遺伝子導入剤及び核酸複合体
【課題】細胞内でのＤＮＡの放出性及びプロトン受容性に優れ、細胞被毒の問題のない遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供する。
【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。前記強塩基性カチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体が好ましく、前記弱塩基性カチオン性モノマーとしては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が好ましい。この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体。
【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。前記強塩基性カチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体が好ましく、前記弱塩基性カチオン性モノマーとしては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が好ましい。この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
本出願人らは、ＤＮＡを細胞中に運搬するための合成高分子ベクターとして、ベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。
【０００４】
この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【０００５】
ところで、合成高分子ベクターの遺伝子導入効率を向上させるためには、ＤＮＡとのイオン複合体が細胞内へ取り込まれた後に、いかにエンドソーム内から脱出するかに依存している、と考えられている。エンドソームからイオン複合体が脱出するには、カチオン性高分子のアミンを中和するための大量のプロトンがエンドソーム内へ浸透し、これによりエンドソーム内の内圧が上がって破裂するプロトンスポンジ現象を起こす必要がある。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができる。このため、ポリプレックス粒子の細胞膜透過性が高くなり、遺伝子導入活性が向上したが、下記（１）〜（３）に挙げる不具合があった。
【０００７】
（１）ＤＮＡを小さく凝縮させるために電荷密度を上げる工夫がされてきたが、一方で、一度頑強に凝縮された微粒子は容易には解離することなく安定に存在することになる（所謂、オーバーコンデンスの状態になる）ため、細胞内でＤＮＡを放出しにくくなる。放出されなかったＤＮＡは当然ｍＲＮＡへ転写されることはなく、タンパクの発現には至らない。
（２）一般に細胞培養及び遺伝子の導入は、中性条件下で行われる。そのため中性条件下でも十分にイオン強度の高いカチオン性高分子の原料として、ｐＫａの高いモノマーが選択される。しかしながら、このような高ｐＫａモノマーからなるカチオン性ポリマーは、中性条件下において、その側鎖の窒素原子のほぼ１００％がカチオン化されており、細胞内へ取り込まれた後にエンドソーム内で、酸性となってもプロトンを呼び込むキャパシティーに欠ける。このため、前述のプロトンスポンジ現象が得られない。
（３）遺伝子導入剤の電荷密度が高いため、運搬したＤＮＡを放出した後、細胞内でカウンターイオンを包接する能力が高い。従って、核膜近傍でＤＮＡを放出した場合、ハウスキーピング遺伝子（常時細胞内で起こっている細胞の増殖、維持に必要な遺伝子）を包接して、その機能の発現を阻害してしまう可能性がある。この場合、細胞の維持が妨げられ、その結果、強い細胞毒性を発現する。
【０００８】
本発明は、上記従来の遺伝子導入剤の問題点を解決し、細胞内でのＤＮＡの放出性及びプロトン受容性に優れ、細胞被毒の問題のない遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記強塩基性カチオン性モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体であり、前記弱塩基性カチオン性モノマーは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項４ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明（請求項８）の核酸複合体は、請求項１ないし７のいずれか1項に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐鎖が少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなるものであるため、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができ、また、エンドソーム内においてもプロトンを捕捉することができるため、遺伝子導入効率が高い。
【００１８】
これは、本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖に導入された強塩基性カチオン性モノマーが、中性条件下においても十分にイオン強度が高く、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができるためであり、また、分岐鎖に導入された弱塩基性カチオン性モノマーが、酸性条件であるエンドソーム内においても、プロトンを呼び込むポテンシャルを有しているため、大量のプロトンをエンドソーム内へ浸透させ、エンドソームの内圧を高めることができる（即ち、プロトンスポンジ現象が発現する。）ためである。
【００１９】
本発明では、特に、強塩基性カチオン性モノマーとして、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体を用いることが好ましく、弱塩基性カチオン性モノマーとして、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を用いることが好ましく（請求項２）、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることが好ましい（請求項３）。
【００２０】
特に、弱塩基性カチオン性モノマーとして、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを分岐鎖に導入した場合、エンドソーム内におけるプロトンの受容性が向上するだけでなく、ＤＮＡの放出性も向上し、細胞毒性も低減する。これは２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが、加水分解性に優れることによるものであり、具体的には、中性条件下において、約４時間で全体の約３５％が２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールとメタクリル酸とに加水分解される。
【００２１】
即ち、分岐鎖中の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート部位は、遺伝子導入剤を細胞に作用させている時間内で加水分解が起こり、加水分解が起きた部位がカチオン性からアニオン性へと変化する。この結果、加水分解によりアニオン性となった部位と、アニオン性であるＤＮＡとが静電反発して、遺伝子導入剤とＤＮＡとが解離しやすくなる。従って、ＤＮＡの放出性に優れる。
【００２２】
また、分岐鎖の一部がカチオン性からアニオン性へと変化し、分岐鎖のカチオン性が失われることにより、ハウスキーピング遺伝子を包接する能力も失うため、細胞毒性が低減する。
【００２３】
本発明に係るポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましく（請求項４）、このＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることが好ましい（請求項５）。
【００２４】
また、前記分岐鎖は、強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体とすることができ（請求項６）、この場合において、本発明に係るポリマー材料は前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることが好ましい（請求項７）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖が、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを共重合成分とする共重合体よりなるものである。
【００２７】
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００２８】
本発明に係るポリマー材料において、分岐鎖は、強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーのブロック重合体であることが好ましい。
【００２９】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３０】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３１】
なお、以下においては、イニファターとして上述のような分岐鎖を有するものを用いて光照射リビング重合を行う場合を例示して、本発明の遺伝子導入剤の製造方法を説明するが、本発明は何らこの方法に限定されるものではない。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３３】
このイニファターに重合させる強塩基性カチオン性モノマーとしては、ｐｋａ＝８．０〜１２．０程度のビニル系モノマーが好ましく、ｐｋａが上記範囲内であると、本発明の遺伝子導入剤がＤＮＡなどの核酸をより強く凝縮することができる。具体的には、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２及びその誘導体が好ましい。上記強塩基性カチオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３４】
また、弱塩基性カチオン性モノマーとしては、ｐｋａ＝６．５〜７．９程度のビニル系モノマーが好ましく、ｐｋａが上記範囲内であると、酸性条件であるエンドソーム内におけるプロトン捕捉性に優れる。具体的には、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体が好ましい。上記弱塩基性カチオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
この弱塩基性カチオン性モノマーとしては、特に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートは、中性〜塩基性条件下での加水分解性に優れ、特に塩基性条件下では分解速度が速い。本発明の遺伝子導入剤では、強塩基性のカチオン性モノマーが同一分子内に重合配置されているため、当然、分子周辺の雰囲気は塩基性となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートユニットの加水分解が促成されるのである。従って、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで遺伝子導入剤を細胞に作用させる時間内（通常は数時間）でも加水分解がある程度進行するのである。
つまり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを分岐鎖に導入した場合、遺伝子導入中に加水分解が起こり、加水分解部位がカチオン性からアニオン性へと変化するため、この部分でＤＮＡと静電反発し、ＤＮＡを放出しやすくなる。また、分岐鎖の一部がアニオン性となることで、分岐鎖全体でのカチオン性が失われ、遺伝導入剤がハウスキーピング遺伝子を包接しにくくなるため細胞毒性が低減する。
【００３６】
本発明の一態様では、イニファターに対し、まず強塩基性カチオン性モノマーを重合させて強塩基性カチオン性ホモポリマーを得、これに弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させることで、分岐鎖が、基端側に強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体とする。
【００３７】
イニファターと上記強塩基性カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及び強塩基性カチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を得る。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【００３８】
この強塩基性カチオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は０．１Ｍ以上、例えば０．１〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３９】
照射する光の波長は２００〜４００ｎｍが好適であり、例えば、低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜５０分程度が特に好適である。
【００４０】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００４１】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００４２】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００４３】
このような光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーを得る。
【００４４】
この強塩基性カチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００４５】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量を指す。
【００４６】
このようにして生成した分岐型重合体よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーに対し、弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させて目的とするポリマー材料とする。
【００４７】
弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させるには、上記のようにして合成した強塩基性カチオン性分岐型重合体（ホモポリマー）をメタノール等の溶媒に溶解させ、これに弱塩基性カチオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性分岐型ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、アニオン性モノマーの濃度は０．１〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、波長２００〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４８】
この強塩基性カチオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の鎖数によるが１０，０００〜１５０，０００程度、特に３０，０００〜１００，０００程度、とりわけ５０，０００〜８０，０００程度が好ましい。
【００４９】
また、各分岐鎖中の強塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましく、弱塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましい。
【００５０】
本発明の別の一態様では、モノマーとして、強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーと、非イオン性モノマーとを用いて、分岐鎖が、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、非イオン性モノマーのポリマーブロックとを有するブロック重合体とする。
【００５１】
上記３種類のモノマーを用いる場合のイニファターに対する重合の順序としては、イニファターに対し、まず非イオン性モノマーを重合させて、非イオン性ホモポリマーを得、これに強塩基性カチオン性モノマーを重合し、次いで弱塩基性カチオン性モノマーを重合することが好ましく、これにより、分岐鎖の基端側に非イオン性モノマーのポリマーブロック有し、分岐鎖の先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、非イオン性モノマーのポリマーブロックと弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックとの間に、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体とすることが好ましい。この場合、非イオン性ホモポリマーの分子量は、分岐鎖の数によるが１０，０００〜１００，０００程度、非イオン性ポリマーブロックと強塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２０，０００〜２００，０００程度、非イオン性ポリマーブロックと強塩基性カチオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２５，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００５２】
また、イニファターに対し、まず強塩基性カチオン性モノマーを重合させて強塩基性カチオン性ホモポリマーを得、これに非イオン性モノマーを重合し、次いで弱塩基性カチオン性モノマーを重合して、分岐鎖の基端側に強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロック有し、分岐鎖の先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックとの間に、非イオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体としてもよい。この場合、強塩基性カチオン性ホモポリマーの分子量は１０，０００〜１００，０００程度、強塩基性カチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２０，０００〜２００，０００程度、強塩基性カチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２５，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００５３】
さらに、上記３種類のモノマーをブロック重合した各分岐鎖中の非イオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなり、強塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなり、弱塩基性カチオン性ポリマーブロックは１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましい。
【００５４】
非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、また、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
上記の通り合成した本発明の遺伝子導入剤は、良溶媒に溶解した後、薄く流延して乾燥させることでフィルム成形し精製することが可能である。例えば、ガラス板へ共重合体溶液を流延して作製したフィルムをエーテル中に浸漬することで、フィルムからモノマーを抽出することができる。また、汎用のエバポレーターで回転数を上げ、フィルムを形成することも可能である。この場合、フラスコへエーテルを注入することでモノマーを抽出・除去することが可能である。さらに、フィルム形成の際に、溶媒の蒸発時間を短くすることでフィルムを多孔性にすることもできる。この場合、エーテルと接触する表面積が増えるため、モノマーの抽出効率が向上する。
【００５６】
本発明の遺伝子導入剤（ベクター）と核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５７】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５８】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００５９】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６３】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００６４】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６５】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６６】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６７】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６８】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００６９】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００７０】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００７１】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００７２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７３】
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７４】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００７６】
【化１】
【００７７】
ii)強塩基性カチオン性モノマーのブロック重合
下記反応式に従い、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００７８】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を照射した。なお、混合紫外線の照射時間は３０分又は４０分間であり、混合紫外線を３０分間照射することにより得られたホモポリマーを、以下「ホモポリマーＩ」といい、混合紫外線を４０分間照射することにより得られたホモポリマーを、以下「ホモポリマーII」という。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーＩ，IIをそれぞれ得た。
【００７９】
ホモポリマーＩの重合率は２６％、ホモポリマーIIの重合率は３５％となった。ポリエチレングリコールを標準物質としたホモポリマーＩとホモポリマーIIの数平均分子量は、ＧＰＣにより、それぞれ、３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）、５５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。
【００８０】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、ホモポリマーＩ，IIともに、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８１】
【化２】
【００８２】
iii)強塩基性カチオン性ホモポリマーへの弱塩基性カチオン性モノマーのブロック重合
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを弱塩基性カチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＤＭＡＥＭＡＡと記すことがある。）の合成を行った。
【００８３】
即ち、上記ii）で合成したホモポリマーI（分子量３５，０００）４．０ｇ及び２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０グラムを約３０ｍＬのメタノールへ溶解し、全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。ガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、光照射時間を４０分としてii)と同様の手法で光照射重合を行った。３００ｍＬのナスフラスコを使用して重合溶液をエバポレーターで濃縮した後、真空乾燥してフラスコ内でポリマーフィルムを形成させた。ここへ２００ｍＬのジエチルエーテルを加え、３時間回転子で攪拌して残留モノマーを抽出した。エーテルをデカンテーションした後、新しいエーテルを２００ｍＬ加えて同様の操作を１０回繰り返した。得られたポリマーフィルムをベンゼンへ溶解し、凍結乾燥することで、テトラキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマー。以下、「ブロックコポリマー」という場合がある。）を得た（収率７％）。分子量はＧＰＣにより５５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８）と測定された。
【００８４】
以上より、４分岐型ポリマーの各分岐鎖に８７個モノマー単位からなる３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、３２個モノマー単位からなる２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックが導入された４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマーが合成されたことが確認された。
【００８５】
【化３】
【００８６】
［実施例１，比較例１〜３］
以下、上記ii）で合成したホモポリマーIを比較例１とし、ホモポリマーIIを比較例２とし、iii)で合成したブロックコポリマーを実施例１として各重合体の評価を行った。なお、比較例３は、ポリエチレンイミン製の遺伝子導入試薬「ＥｘＧｅｎ５００」（ユーロメディック社製）である。
【００８７】
iv）イオン交換容量のｐＨ依存性
ii）で合成したホモポリマーII（比較例２）及びiii）で合成したブロックコポリマー（実施例１）を各々０．１グラム分取し、約２００ｍＬの水へ溶解し、速やかに０．０５Ｎ塩酸で自動中和滴定装置（京都電子社、ＡＴ−６１０）を用いて滴定を行った。ｐＨとイオン交換容量の関係を図１に示した。
【００８８】
図１より、比較例２は中性域に一つの緩衝領域があるのに対して、実施例１は中性域の他、ｐＨ＝５〜６の領域にわずかな緩衝領域があることが分かる。これは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックの側鎖のｐＫａの相違によるものであると考えられる。
【００８９】
v）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートの加水分解性
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重水へ溶解し、ＮＭＲで経時変化を確認した。溶解と同時に加水分解が始まり、メタクリル酸と２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エタノールが生成し、４時間後に３５％が分解した。
【００９０】
この結果から、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマーの２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックがカチオン性からアニオン性へと変わる機能を有していることが分かる。
【００９１】
vi) 遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００９２】
上記ii)またはiii）にて合成したホモポリマーＩ（比較例１）、ホモポリマーII（比較例２）及びブロックコポリマー（実施例１）を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はポリマー中のモノマー単位の分子量１５６または１５７から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００９３】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図２に示す。
【００９４】
比較例２は、比較例１に比べて遺伝子導入活性が向上している。これは、比較例２が比較例１に比べて分子量が大きく、核酸を包接しやすいためであると考えられる。一方、比較例２と実施例１とは同じ分子量であるが、実施例１の方が遺伝子導入活性に優れている。これは、実施例１の分岐鎖に導入された弱塩基性カチオン性ポリマーブロックが、加水分解してＤＮＡを容易に放出すると共に、エンドソーム内において多量のプロトンを捕捉し、プロトンスポンジ現象が起きているためであると推察される。
【００９５】
vii）細胞毒性
vi）と同様の細胞を使用して細胞毒性を評価した。９６Ｗｅｌｌ培養皿の各Ｗｅｌｌへ５，０００個の細胞を播種し、２４時間培養した。この各Ｗｅｌｌへ、vi）の要領で調製したポリプレックス溶液を６．２μＬづつ滴下した。比較例３のポリエチレンイミン製の遺伝子導入試薬については、添付のプロトコールに従って添加した。３時間後、ＰＢＳで１回洗浄し、完全培地５０μＬを加えてさらに２４時間培養した。１０μＬのＷＳＴ８試薬（同仁堂）を加え、２時間後に４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，６８０ＸＲ）を使用して吸光度を測定し、生存細胞率（ブランクとして生理食塩水６．２μＬを滴下したＷｅｌｌの吸光度に対する割合（％））を計算した。結果を図３に示す。
【００９６】
比較例１，２（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）では分子量に依存して細胞毒性の増加が確認された。これは当業者に周知の現象である。同じ分子量でも弱塩基性モノマーブロックを含有する実施例１（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマー）では細胞毒性の軽減が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】実施例１と比較例２のｐＨとイオン交換容量との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１及び比較例１，２のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３】実施例１及び比較例１〜３の生存細胞率を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
本出願人らは、ＤＮＡを細胞中に運搬するための合成高分子ベクターとして、ベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。
【０００４】
この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【０００５】
ところで、合成高分子ベクターの遺伝子導入効率を向上させるためには、ＤＮＡとのイオン複合体が細胞内へ取り込まれた後に、いかにエンドソーム内から脱出するかに依存している、と考えられている。エンドソームからイオン複合体が脱出するには、カチオン性高分子のアミンを中和するための大量のプロトンがエンドソーム内へ浸透し、これによりエンドソーム内の内圧が上がって破裂するプロトンスポンジ現象を起こす必要がある。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができる。このため、ポリプレックス粒子の細胞膜透過性が高くなり、遺伝子導入活性が向上したが、下記（１）〜（３）に挙げる不具合があった。
【０００７】
（１）ＤＮＡを小さく凝縮させるために電荷密度を上げる工夫がされてきたが、一方で、一度頑強に凝縮された微粒子は容易には解離することなく安定に存在することになる（所謂、オーバーコンデンスの状態になる）ため、細胞内でＤＮＡを放出しにくくなる。放出されなかったＤＮＡは当然ｍＲＮＡへ転写されることはなく、タンパクの発現には至らない。
（２）一般に細胞培養及び遺伝子の導入は、中性条件下で行われる。そのため中性条件下でも十分にイオン強度の高いカチオン性高分子の原料として、ｐＫａの高いモノマーが選択される。しかしながら、このような高ｐＫａモノマーからなるカチオン性ポリマーは、中性条件下において、その側鎖の窒素原子のほぼ１００％がカチオン化されており、細胞内へ取り込まれた後にエンドソーム内で、酸性となってもプロトンを呼び込むキャパシティーに欠ける。このため、前述のプロトンスポンジ現象が得られない。
（３）遺伝子導入剤の電荷密度が高いため、運搬したＤＮＡを放出した後、細胞内でカウンターイオンを包接する能力が高い。従って、核膜近傍でＤＮＡを放出した場合、ハウスキーピング遺伝子（常時細胞内で起こっている細胞の増殖、維持に必要な遺伝子）を包接して、その機能の発現を阻害してしまう可能性がある。この場合、細胞の維持が妨げられ、その結果、強い細胞毒性を発現する。
【０００８】
本発明は、上記従来の遺伝子導入剤の問題点を解決し、細胞内でのＤＮＡの放出性及びプロトン受容性に優れ、細胞被毒の問題のない遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記強塩基性カチオン性モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体であり、前記弱塩基性カチオン性モノマーは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項４ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明（請求項８）の核酸複合体は、請求項１ないし７のいずれか1項に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤であって、該分岐鎖が少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなるものであるため、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができ、また、エンドソーム内においてもプロトンを捕捉することができるため、遺伝子導入効率が高い。
【００１８】
これは、本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖に導入された強塩基性カチオン性モノマーが、中性条件下においても十分にイオン強度が高く、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができるためであり、また、分岐鎖に導入された弱塩基性カチオン性モノマーが、酸性条件であるエンドソーム内においても、プロトンを呼び込むポテンシャルを有しているため、大量のプロトンをエンドソーム内へ浸透させ、エンドソームの内圧を高めることができる（即ち、プロトンスポンジ現象が発現する。）ためである。
【００１９】
本発明では、特に、強塩基性カチオン性モノマーとして、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体を用いることが好ましく、弱塩基性カチオン性モノマーとして、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を用いることが好ましく（請求項２）、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることが好ましい（請求項３）。
【００２０】
特に、弱塩基性カチオン性モノマーとして、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを分岐鎖に導入した場合、エンドソーム内におけるプロトンの受容性が向上するだけでなく、ＤＮＡの放出性も向上し、細胞毒性も低減する。これは２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが、加水分解性に優れることによるものであり、具体的には、中性条件下において、約４時間で全体の約３５％が２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールとメタクリル酸とに加水分解される。
【００２１】
即ち、分岐鎖中の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート部位は、遺伝子導入剤を細胞に作用させている時間内で加水分解が起こり、加水分解が起きた部位がカチオン性からアニオン性へと変化する。この結果、加水分解によりアニオン性となった部位と、アニオン性であるＤＮＡとが静電反発して、遺伝子導入剤とＤＮＡとが解離しやすくなる。従って、ＤＮＡの放出性に優れる。
【００２２】
また、分岐鎖の一部がカチオン性からアニオン性へと変化し、分岐鎖のカチオン性が失われることにより、ハウスキーピング遺伝子を包接する能力も失うため、細胞毒性が低減する。
【００２３】
本発明に係るポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましく（請求項４）、このＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることが好ましい（請求項５）。
【００２４】
また、前記分岐鎖は、強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体とすることができ（請求項６）、この場合において、本発明に係るポリマー材料は前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることが好ましい（請求項７）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖が、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを共重合成分とする共重合体よりなるものである。
【００２７】
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００２８】
本発明に係るポリマー材料において、分岐鎖は、強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーのブロック重合体であることが好ましい。
【００２９】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３０】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３１】
なお、以下においては、イニファターとして上述のような分岐鎖を有するものを用いて光照射リビング重合を行う場合を例示して、本発明の遺伝子導入剤の製造方法を説明するが、本発明は何らこの方法に限定されるものではない。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３３】
このイニファターに重合させる強塩基性カチオン性モノマーとしては、ｐｋａ＝８．０〜１２．０程度のビニル系モノマーが好ましく、ｐｋａが上記範囲内であると、本発明の遺伝子導入剤がＤＮＡなどの核酸をより強く凝縮することができる。具体的には、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２及びその誘導体が好ましい。上記強塩基性カチオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３４】
また、弱塩基性カチオン性モノマーとしては、ｐｋａ＝６．５〜７．９程度のビニル系モノマーが好ましく、ｐｋａが上記範囲内であると、酸性条件であるエンドソーム内におけるプロトン捕捉性に優れる。具体的には、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体が好ましい。上記弱塩基性カチオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
この弱塩基性カチオン性モノマーとしては、特に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートは、中性〜塩基性条件下での加水分解性に優れ、特に塩基性条件下では分解速度が速い。本発明の遺伝子導入剤では、強塩基性のカチオン性モノマーが同一分子内に重合配置されているため、当然、分子周辺の雰囲気は塩基性となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートユニットの加水分解が促成されるのである。従って、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで遺伝子導入剤を細胞に作用させる時間内（通常は数時間）でも加水分解がある程度進行するのである。
つまり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを分岐鎖に導入した場合、遺伝子導入中に加水分解が起こり、加水分解部位がカチオン性からアニオン性へと変化するため、この部分でＤＮＡと静電反発し、ＤＮＡを放出しやすくなる。また、分岐鎖の一部がアニオン性となることで、分岐鎖全体でのカチオン性が失われ、遺伝導入剤がハウスキーピング遺伝子を包接しにくくなるため細胞毒性が低減する。
【００３６】
本発明の一態様では、イニファターに対し、まず強塩基性カチオン性モノマーを重合させて強塩基性カチオン性ホモポリマーを得、これに弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させることで、分岐鎖が、基端側に強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体とする。
【００３７】
イニファターと上記強塩基性カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及び強塩基性カチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を得る。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【００３８】
この強塩基性カチオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は０．１Ｍ以上、例えば０．１〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３９】
照射する光の波長は２００〜４００ｎｍが好適であり、例えば、低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜５０分程度が特に好適である。
【００４０】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００４１】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００４２】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００４３】
このような光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーを得る。
【００４４】
この強塩基性カチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００４５】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量を指す。
【００４６】
このようにして生成した分岐型重合体よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーに対し、弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させて目的とするポリマー材料とする。
【００４７】
弱塩基性カチオン性モノマーをブロック重合させるには、上記のようにして合成した強塩基性カチオン性分岐型重合体（ホモポリマー）をメタノール等の溶媒に溶解させ、これに弱塩基性カチオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性分岐型ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、アニオン性モノマーの濃度は０．１〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、波長２００〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４８】
この強塩基性カチオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の鎖数によるが１０，０００〜１５０，０００程度、特に３０，０００〜１００，０００程度、とりわけ５０，０００〜８０，０００程度が好ましい。
【００４９】
また、各分岐鎖中の強塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましく、弱塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましい。
【００５０】
本発明の別の一態様では、モノマーとして、強塩基性カチオン性モノマーと、弱塩基性カチオン性モノマーと、非イオン性モノマーとを用いて、分岐鎖が、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、非イオン性モノマーのポリマーブロックとを有するブロック重合体とする。
【００５１】
上記３種類のモノマーを用いる場合のイニファターに対する重合の順序としては、イニファターに対し、まず非イオン性モノマーを重合させて、非イオン性ホモポリマーを得、これに強塩基性カチオン性モノマーを重合し、次いで弱塩基性カチオン性モノマーを重合することが好ましく、これにより、分岐鎖の基端側に非イオン性モノマーのポリマーブロック有し、分岐鎖の先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、非イオン性モノマーのポリマーブロックと弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックとの間に、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体とすることが好ましい。この場合、非イオン性ホモポリマーの分子量は、分岐鎖の数によるが１０，０００〜１００，０００程度、非イオン性ポリマーブロックと強塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２０，０００〜２００，０００程度、非イオン性ポリマーブロックと強塩基性カチオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２５，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００５２】
また、イニファターに対し、まず強塩基性カチオン性モノマーを重合させて強塩基性カチオン性ホモポリマーを得、これに非イオン性モノマーを重合し、次いで弱塩基性カチオン性モノマーを重合して、分岐鎖の基端側に強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロック有し、分岐鎖の先端側に弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックを有し、強塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックと、弱塩基性カチオン性モノマーのポリマーブロックとの間に、非イオン性モノマーのポリマーブロックを有するブロック重合体としてもよい。この場合、強塩基性カチオン性ホモポリマーの分子量は１０，０００〜１００，０００程度、強塩基性カチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２０，０００〜２００，０００程度、強塩基性カチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックと弱塩基性カチオン性ポリマーブロックとを分岐鎖に有する分岐型重合体の分子量は２５，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００５３】
さらに、上記３種類のモノマーをブロック重合した各分岐鎖中の非イオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなり、強塩基性カチオン性ポリマーブロックは、１０〜１００個程度のモノマー単位からなり、弱塩基性カチオン性ポリマーブロックは１０〜１００個程度のモノマー単位からなることが好ましい。
【００５４】
非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、また、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
上記の通り合成した本発明の遺伝子導入剤は、良溶媒に溶解した後、薄く流延して乾燥させることでフィルム成形し精製することが可能である。例えば、ガラス板へ共重合体溶液を流延して作製したフィルムをエーテル中に浸漬することで、フィルムからモノマーを抽出することができる。また、汎用のエバポレーターで回転数を上げ、フィルムを形成することも可能である。この場合、フラスコへエーテルを注入することでモノマーを抽出・除去することが可能である。さらに、フィルム形成の際に、溶媒の蒸発時間を短くすることでフィルムを多孔性にすることもできる。この場合、エーテルと接触する表面積が増えるため、モノマーの抽出効率が向上する。
【００５６】
本発明の遺伝子導入剤（ベクター）と核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５７】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５８】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００５９】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６３】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００６４】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６５】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６６】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６７】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６８】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００６９】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００７０】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００７１】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００７２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７３】
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７４】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００７６】
【化１】
【００７７】
ii)強塩基性カチオン性モノマーのブロック重合
下記反応式に従い、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００７８】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を照射した。なお、混合紫外線の照射時間は３０分又は４０分間であり、混合紫外線を３０分間照射することにより得られたホモポリマーを、以下「ホモポリマーＩ」といい、混合紫外線を４０分間照射することにより得られたホモポリマーを、以下「ホモポリマーII」という。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなる強塩基性カチオン性ホモポリマーＩ，IIをそれぞれ得た。
【００７９】
ホモポリマーＩの重合率は２６％、ホモポリマーIIの重合率は３５％となった。ポリエチレングリコールを標準物質としたホモポリマーＩとホモポリマーIIの数平均分子量は、ＧＰＣにより、それぞれ、３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）、５５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。
【００８０】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、ホモポリマーＩ，IIともに、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８１】
【化２】
【００８２】
iii)強塩基性カチオン性ホモポリマーへの弱塩基性カチオン性モノマーのブロック重合
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを弱塩基性カチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＤＭＡＥＭＡＡと記すことがある。）の合成を行った。
【００８３】
即ち、上記ii）で合成したホモポリマーI（分子量３５，０００）４．０ｇ及び２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０グラムを約３０ｍＬのメタノールへ溶解し、全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。ガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、光照射時間を４０分としてii)と同様の手法で光照射重合を行った。３００ｍＬのナスフラスコを使用して重合溶液をエバポレーターで濃縮した後、真空乾燥してフラスコ内でポリマーフィルムを形成させた。ここへ２００ｍＬのジエチルエーテルを加え、３時間回転子で攪拌して残留モノマーを抽出した。エーテルをデカンテーションした後、新しいエーテルを２００ｍＬ加えて同様の操作を１０回繰り返した。得られたポリマーフィルムをベンゼンへ溶解し、凍結乾燥することで、テトラキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマー。以下、「ブロックコポリマー」という場合がある。）を得た（収率７％）。分子量はＧＰＣにより５５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８）と測定された。
【００８４】
以上より、４分岐型ポリマーの各分岐鎖に８７個モノマー単位からなる３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、３２個モノマー単位からなる２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックが導入された４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマーが合成されたことが確認された。
【００８５】
【化３】
【００８６】
［実施例１，比較例１〜３］
以下、上記ii）で合成したホモポリマーIを比較例１とし、ホモポリマーIIを比較例２とし、iii)で合成したブロックコポリマーを実施例１として各重合体の評価を行った。なお、比較例３は、ポリエチレンイミン製の遺伝子導入試薬「ＥｘＧｅｎ５００」（ユーロメディック社製）である。
【００８７】
iv）イオン交換容量のｐＨ依存性
ii）で合成したホモポリマーII（比較例２）及びiii）で合成したブロックコポリマー（実施例１）を各々０．１グラム分取し、約２００ｍＬの水へ溶解し、速やかに０．０５Ｎ塩酸で自動中和滴定装置（京都電子社、ＡＴ−６１０）を用いて滴定を行った。ｐＨとイオン交換容量の関係を図１に示した。
【００８８】
図１より、比較例２は中性域に一つの緩衝領域があるのに対して、実施例１は中性域の他、ｐＨ＝５〜６の領域にわずかな緩衝領域があることが分かる。これは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックの側鎖のｐＫａの相違によるものであると考えられる。
【００８９】
v）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートの加水分解性
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重水へ溶解し、ＮＭＲで経時変化を確認した。溶解と同時に加水分解が始まり、メタクリル酸と２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エタノールが生成し、４時間後に３５％が分解した。
【００９０】
この結果から、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマーの２-Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーブロックがカチオン性からアニオン性へと変わる機能を有していることが分かる。
【００９１】
vi) 遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００９２】
上記ii)またはiii）にて合成したホモポリマーＩ（比較例１）、ホモポリマーII（比較例２）及びブロックコポリマー（実施例１）を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はポリマー中のモノマー単位の分子量１５６または１５７から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００９３】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図２に示す。
【００９４】
比較例２は、比較例１に比べて遺伝子導入活性が向上している。これは、比較例２が比較例１に比べて分子量が大きく、核酸を包接しやすいためであると考えられる。一方、比較例２と実施例１とは同じ分子量であるが、実施例１の方が遺伝子導入活性に優れている。これは、実施例１の分岐鎖に導入された弱塩基性カチオン性ポリマーブロックが、加水分解してＤＮＡを容易に放出すると共に、エンドソーム内において多量のプロトンを捕捉し、プロトンスポンジ現象が起きているためであると推察される。
【００９５】
vii）細胞毒性
vi）と同様の細胞を使用して細胞毒性を評価した。９６Ｗｅｌｌ培養皿の各Ｗｅｌｌへ５，０００個の細胞を播種し、２４時間培養した。この各Ｗｅｌｌへ、vi）の要領で調製したポリプレックス溶液を６．２μＬづつ滴下した。比較例３のポリエチレンイミン製の遺伝子導入試薬については、添付のプロトコールに従って添加した。３時間後、ＰＢＳで１回洗浄し、完全培地５０μＬを加えてさらに２４時間培養した。１０μＬのＷＳＴ８試薬（同仁堂）を加え、２時間後に４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，６８０ＸＲ）を使用して吸光度を測定し、生存細胞率（ブランクとして生理食塩水６．２μＬを滴下したＷｅｌｌの吸光度に対する割合（％））を計算した。結果を図３に示す。
【００９６】
比較例１，２（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）では分子量に依存して細胞毒性の増加が確認された。これは当業者に周知の現象である。同じ分子量でも弱塩基性モノマーブロックを含有する実施例１（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＤＭＡＥＭＡＡブロックコポリマー）では細胞毒性の軽減が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】実施例１と比較例２のｐＨとイオン交換容量との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１及び比較例１，２のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３】実施例１及び比較例１〜３の生存細胞率を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、
該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記強塩基性カチオン性モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体であり、前記弱塩基性カチオン性モノマーは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料が前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか1項に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１】
分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、
該分岐鎖は、少なくとも強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとの共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記強塩基性カチオン性モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体であり、前記弱塩基性カチオン性モノマーは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記分岐鎖は、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体のポリマーブロックと、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックとを有するブロック重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記強塩基性カチオン性モノマーと弱塩基性カチオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖が前記強塩基性カチオン性モノマー及び弱塩基性カチオン性モノマーのみからなる共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料が前記イニファターに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び／又はその誘導体をブロック重合し、次いで、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体をブロック重合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか1項に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とする核酸複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１１５１５３（Ｐ２０１０−１１５１５３Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９０８３１（Ｐ２００８−２９０８３１）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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