遺伝子変換活性状態の細胞における遺伝的多様化のための方法
【課題】標的核酸配列または遺伝子産物の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のための方法ならびに上記遺伝的多様化が可能な細胞および細胞株を提供する。
【解決手段】本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、任意の核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のために特に有用な細胞系を提供する。この系は、細胞外刺激（例えば、他の細胞または分子との相互作用）またはＢ細胞抗原レセプターの維持を必要とせずに、再配列された免疫グロブリンＶ遺伝子をインビトロで恒常的に多様化するＢ細胞株に基づく。
【解決手段】本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、任意の核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のために特に有用な細胞系を提供する。この系は、細胞外刺激（例えば、他の細胞または分子との相互作用）またはＢ細胞抗原レセプターの維持を必要とせずに、再配列された免疫グロブリンＶ遺伝子をインビトロで恒常的に多様化するＢ細胞株に基づく。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体産生細胞における免疫グロブリンの遺伝子変換と過剰変異との間の関連性を利用することによる、標的核酸配列または遺伝子産物の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のための方法、ならびに上記遺伝的多様化が可能な細胞および細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子産物において多様性を生成するための多くのアプローチは、非常に多くの変異の生成に依存し、次にこれらの変異は、強力な選択技術を使用して選択される。しかしながら、これらの系は、多くの不都合を有する。突然変異誘発が、遺伝子構築物に対してインビトロで行われ、続いて、この遺伝子構築物が、インビトロで発現されるか、または細胞もしくは動物において導入遺伝子として発現される場合、生理的な状況における遺伝子発現は困難であり、そして変異体のレパートリーはそのうち固定される。一方、突然変異誘発が、生細胞において実行される場合、望ましい標的核酸へ変異を指向することが困難である。それゆえ、十分な効率を有する変異および選択のサイクルを反復することにより、亢進された活性を有する分子を単離する効率は、制限される。さらに、インビボでの無秩序な突然変異誘発は、毒性があり、そして高レベルの望ましくない二次変異を誘発するようである。
【０００３】
自然状態では、選択された核酸配列の指向的多様化は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントにおいて生じる。抗体特異性の一次的なレパートリーは、免疫グロブリンＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの接合を伴うＤＮＡ再配列のプロセスにより生成される。抗原接触に続いて、Ｂ細胞（その表面のＩｇが、この抗原に低い親和性または中程度の親和性で結合し得る）における再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントは、過剰変異による第二波の多様化に供される。この、いわゆる体細胞過剰変異は、二次的なレパートリーを生成する。その結果、増大した結合特異性が、選択され、体液性免疫応答の親和性の成熟を可能にする（非特許文献１）。
【０００４】
顕著な多様性が、無秩序な組み合わせによって、この段階において創出されるように、マウスおよびヒトの免疫グロブリン遺伝子座は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列に関与し得るＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの大規模なプールを含む。他の種（例えば、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジおよびブタ）は、それらの一次的なＩｇレパートリーを発達させるために、異なる戦略を使用する（非特許文献２）。単一機能のＶセグメントおよびＪセグメントの再配列後、ニワトリの軽鎖の遺伝子のさらなる多様化が、特化したリンパ系器官（ファブリーキウス嚢）における遺伝子変換により生じる（非特許文献３；非特許文献４）。このプロセスの間、非機能的な偽Ｖ遺伝子由来の配列のストレッチは、再配列されたＶ遺伝子に転移される。２５個の偽Ｖ遺伝子が、機能的なＶ遺伝子の上流に位置し、そしてＶ遺伝子と配列相同性を共有する。ヒトおよびマウスにおける状況と同様に、抗原接触後の親和性の成熟は、ニワトリの脾性胚芽中心における過剰変異により生じる（非特許文献５）。
【０００５】
Ｉｇレパートリー形成の３つ全てのＢ細胞特異的な活性−遺伝子変換（非特許文献６）、過剰変異およびアイソタイプスイッチ組換え（非特許文献７；非特許文献８）−は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）遺伝子の発現を必要とする。ＡＩＤはＤＮＡ編集酵素であることが最初に提唱された（非特許文献９）が、より最近の研究は、ＡＩＤが、シトシンからウラシルへの脱アミノ作用によりＤＮＡを直接修飾することを示唆する（非特許文献１０）。しかしながら、その型において相違はあるものの、ＡＩＤ誘発ＤＮＡ修飾の位置およびプロセスは、異なる種およびＢ細胞の環境において、組換えまたは過剰変異の選択的な発生を説明し得るので、このシトシン脱アミノ活性は、さらに調節されるはずである。特定のＡＩＤ変異がスイッチ組換えに影響するが、体細胞過剰変異には影響しないという知見に基づいて、ＡＩＤが、スイッチ組換えを開始するために補因子の結合を必要とすることが示唆された（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００６】
ＤＴ４０ノックアウト変異の分析は、ＲＡＤ５４遺伝子（非特許文献１３）およびＲＡＤ５２組換え修復経路の他のメンバーが、効率的なＩｇ遺伝子変換のために必要とされることを示唆する（非特許文献１４）。ＲＡＤ５１アナログおよびＲＡＤ５１パラログの破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させ、そして再配列された軽鎖の遺伝子における過剰変異を誘導する（非特許文献１４）。このことは、相同組換えによるＤＮＡ修復における欠陥は、Ｉｇ遺伝子変換から過剰変異へシフトし得ることを示唆する。
最近、免疫グロブリン遺伝子座における体細胞過剰変異の現象を利用して、恒常的かつ直接的な様式で標的遺伝子の変異を生成する、最初の細胞系が開発された。これらの細胞系は、変異の発生と選択との循環的な工程により、所望の活性を有する遺伝子産物を調製することを可能にする。それゆえ、特許文献１および特許文献２は、特定の核酸領域の指向性の恒常的な過剰変異が可能なヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）を記載する。これらの変異領域は、内因性の再配列されたＶセグメント、または過剰変異を指向する制御配列へ作動可能に連結された外因性の遺伝子であり得る。トランスフェクトされる構築物が、主に、染色体の位置に無秩序に挿入されるので、この細胞系の顕著な不都合は、ヒト細胞が、標的組込みにより効率的に遺伝子操作され得ないことである。
特許文献２はまた、Ｉｇ遺伝子座において遺伝的多様性を生成するための別の細胞系も記載し、この細胞系は、ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０に基づく。ＤＴ４０は、細胞培養の間、再配列された軽鎖免疫グロブリン遺伝子の遺伝子変換を継続する（非特許文献１５）。重要なことに、この細胞株は、トランスフェクトされる構築物の無秩序な組換えに対する標的組込みの高い比を有し、それゆえ、効率的な遺伝子操作を可能にする（非特許文献１６）。特許文献２によれば、相同組換えおよびＤＮＡ修復に関連するＲＡＤ５１遺伝子のパラログのＤＴ４０における欠失は、遺伝子変換の低下と再配列されたＶセグメントの過剰変異の併発的な活性化とを導く。しかしながら、この系の主要な不都合は、変異細胞が、Ｘ線感受性および染色体の不安定性により示されるようなＤＮＡ修復の欠陥を有することである。これらの変異体はまた、低い増殖速度および低い遺伝子ターゲティング効率も有する。したがって、この系は効率的な遺伝子多様化および選択のために適切ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／０２２１１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１００９９８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．およびＲａｄａ Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、第２版、１９９５年、ｐ．５７〜８１
【非特許文献２】Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊ．Ｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂ−ｃｅｌｌ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ．Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９９８年、１７、ｐ．４３〜７０
【非特許文献３】Ｒｅｙｎａｕｄ、Ｃ−Ａ．ら、Ａ ｈｙｐｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｃｅｌｌ、１９８７年、４８、ｐ．３７９〜３８８
【非特許文献４】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．およびＢｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ−Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｕｒｓａｌ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＤＴ４０ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、印刷中
【非特許文献５】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｈｙｐｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｎｇｏｉｎｇ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｐｌｅｎｉｃ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６年、１５、ｐ．２５４０〜２５４６
【非特許文献６】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．ら、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ）Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２年、２９５、ｐ．１３０１〜１３０６
【非特許文献７】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ、Ｍ．ら、Ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ），ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｃｅｌｌ、２０００年、１０２、ｐ．５５３〜５６３
【非特許文献８】Ｒｅｖｙ、Ｐ．ら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ） ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒ−ＩｇＭ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ、２０００年、１０２、ｐ．５６５〜５７５
【非特許文献９】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ、Ｍ．ら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ），ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ−ｅｄｉｔｉｎｇ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４、ｐ．１８４７０〜１８４７６
【非特許文献１０】Ｄｉ Ｎｏｉａ、Ｊ．およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１９、ｐ．４３〜４８
【非特許文献１１】Ｔａ Ｖ．Ｔ．ら、ＡＩＤ ｍｕｔａｎｔ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３年、４、ｐ．８４３〜８４８
【非特許文献１２】Ｂａｒｒｅｔｏ、Ｖ．ら、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤ ｕｎｃｏｕｐｌｅｓ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００３年、１２、ｐ．５０１〜５０８
【非特許文献１３】Ｂｅｚｚｕｂｏｖａ、Ｏ．ら、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｘ−ｒａｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ａ ＲＡＤ５４−／− ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ＤＴ４Ｏ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｃｅｌｌ、１９９７年、８９、ｐ．１８５〜１９３
【非特許文献１４】Ｓａｌｅ、Ｊ．Ｅ．ら、Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＸＲＣＣ２／３ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１２、ｐ．９２１〜９２６
【非特許文献１５】Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ−Ｍ．ら、Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｉｎ ａｎ ＡＬＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０年、９、ｐ．９２１〜９２７
【非特許文献１６】Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ．Ｍ．およびＴａｋｅｄａ、Ｓ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １９９１年１０月４日 ６７（１）：ｐ．１７９〜８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、先行技術の系の不都合を克服し、そして、なおさらなる利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の第一の局面において、過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有する遺伝的に改変されたリンパ系細胞が提供される。この細胞は、ＲＡＤ５１遺伝子（重要な相同組換え因子をコードする）のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない。詳しくは、この細胞は、野生型の相同組換え因子を含む。インタクトな相同組換え機構のため、本発明に記載の細胞は、高効率の組換えおよび高精度の修復を有し、そして通常の速度で増殖する。
【００１１】
本発明の細胞は、免疫グロブリンのレパートリーを発達させるために遺伝子変換の機構を使用する動物種から得られる、免疫グロブリンを発現するＢリンパ球である。これらの種は、例えば、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウサギである。好ましくは、この細胞は、ニワトリの嚢リンパ腫から得られる。最も好ましくは、この細胞は、ＤＴ４０細胞株から得られるか、またはＤＴ４０細胞株に関連する。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明に記載の細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化を可能にする。標的核酸は、タンパク質をコードし得るか、または調節活性を保持する。タンパク質の例は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、レセプタータンパク質またはそれらの一部である。好ましい実施形態において、この標的核酸は、再配列されたヒト免疫グロブリン遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊセグメントである。調節性の核酸の例は、転写調節エレメントまたはＲＮＡｉ配列である。
【００１３】
標的核酸が、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより多様化される一実施形態において、本発明に記載の細胞は、標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、この標的核酸は、遺伝的多様化を指向する制御核酸配列へ作動可能に連結された外因性の核酸である。
【００１５】
さらなる実施形態において、この標的核酸は、本発明に記載の細胞において、所望の活性を示す細胞の選択を促進する様式で発現される。この選択は、細胞内の、細胞表面上または細胞外における、標的核酸の活性に対する直接的な選択であり得る。代替的に、この選択は、レポーター核酸の活性に対する間接的な選択であり得る。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明に記載の細胞において、標的核酸の遺伝的な多様化を調節する遺伝的手段を提供する。この調節は、シス作用性調節配列の改変、遺伝子変換ドナーの数を変更すること、またはトランス作用性調節因子（例えば、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）またはＲＡＤ５１のアナログもしくはパラログ以外のＤＮＡ修復因子もしくはＤＮＡ組換え因子）の改変によるものであり得る。好ましくは、この細胞は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）を条件的に発現する。
【００１７】
第二の局面において、本発明に記載の細胞から得られる細胞株が提供される。好ましい実施形態において、この細胞株はＤＴ４０またはその改変物である。
【００１８】
第三の局面において、過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有するリンパ系細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。上記トランスジェニック非ヒト動物において、この細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない。そして、この細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせによりトランスジェニック標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である。好ましい実施形態において、この動物はニワトリである。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能な細胞を調製するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的核酸を含む遺伝学的構築物により、遺伝子変換が可能なリンパ系細胞をトランスフェクトする工程、および（ｂ）内因性Ｖ遺伝子セグメントの一部がこの標的核酸に置き換えられた内因性Ｖ遺伝子セグメントを有する細胞を同定する工程。
【００２０】
さらなる実施形態によれば、この標的核酸を含む遺伝学的構築物はさらに、標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む。標的核酸を含む遺伝子座は、この遺伝子座の異なる構成要素を含む構築物による単回のトランスフェクションまたは複数回のトランスフェクションにより構築され得る。
【００２１】
所望の活性を有する細胞に対する選択が間接的である実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を包含する：（ｃ）この標的核酸により影響され得るレポーター遺伝子を含むさらなる遺伝学的構築物により、工程（ｂ）由来の細胞をトランスフェクトする工程。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、さらに（ｄ）トランス作用性調節因子を条件的に発現させる工程を包含する。好ましい実施形態において、このトランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である。
【００２３】
特に好ましい実施形態によれば、この標的核酸は、標的組込みにより細胞に挿入される。
【００２４】
さらなる局面において、所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的核酸を発現するために適切な条件下で、本発明に記載の細胞を培養する工程、（ｂ）細胞の集団中で、所望の活性を有する変異遺伝子産物を発現する細胞を同定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において同定された細胞由来の１つ以上のクローンの細胞集団を樹立する工程、ならびに、このクローン集団から、改善された所望の活性を有する遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程。
【００２５】
一実施形態において、工程（ｂ）および工程（ｃ）は、最適化された所望の活性を有する遺伝子産物が産生されるまで反復的に繰り返される。
【００２６】
さらなる実施形態によれば、最適化された所望の活性を有する遺伝子産物を産生する細胞が同定された場合、遺伝的多様化は、例えば、トランス作用性調節因子の発現のダウンレギュレーションにより、停止され得る。このトランス作用性調節因子は、例えば、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）または、ＲＡＤ５１のパラログもしくはアナログ以外の、相同組換えもしくはＤＮＡ修復に関与する因子であり得る。
【００２７】
別の実施形態において、標的核酸の多様化は、さらに、標的配列の最適化（例えば、Ｉｇ過剰変異のホットスポットの導入またはＧＣ含量の増加）により改変される。
本発明のさらなる局面において、所望の活性を有する遺伝子産物の調製のための、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能な細胞の使用が提供される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有する、遺伝的に改変されたリンパ系細胞であって、該細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない、細胞。
（項目２）
野生型の相同組換え活性を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
影響されていない増殖速度を有する、項目１または２に記載の細胞。
（項目４）
高精度のＤＮＡ修復能を有する、項目１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５）
免疫グロブリンを発現するＢ細胞である、項目１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６）
ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはウサギ由来である、項目１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７）
ニワトリの嚢リンパ腫細胞である、項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８）
ＤＴ４０細胞またはその派生物である、項目１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目９）
活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）を発現する、項目１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか一項に記載の細胞であって、該細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である、細胞。
（項目１１）
前記標的核酸は、タンパク質をコードするか、または調節活性を発揮する、項目１０に記載の細胞。
（項目１２）
前記標的核酸は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、レセプタータンパク質またはそれらの一部をコードする、項目１１に記載の細胞。
（項目１３）
前記標的核酸は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子、またはその一部である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記標的核酸は、転写調節エレメントまたはＲＮＡｉ配列を含む、項目１１に記載の細胞。
（項目１５）
さらに、前記標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む、項目１０〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１６）
前記標的核酸は、標的組込みにより、染色体の所定の位置へ組み込まれる、項目１０〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１７）
前記標的核酸は、遺伝的多様化を指向する制御核酸配列へ作動可能に連結される、項目１１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１８）
所望の活性を有する前記標的核酸の変異体を含む細胞の選択を促進する様式で、該標的核酸を発現する、項目１１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１９）
前記選択は、前記細胞内、該細胞表面上または該細胞外における、該細胞内の前記標的核酸の活性に対する直接的な選択である、項目１８に記載の細胞。
（項目２０）
前記選択は、レポーター核酸の活性に対する間接的な選択である、項目１８に記載の細胞。
（項目２１）
遺伝子変換および過剰変異による前記標的核酸の遺伝的多様化は、遺伝子操作により調節される、項目１０〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２２）
前記調節は、シス作用性調節配列によるものである、項目２１に記載の細胞。
（項目２３）
前記調節は、遺伝子変換ドナーの数、方向、長さまたは相同性の程度を変更することによるものである、項目２０または２２に記載の細胞。
（項目２４）
前記調節は、トランス作用性調節因子によるものである、項目２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２５）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記トランス作用性調節因子は、ＲＡＤ５１のパラログまたはアナログ以外のＤＮＡ修復因子またはＤＮＡ組換え因子である、項目２４に記載の細胞。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項に記載の細胞から得られる細胞株。
（項目２８）
過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有するリンパ系細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さず、そして、該細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせによりトランスジェニック標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である、トランスジェニック非ヒト動物。
（項目２９）
過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化を可能にする細胞を調製するための方法であって、該方法は、ａ）該標的核酸を含む遺伝学的構築物により、遺伝子変換が可能なリンパ系細胞をトランスフェクトする工程、および（ｂ）該標的核酸により置き換えられた、内因性Ｖ遺伝子またはそのフラグメントを有する細胞を同定する工程、を包含する、方法。
（項目３０）
前記標的核酸を含む遺伝学的構築物は、前記標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る少なくとも１つの核酸をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記標的核酸を含む遺伝子座は、複数回のトランスフェクションにより構築される、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
さらに、（ｃ）前記標的核酸により影響され得るレポーター遺伝子を含むさらなる遺伝学的構築物により、前記工程（ｂ）由来の細胞をトランスフェクトする工程、を包含する、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
さらに、（ｄ）トランス作用性調節因子を条件的に発現させる工程を包含する、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標的核酸は、標的組込みにより、前記細胞の染色体の特定の位置に挿入される、項目２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）標的核酸を発現するために適切な条件下で、項目１１〜２６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の集団中で、細胞所望の活性を有する変異遺伝子産物を発現する細胞を同定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において同定された細胞由来の１つ以上のクローンの細胞集団を樹立する工程、ならびに、該クローン集団から、改善された所望の活性を有する遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程
を包含する、方法。
（項目３７）
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）は、反復的に繰り返される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
さらに、遺伝的多様化を停止する工程を包含する、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記標的核酸の多様化は、さらに、標的配列の最適化により改変される、項目３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝的多様化は、トランス作用性調節因子の発現のダウンレギュレーションにより停止される、項目３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための、項目１０〜２６のいずれか一項に記載の細胞または項目２７に記載の細胞株の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（図１．ψＶ遺伝子欠失）（Ａ）ニワトリの再配列されたＩｇ軽鎖遺伝子座およびψＶノックアウト構築物の物理的地図。この遺伝子座は、機能的なＶセグメントの上流の全２５個のψＶ遺伝子を含む。ｐψＶＤｅｌ１−２５構築物およびｐψＶＤｅｌ３−２５構築物の標的組込みによるψＶ遺伝子のノックアウト戦略が、以下に示される。関連するＥｃｏＲＩ部位のみ、示される。（Ｂ）ＥｃｏＲＩ消化後の、（Ａ）に示されるプローブを使用する、野生型クローンおよびノックアウトクローンのサザンブロット分析。野生型遺伝子座は、１２ｋｂのフラグメントとしてハイブリダイズするが、ψＶ部分的遺伝子座およびψＶ−遺伝子座は、それぞれ７．４ｋｂのフラグメントおよび６．３ｋｂのフラグメントとしてハイブリダイズする。（Ｃ）ＡＩＤの状態。ＡＩＤ遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、ＡＩＤ ｃＤＮＡ発現カセットの存在または欠如を確かめた。
【図２】（図２．コントロールクローンおよびψＶノックアウトクローンのｓＩｇＭ発現分析）（Ａ）元のｓＩｇＭ（＋）クローンに由来する代表的なサブクローンのＦＡＣＳの抗ＩｇＭ染色プロフィール。（Ｂ）２４個のサブクローンの測定に基づく、ｓＩｇＭ（−）ゲートに入る事象の平均パーセント。
【図３】（図３．ψＶノックアウトクローンのＩｇ軽鎖配列分析）ＡＩＤＲψＶ−クローンおよびＡＩＤＲψＶ部分的クローンの変異プロフィール。Ｊ−Ｃイントロンに対するリーダー配列由来の領域内の異なる配列において同定された、全てのヌクレオチド置換が、ＡＩＤＲ前駆体クローンに存在する再配列された軽鎖配列上にマッピングされる。ＡＩＤＲψＶ−クローンおよびＡＩＤＲψＶ部分的クローンの変異が、上記および下記の基準配列にそれぞれ示される。欠失、挿入および遺伝子変換の事象もまた、示される。ホットスポットモチーフ（ＲＧＹＷおよびその相補的なＷＲＣＹ）が、太字で強調される。
【図４】（図４．過剰変異細胞株の変異プロフィール）（Ａ）特定の数の変異を保有する配列のパーセント。各々鋳型されないヌクレオチド置換が計数されるが、複数個のヌクレオチドが関与する遺伝子変換、欠失および挿入は、単一の事象として計数される。ＰＭ、点変異；ＧＣ、遺伝子変換；Ｄ、欠失；Ｉ、挿入。（Ｂ）ψＶノックアウトクローンおよびＸＲＣＣ３ノックアウトクローン由来の配列内のヌクレオチド置換のパターン。遺伝子変換事象の一部としてのヌクレオチド置換は、除外される。転換（ｔｒｖ）に対する転移（ｔｒｓ）の比もまた、示される。（Ｃ）鋳型されないヌクレオチド置換変異のホットスポットの優先傾向。ホットスポットモチーフ（ＲＧＹＷおよびその相補的なＷＲＣＹ）内に発生する変異が、パーセントにより示される。（Ｄ）自発的に死ぬ細胞の指標としての、トリパンブルー陽性細胞。
【図５】（図５．未選別のＡＩＤＲψＶ−細胞由来のゲノム配列内および選別されたＩｇＭ（−）ＡＩＤＲψＶ−細胞由来のｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド置換の分布）変異の数は、５０ｂｐ毎に計数され、そして、軽鎖ゲノム遺伝子座またはｃＤＮＡ配列の、対応する物理的地図とともに示される。
【図６】（図６．Ｉｇ遺伝子変換およびＩｇ過剰変異の調節を説明するモデル）
【図７】（図７．ＧＦＰ遺伝子のインサイチュ突然変異誘発）（Ａ）Ｉｇ ＶＪ置換ベクター。（Ｂ）過剰変異によるＧＦＰ遺伝子のインビボ変異誘発。（Ｃ）ψＶドナー置換ベクター。（Ｄ）遺伝子変換および過剰変異による、ＧＦＰ遺伝子のインビボ突然変異誘発。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、任意の核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のために、特に有用な細胞系を利用可能にする。この系は、細胞外刺激（例えば、他の細胞または分子との相互作用）またはＢ細胞抗原レセプターの維持を必要とせずに、再配列された免疫グロブリンＶ遺伝子をインビトロで恒常的に多様化するＢ細胞株に基づく。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「指向的かつ選択的な遺伝的多様化」は、特定の細胞の、内因性の核酸またはトランスジェニック核酸の特定の領域の核酸配列の変更を引き起こす能力をいい、したがって、これらの領域外の配列は、変異に供されない。
【００３１】
「遺伝的多様化」は、核酸内の個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチの変更をいう。本発明に記載の細胞における遺伝的多様化は、過剰変異、遺伝子変換または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより生じる。
【００３２】
「過剰変異」は、バックグラウンド以上の比率での、細胞における核酸の変異をいう。好ましくは、過剰変異は、一世代あたり、１０−５ｂｐ−１から１０−３ｂｐ−１の間の変異の比率をいう。これは、バックグラウンドの変異比率（一世代あたり、１０−９変異ｂｐ−１〜１０−１０変異ｂｐ−１のオーダー（Ｄｒａｋｅら １９８８））およびＰＣＲにおいて観察される自然発生的な変異を大幅に超過する。Ｐｆｕポリメラーゼによる３０サイクルの増幅は、産物において０．０５×１０−３変異ｂｐ−１未満を生成する（この場合、１００個の観察される変異において１個未満の原因となる）（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１）。
【００３３】
「遺伝子変換」は、配列情報が、一方の相同的な対立遺伝子からもう一方の相同的な対立遺伝子へ、一方向性の様式で転移される事象をいう。遺伝子変換は、テンプレートを切り換えし、そして相同配列から転写するＤＮＡポリメラーゼの結果、または．ヘテロ二本鎖の形成後のミスマッチ修復（一方の鎖から除去され、そしてもう一方の鎖を使用する修復合成により置換されるヌクレオチド）の結果であり得る。
【００３４】
過剰変異および遺伝子変換は、Ｂ細胞の免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊセグメント内に天然の多様性を生成する。過剰変異は、抗原刺激後のマウスおよびヒトのような種の胚芽中心において生じる。遺伝子変換は、抗原刺激に関係なく、ニワトリ、ウシ、ウサギ、ヒツジおよびブタのような種における、ファブリーキウス嚢のような主要リンパ系器官または腸関連リンパ系組織において生じる。ニワトリにおいて、上流の偽Ｖ遺伝子由来のストレッチは、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントに転移される。それゆえ、本発明によれば、細胞または細胞株は、好ましくは、その再配列された免疫グロブリン遺伝子を多様化し得る免疫グロブリン産生細胞または細胞株である。
【００３５】
過剰変異の開始と遺伝子変換の開始との間の直接的な関係は、本明細書において報告される実験において、初めて証明される。具体的には、細胞培養において遺伝子変換を継続する細胞株における、偽Ｖ遺伝子の部分的な欠失または完全な欠失は、免疫グロブリン遺伝子座における過剰変異の活性化につながる。全ての偽Ｖ遺伝子の欠失は、遺伝子変換の停止および高比率の過剰変異の同時活性化をもたらし、一方で少数の偽遺伝子の欠失は、遺伝子変換のダウンレギュレーションおよび、完全な偽遺伝子の欠失について観察されるものよりは低い比率での過剰変異の同時活性化をもたらす。したがって、利用可能な偽遺伝子ドナーの数は、遺伝子変換の比率に直接的に相関し、そして過剰変異の比率に逆相関する。遺伝子変換および過剰変異は、互いに相反的な関係にあると説明される。それゆえ、本発明は、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、標的核酸を遺伝的に多様化することを可能にする細胞系を、初めて提供する。したがって、これらの２つの事象の寄与は、遺伝子変換ドナーの数、その方向、またはその相同性の程度もしくは長さを変更することにより調節され得る。
【００３６】
過剰変異活性のみを有する細胞系（例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＷＯ００／２２１１１およびＷＯ０２／１００９９８）に基づくもの）を上回る、本発明に記載の細胞系の利点は、１つの細胞において、過剰変異および遺伝子変換による遺伝的多様化を組み合わせる能力である。例えば、遺伝子変換ドナーは、好ましい方法で標的核酸活性に影響するような配列を含むように操作され得るので、より多くの規定される変更が、無秩序な過剰変異ではなく遺伝子変換により標的遺伝子に導入され得る。こうして、試験前の配列ブロックは、無秩序な過剰変異により組み合わされるので、遺伝子変換および過剰変異は、所望の改変体を生成する機会を増大し得る。標的遺伝子の特定の領域と同一な配列を有する偽遺伝子はまた、過剰変異が非変換部分においてのみ持続する効果を有する頻繁な変換により、標的核酸の一部を安定的に保持するために使用され得る。このアプローチは、標的核酸が、最適な活性を安定的に維持する領域を含む場合、有用である。
【００３７】
遺伝子変換活性状態の細胞における相同組換え活性の抑制に基づく細胞系（ＷＯ０２／１００９９８）を上回る、本発明に記載の細胞系の利点は、通常の増殖速度、耐放射線性およびＤＮＡ修復能力に反映される細胞の遺伝的安定性である。
【００３８】
全ての公知の系を上回る、本発明の細胞系の特定の利点は、本発明に記載の細胞の、トランスフェクトされた核酸構築物を標的組込みにより相同な内因性遺伝子座に組み込む能力である。
【００３９】
「標的組込み」は、相同組換えによる、内因性遺伝子座への、内因性の核酸配列と相同な核酸配列を含むトランスフェクトされた核酸構築物の組み込みである。標的組込みは、規定の染色体位置へ、任意の核酸を直接挿入し得る。好ましい実施形態において、目的の遺伝子産物をコードする核酸は、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントまたはその一部の代わりに、免疫グロブリン遺伝子座へと標的組込みにより挿入される。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明に記載の細胞は、インビボでＩｇ遺伝子変換を起こす細胞に由来するか、または関連する。インビボでＩｇ遺伝子変換を起こす細胞は、例えば、主要リンパ系器官において表面Ｉｇを発現するＢ細胞（例えば、鳥類の嚢のＢ細胞）である。主要リンパ系器官のＢ細胞に由来するリンパ腫細胞は、本発明に記載の細胞および細胞株を構築するための、特に良好な候補である。最も好ましい実施形態において、この細胞は、ニワトリの嚢リンパ腫細胞株ＤＴ４０に由来する。
【００４１】
過剰変異および遺伝子変換による恒常的な遺伝的多様化のプロセスは、所望の活性、新規の活性または改善された活性を有する遺伝子産物を産生するために、本発明において使用される。
【００４２】
「標的核酸」は、本発明に記載の細胞内の核酸配列または染色体領域であり、これは、指向的かつ選択的な遺伝的多様化に供される。標的核酸は、内因性か、またはトランスジェニックのいずれかであり得、そして、遺伝子産物をコードする１つ以上の転写単位を含み得る。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「導入遺伝子」は、例えば、トランスフェクションまたは形質導入により、細胞に挿入される核酸分子である。例えば、導入遺伝子は、所望の位置において細胞のゲノムに挿入され得る、異種の転写単位を含み得る。
【００４４】
一実施形態において、導入遺伝子は、免疫グロブリンを産生する細胞において見出される免疫グロブリンＶ遺伝子、またはＶ遺伝子のフラグメントである。好ましくは、標的核酸は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子である。この場合において、本発明に記載の細胞は、任意の所定の抗原に結合し得るヒト抗体改変体の「工場」である。
【００４５】
あるいは、標的核酸は、非免疫グロブリン核酸（例えば、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素またはレセプタータンパク質をコードする遺伝子）である。例えば、新規の蛍光選択マーカーは、遺伝子変換ドナーとして働く他の公知のマーカー（異なる蛍光スペクトルを有する）の助けを借りた過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、公知のマーカーを変異させることにより生成され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態において、標的核酸は、直接的に、目的の遺伝子産物をコードする。このような核酸の遺伝的多様化は、コードされる遺伝子産物の切断またはその初期配列の変更をもたらす。毎回の多様化および選択について、改善された活性を有する遺伝子産物を発現する細胞が探索される。
【００４７】
代替的に、標的核酸は、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサーのような転写調節エレメント）または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。この実施形態において、標的核酸により影響され、かつ同定可能な遺伝子産物をコードする、さらなる核酸（レポーター遺伝子）が、目的の標的核酸を保持する細胞を同定するために必要とされる。
【００４８】
標的核酸の遺伝的多様化が、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより生じる実施形態において、遺伝子変換ドナーとして働き得る、さらなる核酸が、細胞のゲノムに、好ましくは標的核酸の上流に挿入される。
【００４９】
「遺伝子変換ドナーとして働き得る核酸」は、標的核酸と相同な配列を有する核酸である。天然の遺伝子変換ドナーの例は、特定の種の免疫グロブリン遺伝子座における偽Ｖ遺伝子である。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、標的核酸の指向的かつ選択的な多様化が可能な細胞は、規定の染色体部位での標的組込みによって、宿主細胞へ標的核酸を挿入することにより構築される。この目的のために、トランスフェクトされる構築物は、所望の染色体組み込み部位に相同な、標的核酸配列の上流および下流を含み得る。好ましくは、この細胞は、導入遺伝子が、遺伝子変換および／または過剰変異の事象の標的になるような相同組み換えまたは遺伝子ターゲティングによって、内因性Ｖ遺伝子またはそのセグメントをこの導入遺伝子に置換することにより構築される。
【００５１】
別の実施形態において、本発明に記載の導入遺伝子はまた、遺伝子変換および／または過剰変異を指向する配列を含む。したがって、遺伝子産物を発現し得、そしてこの転写単位に対する過剰変異および遺伝子変換を指向する完全な遺伝子座は、細胞に転移され、そして無秩序な染色体への組み込み後においても活性的に多様化される。
【００５２】
標的組込みにより導入遺伝子を組み込まれたクローンのスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲにより行われ得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明に記載の導入遺伝子は、この導入遺伝子が安定的に組み込まれたクローンの選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。続いて、この選択可能なマーカー遺伝子は、組換えにより除去され得るか、または他の方法により不活性化され得る。
【００５４】
本発明は、さらに、所望の活性を有する標的核酸を保持する細胞についての細胞の増殖および選択の度重なる繰り返しにより、所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法を提供する。本明細書において使用される場合、「選択」は、標的核酸内の配列の改変の存在の決定をいい、この配列の改変は、標的核酸によりコードされる遺伝子産物の所望の活性または標的核酸の調節機能の所望の活性をもたらす。
【００５５】
遺伝子変換および過剰変異のプロセスは、免疫グロブリン分子において改善された結合特異性または新規の結合特異性を生成するために、インビボで使用される。それゆえ、所望の抗原に結合し得る免疫グロブリンを産生する本発明に記載の細胞を選択すること、そして次に、さらなる変異の発生を可能にするためにこれらの細胞を増殖させることにより、所望の抗原への改善された結合を有する免疫グロブリンを発現する細胞が、単離され得る。
【００５６】
種々の選択手順は、所望の特異性を有する変異の単離のために適用され得る。これらとしては、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）、磁性粒子を使用する細胞分離、抗原クロマトグラフィー方法および他の細胞分離技術（例えば、ポリスチレンビーズの使用）が挙げられる。
【００５７】
蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）は、細胞の異なる表面分子（例えば、表面提示される免疫グロブリン）に基づいて、細胞を単離するために使用され得る。分離されるべきサンプルまたは集団内の細胞は、細胞表面分子に結合する特異的な蛍光試薬により染色される。これらの試薬は、蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、マラカイトグリーン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または当業者に公知の任意の他の蛍光団）に（直接的にか、または間接的にかのいずれかで）連結された目的の抗原である。次に、この細胞集団は、ＦＡＣＳ機器の振動フローチャンバーへ導入される。このチャンバーを出ていく細胞の流れは、シースの緩衝流体（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水））に入れられる。この流れはレーザー光により照射され、そして各々の細胞は蛍光（蛍光標識抗原の結合を示す）について測定される。細胞の流れ内の振動は、細胞の流れを小滴へ細分化し、この小滴は、微小な荷電を帯びる。これらの小滴は、蛍光標識抗原に対するそれらの親和性にしたがって、異なる細胞集団を回収するために、コンピュータ制御下の電気偏向板により導かれ得る。この様式において、目的の抗原に対して異なる親和性を示す細胞集団は、この抗原を結合しない細胞から容易に分離され得る。ＦＡＣＳにおける使用のためのＦＡＣＳ機器および試薬は、世界中の供給源（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはサービス提供者（例えば、Ａｒｉｚｏｎａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｌ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｆａｃｓ／））から広範に利用可能である。
【００５８】
特定の抗原に対する細胞表面タンパク質の親和性にしたがって細胞の集団を分離するために使用され得る、別の方法は、アフィニティークロマトグラフィーである。この方法において、適切な樹脂（例えば、ＣＬ−６００セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）は、適切な抗原に共有結合される。この樹脂は、カラムに封入され、そして細胞の混合集団は、このカラムを通過させられる。適切な時間（例えば、２０分間）のインキュベーション後、未結合の細胞は、（例えば）ＰＢＳ緩衝液を使用して洗い流される。このことは、目的の抗原に結合する免疫グロブリンを発現する細胞の部分集合のみを残す。次に、これらの細胞は、（例えば）過剰量の目的の抗原を使用するか、または樹脂から抗原を酵素的にか、もしくは化学的に切断することにより、このカラムから溶出される。このことは、特異的なプロテアーゼ（例えば、ファクターＸ、トロンビン、または抗原−樹脂複合体に予め取り込まれた適切な切断部位を介してカラムから抗原を切断する、当業者に公知の他の特異的なプロテアーゼ）を使用して行われ得る。代替的に、非特異的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）は、樹脂から抗原を除去するために使用され得、それにより目的の抗原に対する親和性を示した細胞の集団を解放し得る。
【００５９】
本発明は、初めて、標的核酸の遺伝的多様化を調節し得る機構を提供した。本発明者らにより示されるように、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）は、免疫グロブリン遺伝子座において遺伝子変換ならびに過剰変異を調節する因子である。ＡＩＤは、隣接するドナー配列が存在する場合には変換トラクト（ｔｒａｃｔ）を導き、それが存在しない場合には点変異を導く、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントにおいて共通の改変を誘導することが示唆される。したがって、ＡＩＤ発現を調節することにより、両方の事象が調節され得る。好ましい実施形態において、ＡＩＤ遺伝子は、標的核酸を含む細胞において一過的に発現される。例えば、ＡＩＤは、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性遺伝子発現系）下で発現され得る。そうでなければ、遺伝子発現は、誘導性の組換えによるＡＩＤ発現カセットの切除により、停止され得る。ＡＩＤ発現の停止は、標的配列のさらなる多様化を防止する。好ましくは、ＡＩＤ発現は、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する細胞において、この所望の活性の損失を導き得るさらなる変異を防止するために、停止される。
【００６０】
本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００６１】
（１．ＡＩＤは、共通の中間体による免疫グロブリンの遺伝子変換および過剰変異を開始する）
本明細書において、ψＶドナーの除去が、ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０において、ＡＩＤ依存性Ｉｇ過剰変異を活性化することが報告される。このことは、Ｉｇ遺伝子変換および過剰変異が、同一のＡＩＤ惹起性の中間体に由来する競合経路であることを示す。さらに、ψＶノックアウトＤＴ４０は、Ｉｇ過剰変異の分子機構にアプローチするための理想的なモデル系として、そしてインサイチュ突然変異誘発のための新規のツールとして提案される。
【００６２】
（方法）
（細胞株）
ＤＴ４０Ｃｒｅ１（ｖ−ｍｙｂ導入遺伝子に起因して、Ｉｇ遺伝子変換の増大を示し、そしてタモキシフェン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを含む）は、以前に記載されている（Ａｒａｋａｗａら、２００１）。ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−を、ＤＴ４０Ｃｒｅ１の両方のＡＩＤ対立遺伝子の標的破壊により生成した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。ＡＩＤＲを、ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ二重シストロン性カセット（ＡＩＤおよびＧＦＰの両方が、同一のβ−アクチンプロモーターから発現される）の安定的な組み込み後に、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−から取得した。ＡＩＤＲψＶ−を、ｐψＶＤｅｌ１−２５のトランスフェクションによって、ＡＩＤＲから取得した（図１Ａ）。次に、再配列された軽鎖遺伝子座へこの構築物を組み込んだ安定なトランスフェクト体を、遺伝子座特異的ＰＣＲにより同定した。ｐψＶＤｅｌ１−２５の標的組込みは、ψＶ２５の０．４ｋｂ上流から始まり、ψＶ１の１ｂｐ下流で終わるψＶ遺伝子座全体の欠失をもたらす。ＡＩＤＲψＶ部分的を、ｐψＶＤｅｌ３−２５のトランスフェクションにより、ＡＩＤＲψＶ−と同様な方法で生成した。標的組込みによるｐψＶＤｅｌ３−２５のトランスフェクションは、ψＶ２５の０．４ｋｂ上流から始まり、ψＶ３の１ｂｐ下流で終わるψＶ遺伝子座の部分的な欠失を導く。細胞培養およびエレクトロポレーションを、以前に記載されるように実行した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。ＸＲＣＣ３−／−を、ＸＲＣＣ３ノックアウト構築物のトランスフェクションに続いて、ＸＲＣＣ３遺伝子のアミノ酸７２〜１７０を欠失させることにより、ＤＴ４０Ｃｒｅ１から取得した。まず標的組込みの生じたクローンを、ロングレンジＰＣＲにより同定し、そして次に、このＸＲＣＣ３欠失を、サザンブロット分析により確認した。
【００６３】
（Ｉｇ復帰変異アッセイ）
サブクローニング、抗体染色、フローサイトメトリーおよびｓＩｇＭ発現の定量化は、以前に記載されている（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。この研究で使用された全てのクローンは、遺伝子変換事象による元のＣ１１８（−）改変体（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅら、１９９０）の軽鎖のフレームシフトの修復に起因して、ｓＩｇＭ（＋）であった。
【００６４】
（ＰＣＲ）
ＰＣＲに誘発される人工的な変異を最小化するために、ＰｆｕＵｌｔｒａホットスタートポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、配列決定前の増幅のために使用した。ロングレンジＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＩｇ軽鎖配列決定を、以前に記載されるように実行した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。Ｉｇ軽鎖プラスミドクローンのプロモーター領域およびＪ−Ｃイントロン領域を、Ｍ１３順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーおよびＭ１３逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを使用して配列決定した。Ｂｕ−１遺伝子およびＥＦ１α遺伝子を、それぞれ以下のプライマーの対を使用して増幅した：
【００６５】
【化１】
これらの遺伝子のＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターへクローニングし、そしてＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決定した。
【００６６】
（結果）
（再配列された軽鎖遺伝子座におけるψＶドナー配列の標的欠失（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ））
２つのψＶノックアウト構築物を、ゲノム配列をクローニングすることにより調製した。このゲノム配列は、意図される欠失の末端の地点（ｌｏｘＰに挟まれたｇｐｔ（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）カセット（Ａｒａｋａｗａら、２００１）の上流および下流）に隣接する。標的組込みにおいて、第一の構築物（ｐψＶＤｅｌ１−２５）は全ての偽遺伝子（ψＶ２５〜ψＶ１）を欠失させる一方で、第二の構築物（ｐψＶＤｅｌ３−２５）は大半の偽遺伝子（ψＶ２５〜ψＶ３）を欠失させる（図１Ａ）。表面ＩｇＭ陽性（ｓＩｇＭ（＋））クローン（ｌｏｘＰに挟まれたＡＩＤ−ＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）−ＧＦＰ導入遺伝子のトランスフェクションおよび安定的な組み込みにより、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−細胞（Ａｒａｋａｗａら、２００２）から取得した）を、ψＶノックアウト構築物のトランスフェクションのために選択した。このＡＩＤ再構成クローン（ＡＩＤＲと名づけた）は、有害なＩｇ軽鎖の変異の出現が、ｓＩｇＭの発現の欠失により容易に検出され得、そして、ＧＦＰ標識されるＡＩＤ発現が、ＤＴ４０Ｃｒｅ１から受け継がれたＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子のタモキシフェン誘導後に停止され得るという利点を有する（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。
【００６７】
ＡＩＤＲクローンへのψＶノックアウト構築物のトランスフェクション後、再配列された軽鎖遺伝子座の標的欠失を含むミコフェノール酸耐性クローンを同定した。これらの初代ψＶノックアウトクローンは、２つのｌｏｘＰに挟まれた導入遺伝子（再配列された軽鎖遺伝子座内に挿入されたｇｐｔマーカー遺伝子およびＡＩＤＲ前駆体クローンのＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子）を含む。ｇｐｔ遺伝子は、隣接する転写またはクロマチン構造を撹乱させ得るので、初代ψＶノックアウト体を、低濃度のタモキシフェンに曝露し、次に限界希釈によりサブクローニングした。この方法では、二次的なψＶノックアウトクローンが、単離され得、これらは、ｇｐｔ遺伝子のみが欠失しているか（ＡＩＤＲψＶ−およびＡＩＤＲψＶ部分的）、またはｇｐｔ遺伝子とともにＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子が欠失している（ＡＩＤ−／−ψＶ−およびＡＩＤ−／−ψＶ部分的）かのいずれかである。再配列された軽鎖遺伝子座におけるψＶ遺伝子の破壊およびＡＩＤ過剰発現カセットの除去を、それぞれサザンブロット分析（図１Ｂ）およびＰＣＲ（図１Ｃ）により確かめた。
【００６８】
（ＡＩＤ陽性クローンにおけるψＶ遺伝子の欠失後のｓＩｇＭ発現の減少の拡大）
有害なＩｇ変異の比率を推定するために、ＤＴ４０Ｃｒｅ１、ＡＩＤＲ、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−およびψＶノックアウトクローンの各々２４サブクローンについての２週間の培養後、ｓＩｇ発現を、ＦＡＣＳにより測定した（図２Ａおよび２Ｂ）。インタクトなψＶ遺伝子座を有するコントロールの分析は、ＤＴ４０Ｃｒｅ１およびＡＩＤＲサブクローンに対してそれぞれ平均０．５２％および平均２．２７％がｓＩｇＭ（−）細胞であるが、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−に対しては、わずか０．０８％がｓＩｇＭ（−）細胞であることを明らかにした。自然発生したｓＩｇＭ（−）ＤＴ４０改変体の以前の分析は、約３分の１が、再配列された軽鎖Ｖセグメントにおいてフレームシフト変異を含み、これは、Ｉｇ遺伝子変換活性の副産物としてみなされたことを示した（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅら、１９９０）。現在、この考えは、ＡＩＤ陰性ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−クローン（Ｉｇ遺伝子変換活性を失っているはずである）が安定的にｓＩｇＭ（＋）であり続けるという知見により支持される。最も興味深いことに、ＡＩＤ陽性ψＶノックアウトクローン（ＡＩＤＲψＶ部分的およびＡＩＤＲψＶ−）のサブクローンは、ｓＩｇＭ（−）集団を急速に蓄積する一方で、ＡＩＤ陰性ψＶノックアウトクローン（ＡＩＤ−／−ψＶ部分的およびＡＩＤ−／−ψＶ−）のサブクローンは、ｓＩｇＭ（＋）を維持する（図２Ａおよび２Ｂ）。このことは、偽遺伝子の欠失が、ＡＩＤ発現細胞において、有害な軽鎖の変異の比率を劇的に増大することを示唆する。
【００６９】
（ψＶドナーが無い状態での、過剰変異によるＩｇ遺伝子変換の置き換え）
新規に同定された変異活性を分析するために、ψＶノックアウトクローンの再配列された軽鎖ＶＪセグメントを、サブクローニングから５〜６週間後に、配列決定した。全部で１３５ヌクレオチドの変更（図４Ａ、表１）を、ＡＩＤＲψＶ−クローン由来の９５個の配列内のＶリーダーとＪ−Ｃイントロンの５’端との間の０．５ｋｂの領域において見出した（図３、参照配列の上）。野生型ＤＴ４０細胞に見られる変換トラクトとは対照的に、ほぼ全ての変更は、単一の塩基置換であり、少数の短い欠失およびジヌクレオチド変更以外に、変異のクラスターは観察されなかった。再配列されていない軽鎖遺伝子座のψＶ遺伝子をなお含むＡＩＤＲψＶ−における変換の事象の欠如は、Ｉｇ遺伝子変換が、再配列された軽鎖遺伝子の多様化のために、同一の染色体上のψＶ遺伝子のみを補充することを確かにした（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９０）。ＡＩＤ−／−ψＶ−クローン由来の９５個の軽鎖遺伝子配列の収集物において、配列の多様性は見出されなかった（図４Ａ、表１）。このことは、ＡＩＤが変異活性のために必要とされることを示す。
【００７０】
ＡＩＤＲψＶ部分的クローンに由来する配列は、たまに、残存するψＶ１およびψＶ２により起因され得る変異のストレッチを示す（図３、参照配列の下）。それにもかかわらず、ＡＩＤＲψＶ部分的の変異の大部分は、ＡＩＤＲψＶ−細胞により見られるような、単一の鋳型されない塩基置換である（図４Ａ、表１）。おそらくＰＣＲアーチファクトである３塩基置換のみが、ＡＩＤ−／−ψＶ部分的クローンの９２個の配列において見出された。このことは、遺伝子変換およびＡＩＤＲψＶ部分的の変異活性の両方がＡＩＤ依存的であることを確かにした。
【００７１】
（ψＶノックアウトクローンの新規の変異活性は、体細胞の過剰変異に酷似する）
ψＶノックアウトクローンにおいて発見された単一のヌクレオチド置換が優勢なＩｇ変異活性は、体細胞の過剰変異がＩｇ遺伝子変換にとって替わったことを示唆する。しかしながら、ＡＩＤＲψＶ部分的クローンおよびＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるヌクレオチド置換と胚芽中心のＢ細胞におけるＩｇ過剰変異との間に相違がある。ここで、これらのクローンは、Ａ／Ｔ塩基においてほとんど変異を示さず、トランスバージョン変異への偏りを示す（図４Ｂ）。
【００７２】
代表的に、Ｉｇ過剰変異は、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）への偏りを伴って、転写された遺伝子の配列の１ｋｂ以内に限局化する一方で、Ｃ領域の下流において変異が存在しないか、または少数の変異が存在する（ＬｅｂｅｃｑｕｅおよびＧｅａｒｈａｒｔ、１９９０）。ＡＩＤＲψＶ−クローンにおける変異が同様の分布に従うか否かを調べるために、配列分析を、再配列された軽鎖遺伝子のプロモーター領域およびＪ−Ｃイントロンまで拡大した（図５）。変異は、プロモーターの近傍およびＪセグメントの下流のイントロン内において見出されるが、頻度のピークは、明らかにＣＤＲ１およびＣＤＲ３（これらはまた、ＤＴ４０における遺伝子変換が生じやすい部位である）と一致する（未公開結果）。全点変異のおよそ半分が、ＲＧＹＷ（Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｗ＝Ａ／Ｔ）配列モチーフ内またはその相補的なＷＲＣＹ内に収まる（図４Ｃ）。これらは、ヒトおよびマウスにおけるＩｇ過剰変異のホットスポットとして公知である。
【００７３】
ＲＡＤ５１パラログの欠失が、ＤＴ４０においてＩｇ過剰変異を誘導することが以前に報告された（Ｓａｌｅら、２００１）。ψＶ遺伝子陰性バックグラウンドおよびＲＡＤ５１パラログ陰性バックグラウンドにおいて過剰変異活性を比較するために、ＸＲＣＣ３遺伝子を、ＤＴ４０Ｃｒｅ１クローンにおいて破壊し、そして再配列されたＶＪ遺伝子を、サブクローニングから６週間後に配列決定した。ＡＩＤＲψＶ−クローンにおける変異スペクトルおよび以前に報告されたもの（Ｓａｌｅら、２００１）と類似して、ＸＲＣＣ３−／−細胞由来の配列における変異は、トランスバージョンへの偏りおよびＡ／Ｔ塩基における変異の欠如を示す（図４Ｂ）。それでもなお、ＸＲＣＣ３変異体における変異率は、ＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるものの約１／２．５倍、そして野生型ＤＴ４０およびＡＩＤＲψＶ−クローンと比較すると、ＸＲＣＣ３変異体は、明らかに増殖の遅い表現型であった（図４Ｄ）。
【００７４】
ＡＩＤＲψＶ−クローンにおいて、ｓＩｇＭの発現の欠失をもたらす変異を同定するために、選別されたｓＩｇＭ（−）細胞由来の９４個の軽鎖ｃＤＮＡを増幅し、配列決定した。この収集物において、１つの短い挿入および５つの欠失が検出された（表１）が、２４５個の全ての変異のうちの８９％は、ＶＪセグメント内の単一ヌクレオチド置換である（図５）。驚くべきことに、ほんの約１０％の配列が、停止コドンまたはフレームシフトを含み、ｓＩｇＭ（−）発現の欠失が主に、Ｉｇ軽鎖タンパク質およびＩｇ重鎖タンパク質の対合に影響するアミノ酸置換によりもたらされることを示唆した。
【００７５】
（過剰変異のＩｇ遺伝子座特異性）
線維芽細胞（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、２００２）およびＢ細胞ハイブリドーマ（ＭａｒｔｉｎおよびＳｃｈａｒｆｆ、２００２）におけるＡＩＤの高発現が、トランスフェクトされた導入遺伝子において頻繁な変異を誘導することが報告されている。偽遺伝子の欠失が全体的な過剰変異性の表現型を誘導したことを除外するために、Ｂ細胞特異的マーカーＢｕ−１および翻訳延長因子ＥＦ１αをコードする遺伝子の５’端を、ＡＩＤＲψＶ−クローンについて配列決定した。唯一の１ｂｐ欠失のみが、Ｂｕ−１遺伝子の９５個の配列内において見出され、そして２つの単一ヌクレオチド置換がＥＦ１αの８９個の配列内において見出された（表１）。これらの変更は、多分ＰＣＲアーチファクトを示すので、このことは、ψＶ欠失により誘導される過剰変異がＩｇ遺伝子座特異的であるという考えをさらに支持する。
【００７６】
（考察）
これらの結果は、偽遺伝子近傍のドナーの欠失が、ＤＴ４０においてＩｇ遺伝子変換を無効にし、かつ、Ｉｇ過剰変異に酷似する変異活性を活性化することを示す。この新規の活性と体細胞の過剰変異との間で共有される特徴としては以下が挙げられる：１）ＡＩＤ依存性、２）単一ヌクレオチド置換が優勢であること、３）５’転写領域内の変異の分布、４）ホットスポットについての偏り、および５）Ｉｇ遺伝子特異性。インビボにおけるＩｇ過剰変異についての相違は、Ａ／Ｔ塩基における変異が相対的に欠如していること、およびψＶノックアウトクローンにおいてトランスバージョン変異が優勢であることのみである。しかしながら、この相違はまた、過剰変異性ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株（ＢａｃｈｌおよびＷａｂｌ、１９９６；Ｆａｉｌｉら、２００２）およびＲＡＤ５１パラログのＤＴ４０変異体（Ｓａｌｅら、２００１）においても見られ、このことは、Ｉｇ過剰変異性の活性の一部が、形質転換されたＢ細胞株において失われていることを示す。興味深いことに、ＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるＩｇ過剰変異の比率は、ＤＴ４０Ｃｒｅ１の祖先におけるＩｇ遺伝子変換の比率よりも高いようである。このことに対する説明は、数個の変換トラクトが、同一のドナーおよび標的配列のストレッチに限定され、したがって何の痕跡も残さないことであり得る。
【００７７】
Ｉｇ遺伝子変換のブロックによるＩｇ過剰変異の誘導は、どのようにして過剰変異と組換えとが開始され、そして調節されるかを説明する単純なモデルを支持する（図６）。これらの事象の始めには、ＡＩＤにより直接的または間接的のいずれかで誘導される、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントの改変がある。近傍のドナーの欠如または高い相同組換え活性の欠如において、この損傷部位の初期設定のプロセシングは、単一ヌクレオチド置換の形態でのＩｇ過剰変異を誘導する（図６、右側）。しかしながら、ドナー配列が利用可能である場合、ＡＩＤにより誘導された損傷部位のプロセシングは、Ｉｇ過剰変異へのシフトが依然として可能である、鎖の交換前の段階、およびＩｇ遺伝子変換に向かう方針が定まった、鎖の交換後の段階に分かれ得る（図６、左側）。この第一の段階の完成は、ＲＡＤ５１パラログの関与を必要とする一方で、この第二の段階には、ＲＡＤ５４タンパク質のような他の組換え因子が関与する。
【００７８】
方針におけるこの相違は、なぜ、ＲＡＤ５１パラログの破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させるだけではなく、Ｉｇ過剰変異を誘導する（Ｓａｌｅら、２００１）一方で、ＲＡＤ５４遺伝子の破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させる（Ｂｅｚｚｕｂｏｖａら、１９９７）のみであるのかを説明する。このモデルはまた、細胞の相同組換え活性が低いことが、変換ドナーの存在下においてさえもＩｇ遺伝子変換を防止することを予測する。このような相同組換えの低い活性は、ヒトＢ細胞およびマウスＢ細胞が、再配列されていないＶセグメントの形態の近接する候補ドナーが存在するにもかかわらず、Ｉｇ遺伝子変換を決して使用しないこと、ならびに胚芽中心のＢ細胞が、Ｉｇ遺伝子変換からＩｇ過剰変異へシフトしたことの理由になり得る（Ａｒａｋａｗａら、１９９８）。
【００７９】
ＡＩＤＲおよびψＶノックアウトＤＴ４０クローンは、Ｉｇ遺伝子変換および過剰変異に対するトランス作用性因子およびシス作用性調節配列の役割に対処するための強力な実験系である。代替的な動物系または細胞培養系と比較して、この系は、以下の利点を提供する：１）Ｉｇ遺伝子変換およびＩｇ過剰変異の平行分析、２）条件的なＡＩＤ発現、３）遺伝子ターゲティングによる簡単なゲノム改変、４）正常な細胞増殖および修復効率、ならびに５）過剰変異のＩｇ遺伝子座特異性。ＤＴ４０細胞株において、遺伝子特異的な過剰変異を誘導する能力はまた、生物工学において用途を見出し得る。１つの可能性は、ニワトリの抗体をコードする領域をそのヒトの対応するものと置き換え、次いで、Ｉｇ過剰変異により継続的に発達するレパートリー由来の抗体親和性の成熟を刺激することである。
【００８０】
（２．遺伝子変換および過剰変異による、ＧＦＰのインビボ標的変異誘発）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子は、本発明の細胞系（特にＤＴ４０細胞株）を使用して遺伝的に多様化され得る標的核酸の一例である。標的組込みによりＩｇ軽鎖遺伝子座に挿入されたＧＦＰ遺伝子は、過剰変異に供され、そして色、強度および半減期に関するその活性は、時間とともに発達する（図７Ｂ）。過剰変異と遺伝子変換との組み合わせが、これらのＧＦＰ活性を改変するために使用される場合、ＧＦＰに対する遺伝子変換ドナーとしての役割を果たし得る改変ＧＦＰ配列もまた、Ｉｇ遺伝子座に挿入される（図７Ｄ）。
【００８１】
Ｉｇ軽鎖ＶＪ遺伝子を任意の核酸標的により置き換えることを可能にするＩｇ ＶＪ置換ベクター（ｐＶｊＲｅｐＢｓｒ）が、図７Ａに示される。変異誘発に対する潜在的な標的は、ＳｐｅＩ部位（ＸｂａＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＡｖｒＩＩ部位およびＳｐｅＩ部位と互換性である）へクローニングされ得る。例えば、ＧＦＰ遺伝子は、ｐＶｊＲｅｐＢｓｒを使用する標的組込みによりＩｇ軽鎖遺伝子座に挿入され得る。Ｉｇ ψＶ遺伝子の軽鎖遺伝子座を任意の核酸標的により置き換えることを可能にするψＶ遺伝子ドナー置換ベクター（ｐＰｓｅｕｄｏＲｅｐＢｓｒ）が、図７Ｃに示される。強力な遺伝子変換ドナーは、ＮｈｅＩ部位またはＳｐｅＩ部位（ＸｂａＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＡｖｒＩＩ部位およびＳｐｅＩ部位と互換性である）のいずれかへクローニングされ得る。ＮｈｅＩ部位は、２つのｌｏｘＰの間に位置するため、この部位は、条件的なノックアウト設計のために使用され得る。ｐＰｓｅｕｄｏＲｅｐＧｐｔおよびｐＶｊＲｅｐＢｓｒを使用する段階的な標的組込みにより、ψＶ遺伝子は、ψＧＦＰ遺伝子およびその改変体（例えば、ψＣＦＰ：青色蛍光タンパク質およびψＹＦＰ：黄色蛍光タンパク質）により置き換えられ得、そしてＶＪ遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子の遺伝的多様化をモニターするためのフレームシフト変異を保有するＧＦＰ（ＦｓＧＦＰ）により置き換えられ得る。ＦｓＧＦＰにおけるフレームシフトは、テンプレートとしてのψＧＦＰ、ψＣＦＰおよびψＹＦＰの遺伝子変換により修復されることが予想される。加えて、この遺伝子は、さらに過剰変異により多様化される。
【００８２】
【化２】
【００８３】
【化３】
【００８４】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体産生細胞における免疫グロブリンの遺伝子変換と過剰変異との間の関連性を利用することによる、標的核酸配列または遺伝子産物の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のための方法、ならびに上記遺伝的多様化が可能な細胞および細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子産物において多様性を生成するための多くのアプローチは、非常に多くの変異の生成に依存し、次にこれらの変異は、強力な選択技術を使用して選択される。しかしながら、これらの系は、多くの不都合を有する。突然変異誘発が、遺伝子構築物に対してインビトロで行われ、続いて、この遺伝子構築物が、インビトロで発現されるか、または細胞もしくは動物において導入遺伝子として発現される場合、生理的な状況における遺伝子発現は困難であり、そして変異体のレパートリーはそのうち固定される。一方、突然変異誘発が、生細胞において実行される場合、望ましい標的核酸へ変異を指向することが困難である。それゆえ、十分な効率を有する変異および選択のサイクルを反復することにより、亢進された活性を有する分子を単離する効率は、制限される。さらに、インビボでの無秩序な突然変異誘発は、毒性があり、そして高レベルの望ましくない二次変異を誘発するようである。
【０００３】
自然状態では、選択された核酸配列の指向的多様化は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントにおいて生じる。抗体特異性の一次的なレパートリーは、免疫グロブリンＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの接合を伴うＤＮＡ再配列のプロセスにより生成される。抗原接触に続いて、Ｂ細胞（その表面のＩｇが、この抗原に低い親和性または中程度の親和性で結合し得る）における再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントは、過剰変異による第二波の多様化に供される。この、いわゆる体細胞過剰変異は、二次的なレパートリーを生成する。その結果、増大した結合特異性が、選択され、体液性免疫応答の親和性の成熟を可能にする（非特許文献１）。
【０００４】
顕著な多様性が、無秩序な組み合わせによって、この段階において創出されるように、マウスおよびヒトの免疫グロブリン遺伝子座は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列に関与し得るＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの大規模なプールを含む。他の種（例えば、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジおよびブタ）は、それらの一次的なＩｇレパートリーを発達させるために、異なる戦略を使用する（非特許文献２）。単一機能のＶセグメントおよびＪセグメントの再配列後、ニワトリの軽鎖の遺伝子のさらなる多様化が、特化したリンパ系器官（ファブリーキウス嚢）における遺伝子変換により生じる（非特許文献３；非特許文献４）。このプロセスの間、非機能的な偽Ｖ遺伝子由来の配列のストレッチは、再配列されたＶ遺伝子に転移される。２５個の偽Ｖ遺伝子が、機能的なＶ遺伝子の上流に位置し、そしてＶ遺伝子と配列相同性を共有する。ヒトおよびマウスにおける状況と同様に、抗原接触後の親和性の成熟は、ニワトリの脾性胚芽中心における過剰変異により生じる（非特許文献５）。
【０００５】
Ｉｇレパートリー形成の３つ全てのＢ細胞特異的な活性−遺伝子変換（非特許文献６）、過剰変異およびアイソタイプスイッチ組換え（非特許文献７；非特許文献８）−は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）遺伝子の発現を必要とする。ＡＩＤはＤＮＡ編集酵素であることが最初に提唱された（非特許文献９）が、より最近の研究は、ＡＩＤが、シトシンからウラシルへの脱アミノ作用によりＤＮＡを直接修飾することを示唆する（非特許文献１０）。しかしながら、その型において相違はあるものの、ＡＩＤ誘発ＤＮＡ修飾の位置およびプロセスは、異なる種およびＢ細胞の環境において、組換えまたは過剰変異の選択的な発生を説明し得るので、このシトシン脱アミノ活性は、さらに調節されるはずである。特定のＡＩＤ変異がスイッチ組換えに影響するが、体細胞過剰変異には影響しないという知見に基づいて、ＡＩＤが、スイッチ組換えを開始するために補因子の結合を必要とすることが示唆された（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００６】
ＤＴ４０ノックアウト変異の分析は、ＲＡＤ５４遺伝子（非特許文献１３）およびＲＡＤ５２組換え修復経路の他のメンバーが、効率的なＩｇ遺伝子変換のために必要とされることを示唆する（非特許文献１４）。ＲＡＤ５１アナログおよびＲＡＤ５１パラログの破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させ、そして再配列された軽鎖の遺伝子における過剰変異を誘導する（非特許文献１４）。このことは、相同組換えによるＤＮＡ修復における欠陥は、Ｉｇ遺伝子変換から過剰変異へシフトし得ることを示唆する。
最近、免疫グロブリン遺伝子座における体細胞過剰変異の現象を利用して、恒常的かつ直接的な様式で標的遺伝子の変異を生成する、最初の細胞系が開発された。これらの細胞系は、変異の発生と選択との循環的な工程により、所望の活性を有する遺伝子産物を調製することを可能にする。それゆえ、特許文献１および特許文献２は、特定の核酸領域の指向性の恒常的な過剰変異が可能なヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）を記載する。これらの変異領域は、内因性の再配列されたＶセグメント、または過剰変異を指向する制御配列へ作動可能に連結された外因性の遺伝子であり得る。トランスフェクトされる構築物が、主に、染色体の位置に無秩序に挿入されるので、この細胞系の顕著な不都合は、ヒト細胞が、標的組込みにより効率的に遺伝子操作され得ないことである。
特許文献２はまた、Ｉｇ遺伝子座において遺伝的多様性を生成するための別の細胞系も記載し、この細胞系は、ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０に基づく。ＤＴ４０は、細胞培養の間、再配列された軽鎖免疫グロブリン遺伝子の遺伝子変換を継続する（非特許文献１５）。重要なことに、この細胞株は、トランスフェクトされる構築物の無秩序な組換えに対する標的組込みの高い比を有し、それゆえ、効率的な遺伝子操作を可能にする（非特許文献１６）。特許文献２によれば、相同組換えおよびＤＮＡ修復に関連するＲＡＤ５１遺伝子のパラログのＤＴ４０における欠失は、遺伝子変換の低下と再配列されたＶセグメントの過剰変異の併発的な活性化とを導く。しかしながら、この系の主要な不都合は、変異細胞が、Ｘ線感受性および染色体の不安定性により示されるようなＤＮＡ修復の欠陥を有することである。これらの変異体はまた、低い増殖速度および低い遺伝子ターゲティング効率も有する。したがって、この系は効率的な遺伝子多様化および選択のために適切ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／０２２１１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１００９９８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．およびＲａｄａ Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、第２版、１９９５年、ｐ．５７〜８１
【非特許文献２】Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊ．Ｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂ−ｃｅｌｌ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ．Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９９８年、１７、ｐ．４３〜７０
【非特許文献３】Ｒｅｙｎａｕｄ、Ｃ−Ａ．ら、Ａ ｈｙｐｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｃｅｌｌ、１９８７年、４８、ｐ．３７９〜３８８
【非特許文献４】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．およびＢｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ−Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｕｒｓａｌ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＤＴ４０ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、印刷中
【非特許文献５】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｈｙｐｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｎｇｏｉｎｇ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｐｌｅｎｉｃ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６年、１５、ｐ．２５４０〜２５４６
【非特許文献６】Ａｒａｋａｗａ、Ｈ．ら、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ）Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２年、２９５、ｐ．１３０１〜１３０６
【非特許文献７】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ、Ｍ．ら、Ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ），ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｃｅｌｌ、２０００年、１０２、ｐ．５５３〜５６３
【非特許文献８】Ｒｅｖｙ、Ｐ．ら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ） ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒ−ＩｇＭ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ、２０００年、１０２、ｐ．５６５〜５７５
【非特許文献９】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ、Ｍ．ら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ），ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ−ｅｄｉｔｉｎｇ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４、ｐ．１８４７０〜１８４７６
【非特許文献１０】Ｄｉ Ｎｏｉａ、Ｊ．およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｕｒａｃｉｌ−ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１９、ｐ．４３〜４８
【非特許文献１１】Ｔａ Ｖ．Ｔ．ら、ＡＩＤ ｍｕｔａｎｔ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３年、４、ｐ．８４３〜８４８
【非特許文献１２】Ｂａｒｒｅｔｏ、Ｖ．ら、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤ ｕｎｃｏｕｐｌｅｓ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００３年、１２、ｐ．５０１〜５０８
【非特許文献１３】Ｂｅｚｚｕｂｏｖａ、Ｏ．ら、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｘ−ｒａｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ａ ＲＡＤ５４−／− ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ＤＴ４Ｏ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｃｅｌｌ、１９９７年、８９、ｐ．１８５〜１９３
【非特許文献１４】Ｓａｌｅ、Ｊ．Ｅ．ら、Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＸＲＣＣ２／３ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１２、ｐ．９２１〜９２６
【非特許文献１５】Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ−Ｍ．ら、Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｉｎ ａｎ ＡＬＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０年、９、ｐ．９２１〜９２７
【非特許文献１６】Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ、Ｊ．Ｍ．およびＴａｋｅｄａ、Ｓ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １９９１年１０月４日 ６７（１）：ｐ．１７９〜８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、先行技術の系の不都合を克服し、そして、なおさらなる利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の第一の局面において、過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有する遺伝的に改変されたリンパ系細胞が提供される。この細胞は、ＲＡＤ５１遺伝子（重要な相同組換え因子をコードする）のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない。詳しくは、この細胞は、野生型の相同組換え因子を含む。インタクトな相同組換え機構のため、本発明に記載の細胞は、高効率の組換えおよび高精度の修復を有し、そして通常の速度で増殖する。
【００１１】
本発明の細胞は、免疫グロブリンのレパートリーを発達させるために遺伝子変換の機構を使用する動物種から得られる、免疫グロブリンを発現するＢリンパ球である。これらの種は、例えば、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウサギである。好ましくは、この細胞は、ニワトリの嚢リンパ腫から得られる。最も好ましくは、この細胞は、ＤＴ４０細胞株から得られるか、またはＤＴ４０細胞株に関連する。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明に記載の細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化を可能にする。標的核酸は、タンパク質をコードし得るか、または調節活性を保持する。タンパク質の例は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、レセプタータンパク質またはそれらの一部である。好ましい実施形態において、この標的核酸は、再配列されたヒト免疫グロブリン遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊセグメントである。調節性の核酸の例は、転写調節エレメントまたはＲＮＡｉ配列である。
【００１３】
標的核酸が、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより多様化される一実施形態において、本発明に記載の細胞は、標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、この標的核酸は、遺伝的多様化を指向する制御核酸配列へ作動可能に連結された外因性の核酸である。
【００１５】
さらなる実施形態において、この標的核酸は、本発明に記載の細胞において、所望の活性を示す細胞の選択を促進する様式で発現される。この選択は、細胞内の、細胞表面上または細胞外における、標的核酸の活性に対する直接的な選択であり得る。代替的に、この選択は、レポーター核酸の活性に対する間接的な選択であり得る。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明に記載の細胞において、標的核酸の遺伝的な多様化を調節する遺伝的手段を提供する。この調節は、シス作用性調節配列の改変、遺伝子変換ドナーの数を変更すること、またはトランス作用性調節因子（例えば、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）またはＲＡＤ５１のアナログもしくはパラログ以外のＤＮＡ修復因子もしくはＤＮＡ組換え因子）の改変によるものであり得る。好ましくは、この細胞は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）を条件的に発現する。
【００１７】
第二の局面において、本発明に記載の細胞から得られる細胞株が提供される。好ましい実施形態において、この細胞株はＤＴ４０またはその改変物である。
【００１８】
第三の局面において、過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有するリンパ系細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。上記トランスジェニック非ヒト動物において、この細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない。そして、この細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせによりトランスジェニック標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である。好ましい実施形態において、この動物はニワトリである。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能な細胞を調製するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的核酸を含む遺伝学的構築物により、遺伝子変換が可能なリンパ系細胞をトランスフェクトする工程、および（ｂ）内因性Ｖ遺伝子セグメントの一部がこの標的核酸に置き換えられた内因性Ｖ遺伝子セグメントを有する細胞を同定する工程。
【００２０】
さらなる実施形態によれば、この標的核酸を含む遺伝学的構築物はさらに、標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む。標的核酸を含む遺伝子座は、この遺伝子座の異なる構成要素を含む構築物による単回のトランスフェクションまたは複数回のトランスフェクションにより構築され得る。
【００２１】
所望の活性を有する細胞に対する選択が間接的である実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を包含する：（ｃ）この標的核酸により影響され得るレポーター遺伝子を含むさらなる遺伝学的構築物により、工程（ｂ）由来の細胞をトランスフェクトする工程。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、さらに（ｄ）トランス作用性調節因子を条件的に発現させる工程を包含する。好ましい実施形態において、このトランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である。
【００２３】
特に好ましい実施形態によれば、この標的核酸は、標的組込みにより細胞に挿入される。
【００２４】
さらなる局面において、所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的核酸を発現するために適切な条件下で、本発明に記載の細胞を培養する工程、（ｂ）細胞の集団中で、所望の活性を有する変異遺伝子産物を発現する細胞を同定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において同定された細胞由来の１つ以上のクローンの細胞集団を樹立する工程、ならびに、このクローン集団から、改善された所望の活性を有する遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程。
【００２５】
一実施形態において、工程（ｂ）および工程（ｃ）は、最適化された所望の活性を有する遺伝子産物が産生されるまで反復的に繰り返される。
【００２６】
さらなる実施形態によれば、最適化された所望の活性を有する遺伝子産物を産生する細胞が同定された場合、遺伝的多様化は、例えば、トランス作用性調節因子の発現のダウンレギュレーションにより、停止され得る。このトランス作用性調節因子は、例えば、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）または、ＲＡＤ５１のパラログもしくはアナログ以外の、相同組換えもしくはＤＮＡ修復に関与する因子であり得る。
【００２７】
別の実施形態において、標的核酸の多様化は、さらに、標的配列の最適化（例えば、Ｉｇ過剰変異のホットスポットの導入またはＧＣ含量の増加）により改変される。
本発明のさらなる局面において、所望の活性を有する遺伝子産物の調製のための、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能な細胞の使用が提供される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有する、遺伝的に改変されたリンパ系細胞であって、該細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さない、細胞。
（項目２）
野生型の相同組換え活性を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
影響されていない増殖速度を有する、項目１または２に記載の細胞。
（項目４）
高精度のＤＮＡ修復能を有する、項目１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５）
免疫グロブリンを発現するＢ細胞である、項目１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６）
ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはウサギ由来である、項目１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７）
ニワトリの嚢リンパ腫細胞である、項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８）
ＤＴ４０細胞またはその派生物である、項目１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目９）
活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）を発現する、項目１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか一項に記載の細胞であって、該細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である、細胞。
（項目１１）
前記標的核酸は、タンパク質をコードするか、または調節活性を発揮する、項目１０に記載の細胞。
（項目１２）
前記標的核酸は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、レセプタータンパク質またはそれらの一部をコードする、項目１１に記載の細胞。
（項目１３）
前記標的核酸は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子、またはその一部である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記標的核酸は、転写調節エレメントまたはＲＮＡｉ配列を含む、項目１１に記載の細胞。
（項目１５）
さらに、前記標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る、少なくとも１つの配列を含む、項目１０〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１６）
前記標的核酸は、標的組込みにより、染色体の所定の位置へ組み込まれる、項目１０〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１７）
前記標的核酸は、遺伝的多様化を指向する制御核酸配列へ作動可能に連結される、項目１１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１８）
所望の活性を有する前記標的核酸の変異体を含む細胞の選択を促進する様式で、該標的核酸を発現する、項目１１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１９）
前記選択は、前記細胞内、該細胞表面上または該細胞外における、該細胞内の前記標的核酸の活性に対する直接的な選択である、項目１８に記載の細胞。
（項目２０）
前記選択は、レポーター核酸の活性に対する間接的な選択である、項目１８に記載の細胞。
（項目２１）
遺伝子変換および過剰変異による前記標的核酸の遺伝的多様化は、遺伝子操作により調節される、項目１０〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２２）
前記調節は、シス作用性調節配列によるものである、項目２１に記載の細胞。
（項目２３）
前記調節は、遺伝子変換ドナーの数、方向、長さまたは相同性の程度を変更することによるものである、項目２０または２２に記載の細胞。
（項目２４）
前記調節は、トランス作用性調節因子によるものである、項目２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２５）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記トランス作用性調節因子は、ＲＡＤ５１のパラログまたはアナログ以外のＤＮＡ修復因子またはＤＮＡ組換え因子である、項目２４に記載の細胞。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項に記載の細胞から得られる細胞株。
（項目２８）
過剰変異によって完全にか、または部分的に置き換えられた遺伝子変換を有するリンパ系細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該細胞は、ＲＡＤ５１タンパク質のパラログおよびアナログをコードする遺伝子において有害な変異を有さず、そして、該細胞は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせによりトランスジェニック標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化が可能である、トランスジェニック非ヒト動物。
（項目２９）
過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、標的核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化を可能にする細胞を調製するための方法であって、該方法は、ａ）該標的核酸を含む遺伝学的構築物により、遺伝子変換が可能なリンパ系細胞をトランスフェクトする工程、および（ｂ）該標的核酸により置き換えられた、内因性Ｖ遺伝子またはそのフラグメントを有する細胞を同定する工程、を包含する、方法。
（項目３０）
前記標的核酸を含む遺伝学的構築物は、前記標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして働き得る少なくとも１つの核酸をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記標的核酸を含む遺伝子座は、複数回のトランスフェクションにより構築される、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
さらに、（ｃ）前記標的核酸により影響され得るレポーター遺伝子を含むさらなる遺伝学的構築物により、前記工程（ｂ）由来の細胞をトランスフェクトする工程、を包含する、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
さらに、（ｄ）トランス作用性調節因子を条件的に発現させる工程を包含する、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標的核酸は、標的組込みにより、前記細胞の染色体の特定の位置に挿入される、項目２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）標的核酸を発現するために適切な条件下で、項目１１〜２６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の集団中で、細胞所望の活性を有する変異遺伝子産物を発現する細胞を同定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において同定された細胞由来の１つ以上のクローンの細胞集団を樹立する工程、ならびに、該クローン集団から、改善された所望の活性を有する遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程
を包含する、方法。
（項目３７）
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）は、反復的に繰り返される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
さらに、遺伝的多様化を停止する工程を包含する、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記標的核酸の多様化は、さらに、標的配列の最適化により改変される、項目３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝的多様化は、トランス作用性調節因子の発現のダウンレギュレーションにより停止される、項目３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記トランス作用性調節因子は、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための、項目１０〜２６のいずれか一項に記載の細胞または項目２７に記載の細胞株の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（図１．ψＶ遺伝子欠失）（Ａ）ニワトリの再配列されたＩｇ軽鎖遺伝子座およびψＶノックアウト構築物の物理的地図。この遺伝子座は、機能的なＶセグメントの上流の全２５個のψＶ遺伝子を含む。ｐψＶＤｅｌ１−２５構築物およびｐψＶＤｅｌ３−２５構築物の標的組込みによるψＶ遺伝子のノックアウト戦略が、以下に示される。関連するＥｃｏＲＩ部位のみ、示される。（Ｂ）ＥｃｏＲＩ消化後の、（Ａ）に示されるプローブを使用する、野生型クローンおよびノックアウトクローンのサザンブロット分析。野生型遺伝子座は、１２ｋｂのフラグメントとしてハイブリダイズするが、ψＶ部分的遺伝子座およびψＶ−遺伝子座は、それぞれ７．４ｋｂのフラグメントおよび６．３ｋｂのフラグメントとしてハイブリダイズする。（Ｃ）ＡＩＤの状態。ＡＩＤ遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、ＡＩＤ ｃＤＮＡ発現カセットの存在または欠如を確かめた。
【図２】（図２．コントロールクローンおよびψＶノックアウトクローンのｓＩｇＭ発現分析）（Ａ）元のｓＩｇＭ（＋）クローンに由来する代表的なサブクローンのＦＡＣＳの抗ＩｇＭ染色プロフィール。（Ｂ）２４個のサブクローンの測定に基づく、ｓＩｇＭ（−）ゲートに入る事象の平均パーセント。
【図３】（図３．ψＶノックアウトクローンのＩｇ軽鎖配列分析）ＡＩＤＲψＶ−クローンおよびＡＩＤＲψＶ部分的クローンの変異プロフィール。Ｊ−Ｃイントロンに対するリーダー配列由来の領域内の異なる配列において同定された、全てのヌクレオチド置換が、ＡＩＤＲ前駆体クローンに存在する再配列された軽鎖配列上にマッピングされる。ＡＩＤＲψＶ−クローンおよびＡＩＤＲψＶ部分的クローンの変異が、上記および下記の基準配列にそれぞれ示される。欠失、挿入および遺伝子変換の事象もまた、示される。ホットスポットモチーフ（ＲＧＹＷおよびその相補的なＷＲＣＹ）が、太字で強調される。
【図４】（図４．過剰変異細胞株の変異プロフィール）（Ａ）特定の数の変異を保有する配列のパーセント。各々鋳型されないヌクレオチド置換が計数されるが、複数個のヌクレオチドが関与する遺伝子変換、欠失および挿入は、単一の事象として計数される。ＰＭ、点変異；ＧＣ、遺伝子変換；Ｄ、欠失；Ｉ、挿入。（Ｂ）ψＶノックアウトクローンおよびＸＲＣＣ３ノックアウトクローン由来の配列内のヌクレオチド置換のパターン。遺伝子変換事象の一部としてのヌクレオチド置換は、除外される。転換（ｔｒｖ）に対する転移（ｔｒｓ）の比もまた、示される。（Ｃ）鋳型されないヌクレオチド置換変異のホットスポットの優先傾向。ホットスポットモチーフ（ＲＧＹＷおよびその相補的なＷＲＣＹ）内に発生する変異が、パーセントにより示される。（Ｄ）自発的に死ぬ細胞の指標としての、トリパンブルー陽性細胞。
【図５】（図５．未選別のＡＩＤＲψＶ−細胞由来のゲノム配列内および選別されたＩｇＭ（−）ＡＩＤＲψＶ−細胞由来のｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド置換の分布）変異の数は、５０ｂｐ毎に計数され、そして、軽鎖ゲノム遺伝子座またはｃＤＮＡ配列の、対応する物理的地図とともに示される。
【図６】（図６．Ｉｇ遺伝子変換およびＩｇ過剰変異の調節を説明するモデル）
【図７】（図７．ＧＦＰ遺伝子のインサイチュ突然変異誘発）（Ａ）Ｉｇ ＶＪ置換ベクター。（Ｂ）過剰変異によるＧＦＰ遺伝子のインビボ変異誘発。（Ｃ）ψＶドナー置換ベクター。（Ｄ）遺伝子変換および過剰変異による、ＧＦＰ遺伝子のインビボ突然変異誘発。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、任意の核酸の指向的かつ選択的な遺伝的多様化のために、特に有用な細胞系を利用可能にする。この系は、細胞外刺激（例えば、他の細胞または分子との相互作用）またはＢ細胞抗原レセプターの維持を必要とせずに、再配列された免疫グロブリンＶ遺伝子をインビトロで恒常的に多様化するＢ細胞株に基づく。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「指向的かつ選択的な遺伝的多様化」は、特定の細胞の、内因性の核酸またはトランスジェニック核酸の特定の領域の核酸配列の変更を引き起こす能力をいい、したがって、これらの領域外の配列は、変異に供されない。
【００３１】
「遺伝的多様化」は、核酸内の個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチの変更をいう。本発明に記載の細胞における遺伝的多様化は、過剰変異、遺伝子変換または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより生じる。
【００３２】
「過剰変異」は、バックグラウンド以上の比率での、細胞における核酸の変異をいう。好ましくは、過剰変異は、一世代あたり、１０−５ｂｐ−１から１０−３ｂｐ−１の間の変異の比率をいう。これは、バックグラウンドの変異比率（一世代あたり、１０−９変異ｂｐ−１〜１０−１０変異ｂｐ−１のオーダー（Ｄｒａｋｅら １９８８））およびＰＣＲにおいて観察される自然発生的な変異を大幅に超過する。Ｐｆｕポリメラーゼによる３０サイクルの増幅は、産物において０．０５×１０−３変異ｂｐ−１未満を生成する（この場合、１００個の観察される変異において１個未満の原因となる）（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１）。
【００３３】
「遺伝子変換」は、配列情報が、一方の相同的な対立遺伝子からもう一方の相同的な対立遺伝子へ、一方向性の様式で転移される事象をいう。遺伝子変換は、テンプレートを切り換えし、そして相同配列から転写するＤＮＡポリメラーゼの結果、または．ヘテロ二本鎖の形成後のミスマッチ修復（一方の鎖から除去され、そしてもう一方の鎖を使用する修復合成により置換されるヌクレオチド）の結果であり得る。
【００３４】
過剰変異および遺伝子変換は、Ｂ細胞の免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊセグメント内に天然の多様性を生成する。過剰変異は、抗原刺激後のマウスおよびヒトのような種の胚芽中心において生じる。遺伝子変換は、抗原刺激に関係なく、ニワトリ、ウシ、ウサギ、ヒツジおよびブタのような種における、ファブリーキウス嚢のような主要リンパ系器官または腸関連リンパ系組織において生じる。ニワトリにおいて、上流の偽Ｖ遺伝子由来のストレッチは、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントに転移される。それゆえ、本発明によれば、細胞または細胞株は、好ましくは、その再配列された免疫グロブリン遺伝子を多様化し得る免疫グロブリン産生細胞または細胞株である。
【００３５】
過剰変異の開始と遺伝子変換の開始との間の直接的な関係は、本明細書において報告される実験において、初めて証明される。具体的には、細胞培養において遺伝子変換を継続する細胞株における、偽Ｖ遺伝子の部分的な欠失または完全な欠失は、免疫グロブリン遺伝子座における過剰変異の活性化につながる。全ての偽Ｖ遺伝子の欠失は、遺伝子変換の停止および高比率の過剰変異の同時活性化をもたらし、一方で少数の偽遺伝子の欠失は、遺伝子変換のダウンレギュレーションおよび、完全な偽遺伝子の欠失について観察されるものよりは低い比率での過剰変異の同時活性化をもたらす。したがって、利用可能な偽遺伝子ドナーの数は、遺伝子変換の比率に直接的に相関し、そして過剰変異の比率に逆相関する。遺伝子変換および過剰変異は、互いに相反的な関係にあると説明される。それゆえ、本発明は、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、標的核酸を遺伝的に多様化することを可能にする細胞系を、初めて提供する。したがって、これらの２つの事象の寄与は、遺伝子変換ドナーの数、その方向、またはその相同性の程度もしくは長さを変更することにより調節され得る。
【００３６】
過剰変異活性のみを有する細胞系（例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＷＯ００／２２１１１およびＷＯ０２／１００９９８）に基づくもの）を上回る、本発明に記載の細胞系の利点は、１つの細胞において、過剰変異および遺伝子変換による遺伝的多様化を組み合わせる能力である。例えば、遺伝子変換ドナーは、好ましい方法で標的核酸活性に影響するような配列を含むように操作され得るので、より多くの規定される変更が、無秩序な過剰変異ではなく遺伝子変換により標的遺伝子に導入され得る。こうして、試験前の配列ブロックは、無秩序な過剰変異により組み合わされるので、遺伝子変換および過剰変異は、所望の改変体を生成する機会を増大し得る。標的遺伝子の特定の領域と同一な配列を有する偽遺伝子はまた、過剰変異が非変換部分においてのみ持続する効果を有する頻繁な変換により、標的核酸の一部を安定的に保持するために使用され得る。このアプローチは、標的核酸が、最適な活性を安定的に維持する領域を含む場合、有用である。
【００３７】
遺伝子変換活性状態の細胞における相同組換え活性の抑制に基づく細胞系（ＷＯ０２／１００９９８）を上回る、本発明に記載の細胞系の利点は、通常の増殖速度、耐放射線性およびＤＮＡ修復能力に反映される細胞の遺伝的安定性である。
【００３８】
全ての公知の系を上回る、本発明の細胞系の特定の利点は、本発明に記載の細胞の、トランスフェクトされた核酸構築物を標的組込みにより相同な内因性遺伝子座に組み込む能力である。
【００３９】
「標的組込み」は、相同組換えによる、内因性遺伝子座への、内因性の核酸配列と相同な核酸配列を含むトランスフェクトされた核酸構築物の組み込みである。標的組込みは、規定の染色体位置へ、任意の核酸を直接挿入し得る。好ましい実施形態において、目的の遺伝子産物をコードする核酸は、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントまたはその一部の代わりに、免疫グロブリン遺伝子座へと標的組込みにより挿入される。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明に記載の細胞は、インビボでＩｇ遺伝子変換を起こす細胞に由来するか、または関連する。インビボでＩｇ遺伝子変換を起こす細胞は、例えば、主要リンパ系器官において表面Ｉｇを発現するＢ細胞（例えば、鳥類の嚢のＢ細胞）である。主要リンパ系器官のＢ細胞に由来するリンパ腫細胞は、本発明に記載の細胞および細胞株を構築するための、特に良好な候補である。最も好ましい実施形態において、この細胞は、ニワトリの嚢リンパ腫細胞株ＤＴ４０に由来する。
【００４１】
過剰変異および遺伝子変換による恒常的な遺伝的多様化のプロセスは、所望の活性、新規の活性または改善された活性を有する遺伝子産物を産生するために、本発明において使用される。
【００４２】
「標的核酸」は、本発明に記載の細胞内の核酸配列または染色体領域であり、これは、指向的かつ選択的な遺伝的多様化に供される。標的核酸は、内因性か、またはトランスジェニックのいずれかであり得、そして、遺伝子産物をコードする１つ以上の転写単位を含み得る。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「導入遺伝子」は、例えば、トランスフェクションまたは形質導入により、細胞に挿入される核酸分子である。例えば、導入遺伝子は、所望の位置において細胞のゲノムに挿入され得る、異種の転写単位を含み得る。
【００４４】
一実施形態において、導入遺伝子は、免疫グロブリンを産生する細胞において見出される免疫グロブリンＶ遺伝子、またはＶ遺伝子のフラグメントである。好ましくは、標的核酸は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子である。この場合において、本発明に記載の細胞は、任意の所定の抗原に結合し得るヒト抗体改変体の「工場」である。
【００４５】
あるいは、標的核酸は、非免疫グロブリン核酸（例えば、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素またはレセプタータンパク質をコードする遺伝子）である。例えば、新規の蛍光選択マーカーは、遺伝子変換ドナーとして働く他の公知のマーカー（異なる蛍光スペクトルを有する）の助けを借りた過剰変異または過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより、公知のマーカーを変異させることにより生成され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態において、標的核酸は、直接的に、目的の遺伝子産物をコードする。このような核酸の遺伝的多様化は、コードされる遺伝子産物の切断またはその初期配列の変更をもたらす。毎回の多様化および選択について、改善された活性を有する遺伝子産物を発現する細胞が探索される。
【００４７】
代替的に、標的核酸は、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサーのような転写調節エレメント）または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。この実施形態において、標的核酸により影響され、かつ同定可能な遺伝子産物をコードする、さらなる核酸（レポーター遺伝子）が、目的の標的核酸を保持する細胞を同定するために必要とされる。
【００４８】
標的核酸の遺伝的多様化が、過剰変異と遺伝子変換との組み合わせにより生じる実施形態において、遺伝子変換ドナーとして働き得る、さらなる核酸が、細胞のゲノムに、好ましくは標的核酸の上流に挿入される。
【００４９】
「遺伝子変換ドナーとして働き得る核酸」は、標的核酸と相同な配列を有する核酸である。天然の遺伝子変換ドナーの例は、特定の種の免疫グロブリン遺伝子座における偽Ｖ遺伝子である。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、標的核酸の指向的かつ選択的な多様化が可能な細胞は、規定の染色体部位での標的組込みによって、宿主細胞へ標的核酸を挿入することにより構築される。この目的のために、トランスフェクトされる構築物は、所望の染色体組み込み部位に相同な、標的核酸配列の上流および下流を含み得る。好ましくは、この細胞は、導入遺伝子が、遺伝子変換および／または過剰変異の事象の標的になるような相同組み換えまたは遺伝子ターゲティングによって、内因性Ｖ遺伝子またはそのセグメントをこの導入遺伝子に置換することにより構築される。
【００５１】
別の実施形態において、本発明に記載の導入遺伝子はまた、遺伝子変換および／または過剰変異を指向する配列を含む。したがって、遺伝子産物を発現し得、そしてこの転写単位に対する過剰変異および遺伝子変換を指向する完全な遺伝子座は、細胞に転移され、そして無秩序な染色体への組み込み後においても活性的に多様化される。
【００５２】
標的組込みにより導入遺伝子を組み込まれたクローンのスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲにより行われ得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明に記載の導入遺伝子は、この導入遺伝子が安定的に組み込まれたクローンの選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。続いて、この選択可能なマーカー遺伝子は、組換えにより除去され得るか、または他の方法により不活性化され得る。
【００５４】
本発明は、さらに、所望の活性を有する標的核酸を保持する細胞についての細胞の増殖および選択の度重なる繰り返しにより、所望の活性を有する遺伝子産物を調製するための方法を提供する。本明細書において使用される場合、「選択」は、標的核酸内の配列の改変の存在の決定をいい、この配列の改変は、標的核酸によりコードされる遺伝子産物の所望の活性または標的核酸の調節機能の所望の活性をもたらす。
【００５５】
遺伝子変換および過剰変異のプロセスは、免疫グロブリン分子において改善された結合特異性または新規の結合特異性を生成するために、インビボで使用される。それゆえ、所望の抗原に結合し得る免疫グロブリンを産生する本発明に記載の細胞を選択すること、そして次に、さらなる変異の発生を可能にするためにこれらの細胞を増殖させることにより、所望の抗原への改善された結合を有する免疫グロブリンを発現する細胞が、単離され得る。
【００５６】
種々の選択手順は、所望の特異性を有する変異の単離のために適用され得る。これらとしては、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）、磁性粒子を使用する細胞分離、抗原クロマトグラフィー方法および他の細胞分離技術（例えば、ポリスチレンビーズの使用）が挙げられる。
【００５７】
蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）は、細胞の異なる表面分子（例えば、表面提示される免疫グロブリン）に基づいて、細胞を単離するために使用され得る。分離されるべきサンプルまたは集団内の細胞は、細胞表面分子に結合する特異的な蛍光試薬により染色される。これらの試薬は、蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、マラカイトグリーン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または当業者に公知の任意の他の蛍光団）に（直接的にか、または間接的にかのいずれかで）連結された目的の抗原である。次に、この細胞集団は、ＦＡＣＳ機器の振動フローチャンバーへ導入される。このチャンバーを出ていく細胞の流れは、シースの緩衝流体（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水））に入れられる。この流れはレーザー光により照射され、そして各々の細胞は蛍光（蛍光標識抗原の結合を示す）について測定される。細胞の流れ内の振動は、細胞の流れを小滴へ細分化し、この小滴は、微小な荷電を帯びる。これらの小滴は、蛍光標識抗原に対するそれらの親和性にしたがって、異なる細胞集団を回収するために、コンピュータ制御下の電気偏向板により導かれ得る。この様式において、目的の抗原に対して異なる親和性を示す細胞集団は、この抗原を結合しない細胞から容易に分離され得る。ＦＡＣＳにおける使用のためのＦＡＣＳ機器および試薬は、世界中の供給源（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはサービス提供者（例えば、Ａｒｉｚｏｎａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｌ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｆａｃｓ／））から広範に利用可能である。
【００５８】
特定の抗原に対する細胞表面タンパク質の親和性にしたがって細胞の集団を分離するために使用され得る、別の方法は、アフィニティークロマトグラフィーである。この方法において、適切な樹脂（例えば、ＣＬ−６００セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）は、適切な抗原に共有結合される。この樹脂は、カラムに封入され、そして細胞の混合集団は、このカラムを通過させられる。適切な時間（例えば、２０分間）のインキュベーション後、未結合の細胞は、（例えば）ＰＢＳ緩衝液を使用して洗い流される。このことは、目的の抗原に結合する免疫グロブリンを発現する細胞の部分集合のみを残す。次に、これらの細胞は、（例えば）過剰量の目的の抗原を使用するか、または樹脂から抗原を酵素的にか、もしくは化学的に切断することにより、このカラムから溶出される。このことは、特異的なプロテアーゼ（例えば、ファクターＸ、トロンビン、または抗原−樹脂複合体に予め取り込まれた適切な切断部位を介してカラムから抗原を切断する、当業者に公知の他の特異的なプロテアーゼ）を使用して行われ得る。代替的に、非特異的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）は、樹脂から抗原を除去するために使用され得、それにより目的の抗原に対する親和性を示した細胞の集団を解放し得る。
【００５９】
本発明は、初めて、標的核酸の遺伝的多様化を調節し得る機構を提供した。本発明者らにより示されるように、活性化誘導性脱アミノ酵素（ＡＩＤ）は、免疫グロブリン遺伝子座において遺伝子変換ならびに過剰変異を調節する因子である。ＡＩＤは、隣接するドナー配列が存在する場合には変換トラクト（ｔｒａｃｔ）を導き、それが存在しない場合には点変異を導く、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントにおいて共通の改変を誘導することが示唆される。したがって、ＡＩＤ発現を調節することにより、両方の事象が調節され得る。好ましい実施形態において、ＡＩＤ遺伝子は、標的核酸を含む細胞において一過的に発現される。例えば、ＡＩＤは、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性遺伝子発現系）下で発現され得る。そうでなければ、遺伝子発現は、誘導性の組換えによるＡＩＤ発現カセットの切除により、停止され得る。ＡＩＤ発現の停止は、標的配列のさらなる多様化を防止する。好ましくは、ＡＩＤ発現は、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する細胞において、この所望の活性の損失を導き得るさらなる変異を防止するために、停止される。
【００６０】
本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００６１】
（１．ＡＩＤは、共通の中間体による免疫グロブリンの遺伝子変換および過剰変異を開始する）
本明細書において、ψＶドナーの除去が、ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０において、ＡＩＤ依存性Ｉｇ過剰変異を活性化することが報告される。このことは、Ｉｇ遺伝子変換および過剰変異が、同一のＡＩＤ惹起性の中間体に由来する競合経路であることを示す。さらに、ψＶノックアウトＤＴ４０は、Ｉｇ過剰変異の分子機構にアプローチするための理想的なモデル系として、そしてインサイチュ突然変異誘発のための新規のツールとして提案される。
【００６２】
（方法）
（細胞株）
ＤＴ４０Ｃｒｅ１（ｖ−ｍｙｂ導入遺伝子に起因して、Ｉｇ遺伝子変換の増大を示し、そしてタモキシフェン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを含む）は、以前に記載されている（Ａｒａｋａｗａら、２００１）。ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−を、ＤＴ４０Ｃｒｅ１の両方のＡＩＤ対立遺伝子の標的破壊により生成した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。ＡＩＤＲを、ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ二重シストロン性カセット（ＡＩＤおよびＧＦＰの両方が、同一のβ−アクチンプロモーターから発現される）の安定的な組み込み後に、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−から取得した。ＡＩＤＲψＶ−を、ｐψＶＤｅｌ１−２５のトランスフェクションによって、ＡＩＤＲから取得した（図１Ａ）。次に、再配列された軽鎖遺伝子座へこの構築物を組み込んだ安定なトランスフェクト体を、遺伝子座特異的ＰＣＲにより同定した。ｐψＶＤｅｌ１−２５の標的組込みは、ψＶ２５の０．４ｋｂ上流から始まり、ψＶ１の１ｂｐ下流で終わるψＶ遺伝子座全体の欠失をもたらす。ＡＩＤＲψＶ部分的を、ｐψＶＤｅｌ３−２５のトランスフェクションにより、ＡＩＤＲψＶ−と同様な方法で生成した。標的組込みによるｐψＶＤｅｌ３−２５のトランスフェクションは、ψＶ２５の０．４ｋｂ上流から始まり、ψＶ３の１ｂｐ下流で終わるψＶ遺伝子座の部分的な欠失を導く。細胞培養およびエレクトロポレーションを、以前に記載されるように実行した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。ＸＲＣＣ３−／−を、ＸＲＣＣ３ノックアウト構築物のトランスフェクションに続いて、ＸＲＣＣ３遺伝子のアミノ酸７２〜１７０を欠失させることにより、ＤＴ４０Ｃｒｅ１から取得した。まず標的組込みの生じたクローンを、ロングレンジＰＣＲにより同定し、そして次に、このＸＲＣＣ３欠失を、サザンブロット分析により確認した。
【００６３】
（Ｉｇ復帰変異アッセイ）
サブクローニング、抗体染色、フローサイトメトリーおよびｓＩｇＭ発現の定量化は、以前に記載されている（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。この研究で使用された全てのクローンは、遺伝子変換事象による元のＣ１１８（−）改変体（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅら、１９９０）の軽鎖のフレームシフトの修復に起因して、ｓＩｇＭ（＋）であった。
【００６４】
（ＰＣＲ）
ＰＣＲに誘発される人工的な変異を最小化するために、ＰｆｕＵｌｔｒａホットスタートポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、配列決定前の増幅のために使用した。ロングレンジＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＩｇ軽鎖配列決定を、以前に記載されるように実行した（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。Ｉｇ軽鎖プラスミドクローンのプロモーター領域およびＪ−Ｃイントロン領域を、Ｍ１３順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーおよびＭ１３逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを使用して配列決定した。Ｂｕ−１遺伝子およびＥＦ１α遺伝子を、それぞれ以下のプライマーの対を使用して増幅した：
【００６５】
【化１】
これらの遺伝子のＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターへクローニングし、そしてＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決定した。
【００６６】
（結果）
（再配列された軽鎖遺伝子座におけるψＶドナー配列の標的欠失（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ））
２つのψＶノックアウト構築物を、ゲノム配列をクローニングすることにより調製した。このゲノム配列は、意図される欠失の末端の地点（ｌｏｘＰに挟まれたｇｐｔ（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）カセット（Ａｒａｋａｗａら、２００１）の上流および下流）に隣接する。標的組込みにおいて、第一の構築物（ｐψＶＤｅｌ１−２５）は全ての偽遺伝子（ψＶ２５〜ψＶ１）を欠失させる一方で、第二の構築物（ｐψＶＤｅｌ３−２５）は大半の偽遺伝子（ψＶ２５〜ψＶ３）を欠失させる（図１Ａ）。表面ＩｇＭ陽性（ｓＩｇＭ（＋））クローン（ｌｏｘＰに挟まれたＡＩＤ−ＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）−ＧＦＰ導入遺伝子のトランスフェクションおよび安定的な組み込みにより、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−細胞（Ａｒａｋａｗａら、２００２）から取得した）を、ψＶノックアウト構築物のトランスフェクションのために選択した。このＡＩＤ再構成クローン（ＡＩＤＲと名づけた）は、有害なＩｇ軽鎖の変異の出現が、ｓＩｇＭの発現の欠失により容易に検出され得、そして、ＧＦＰ標識されるＡＩＤ発現が、ＤＴ４０Ｃｒｅ１から受け継がれたＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子のタモキシフェン誘導後に停止され得るという利点を有する（Ａｒａｋａｗａら、２００２）。
【００６７】
ＡＩＤＲクローンへのψＶノックアウト構築物のトランスフェクション後、再配列された軽鎖遺伝子座の標的欠失を含むミコフェノール酸耐性クローンを同定した。これらの初代ψＶノックアウトクローンは、２つのｌｏｘＰに挟まれた導入遺伝子（再配列された軽鎖遺伝子座内に挿入されたｇｐｔマーカー遺伝子およびＡＩＤＲ前駆体クローンのＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子）を含む。ｇｐｔ遺伝子は、隣接する転写またはクロマチン構造を撹乱させ得るので、初代ψＶノックアウト体を、低濃度のタモキシフェンに曝露し、次に限界希釈によりサブクローニングした。この方法では、二次的なψＶノックアウトクローンが、単離され得、これらは、ｇｐｔ遺伝子のみが欠失しているか（ＡＩＤＲψＶ−およびＡＩＤＲψＶ部分的）、またはｇｐｔ遺伝子とともにＡＩＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子が欠失している（ＡＩＤ−／−ψＶ−およびＡＩＤ−／−ψＶ部分的）かのいずれかである。再配列された軽鎖遺伝子座におけるψＶ遺伝子の破壊およびＡＩＤ過剰発現カセットの除去を、それぞれサザンブロット分析（図１Ｂ）およびＰＣＲ（図１Ｃ）により確かめた。
【００６８】
（ＡＩＤ陽性クローンにおけるψＶ遺伝子の欠失後のｓＩｇＭ発現の減少の拡大）
有害なＩｇ変異の比率を推定するために、ＤＴ４０Ｃｒｅ１、ＡＩＤＲ、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−およびψＶノックアウトクローンの各々２４サブクローンについての２週間の培養後、ｓＩｇ発現を、ＦＡＣＳにより測定した（図２Ａおよび２Ｂ）。インタクトなψＶ遺伝子座を有するコントロールの分析は、ＤＴ４０Ｃｒｅ１およびＡＩＤＲサブクローンに対してそれぞれ平均０．５２％および平均２．２７％がｓＩｇＭ（−）細胞であるが、ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−に対しては、わずか０．０８％がｓＩｇＭ（−）細胞であることを明らかにした。自然発生したｓＩｇＭ（−）ＤＴ４０改変体の以前の分析は、約３分の１が、再配列された軽鎖Ｖセグメントにおいてフレームシフト変異を含み、これは、Ｉｇ遺伝子変換活性の副産物としてみなされたことを示した（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅら、１９９０）。現在、この考えは、ＡＩＤ陰性ＤＴ４０Ｃｒｅ１ＡＩＤ−／−クローン（Ｉｇ遺伝子変換活性を失っているはずである）が安定的にｓＩｇＭ（＋）であり続けるという知見により支持される。最も興味深いことに、ＡＩＤ陽性ψＶノックアウトクローン（ＡＩＤＲψＶ部分的およびＡＩＤＲψＶ−）のサブクローンは、ｓＩｇＭ（−）集団を急速に蓄積する一方で、ＡＩＤ陰性ψＶノックアウトクローン（ＡＩＤ−／−ψＶ部分的およびＡＩＤ−／−ψＶ−）のサブクローンは、ｓＩｇＭ（＋）を維持する（図２Ａおよび２Ｂ）。このことは、偽遺伝子の欠失が、ＡＩＤ発現細胞において、有害な軽鎖の変異の比率を劇的に増大することを示唆する。
【００６９】
（ψＶドナーが無い状態での、過剰変異によるＩｇ遺伝子変換の置き換え）
新規に同定された変異活性を分析するために、ψＶノックアウトクローンの再配列された軽鎖ＶＪセグメントを、サブクローニングから５〜６週間後に、配列決定した。全部で１３５ヌクレオチドの変更（図４Ａ、表１）を、ＡＩＤＲψＶ−クローン由来の９５個の配列内のＶリーダーとＪ−Ｃイントロンの５’端との間の０．５ｋｂの領域において見出した（図３、参照配列の上）。野生型ＤＴ４０細胞に見られる変換トラクトとは対照的に、ほぼ全ての変更は、単一の塩基置換であり、少数の短い欠失およびジヌクレオチド変更以外に、変異のクラスターは観察されなかった。再配列されていない軽鎖遺伝子座のψＶ遺伝子をなお含むＡＩＤＲψＶ−における変換の事象の欠如は、Ｉｇ遺伝子変換が、再配列された軽鎖遺伝子の多様化のために、同一の染色体上のψＶ遺伝子のみを補充することを確かにした（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９０）。ＡＩＤ−／−ψＶ−クローン由来の９５個の軽鎖遺伝子配列の収集物において、配列の多様性は見出されなかった（図４Ａ、表１）。このことは、ＡＩＤが変異活性のために必要とされることを示す。
【００７０】
ＡＩＤＲψＶ部分的クローンに由来する配列は、たまに、残存するψＶ１およびψＶ２により起因され得る変異のストレッチを示す（図３、参照配列の下）。それにもかかわらず、ＡＩＤＲψＶ部分的の変異の大部分は、ＡＩＤＲψＶ−細胞により見られるような、単一の鋳型されない塩基置換である（図４Ａ、表１）。おそらくＰＣＲアーチファクトである３塩基置換のみが、ＡＩＤ−／−ψＶ部分的クローンの９２個の配列において見出された。このことは、遺伝子変換およびＡＩＤＲψＶ部分的の変異活性の両方がＡＩＤ依存的であることを確かにした。
【００７１】
（ψＶノックアウトクローンの新規の変異活性は、体細胞の過剰変異に酷似する）
ψＶノックアウトクローンにおいて発見された単一のヌクレオチド置換が優勢なＩｇ変異活性は、体細胞の過剰変異がＩｇ遺伝子変換にとって替わったことを示唆する。しかしながら、ＡＩＤＲψＶ部分的クローンおよびＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるヌクレオチド置換と胚芽中心のＢ細胞におけるＩｇ過剰変異との間に相違がある。ここで、これらのクローンは、Ａ／Ｔ塩基においてほとんど変異を示さず、トランスバージョン変異への偏りを示す（図４Ｂ）。
【００７２】
代表的に、Ｉｇ過剰変異は、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）への偏りを伴って、転写された遺伝子の配列の１ｋｂ以内に限局化する一方で、Ｃ領域の下流において変異が存在しないか、または少数の変異が存在する（ＬｅｂｅｃｑｕｅおよびＧｅａｒｈａｒｔ、１９９０）。ＡＩＤＲψＶ−クローンにおける変異が同様の分布に従うか否かを調べるために、配列分析を、再配列された軽鎖遺伝子のプロモーター領域およびＪ−Ｃイントロンまで拡大した（図５）。変異は、プロモーターの近傍およびＪセグメントの下流のイントロン内において見出されるが、頻度のピークは、明らかにＣＤＲ１およびＣＤＲ３（これらはまた、ＤＴ４０における遺伝子変換が生じやすい部位である）と一致する（未公開結果）。全点変異のおよそ半分が、ＲＧＹＷ（Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｗ＝Ａ／Ｔ）配列モチーフ内またはその相補的なＷＲＣＹ内に収まる（図４Ｃ）。これらは、ヒトおよびマウスにおけるＩｇ過剰変異のホットスポットとして公知である。
【００７３】
ＲＡＤ５１パラログの欠失が、ＤＴ４０においてＩｇ過剰変異を誘導することが以前に報告された（Ｓａｌｅら、２００１）。ψＶ遺伝子陰性バックグラウンドおよびＲＡＤ５１パラログ陰性バックグラウンドにおいて過剰変異活性を比較するために、ＸＲＣＣ３遺伝子を、ＤＴ４０Ｃｒｅ１クローンにおいて破壊し、そして再配列されたＶＪ遺伝子を、サブクローニングから６週間後に配列決定した。ＡＩＤＲψＶ−クローンにおける変異スペクトルおよび以前に報告されたもの（Ｓａｌｅら、２００１）と類似して、ＸＲＣＣ３−／−細胞由来の配列における変異は、トランスバージョンへの偏りおよびＡ／Ｔ塩基における変異の欠如を示す（図４Ｂ）。それでもなお、ＸＲＣＣ３変異体における変異率は、ＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるものの約１／２．５倍、そして野生型ＤＴ４０およびＡＩＤＲψＶ−クローンと比較すると、ＸＲＣＣ３変異体は、明らかに増殖の遅い表現型であった（図４Ｄ）。
【００７４】
ＡＩＤＲψＶ−クローンにおいて、ｓＩｇＭの発現の欠失をもたらす変異を同定するために、選別されたｓＩｇＭ（−）細胞由来の９４個の軽鎖ｃＤＮＡを増幅し、配列決定した。この収集物において、１つの短い挿入および５つの欠失が検出された（表１）が、２４５個の全ての変異のうちの８９％は、ＶＪセグメント内の単一ヌクレオチド置換である（図５）。驚くべきことに、ほんの約１０％の配列が、停止コドンまたはフレームシフトを含み、ｓＩｇＭ（−）発現の欠失が主に、Ｉｇ軽鎖タンパク質およびＩｇ重鎖タンパク質の対合に影響するアミノ酸置換によりもたらされることを示唆した。
【００７５】
（過剰変異のＩｇ遺伝子座特異性）
線維芽細胞（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、２００２）およびＢ細胞ハイブリドーマ（ＭａｒｔｉｎおよびＳｃｈａｒｆｆ、２００２）におけるＡＩＤの高発現が、トランスフェクトされた導入遺伝子において頻繁な変異を誘導することが報告されている。偽遺伝子の欠失が全体的な過剰変異性の表現型を誘導したことを除外するために、Ｂ細胞特異的マーカーＢｕ−１および翻訳延長因子ＥＦ１αをコードする遺伝子の５’端を、ＡＩＤＲψＶ−クローンについて配列決定した。唯一の１ｂｐ欠失のみが、Ｂｕ−１遺伝子の９５個の配列内において見出され、そして２つの単一ヌクレオチド置換がＥＦ１αの８９個の配列内において見出された（表１）。これらの変更は、多分ＰＣＲアーチファクトを示すので、このことは、ψＶ欠失により誘導される過剰変異がＩｇ遺伝子座特異的であるという考えをさらに支持する。
【００７６】
（考察）
これらの結果は、偽遺伝子近傍のドナーの欠失が、ＤＴ４０においてＩｇ遺伝子変換を無効にし、かつ、Ｉｇ過剰変異に酷似する変異活性を活性化することを示す。この新規の活性と体細胞の過剰変異との間で共有される特徴としては以下が挙げられる：１）ＡＩＤ依存性、２）単一ヌクレオチド置換が優勢であること、３）５’転写領域内の変異の分布、４）ホットスポットについての偏り、および５）Ｉｇ遺伝子特異性。インビボにおけるＩｇ過剰変異についての相違は、Ａ／Ｔ塩基における変異が相対的に欠如していること、およびψＶノックアウトクローンにおいてトランスバージョン変異が優勢であることのみである。しかしながら、この相違はまた、過剰変異性ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株（ＢａｃｈｌおよびＷａｂｌ、１９９６；Ｆａｉｌｉら、２００２）およびＲＡＤ５１パラログのＤＴ４０変異体（Ｓａｌｅら、２００１）においても見られ、このことは、Ｉｇ過剰変異性の活性の一部が、形質転換されたＢ細胞株において失われていることを示す。興味深いことに、ＡＩＤＲψＶ−クローンにおけるＩｇ過剰変異の比率は、ＤＴ４０Ｃｒｅ１の祖先におけるＩｇ遺伝子変換の比率よりも高いようである。このことに対する説明は、数個の変換トラクトが、同一のドナーおよび標的配列のストレッチに限定され、したがって何の痕跡も残さないことであり得る。
【００７７】
Ｉｇ遺伝子変換のブロックによるＩｇ過剰変異の誘導は、どのようにして過剰変異と組換えとが開始され、そして調節されるかを説明する単純なモデルを支持する（図６）。これらの事象の始めには、ＡＩＤにより直接的または間接的のいずれかで誘導される、再配列されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントの改変がある。近傍のドナーの欠如または高い相同組換え活性の欠如において、この損傷部位の初期設定のプロセシングは、単一ヌクレオチド置換の形態でのＩｇ過剰変異を誘導する（図６、右側）。しかしながら、ドナー配列が利用可能である場合、ＡＩＤにより誘導された損傷部位のプロセシングは、Ｉｇ過剰変異へのシフトが依然として可能である、鎖の交換前の段階、およびＩｇ遺伝子変換に向かう方針が定まった、鎖の交換後の段階に分かれ得る（図６、左側）。この第一の段階の完成は、ＲＡＤ５１パラログの関与を必要とする一方で、この第二の段階には、ＲＡＤ５４タンパク質のような他の組換え因子が関与する。
【００７８】
方針におけるこの相違は、なぜ、ＲＡＤ５１パラログの破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させるだけではなく、Ｉｇ過剰変異を誘導する（Ｓａｌｅら、２００１）一方で、ＲＡＤ５４遺伝子の破壊は、Ｉｇ遺伝子変換を減少させる（Ｂｅｚｚｕｂｏｖａら、１９９７）のみであるのかを説明する。このモデルはまた、細胞の相同組換え活性が低いことが、変換ドナーの存在下においてさえもＩｇ遺伝子変換を防止することを予測する。このような相同組換えの低い活性は、ヒトＢ細胞およびマウスＢ細胞が、再配列されていないＶセグメントの形態の近接する候補ドナーが存在するにもかかわらず、Ｉｇ遺伝子変換を決して使用しないこと、ならびに胚芽中心のＢ細胞が、Ｉｇ遺伝子変換からＩｇ過剰変異へシフトしたことの理由になり得る（Ａｒａｋａｗａら、１９９８）。
【００７９】
ＡＩＤＲおよびψＶノックアウトＤＴ４０クローンは、Ｉｇ遺伝子変換および過剰変異に対するトランス作用性因子およびシス作用性調節配列の役割に対処するための強力な実験系である。代替的な動物系または細胞培養系と比較して、この系は、以下の利点を提供する：１）Ｉｇ遺伝子変換およびＩｇ過剰変異の平行分析、２）条件的なＡＩＤ発現、３）遺伝子ターゲティングによる簡単なゲノム改変、４）正常な細胞増殖および修復効率、ならびに５）過剰変異のＩｇ遺伝子座特異性。ＤＴ４０細胞株において、遺伝子特異的な過剰変異を誘導する能力はまた、生物工学において用途を見出し得る。１つの可能性は、ニワトリの抗体をコードする領域をそのヒトの対応するものと置き換え、次いで、Ｉｇ過剰変異により継続的に発達するレパートリー由来の抗体親和性の成熟を刺激することである。
【００８０】
（２．遺伝子変換および過剰変異による、ＧＦＰのインビボ標的変異誘発）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子は、本発明の細胞系（特にＤＴ４０細胞株）を使用して遺伝的に多様化され得る標的核酸の一例である。標的組込みによりＩｇ軽鎖遺伝子座に挿入されたＧＦＰ遺伝子は、過剰変異に供され、そして色、強度および半減期に関するその活性は、時間とともに発達する（図７Ｂ）。過剰変異と遺伝子変換との組み合わせが、これらのＧＦＰ活性を改変するために使用される場合、ＧＦＰに対する遺伝子変換ドナーとしての役割を果たし得る改変ＧＦＰ配列もまた、Ｉｇ遺伝子座に挿入される（図７Ｄ）。
【００８１】
Ｉｇ軽鎖ＶＪ遺伝子を任意の核酸標的により置き換えることを可能にするＩｇ ＶＪ置換ベクター（ｐＶｊＲｅｐＢｓｒ）が、図７Ａに示される。変異誘発に対する潜在的な標的は、ＳｐｅＩ部位（ＸｂａＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＡｖｒＩＩ部位およびＳｐｅＩ部位と互換性である）へクローニングされ得る。例えば、ＧＦＰ遺伝子は、ｐＶｊＲｅｐＢｓｒを使用する標的組込みによりＩｇ軽鎖遺伝子座に挿入され得る。Ｉｇ ψＶ遺伝子の軽鎖遺伝子座を任意の核酸標的により置き換えることを可能にするψＶ遺伝子ドナー置換ベクター（ｐＰｓｅｕｄｏＲｅｐＢｓｒ）が、図７Ｃに示される。強力な遺伝子変換ドナーは、ＮｈｅＩ部位またはＳｐｅＩ部位（ＸｂａＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＡｖｒＩＩ部位およびＳｐｅＩ部位と互換性である）のいずれかへクローニングされ得る。ＮｈｅＩ部位は、２つのｌｏｘＰの間に位置するため、この部位は、条件的なノックアウト設計のために使用され得る。ｐＰｓｅｕｄｏＲｅｐＧｐｔおよびｐＶｊＲｅｐＢｓｒを使用する段階的な標的組込みにより、ψＶ遺伝子は、ψＧＦＰ遺伝子およびその改変体（例えば、ψＣＦＰ：青色蛍光タンパク質およびψＹＦＰ：黄色蛍光タンパク質）により置き換えられ得、そしてＶＪ遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子の遺伝的多様化をモニターするためのフレームシフト変異を保有するＧＦＰ（ＦｓＧＦＰ）により置き換えられ得る。ＦｓＧＦＰにおけるフレームシフトは、テンプレートとしてのψＧＦＰ、ψＣＦＰおよびψＹＦＰの遺伝子変換により修復されることが予想される。加えて、この遺伝子は、さらに過剰変異により多様化される。
【００８２】
【化２】
【００８３】
【化３】
【００８４】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２１０２２９（Ｐ２０１２−２１０２２９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１７２９１４（Ｐ２０１２−１７２９１４）
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００６−５５３５７０（Ｐ２００６−５５３５７０）の分割
【原出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【出願人】（５０１３５７２０１）ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー） (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７２９１４（Ｐ２０１２−１７２９１４）
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００６−５５３５７０（Ｐ２００６−５５３５７０）の分割
【原出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【出願人】（５０１３５７２０１）ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー） (4)
【Ｆターム（参考）】
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