１から７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
ＢＡＣベクターがシャトルＢＡＣベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
シャトルＢＡＣベクターが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクター、ｐＳＢＡＣである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
２つの複製起点が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点である、請求項１から１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
複製起点の少なくとも１つがｏｒｉ２およびｏｒｉＶから選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
複製起点の少なくとも１つが配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
原核Ｆ因子分配系が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系である、請求項１から１３のいずれかに記載のベクター。
【請求項１５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子分配系が配列番号４の核酸配列を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
伝達起点がｏｒｉＴである、請求項１から１５のいずれかに記載のベクター。
【請求項１７】
伝達起点が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
遺伝子クラスターが、二次代謝物の特異的な生合成経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、請求項３または請求項６から１７のいずれかに記載のベクター。
【請求項１９】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
二次代謝物のための生合成経路の遺伝子産物（複数可）がポリケチドまたは非リボソームポリペプチド（ＮＲＰ）である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
ポリケチドが、抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、抗真菌剤およびコレステロール降下剤からなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、大きなＤＮＡ断片が約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、
（ａ）請求項１から２１のいずれかに記載のいずれかのベクターを、ベクターの組込みを可能にする部位特異的組込み配列を有する核酸を含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞に伝達するステップと、
（ｂ）放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＤＮＡをレシピエント細胞の染色体から単離するステップと、
（ｄ）ステップｃ）からのＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、
（ｅ）請求項２０に記載のいずれかのベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、
（ｆ）ステップｅ）のベクターから大きなＤＮＡ断片を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
レシピエント細胞内の部位特異的組込み配列がａｔｔ部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
レシピエント細胞内のａｔｔ部位が、配列番号６のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
大きなＤＮＡ断片を単離またはクローニングするためのプラスミドレスキュー方法であって、ＤＮＡ断片は約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさであり、
（ａ）請求項１から２１のいずれかに記載のいずれかのベクターを、ベクターの相同組換えを可能にする相同配列を含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞に伝達するステップと、
（ｂ）放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）染色体内に取り込まれたベクターを含有するレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＤＮＡをレシピエント細胞の染色体から単離するステップと、
（ｄ）ステップｃ）からのＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に伝達するステップと、
（ｅ）請求項２０に記載のいずれかのベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についてスクリーニングするステップと、
（ｆ）ステップｅ）のベクターからＤＮＡ断片を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
大きなＤＮＡ断片が遺伝子クラスターの全体または一部分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子クラスターが、アクチノロージン、メリダマイシン、またはその誘導体の生合成に関与しているタンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
選択するステップが、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される生物学的活性または酵素活性について選択することを含む、請求項２２または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ベクターの伝達が、ベクターを含有するドナー細胞をレシピエント放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞と接合させることを含む、請求項２２または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
配列番号３１のｍｅｒ遺伝子クラスターによってコードされているアミノ酸を発現させることを含む、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中でメリダマイシンを産生する方法。
【請求項３３】
ｍｅｒ遺伝子クラスターが配列番号１のｐＳＢＡＣベクター内に取り込まれている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子クラスターが配列番号３１を含む、請求項１９に記載のベクター。
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）ＢＡＣベクターｐＳＢＡＣのマップを示す図である。
【図２】プラスミドレスキューの模式図およびレスキューしたクローンの分析を示す図である。
【図３】ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために使用した戦略の模式図およびレスキューしたクローンの分析を示す図である。
【図４】エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４および相補株ＡＣＴｒｅｓ１２の粗抽出物の吸収スペクトルを示す図である。
【図５】（Ａ）ｍｅｒ遺伝子クラスター全体をｐＳＢＡＣベクター内にクローニングすることを示す図である。ｍｅｒ遺伝子クラスターの模式図を示す。矢印はＭｅｒＰ遺伝子の翻訳開始コドン部位を表す。実線はライブラリのスクリーニングに使用したプローブを表し、斜線はサザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを表す。（Ｂ）サザン分析によって、ｍｅｒ遺伝子クラスターが異種宿主内に導入されたことが確認された。
【図６】様々な株におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの転写の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図７】エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４、ＨＬ３０−Ｋ３、Ｅ７、元のメリダマイシン産生株ＮＲＲＬ３０７４８ならびにメリダマイシンおよび３−ノルメルジアマイシン標準の発酵抽出物のＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。
【図８】４％のプロリンおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させたストレインＥ７からのメルダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンの産生の、ＨＲＭＳ確認を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本方法および処理方法を記載する前に、本発明は、記載した特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変化し得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈により明らかにそうでないと表されない場合以外は、複数形の言及も含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、１つまたは複数の方法、および／または本明細書中に記載するおよび／または本開示を読解した際に当業者に明らかとなる種類のステップなどが含まれる。
【００２９】
したがって、本出願中では、当分野の技術範囲内にある慣用の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用い得る。そのような技術は文献中に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９」）；ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；固定細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングの実用的指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００３０】
本明細書中に記載のものと類似または均等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての出版物は、その全体が参考として組み込まれている。
【００３１】
定義
本明細書中で使用する用語は当業者に理解かつ知られている意味を持つが、利便性および完全性のために、特定の用語およびその意味を以下に記載する。
【００３２】
用語「約」とは、２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。本発明の一実施形態では、用語「約」とは、２０ｋｂ〜１００ｋｂの範囲である、本発明中に記載する遺伝子クラスターの大きさをいう。一実施形態では、用語「約」とは、本明細書中に記載する実際の大きさまたは範囲をいう。
【００３３】
「放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）」とは、非運動性かつ糸状のグラム陽性細菌である。放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、成長するにつれて、枝分れする細胞のフィラメントを形成し、これは菌糸体と呼ばれる糸状のネットワークとなり、外観が一部の真菌の菌糸体と似ている。放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）はまた、胞子を形成し、数々の抗生物質を産生するその様式も独特である。この群の、圧倒的に最も盛大な属はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）であり、５００を超える種が存在する。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、その枝分れする糸状構造が真菌に似ている細菌である、細菌目の放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のメンバーである。しかし、これらは、真核の真菌細胞とは異なり、真の細菌、すなわち原核細胞である。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種とは、マクロライド抗生物質複合体を産生する陸生の放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）をいう。
【００３４】
アクチノロージンとは、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の青色色素を有する芳香族ポリケチド抗生物質をいい、その基本的な炭素骨格はＩＩ型ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）に由来する。（Ａ．ＺｅｅｃｋおよびＰ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、７２４（１９６９）、ページ１７２〜１８２）。
【００３５】
「抗生物質生合成経路」には、一次代謝物を抗生物質へと変換するプロセスに必要な抗生物質生合成遺伝子の全集合が含まれる。これらの遺伝子は当分野で周知の方法によって単離することができ、例えば米国特許第４，９３５，３４０号を参照されたい。
【００３６】
「ａｔｔ」部位とは、２つの核酸分子間の部位特異的組換えを容易にする、核酸の同一性または類似性を有する部位をいう。例えば、本発明中に記載する１つのａｔｔ部位は、φＢＴ１バクテリオファージの組込み部位である（Ｇｒｅｇｏｒｙ，ＭＡ他、２００３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５、第１７号：５３２０〜５３２３）。「ａｔｔＢ」部位とは、細菌細胞の染色体上の付着部位をいい、「ａｔｔＰ」部位とは、バクテリオファージ上の付着部位をいう。φＢＴ１系のバクテリオファージ中のａｔｔＰ部位の核酸配列を配列番号７に示し、φＢＴ１系の細菌細胞（放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ））中のａｔｔＢ部位の核酸配列を配列番号６に示す。「ａｔｔ」部位の別の例は、Ｂｉｅｒｍａｎ他によって記載されているφＣ３１ ａｔｔ部位である（Ｂｉｅｒｍａｎ，Ｍ．、Ｒ．Ｌｏｇａｎ、Ｋ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｅ．Ｔ．Ｓｅｎｏ、Ｒ．Ｎ．Ｒａｏ、およびＢ．Ｅ．Ｓｃｈｏｎｅｒ（１９９２）、Ｇｅｎｅ、１１６：４３〜４９ならびにＫｉｅｓｅｒ，Ｔ．、Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ、Ｍ．Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ、Ｋ．Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ、およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ノッティンガム大学、英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「ＢＡＣ」（細菌人工染色体）とは、大きなＤＮＡ断片をその中に挿入することができる細菌の染色体に由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲の大きさであり得る。一実施形態では、大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲の大きさであり得る。一実施形態では、大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさの遺伝子クラスターの全体または一部分を含む。大きなＤＮＡ断片のＢＡＣは、単一コピーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦプラスミドに基づいており、＞３００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ならびにバキュロウイルスおよびネズミサイトメガロウイルスのものを含めた大きなＤＮＡウイルスのゲノムを安定に維持することが以前に実証されている（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２）；Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６ ４５７９（１９９３）；Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１４７５９ １４７６３（１９９７））。本明細書中で使用する用語「組換え細菌人工染色体」（ＢＡＣ）とは、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂまでの範囲の大きさの大きなＤＮＡ挿入物を含有するＢＡＣベクターをいう。一実施形態では、大きなＤＮＡ挿入物は、特異的生合成代謝経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの遺伝子クラスターの全体または一部分を含む。組換えＢＡＣのＤＮＡが宿主細菌内に導入された後、これは、自己複製するか、または宿主の染色体内に組み込まれることができる。
【００３８】
用語「二次代謝物のための生合成経路」とは、薬学的に使用するために二次代謝物を合成するための、細菌、ヒト、および様々な植物の遺伝子からなる生合成ネットワークをいう。この経路は、一般に、一連の天然に存在する酵素に制御された反応を含み、１つの物質が別の物質に変換されて、二次代謝物または副産物の放出がもたらされる。
【００３９】
「コード配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列とは、発現された場合にＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、言い換えると、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列には、開始コドン（通常はＡＴＧ）およびストップコドンが含まれ得る。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「接合」とは、細胞の直接接触を介した、１つの原核細胞から別の原核細胞への核酸の直接伝達をいう。したがって、「接合ベクター」（例えばｐＳＢＡＣ）とは、目的の核酸を含有するベクターであり、そのような核酸は、ベクターを含有する細胞と２つの細胞の直接接触後に核酸が伝達されるレシピエント細胞との間の直接接触を介して、１つの細胞から別の細胞へと直接伝達される（すなわち、配列を単離せずに核酸配列を１つの細胞から別の細胞へと受け渡される）。本明細書中で使用する用語「接合伝達」とは、２つの細菌細胞の一時的な結合をいい、その間に、一方の細胞がその遺伝物質の一部または全体を他方の細胞に伝達する。
【００４１】
用語「誘導体」とは、活性親化合物と機能的には均等であるが、構造的には異なり得る化学合成有機分子をいう。これはまた、生体利用度、吸収を増加させるため、または毒性を低下させるために化学的に変更した、化学的に類似の化合物もいい得る。例えば、誘導体とは、類似の化合物から形成される化合物、または別の化合物から、１個の原子を別の原子もしくは原子群で置き換えた場合に生じることが予想される化合物、または前駆体化合物から形成され得る化合物である。
【００４２】
用語「発現する」および「発現」とは、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報が顕在化することを可能にするまたは引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生させることを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内または細胞によって発現されて、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、生じるタンパク質も、細胞によって「発現された」と言ってもよい。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたものとして特徴づけることができる。用語「細胞内」とは、細胞内に存在するものを意味する。用語「細胞外」とは、細胞外に存在するものを意味する。物質は、細胞上または細胞内のどこかから、細胞外に顕著な量で見られる場合に、細胞によって「分泌された」ものである。
【００４３】
用語「発現制御配列」とは、一緒になってコード配列の転写を調節するプロモーターおよび任意のエンハンサーまたは抑制要素をいう。好ましい実施形態では、この要素は複製起点である。
【００４４】
「Ｆ因子」または「原核Ｆ因子」とは、原核生物中に見つかる稔性因子をいう。これは、細菌が他の細菌との接合を媒介することを可能にする、小さなエピソームＤＮＡ片である。その染色体外の状態では、この因子は約６２ｋｂの分子量を有し、少なくとも２０個の伝達遺伝子、複製起点ならびに不和合および複製のための他の遺伝子をコードする。Ｆ因子は３つの異なる状態で存在することができる。「Ｆ＋」とは、上述の遺伝情報のみを含有する、自律性の染色体外状態の因子をいう。「Ｈｆｒ」（「高頻度組換え」を指す）状態とは、因子が、恐らくはその様々な挿入配列が原因で、自身を染色体内に組み込んだ状況を説明している。最後に、「Ｆ’」または（Ｆダッシュ）状態とは、染色体外の要素として存在する因子をいうが、追加の要件として、染色体ＤＮＡの一部分がそれと共有結合して含有されている。Ｆ因子を含有しない株は「Ｆ−」であると言う。Ｆ因子の「分配系」とは、どちらの娘細胞にも親プラスミドのコピーが遺伝していることを確実にする系をいう。
【００４５】
「断片」とは、親のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０個のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド、または、親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０個の塩基対（好ましくは少なくとも２０個の塩基対、少なくとも３０個の塩基対、少なくとも４０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも１００個の塩基対、少なくとも２００個の塩基対）のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれかをいう。任意の所定の断片は、親の核酸またはタンパク質またはポリペプチドの機能的活性を保有していても、していなくてもよい。
【００４６】
用語「遺伝子」とは、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全体または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列が含まれていても、含まれていなくてもよい。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写されるが、アミノ酸配列へと翻訳されない場合がある。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。
【００４７】
用語「遺伝子クラスター」とは、同じまたは類似の産物をコードする、２つ以上の密に関連する遺伝子の任意の群をいう。本発明では、遺伝子クラスターは、本明細書中に定義する二次代謝物の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイム（多酵素系）をコードする。例えば、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）および非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）は、どちらも対応する化学物質の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイムである（Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｊ．他、Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．（２００１）８月；１８（４）：３８０〜４１６；Ｆｉｎｋｉｎｇ，Ｒ．他、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４；５８：４５３〜８８参照）。これらの多酵素系をコードする遺伝子は、通常、染色体上でグループを作っており、明確な生合成遺伝子クラスターを形成している。
【００４８】
本明細書中で使用する「遺伝子産物」とは、遺伝子によって、その遺伝子が発現された際に産生される産物をいう。典型的には、この語句は、核酸、タンパク質またはポリペプチドをいう。例えば、本発明では、この語句は、ポリケチド合成酵素などの酵素もしくは非リボソームポリペプチドの合成に役割を果たす任意の酵素をいうか、または、実際のポリケチドもしくは非リボソームポリペプチドもいう場合がある。この例は、米国特許公開第２００５０２７２１３３号、または第２００３０１３４３９８号および第２００３０１２４６８９号中に見つけ得る。さらなる例は、米国特許第６，４９５，３４８号中に見つけ得る。
【００４９】
用語「異種」とは、天然に存在しない要素の組合せをいう。例えば、異種ＤＮＡとは、天然では細胞内または細胞の染色体部位内に位置しないＤＮＡをいう。異種ＤＮＡには、細胞に外来性である遺伝子が含まれ得る。異種発現調節要素とは、それが天然で作動可能に会合しているものとは異なる遺伝子と作動可能に会合している要素をいう。
【００５０】
「相同組換え」とは遺伝的組換えの種類であり、２本の異なるＤＮＡ分子鎖間で生じる物理的な再配置プロセスである。相同組換えは、鎖間で物質の交換を生じるための、同一または類似の配列のアラインメント、２つの分子のアラインメントした相同的なＤＮＡ鎖間のクロスオーバー、ならびにＤＮＡの切断および修復を含む。相同組換えは他の種類の組換えとは区別される。例えば、反転可能な要素、リゾルバーゼ、および一部のファージ組込み事象によって例示される「部位特異的組換え」が、非相同的組換えの例である。多くの場合、２つの組換え部位で同一または類似の配列が必要であるが、配列は短く、相同組換えで用いられる、より長いストレッチ（数百個の塩基対）から区別される。（Ｊ ＲｕｂｎｉｔｚおよびＳ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、１９８４、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：２２５３〜２２５８）。
【００５１】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、適切な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子とアニーリングすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸の予備スクリーニングには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５×デンハート溶液、およびホルムアミドなし；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５×デンハート溶液を使用することができる。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ、５×デンハート溶液に対応する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ、５×デンハート溶液に対応する。ＳＣＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ−クエン酸緩衝液である。５×デンハート溶液は、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％ｇのＢＳＡ（ｗ／ｖ）である。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第では、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きければ大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに相当）は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記、９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記、１１．７〜１１．８参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドであり；より好ましくは、長さは少なくとも約２０個のヌクレオチドである。
【００５２】
用語「組込み部位」とは、レシピエント細胞のゲノム内への核酸の挿入部位をいう。組込み部位は、ランダムであるか、または当業者に知られている部位特異的機構によって起こり得る。保存的な部位特異的組換えでは、例えば、クロスオーバーで見られるものと類似の手段によって可動ＤＮＡ要素を１本のＤＮＡ鎖内に挿入する。可動要素上のＤＮＡのセグメントが標的上のＤＮＡのセグメントと正確に一致し、これにより、インテグラーゼと呼ばれる酵素が可動要素の残りの部分を標的内に挿入することが可能となる。インテグラーゼとは、特別な種類のリコンビナーゼ酵素である。リコンビナーゼとは、二本鎖ＤＮＡを特異的部位で切断してリン酸ジエステル結合の損失をもたらす酵素である。この反応は、ホスホチロシン結合を介してリコンビナーゼとＤＮＡとの間に共有結合が形成されることによって安定化する。部位特異的組換えの別の形態である転位組換えは、可動要素内のＤＮＡの同一の鎖が標的ＤＮＡと一致することを必要としない。その代わりに、関与するインテグラーゼが可動要素および標的ＤＮＡの両方に切れ目を導入し、可動ＤＮＡが配列に入ることを可能にする。その後、切れ目をリガーゼによって除去する。また、配列相同性を含有しないＤＮＡ配列間の組換えは、非相同的末端結合とも呼ばれる。
【００５３】
一般論として、単語「単離すること」とは、目的の物質をその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境、またはそれを配置した環境から）から取り出すことをいう。例えば、「単離した」ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または化学合成した場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。本発明では、プラスミドレスキュー方法は、組込み部位に隣接して位置する遺伝子クラスターを、任意の他の汚染性の遺伝物質または細胞物質を含まないように、「単離」または回収する手段を提供する。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「大きなＤＮＡ断片」とは、約２０キロ塩基〜約４００キロ塩基の範囲のおおよその大きさを有する一片のＤＮＡをいう。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、遺伝子クラスターの全体または一部分を含み得る。
【００５５】
「メリダマイシン」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強力なＦＫＢＰ１２結合活性および顕著な神経保護活性を有することが示されているマクロライドポリケチドであり、以下の構造（Ｉ）を有する。
【００５６】
【化１】
【００５７】
これは、ブダペスト条約の規約の下、２００４年５月１８日に農業研究局カルチャーコレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＮＲＲＬ）（受託番号ＮＲＬＬ３０７４８）に寄託されている、陸生放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のＷｙｅｔｈ培養物ＬＬ−ＢＢ０００５によって産生される。メリダマイシンは、ＦＫ結合タンパク質と結合するイムノフィリンリガンドとして機能する。
【００５８】
「天然物」とは、天然に見つかり、通常は薬学的な創薬および薬物設計で使用するための薬理学的活性または生物活性を有する、化学物質または生きた生物によって産生される物質である。天然物は、全合成によって調製することができる場合でも、そのようにみなすことができる。すべての天然物を完全に合成できるわけではなく、多くの天然物は非常に複雑な構造を有しており、その一部は工業的スケールで合成するには困難かつ高価すぎる。そのような化合物は、その天然源から収穫することしかできない。さらに、収穫から得ることができる構造的類似体の数は非常に限定されている。時折、このような問題を避けるために半合成手順を使用する。これは、しばしば、最終（リード）化合物自体ではなく生合成の中間体を天然源から収穫することを含む。その後、慣用の合成によって中間体を最終産物に変換することができる。この手法は２つの利点を有することができる。第１に、中間体は、最終産物自体よりも容易かつ高収率で抽出し得る。第２に、これは、最終産物の類似体を合成する可能性を可能にし得る。半合成ペニシリンがこの手法の例示である。別の例は、パクリタキセルのそれである。これは、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩをイチイの樹の針葉から抽出し、その後、４段階の合成を実施することによって製造する。
【００５９】
用語「非リボソームポリペプチド」とは、コンベヤベルトと同じように機能するモジュール式の酵素複合体を用いて合成されるポリペプチドをいう。非リボソームペプチドは、主に単細胞生物、植物および真菌に限定されている。これらの複合体はすべて同様の様式で配置されており、多くの異なるモジュールを含有して、開発中の生成物に化学操作の多様な集合を行うことができる。一般に、これらのペプチドは環状であるが（しばしば高度に複雑な環状構造を有する）、直鎖状の非リボソームペプチドも一般的である。この系はモジュール式であり、脂肪酸およびポリケチドを構築する機構に密に関連しているため、ハイブリッド化合物がしばしば見つかる。オキサゾール、チアゾールおよびそれらの還元された対応物は、しばしば、化合物がこの様式で合成されたことを示している。非リボソームポリペプチドの他の例には、バンコマイシン、チオストレプトン、ラモプラニン、テイコプラニン、グラミシジン、およびバシトラシンが含まれる。
【００６０】
「ポリケチド」とは、細菌、真菌、植物および動物からの二次代謝物である。二次代謝物は生物の個体発生に不必要であると思われるが、防御および細胞間通信などの用途を有すると考えられる。ポリケチドは、アセテート、プロピオネートまたはブチレートなどの単純なカルボキシレートの連続的な縮合から誘導される、大きな天然物の群を表す。また、これらは、広範囲の天然物の構成単位として役割を果たすか、または誘導体化されている。ポリケチドは、非常に広い範囲の生物活性および薬理学的特性を有する、構造的に非常に多様な天然物のファミリーである。ポリケチド抗生物質、抗真菌剤、細胞分裂抑制性剤、抗コレステロール剤、抗寄生虫剤、抗コクシジウム剤、動物成長促進物質および天然の殺虫剤が商業的に使用されている。例には、マクロライド、例えば、ピクロマイシン、エリスロマイシンＡ、クラリスロマイシン、およびアジスロマイシンが含まれる。また、免疫抑制剤タクロリムス（ＦＫ５０６）およびラパマイシン、ならびにポリエン抗生物質、例えばアムホテリシンも含まれる。また、テトラサイクリン抗生物質ファミリーも含まれる。抗癌化合物、ダウノマイシン、ブリオスタチンおよびディスコデルモリドもポリケチドである。獣医学用化合物モネンシンおよびアベルメクチンもポリケチドである。また、アクチノロージンおよびメリダマイシンも含まれる。ポリケチドは、１つまたは複数の特殊化したポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の酵素によって合成する（米国特許公開第２００７０１４８７１７号参照）。
【００６１】
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのどちらかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマーの形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステル類似体をいう。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語、核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみを指し、それをどのような特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語には、とりわけ、直鎖状（例えば制限断片）または環状のＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体中に見つかる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を記述するにあたって、本明細書中で、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向でのみ配列を与えるという通常の習慣に従って記載し得る。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的な操作を受けたＤＮＡ分子をいう。
【００６２】
「ヌクレオチド」とは、窒素含有塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）、リン酸分子、ならびに糖分子（ＤＮＡ中ではデオキシリボース、ＲＮＡ中ではリボース）からなるＤＮＡまたはＲＮＡのサブユニットをいう。
【００６３】
ベクターを宿主細胞内で増殖させるためには、そこで複製が開始される特異的な核酸配列である、１つまたは複数の「複製起点」部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ぶ）を含有し得る。したがって、本明細書中で使用する用語「複製起点」または「ｏｒｉ」とは、核酸の複製を開始する核酸配列をいう。起点では、２本のＤＮＡの鎖が引き離されて複製バブルが形成される。これは、バブルの各側に一本鎖ＤＮＡの領域を生じる。その後、ＤＮＡポリメラーゼ機構が入り込み、古い鎖を鋳型として使用して新しいＤＮＡ鎖の合成を開始することができる。複製「フォーク」が起点からどちらの方向にもＤＮＡに沿って移動し、新しいＤＮＡを合成する。
【００６４】
「ｏｒｉ２」とは、単一コピーの複製を可能にする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド由来の「複製起点」をいう。（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｍａｎｃｉｎｏ，ｖ．、Ｓｌｅｐａｋ，ＴＩ、Ｔａｃｈｉｉｒｉ，Ｙ．、およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．、８９０：８７９４〜８７９７）。
【００６５】
「ｏｒｉＶ」とは、高コピーの複製を可能にする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド由来の「複製起点」をいう。（Ｐｅｒｒｉ，Ｓ．およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．、１９９３、ＲＫ２複製開始タンパク質とプラスミド起点反復との相互作用のＤＮＡ配列要件（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＫ２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｐｅａｔｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：３６６２〜２６６９）。
【００６６】
「ｏｒｉＴ」とは、ベクターが１つの細菌細胞から別の細菌細胞へと伝達することを許容する「伝達起点」をいう。
【００６７】
「伝達起点」（例えばｏｒｉＴ）とは、伝達プロセスが開始されるベクター上の部位を表す。これはまた、伝達させるＤＮＡに対してシスで必要な領域として、遺伝的に定義される。接合に特異的なＤＮＡ複製は、プラスミド伝達因子もコードするｏｒｉＴ領域内で開始される。
【００６８】
「φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系」とは、ベクターがレシピエント細胞の染色体のａｔｔＢ部位内に部位特異的に組み込まれることを許容する部位特異的組換え系をいう。（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｍ．Ａ．、Ｔｉｌｌ，Ｒ．、およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．Ｍ．、２００３、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５：５３２０〜５３２３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５５０９４０）
【００６９】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸中の一連のヌクレオチド塩基であり、２個以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって使用される情報を含めた、遺伝情報を保有する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作したポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方（ただし、センスストランドのみを本明細書中で表す）が含まれる。これには、一本鎖および二本鎖の分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸主鎖とコンジュゲートさせることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。また、これには修飾された塩基を含有する核酸、例えばチオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルも含まれる。本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列が隣接していてもよいか、または、プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード領域などを含めた異種配列と会合していてもよい。また、核酸は、当分野で知られている数多くの手段によって修飾されていてもよい。そのような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数を類似体で置換すること、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合を用いたもの（例えば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合を用いたもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などが含まれる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の追加の共有結合した部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などを含有し得る。ポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルのリン酸トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の形成によって誘導体化し得る。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドはまた、検出可能なシグナルをもたらすことができる標識を用いて、直接または間接的に修飾し得る。例示的な標識には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。
【００７０】
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合しており、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基または要素が含まれる。プロモーター配列内には、転写開始部位（便宜上、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマップ作成することによって定義する）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担っているタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見つかる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含めた他の発現制御配列と作動可能に会合していてもよい。
【００７１】
「原核Ｆ因子分配系」とは、細胞分裂において娘Ｆ因子の正しい分離および忠実な分布を確実にする活性な位置決めプロセスをいう。（Ｎｉｋｉ，Ｈ．およびＨｉｒａｇａ，Ｓ．、１９９７、細胞分裂周期中の大腸菌における分配が活動的なＦプラスミドの細胞内分布（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．）、Ｃｅｌｌ、９０：９５１〜９５７）。この分配系は３つの機能的に明確な領域を含有する。そのうちの２つ（ｓｏｐＡおよびｓｏｐＢ）はトランスで作用する遺伝子産物をコードする一方で、第３の領域（ｓｏｐＣ）はシスで機能する。すべての領域が細胞分裂中のプラスミドの分配に必須である。（Ｏｇｕｒａ Ｔ．、Ｈｉｒａｇａ Ｓ．、１９８３、Ｃｅｌｌ、３２：３５１〜６０）。
【００７２】
用語「レシピエント細胞」とは、本明細書中に記載の目的のベクターを受け取るために選択された細胞をいう。「レシピエント細胞」はまた、「宿主細胞」とも呼び得る。例えば、本発明では、一実施形態は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）をレシピエント細胞として提供する。一実施形態では、本発明は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の属、特にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種を、レシピエント細胞として提供する。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がレシピエント細胞であり得る。さらに、レシピエント細胞は、特定の遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、またはタンパク質を発現するように操作したものであり得る。レシピエント細胞はさらに、スクリーニングに使用することができる。レシピエント細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、または１つもしくは複数の細胞を非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物もしくは一過的に形質移入した動物）に伝達し得る。レシピエント細胞は、原核（例えば細菌）細胞、植物細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含めた真核細胞を含めた、任意の生物有機体から選択され得る。適切なレシピエント細胞の他の代表的な例には、任意の他の細菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞など；ならびに昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などが含まれる。
【００７３】
「二次代謝物」とは、生物の正常な成長、発生、または繁殖に直接関与していない有機化合物である。一次代謝物とは異なり、二次代謝物が存在しないことは、生存性／繁殖力の低下、美的な差、または表現型にまったく変化がないことなど、生物にとって穏和な機能障害しかもたらさない。二次代謝物は、しばしば、系統学的群内の狭い一組の種に限定されている。生物に対するこれらの化合物の機能または重要性は、通常、これらが捕食者、寄生生物および疾患に対する防御として、種間競合のため、ならびに繁殖プロセスを促進するため（着色料、魅力的な匂いなど）として使用されるため、生態学的な性質のものである。これらの化合物は、通常、はるかに限定されている生物群に制限されているため、これらは長い間、分類学研究において最重要であった。人類における目的の二次代謝物のほとんどは以下の分類に当てはまり、一部は複数に当てはまる。これらの分類は広い分類であり、二次代謝物をその生合成起源に基づいて分類する。二次代謝物は、しばしば、修飾された一次代謝物合成酵素によって、すなわち、一次代謝物起源の基質を「借りる」ことによって作製されるため、これらの分類は、分類中のすべての分子が二次代謝物であると示していると解釈されるべきでなく（例えばステロイド分類）、むしろ、これらの分類中に二次代謝物が存在すると解釈されるべきである。これらの分類の例およびそれぞれの分類中の試料には、アルカロイド、例えば、ヒヨスチアミン、アトロピン、コカイン、コデイン、モルヒネ、テトロドトキシンなど；テルペノイド、例えば、アザジラクチン、アルテミシン、テトラヒドロカンナビノールなど；ステロイド、例えば、テルペン、サポニンなど；グリコシド、例えば、ノジリマイシンおよびグルコシノレートなど；フェノール、例えばレスベラトロールなど；フェナジン、例えば、ピオシアニンおよびフェナジン−１−カルボン酸（ならびに誘導体）などが含まれる。
【００７４】
用語「選択すること」とは、目的のベクターを含有するレシピエント細胞の同定および単離をいう。形質転換させた微生物、すなわち、組換え分子を含有するものは、様々な陽性および／または陰性の選択方法またはマーカーを用いて選択し得る。特定の態様では、陽性選択マーカーは、アミノ酸などの必須の栄養素が存在しない場合に成長を可能にする遺伝子である。例えば、チミンおよびチミジンが存在しない場合に、ｔｈｙＡ遺伝子を発現する細胞は生存する一方で、この遺伝子を発現しない細胞は生存しない。様々な適切な陽性／陰性選択の対が、当分野で利用可能である。例えば、当分野で知られている様々なアミノ酸類似体を陰性選択として使用することができる一方で、最少培地（アミノ酸類似体に関して）上での成長を陽性選択として使用することができる。視覚的に検出可能なマーカーも本発明における使用に適しており、陽性および陰性によって選択するか、かつ／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）もしくはマイクロフルイディクスなどの技術を用いてスクリーニングし得る。検出可能なマーカーの例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーなどが含まれる。適切な蛍光タンパク質の例には、それだけには限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリンなどが含まれる。適切な生物発光マーカーの例には、それだけには限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれる。視覚的に検出可能なシグナルを有する適切な酵素系の例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれる。他の態様では、陽性選択マーカーとは、遺伝子が存在しない場合に細胞にとって致死的となる化合物に対する耐性を与える遺伝子である。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は抗生物質の存在下で生存する一方で、その遺伝子を欠く細胞は存在しない。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在は、テトラサイクリンの存在下で陽性に選択することができ、フザリン酸の存在下において陰性に選択することができる。適切な抗生物質耐性遺伝子には、それだけには限定されないが、アンピシリン−耐性遺伝子、ネオマイシン−耐性遺伝子、ブラストサイジン−耐性遺伝子、ハイグロマイシン−耐性遺伝子、プロマイシン−耐性遺伝子、クロラムフェニコール−耐性遺伝子、アプラマイシン−耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。特定の態様では、陰性選択マーカーは、特定の基質の存在下で標的細胞に対して致死的な遺伝子である。例えば、ｔｈｙＡ遺伝子は、トリメトプリムの存在下で致死的である。したがって、トリメトプリムの存在下で成長する細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子を発現しない。陰性選択マーカーには、それだけには限定されないが、ｔｈｙＡ、ｓａｃＢ、ｇｎｄ、ｇａｐＣ、ｚｗＪ、ｔａｌＡ、ｔａｉＢ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡ、ｐｇｉ、Ｊｂｐ、ｐｙｋＡ、ｃｉｔ、ａｃｓ、ｅｄｄ、ｉｃｄＡ、ｇｒｏＥＬ、ｓｅｃＡなどの遺伝子が含まれる。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「生物学的活性または酵素活性について選択すること」とは、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される遺伝子産物、例えば、それだけには限定されないがポリケチド合成酵素などの遺伝子クラスターによってコードされている酵素に関連する生物活性を測定すること、または、酵素自体の活性を測定することによって、レシピエント細胞、例えば、伝達したベクターを含有する放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を同定および選択することをいう。また、これは、ポリケチドまたは非リボソームポリペプチドであり得る最終産物の生物活性をいう場合もある。
【００７６】
用語「選択マーカー」または「選択可能マーカー」とは、薬物を、形質転換体のクローニングおよび同定を補助するマーカーとして使用または含めることをいい、例えば、アプラマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択可能マーカーである。したがって、本発明の核酸構築体を含有する細胞は、マーカーをベクター内に含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定し得る。そのようなマーカーは細胞に識別可能な変化を与え、ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能となる。一般に、選択可能マーカーとは、選択を可能にする特性を与えるものである。陽性の選択可能マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものである一方で、陰性の選択可能マーカーとは、その存在がその選択を阻止するものである。陽性の選択可能マーカーの例は薬物耐性マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、比色分析に基づくＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含めた他の種類のマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ｔｋ」）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）などのスクリーニング可能な酵素を利用し得る。当業者は、免疫マーカーを、場合によってはＦＡＣＳ分析と併せて、どのように用いるかも知っているであろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限りは、重要でないと考えられる。選択可能およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００７７】
したがって、用語「配列類似性」とは、進化上の起源が共通であるまたは共通でない場合がある、タンパク質の核酸またはアミノ酸の配列間の同一性または対応性の度合をいう。
【００７８】
「シャトルベクター」とは、一般に、２つの異なる生物、例えば、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内などで複製されることができるプラスミドをいう。本発明では、シャトルベクターは、遺伝子クラスターの全体または一部分を含めた大きなＤＮＡ断片の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）間の伝達を可能にする。さらに、本発明のシャトルベクターは、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂのＤＮＡの大きな断片の伝達を可能にし、２つの異なる生物内で複製されることができるベクターである、「シャトル細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター」である。
【００７９】
「部位特異的組込み配列」とは、２つの核酸分子間の組換えおよびドナー核酸分子からレシピエント核酸分子への組込みを容易にする、ドナーまたはレシピエントの核酸分子中の核酸配列をいう。
【００８０】
「部位特異的組換え」または「部位特異的組換え系」とは、一般に２０〜３０個の塩基の長さの付着（ａｔｔ）部位と呼ばれるそれぞれの分子の独特の部位で起こる、２つのＤＮＡ分子間の組換えプロセスをいう。特殊化した酵素「インテグラーゼ」が２つのａｔｔ部位を認識し、２つのＤＮＡ分子を一緒にし、ＤＮＡ二重鎖の切断および再結合事象を触媒して、レシピエント細胞のＤＮＡ分子のうちの一方が他方のＤＮＡ内に組み込まれる。（Ｎ．Ｄ．Ｇｒｉｎｄｌｅｙ、Ｋ．Ｌ．Ｗｈｉｔｅｓｏｎ、Ｐ．Ａ．Ｒｉｃｅ、２００６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７５、５６７〜６０５）。
【００８１】
具体的な実施形態では、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは５５℃のＴｍをいい、上述の条件を利用する。
【００８２】
言語「細胞物質を実質的に含まない」には、ポリペプチド／タンパク質が、それを単離または組換えによって産生した細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチド／タンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％未満（乾重量）の汚染タンパク質しか有さないポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。ポリペプチド／タンパク質を組換えによって産生した場合は、培地を実質的に含まないことも好ましい、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満を表す。ポリペプチド／タンパク質を化学合成によって生成した場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、タンパク質の合成に関与している化学前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、ポリペプチド／タンパク質のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾重量）の、目的のポリペプチド／タンパク質断片以外の化学前駆体または化合物しか有さない。「単離した」または「精製した」核酸分子とは、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、ｃＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、または遺伝子クラスターなどの「単離した」核酸分子は、他の細胞物質、または組換え技術によって産生した場合は培地を実質的に含まないことができ、または化学合成した場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【００８３】
具体的な実施形態では、２つのＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒなどの配列比較アルゴリズムによって決定して、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、定義した長さのＤＮＡ配列にわたって一致する場合に、「実質的に相同的」または「実質的に類似」している。そのような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子または種の変異体である。実質的に相同的な配列は、配列データバンクで利用可能な標準のソフトウェアを用いて、または、例えば、その特定の系について定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することによって、同定することができる。
【００８４】
同様に、特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列は、８０％を超えるアミノ酸が同一である、または約９０％を超えるアミノ酸が類似である場合に、「実質的に相同的」または「実質的に類似」である。好ましくは、アミノ酸は機能的に同一である。好ましくは、類似または相同的な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用のプログラム説明書、バージョン７、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のパイルアッププログラム、または上述のプログラムのうちの任意のもの（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いたアラインメントによって同定する。
【００８５】
用語「伝達する（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）」とは、電気穿孔（電気ショックを用いて細胞膜に一過性の穴を作ること）、接合（細胞の直接接触を介した、１つの原核細胞から別の原核細胞への核酸の直接伝達をいう）、形質導入（細菌ＤＮＡをウイルスによって１つの細菌から別の細菌へと移すプロセス）または形質移入（典型的には、細胞膜に一過性の孔もしくは「穴」を開けて、物質の取り込みを可能にすることを含む、外来物質を細胞内に導入すること。形質移入は、しばしば、カチオン性脂質を物質と混合してリポソームを生成することによって実施し、これは、細胞膜と融合してその内容物を内部に入れる。）を含めた、任意の手段によって、核酸を細胞内に導入することをいう。形質転換とは、外来遺伝物質の取り込みおよび発現によりもたらされる、細胞の遺伝子変化である。
【００８６】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはコスミドなどのレプリコンであり、結合したセグメントの複製をもたらすために、それに別のＤＮＡセグメント（例えば外来遺伝子）を取り込ませてもよく、これにより、導入した配列の発現がもたらされる。ベクターは、導入したＤＮＡに異種であるが、宿主細胞に認識され、それによって使用される、プロモーターおよび１つまたは複数の制御要素（例えばエンハンサー要素）を含み得る。あるいは、ベクター内に導入する配列は、宿主細胞によって認識および発現され得るその天然のプロモーターを保持する（Ｂｏｒｍａｎｎ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９６；１７８：１２１６〜１２１８）。「レプリコン」とは、細胞内で自律したＤＮＡ複製単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。一実施形態では、本発明のベクターは、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の間の接合を許容する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）シャトルベクターである。１つのＤＮＡセグメントを別のＤＮＡセグメント内に挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特異的部位（ヌクレオチドの特異的な群）でＤＮＡを切断する、制限酵素と呼ばれる特定的な酵素の使用を含む。「カセット」とは、定義した制限部位でベクター内に挿入することができる発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントをいう。カセット制限部位は、カセットが正しいリーディングフレーム内に挿入されることを確実にするように設計されている。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位で挿入され、その後、ベクターによって、伝播可能なベクターＤＮＡと共に宿主細胞内に運ばれる。発現ベクターなどの、挿入または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築体」と呼ぶこともできる。ベクターの一般的な種類は「プラスミド」であり、これは、一般に、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、適切な宿主細胞内に容易に導入することができる、通常は細菌起源の自己完結的な二本鎖ＤＮＡ分子である。プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡの挿入に適した１つまたは複数の制限部位を有する。コードＤＮＡとは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとは、開始、調節、または他の様式でコードＤＮＡの発現を媒介もしくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来してもよく、同じまたは異なる生物に由来してよい。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主中の選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットが含まれる。ベクター構築体は、当分野の技術範囲内にある慣用の分子生物学および組換えＤＮＡ技術を用いて生成し得る。そのような技術は文献中に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９」）；ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００８７】
概要
本発明は、以下の構成要素を含有するベクター（ｐＳＢＡＣ）を提供する。第１に、これは、２つの複製起点（単一コピーの複製の開始のためのｏｒｉ２および高コピーの複製の開始のためのｏｒｉＶ）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子に基づいた分配系（ＰａｒＡ、ＰａｒＢおよびＰａｒＣ）を有する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターｐＣＣ１ＢＡＣの主鎖を含有する；第２に、これは、ベクターが１つの細菌細胞から別の細菌細胞へと伝達されることを許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）を含有し、この機能は、核酸が直接の細胞間接触を介して１つの原核細胞から別の原核細胞へと伝達されることをもたらす、接合に重要である；第３に、これは、レシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内へのベクターの部位特異的組込みを許容する部位特異的な組換え系をコードする、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する。これらの構成要素すべてにおいて、このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、およびクローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡを放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）ゲノム内にφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。φＢＴ１は、幅広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み部位を有するため、このベクターは、よく利用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み系を表す。このベクター系は利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大し、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避する。（例えば、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系の使用は、ストレプトマイセス・トヨカエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）において、糖ペプチド抗生物質であるＡ４７９３４の産生を、対照株の５９％まで減少させる。さらに、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系の使用は、サッカロポリスポラ・スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）において、既知の農業用殺虫剤であるスピノシンの産生を、対照株の９６％まで減少させる。（Ｂａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｐ．他、１９９４、Ｇｅｎｅ、１４６：３９〜４５；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｐ．およびＢａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４２：２６１〜１２７）
【００８８】
二次代謝物の産生を担っている遺伝子は、大きさが１００ｋｂの規模であることができるクラスター内に位置するため、このベクターは、これらの遺伝子クラスターをクローニングするため、ならびに、これらの大きな遺伝子セグメントをベクターが自己複製される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と染色体内のφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に部位特異的に組み込まれる様々な放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主との間でシャフリングするための、重要なビヒクルを提供する。
【００８９】
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている。しかし、この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は主に、外来性ＤＮＡが挿入された座位の隣接領域のクローニングおよび同定に使用した。ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、本発明はまた、ｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片上の生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法も提供する。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。原理の証拠として、最初に、ベクターをストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。アプラマイシン−耐性の接合完了体を回収した。そのうち２つのさらなる分析により、ベクターがφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に特異的に組み込まれたことが明らかとなった。これら２つのゲノムＤＮＡを単離し、異なる制限酵素で消化し、消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供した。電気泳動のＤＮＡ画分の様々な部分を回収した。自己ライゲーションおよび形質転換の後、レスキューしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ＴｒａｎｆｏｒＭａｘ ＥＰＩ３００内に導入した。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。この方法が一般的な応用の潜在性を有することを証明するために、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスターの末端の２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を有さないｐＳＢＡＣベクター内にクローニングした。その後、この構築体をエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に形質転換させ、相同組換えにより単一のクロスオーバーがもたらされ、構築体が相同領域内に部位特異的に挿入された。接合完了体のゲノムＤＮＡを単離し、上述の手順を用いた、アクチノロージン遺伝子クラスター全体の単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内へのレスキューが成功した。その後、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ断片をレスキューしたクローン内に導入して、続く遺伝子クラスターの特異的座位内への組込みを容易にした。最後に、アクチノロージン遺伝子クラスターを、アクチノロージン遺伝子クラスターを事前に欠失させた突然変異したエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株内に伝達した。クローニングしたアクチノロージン遺伝子クラスターの発現の成功は、アクチノロージンの産生の修復によって実証した。
【００９０】
大きな核酸断片をクローニングおよび伝達する方法
本発明の一態様は、核酸の大きな断片、例えば遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へとクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。一実施形態では、原核生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株である。他の実施形態では、原核生物は、核酸を１つの生物から別の生物へと、例えば、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達するために使用する、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の同じもしくは異なる株、または当業者に知られている任意の他の生物である。遺伝物質のドナーは、遺伝物質を１つの生物から別の生物へと伝達するために使用する、当業者に知られている原核または真核生物であり得る。
【００９１】
一実施形態では、ベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである。一実施形態では、ＢＡＣベクターはシャトルＢＡＣベクターである。一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、ｐＳＢＡＣと呼ばれる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクターである。一実施形態では、ベクターは、遺伝子クラスターの全体または一部分をさらに含む。ベクターはＢＡＣベクターであることを想定するが、大きな核酸断片を伝達することができる他のベクターも使用が想定される。これらには、バクテリオファージ由来の人工染色体（ＰＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。
【００９２】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびバクテリオファージ由来の人工染色体（ＰＡＣ）は、大きなＤＮＡ断片のクローニングに用いられている。さらに、ＢＡＣおよびＰＡＣは、従来の大きなＤＮＡのクローニング系である酵母人工染色体（ＹＡＣ）を超える特定の利点を有し得る。これには、大きな保有容量（約１００〜３００ｋｂまで）、高いクローナル安定性、低いキメラ化現象、および取扱いの容易さが含まれる（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｍａｎｃｉｎｏ，Ｖ．、Ｓｌｅｐａｋ，Ｔ．、Ｔａｃｈｉｉｒｉ，Ｙ．、およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．、１９９２、ＰＮＡＳ、８９：８７９４〜８７９７；Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．、Ａｍｅｍｉｙａ，Ｃ．Ｔ．、Ｇａｒｎｅｓ，Ｊ．、Ｋｒｏｉｓｅｌ，Ｐ．Ｍ．、Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．、Ｂａｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、およびｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．Ｊ．、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、６：８４〜８９；Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．、Ｋｕｃａｂａ，Ｔ．Ａ．、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｎ．Ｌ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．Ｄ．、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｋ．、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｍ．、Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｗ．、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、およびＷａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７：１０７２〜１０８４；Ｋｅｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．、Ｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｅ．、Ｃｒａｖｅｎ，Ｍ．Ｂ．、Ｂｏｃｓｋａｉ，Ｄ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｒｏｕｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｄ．、およびＡｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：１５３９〜１５４６）；Ｍｏｚｏ，Ｔ．、Ｄｅｗａｒ，Ｋ．、Ｄｕｎｎ，Ｐ．、Ｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．、Ｋｌｏｓｋａ，Ｓ．、Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｈ．、Ｍａｒｒａ，Ｍ．、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．、Ｍｅｉｅｒ−Ｅｗｅｒｔ，Ｓ．、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：２７１〜２７５；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｒ．Ａ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｂｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｐ．、Ｌａｖｅｒｔｙ，Ｔ．Ｒ．、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｒ．Ａ．、Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ，Ｌ．、Ｎａｅｅｍｕｄｄｉｎ，Ｍ．、Ａｒｅｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．、Ｄｕｒｂｉｎ，Ｊ．、Ｄａｖｉｄ，Ｒ．Ｇ．、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：２２７１〜２２７４；Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．、Ｔａｔｅｎｏ，Ｍ．、Ｗｏｏｎ，Ｐ．Ｙ．、Ｆｒｅｎｇｅｎ，Ｅ．、Ｍａｍｍｏｓｅｒ，Ａ．Ｇ．、Ｃａｔａｎｅｓｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．、およびｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．Ｊ．、２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１０：１１６〜１２８；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｍａｒｒａ，Ｍ．、Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．、Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｃｈｉｎｗａｌｌａ，Ａ．、Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ．、Ｓｅｋｈｏｎ，Ｍ．、Ｗｙｌｉｅ，Ｋ．、Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｋ．、２００１；Ｎａｔｕｒｅ、４０９：９３４〜９４１）。
【００９３】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２））およびＰ１−人工染色体（ＰＡＣ）（Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、６：８４ ８９（１９９４））の開発は、物理的なマップ作成プロジェクトおよびゲノム配列決定を大きく援助している。ＢＡＣおよびＰＡＣは、ミクログラム単位の量のベクターを調製することの容易さを含めた、大きなＤＮＡ挿入物をクローニングすることに関して酵母人工染色体（ＹＡＣ）を超える多くの利点を有する（Ｍｏｎａｃｏ，Ａ．Ｐ．、およびＬａｒｉｎ，Ｚ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：２８０ ２８６（１９９４））。
【００９４】
ＢＡＣおよびＰＡＣからの遺伝子発現は、細胞培養系（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１ １３１４（２０００年１２月）；Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｓ．Ｈ．他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１６００ １６０５（２０００）；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、８：４０４ ４１２（１９９８））およびトランスジェニック動物モデル（Ａｎｔｏｃｈ，Ｍ．Ｐ．他、Ｃｅｌｌ、８９：６５５ ６６７（１９９７）；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｗ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、２２：３２７ ３３５（１９９９））において実証されている。Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ他は、ＢＡＣおよびＥＢＶエピソーム技術の融合に基づいて、ヒト細胞における遺伝子発現のための大きな挿入シャトルベクターを開発している（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１ １３１４（２０００年１２月）；Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：１６７４ １６８２（１９９９））。このベクターは、ＥＢＶに基づいたエピソームとしてヒト細胞内に保持されるゲノムＤＮＡ導入遺伝子によって、細胞培養表現型を補完するために使用された（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１〜１３１４（２０００年１２月））。構築体の染色体外維持は、構築体の組込みでしばしば見られるＤＮＡ再配置を防止した。Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ、上記によって記載されているベクターは、ＥＢＶの特長にのみ基づいている。
【００９５】
Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｅ．Ｍ．他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９：１８６３ １８７３（１９９８年９月）およびＶｏｓ他の国際公開公報ＷＯ００／１２６９３号は、大きなゲノム挿入物を既存のＢＡＣまたはＰＡＣライブラリからヒト細胞へとシャトルするためのベクター系に関する。この系は、ヒト細胞内での複製のために、ＢＡＣと同様にＦに基づいた複製系およびＥＢＶのｏｒｉＰを含有する、ハイブリッドＢＡＣ−ＨＡＥＣ（ヒト人工エピソーム染色体）を利用する。ヒトβ−グロビン遺伝子（１８５ｋｂ）の転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された。
【００９６】
Ｈｅｉｎｔｚ他の米国特許第６，１４３，５６６号は、標的化したＢＡＣ修飾に関する。この特許は、クローニングベクター内に含有される特定の遺伝子中に欠失、置換、および／または点突然変異を生じることを含めた、組換え欠乏宿主細胞内の独立した起源に基づくクローニングベクター（具体的な一実施形態ではＢＡＣなど）を直接修飾する方法を教示する。修飾されたクローニングベクターを用いて、修飾された異種遺伝子を宿主細胞内に導入し得る。提示する一例では、修飾されたＢＡＣをネズミ対象動物内に挿入し、ｉｎ ｖｉｖｏの異種遺伝子発現が実証された。本発明の方法は、ＲｅｃＡ宿主細胞におけるクローニングベクターと条件的複製シャトルベクターとの相同組換えを含み、条件的複製シャトルベクターは、ＲｅｃＡ様タンパク質をコードする。好ましい実施形態では、ベクターは、温度感受性シャトルベクターｐＳＶ１．ＲｅｃＡとの相同組換えを受けたＢＡＣである。
【００９７】
Ｓｏｓｉｏ他は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主の間でシャトルされ、染色体内に組み込まれることができるＢＡＣを記載している。彼らは、部位特異的組込みのための遺伝子カセットを宿主の染色体内に取り込ませることによって宿主内に安定して維持することができるＢＡＣの誘導体の構築を提案している。具体的には、彼らは、φＣ３１−ａｔｔＢ−ｉｎｔ系およびチオストレプトンに対する耐性を与えるためにｔｓｒを用いた。（Ｓｏｓｉｏ他（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：３４３〜３４５）。しかし、ベクターをφＣ３１−ａｔｔＢ部位内に組み込むことは、抗生物質の産生に有害な影響が与えられる場合があることが報告されている。（Ｂａｌｔｚ他（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３）。これらの報告されている抗生物質の合成の減少は、挿入による突然変異誘発または偽ａｔｔＢ部位内への組込みまたは何らかの他の因子が原因であり得る。
【００９８】
本発明は、φＢＴ１−ａｔｔＢ組込み系を使用することで本明細書中に記載のベクターをレシピエント細胞の染色体内へ部位特異的に組み込み、それにより、φＣ３１−ａｔｔＢ−ｉｎｔ系に関連する有害な影響をすべて排除することを提供する。この組込み部位は、Ｇｒｅｇｏｒｙ他によって記載されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ他（２００３）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７：５３２０〜５３２３）。
【００９９】
さらに、ＢＡＣベクターを使用する主な利点は、非常に大きなＤＮＡ断片をクローニングおよび伝達するため、ならびにクローンの安定性のためであるが、ＤＮＡの回収量は非常に低い。（Ｗｉｌｄ他（２００２）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：１４３４〜１４４４）。本発明は、２つの複製起点、すなわちｏｒｉ２およびｏｒｉＶをベクター内に取り込んでおり、したがって本発明のクローニングしたＤＮＡの全収率が向上する。
【０１００】
明らかに、大容量ＤＮＡクローニングベクター内のＤＮＡ挿入物（特に大きなＤＮＡ挿入物）をより容易に細胞に伝達できるように、例えばＢＡＣおよびＰＡＣなどの大容量ＤＮＡクローニングベクターの遺伝子送達系を、単純化および増強する必要性が当分野で存在する。より詳細には、大きなＤＮＡ断片、例えば、遺伝子クラスターの全体または一部分を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へとクローニングおよび伝達する能力を最適化する必要性が存在する。
【０１０１】
上述のように、クローニングおよび伝達ビヒクルのレパートリーを拡大するため、ならびに一部の株においてφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避するために（Ｂａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３）、本出願の発明者らは、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を用いることによって、新規の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルＢＡＣベクター系を開発した。φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系に基づく組込みベクターは、広い宿主範囲を持つだけでなく、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系に基づくベクターとも適合性を有し、したがって、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の分子遺伝学を研究するという追加の選択肢を与えることが報告されている。
【０１０２】
シャトルベクターｐＳＢＡＣを、最初に、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のφＢＴ１付着部位内に部位特異的組換えによって導入した。ａｔｔＢ部位で隣接する様々な大きさの領域は、プラスミドレスキュー戦略によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に容易にクローニングできる。さらに、この方法を用いてアクチノロージン遺伝子クラスター全体をクローニングし、続いて異種宿主内で発現させた。
【０１０３】
ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）の二次代謝物の生合成遺伝子クラスターのクローニング、伝達および異種発現を容易にするために、多目的の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトル細菌人工染色体ベクター、ｐＳＢＡＣを構築した。このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、クローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）ゲノム内にファージφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。このベクターを用いたプラスミドレスキュー方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、二次代謝物の生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングするプロセスを加速させるために開発されている。その後、クローニングしたＤＮＡを、推定上の二次代謝物の遺伝子クラスターの配列決定または異種発現に使用することができる。応用の一例として、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のアクチノロージン遺伝子クラスター（ａｃｔ）は、このベクターによる単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内でのレスキューが成功し、続いて、ａｃｔ遺伝子クラスターを欠失させた突然変異したエス・リビディアンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄｉａｎｓ）株内に伝達した。アクチノロージンの産生の修復により、クローニングしたａｃｔ遺伝子クラスターの発現の成功が実証された。
【０１０４】
ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、新規ＢＡＣベクターを使用してストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｔｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）から大きなＤＮＡ断片をクローニングするための、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を開発した。最初に、目的の遺伝子に対する一片の相同配列を有するＢＡＣベクターを目的の株内に接合した。相同組換えにより、ベクターが標的として座位内に挿入されることがもたらされる。その後、接合完了体のゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素で消化し、その後、環状化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換させた。元のベクター内に複製起点（ｏｒｉ）が存在いるためにレスキューしたプラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で複製し、ベクター内に含まれる耐性選択マーカーのために形質転換体を寒天プレート上で選択した。様々なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）中の相同組換え機構、およびＢＡＣベクターの大きなＤＮＡ断片をクローニングする独特な能力を利用することによって、この方法では、部位特異的な挿入部位に隣接する顕著な長さの配列を破壊された株から回収することができる。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。
【０１０５】
本方法は、ＢＡＣまたはＰＡＣなどの大容量クローニングベクターを利用する。ＢＡＣまたはＰＡＣが特に好ましい大容量クローニングベクターであるが、当業者に知られている他の大容量クローニングベクターも、本発明で使用することができる。これらには、例えば、コスミド（Ｅｖａｎｓ他、Ｇｅｎｅ、７９：９ ２０（１９８９））、酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、分子クローニング：実験室の手引き（Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：１２５７ １２５９（１９９７）、ヒト人工染色体（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：３４５ ３５４（１９９７））、またはウイルスに基づいたベクター、例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、もしくはバキュロウイルスなどが含まれる。
【０１０６】
本明細書中で使用する用語「ＢＡＣ」（細菌人工染色体）とは、大きなゲノムＤＮＡ断片、典型的には４００ｋｂまでのものをその中に挿入することができる細菌の染色体に由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。ＢＡＣは、単一コピーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦプラスミドに基づいており、＞３００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ならびにバキュロウイルスおよびネズミサイトメガロウイルスのものを含めた大きなＤＮＡウイルスのゲノムを安定に維持することが以前に実証されている（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２）；Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６ ４５７９（１９９３）；Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１４７５９ １４７６３（１９９７）。
【０１０７】
本明細書中で使用する用語「ＰＡＣ」とは、大きなゲノムＤＮＡ断片、典型的には３００ｋｂまでをその中に挿入することができる、Ｐ１バクテリオファージに由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。ＰＡＣは、Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：８４〜８９（１９９４）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：１０３ １０７（１９９０）に記載されている。
【０１０８】
ＢＡＣまたはＰＡＣライブラリ、特にヒトゲノムプロジェクトの結果としてヒトゲノムＤＮＡを含有するものは、当業者が容易に入手可能である（例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：８３９（１９９７））を参照。
【０１０９】
一般に、特に上記例では、宿主微生物を、構成要素ポリヌクレオチドを保有するベクターで形質転換させることは、慣用技術を用いて実施する。一実施形態では、ベクターは、２つの生物間の接合によって、宿主またはレシピエント細胞へと伝達する。一実施形態では、ベクターは、形質移入方法によって宿主細胞またはレシピエント細胞へと伝達し得る。本明細書中で使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＢ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、電気穿孔、光穿孔、機械的注入、微粒子銃注入などを含めた、外来性核酸配列（例えばＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための、様々な当分野で認識された技術を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換または形質移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）、および同様の実験室の手引き中に見つかる。
【０１１０】
選択マーカー
一実施形態では、シャトルベクターには、目的の核酸を含有する細胞中で機能的な「選択マーカー」または「選択可能マーカー」が含まれる。この「選択マーカー」は、発現された際、宿主細胞が目的の核酸を含有しない細胞から区別されることを可能にすることができる。例えば、用語「選択マーカー」または「選択可能マーカー」とは、薬物を、形質転換体のクローニングおよび同定を補助するマーカーとして使用または含めることをいい、例えば、アプラマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択可能または選択マーカーである。したがって、本発明の核酸構築体を含有する細胞は、マーカーをベクター内に含めることによって同定し得る。そのようなマーカーは細胞に識別可能な変化を与え、ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能となる。一般に、選択可能マーカーとは、選択を可能にする特性を与えるものである。陽性の選択可能マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものである一方で、陰性の選択可能マーカーとは、その存在がその選択を阻止するものである。陽性選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。本実施形態では、陽性選択マーカーとは、遺伝子が存在しない場合に細胞にとって致死的となる化合物に対する耐性を与える遺伝子である。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は抗生物質の存在下で生存する一方で、その遺伝子を欠く細胞は存在しない。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在は、テトラサイクリンの存在下で陽性に選択することができ、フザリン酸の存在下において陰性に選択することができる。適切な抗生物質耐性遺伝子には、それだけには限定されないが、アンピシリン−耐性遺伝子、ネオマイシン−耐性遺伝子、ブラストサイジン−耐性遺伝子、ハイグロマイシン−耐性遺伝子、プロマイシン−耐性遺伝子、クロラムフェニコール−耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。特定の態様では、陰性選択マーカーは、特定の基質の存在下で標的細胞に対して致死的な遺伝子である。例えば、ｔｈｙＡ遺伝子は、トリメトプリムの存在下で致死的である。したがって、トリメトプリムの存在下で成長する細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子を発現しない。陰性選択マーカーには、それだけには限定されないが、ｔｈｙＡ、ｓａｃＢ、ｇｎｄ、ｇａｐＣ、ｚｗＪ、ｔａｌＡ、ｔａｉＢ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡ、ｐｇｉ、Ｊｂｐ、ｐｙｋＡ、ｃｉｔ、ａｃｓ、ｅｄｄ、ｉｃｄＡ、ｇｒｏＥＬ、ｓｅｃＡなどの遺伝子が含まれる。一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子は、アプラマイシン耐性を提供する遺伝子である。（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ４１４６７０参照）
【０１１１】
別の実施形態では、選択マーカー遺伝子は検出遺伝子であり得る。検出遺伝子は、直接または間接的な標識として、すなわち、細胞を分別するために、すなわち、ＦＡＣＳによる細胞濃縮のために使用することができるタンパク質をコードする。本実施形態では、選択可能マーカー遺伝子自体のタンパク質産物が、選択可能遺伝子を発現する細胞を区別するために役割を果たすことができる。本実施形態では、適切な選択可能遺伝子には、すべて市販されている、すなわち、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードするものが含まれる。
【０１１２】
あるいは、選択可能マーカー遺伝子は、選択の基準として使用することができる標識と結合するタンパク質をコードする。すなわち、選択可能マーカー遺伝子は、間接標識または検出遺伝子として役割を果たす。例えば、視覚的に検出可能なマーカーも本発明における使用に適しており、陽性および陰性によって選択するか、かつ／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）もしくはマイクロフルイディクスなどの技術を用いてスクリーニングし得る。検出可能なマーカーの例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーなどが含まれる。適切な蛍光タンパク質の例には、それだけには限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリンなどが含まれる。適切な生物発光マーカーの例には、それだけには限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれる。視覚的に検出可能なシグナルを有する適切な酵素系の例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれる。
【０１１３】
本発明の別の態様は、上述のｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片をストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を提供する。この方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路を大きく促進する。第１のステップとして、最初に、ｐＳＢＡＣベクターを、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。いくつかのアプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、そのうちの１つからのゲノムＤＮＡを単離し、ＳｃａＩで部分的に消化した。消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供し、４０〜５０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を回収し、自己ライゲーションし、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）内に形質転換させた。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は例示のためのみであり、本発明の条件および範囲に関して完全に決定的であることを主張しないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間など）を与えた場合、指定した範囲の上および下の条件をどちらも、一般には利便性が下がるが使用できることを理解されたい。別段に指定しない限りは、本明細書中で言及するすべての部およびパーセントは重量に基づき、すべての温度は摂氏で表す。
【０１１５】
（実施例１）
ｐＳＢＡＣベクターの構築およびプラスミドレスキュー手順の開発
材料および方法
細菌株およびプラスミド：
ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）株Ｍ１４５およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４を本研究で用いた。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−４４１（ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６：１０６〜１１０）を、アクチノロージン遺伝子クラスターを発現させる異種宿主として用いた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＥＰＩ３００（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を、ｐＳＢＡＣベクターおよびそれに由来する構築体のクローニングおよび増幅に用いた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＮｏｖａＢｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を他のクローニング目的のために使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７−１を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）に導入するための接合に使用した。プラスミドｐＨＬＷ３は、ｏｒｉＴおよびアプラマイシン耐性遺伝子を有する、ＢＡＣ（細菌人工染色体）に由来するベクターであった。ｐＳＢＡＣはｐＨＬＷ３に由来し、φＢＴ１のａｔｔＰ−ｉｎｔカセットが導入されている。プラスミドｐＨＬＷ２１、２２、２３、および２４は、ｐＳＢＡＣをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のゲノムのφＢＴ１付着部位内への接合に由来する株からレスキューしたＢＡＣクローンである。プラスミドｐＨＬＷ３５は、アクチノロージン遺伝子クラスターの３’末端に対応するプライマー組を用いて、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）から増幅した２ｋｂのＰＣＲ産物が挿入された、ｐＨＬＷ３に由来する。プラスミドｐＨＬＷ３８、３９、４０、４１、および４２は、ｐＨＬＷ３５のエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスター内への接合に由来する株からレスキューしたＢＡＣクローンである。最後に、プラスミドｐＨＬＷ７６および７８は、φＢＴ１のａｔｔＢ−ｉｎｔカセットをそれぞれプラスミドｐＨＬＷ４１および４２内に付加することによって誘導した。
【０１１６】
培養培地および成長条件：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のどちらかを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で成長させた。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株を、２８℃で、ＭＹＭ、Ｒ２ＹＥまたはＲ４培地中で成長させた（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｂｂ、Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ、Ｋ．Ｆ．，Ｃｈａｔｅｒ、およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ノッティンガム大学、英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）。接合に使用したＲ６培地には、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびナリジクス酸（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１１７】
分子遺伝学的技術：
ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖｇｅｎ）を、製造者の指示に従ったＰＣＲ増幅に使用した。既に記載した手順を用いて、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のゲノムＤＮＡを単離した（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｓｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）。Ｚａｐｐｙプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＢＡＣＭＡＸ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて大きな挿入物を有するＢＡＣクローンを単離した。プラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への形質転換は、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞またはＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞のどちらかを用いて行った。意図するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１をドナー株として用いて、接合ベクターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４またはＫ４−１１４内に導入した。パルスフィールド電気泳動を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールド電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。手短に述べると、消化したＤＮＡを０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で分離した。以下のパラメータを用いてゲルを流した：１秒間の初期スイッチ時間、６秒間の最終スイッチ時間、１２０°の開先角度および１６時間の実行時間、１４℃、６ボルト／ｃｍの条件下。
【０１１８】
ｐＳＢＡＣベクターの構築
ｐＳＢＡＣベクターの主鎖を、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ（配列番号８参照）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）から、プライマー組ｐＣＣ１ＢＡＣＦｏｒ：５’−ＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧ−３’（配列番号９）およびｐＣＣ１ＢＡＣＲｅｖ：５’−ＧＧＴＴＡＣＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＡＣ−３’（配列番号１０）を用いて増幅した。伝達起点領域（ｏｒｉＴ）およびアプラマイシン耐性遺伝子を、複数のクローニング部位と一緒に、プラスミドｐＢＷＡ２（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｓｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）から、プライマー組：ｐＢ１：５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１１）およびｐＢ２：５’−ＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）を用いて増幅した。第１のプライマー組から増幅された６．５ｋｂのＰＣＲ産物および第２のプライマー組から増幅された４ｋｂのＰＣＲ産物を一緒にライゲーションして、プラスミドｐＨＬＷ３を生成した。その後、φＢＴ１のａｔｔＰ−ｉｎｔ含有する２ｋｂのＤＮＡ断片を合成し（Ｃｅｌｔｅｋ−ｇｅｎｅｓ、テネシー州Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）、ｐＨＬＷ３の独特のＳｃａＩ部位内に導入して、最終構築体ｐＳＢＡＣが得られた。
【０１１９】
プラスミドレスキュー手順
Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）のエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内への接合から得られた接合完了体を、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＭＹＭ液体培地中で成長させた。ゲノムＤＮＡをＳｃａＩで部分的に消化し、その後、消化したＤＮＡを、パルスフィールド電気泳動を用いて分離した。４０〜６０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を切り出し、ゲルから電気泳動によって電気溶出させた。電気溶出させたＤＮＡを、Ｆａｓｔ−ｌｉｎｋＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏ）を用いて自己ライゲーションした。その後、ライゲーション混合物を、１．８％のグルコースを含む１％のアガロース中で脱塩し、１μｌの最終ライゲーション混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＣ１００コンピテント細胞を電気穿孔した。いくつかの形質転換体をランダムに選択し、プラスミドＤＮＡを単離した。レスキューしたプラスミドの大きさを確認するためにプラスミドＤＮＡを様々な制限酵素で消化し、その一部を配列決定に供した。ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために、遺伝子クラスターの３’末端に対応する２ｋｂのＰＣＲ産物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ９３９１２２．１のゲノム配列位置：１７０３１１〜１７２２８０に対応）を、プライマー組Ｓｃｒｅｓ１：５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１３）（ＥｃｏＲＩ部位に下線を引いた）およびＳｃｒｅｓ２：５’−ＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＣ−３’（配列番号１４）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いた）を用いて増幅した。
【０１２０】
この２ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、ｐＨＬＷ３の対応する部位とライゲーションした。その後、生じたプラスミドｐＨＬＷ３５を接合によってエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に導入した。プラスミドのＡＣＴ遺伝子クラスター内への特異的組込みを、いくつかの接合完了体においてＰＣＲ分析によって最初に確認した。その後、上述の手順を用いてａｃｔ遺伝子クラスターをレスキューした。これらのクローンからのａｃｔ遺伝子全体の存在は、プライマー組ｐＡＣＴ１：５’−ＣＡＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５）およびｐＡＣＴ２：５’−ＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）を用いたＰＣＲ分析によって確認され、ａｃｔ遺伝子クラスターの最先端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ９３９１２２のゲノム配列位置：１４７００１〜１４７６４０に対応）に対応する。
【０１２１】
抽出物の調製および質量分析：
様々な株におけるアクチオノロージンの産生を分析するために、適切な株を１０ｍｌのＲ２ＹＥ中、２８℃で、５日間成長させた。１ｍｌの培養物をそれぞれの試料から採取し、等体積の酢酸エチル−メタノール（９５：５［体積：体積］）で抽出した。その後、抽出物を高速真空機によって乾燥させ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析のために２００μｌのメタノールに再懸濁させた。分析は、ＬＣＱ Ｄｅｃａ質量分析装置と接続したＡｇｉｌｅｎｔ１１００システムで実施した。試料は、Ｈ２Ｏ／０．０２５％のギ酸中の５％から９５％のＭｅＣＮ／０．０２５％のギ酸を用いて、１５分間かけて、ＹＭＣ ＯＤＳ Ｓ−３カラム（２．０×１００ｍｍ）上でクロマトグラフィーを行った。
【０１２２】
結果：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）ＢＡＣベクターｐＳＢＡＣの構築
大きなＤＮＡ断片のクローニングを容易にするために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ＢＡＣベクター、ｐＳＢＡＣ（図１）を構築し、続いて、これらの断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達した。このベクターは、２つの複製起点（単一コピーの複製の開始のためのｏｒｉ２および高コピーの複製の開始のためのｏｒｉＶ）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子に基づいた分配系（ＰａｒＡ、ＰａｒＢおよびＰａｒＣ）を有する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターｐＣＣ１ＢＡＣの主鎖を含有する（Ｗｉｌｄ，Ｊ．、Ｈｒａｄｅｃｎａ，Ｚ．、およびＳｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ．、２００２、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：１４３４〜１４４４）。ｐＳＢＡＣベクターはまた、ベクターが１つの細菌から別の細菌へと伝達されることを許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）も含有し、この機能は、核酸が直接の細胞間接触を介して１つの原核細胞から別の原核細胞へと伝達されることをもたらす、接合に重要である；これはまた、レシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内へのベクターの部位特異的組込みを許容する部位特異的な組換え系をコードする、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する。これらの構成要素すべてにおいて、このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、およびクローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）ゲノム内にφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。φＢＴ１は、幅広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み部位を有するため、このベクターは、よく利用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なるが、それでも適合性のある組込み系を表す。このベクター系の構築は本発明者らの利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大し、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避する。二次代謝物の産生を担っている遺伝子は大きさが１００ｋｂの規模であることができるクラスター内に位置するため、このベクターは、これらの遺伝子クラスターをクローニングするため、ならびに、これらの大きな遺伝子セグメントをベクターが自己複製される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と染色体内のφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に部位特異的に組み込まれる様々なストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主との間でシャフリングするための、重要なビヒクルを提供する。
【０１２３】
ｐＳＢＡＣベクターを用いたプラスミドレスキュー方法の開発
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている（Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，Ｙ．、およびＤｕｂｎａｕ，Ｄ．、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１５４：１０７７〜１０８７；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｕ．、Ｐｌａｔｚｅｒ，Ｍ．、およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍ．、１９８４、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、１９３：５１２〜５１９．；ＭｃＭａｈｏｎ Ｔ．Ｌ．、Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋａ，Ｚ．、Ｂａｒｔｈ，Ｃ．、Ｆｒａｓｅｒ，Ｂ．Ｄ．、Ｐｏｎｔｅｓ，Ｌ．、およびＦｉｓｈｅｒ Ｐ．Ｒ．、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．、２４：４０９６〜４０９７）。しかし、この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は主に、外来性ＤＮＡが挿入した座位の隣接領域のクローニングおよび同定に使用された。ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、ｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片をストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を開発した。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。原理を証明するための第１のステップとして、最初に、ｐＳＢＡＣベクターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。いくつかのアプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、そのうちの１つからのゲノムＤＮＡを単離し、ＳｃａＩで部分的に消化した。消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供し、４０〜５０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を回収し、自己ライゲーションし、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）内に形質転換させた。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した（図２）。図２ａは、ｐＳＢＡＣベクターを用いたプラスミドレスキューに使用した戦略の概要を示す。図２ｂは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した４つのレスキューしたクローンのパルスフィールドゲル電気泳動分析の結果を示す。（レーン１：パルスマーカー；レーン２〜５：レスキューしたクローンｐＨＬＷ２１、２２、２３および２４）。Ａｐｒａ：アプラマイシン耐性マーカー。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。
【０１２４】
プラスミドレスキューによるアクチノロージン遺伝子クラスターのクローニングおよび代理宿主におけるこの遺伝子クラスターの異種発現
ｐＳＢＡＣを用いて開発したプラスミドレスキュー方法の応用性をさらに拡大するために、また、この方法が一般的な応用の潜在性を有し、目的の大きな遺伝子クラスターをクローニングするために使用できることを証明するために、十分に特徴づけられたアクチノロージン遺伝子クラスターを、さらなるクローニングおよび発現研究のために選択した。図３ａは、ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために使用した戦略の模式図を示し、３ｂは、レスキューしたクローンの分析を示す。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスターの末端に対応する２ｋｂのＤＮＡ断片を、プライマー組Ｓｃｒｅｓ１およびＳｃｒｅｓ２を用いて増幅し、その後、ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を有さないという点でｐＳＢＡＣとは異なるベクターｐＨＬＷ３内にクローニングした。その後、生じた構築体をエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に形質転換させ、相同組換えにより単一のクロスオーバーがもたらされ、構築体が相同領域内に部位特異的に挿入された（図３ａ）。ＰＣＲ分析によって接合完了体の一部への部位特異的組込みを確認した後（データ示さず）、これらの株のうちの１つのゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡをより小さな小片へと機械的に剪断した。その後、生じたＤＮＡをパルスフィールド電気泳動によって分離し、４０〜５０ｋｂのＤＮＡ画分を回収した。図３ｂは、ａｃｔ遺伝子クラスター全体を潜在的に含有する、レスキューしたクローンのうちの５つのパルスフィールドゲル電気泳動分析の結果を示す（レーン１：パルスマーカー；レーン２〜７：ＥｃｏＲＩで消化したクローンｐＨＬＷ３８、３９、４０、４１および４２；レーン８〜１３、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した上記クローン；レーン１４：１ｋｂのＤＮＡラダー）。回収したＤＮＡを、Ｅｎｄ−ｉｔ（商標）ＤＮＡ末端修復キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて平滑末端化し、その後、自己ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞内に形質転換させた。数々の形質転換体をＰＣＲ分析に供して、アクチノロージン遺伝子クラスターの先頭および終末をどちらも含有するクローンを選択した。確認されたクローンは、遺伝子クラスターの両末端が存在するため、アクチノロージン遺伝子クラスター全体を潜在的に含有するクローンであった。その後、続く遺伝子クラスターの特異的ａｔｔＢ付着座位内への組込みを容易にするために、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ断片を、レスキューしたクローンのＡｖｒＩＩ部位内に導入した。最後に、アクチノロージン遺伝子クラスター全体を有するクローンを、アクチノロージン遺伝子クラスターを事前に欠失させたエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株Ｋ４−１１４内に伝達した。接合完了体を、アプラマイシンおよびナリジクス酸を添加したＲ６プレートから選択し、アパラマイシンおよびナリジクス酸を添加したＭＹＭ寒天プレート上に再度画線した。２８℃で５日間インキュベーションした後、画線したコロニーのほとんどが赤−青色を示し、アクチノロージン遺伝子クラスターの新しい宿主内への導入および発現が成功したことが示された（データ示さず）。Ｒ２ＹＥ寒天プレートまたは液体培地のどちらかにおける、代表的なクローン成長による青色色素の産生を検査することによって、アクチノロージンの産生をさらに特徴づけた。（Ｂｙｓｔｒｙｋｈ，Ｌ．Ｖ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．、Ｈｅｒｒｅｍａ，Ｊ．Ｋ．、Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．、およびＤｉｊｋｈｕｉｚｅｎ，Ｌ．、１９９６、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７８：２２３８〜２２４４；Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｂ．、およびＢｉｂｂ，Ｍ．、１９９６、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２１：３８５〜３９６）。最後に、ＬＣ／ＭＳ分析により、このクローンにおけるアクチノロージンの産生が確認された（図４）。アクチノロージンの産生の修復により、クローニングしたアクチノロージン遺伝子クラスターの異種宿主中での発現が成功したことが実証された。興味深いことに、Ｋ４−１１４の親株であるエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４は、通常の成長条件下でアクチノロージンを産生しないため（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．、Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．およびＣｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．、１９８６、二次代謝物形成の制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ，Ｈ．他（編）、ＶＣＨ、ドイツＷｅｉｎｈｅｉｍ、ページ２３〜３３）、これらの接合完了体におけるアクチノロージンの検出は、接合に使用したレスキューしたプラスミドクローンが、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるアクチノロージンの産生を活性化するための調節要素を含有していることを示唆しており、この結果は、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）中のａｃｔ遺伝子クラスターのａｃｔＩＩ領域が、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）においてａｃｔ遺伝子クラスターの発現を誘発できる陽性調節配列を含有することを示す以前の研究と矛盾していない（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．、Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．およびＭａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．、１９９１．Ｃｅｌｌ、６６：７６９〜７８０）。
【０１２５】
新規の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャトルベクター、ｐＳＢＡＣを構築し、このベクターは、小さな、中程度または大きな遺伝子クラスターを直接クローニングすること、クローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から様々な土壌細菌ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）株へと伝達すること、およびクローニングしたＤＮＡをレシピエントの染色体のφＢＴ１ ａｔｔＢ部位へと組み込むことに使用することができる。このベクターは、広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なるが、それでも適合性を有する組込み系を表し、利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大する。本発明で開発したプラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片を、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の遺伝子破壊形質転換体から直接クローニングするために使用することができる。これは、ＤＮＡ取扱いのいくつかの単純なステップのみを含み、高品質なＢＡＣライブラリの構築に必須であるゲノムＤＮＡの完全性を傷つける手順を、最小限にする。
【０１２６】
（実施例２）
ｐＳＢＡＣを用いた、メリダマイシン生合成遺伝子クラスターの迅速なクローニングおよび異種発現
メリダマイシンおよびその天然に存在する類似体３−ノルメリダマイシンは、ドーパミン作動性ニューロン中で強力な神経保護活性を有する、非免疫抑制性のＦＫＢＰ１２結合大環状ポリケチドである。メリダマイシンの生合成遺伝子クラスターは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８からクローニングされており、いくつかの重複するコスミド上に見つかっている（Ｈｅ他、Ｇｅｎｅ、（２００６）８月、１；３７７：１０９〜１８）。遺伝子クラスターの全体は約９０ｋｂまでであり、合計１５個のＩ型ポリケチド合成酵素モジュール、１個のＮＲＰＳモジュール、１個のチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼならびにいくつかの調節および輸送タンパク質をコードする大きな転写単位を含有する。この巨大なポリケチド合成酵素複合体は、ＭｅｒＡ、ＭｅｒＢおよびＭｅｒＣと呼ばれる３つの大きなサブユニットを含む。
【０１２７】
本発明では、異種宿主中での伝達および発現を容易にするために、ｍｅｒ遺伝子クラスターをｐＳＢＡＣベクター内にクローニングした。より詳細には、ｐＳＢＡＣを使用することによって、メリダマイシン生合成遺伝子クラスター全体（約９７ｋｂまで）を単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内にクローニングし、その後、異種発現のためにストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）内に伝達した。元のｍｅｒプロモーターが異種宿主中で遺伝子クラスター全体の転写を駆動することができたが、メリダマイシンの産生は、元のプロモーターがｅｒｍＥ＊プロモーターで置き換えられた場合にのみ、質量分析で検出可能であった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍｅｒ遺伝子クラスターのプロモーター効率および転写レベルが、新しい宿主におけるメリダマイシンおよびその類似体の産生に影響を与える最も重要な因子であることが明らかとなった。エチルマロニルＣｏＡの前駆体の供給も、メリダマイシンおよびその類似体の産生を増大させた。
【０１２８】
材料および方法
細菌株およびプラスミド
本研究中で使用した様々な株およびプラスミドを、以下の表１に要約する。
【０１２９】
【表１−１】
【０１３０】
【表１−２】
【０１３１】
培養培地および成長条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のどちらかを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で成長させた。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株を、２８℃で、ＭＹＭ、Ｒ２ＹＥ（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．、Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．、およびＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．（編）、２０００、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、英国Ｎｏｒｗｉｃｈ）またはＦＫＡ培地（Ｌｅａｆ，Ｔ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ，Ｍ．、Ｄｅｓａｉ，Ｒ．、Ｒｅｇｅｎｔｉｎ，Ｒ．、Ｗｏｏ，Ｅ．、Ａｓｈｌｅｙ，Ｇ．、およびＬｉｃａｒｉ，Ｐ．、２００２、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７７：１１２２〜１１２６）中で成長させた。接合に使用したＲ６培地（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）には、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびナリジクス酸（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１３２】
ＤＮＡ操作
ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を、製造者の指示に従ったＰＣＲ増幅に使用した。既に記載した手順を用いて、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のゲノムＤＮＡを単離した（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）。Ｚａｐｐｙプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州Ｏｒａｎｇｅ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＢＡＣＭＡＸ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いて大きな挿入物を有するＢＡＣクローンを単離した。プラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への形質転換は、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞またはＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞のどちらかを用いて行った。意図するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１またはＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）をドナー株として用いて、接合ベクターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４またはＫ４−１１４内に導入した。パルスフィールド電気泳動を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールド電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。手短に述べると、消化したＤＮＡを０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で分離した。以下のパラメータを用いてゲルを流した：１秒間の初期スイッチ時間、６秒間の最終スイッチ時間、１２０°の開先角度および１６時間の実行時間、１４℃、６ボルト／ｃｍの条件下。
【０１３３】
ｐＳＢＡＣを用いたメリダマイシン生合成遺伝子クラスターの迅速なクローニング
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８を、ＴＳＢＣ液体培地中、７２時間、２８℃で成長させた。菌糸体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ゲノムＤＮＡプラグの調製は、ＣＨＥＦゲノムＤＮＡプラグキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の取扱い説明書に従って実施した。手短に述べると、菌糸体ペレットを細胞懸濁緩衝液に再懸濁させ、その後、プラグカビを用いてＣｌｅａｎＣｕｔアガロースに包埋した。その後、固化したアガロースプラグをリゾチームで処理し、続いてプロテイナーゼＫで処理した。プラグを１×洗浄バッファーで２回洗浄した後、１ｍＭのＰＭＳＦで処理して、残留プロテイナーゼＫを失活化した。最後に、プラグを十分に洗浄し、使用時まで１×洗浄バッファー中に４℃で保管した。ＤＮＡプラグの前処理および制限消化は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他に記載のプロトコルを用いて行った（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．、Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｊ．Ｐ．、Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｗｉｎｇ，Ｒ．Ａ．、およびＰａｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｈ．、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５：１〜１００）。その後、ＤＮＡプラグを刻み、制限酵素ＭｆｅＩによって３７℃で２時間消化した。ＥＤＴＡを最終濃度５０ｍＭまで加えることによって消化反応を停止させた。その後、消化したＤＮＡプラグの小片を、０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のパルスフィールド電気泳動に、以下のパラメータを用いて供した：初期スイッチ時間＝１．０秒間、最終スイッチ時間＝５０．０秒間、実行時間＝１６時間、ボルト／ｃｍ＝６、開先角度＝１２０°、温度＝１４℃。９０〜１１０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を切り出し、電気溶出によってゲルから溶出させた。溶出したＤＮＡを沈殿させ、濃縮した後、Ｆａｓｔ−ｌｉｎｋＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏ）を用いてＥｃｏＲＩで消化したｐＳＢＡＣベクターとライゲーションさせた。その後、ライゲーション混合物を、１．８％のグルコースを含有する１％のアガロース中で脱塩し、１μｌの最終ライゲーション混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００コンピテント細胞を電気穿孔した。ｍｅｒ遺伝子クラスターに隣接する配列に由来するＤＮＡプローブを用いて約３００個の組換えコロニーをスクリーニングし、メリダマイシン生合成遺伝子クラスター全体を含有するｐＨＬＷ３０の同定がもたらされた。
【０１３４】
ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析
様々なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）株からの全ＲＮＡを、Ｖａｎ Ｄｅｓｓｅｌ、Ｗ．Ｖ（２００４）（Ｖａｎ Ｄｅｓｓｅｌ，Ｗ．、Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ，Ｌ．、Ｇｅｕｋｅｎｓ，Ｎ．、Ｌａｍｍｅｒｔｙｎ，ＥおよびＡｎｎｅ，Ｊ．、２００４、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５８：１３５〜１３７）によって記載されている方法に変更を加えて用いて、単離した。手短に述べると、７２時間成長させた３ｍｌの培養物を収集し、２倍体積のＲＮＡ保護試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をすぐに加え、室温で５分間静置し、その後、遠心分離して、菌糸体ペレットが得られた。ペレットを１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのリゾチームで１時間、３７℃で処理し、その後、フェノール：クロロホルム（５：１；ｐＨ４．５）で抽出し、２ｍｌのエタノール、２５０μｌの１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）および１００μｌの５ＭのＮａＣｌで沈殿させた。沈殿したＲＮＡを８０％のエタノールで１回洗浄し、乾燥させ、１００ｕｌのＲＮＡ保管緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）に溶解した。ＤＮａｓｅ１消化（Ａｍｂｉｏｎ）によってＤＮＡ汚染を排除し、上記手順を繰り返して再度精製した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー組は、ｍｅｒ遺伝子クラスターの５’末端の増幅のためには、ＲＴ１：５’−ＧＣＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１９）、ＲＴ２：５’−ＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２０）；プライマー１６ｓＦｏｒ：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２１）および１６ｓＲｅｖ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣ ＴＣＡＧ−３’（配列番号２２）を、等量の全ＲＮＡがそれぞれの試料中に存在することを確実にするための内部対照として使用した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、以前に記載した方法に類似であるが（Ｎｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｅ．、Ｂｅｃｋ，Ｃ．、Ｈｏｌｚｍａｙｅｒ，Ｔ．Ａ．、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｗｕｎｄｅｒ，Ｊ．Ｓ．、Ａｕｄｒｕｌｉｓ，Ｉ．Ｌ．、Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｃ．Ｌ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｂ．、Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．ＶおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ｂ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：７１６０〜７１６４）、１ステップのＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を取扱い説明書に従って使用した。ＲＴ−ＰＣＲが増幅の対数期中に実施されることを確実にするために、サイクル数および鋳型の量を注意深く較正した。
【０１３５】
元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターで変更する
元の／ネイティブＭｅｒＰプロモーターすぐ下流に対応する２ｋｂのＰＣＲ産物を、プライマー組Ｐ１：ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＣ（配列番号２３）（ＸｂａＩ部位に下線を引いた）およびＰ２：ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡ（配列番号２４）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いた）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、プラスミドｐＳＥ３４（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ，Ｔ．およびＥｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：４９３〜４９８）内の対応する部位内にクローニングして、プラスミドｐＨＬＷ７０を生成した。このベクターを動員するために、１．２ｋｂのｏｒｉＴ配列を、プラスミドｐＢＷＶ２（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）から、プライマー組：ｏｒｉＴＦＯＲ：５’−ＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴＣＧＧＴＧＡ−３’（配列番号２５）およびｏｒｉＴＲＥＶ：５’−ＣＧＣＡＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２６）を用いて増幅した。１．２ｋｂのＰＣＲ産物を精製し、その５’末端をＴ４ ＰＮＫによってリン酸化した。最終産物をｐＨＬＷ７０の平滑末端化したＢｓｔＢＩ部位内にクローニングし、プラスミドｐＨＬＷ７１を生じた。プラスミドを異種宿主ＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３内に接合した。数々の接合完了体を、プライマー組：ＥｒｍＥ１：５’−ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＧＧ−３’（配列番号２７）；ＥｒｍＥ２：５’−ＣＧＴＴＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＧ ＣＧ−３’（配列番号２８）、およびＥｒｍＥ３：５’−ＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号２９）；ＥｒｍＥ４：５’−ＣＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＣＴＣＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＴ−３’（配列番号３０）を用いたさらなるコロニーＰＣＲ分析について選択して、意図する単一のクロスオーバーを含有する株を選択し、この結果、ｅｒｍＥ＊プロモーターがｍｅｒ遺伝子クラスターの前に配置された。ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定して、部位特異的組込みを確認した。ｅｒｍＥ＊プロモーターの制御下のｍｅｒ遺伝子クラスターを含有する最終株Ｅ３およびＥ７は、それぞれＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３に由来する。
【０１３６】
抽出物の調製および質量分析
１５ｍｌの発酵培養物には、１ｇのＨＰ２０樹脂を加え、２８℃で２時間、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。菌糸体をＨＰ２０と一緒に、遠心分離によって収集した。１０ｍｌの酢酸エチル：メタノール（９５：５）を加え、５分間渦攪拌した。遠心分離して層を分離し、上部の酢酸エチル層を収集し、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて乾燥させ、その後、５００μｌのメタノールに再度溶解した。エレクトロスプレーイオン化を陰イオンモードで用いたＡｇｉｌｅｎｔ１１００システム上の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、メリダマイシンおよびその類似体を検出した。試料を、Ａ中の６５％〜９０％のＢを用いて、１５分間かけて、０．３ｍｌ／ｍｌの流速で、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂｏｘ ＳＢ−Ｃ１８カラムで溶出させた（Ａ＝５ｍＭの酢酸アンモニア；Ｂ＝メタノール）。高分解能の精密質量測定（ＨＲＭＳ）用に試料を調製するために、粗抽出物を、水中の５％から９５％のアセトニトリルの直線勾配を用いて、ＹＭＣ−ＯＤＳ ４．６×１５０ｍｍの５μｍカラムを用いたＬＣＱ質量分析装置上で分画した。メリダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンに対応する画分を収集し、乾燥させ、３０μｌのＭｅＯＨに再懸濁させ、ＨＲＭＳに供した。アクティブ遮蔽された９．４ Ｔｅｓｌａ超伝導磁石（Ｍａｇｎｅｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、英国）、外部Ｂｒｕｋｅｒ Ａｐｏｌｌｏ ＥＳＩ源、およびＳｙｎｒａｄ ５０Ｗ ＣＯ２ ＣＷレーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＡＰＥＸ ＩＩ ＦＴＩＣＲ質量分析装置を用いて、高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）が得られた。この装置およびその性能の詳細な説明は、以前に公開されている（Ｐａｌｍｂｌａｄ，Ｍ．、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｋ．、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｐ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｉａｎｎａｋｏｐｕｌｏｓ，Ａ．Ｅ．、およびＤｅｒｒｉｃｋ，Ｐ．Ｊ．、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、６：２６７〜２７５）。試料の量が非常に限られているため、ナノエレクトロスプレーを用いた。約５μｌの試料を、伝導性コーティングを有するナノエレクトロスプレーチップ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、マサチューセッツ州Ｗｏｂｕｒｎ）に載せ、事前に載せた、同量の１％のギ酸を含有するメタノールと混合した。約−８００Ｖの高電位をナノエレクトロスプレーチップとキャピラリーの間に適用した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳ調整ミックスを用いて質量スペクトルを外部較正した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｍａｓｓソフトウェア（バージョン７）を、予測された質量の計算を含めたデータの獲得および分析に用いた。誤差は、実測値と予測値の間の差異をｍＤａで表したものである。
【０１３７】
結果および考察：
メリダマイシン生合成遺伝子クラスターの単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内へのｐＳＢＡＣクローニング
事前に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８からのメリダマイシン（ｍｅｒ）生合成遺伝子クラスターをいくつかのコスミドクローン内にクローニングし、配列結果により、メリダマイシンのコア構造の構築を担っている遺伝子がＤＮＡ断片の約９０ｋｂに位置することが明らかとなっている（Ｈｅ，Ｍ．、Ｈａｌｔｉ，Ｂ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．およびＨｕｃｕｌ，Ｊ．（２００６）、Ｇｅｎｅ、３７７：１０９〜１１８）。配列データの制限消化分析から、２つの制限酵素部位（ＭｆｅＩ）が、それぞれｍｅｒ遺伝子クラスターの３７８ｂｐ上流および約１６ｋｂまで下流に位置することが判明している。このＭｆｅＩ ＤＮＡ断片は、ｍｅｒ遺伝子クラスター全体をカバーするＤＮＡを含有し、その元のプロモーターおよび多くの下流の修飾酵素コード領域を有する（図５Ａ）。サザン分析により、ゲノムＤＮＡをＭｆｅＩで消化し、ｍｅｒ遺伝子クラスター特異的プローブとハイブリダイズさせた場合に、９７ｋｂのバンドの存在が実証された（データ示さず）。この遺伝子クラスターをクローニングするために、大きなＤＮＡ挿入物を収容するためにＢＡＣベクターの必須構成要素を有するだけでなく、接合によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へのベクターの伝達を許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）、およびベクターのレシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内への部位特異的組込みを許容する部位特異的組換え系をコードするφＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャトルＢＡＣベクター、ｐＳＢＡＣを用いて、ＭｆｅＩで消化したゲノムＢＡＣライブラリを構築した（ＬｉｕおよびＨｅ．、原稿準備中）。
【０１３８】
約３００個の組換えクローンを、ｍｅｒ遺伝子クラスターの中間に対応するＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。１つの陽性クローンであるｐＨＬＷ３０をさらなる分析のために選択した（配列番号３１：ｍｅｒ遺伝子クラスター）。末端配列決定、制限消化およびｍｅｒ遺伝子クラスターの両末端に対応するプライマー組を用いたＰＣＲ増幅により、遺伝子クラスター全体を１つの単一のクローン内にクローニングすることが成功したことが確認された。このクローンはまた、プロモーターとして機能する可能性がある、遺伝子クラスターの３７８ｂｐ上流の領域、および潜在的なテイラー酵素をコードする遺伝子を含有する１６ｋｂ下流の領域も含有する。
【０１３９】
エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの異種発現
ＢＡＣクローンｐＨＬＷ３０を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７を用いて、接合によって、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４およびＫ４−１１４株内に伝達した。Ｋ４−１１４株は、Ｋ４−１１４中のａｃｔ遺伝子クラスターの一部が欠失してアクチノロージンを産生するその能力が消滅しており、したがって異種発現に関してよりきれいなバックグラウンドが提供されるという点で、ＴＫ２４とは異なる。アプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、ｍｅｒ遺伝子クラスターの両末端に対応するプライマー組を用いたＰＣＲ分析により、遺伝子クラスターの新しい宿主内への導入が確認された（データ示さず）。サザン分析により、それぞれＴＫ２４およびＫ４−１１４から誘導した新しい宿主であるＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３中に遺伝子クラスターが存在することが、さらに確認された（図５Ｂ）。具体的には、様々な株からのプラスミドｐＨＬＷ３０およびゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、その後、ｍｅｒＰ特異的ＤＮＡ断片でプロービングした。（ｐＨＬ３０−２：ＴＫ２４中にＭｅｒ遺伝子クラスター；ｐＨＬ３０−Ｋ３：Ｋ４−１１４中にＭｅｒ遺伝子クラスター（Ａｃｔ−株））。株ＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３のＦＫＡ発酵培地中での小スケールの発酵（２５ｍｌ）では、ＬＣ−ＭＳ分析によって検出可能な量のメリダマイシンが産生されなかった。異種宿主が意図する化合物を産生できなかった結果の可能性のある理由を調査するための第１のステップとして、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子クラスターの転写物を分析することによって、ｍｅｒ遺伝子クラスターの元のプロモーターが新しい宿主中で活性を有するかどうかを検査した。この遺伝子クラスターの転写物をどちらの宿主からも検出することができ、プロモーターが機能的であることが示唆された（データ示さず）。さらなる半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、異種宿主からのｍｅｒ遺伝子クラスターの転写物のレベルが元の産生株ＮＲＲＬ３０７４８よりもはるかに低いことが明らかとなり（図６）、元のｍｅｒプロモーターが新しい宿主中で効率的でないことが示唆され、転写制御が新しい宿主におけるメリダマイシンの産生に影響を与える最重要な因子である可能性が示された。図６の上パネルは、ＭｅｒＰ遺伝子の一部を増幅する、プライマー組ＲＴ１およびＲＴ２を用いた様々な株のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。図６の下パネルは、１６ｓｒ ｒＲＮＡの一部を増幅する、プライマー組１６ｓＦｏｒおよび１６ｓＲｅｖを用いた対応する株のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。（ＴＫ２４：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４、Ｋ４−１１４：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４、ＨＬ３０−２：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４中にｍｅｒ遺伝子クラスター、ＨＬ３０−Ｋ３：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４中にＭｅｒ遺伝子クラスター、Ｅ３：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４中にＭｅｒ遺伝子クラスターおよびｅｒｍＥ＊プロモーター、Ｅ７：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４中にｍｅｒ遺伝子クラスターおよびｅｒｍＥ＊プロモーター）。この結果により、元のｍｅｒプロモーターを、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）において強力なプロモーターが証明されている構成的に活性のあるｅｒｍＥ＊プロモーターに変更することが促された（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．、Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｇ．Ｒ．、およびＷａｒｄ，Ｊ．Ｍ．、１９８５、Ｇｅｎｅ、３８：２１５〜２２６）。ＭｅｒＰ遺伝子の先頭の２ｋｂの相同配列の前にｅｒｍＥ＊プロモーターを有するプラスミドｐＨＬＷ７１を用いて、相同組換えの結果として元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターで置き換えた（図６）。数々の接合完了体を選択し、ＰＣＲを用いて、予測される単一のクロスオーバーの相同組換えを有する株を選択した。この組換えの結果、ｅｒｍＥ＊プロモーターがｍｅｒ遺伝子クラスター全体の前に配置され、その転写の駆動に使用された。続く半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、プロモーターの変更によりｍｅｒ遺伝子クラスターの転写が劇的に増加したことが実証された（図６）。ｅｒｍＥ＊プロモーターに変更することでエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの転写が有意に増加したが（３倍）、新しい宿主におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの全体的な転写は、依然として元の産生株ＮＲＲＬ３０７４８よりも低かった（図６）。元のメリダマイシン産生株が、遺伝子クラスターの発現を駆動する非常に効率的なプロモーターを有すると仮定することが合理的である。
【０１４０】
続くＬＣ−ＭＳ検出により、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４の背景で元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターに変更した、Ｅ７株からのメリダマイシンの産生が実証された（図７）。図７の左パネルは、２ｍＭのピペコレートおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させた株からの、メリダマイシンの産生の検出を示す。図７の右パネルは、０．４％のプロリンおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させた株からの、３−ノルメリダマイシンの産生の検出を示す。矢印は、メリダマイシンまたは３−ノルメリダマイシンのどちらかの、予測される分子量を有するピークおよび保持時間を示す。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４に由来する対応する株（株ＨＬ３０−２）が検出可能な量のメリダマイシンを産生できないことは、前駆体の供給または宿主代謝物からの妨害が原因であり得る（図７）。目的の生成物が何であるかは、長い蓄積時間を有するナノエレクトロスプレー源を用いたＦＴＭＳ高分解能の精密質量スペクトルによって、さらに確認した。低い存在量のメリダマイシンおよびノルメリダマイシンのナトリウム付加分子イオンは、陽イオンモードで、それぞれｍ／ｚ８４４．５１９２８およびｍ／ｚ８３０．５０２９８で検出され、これらは予測値と非常に良好に一致し（［Ｍ＋Ｎａ］１＋、メリダマイシン：予測値８４４．５１８１５、Δ＝１．１３ｍＤａ；ノルメリダマイシン：予測値８３０．５０２５０、Δ＝０．４８ｍＤａ）、したがって、生成物がメリダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンであることが確認された（図８）。
【０１４１】
クローニングしたメリダマイシン生合成遺伝子クラスターのそれぞれのＡＴドメインの以前の分析により、マロネート−ＣｏＡ、メチルマロネート−ＣｏＡおよびエチルマロネート−ＣｏＡを含めた３つの異なる伸長単位が、メリダマイシンの完全合成に提示されなければならないことが明らかとなっている（Ｈｅ，Ｍ．、Ｈａｌｔｉ，Ｂ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．およびＨｕｃｕｌ，Ｊ．（２００６）、Ｇｅｎｅ、３７７：１０９〜１１８）。モジュール４中のアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）が、エチルマロニル−ＣｏＡのメリダマイシンのポリケチド主鎖内への取り込みを担っているが（Ｈｅ他、２００６）、遺伝子クラスターはエイトルマロネート伸長単位を生合成する遺伝子を欠いており、他の機能的遺伝子クラスターがエチマロネートを合成でき、それをメリダマイシンの産生に提供している可能性があることが示唆されている。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）はエチルマロニル−ＣｏＡを産生するが（Ｈｕ，Ｚ．、Ｒｅｉｄ，Ｒ．、およびＧｒａｍａｊｏ，Ｈ．、２００５、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、５８：６２５〜６３３）、この前駆体は、異種宿主による一部のポリケチドの合成を制限する重要な因子であることが実証されている（Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．、Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｊ．、Ｐａｒｋ．，Ｓ．Ｒ．、Ｊｅｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．、Ｈａｎ，Ａ．Ｒ．、Ｓｏｈｎｇ，Ｊ．Ｋ．、Ｋｉｍ Ｂ．Ｇ．、Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｙ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．、およびＹｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、２００６、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７２：７６３〜７６９）。エチルマロニルＣｏＡの供給が異種宿主におけるメリダマイシンの産生に影響を与えるかどうかを調査するために、Ｅ７株を、エチルマロニル−ＣｏＡの有効な前駆体であることが証明されている１０ｍＭのジエチルマロン酸を添加したＦＫＡ培地中で培養した（Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．、Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｊ．、Ｐａｒｋ．，Ｓ．Ｒ．、Ｊｅｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．、Ｈａｎ，Ａ．Ｒ．、Ｓｏｈｎｇ，Ｊ．Ｋ．、Ｋｉｍ Ｂ．Ｇ．、Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｙ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．、およびＹｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、２００６、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７２：７６３〜７６９）。結果により、マロン酸ジエチルを供給することでメリダマイシンの産生が２倍増加したことが示された（１５０μｇ／Ｌから３００μｇ／Ｌ）。
【０１４２】
元のメルジアマイシン産生株ＮＲＲＬ３０７４８に関連する問題の１つは、メリダマイシン、３−ノルメリダマイシンおよびＣ９−デオキソメリダマイシンの混合物である、発酵産物の不均一性である。メリダマイシン生合成遺伝子クラスターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中で異種発現させることによって、３−ノルメリダマイシンは、プロリンを培地に添加した場合に、Ｅ７株からのみ検出可能であった（図８）。
【０１４３】
【表２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【図２】プラスミドレスキューの模式図およびレスキューしたクローンの分析を示す図である。
【図３】ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために使用した戦略の模式図およびレスキューしたクローンの分析を示す図である。
【図４】エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４および相補株ＡＣＴｒｅｓ１２の粗抽出物の吸収スペクトルを示す図である。
【図５】（Ａ）ｍｅｒ遺伝子クラスター全体をｐＳＢＡＣベクター内にクローニングすることを示す図である。ｍｅｒ遺伝子クラスターの模式図を示す。矢印はＭｅｒＰ遺伝子の翻訳開始コドン部位を表す。実線はライブラリのスクリーニングに使用したプローブを表し、斜線はサザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを表す。（Ｂ）サザン分析によって、ｍｅｒ遺伝子クラスターが異種宿主内に導入されたことが確認された。
【図６】様々な株におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの転写の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図７】エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４、ＨＬ３０−Ｋ３、Ｅ７、元のメリダマイシン産生株ＮＲＲＬ３０７４８ならびにメリダマイシンおよび３−ノルメルジアマイシン標準の発酵抽出物のＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。
【図８】４％のプロリンおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させたストレインＥ７からのメルダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンの産生の、ＨＲＭＳ確認を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本方法および処理方法を記載する前に、本発明は、記載した特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変化し得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈により明らかにそうでないと表されない場合以外は、複数形の言及も含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、１つまたは複数の方法、および／または本明細書中に記載するおよび／または本開示を読解した際に当業者に明らかとなる種類のステップなどが含まれる。
【００２９】
したがって、本出願中では、当分野の技術範囲内にある慣用の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用い得る。そのような技術は文献中に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９」）；ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；固定細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングの実用的指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００３０】
本明細書中に記載のものと類似または均等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての出版物は、その全体が参考として組み込まれている。
【００３１】
定義
本明細書中で使用する用語は当業者に理解かつ知られている意味を持つが、利便性および完全性のために、特定の用語およびその意味を以下に記載する。
【００３２】
用語「約」とは、２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。本発明の一実施形態では、用語「約」とは、２０ｋｂ〜１００ｋｂの範囲である、本発明中に記載する遺伝子クラスターの大きさをいう。一実施形態では、用語「約」とは、本明細書中に記載する実際の大きさまたは範囲をいう。
【００３３】
「放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）」とは、非運動性かつ糸状のグラム陽性細菌である。放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、成長するにつれて、枝分れする細胞のフィラメントを形成し、これは菌糸体と呼ばれる糸状のネットワークとなり、外観が一部の真菌の菌糸体と似ている。放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）はまた、胞子を形成し、数々の抗生物質を産生するその様式も独特である。この群の、圧倒的に最も盛大な属はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）であり、５００を超える種が存在する。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）は、その枝分れする糸状構造が真菌に似ている細菌である、細菌目の放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）のメンバーである。しかし、これらは、真核の真菌細胞とは異なり、真の細菌、すなわち原核細胞である。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種とは、マクロライド抗生物質複合体を産生する陸生の放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）をいう。
【００３４】
アクチノロージンとは、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の青色色素を有する芳香族ポリケチド抗生物質をいい、その基本的な炭素骨格はＩＩ型ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）に由来する。（Ａ．ＺｅｅｃｋおよびＰ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、７２４（１９６９）、ページ１７２〜１８２）。
【００３５】
「抗生物質生合成経路」には、一次代謝物を抗生物質へと変換するプロセスに必要な抗生物質生合成遺伝子の全集合が含まれる。これらの遺伝子は当分野で周知の方法によって単離することができ、例えば米国特許第４，９３５，３４０号を参照されたい。
【００３６】
「ａｔｔ」部位とは、２つの核酸分子間の部位特異的組換えを容易にする、核酸の同一性または類似性を有する部位をいう。例えば、本発明中に記載する１つのａｔｔ部位は、φＢＴ１バクテリオファージの組込み部位である（Ｇｒｅｇｏｒｙ，ＭＡ他、２００３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５、第１７号：５３２０〜５３２３）。「ａｔｔＢ」部位とは、細菌細胞の染色体上の付着部位をいい、「ａｔｔＰ」部位とは、バクテリオファージ上の付着部位をいう。φＢＴ１系のバクテリオファージ中のａｔｔＰ部位の核酸配列を配列番号７に示し、φＢＴ１系の細菌細胞（放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ））中のａｔｔＢ部位の核酸配列を配列番号６に示す。「ａｔｔ」部位の別の例は、Ｂｉｅｒｍａｎ他によって記載されているφＣ３１ ａｔｔ部位である（Ｂｉｅｒｍａｎ，Ｍ．、Ｒ．Ｌｏｇａｎ、Ｋ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｅ．Ｔ．Ｓｅｎｏ、Ｒ．Ｎ．Ｒａｏ、およびＢ．Ｅ．Ｓｃｈｏｎｅｒ（１９９２）、Ｇｅｎｅ、１１６：４３〜４９ならびにＫｉｅｓｅｒ，Ｔ．、Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ、Ｍ．Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ、Ｋ．Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ、およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ノッティンガム大学、英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「ＢＡＣ」（細菌人工染色体）とは、大きなＤＮＡ断片をその中に挿入することができる細菌の染色体に由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲の大きさであり得る。一実施形態では、大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲の大きさであり得る。一実施形態では、大きなＤＮＡ断片は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲の大きさの遺伝子クラスターの全体または一部分を含む。大きなＤＮＡ断片のＢＡＣは、単一コピーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦプラスミドに基づいており、＞３００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ならびにバキュロウイルスおよびネズミサイトメガロウイルスのものを含めた大きなＤＮＡウイルスのゲノムを安定に維持することが以前に実証されている（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２）；Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６ ４５７９（１９９３）；Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１４７５９ １４７６３（１９９７））。本明細書中で使用する用語「組換え細菌人工染色体」（ＢＡＣ）とは、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂまでの範囲の大きさの大きなＤＮＡ挿入物を含有するＢＡＣベクターをいう。一実施形態では、大きなＤＮＡ挿入物は、特異的生合成代謝経路の一部である１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの遺伝子クラスターの全体または一部分を含む。組換えＢＡＣのＤＮＡが宿主細菌内に導入された後、これは、自己複製するか、または宿主の染色体内に組み込まれることができる。
【００３８】
用語「二次代謝物のための生合成経路」とは、薬学的に使用するために二次代謝物を合成するための、細菌、ヒト、および様々な植物の遺伝子からなる生合成ネットワークをいう。この経路は、一般に、一連の天然に存在する酵素に制御された反応を含み、１つの物質が別の物質に変換されて、二次代謝物または副産物の放出がもたらされる。
【００３９】
「コード配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列とは、発現された場合にＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、言い換えると、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列には、開始コドン（通常はＡＴＧ）およびストップコドンが含まれ得る。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「接合」とは、細胞の直接接触を介した、１つの原核細胞から別の原核細胞への核酸の直接伝達をいう。したがって、「接合ベクター」（例えばｐＳＢＡＣ）とは、目的の核酸を含有するベクターであり、そのような核酸は、ベクターを含有する細胞と２つの細胞の直接接触後に核酸が伝達されるレシピエント細胞との間の直接接触を介して、１つの細胞から別の細胞へと直接伝達される（すなわち、配列を単離せずに核酸配列を１つの細胞から別の細胞へと受け渡される）。本明細書中で使用する用語「接合伝達」とは、２つの細菌細胞の一時的な結合をいい、その間に、一方の細胞がその遺伝物質の一部または全体を他方の細胞に伝達する。
【００４１】
用語「誘導体」とは、活性親化合物と機能的には均等であるが、構造的には異なり得る化学合成有機分子をいう。これはまた、生体利用度、吸収を増加させるため、または毒性を低下させるために化学的に変更した、化学的に類似の化合物もいい得る。例えば、誘導体とは、類似の化合物から形成される化合物、または別の化合物から、１個の原子を別の原子もしくは原子群で置き換えた場合に生じることが予想される化合物、または前駆体化合物から形成され得る化合物である。
【００４２】
用語「発現する」および「発現」とは、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報が顕在化することを可能にするまたは引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生させることを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内または細胞によって発現されて、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、生じるタンパク質も、細胞によって「発現された」と言ってもよい。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたものとして特徴づけることができる。用語「細胞内」とは、細胞内に存在するものを意味する。用語「細胞外」とは、細胞外に存在するものを意味する。物質は、細胞上または細胞内のどこかから、細胞外に顕著な量で見られる場合に、細胞によって「分泌された」ものである。
【００４３】
用語「発現制御配列」とは、一緒になってコード配列の転写を調節するプロモーターおよび任意のエンハンサーまたは抑制要素をいう。好ましい実施形態では、この要素は複製起点である。
【００４４】
「Ｆ因子」または「原核Ｆ因子」とは、原核生物中に見つかる稔性因子をいう。これは、細菌が他の細菌との接合を媒介することを可能にする、小さなエピソームＤＮＡ片である。その染色体外の状態では、この因子は約６２ｋｂの分子量を有し、少なくとも２０個の伝達遺伝子、複製起点ならびに不和合および複製のための他の遺伝子をコードする。Ｆ因子は３つの異なる状態で存在することができる。「Ｆ＋」とは、上述の遺伝情報のみを含有する、自律性の染色体外状態の因子をいう。「Ｈｆｒ」（「高頻度組換え」を指す）状態とは、因子が、恐らくはその様々な挿入配列が原因で、自身を染色体内に組み込んだ状況を説明している。最後に、「Ｆ’」または（Ｆダッシュ）状態とは、染色体外の要素として存在する因子をいうが、追加の要件として、染色体ＤＮＡの一部分がそれと共有結合して含有されている。Ｆ因子を含有しない株は「Ｆ−」であると言う。Ｆ因子の「分配系」とは、どちらの娘細胞にも親プラスミドのコピーが遺伝していることを確実にする系をいう。
【００４５】
「断片」とは、親のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０個のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド、または、親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０個の塩基対（好ましくは少なくとも２０個の塩基対、少なくとも３０個の塩基対、少なくとも４０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも１００個の塩基対、少なくとも２００個の塩基対）のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれかをいう。任意の所定の断片は、親の核酸またはタンパク質またはポリペプチドの機能的活性を保有していても、していなくてもよい。
【００４６】
用語「遺伝子」とは、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全体または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするまたはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列が含まれていても、含まれていなくてもよい。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写されるが、アミノ酸配列へと翻訳されない場合がある。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。
【００４７】
用語「遺伝子クラスター」とは、同じまたは類似の産物をコードする、２つ以上の密に関連する遺伝子の任意の群をいう。本発明では、遺伝子クラスターは、本明細書中に定義する二次代謝物の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイム（多酵素系）をコードする。例えば、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）および非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）は、どちらも対応する化学物質の合成を担っているマルチモジュールのメガンザイムである（Ｓｔａｕｎｔｏｎ Ｊ．他、Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．（２００１）８月；１８（４）：３８０〜４１６；Ｆｉｎｋｉｎｇ，Ｒ．他、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４；５８：４５３〜８８参照）。これらの多酵素系をコードする遺伝子は、通常、染色体上でグループを作っており、明確な生合成遺伝子クラスターを形成している。
【００４８】
本明細書中で使用する「遺伝子産物」とは、遺伝子によって、その遺伝子が発現された際に産生される産物をいう。典型的には、この語句は、核酸、タンパク質またはポリペプチドをいう。例えば、本発明では、この語句は、ポリケチド合成酵素などの酵素もしくは非リボソームポリペプチドの合成に役割を果たす任意の酵素をいうか、または、実際のポリケチドもしくは非リボソームポリペプチドもいう場合がある。この例は、米国特許公開第２００５０２７２１３３号、または第２００３０１３４３９８号および第２００３０１２４６８９号中に見つけ得る。さらなる例は、米国特許第６，４９５，３４８号中に見つけ得る。
【００４９】
用語「異種」とは、天然に存在しない要素の組合せをいう。例えば、異種ＤＮＡとは、天然では細胞内または細胞の染色体部位内に位置しないＤＮＡをいう。異種ＤＮＡには、細胞に外来性である遺伝子が含まれ得る。異種発現調節要素とは、それが天然で作動可能に会合しているものとは異なる遺伝子と作動可能に会合している要素をいう。
【００５０】
「相同組換え」とは遺伝的組換えの種類であり、２本の異なるＤＮＡ分子鎖間で生じる物理的な再配置プロセスである。相同組換えは、鎖間で物質の交換を生じるための、同一または類似の配列のアラインメント、２つの分子のアラインメントした相同的なＤＮＡ鎖間のクロスオーバー、ならびにＤＮＡの切断および修復を含む。相同組換えは他の種類の組換えとは区別される。例えば、反転可能な要素、リゾルバーゼ、および一部のファージ組込み事象によって例示される「部位特異的組換え」が、非相同的組換えの例である。多くの場合、２つの組換え部位で同一または類似の配列が必要であるが、配列は短く、相同組換えで用いられる、より長いストレッチ（数百個の塩基対）から区別される。（Ｊ ＲｕｂｎｉｔｚおよびＳ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、１９８４、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：２２５３〜２２５８）。
【００５１】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、適切な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子とアニーリングすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸の予備スクリーニングには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５×デンハート溶液、およびホルムアミドなし；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５×デンハート溶液を使用することができる。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ、５×デンハート溶液に対応する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ、５×デンハート溶液に対応する。ＳＣＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ−クエン酸緩衝液である。５×デンハート溶液は、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％ｇのＢＳＡ（ｗ／ｖ）である。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第では、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きければ大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに相当）は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記、９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記、１１．７〜１１．８参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドであり；より好ましくは、長さは少なくとも約２０個のヌクレオチドである。
【００５２】
用語「組込み部位」とは、レシピエント細胞のゲノム内への核酸の挿入部位をいう。組込み部位は、ランダムであるか、または当業者に知られている部位特異的機構によって起こり得る。保存的な部位特異的組換えでは、例えば、クロスオーバーで見られるものと類似の手段によって可動ＤＮＡ要素を１本のＤＮＡ鎖内に挿入する。可動要素上のＤＮＡのセグメントが標的上のＤＮＡのセグメントと正確に一致し、これにより、インテグラーゼと呼ばれる酵素が可動要素の残りの部分を標的内に挿入することが可能となる。インテグラーゼとは、特別な種類のリコンビナーゼ酵素である。リコンビナーゼとは、二本鎖ＤＮＡを特異的部位で切断してリン酸ジエステル結合の損失をもたらす酵素である。この反応は、ホスホチロシン結合を介してリコンビナーゼとＤＮＡとの間に共有結合が形成されることによって安定化する。部位特異的組換えの別の形態である転位組換えは、可動要素内のＤＮＡの同一の鎖が標的ＤＮＡと一致することを必要としない。その代わりに、関与するインテグラーゼが可動要素および標的ＤＮＡの両方に切れ目を導入し、可動ＤＮＡが配列に入ることを可能にする。その後、切れ目をリガーゼによって除去する。また、配列相同性を含有しないＤＮＡ配列間の組換えは、非相同的末端結合とも呼ばれる。
【００５３】
一般論として、単語「単離すること」とは、目的の物質をその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境、またはそれを配置した環境から）から取り出すことをいう。例えば、「単離した」ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または化学合成した場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。本発明では、プラスミドレスキュー方法は、組込み部位に隣接して位置する遺伝子クラスターを、任意の他の汚染性の遺伝物質または細胞物質を含まないように、「単離」または回収する手段を提供する。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「大きなＤＮＡ断片」とは、約２０キロ塩基〜約４００キロ塩基の範囲のおおよその大きさを有する一片のＤＮＡをいう。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲であり得る。一実施形態では、「大きなＤＮＡ断片」は、遺伝子クラスターの全体または一部分を含み得る。
【００５５】
「メリダマイシン」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強力なＦＫＢＰ１２結合活性および顕著な神経保護活性を有することが示されているマクロライドポリケチドであり、以下の構造（Ｉ）を有する。
【００５６】
【化１】
【００５７】
これは、ブダペスト条約の規約の下、２００４年５月１８日に農業研究局カルチャーコレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＮＲＲＬ）（受託番号ＮＲＬＬ３０７４８）に寄託されている、陸生放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のＷｙｅｔｈ培養物ＬＬ−ＢＢ０００５によって産生される。メリダマイシンは、ＦＫ結合タンパク質と結合するイムノフィリンリガンドとして機能する。
【００５８】
「天然物」とは、天然に見つかり、通常は薬学的な創薬および薬物設計で使用するための薬理学的活性または生物活性を有する、化学物質または生きた生物によって産生される物質である。天然物は、全合成によって調製することができる場合でも、そのようにみなすことができる。すべての天然物を完全に合成できるわけではなく、多くの天然物は非常に複雑な構造を有しており、その一部は工業的スケールで合成するには困難かつ高価すぎる。そのような化合物は、その天然源から収穫することしかできない。さらに、収穫から得ることができる構造的類似体の数は非常に限定されている。時折、このような問題を避けるために半合成手順を使用する。これは、しばしば、最終（リード）化合物自体ではなく生合成の中間体を天然源から収穫することを含む。その後、慣用の合成によって中間体を最終産物に変換することができる。この手法は２つの利点を有することができる。第１に、中間体は、最終産物自体よりも容易かつ高収率で抽出し得る。第２に、これは、最終産物の類似体を合成する可能性を可能にし得る。半合成ペニシリンがこの手法の例示である。別の例は、パクリタキセルのそれである。これは、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩをイチイの樹の針葉から抽出し、その後、４段階の合成を実施することによって製造する。
【００５９】
用語「非リボソームポリペプチド」とは、コンベヤベルトと同じように機能するモジュール式の酵素複合体を用いて合成されるポリペプチドをいう。非リボソームペプチドは、主に単細胞生物、植物および真菌に限定されている。これらの複合体はすべて同様の様式で配置されており、多くの異なるモジュールを含有して、開発中の生成物に化学操作の多様な集合を行うことができる。一般に、これらのペプチドは環状であるが（しばしば高度に複雑な環状構造を有する）、直鎖状の非リボソームペプチドも一般的である。この系はモジュール式であり、脂肪酸およびポリケチドを構築する機構に密に関連しているため、ハイブリッド化合物がしばしば見つかる。オキサゾール、チアゾールおよびそれらの還元された対応物は、しばしば、化合物がこの様式で合成されたことを示している。非リボソームポリペプチドの他の例には、バンコマイシン、チオストレプトン、ラモプラニン、テイコプラニン、グラミシジン、およびバシトラシンが含まれる。
【００６０】
「ポリケチド」とは、細菌、真菌、植物および動物からの二次代謝物である。二次代謝物は生物の個体発生に不必要であると思われるが、防御および細胞間通信などの用途を有すると考えられる。ポリケチドは、アセテート、プロピオネートまたはブチレートなどの単純なカルボキシレートの連続的な縮合から誘導される、大きな天然物の群を表す。また、これらは、広範囲の天然物の構成単位として役割を果たすか、または誘導体化されている。ポリケチドは、非常に広い範囲の生物活性および薬理学的特性を有する、構造的に非常に多様な天然物のファミリーである。ポリケチド抗生物質、抗真菌剤、細胞分裂抑制性剤、抗コレステロール剤、抗寄生虫剤、抗コクシジウム剤、動物成長促進物質および天然の殺虫剤が商業的に使用されている。例には、マクロライド、例えば、ピクロマイシン、エリスロマイシンＡ、クラリスロマイシン、およびアジスロマイシンが含まれる。また、免疫抑制剤タクロリムス（ＦＫ５０６）およびラパマイシン、ならびにポリエン抗生物質、例えばアムホテリシンも含まれる。また、テトラサイクリン抗生物質ファミリーも含まれる。抗癌化合物、ダウノマイシン、ブリオスタチンおよびディスコデルモリドもポリケチドである。獣医学用化合物モネンシンおよびアベルメクチンもポリケチドである。また、アクチノロージンおよびメリダマイシンも含まれる。ポリケチドは、１つまたは複数の特殊化したポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の酵素によって合成する（米国特許公開第２００７０１４８７１７号参照）。
【００６１】
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのどちらかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマーの形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステル類似体をいう。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語、核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみを指し、それをどのような特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語には、とりわけ、直鎖状（例えば制限断片）または環状のＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体中に見つかる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を記述するにあたって、本明細書中で、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向でのみ配列を与えるという通常の習慣に従って記載し得る。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的な操作を受けたＤＮＡ分子をいう。
【００６２】
「ヌクレオチド」とは、窒素含有塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）、リン酸分子、ならびに糖分子（ＤＮＡ中ではデオキシリボース、ＲＮＡ中ではリボース）からなるＤＮＡまたはＲＮＡのサブユニットをいう。
【００６３】
ベクターを宿主細胞内で増殖させるためには、そこで複製が開始される特異的な核酸配列である、１つまたは複数の「複製起点」部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ぶ）を含有し得る。したがって、本明細書中で使用する用語「複製起点」または「ｏｒｉ」とは、核酸の複製を開始する核酸配列をいう。起点では、２本のＤＮＡの鎖が引き離されて複製バブルが形成される。これは、バブルの各側に一本鎖ＤＮＡの領域を生じる。その後、ＤＮＡポリメラーゼ機構が入り込み、古い鎖を鋳型として使用して新しいＤＮＡ鎖の合成を開始することができる。複製「フォーク」が起点からどちらの方向にもＤＮＡに沿って移動し、新しいＤＮＡを合成する。
【００６４】
「ｏｒｉ２」とは、単一コピーの複製を可能にする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド由来の「複製起点」をいう。（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｍａｎｃｉｎｏ，ｖ．、Ｓｌｅｐａｋ，ＴＩ、Ｔａｃｈｉｉｒｉ，Ｙ．、およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．、８９０：８７９４〜８７９７）。
【００６５】
「ｏｒｉＶ」とは、高コピーの複製を可能にする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド由来の「複製起点」をいう。（Ｐｅｒｒｉ，Ｓ．およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．、１９９３、ＲＫ２複製開始タンパク質とプラスミド起点反復との相互作用のＤＮＡ配列要件（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＫ２ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｐｅａｔｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：３６６２〜２６６９）。
【００６６】
「ｏｒｉＴ」とは、ベクターが１つの細菌細胞から別の細菌細胞へと伝達することを許容する「伝達起点」をいう。
【００６７】
「伝達起点」（例えばｏｒｉＴ）とは、伝達プロセスが開始されるベクター上の部位を表す。これはまた、伝達させるＤＮＡに対してシスで必要な領域として、遺伝的に定義される。接合に特異的なＤＮＡ複製は、プラスミド伝達因子もコードするｏｒｉＴ領域内で開始される。
【００６８】
「φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ組換え系」とは、ベクターがレシピエント細胞の染色体のａｔｔＢ部位内に部位特異的に組み込まれることを許容する部位特異的組換え系をいう。（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｍ．Ａ．、Ｔｉｌｌ，Ｒ．、およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．Ｍ．、２００３、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８５：５３２０〜５３２３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５５０９４０）
【００６９】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸中の一連のヌクレオチド塩基であり、２個以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって使用される情報を含めた、遺伝情報を保有する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作したポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方（ただし、センスストランドのみを本明細書中で表す）が含まれる。これには、一本鎖および二本鎖の分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸主鎖とコンジュゲートさせることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。また、これには修飾された塩基を含有する核酸、例えばチオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルも含まれる。本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列が隣接していてもよいか、または、プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コード領域などを含めた異種配列と会合していてもよい。また、核酸は、当分野で知られている数多くの手段によって修飾されていてもよい。そのような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数を類似体で置換すること、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合を用いたもの（例えば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合を用いたもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などが含まれる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の追加の共有結合した部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などを含有し得る。ポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルのリン酸トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の形成によって誘導体化し得る。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドはまた、検出可能なシグナルをもたらすことができる標識を用いて、直接または間接的に修飾し得る。例示的な標識には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。
【００７０】
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合しており、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基または要素が含まれる。プロモーター配列内には、転写開始部位（便宜上、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマップ作成することによって定義する）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担っているタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見つかる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含めた他の発現制御配列と作動可能に会合していてもよい。
【００７１】
「原核Ｆ因子分配系」とは、細胞分裂において娘Ｆ因子の正しい分離および忠実な分布を確実にする活性な位置決めプロセスをいう。（Ｎｉｋｉ，Ｈ．およびＨｉｒａｇａ，Ｓ．、１９９７、細胞分裂周期中の大腸菌における分配が活動的なＦプラスミドの細胞内分布（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．）、Ｃｅｌｌ、９０：９５１〜９５７）。この分配系は３つの機能的に明確な領域を含有する。そのうちの２つ（ｓｏｐＡおよびｓｏｐＢ）はトランスで作用する遺伝子産物をコードする一方で、第３の領域（ｓｏｐＣ）はシスで機能する。すべての領域が細胞分裂中のプラスミドの分配に必須である。（Ｏｇｕｒａ Ｔ．、Ｈｉｒａｇａ Ｓ．、１９８３、Ｃｅｌｌ、３２：３５１〜６０）。
【００７２】
用語「レシピエント細胞」とは、本明細書中に記載の目的のベクターを受け取るために選択された細胞をいう。「レシピエント細胞」はまた、「宿主細胞」とも呼び得る。例えば、本発明では、一実施形態は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）をレシピエント細胞として提供する。一実施形態では、本発明は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の属、特にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の種を、レシピエント細胞として提供する。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がレシピエント細胞であり得る。さらに、レシピエント細胞は、特定の遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、またはタンパク質を発現するように操作したものであり得る。レシピエント細胞はさらに、スクリーニングに使用することができる。レシピエント細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、または１つもしくは複数の細胞を非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物もしくは一過的に形質移入した動物）に伝達し得る。レシピエント細胞は、原核（例えば細菌）細胞、植物細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含めた真核細胞を含めた、任意の生物有機体から選択され得る。適切なレシピエント細胞の他の代表的な例には、任意の他の細菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞など；ならびに昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などが含まれる。
【００７３】
「二次代謝物」とは、生物の正常な成長、発生、または繁殖に直接関与していない有機化合物である。一次代謝物とは異なり、二次代謝物が存在しないことは、生存性／繁殖力の低下、美的な差、または表現型にまったく変化がないことなど、生物にとって穏和な機能障害しかもたらさない。二次代謝物は、しばしば、系統学的群内の狭い一組の種に限定されている。生物に対するこれらの化合物の機能または重要性は、通常、これらが捕食者、寄生生物および疾患に対する防御として、種間競合のため、ならびに繁殖プロセスを促進するため（着色料、魅力的な匂いなど）として使用されるため、生態学的な性質のものである。これらの化合物は、通常、はるかに限定されている生物群に制限されているため、これらは長い間、分類学研究において最重要であった。人類における目的の二次代謝物のほとんどは以下の分類に当てはまり、一部は複数に当てはまる。これらの分類は広い分類であり、二次代謝物をその生合成起源に基づいて分類する。二次代謝物は、しばしば、修飾された一次代謝物合成酵素によって、すなわち、一次代謝物起源の基質を「借りる」ことによって作製されるため、これらの分類は、分類中のすべての分子が二次代謝物であると示していると解釈されるべきでなく（例えばステロイド分類）、むしろ、これらの分類中に二次代謝物が存在すると解釈されるべきである。これらの分類の例およびそれぞれの分類中の試料には、アルカロイド、例えば、ヒヨスチアミン、アトロピン、コカイン、コデイン、モルヒネ、テトロドトキシンなど；テルペノイド、例えば、アザジラクチン、アルテミシン、テトラヒドロカンナビノールなど；ステロイド、例えば、テルペン、サポニンなど；グリコシド、例えば、ノジリマイシンおよびグルコシノレートなど；フェノール、例えばレスベラトロールなど；フェナジン、例えば、ピオシアニンおよびフェナジン−１−カルボン酸（ならびに誘導体）などが含まれる。
【００７４】
用語「選択すること」とは、目的のベクターを含有するレシピエント細胞の同定および単離をいう。形質転換させた微生物、すなわち、組換え分子を含有するものは、様々な陽性および／または陰性の選択方法またはマーカーを用いて選択し得る。特定の態様では、陽性選択マーカーは、アミノ酸などの必須の栄養素が存在しない場合に成長を可能にする遺伝子である。例えば、チミンおよびチミジンが存在しない場合に、ｔｈｙＡ遺伝子を発現する細胞は生存する一方で、この遺伝子を発現しない細胞は生存しない。様々な適切な陽性／陰性選択の対が、当分野で利用可能である。例えば、当分野で知られている様々なアミノ酸類似体を陰性選択として使用することができる一方で、最少培地（アミノ酸類似体に関して）上での成長を陽性選択として使用することができる。視覚的に検出可能なマーカーも本発明における使用に適しており、陽性および陰性によって選択するか、かつ／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）もしくはマイクロフルイディクスなどの技術を用いてスクリーニングし得る。検出可能なマーカーの例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーなどが含まれる。適切な蛍光タンパク質の例には、それだけには限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリンなどが含まれる。適切な生物発光マーカーの例には、それだけには限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれる。視覚的に検出可能なシグナルを有する適切な酵素系の例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれる。他の態様では、陽性選択マーカーとは、遺伝子が存在しない場合に細胞にとって致死的となる化合物に対する耐性を与える遺伝子である。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は抗生物質の存在下で生存する一方で、その遺伝子を欠く細胞は存在しない。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在は、テトラサイクリンの存在下で陽性に選択することができ、フザリン酸の存在下において陰性に選択することができる。適切な抗生物質耐性遺伝子には、それだけには限定されないが、アンピシリン−耐性遺伝子、ネオマイシン−耐性遺伝子、ブラストサイジン−耐性遺伝子、ハイグロマイシン−耐性遺伝子、プロマイシン−耐性遺伝子、クロラムフェニコール−耐性遺伝子、アプラマイシン−耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。特定の態様では、陰性選択マーカーは、特定の基質の存在下で標的細胞に対して致死的な遺伝子である。例えば、ｔｈｙＡ遺伝子は、トリメトプリムの存在下で致死的である。したがって、トリメトプリムの存在下で成長する細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子を発現しない。陰性選択マーカーには、それだけには限定されないが、ｔｈｙＡ、ｓａｃＢ、ｇｎｄ、ｇａｐＣ、ｚｗＪ、ｔａｌＡ、ｔａｉＢ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡ、ｐｇｉ、Ｊｂｐ、ｐｙｋＡ、ｃｉｔ、ａｃｓ、ｅｄｄ、ｉｃｄＡ、ｇｒｏＥＬ、ｓｅｃＡなどの遺伝子が含まれる。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「生物学的活性または酵素活性について選択すること」とは、ベクターによってレシピエント細胞に伝達される遺伝子産物、例えば、それだけには限定されないがポリケチド合成酵素などの遺伝子クラスターによってコードされている酵素に関連する生物活性を測定すること、または、酵素自体の活性を測定することによって、レシピエント細胞、例えば、伝達したベクターを含有する放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞を同定および選択することをいう。また、これは、ポリケチドまたは非リボソームポリペプチドであり得る最終産物の生物活性をいう場合もある。
【００７６】
用語「選択マーカー」または「選択可能マーカー」とは、薬物を、形質転換体のクローニングおよび同定を補助するマーカーとして使用または含めることをいい、例えば、アプラマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択可能マーカーである。したがって、本発明の核酸構築体を含有する細胞は、マーカーをベクター内に含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定し得る。そのようなマーカーは細胞に識別可能な変化を与え、ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能となる。一般に、選択可能マーカーとは、選択を可能にする特性を与えるものである。陽性の選択可能マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものである一方で、陰性の選択可能マーカーとは、その存在がその選択を阻止するものである。陽性の選択可能マーカーの例は薬物耐性マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、比色分析に基づくＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含めた他の種類のマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ｔｋ」）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）などのスクリーニング可能な酵素を利用し得る。当業者は、免疫マーカーを、場合によってはＦＡＣＳ分析と併せて、どのように用いるかも知っているであろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限りは、重要でないと考えられる。選択可能およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００７７】
したがって、用語「配列類似性」とは、進化上の起源が共通であるまたは共通でない場合がある、タンパク質の核酸またはアミノ酸の配列間の同一性または対応性の度合をいう。
【００７８】
「シャトルベクター」とは、一般に、２つの異なる生物、例えば、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内などで複製されることができるプラスミドをいう。本発明では、シャトルベクターは、遺伝子クラスターの全体または一部分を含めた大きなＤＮＡ断片の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）間の伝達を可能にする。さらに、本発明のシャトルベクターは、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂのＤＮＡの大きな断片の伝達を可能にし、２つの異なる生物内で複製されることができるベクターである、「シャトル細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター」である。
【００７９】
「部位特異的組込み配列」とは、２つの核酸分子間の組換えおよびドナー核酸分子からレシピエント核酸分子への組込みを容易にする、ドナーまたはレシピエントの核酸分子中の核酸配列をいう。
【００８０】
「部位特異的組換え」または「部位特異的組換え系」とは、一般に２０〜３０個の塩基の長さの付着（ａｔｔ）部位と呼ばれるそれぞれの分子の独特の部位で起こる、２つのＤＮＡ分子間の組換えプロセスをいう。特殊化した酵素「インテグラーゼ」が２つのａｔｔ部位を認識し、２つのＤＮＡ分子を一緒にし、ＤＮＡ二重鎖の切断および再結合事象を触媒して、レシピエント細胞のＤＮＡ分子のうちの一方が他方のＤＮＡ内に組み込まれる。（Ｎ．Ｄ．Ｇｒｉｎｄｌｅｙ、Ｋ．Ｌ．Ｗｈｉｔｅｓｏｎ、Ｐ．Ａ．Ｒｉｃｅ、２００６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７５、５６７〜６０５）。
【００８１】
具体的な実施形態では、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは５５℃のＴｍをいい、上述の条件を利用する。
【００８２】
言語「細胞物質を実質的に含まない」には、ポリペプチド／タンパク質が、それを単離または組換えによって産生した細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチド／タンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％未満（乾重量）の汚染タンパク質しか有さないポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。ポリペプチド／タンパク質を組換えによって産生した場合は、培地を実質的に含まないことも好ましい、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満を表す。ポリペプチド／タンパク質を化学合成によって生成した場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、タンパク質の合成に関与している化学前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、ポリペプチド／タンパク質のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾重量）の、目的のポリペプチド／タンパク質断片以外の化学前駆体または化合物しか有さない。「単離した」または「精製した」核酸分子とは、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、ｃＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、または遺伝子クラスターなどの「単離した」核酸分子は、他の細胞物質、または組換え技術によって産生した場合は培地を実質的に含まないことができ、または化学合成した場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【００８３】
具体的な実施形態では、２つのＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒなどの配列比較アルゴリズムによって決定して、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、定義した長さのＤＮＡ配列にわたって一致する場合に、「実質的に相同的」または「実質的に類似」している。そのような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子または種の変異体である。実質的に相同的な配列は、配列データバンクで利用可能な標準のソフトウェアを用いて、または、例えば、その特定の系について定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することによって、同定することができる。
【００８４】
同様に、特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列は、８０％を超えるアミノ酸が同一である、または約９０％を超えるアミノ酸が類似である場合に、「実質的に相同的」または「実質的に類似」である。好ましくは、アミノ酸は機能的に同一である。好ましくは、類似または相同的な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用のプログラム説明書、バージョン７、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のパイルアッププログラム、または上述のプログラムのうちの任意のもの（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いたアラインメントによって同定する。
【００８５】
用語「伝達する（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）」とは、電気穿孔（電気ショックを用いて細胞膜に一過性の穴を作ること）、接合（細胞の直接接触を介した、１つの原核細胞から別の原核細胞への核酸の直接伝達をいう）、形質導入（細菌ＤＮＡをウイルスによって１つの細菌から別の細菌へと移すプロセス）または形質移入（典型的には、細胞膜に一過性の孔もしくは「穴」を開けて、物質の取り込みを可能にすることを含む、外来物質を細胞内に導入すること。形質移入は、しばしば、カチオン性脂質を物質と混合してリポソームを生成することによって実施し、これは、細胞膜と融合してその内容物を内部に入れる。）を含めた、任意の手段によって、核酸を細胞内に導入することをいう。形質転換とは、外来遺伝物質の取り込みおよび発現によりもたらされる、細胞の遺伝子変化である。
【００８６】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはコスミドなどのレプリコンであり、結合したセグメントの複製をもたらすために、それに別のＤＮＡセグメント（例えば外来遺伝子）を取り込ませてもよく、これにより、導入した配列の発現がもたらされる。ベクターは、導入したＤＮＡに異種であるが、宿主細胞に認識され、それによって使用される、プロモーターおよび１つまたは複数の制御要素（例えばエンハンサー要素）を含み得る。あるいは、ベクター内に導入する配列は、宿主細胞によって認識および発現され得るその天然のプロモーターを保持する（Ｂｏｒｍａｎｎ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９６；１７８：１２１６〜１２１８）。「レプリコン」とは、細胞内で自律したＤＮＡ複製単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。一実施形態では、本発明のベクターは、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の間の接合を許容する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）シャトルベクターである。１つのＤＮＡセグメントを別のＤＮＡセグメント内に挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特異的部位（ヌクレオチドの特異的な群）でＤＮＡを切断する、制限酵素と呼ばれる特定的な酵素の使用を含む。「カセット」とは、定義した制限部位でベクター内に挿入することができる発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントをいう。カセット制限部位は、カセットが正しいリーディングフレーム内に挿入されることを確実にするように設計されている。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位で挿入され、その後、ベクターによって、伝播可能なベクターＤＮＡと共に宿主細胞内に運ばれる。発現ベクターなどの、挿入または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築体」と呼ぶこともできる。ベクターの一般的な種類は「プラスミド」であり、これは、一般に、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、適切な宿主細胞内に容易に導入することができる、通常は細菌起源の自己完結的な二本鎖ＤＮＡ分子である。プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡの挿入に適した１つまたは複数の制限部位を有する。コードＤＮＡとは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとは、開始、調節、または他の様式でコードＤＮＡの発現を媒介もしくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来してもよく、同じまたは異なる生物に由来してよい。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主中の選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットが含まれる。ベクター構築体は、当分野の技術範囲内にある慣用の分子生物学および組換えＤＮＡ技術を用いて生成し得る。そのような技術は文献中に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９」）；ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００８７】
概要
本発明は、以下の構成要素を含有するベクター（ｐＳＢＡＣ）を提供する。第１に、これは、２つの複製起点（単一コピーの複製の開始のためのｏｒｉ２および高コピーの複製の開始のためのｏｒｉＶ）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子に基づいた分配系（ＰａｒＡ、ＰａｒＢおよびＰａｒＣ）を有する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターｐＣＣ１ＢＡＣの主鎖を含有する；第２に、これは、ベクターが１つの細菌細胞から別の細菌細胞へと伝達されることを許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）を含有し、この機能は、核酸が直接の細胞間接触を介して１つの原核細胞から別の原核細胞へと伝達されることをもたらす、接合に重要である；第３に、これは、レシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内へのベクターの部位特異的組込みを許容する部位特異的な組換え系をコードする、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する。これらの構成要素すべてにおいて、このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、およびクローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡを放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）ゲノム内にφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。φＢＴ１は、幅広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み部位を有するため、このベクターは、よく利用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み系を表す。このベクター系は利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大し、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避する。（例えば、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系の使用は、ストレプトマイセス・トヨカエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）において、糖ペプチド抗生物質であるＡ４７９３４の産生を、対照株の５９％まで減少させる。さらに、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系の使用は、サッカロポリスポラ・スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）において、既知の農業用殺虫剤であるスピノシンの産生を、対照株の９６％まで減少させる。（Ｂａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｐ．他、１９９４、Ｇｅｎｅ、１４６：３９〜４５；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｐ．およびＢａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４２：２６１〜１２７）
【００８８】
二次代謝物の産生を担っている遺伝子は、大きさが１００ｋｂの規模であることができるクラスター内に位置するため、このベクターは、これらの遺伝子クラスターをクローニングするため、ならびに、これらの大きな遺伝子セグメントをベクターが自己複製される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と染色体内のφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に部位特異的に組み込まれる様々な放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主との間でシャフリングするための、重要なビヒクルを提供する。
【００８９】
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている。しかし、この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は主に、外来性ＤＮＡが挿入された座位の隣接領域のクローニングおよび同定に使用した。ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、本発明はまた、ｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片上の生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法も提供する。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。原理の証拠として、最初に、ベクターをストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。アプラマイシン−耐性の接合完了体を回収した。そのうち２つのさらなる分析により、ベクターがφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に特異的に組み込まれたことが明らかとなった。これら２つのゲノムＤＮＡを単離し、異なる制限酵素で消化し、消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供した。電気泳動のＤＮＡ画分の様々な部分を回収した。自己ライゲーションおよび形質転換の後、レスキューしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ＴｒａｎｆｏｒＭａｘ ＥＰＩ３００内に導入した。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。この方法が一般的な応用の潜在性を有することを証明するために、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスターの末端の２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を有さないｐＳＢＡＣベクター内にクローニングした。その後、この構築体をエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に形質転換させ、相同組換えにより単一のクロスオーバーがもたらされ、構築体が相同領域内に部位特異的に挿入された。接合完了体のゲノムＤＮＡを単離し、上述の手順を用いた、アクチノロージン遺伝子クラスター全体の単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内へのレスキューが成功した。その後、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ断片をレスキューしたクローン内に導入して、続く遺伝子クラスターの特異的座位内への組込みを容易にした。最後に、アクチノロージン遺伝子クラスターを、アクチノロージン遺伝子クラスターを事前に欠失させた突然変異したエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株内に伝達した。クローニングしたアクチノロージン遺伝子クラスターの発現の成功は、アクチノロージンの産生の修復によって実証した。
【００９０】
大きな核酸断片をクローニングおよび伝達する方法
本発明の一態様は、核酸の大きな断片、例えば遺伝子クラスターの全体または一部分を含む大きなＤＮＡ断片を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へとクローニングまたは伝達するためのベクターを提供する。一実施形態では、原核生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株である。他の実施形態では、原核生物は、核酸を１つの生物から別の生物へと、例えば、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達するために使用する、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の同じもしくは異なる株、または当業者に知られている任意の他の生物である。遺伝物質のドナーは、遺伝物質を１つの生物から別の生物へと伝達するために使用する、当業者に知られている原核または真核生物であり得る。
【００９１】
一実施形態では、ベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターである。一実施形態では、ＢＡＣベクターはシャトルＢＡＣベクターである。一実施形態では、シャトルＢＡＣベクターは、ｐＳＢＡＣと呼ばれる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ベクターである。一実施形態では、ベクターは、遺伝子クラスターの全体または一部分をさらに含む。ベクターはＢＡＣベクターであることを想定するが、大きな核酸断片を伝達することができる他のベクターも使用が想定される。これらには、バクテリオファージ由来の人工染色体（ＰＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。
【００９２】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびバクテリオファージ由来の人工染色体（ＰＡＣ）は、大きなＤＮＡ断片のクローニングに用いられている。さらに、ＢＡＣおよびＰＡＣは、従来の大きなＤＮＡのクローニング系である酵母人工染色体（ＹＡＣ）を超える特定の利点を有し得る。これには、大きな保有容量（約１００〜３００ｋｂまで）、高いクローナル安定性、低いキメラ化現象、および取扱いの容易さが含まれる（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｍａｎｃｉｎｏ，Ｖ．、Ｓｌｅｐａｋ，Ｔ．、Ｔａｃｈｉｉｒｉ，Ｙ．、およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．、１９９２、ＰＮＡＳ、８９：８７９４〜８７９７；Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．、Ａｍｅｍｉｙａ，Ｃ．Ｔ．、Ｇａｒｎｅｓ，Ｊ．、Ｋｒｏｉｓｅｌ，Ｐ．Ｍ．、Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．、Ｂａｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．、およびｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．Ｊ．、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、６：８４〜８９；Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．、Ｋｕｃａｂａ，Ｔ．Ａ．、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｎ．Ｌ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．Ｄ．、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｋ．、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｍ．、Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．Ｗ．、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、およびＷａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７：１０７２〜１０８４；Ｋｅｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．、Ｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｅ．、Ｃｒａｖｅｎ，Ｍ．Ｂ．、Ｂｏｃｓｋａｉ，Ｄ．、Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．、Ｒｏｕｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｄ．、およびＡｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：１５３９〜１５４６）；Ｍｏｚｏ，Ｔ．、Ｄｅｗａｒ，Ｋ．、Ｄｕｎｎ，Ｐ．、Ｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．、Ｋｌｏｓｋａ，Ｓ．、Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｈ．、Ｍａｒｒａ，Ｍ．、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．、Ｍｅｉｅｒ−Ｅｗｅｒｔ，Ｓ．、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：２７１〜２７５；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｒ．Ａ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｂｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｐ．、Ｌａｖｅｒｔｙ，Ｔ．Ｒ．、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｒ．Ａ．、Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ，Ｌ．、Ｎａｅｅｍｕｄｄｉｎ，Ｍ．、Ａｒｅｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．、Ｄｕｒｂｉｎ，Ｊ．、Ｄａｖｉｄ，Ｒ．Ｇ．、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：２２７１〜２２７４；Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．、Ｔａｔｅｎｏ，Ｍ．、Ｗｏｏｎ，Ｐ．Ｙ．、Ｆｒｅｎｇｅｎ，Ｅ．、Ｍａｍｍｏｓｅｒ，Ａ．Ｇ．、Ｃａｔａｎｅｓｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．、およびｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．Ｊ．、２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１０：１１６〜１２８；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｍａｒｒａ，Ｍ．、Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．、Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｃｈｉｎｗａｌｌａ，Ａ．、Ｗａｌｌｉｓ，Ｊ．、Ｓｅｋｈｏｎ，Ｍ．、Ｗｙｌｉｅ，Ｋ．、Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｋ．、２００１；Ｎａｔｕｒｅ、４０９：９３４〜９４１）。
【００９３】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２））およびＰ１−人工染色体（ＰＡＣ）（Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、６：８４ ８９（１９９４））の開発は、物理的なマップ作成プロジェクトおよびゲノム配列決定を大きく援助している。ＢＡＣおよびＰＡＣは、ミクログラム単位の量のベクターを調製することの容易さを含めた、大きなＤＮＡ挿入物をクローニングすることに関して酵母人工染色体（ＹＡＣ）を超える多くの利点を有する（Ｍｏｎａｃｏ，Ａ．Ｐ．、およびＬａｒｉｎ，Ｚ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２：２８０ ２８６（１９９４））。
【００９４】
ＢＡＣおよびＰＡＣからの遺伝子発現は、細胞培養系（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１ １３１４（２０００年１２月）；Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｓ．Ｈ．他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１６００ １６０５（２０００）；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、８：４０４ ４１２（１９９８））およびトランスジェニック動物モデル（Ａｎｔｏｃｈ，Ｍ．Ｐ．他、Ｃｅｌｌ、８９：６５５ ６６７（１９９７）；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｗ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、２２：３２７ ３３５（１９９９））において実証されている。Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ他は、ＢＡＣおよびＥＢＶエピソーム技術の融合に基づいて、ヒト細胞における遺伝子発現のための大きな挿入シャトルベクターを開発している（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１ １３１４（２０００年１２月）；Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：１６７４ １６８２（１９９９））。このベクターは、ＥＢＶに基づいたエピソームとしてヒト細胞内に保持されるゲノムＤＮＡ導入遺伝子によって、細胞培養表現型を補完するために使用された（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：１３１１〜１３１４（２０００年１２月））。構築体の染色体外維持は、構築体の組込みでしばしば見られるＤＮＡ再配置を防止した。Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ、上記によって記載されているベクターは、ＥＢＶの特長にのみ基づいている。
【００９５】
Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｅ．Ｍ．他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９：１８６３ １８７３（１９９８年９月）およびＶｏｓ他の国際公開公報ＷＯ００／１２６９３号は、大きなゲノム挿入物を既存のＢＡＣまたはＰＡＣライブラリからヒト細胞へとシャトルするためのベクター系に関する。この系は、ヒト細胞内での複製のために、ＢＡＣと同様にＦに基づいた複製系およびＥＢＶのｏｒｉＰを含有する、ハイブリッドＢＡＣ−ＨＡＥＣ（ヒト人工エピソーム染色体）を利用する。ヒトβ−グロビン遺伝子（１８５ｋｂ）の転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された。
【００９６】
Ｈｅｉｎｔｚ他の米国特許第６，１４３，５６６号は、標的化したＢＡＣ修飾に関する。この特許は、クローニングベクター内に含有される特定の遺伝子中に欠失、置換、および／または点突然変異を生じることを含めた、組換え欠乏宿主細胞内の独立した起源に基づくクローニングベクター（具体的な一実施形態ではＢＡＣなど）を直接修飾する方法を教示する。修飾されたクローニングベクターを用いて、修飾された異種遺伝子を宿主細胞内に導入し得る。提示する一例では、修飾されたＢＡＣをネズミ対象動物内に挿入し、ｉｎ ｖｉｖｏの異種遺伝子発現が実証された。本発明の方法は、ＲｅｃＡ宿主細胞におけるクローニングベクターと条件的複製シャトルベクターとの相同組換えを含み、条件的複製シャトルベクターは、ＲｅｃＡ様タンパク質をコードする。好ましい実施形態では、ベクターは、温度感受性シャトルベクターｐＳＶ１．ＲｅｃＡとの相同組換えを受けたＢＡＣである。
【００９７】
Ｓｏｓｉｏ他は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主の間でシャトルされ、染色体内に組み込まれることができるＢＡＣを記載している。彼らは、部位特異的組込みのための遺伝子カセットを宿主の染色体内に取り込ませることによって宿主内に安定して維持することができるＢＡＣの誘導体の構築を提案している。具体的には、彼らは、φＣ３１−ａｔｔＢ−ｉｎｔ系およびチオストレプトンに対する耐性を与えるためにｔｓｒを用いた。（Ｓｏｓｉｏ他（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：３４３〜３４５）。しかし、ベクターをφＣ３１−ａｔｔＢ部位内に組み込むことは、抗生物質の産生に有害な影響が与えられる場合があることが報告されている。（Ｂａｌｔｚ他（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３）。これらの報告されている抗生物質の合成の減少は、挿入による突然変異誘発または偽ａｔｔＢ部位内への組込みまたは何らかの他の因子が原因であり得る。
【００９８】
本発明は、φＢＴ１−ａｔｔＢ組込み系を使用することで本明細書中に記載のベクターをレシピエント細胞の染色体内へ部位特異的に組み込み、それにより、φＣ３１−ａｔｔＢ−ｉｎｔ系に関連する有害な影響をすべて排除することを提供する。この組込み部位は、Ｇｒｅｇｏｒｙ他によって記載されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ他（２００３）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７：５３２０〜５３２３）。
【００９９】
さらに、ＢＡＣベクターを使用する主な利点は、非常に大きなＤＮＡ断片をクローニングおよび伝達するため、ならびにクローンの安定性のためであるが、ＤＮＡの回収量は非常に低い。（Ｗｉｌｄ他（２００２）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：１４３４〜１４４４）。本発明は、２つの複製起点、すなわちｏｒｉ２およびｏｒｉＶをベクター内に取り込んでおり、したがって本発明のクローニングしたＤＮＡの全収率が向上する。
【０１００】
明らかに、大容量ＤＮＡクローニングベクター内のＤＮＡ挿入物（特に大きなＤＮＡ挿入物）をより容易に細胞に伝達できるように、例えばＢＡＣおよびＰＡＣなどの大容量ＤＮＡクローニングベクターの遺伝子送達系を、単純化および増強する必要性が当分野で存在する。より詳細には、大きなＤＮＡ断片、例えば、遺伝子クラスターの全体または一部分を、１つの原核生物から放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）へとクローニングおよび伝達する能力を最適化する必要性が存在する。
【０１０１】
上述のように、クローニングおよび伝達ビヒクルのレパートリーを拡大するため、ならびに一部の株においてφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避するために（Ｂａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：７６〜８３）、本出願の発明者らは、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を用いることによって、新規の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルＢＡＣベクター系を開発した。φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系に基づく組込みベクターは、広い宿主範囲を持つだけでなく、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系に基づくベクターとも適合性を有し、したがって、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の分子遺伝学を研究するという追加の選択肢を与えることが報告されている。
【０１０２】
シャトルベクターｐＳＢＡＣを、最初に、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のφＢＴ１付着部位内に部位特異的組換えによって導入した。ａｔｔＢ部位で隣接する様々な大きさの領域は、プラスミドレスキュー戦略によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に容易にクローニングできる。さらに、この方法を用いてアクチノロージン遺伝子クラスター全体をクローニングし、続いて異種宿主内で発現させた。
【０１０３】
ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）の二次代謝物の生合成遺伝子クラスターのクローニング、伝達および異種発現を容易にするために、多目的の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトル細菌人工染色体ベクター、ｐＳＢＡＣを構築した。このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、クローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）ゲノム内にファージφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。このベクターを用いたプラスミドレスキュー方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、二次代謝物の生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングするプロセスを加速させるために開発されている。その後、クローニングしたＤＮＡを、推定上の二次代謝物の遺伝子クラスターの配列決定または異種発現に使用することができる。応用の一例として、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のアクチノロージン遺伝子クラスター（ａｃｔ）は、このベクターによる単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内でのレスキューが成功し、続いて、ａｃｔ遺伝子クラスターを欠失させた突然変異したエス・リビディアンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄｉａｎｓ）株内に伝達した。アクチノロージンの産生の修復により、クローニングしたａｃｔ遺伝子クラスターの発現の成功が実証された。
【０１０４】
ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、新規ＢＡＣベクターを使用してストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｔｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）から大きなＤＮＡ断片をクローニングするための、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を開発した。最初に、目的の遺伝子に対する一片の相同配列を有するＢＡＣベクターを目的の株内に接合した。相同組換えにより、ベクターが標的として座位内に挿入されることがもたらされる。その後、接合完了体のゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素で消化し、その後、環状化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換させた。元のベクター内に複製起点（ｏｒｉ）が存在いるためにレスキューしたプラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で複製し、ベクター内に含まれる耐性選択マーカーのために形質転換体を寒天プレート上で選択した。様々なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）中の相同組換え機構、およびＢＡＣベクターの大きなＤＮＡ断片をクローニングする独特な能力を利用することによって、この方法では、部位特異的な挿入部位に隣接する顕著な長さの配列を破壊された株から回収することができる。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。
【０１０５】
本方法は、ＢＡＣまたはＰＡＣなどの大容量クローニングベクターを利用する。ＢＡＣまたはＰＡＣが特に好ましい大容量クローニングベクターであるが、当業者に知られている他の大容量クローニングベクターも、本発明で使用することができる。これらには、例えば、コスミド（Ｅｖａｎｓ他、Ｇｅｎｅ、７９：９ ２０（１９８９））、酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、分子クローニング：実験室の手引き（Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：１２５７ １２５９（１９９７）、ヒト人工染色体（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：３４５ ３５４（１９９７））、またはウイルスに基づいたベクター、例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、もしくはバキュロウイルスなどが含まれる。
【０１０６】
本明細書中で使用する用語「ＢＡＣ」（細菌人工染色体）とは、大きなゲノムＤＮＡ断片、典型的には４００ｋｂまでのものをその中に挿入することができる細菌の染色体に由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。ＢＡＣは、単一コピーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦプラスミドに基づいており、＞３００ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ、ならびにバキュロウイルスおよびネズミサイトメガロウイルスのものを含めた大きなＤＮＡウイルスのゲノムを安定に維持することが以前に実証されている（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８７９４ ８７９７（１９９２）；Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６ ４５７９（１９９３）；Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１４７５９ １４７６３（１９９７）。
【０１０７】
本明細書中で使用する用語「ＰＡＣ」とは、大きなゲノムＤＮＡ断片、典型的には３００ｋｂまでをその中に挿入することができる、Ｐ１バクテリオファージに由来するクローニングおよび配列決定ベクターを意味することを意図する。ＰＡＣは、Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｐ．Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：８４〜８９（１９９４）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７：１０３ １０７（１９９０）に記載されている。
【０１０８】
ＢＡＣまたはＰＡＣライブラリ、特にヒトゲノムプロジェクトの結果としてヒトゲノムＤＮＡを含有するものは、当業者が容易に入手可能である（例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：８３９（１９９７））を参照。
【０１０９】
一般に、特に上記例では、宿主微生物を、構成要素ポリヌクレオチドを保有するベクターで形質転換させることは、慣用技術を用いて実施する。一実施形態では、ベクターは、２つの生物間の接合によって、宿主またはレシピエント細胞へと伝達する。一実施形態では、ベクターは、形質移入方法によって宿主細胞またはレシピエント細胞へと伝達し得る。本明細書中で使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＢ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、電気穿孔、光穿孔、機械的注入、微粒子銃注入などを含めた、外来性核酸配列（例えばＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための、様々な当分野で認識された技術を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換または形質移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）、および同様の実験室の手引き中に見つかる。
【０１１０】
選択マーカー
一実施形態では、シャトルベクターには、目的の核酸を含有する細胞中で機能的な「選択マーカー」または「選択可能マーカー」が含まれる。この「選択マーカー」は、発現された際、宿主細胞が目的の核酸を含有しない細胞から区別されることを可能にすることができる。例えば、用語「選択マーカー」または「選択可能マーカー」とは、薬物を、形質転換体のクローニングおよび同定を補助するマーカーとして使用または含めることをいい、例えば、アプラマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択可能または選択マーカーである。したがって、本発明の核酸構築体を含有する細胞は、マーカーをベクター内に含めることによって同定し得る。そのようなマーカーは細胞に識別可能な変化を与え、ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能となる。一般に、選択可能マーカーとは、選択を可能にする特性を与えるものである。陽性の選択可能マーカーとは、マーカーの存在がその選択を可能にするものである一方で、陰性の選択可能マーカーとは、その存在がその選択を阻止するものである。陽性選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。本実施形態では、陽性選択マーカーとは、遺伝子が存在しない場合に細胞にとって致死的となる化合物に対する耐性を与える遺伝子である。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は抗生物質の存在下で生存する一方で、その遺伝子を欠く細胞は存在しない。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在は、テトラサイクリンの存在下で陽性に選択することができ、フザリン酸の存在下において陰性に選択することができる。適切な抗生物質耐性遺伝子には、それだけには限定されないが、アンピシリン−耐性遺伝子、ネオマイシン−耐性遺伝子、ブラストサイジン−耐性遺伝子、ハイグロマイシン−耐性遺伝子、プロマイシン−耐性遺伝子、クロラムフェニコール−耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。特定の態様では、陰性選択マーカーは、特定の基質の存在下で標的細胞に対して致死的な遺伝子である。例えば、ｔｈｙＡ遺伝子は、トリメトプリムの存在下で致死的である。したがって、トリメトプリムの存在下で成長する細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子を発現しない。陰性選択マーカーには、それだけには限定されないが、ｔｈｙＡ、ｓａｃＢ、ｇｎｄ、ｇａｐＣ、ｚｗＪ、ｔａｌＡ、ｔａｉＢ、ｐｐｃ、ｇｄｈＡ、ｐｇｉ、Ｊｂｐ、ｐｙｋＡ、ｃｉｔ、ａｃｓ、ｅｄｄ、ｉｃｄＡ、ｇｒｏＥＬ、ｓｅｃＡなどの遺伝子が含まれる。一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子は、アプラマイシン耐性を提供する遺伝子である。（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ４１４６７０参照）
【０１１１】
別の実施形態では、選択マーカー遺伝子は検出遺伝子であり得る。検出遺伝子は、直接または間接的な標識として、すなわち、細胞を分別するために、すなわち、ＦＡＣＳによる細胞濃縮のために使用することができるタンパク質をコードする。本実施形態では、選択可能マーカー遺伝子自体のタンパク質産物が、選択可能遺伝子を発現する細胞を区別するために役割を果たすことができる。本実施形態では、適切な選択可能遺伝子には、すべて市販されている、すなわち、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼをコードするものが含まれる。
【０１１２】
あるいは、選択可能マーカー遺伝子は、選択の基準として使用することができる標識と結合するタンパク質をコードする。すなわち、選択可能マーカー遺伝子は、間接標識または検出遺伝子として役割を果たす。例えば、視覚的に検出可能なマーカーも本発明における使用に適しており、陽性および陰性によって選択するか、かつ／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）もしくはマイクロフルイディクスなどの技術を用いてスクリーニングし得る。検出可能なマーカーの例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーなどが含まれる。適切な蛍光タンパク質の例には、それだけには限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリンなどが含まれる。適切な生物発光マーカーの例には、それだけには限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれる。視覚的に検出可能なシグナルを有する適切な酵素系の例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれる。
【０１１３】
本発明の別の態様は、上述のｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片をストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を提供する。この方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路を大きく促進する。第１のステップとして、最初に、ｐＳＢＡＣベクターを、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。いくつかのアプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、そのうちの１つからのゲノムＤＮＡを単離し、ＳｃａＩで部分的に消化した。消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供し、４０〜５０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を回収し、自己ライゲーションし、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）内に形質転換させた。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は例示のためのみであり、本発明の条件および範囲に関して完全に決定的であることを主張しないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間など）を与えた場合、指定した範囲の上および下の条件をどちらも、一般には利便性が下がるが使用できることを理解されたい。別段に指定しない限りは、本明細書中で言及するすべての部およびパーセントは重量に基づき、すべての温度は摂氏で表す。
【０１１５】
（実施例１）
ｐＳＢＡＣベクターの構築およびプラスミドレスキュー手順の開発
材料および方法
細菌株およびプラスミド：
ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）株Ｍ１４５およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４を本研究で用いた。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−４４１（ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６：１０６〜１１０）を、アクチノロージン遺伝子クラスターを発現させる異種宿主として用いた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＥＰＩ３００（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を、ｐＳＢＡＣベクターおよびそれに由来する構築体のクローニングおよび増幅に用いた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＮｏｖａＢｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を他のクローニング目的のために使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７−１を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）に導入するための接合に使用した。プラスミドｐＨＬＷ３は、ｏｒｉＴおよびアプラマイシン耐性遺伝子を有する、ＢＡＣ（細菌人工染色体）に由来するベクターであった。ｐＳＢＡＣはｐＨＬＷ３に由来し、φＢＴ１のａｔｔＰ−ｉｎｔカセットが導入されている。プラスミドｐＨＬＷ２１、２２、２３、および２４は、ｐＳＢＡＣをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のゲノムのφＢＴ１付着部位内への接合に由来する株からレスキューしたＢＡＣクローンである。プラスミドｐＨＬＷ３５は、アクチノロージン遺伝子クラスターの３’末端に対応するプライマー組を用いて、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）から増幅した２ｋｂのＰＣＲ産物が挿入された、ｐＨＬＷ３に由来する。プラスミドｐＨＬＷ３８、３９、４０、４１、および４２は、ｐＨＬＷ３５のエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスター内への接合に由来する株からレスキューしたＢＡＣクローンである。最後に、プラスミドｐＨＬＷ７６および７８は、φＢＴ１のａｔｔＢ−ｉｎｔカセットをそれぞれプラスミドｐＨＬＷ４１および４２内に付加することによって誘導した。
【０１１６】
培養培地および成長条件：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のどちらかを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で成長させた。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株を、２８℃で、ＭＹＭ、Ｒ２ＹＥまたはＲ４培地中で成長させた（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｂｂ、Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ、Ｋ．Ｆ．，Ｃｈａｔｅｒ、およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ノッティンガム大学、英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）。接合に使用したＲ６培地には、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびナリジクス酸（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１１７】
分子遺伝学的技術：
ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖｇｅｎ）を、製造者の指示に従ったＰＣＲ増幅に使用した。既に記載した手順を用いて、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のゲノムＤＮＡを単離した（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｓｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）。Ｚａｐｐｙプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＢＡＣＭＡＸ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて大きな挿入物を有するＢＡＣクローンを単離した。プラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への形質転換は、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞またはＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞のどちらかを用いて行った。意図するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１をドナー株として用いて、接合ベクターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４またはＫ４−１１４内に導入した。パルスフィールド電気泳動を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールド電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。手短に述べると、消化したＤＮＡを０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で分離した。以下のパラメータを用いてゲルを流した：１秒間の初期スイッチ時間、６秒間の最終スイッチ時間、１２０°の開先角度および１６時間の実行時間、１４℃、６ボルト／ｃｍの条件下。
【０１１８】
ｐＳＢＡＣベクターの構築
ｐＳＢＡＣベクターの主鎖を、プラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ（配列番号８参照）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）から、プライマー組ｐＣＣ１ＢＡＣＦｏｒ：５’−ＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧ−３’（配列番号９）およびｐＣＣ１ＢＡＣＲｅｖ：５’−ＧＧＴＴＡＣＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＡＣ−３’（配列番号１０）を用いて増幅した。伝達起点領域（ｏｒｉＴ）およびアプラマイシン耐性遺伝子を、複数のクローニング部位と一緒に、プラスミドｐＢＷＡ２（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｓｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）から、プライマー組：ｐＢ１：５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１１）およびｐＢ２：５’−ＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）を用いて増幅した。第１のプライマー組から増幅された６．５ｋｂのＰＣＲ産物および第２のプライマー組から増幅された４ｋｂのＰＣＲ産物を一緒にライゲーションして、プラスミドｐＨＬＷ３を生成した。その後、φＢＴ１のａｔｔＰ−ｉｎｔ含有する２ｋｂのＤＮＡ断片を合成し（Ｃｅｌｔｅｋ−ｇｅｎｅｓ、テネシー州Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）、ｐＨＬＷ３の独特のＳｃａＩ部位内に導入して、最終構築体ｐＳＢＡＣが得られた。
【０１１９】
プラスミドレスキュー手順
Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）のエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内への接合から得られた接合完了体を、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＭＹＭ液体培地中で成長させた。ゲノムＤＮＡをＳｃａＩで部分的に消化し、その後、消化したＤＮＡを、パルスフィールド電気泳動を用いて分離した。４０〜６０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を切り出し、ゲルから電気泳動によって電気溶出させた。電気溶出させたＤＮＡを、Ｆａｓｔ−ｌｉｎｋＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏ）を用いて自己ライゲーションした。その後、ライゲーション混合物を、１．８％のグルコースを含む１％のアガロース中で脱塩し、１μｌの最終ライゲーション混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＣ１００コンピテント細胞を電気穿孔した。いくつかの形質転換体をランダムに選択し、プラスミドＤＮＡを単離した。レスキューしたプラスミドの大きさを確認するためにプラスミドＤＮＡを様々な制限酵素で消化し、その一部を配列決定に供した。ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために、遺伝子クラスターの３’末端に対応する２ｋｂのＰＣＲ産物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ９３９１２２．１のゲノム配列位置：１７０３１１〜１７２２８０に対応）を、プライマー組Ｓｃｒｅｓ１：５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１３）（ＥｃｏＲＩ部位に下線を引いた）およびＳｃｒｅｓ２：５’−ＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＣ−３’（配列番号１４）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いた）を用いて増幅した。
【０１２０】
この２ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、ｐＨＬＷ３の対応する部位とライゲーションした。その後、生じたプラスミドｐＨＬＷ３５を接合によってエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に導入した。プラスミドのＡＣＴ遺伝子クラスター内への特異的組込みを、いくつかの接合完了体においてＰＣＲ分析によって最初に確認した。その後、上述の手順を用いてａｃｔ遺伝子クラスターをレスキューした。これらのクローンからのａｃｔ遺伝子全体の存在は、プライマー組ｐＡＣＴ１：５’−ＣＡＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５）およびｐＡＣＴ２：５’−ＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）を用いたＰＣＲ分析によって確認され、ａｃｔ遺伝子クラスターの最先端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ９３９１２２のゲノム配列位置：１４７００１〜１４７６４０に対応）に対応する。
【０１２１】
抽出物の調製および質量分析：
様々な株におけるアクチオノロージンの産生を分析するために、適切な株を１０ｍｌのＲ２ＹＥ中、２８℃で、５日間成長させた。１ｍｌの培養物をそれぞれの試料から採取し、等体積の酢酸エチル−メタノール（９５：５［体積：体積］）で抽出した。その後、抽出物を高速真空機によって乾燥させ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析のために２００μｌのメタノールに再懸濁させた。分析は、ＬＣＱ Ｄｅｃａ質量分析装置と接続したＡｇｉｌｅｎｔ１１００システムで実施した。試料は、Ｈ２Ｏ／０．０２５％のギ酸中の５％から９５％のＭｅＣＮ／０．０２５％のギ酸を用いて、１５分間かけて、ＹＭＣ ＯＤＳ Ｓ−３カラム（２．０×１００ｍｍ）上でクロマトグラフィーを行った。
【０１２２】
結果：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）ＢＡＣベクターｐＳＢＡＣの構築
大きなＤＮＡ断片のクローニングを容易にするために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）接合ＢＡＣベクター、ｐＳＢＡＣ（図１）を構築し、続いて、これらの断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達した。このベクターは、２つの複製起点（単一コピーの複製の開始のためのｏｒｉ２および高コピーの複製の開始のためのｏｒｉＶ）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦ因子に基づいた分配系（ＰａｒＡ、ＰａｒＢおよびＰａｒＣ）を有する、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターｐＣＣ１ＢＡＣの主鎖を含有する（Ｗｉｌｄ，Ｊ．、Ｈｒａｄｅｃｎａ，Ｚ．、およびＳｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ．、２００２、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：１４３４〜１４４４）。ｐＳＢＡＣベクターはまた、ベクターが１つの細菌から別の細菌へと伝達されることを許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）も含有し、この機能は、核酸が直接の細胞間接触を介して１つの原核細胞から別の原核細胞へと伝達されることをもたらす、接合に重要である；これはまた、レシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内へのベクターの部位特異的組込みを許容する部位特異的な組換え系をコードする、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する。これらの構成要素すべてにおいて、このベクターは、大きなＤＮＡ断片を抱えること、およびクローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へと伝達すること、ならびにクローニングしたＤＮＡをストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）ゲノム内にφＢＴ１ ａｔｔＢ座位で組み込むことが可能である。φＢＴ１は、幅広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なる組込み部位を有するため、このベクターは、よく利用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なるが、それでも適合性のある組込み系を表す。このベクター系の構築は本発明者らの利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大し、φＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系によって引き起こされる潜在的な有害な影響を回避する。二次代謝物の産生を担っている遺伝子は大きさが１００ｋｂの規模であることができるクラスター内に位置するため、このベクターは、これらの遺伝子クラスターをクローニングするため、ならびに、これらの大きな遺伝子セグメントをベクターが自己複製される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と染色体内のφＢＴ１ ａｔｔＢ座位内に部位特異的に組み込まれる様々なストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主との間でシャフリングするための、重要なビヒクルを提供する。
【０１２３】
ｐＳＢＡＣベクターを用いたプラスミドレスキュー方法の開発
プラスミドレスキュー方法が、様々な生物中の挿入したＤＮＡ片に隣接する染色体ＤＮＡを単離するために使用されている（Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，Ｙ．、およびＤｕｂｎａｕ，Ｄ．、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１５４：１０７７〜１０８７；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｕ．、Ｐｌａｔｚｅｒ，Ｍ．、およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍ．、１９８４、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、１９３：５１２〜５１９．；ＭｃＭａｈｏｎ Ｔ．Ｌ．、Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋａ，Ｚ．、Ｂａｒｔｈ，Ｃ．、Ｆｒａｓｅｒ，Ｂ．Ｄ．、Ｐｏｎｔｅｓ，Ｌ．、およびＦｉｓｈｅｒ Ｐ．Ｒ．、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．、２４：４０９６〜４０９７）。しかし、この目的のために使用するベクターのクローニング容量が限定されているため、この方法は主に、外来性ＤＮＡが挿入した座位の隣接領域のクローニングおよび同定に使用された。ＢＡＣベクターが大きなＤＮＡ断片をクローニングする能力を利用して、ｐＳＢＡＣベクターを用いて大きなＤＮＡ断片をストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）からクローニングする、プラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法を開発した。この方法の実装が成功すれば、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの高度な作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片のクローニング、特に、微生物の二次代謝物の生合成経路が大きく促進される。原理を証明するための第１のステップとして、最初に、ｐＳＢＡＣベクターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＳＢＡＣ）からの接合によって伝達した。いくつかのアプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、そのうちの１つからのゲノムＤＮＡを単離し、ＳｃａＩで部分的に消化した。消化したＤＮＡをパルスフィールド電気泳動に供し、４０〜５０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を回収し、自己ライゲーションし、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）内に形質転換させた。ＢＡＣ ＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限酵素消化およびパルスフィールド電気泳動で分析した（図２）。図２ａは、ｐＳＢＡＣベクターを用いたプラスミドレスキューに使用した戦略の概要を示す。図２ｂは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した４つのレスキューしたクローンのパルスフィールドゲル電気泳動分析の結果を示す。（レーン１：パルスマーカー；レーン２〜５：レスキューしたクローンｐＨＬＷ２１、２２、２３および２４）。Ａｐｒａ：アプラマイシン耐性マーカー。結果により、φＢＴ１ ａｔｔＢ部位に隣接した４０〜５０ｋｂのＤＮＡ断片を、この方法を用いてルーチン的にクローニングできることが実証された。
【０１２４】
プラスミドレスキューによるアクチノロージン遺伝子クラスターのクローニングおよび代理宿主におけるこの遺伝子クラスターの異種発現
ｐＳＢＡＣを用いて開発したプラスミドレスキュー方法の応用性をさらに拡大するために、また、この方法が一般的な応用の潜在性を有し、目的の大きな遺伝子クラスターをクローニングするために使用できることを証明するために、十分に特徴づけられたアクチノロージン遺伝子クラスターを、さらなるクローニングおよび発現研究のために選択した。図３ａは、ａｃｔ遺伝子クラスターをエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からレスキューするために使用した戦略の模式図を示し、３ｂは、レスキューしたクローンの分析を示す。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロージン遺伝子クラスターの末端に対応する２ｋｂのＤＮＡ断片を、プライマー組Ｓｃｒｅｓ１およびＳｃｒｅｓ２を用いて増幅し、その後、ａｔｔＰ−ｉｎｔ座位を有さないという点でｐＳＢＡＣとは異なるベクターｐＨＬＷ３内にクローニングした。その後、生じた構築体をエス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）内に形質転換させ、相同組換えにより単一のクロスオーバーがもたらされ、構築体が相同領域内に部位特異的に挿入された（図３ａ）。ＰＣＲ分析によって接合完了体の一部への部位特異的組込みを確認した後（データ示さず）、これらの株のうちの１つのゲノムＤＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡをより小さな小片へと機械的に剪断した。その後、生じたＤＮＡをパルスフィールド電気泳動によって分離し、４０〜５０ｋｂのＤＮＡ画分を回収した。図３ｂは、ａｃｔ遺伝子クラスター全体を潜在的に含有する、レスキューしたクローンのうちの５つのパルスフィールドゲル電気泳動分析の結果を示す（レーン１：パルスマーカー；レーン２〜７：ＥｃｏＲＩで消化したクローンｐＨＬＷ３８、３９、４０、４１および４２；レーン８〜１３、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した上記クローン；レーン１４：１ｋｂのＤＮＡラダー）。回収したＤＮＡを、Ｅｎｄ−ｉｔ（商標）ＤＮＡ末端修復キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて平滑末端化し、その後、自己ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞内に形質転換させた。数々の形質転換体をＰＣＲ分析に供して、アクチノロージン遺伝子クラスターの先頭および終末をどちらも含有するクローンを選択した。確認されたクローンは、遺伝子クラスターの両末端が存在するため、アクチノロージン遺伝子クラスター全体を潜在的に含有するクローンであった。その後、続く遺伝子クラスターの特異的ａｔｔＢ付着座位内への組込みを容易にするために、φＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ断片を、レスキューしたクローンのＡｖｒＩＩ部位内に導入した。最後に、アクチノロージン遺伝子クラスター全体を有するクローンを、アクチノロージン遺伝子クラスターを事前に欠失させたエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株Ｋ４−１１４内に伝達した。接合完了体を、アプラマイシンおよびナリジクス酸を添加したＲ６プレートから選択し、アパラマイシンおよびナリジクス酸を添加したＭＹＭ寒天プレート上に再度画線した。２８℃で５日間インキュベーションした後、画線したコロニーのほとんどが赤−青色を示し、アクチノロージン遺伝子クラスターの新しい宿主内への導入および発現が成功したことが示された（データ示さず）。Ｒ２ＹＥ寒天プレートまたは液体培地のどちらかにおける、代表的なクローン成長による青色色素の産生を検査することによって、アクチノロージンの産生をさらに特徴づけた。（Ｂｙｓｔｒｙｋｈ，Ｌ．Ｖ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．、Ｈｅｒｒｅｍａ，Ｊ．Ｋ．、Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．、およびＤｉｊｋｈｕｉｚｅｎ，Ｌ．、１９９６、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７８：２２３８〜２２４４；Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｂ．、およびＢｉｂｂ，Ｍ．、１９９６、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２１：３８５〜３９６）。最後に、ＬＣ／ＭＳ分析により、このクローンにおけるアクチノロージンの産生が確認された（図４）。アクチノロージンの産生の修復により、クローニングしたアクチノロージン遺伝子クラスターの異種宿主中での発現が成功したことが実証された。興味深いことに、Ｋ４−１１４の親株であるエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４は、通常の成長条件下でアクチノロージンを産生しないため（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．、Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．およびＣｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．、１９８６、二次代謝物形成の制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ，Ｈ．他（編）、ＶＣＨ、ドイツＷｅｉｎｈｅｉｍ、ページ２３〜３３）、これらの接合完了体におけるアクチノロージンの検出は、接合に使用したレスキューしたプラスミドクローンが、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるアクチノロージンの産生を活性化するための調節要素を含有していることを示唆しており、この結果は、エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）中のａｃｔ遺伝子クラスターのａｃｔＩＩ領域が、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）においてａｃｔ遺伝子クラスターの発現を誘発できる陽性調節配列を含有することを示す以前の研究と矛盾していない（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．、Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．およびＭａｌｐａｒｔｉｄａ，Ｆ．、１９９１．Ｃｅｌｌ、６６：７６９〜７８０）。
【０１２５】
新規の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャトルベクター、ｐＳＢＡＣを構築し、このベクターは、小さな、中程度または大きな遺伝子クラスターを直接クローニングすること、クローニングしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から様々な土壌細菌ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）株へと伝達すること、およびクローニングしたＤＮＡをレシピエントの染色体のφＢＴ１ ａｔｔＢ部位へと組み込むことに使用することができる。このベクターは、広く使用されているφＣ３１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ系とは異なるが、それでも適合性を有する組込み系を表し、利用可能な組込み接合ベクターのレパートリーを拡大する。本発明で開発したプラスミド（ＢＡＣ）レスキュー方法は、コスミドまたはＢＡＣのライブラリの作製およびスクリーニングなしに、大きなＤＮＡ断片を、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の遺伝子破壊形質転換体から直接クローニングするために使用することができる。これは、ＤＮＡ取扱いのいくつかの単純なステップのみを含み、高品質なＢＡＣライブラリの構築に必須であるゲノムＤＮＡの完全性を傷つける手順を、最小限にする。
【０１２６】
（実施例２）
ｐＳＢＡＣを用いた、メリダマイシン生合成遺伝子クラスターの迅速なクローニングおよび異種発現
メリダマイシンおよびその天然に存在する類似体３−ノルメリダマイシンは、ドーパミン作動性ニューロン中で強力な神経保護活性を有する、非免疫抑制性のＦＫＢＰ１２結合大環状ポリケチドである。メリダマイシンの生合成遺伝子クラスターは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８からクローニングされており、いくつかの重複するコスミド上に見つかっている（Ｈｅ他、Ｇｅｎｅ、（２００６）８月、１；３７７：１０９〜１８）。遺伝子クラスターの全体は約９０ｋｂまでであり、合計１５個のＩ型ポリケチド合成酵素モジュール、１個のＮＲＰＳモジュール、１個のチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼならびにいくつかの調節および輸送タンパク質をコードする大きな転写単位を含有する。この巨大なポリケチド合成酵素複合体は、ＭｅｒＡ、ＭｅｒＢおよびＭｅｒＣと呼ばれる３つの大きなサブユニットを含む。
【０１２７】
本発明では、異種宿主中での伝達および発現を容易にするために、ｍｅｒ遺伝子クラスターをｐＳＢＡＣベクター内にクローニングした。より詳細には、ｐＳＢＡＣを使用することによって、メリダマイシン生合成遺伝子クラスター全体（約９７ｋｂまで）を単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内にクローニングし、その後、異種発現のためにストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）内に伝達した。元のｍｅｒプロモーターが異種宿主中で遺伝子クラスター全体の転写を駆動することができたが、メリダマイシンの産生は、元のプロモーターがｅｒｍＥ＊プロモーターで置き換えられた場合にのみ、質量分析で検出可能であった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍｅｒ遺伝子クラスターのプロモーター効率および転写レベルが、新しい宿主におけるメリダマイシンおよびその類似体の産生に影響を与える最も重要な因子であることが明らかとなった。エチルマロニルＣｏＡの前駆体の供給も、メリダマイシンおよびその類似体の産生を増大させた。
【０１２８】
材料および方法
細菌株およびプラスミド
本研究中で使用した様々な株およびプラスミドを、以下の表１に要約する。
【０１２９】
【表１−１】
【０１３０】
【表１−２】
【０１３１】
培養培地および成長条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）のどちらかを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で成長させた。エス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株を、２８℃で、ＭＹＭ、Ｒ２ＹＥ（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．、Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．、およびＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．（編）、２０００、実用的なストレプトマイセスの遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、英国Ｎｏｒｗｉｃｈ）またはＦＫＡ培地（Ｌｅａｆ，Ｔ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ，Ｍ．、Ｄｅｓａｉ，Ｒ．、Ｒｅｇｅｎｔｉｎ，Ｒ．、Ｗｏｏ，Ｅ．、Ａｓｈｌｅｙ，Ｇ．、およびＬｉｃａｒｉ，Ｐ．、２００２、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７７：１１２２〜１１２６）中で成長させた。接合に使用したＲ６培地（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）には、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびナリジクス酸（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１３２】
ＤＮＡ操作
ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を、製造者の指示に従ったＰＣＲ増幅に使用した。既に記載した手順を用いて、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のゲノムＤＮＡを単離した（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）。Ｚａｐｐｙプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州Ｏｒａｎｇｅ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＢＡＣＭＡＸ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いて大きな挿入物を有するＢＡＣクローンを単離した。プラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への形質転換は、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞またはＥＰＩ３００（商標）電気コンピテント細胞のどちらかを用いて行った。意図するプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１またはＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）をドナー株として用いて、接合ベクターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４またはＫ４−１１４内に導入した。パルスフィールド電気泳動を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールド電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。手短に述べると、消化したＤＮＡを０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で分離した。以下のパラメータを用いてゲルを流した：１秒間の初期スイッチ時間、６秒間の最終スイッチ時間、１２０°の開先角度および１６時間の実行時間、１４℃、６ボルト／ｃｍの条件下。
【０１３３】
ｐＳＢＡＣを用いたメリダマイシン生合成遺伝子クラスターの迅速なクローニング
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８を、ＴＳＢＣ液体培地中、７２時間、２８℃で成長させた。菌糸体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ゲノムＤＮＡプラグの調製は、ＣＨＥＦゲノムＤＮＡプラグキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の取扱い説明書に従って実施した。手短に述べると、菌糸体ペレットを細胞懸濁緩衝液に再懸濁させ、その後、プラグカビを用いてＣｌｅａｎＣｕｔアガロースに包埋した。その後、固化したアガロースプラグをリゾチームで処理し、続いてプロテイナーゼＫで処理した。プラグを１×洗浄バッファーで２回洗浄した後、１ｍＭのＰＭＳＦで処理して、残留プロテイナーゼＫを失活化した。最後に、プラグを十分に洗浄し、使用時まで１×洗浄バッファー中に４℃で保管した。ＤＮＡプラグの前処理および制限消化は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他に記載のプロトコルを用いて行った（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．、Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｊ．Ｐ．、Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｗｉｎｇ，Ｒ．Ａ．、およびＰａｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｈ．、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５：１〜１００）。その後、ＤＮＡプラグを刻み、制限酵素ＭｆｅＩによって３７℃で２時間消化した。ＥＤＴＡを最終濃度５０ｍＭまで加えることによって消化反応を停止させた。その後、消化したＤＮＡプラグの小片を、０．５×ＴＢＥランニングバッファー中の１％のパルスフィールドアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のパルスフィールド電気泳動に、以下のパラメータを用いて供した：初期スイッチ時間＝１．０秒間、最終スイッチ時間＝５０．０秒間、実行時間＝１６時間、ボルト／ｃｍ＝６、開先角度＝１２０°、温度＝１４℃。９０〜１１０ｋｂに対応するＤＮＡ画分を切り出し、電気溶出によってゲルから溶出させた。溶出したＤＮＡを沈殿させ、濃縮した後、Ｆａｓｔ−ｌｉｎｋＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏ）を用いてＥｃｏＲＩで消化したｐＳＢＡＣベクターとライゲーションさせた。その後、ライゲーション混合物を、１．８％のグルコースを含有する１％のアガロース中で脱塩し、１μｌの最終ライゲーション混合物を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００コンピテント細胞を電気穿孔した。ｍｅｒ遺伝子クラスターに隣接する配列に由来するＤＮＡプローブを用いて約３００個の組換えコロニーをスクリーニングし、メリダマイシン生合成遺伝子クラスター全体を含有するｐＨＬＷ３０の同定がもたらされた。
【０１３４】
ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析
様々なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）株からの全ＲＮＡを、Ｖａｎ Ｄｅｓｓｅｌ、Ｗ．Ｖ（２００４）（Ｖａｎ Ｄｅｓｓｅｌ，Ｗ．、Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ，Ｌ．、Ｇｅｕｋｅｎｓ，Ｎ．、Ｌａｍｍｅｒｔｙｎ，ＥおよびＡｎｎｅ，Ｊ．、２００４、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５８：１３５〜１３７）によって記載されている方法に変更を加えて用いて、単離した。手短に述べると、７２時間成長させた３ｍｌの培養物を収集し、２倍体積のＲＮＡ保護試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をすぐに加え、室温で５分間静置し、その後、遠心分離して、菌糸体ペレットが得られた。ペレットを１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのリゾチームで１時間、３７℃で処理し、その後、フェノール：クロロホルム（５：１；ｐＨ４．５）で抽出し、２ｍｌのエタノール、２５０μｌの１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）および１００μｌの５ＭのＮａＣｌで沈殿させた。沈殿したＲＮＡを８０％のエタノールで１回洗浄し、乾燥させ、１００ｕｌのＲＮＡ保管緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）に溶解した。ＤＮａｓｅ１消化（Ａｍｂｉｏｎ）によってＤＮＡ汚染を排除し、上記手順を繰り返して再度精製した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー組は、ｍｅｒ遺伝子クラスターの５’末端の増幅のためには、ＲＴ１：５’−ＧＣＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１９）、ＲＴ２：５’−ＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２０）；プライマー１６ｓＦｏｒ：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２１）および１６ｓＲｅｖ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣ ＴＣＡＧ−３’（配列番号２２）を、等量の全ＲＮＡがそれぞれの試料中に存在することを確実にするための内部対照として使用した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、以前に記載した方法に類似であるが（Ｎｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｅ．、Ｂｅｃｋ，Ｃ．、Ｈｏｌｚｍａｙｅｒ，Ｔ．Ａ．、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｗｕｎｄｅｒ，Ｊ．Ｓ．、Ａｕｄｒｕｌｉｓ，Ｉ．Ｌ．、Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｃ．Ｌ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｂ．、Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．ＶおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ｂ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：７１６０〜７１６４）、１ステップのＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を取扱い説明書に従って使用した。ＲＴ−ＰＣＲが増幅の対数期中に実施されることを確実にするために、サイクル数および鋳型の量を注意深く較正した。
【０１３５】
元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターで変更する
元の／ネイティブＭｅｒＰプロモーターすぐ下流に対応する２ｋｂのＰＣＲ産物を、プライマー組Ｐ１：ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＣ（配列番号２３）（ＸｂａＩ部位に下線を引いた）およびＰ２：ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡ（配列番号２４）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いた）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、プラスミドｐＳＥ３４（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ，Ｔ．およびＥｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：４９３〜４９８）内の対応する部位内にクローニングして、プラスミドｐＨＬＷ７０を生成した。このベクターを動員するために、１．２ｋｂのｏｒｉＴ配列を、プラスミドｐＢＷＶ２（Ｍａｇａｒｖｅｙ，Ｎ．Ａ．、Ｈａｌｔｌｉ，Ｂ．、Ｈｅ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、およびＨｕｃｕｌ Ｊ．Ａ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：２１６７〜２１７７）から、プライマー組：ｏｒｉＴＦＯＲ：５’−ＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴＣＧＧＴＧＡ−３’（配列番号２５）およびｏｒｉＴＲＥＶ：５’−ＣＧＣＡＣＧＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２６）を用いて増幅した。１．２ｋｂのＰＣＲ産物を精製し、その５’末端をＴ４ ＰＮＫによってリン酸化した。最終産物をｐＨＬＷ７０の平滑末端化したＢｓｔＢＩ部位内にクローニングし、プラスミドｐＨＬＷ７１を生じた。プラスミドを異種宿主ＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３内に接合した。数々の接合完了体を、プライマー組：ＥｒｍＥ１：５’−ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＧＧ−３’（配列番号２７）；ＥｒｍＥ２：５’−ＣＧＴＴＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＧ ＣＧ−３’（配列番号２８）、およびＥｒｍＥ３：５’−ＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号２９）；ＥｒｍＥ４：５’−ＣＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＣＴＣＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＴ−３’（配列番号３０）を用いたさらなるコロニーＰＣＲ分析について選択して、意図する単一のクロスオーバーを含有する株を選択し、この結果、ｅｒｍＥ＊プロモーターがｍｅｒ遺伝子クラスターの前に配置された。ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定して、部位特異的組込みを確認した。ｅｒｍＥ＊プロモーターの制御下のｍｅｒ遺伝子クラスターを含有する最終株Ｅ３およびＥ７は、それぞれＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３に由来する。
【０１３６】
抽出物の調製および質量分析
１５ｍｌの発酵培養物には、１ｇのＨＰ２０樹脂を加え、２８℃で２時間、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。菌糸体をＨＰ２０と一緒に、遠心分離によって収集した。１０ｍｌの酢酸エチル：メタノール（９５：５）を加え、５分間渦攪拌した。遠心分離して層を分離し、上部の酢酸エチル層を収集し、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて乾燥させ、その後、５００μｌのメタノールに再度溶解した。エレクトロスプレーイオン化を陰イオンモードで用いたＡｇｉｌｅｎｔ１１００システム上の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、メリダマイシンおよびその類似体を検出した。試料を、Ａ中の６５％〜９０％のＢを用いて、１５分間かけて、０．３ｍｌ／ｍｌの流速で、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂｏｘ ＳＢ−Ｃ１８カラムで溶出させた（Ａ＝５ｍＭの酢酸アンモニア；Ｂ＝メタノール）。高分解能の精密質量測定（ＨＲＭＳ）用に試料を調製するために、粗抽出物を、水中の５％から９５％のアセトニトリルの直線勾配を用いて、ＹＭＣ−ＯＤＳ ４．６×１５０ｍｍの５μｍカラムを用いたＬＣＱ質量分析装置上で分画した。メリダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンに対応する画分を収集し、乾燥させ、３０μｌのＭｅＯＨに再懸濁させ、ＨＲＭＳに供した。アクティブ遮蔽された９．４ Ｔｅｓｌａ超伝導磁石（Ｍａｇｎｅｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、英国）、外部Ｂｒｕｋｅｒ Ａｐｏｌｌｏ ＥＳＩ源、およびＳｙｎｒａｄ ５０Ｗ ＣＯ２ ＣＷレーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＡＰＥＸ ＩＩ ＦＴＩＣＲ質量分析装置を用いて、高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）が得られた。この装置およびその性能の詳細な説明は、以前に公開されている（Ｐａｌｍｂｌａｄ，Ｍ．、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｋ．、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，Ｐ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｉａｎｎａｋｏｐｕｌｏｓ，Ａ．Ｅ．、およびＤｅｒｒｉｃｋ，Ｐ．Ｊ．、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、６：２６７〜２７５）。試料の量が非常に限られているため、ナノエレクトロスプレーを用いた。約５μｌの試料を、伝導性コーティングを有するナノエレクトロスプレーチップ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、マサチューセッツ州Ｗｏｂｕｒｎ）に載せ、事前に載せた、同量の１％のギ酸を含有するメタノールと混合した。約−８００Ｖの高電位をナノエレクトロスプレーチップとキャピラリーの間に適用した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳ調整ミックスを用いて質量スペクトルを外部較正した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｍａｓｓソフトウェア（バージョン７）を、予測された質量の計算を含めたデータの獲得および分析に用いた。誤差は、実測値と予測値の間の差異をｍＤａで表したものである。
【０１３７】
結果および考察：
メリダマイシン生合成遺伝子クラスターの単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローン内へのｐＳＢＡＣクローニング
事前に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＮＲＲＬ３０７４８からのメリダマイシン（ｍｅｒ）生合成遺伝子クラスターをいくつかのコスミドクローン内にクローニングし、配列結果により、メリダマイシンのコア構造の構築を担っている遺伝子がＤＮＡ断片の約９０ｋｂに位置することが明らかとなっている（Ｈｅ，Ｍ．、Ｈａｌｔｉ，Ｂ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．およびＨｕｃｕｌ，Ｊ．（２００６）、Ｇｅｎｅ、３７７：１０９〜１１８）。配列データの制限消化分析から、２つの制限酵素部位（ＭｆｅＩ）が、それぞれｍｅｒ遺伝子クラスターの３７８ｂｐ上流および約１６ｋｂまで下流に位置することが判明している。このＭｆｅＩ ＤＮＡ断片は、ｍｅｒ遺伝子クラスター全体をカバーするＤＮＡを含有し、その元のプロモーターおよび多くの下流の修飾酵素コード領域を有する（図５Ａ）。サザン分析により、ゲノムＤＮＡをＭｆｅＩで消化し、ｍｅｒ遺伝子クラスター特異的プローブとハイブリダイズさせた場合に、９７ｋｂのバンドの存在が実証された（データ示さず）。この遺伝子クラスターをクローニングするために、大きなＤＮＡ挿入物を収容するためにＢＡＣベクターの必須構成要素を有するだけでなく、接合によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）へのベクターの伝達を許容する伝達起点（ｏｒｉＴ）、およびベクターのレシピエントの染色体のａｔｔＢ部位内への部位特異的組込みを許容する部位特異的組換え系をコードするφＢＴ１ ａｔｔＰ−ｉｎｔ ＤＮＡ断片も含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャトルＢＡＣベクター、ｐＳＢＡＣを用いて、ＭｆｅＩで消化したゲノムＢＡＣライブラリを構築した（ＬｉｕおよびＨｅ．、原稿準備中）。
【０１３８】
約３００個の組換えクローンを、ｍｅｒ遺伝子クラスターの中間に対応するＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。１つの陽性クローンであるｐＨＬＷ３０をさらなる分析のために選択した（配列番号３１：ｍｅｒ遺伝子クラスター）。末端配列決定、制限消化およびｍｅｒ遺伝子クラスターの両末端に対応するプライマー組を用いたＰＣＲ増幅により、遺伝子クラスター全体を１つの単一のクローン内にクローニングすることが成功したことが確認された。このクローンはまた、プロモーターとして機能する可能性がある、遺伝子クラスターの３７８ｂｐ上流の領域、および潜在的なテイラー酵素をコードする遺伝子を含有する１６ｋｂ下流の領域も含有する。
【０１３９】
エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの異種発現
ＢＡＣクローンｐＨＬＷ３０を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７を用いて、接合によって、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４およびＫ４−１１４株内に伝達した。Ｋ４−１１４株は、Ｋ４−１１４中のａｃｔ遺伝子クラスターの一部が欠失してアクチノロージンを産生するその能力が消滅しており、したがって異種発現に関してよりきれいなバックグラウンドが提供されるという点で、ＴＫ２４とは異なる。アプラマイシン−耐性の接合完了体を選択し、ｍｅｒ遺伝子クラスターの両末端に対応するプライマー組を用いたＰＣＲ分析により、遺伝子クラスターの新しい宿主内への導入が確認された（データ示さず）。サザン分析により、それぞれＴＫ２４およびＫ４−１１４から誘導した新しい宿主であるＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３中に遺伝子クラスターが存在することが、さらに確認された（図５Ｂ）。具体的には、様々な株からのプラスミドｐＨＬＷ３０およびゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、その後、ｍｅｒＰ特異的ＤＮＡ断片でプロービングした。（ｐＨＬ３０−２：ＴＫ２４中にＭｅｒ遺伝子クラスター；ｐＨＬ３０−Ｋ３：Ｋ４−１１４中にＭｅｒ遺伝子クラスター（Ａｃｔ−株））。株ＨＬ３０−２およびＨＬ３０−Ｋ３のＦＫＡ発酵培地中での小スケールの発酵（２５ｍｌ）では、ＬＣ−ＭＳ分析によって検出可能な量のメリダマイシンが産生されなかった。異種宿主が意図する化合物を産生できなかった結果の可能性のある理由を調査するための第１のステップとして、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子クラスターの転写物を分析することによって、ｍｅｒ遺伝子クラスターの元のプロモーターが新しい宿主中で活性を有するかどうかを検査した。この遺伝子クラスターの転写物をどちらの宿主からも検出することができ、プロモーターが機能的であることが示唆された（データ示さず）。さらなる半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、異種宿主からのｍｅｒ遺伝子クラスターの転写物のレベルが元の産生株ＮＲＲＬ３０７４８よりもはるかに低いことが明らかとなり（図６）、元のｍｅｒプロモーターが新しい宿主中で効率的でないことが示唆され、転写制御が新しい宿主におけるメリダマイシンの産生に影響を与える最重要な因子である可能性が示された。図６の上パネルは、ＭｅｒＰ遺伝子の一部を増幅する、プライマー組ＲＴ１およびＲＴ２を用いた様々な株のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。図６の下パネルは、１６ｓｒ ｒＲＮＡの一部を増幅する、プライマー組１６ｓＦｏｒおよび１６ｓＲｅｖを用いた対応する株のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。（ＴＫ２４：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４、Ｋ４−１１４：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４、ＨＬ３０−２：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４中にｍｅｒ遺伝子クラスター、ＨＬ３０−Ｋ３：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４中にＭｅｒ遺伝子クラスター、Ｅ３：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４中にＭｅｒ遺伝子クラスターおよびｅｒｍＥ＊プロモーター、Ｅ７：エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４中にｍｅｒ遺伝子クラスターおよびｅｒｍＥ＊プロモーター）。この結果により、元のｍｅｒプロモーターを、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）において強力なプロモーターが証明されている構成的に活性のあるｅｒｍＥ＊プロモーターに変更することが促された（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．、Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｇ．Ｒ．、およびＷａｒｄ，Ｊ．Ｍ．、１９８５、Ｇｅｎｅ、３８：２１５〜２２６）。ＭｅｒＰ遺伝子の先頭の２ｋｂの相同配列の前にｅｒｍＥ＊プロモーターを有するプラスミドｐＨＬＷ７１を用いて、相同組換えの結果として元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターで置き換えた（図６）。数々の接合完了体を選択し、ＰＣＲを用いて、予測される単一のクロスオーバーの相同組換えを有する株を選択した。この組換えの結果、ｅｒｍＥ＊プロモーターがｍｅｒ遺伝子クラスター全体の前に配置され、その転写の駆動に使用された。続く半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、プロモーターの変更によりｍｅｒ遺伝子クラスターの転写が劇的に増加したことが実証された（図６）。ｅｒｍＥ＊プロモーターに変更することでエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの転写が有意に増加したが（３倍）、新しい宿主におけるｍｅｒ遺伝子クラスターの全体的な転写は、依然として元の産生株ＮＲＲＬ３０７４８よりも低かった（図６）。元のメリダマイシン産生株が、遺伝子クラスターの発現を駆動する非常に効率的なプロモーターを有すると仮定することが合理的である。
【０１４０】
続くＬＣ−ＭＳ検出により、エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｋ４−１１４の背景で元のｍｅｒプロモーターをｅｒｍＥ＊プロモーターに変更した、Ｅ７株からのメリダマイシンの産生が実証された（図７）。図７の左パネルは、２ｍＭのピペコレートおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させた株からの、メリダマイシンの産生の検出を示す。図７の右パネルは、０．４％のプロリンおよび１０ｍＭのマロン酸ジエチルを添加したＦＫＡ培地中で成長させた株からの、３−ノルメリダマイシンの産生の検出を示す。矢印は、メリダマイシンまたは３−ノルメリダマイシンのどちらかの、予測される分子量を有するピークおよび保持時間を示す。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４に由来する対応する株（株ＨＬ３０−２）が検出可能な量のメリダマイシンを産生できないことは、前駆体の供給または宿主代謝物からの妨害が原因であり得る（図７）。目的の生成物が何であるかは、長い蓄積時間を有するナノエレクトロスプレー源を用いたＦＴＭＳ高分解能の精密質量スペクトルによって、さらに確認した。低い存在量のメリダマイシンおよびノルメリダマイシンのナトリウム付加分子イオンは、陽イオンモードで、それぞれｍ／ｚ８４４．５１９２８およびｍ／ｚ８３０．５０２９８で検出され、これらは予測値と非常に良好に一致し（［Ｍ＋Ｎａ］１＋、メリダマイシン：予測値８４４．５１８１５、Δ＝１．１３ｍＤａ；ノルメリダマイシン：予測値８３０．５０２５０、Δ＝０．４８ｍＤａ）、したがって、生成物がメリダマイシンおよび３−ノルメリダマイシンであることが確認された（図８）。
【０１４１】
クローニングしたメリダマイシン生合成遺伝子クラスターのそれぞれのＡＴドメインの以前の分析により、マロネート−ＣｏＡ、メチルマロネート−ＣｏＡおよびエチルマロネート−ＣｏＡを含めた３つの異なる伸長単位が、メリダマイシンの完全合成に提示されなければならないことが明らかとなっている（Ｈｅ，Ｍ．、Ｈａｌｔｉ，Ｂ．、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．、Ｆｅｎｇ，Ｘ．およびＨｕｃｕｌ，Ｊ．（２００６）、Ｇｅｎｅ、３７７：１０９〜１１８）。モジュール４中のアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）が、エチルマロニル−ＣｏＡのメリダマイシンのポリケチド主鎖内への取り込みを担っているが（Ｈｅ他、２００６）、遺伝子クラスターはエイトルマロネート伸長単位を生合成する遺伝子を欠いており、他の機能的遺伝子クラスターがエチマロネートを合成でき、それをメリダマイシンの産生に提供している可能性があることが示唆されている。エス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）はエチルマロニル−ＣｏＡを産生するが（Ｈｕ，Ｚ．、Ｒｅｉｄ，Ｒ．、およびＧｒａｍａｊｏ，Ｈ．、２００５、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、５８：６２５〜６３３）、この前駆体は、異種宿主による一部のポリケチドの合成を制限する重要な因子であることが実証されている（Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．、Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｊ．、Ｐａｒｋ．，Ｓ．Ｒ．、Ｊｅｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．、Ｈａｎ，Ａ．Ｒ．、Ｓｏｈｎｇ，Ｊ．Ｋ．、Ｋｉｍ Ｂ．Ｇ．、Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｙ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．、およびＹｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、２００６、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７２：７６３〜７６９）。エチルマロニルＣｏＡの供給が異種宿主におけるメリダマイシンの産生に影響を与えるかどうかを調査するために、Ｅ７株を、エチルマロニル−ＣｏＡの有効な前駆体であることが証明されている１０ｍＭのジエチルマロン酸を添加したＦＫＡ培地中で培養した（Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．、Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｊ．、Ｐａｒｋ．，Ｓ．Ｒ．、Ｊｅｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．、Ｈａｎ，Ａ．Ｒ．、Ｓｏｈｎｇ，Ｊ．Ｋ．、Ｋｉｍ Ｂ．Ｇ．、Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｙ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．、およびＹｏｏｎ，Ｙ．Ｊ．、２００６、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７２：７６３〜７６９）。結果により、マロン酸ジエチルを供給することでメリダマイシンの産生が２倍増加したことが示された（１５０μｇ／Ｌから３００μｇ／Ｌ）。
【０１４２】
元のメルジアマイシン産生株ＮＲＲＬ３０７４８に関連する問題の１つは、メリダマイシン、３−ノルメリダマイシンおよびＣ９−デオキソメリダマイシンの混合物である、発酵産物の不均一性である。メリダマイシン生合成遺伝子クラスターをエス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中で異種発現させることによって、３−ノルメリダマイシンは、プロリンを培地に添加した場合に、Ｅ７株からのみ検出可能であった（図８）。
【０１４３】
【表２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３４４８９（Ｐ２０１０−５３４４８９Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９２１８（Ｐ２０１０−５１９２１８）
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１７６９２
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１７６９２
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
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