遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法
【課題】本発明は、遺伝子物質の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその遺伝子物質固定化医療用粒子を用いた遺伝子物質の捕捉方法を提供することにある。
【解決手段】粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、ことを特徴とする医療用粒子で、遺伝子物資を、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する医療用粒子を提供することが可能となった。
【解決手段】粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、ことを特徴とする医療用粒子で、遺伝子物資を、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する医療用粒子を提供することが可能となった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴＤＮＡを固定した微粒子が、遺伝子診断などの分析試薬として利用できることが報告されている。（特許文献１）オリゴＤＮＡを固定した微粒子は、オリゴＤＮＡと試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を検出することによって種々の遺伝子解析が行われる。
【０００３】
微粒子表面にオリゴＤＮＡを固定する方法としては、種々開発されており、例えば、アミド結合を介する方法（特許文献２）、カルボジイミド基またはイソシアネート基を用い
た方法（特許文献２）を利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２５６３０６号公報
【特許文献２】特開２００１−１３９５３２号公報
【特許文献３】特開２００１−６６３０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遺伝子物質の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその遺伝子物質固定化医療用粒子を用いた遺伝子物質の捕捉方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（１６）に記載の本発明により達成される。
（１）遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）前記遺伝子物資が、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する（１）ないし（４）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記活性エステル基は、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である（１）ないし（５）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽
和重合性モノマーに由来するものである（１）ないし（６）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（８）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（７）に記載の医療用粒子。
【化１】
（９）前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている（１）ないし（８）のいずれか記載の医療用粒子。
（１０）前記無機材料が、無機酸化物である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（１０）に記載の医療用粒子。
（１２）前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である（９）に記載の医療用粒子。
（１３）前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である（１２）記載の医療用粒子。
（１４）前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている（１）ないし（１３）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（１５）遺伝子物質が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれる（１）ないし（１４）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（１６）（１）ないし（１５）いずれか１項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、遺伝子物質を固定した粒子で、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびそれを用いた遺伝子物質の捕捉方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】蛍光標識オリゴＤＮＡを本発明によるビーズに固定化した図。
【図２】オリゴＤＮＡを固定した本発明のビーズに、ＨＲＰ標識相補てきオリゴＤＮＡを反応させた後、吸光度測定した図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法について詳細に説明する。
本発明の遺伝子物質固定化医療用粒子は、遺伝子物質固定化した医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の遺伝子物質の捕捉方法は、上記に記載の遺伝子物質医療用粒子を用い、固定化した遺伝子物質に相補的な遺伝子を捕捉することを特徴とする。
【００１０】
ここで述べる遺伝子物質とは、特に限定するものではないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれるものが好ましい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡの場合は、固定化されるものは１本鎖の状態であることが好ましい。これにより相補的な遺伝子群を捕捉することが可能となる。また、遺伝子結合性蛋白質を補足する場合は、１本鎖でも２本鎖でもどちらでも良い。
【００１１】
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。
特に、ポリメタクリル酸メチルの粒子が、硬度が高い、水中での遠心分離が可能、さらには架橋させると耐薬品性が高まるといった理由から好適である。
【００１２】
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
【００１３】
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
また、粒径のそろったコア粒子を用いることによりフローサイトメトリーにも利用可能となる。
【００１４】
本発明の医療用粒子は、前記粒子状基材の表面に、遺伝子物質を固定化したもので、粒子状の基材の表面に、遺伝子物質を含む重合体を有するものである。遺伝子物質を含む重合体の導入方法については特に限定するものではない。この遺伝子物質を含む重合体は、粒子状表面に遺伝子物質を含む重合体を塗布、コーティングしても良いし、あらかじめ遺伝子物質と反応する官能基を有する重合体を粒子表面に塗布、コーティングした後、遺伝子物質を反応させても良い。最も好ましくは、遺伝子物質と反応する官能基を有する重合体を構成するモノマーを粒子表面で重合させた後、遺伝子物質を反応させても良い。この場合、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と重合性モノマーを混合し、次いで重合反応を進行させることにより、核となる粒子表面に高分子化合物を含む層を形成する方法が好適に用いられる。この方法によりすべて共有結合で遺伝子物質を含む安定した医療用粒子を得ることができる。
【００１５】
本発明の粒子表面に導入する重合性官能基としては、ビニル基、アリル基、メタクリル基、エポキシ基、スチレン基等が挙げられるが、重合性に優れている点でメタクリル基が好ましい。本発明の粒子表面に導入する連鎖移動基としては、メルカプト基、アミノ基等が挙げられるが、反応性に優れている点でメルカプト基が好ましい。
【００１６】
粒子表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入する方法としては、特に限定されないが、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面
の官能基との共有結合を形成させる方法が好ましい。
【００１７】
重合性官能基を有するシランカップリング剤としては、例えば、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシラン等が挙げられるが、反応性、及び入手性の点から（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシランや（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００１８】
連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、例えば（３-メルカプトプロピル
）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシ
ラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から（３-メルカ
プトプロピル）ジメチルメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシ
シランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００１９】
重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いて、重合性官能基、または連鎖移動基と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法は特に制限されるものではないが、例えば、ｐH２〜４の酸性水溶液に重合性官能基、または連鎖
移動基を有するシランカップリング剤を０．０１〜１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、撹拌混合して加水分解した後、核となる粒子を投入して１０〜１００℃で５〜１８０分間撹拌し、次いで、２０〜１００℃に加熱して粒子を乾燥させて行う。
【００２０】
核となる粒子と重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤０．１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。酸性水溶液は特に限定されるものではないが、酢酸水溶液、塩酸水溶液等が用いられる。なかでも、取り扱いが比較的容易な酢酸水溶液が好ましい。
【００２１】
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットが相補的遺伝子物質を捕捉することができるものである。
【００２２】
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中
に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
【００２３】
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００２４】
【化１】
【００２５】
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。 前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２６】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２７】
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述した遺伝子物質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットに質遺伝子物質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。
【００２８】
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いて遺伝子物質を固定化したものであっても良い。
【００２９】
【化２】
【００３０】
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、遺伝子物質と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に遺伝子物質を配置することが容易となる。
【００３１】
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、遺伝子物質の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００３２】
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在する遺伝子物質が分散するために、有効に作用することができる。
【００３３】
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００３４】
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。
【００３５】
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
【００３６】
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。
【００３７】
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐこ
とができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外の物質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、相補的な遺伝子の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
【００３８】
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記の遺伝子物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルな
どの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３９】
（遺伝子物質の固定化）
本発明において遺伝子物質をビーズ上に固定化する際には、遺伝子物質を溶解または分散させた液中に重合体固定ビーズを分散させる方法が簡便で好ましい。なお、遺伝子物質を１本鎖にした後、溶解又は分散させた液体を付着する方法とより好ましい。この際、遺伝子物質を１本鎖にする方法は、ＤＮＡのＴｍ以上の温度で加熱した後、氷冷する方法が簡便で好ましい。遺伝子物質を溶解する液体のｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０．０がより好ましい。この範囲外だと、遺伝子物質が変性、分解する恐れがある。また、固定化する際は重合体・遺伝子物質にダメージを与えない範囲で加熱してもよい。
遺伝子物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。また、遺伝子物質を固定化する官能基をブロッキングするとさらに非特異吸着を抑制することが可能となる。ブロッキング剤は遺伝子物質を固定化する官能基に応じて適宜選択できるが、たとえば活性エステル基の場合は、２−アミノエタノールなどが好適に用いられる。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
（重合体固定ビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、宇部日東化成株式会社製 ハイプレシカＴＳ）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００４１】
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
【００４２】
（オリゴＤＮＡ固定化ビーズの作製）
前記の重合体固定ビーズ５ｍｇに、ＤＮＡ固定化用バッファ（住友ベークライト製、ＤＮＡ固定化用９６ウェルプレートキット、ＢＳ−６１６０２、付属）に溶解させたＣｙ３標識オリゴＤＮＡ（ggaatttcgc taccttagga ccgttatagt tacg、３４Ｍｅｒ、末端アミノ基
）を添加し、５７℃で一晩加熱して固定化した。Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡを固定化したビーズを純水で３回洗浄し、固定化されていないオリゴＤＮＡを除去した。ビーズを純水に分散させた後、スライドガラス上に滴下し分散させ、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図１に示す。
表面処理ビーズに対しオリゴＤＮＡ固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
【００４３】
＜実施例２＞
（オリゴＤＮＡ固定化ビーズのハイブリ）
まず、実施例１で作製した重合体固定ビーズにオリゴＤＮＡを固定化した。具体的には当該ビーズ２０ｍｇを１００ｐｍｏｌのオリゴＤＮＡ含有固定化液１００μＬに分散させ、５７℃で一晩加熱。 反応終了後、純水で３回洗浄。さらに９５℃で１０分間加熱、氷で
急冷した。
次に、オリゴＤＮＡを固定化したビーズにビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせた。具体的には、所定量のビオチン標識されたターゲットＤＮＡを溶解したハイブリ液１００μＬを９５℃で１０分間加熱、この溶液をオリゴＤＮＡ固定化ビーズ２ｍｇに加え、６５℃３時間転倒混和。固定されなかったターゲットＤＮＡを洗浄により除去した。
さらに、ビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせたビーズと、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと反応させた。具体的には、０．１μｇ/ｍＬに調製したＨＲＰ標識ス
トレプトアビジンのＰＢＳ溶液１ｍＬを添加し、３７℃１５分転倒混和。反応しなかったＨＲＰ標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で４倍に希釈して吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。
【００４４】
＜実施例３＞
本発明の遺伝子固定化ビーズにハイブリした遺伝子が、脱ハイブリが可能かどうかを検証した。具体的には、実施例２でハイブリさせたビーズを９５℃で１０分加熱、ＰＢＳで３回洗浄した。こうして得られたビーズを、実施例２と同様、０．１μｇ/ｍＬに調製した
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンのＰＢＳ溶液１ｍＬを添加し、３７℃１５分転倒混和。反応しなかったＨＲＰ標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で４倍に希釈して吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。
【００４５】
＜比較例１＞
表面処理をしていないシリカビーズ（平均粒径５μｍ、宇部日東化成株式会社製、ハイプレシカＴＳ）に対しても実施例１と同様のＣｙ３標識オリゴＤＮＡ固定化の処理を行った。
図１によると、表面処理ビーズに対しオリゴＤＮＡ固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
一方、未処理ビーズに対し同様にオリゴＤＮＡ固定化を行った場合は、蛍光がほとんど観察されなかった。 このことから、重合体固定ビーズには末端にアミノ基を有するオリゴ
ＤＮＡを固定化できることが分かった。
また、オリゴＤＮＡの処方量の増加とともに、固定化量が増加した。
【００４６】
＜比較例２＞
実施例２において、オリゴＤＮＡを添加しないビーズを作製、このビーズに対しても実施例２と同様、ビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせたのち、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応させ、ぺルオキシダーゼ発色キットで発色した。
【００４７】
図２より、ターゲットＤＮＡをハイブリさせたビーズはターゲット量に応じてシグナル上昇 。９５℃で加熱した後のビーズはシグナルが減少した。このことよりビーズに固定し
たＤＮＡにターゲットＤＮＡをハイブリ可能であり、 また、実施例３に記載した加熱に
よる脱ハイブリも可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の医療用粒子を用いることで、オリゴＤＮＡを選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴＤＮＡを固定した微粒子が、遺伝子診断などの分析試薬として利用できることが報告されている。（特許文献１）オリゴＤＮＡを固定した微粒子は、オリゴＤＮＡと試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を検出することによって種々の遺伝子解析が行われる。
【０００３】
微粒子表面にオリゴＤＮＡを固定する方法としては、種々開発されており、例えば、アミド結合を介する方法（特許文献２）、カルボジイミド基またはイソシアネート基を用い
た方法（特許文献２）を利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２５６３０６号公報
【特許文献２】特開２００１−１３９５３２号公報
【特許文献３】特開２００１−６６３０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遺伝子物質の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその遺伝子物質固定化医療用粒子を用いた遺伝子物質の捕捉方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（１６）に記載の本発明により達成される。
（１）遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）前記遺伝子物資が、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する（１）ないし（４）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記活性エステル基は、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である（１）ないし（５）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽
和重合性モノマーに由来するものである（１）ないし（６）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（８）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（７）に記載の医療用粒子。
【化１】
（９）前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている（１）ないし（８）のいずれか記載の医療用粒子。
（１０）前記無機材料が、無機酸化物である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（１０）に記載の医療用粒子。
（１２）前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である（９）に記載の医療用粒子。
（１３）前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である（１２）記載の医療用粒子。
（１４）前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている（１）ないし（１３）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（１５）遺伝子物質が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれる（１）ないし（１４）いずれか１項に記載の医療用粒子。
（１６）（１）ないし（１５）いずれか１項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、遺伝子物質を固定した粒子で、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびそれを用いた遺伝子物質の捕捉方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】蛍光標識オリゴＤＮＡを本発明によるビーズに固定化した図。
【図２】オリゴＤＮＡを固定した本発明のビーズに、ＨＲＰ標識相補てきオリゴＤＮＡを反応させた後、吸光度測定した図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法について詳細に説明する。
本発明の遺伝子物質固定化医療用粒子は、遺伝子物質固定化した医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の遺伝子物質の捕捉方法は、上記に記載の遺伝子物質医療用粒子を用い、固定化した遺伝子物質に相補的な遺伝子を捕捉することを特徴とする。
【００１０】
ここで述べる遺伝子物質とは、特に限定するものではないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれるものが好ましい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡの場合は、固定化されるものは１本鎖の状態であることが好ましい。これにより相補的な遺伝子群を捕捉することが可能となる。また、遺伝子結合性蛋白質を補足する場合は、１本鎖でも２本鎖でもどちらでも良い。
【００１１】
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。
特に、ポリメタクリル酸メチルの粒子が、硬度が高い、水中での遠心分離が可能、さらには架橋させると耐薬品性が高まるといった理由から好適である。
【００１２】
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
【００１３】
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
また、粒径のそろったコア粒子を用いることによりフローサイトメトリーにも利用可能となる。
【００１４】
本発明の医療用粒子は、前記粒子状基材の表面に、遺伝子物質を固定化したもので、粒子状の基材の表面に、遺伝子物質を含む重合体を有するものである。遺伝子物質を含む重合体の導入方法については特に限定するものではない。この遺伝子物質を含む重合体は、粒子状表面に遺伝子物質を含む重合体を塗布、コーティングしても良いし、あらかじめ遺伝子物質と反応する官能基を有する重合体を粒子表面に塗布、コーティングした後、遺伝子物質を反応させても良い。最も好ましくは、遺伝子物質と反応する官能基を有する重合体を構成するモノマーを粒子表面で重合させた後、遺伝子物質を反応させても良い。この場合、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と重合性モノマーを混合し、次いで重合反応を進行させることにより、核となる粒子表面に高分子化合物を含む層を形成する方法が好適に用いられる。この方法によりすべて共有結合で遺伝子物質を含む安定した医療用粒子を得ることができる。
【００１５】
本発明の粒子表面に導入する重合性官能基としては、ビニル基、アリル基、メタクリル基、エポキシ基、スチレン基等が挙げられるが、重合性に優れている点でメタクリル基が好ましい。本発明の粒子表面に導入する連鎖移動基としては、メルカプト基、アミノ基等が挙げられるが、反応性に優れている点でメルカプト基が好ましい。
【００１６】
粒子表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入する方法としては、特に限定されないが、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面
の官能基との共有結合を形成させる方法が好ましい。
【００１７】
重合性官能基を有するシランカップリング剤としては、例えば、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシラン等が挙げられるが、反応性、及び入手性の点から（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシランや（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００１８】
連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、例えば（３-メルカプトプロピル
）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシ
ラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から（３-メルカ
プトプロピル）ジメチルメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシ
シランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００１９】
重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いて、重合性官能基、または連鎖移動基と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法は特に制限されるものではないが、例えば、ｐH２〜４の酸性水溶液に重合性官能基、または連鎖
移動基を有するシランカップリング剤を０．０１〜１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、撹拌混合して加水分解した後、核となる粒子を投入して１０〜１００℃で５〜１８０分間撹拌し、次いで、２０〜１００℃に加熱して粒子を乾燥させて行う。
【００２０】
核となる粒子と重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤０．１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。酸性水溶液は特に限定されるものではないが、酢酸水溶液、塩酸水溶液等が用いられる。なかでも、取り扱いが比較的容易な酢酸水溶液が好ましい。
【００２１】
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットが相補的遺伝子物質を捕捉することができるものである。
【００２２】
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中
に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
【００２３】
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００２４】
【化１】
【００２５】
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。 前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２６】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２７】
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述した遺伝子物質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットに質遺伝子物質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。
【００２８】
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いて遺伝子物質を固定化したものであっても良い。
【００２９】
【化２】
【００３０】
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、遺伝子物質と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に遺伝子物質を配置することが容易となる。
【００３１】
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、遺伝子物質の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００３２】
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在する遺伝子物質が分散するために、有効に作用することができる。
【００３３】
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００３４】
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。
【００３５】
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
【００３６】
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。
【００３７】
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐこ
とができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外の物質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、相補的な遺伝子の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
【００３８】
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記の遺伝子物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルな
どの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３９】
（遺伝子物質の固定化）
本発明において遺伝子物質をビーズ上に固定化する際には、遺伝子物質を溶解または分散させた液中に重合体固定ビーズを分散させる方法が簡便で好ましい。なお、遺伝子物質を１本鎖にした後、溶解又は分散させた液体を付着する方法とより好ましい。この際、遺伝子物質を１本鎖にする方法は、ＤＮＡのＴｍ以上の温度で加熱した後、氷冷する方法が簡便で好ましい。遺伝子物質を溶解する液体のｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０．０がより好ましい。この範囲外だと、遺伝子物質が変性、分解する恐れがある。また、固定化する際は重合体・遺伝子物質にダメージを与えない範囲で加熱してもよい。
遺伝子物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。また、遺伝子物質を固定化する官能基をブロッキングするとさらに非特異吸着を抑制することが可能となる。ブロッキング剤は遺伝子物質を固定化する官能基に応じて適宜選択できるが、たとえば活性エステル基の場合は、２−アミノエタノールなどが好適に用いられる。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
（重合体固定ビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、宇部日東化成株式会社製 ハイプレシカＴＳ）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００４１】
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
【００４２】
（オリゴＤＮＡ固定化ビーズの作製）
前記の重合体固定ビーズ５ｍｇに、ＤＮＡ固定化用バッファ（住友ベークライト製、ＤＮＡ固定化用９６ウェルプレートキット、ＢＳ−６１６０２、付属）に溶解させたＣｙ３標識オリゴＤＮＡ（ggaatttcgc taccttagga ccgttatagt tacg、３４Ｍｅｒ、末端アミノ基
）を添加し、５７℃で一晩加熱して固定化した。Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡを固定化したビーズを純水で３回洗浄し、固定化されていないオリゴＤＮＡを除去した。ビーズを純水に分散させた後、スライドガラス上に滴下し分散させ、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図１に示す。
表面処理ビーズに対しオリゴＤＮＡ固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
【００４３】
＜実施例２＞
（オリゴＤＮＡ固定化ビーズのハイブリ）
まず、実施例１で作製した重合体固定ビーズにオリゴＤＮＡを固定化した。具体的には当該ビーズ２０ｍｇを１００ｐｍｏｌのオリゴＤＮＡ含有固定化液１００μＬに分散させ、５７℃で一晩加熱。 反応終了後、純水で３回洗浄。さらに９５℃で１０分間加熱、氷で
急冷した。
次に、オリゴＤＮＡを固定化したビーズにビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせた。具体的には、所定量のビオチン標識されたターゲットＤＮＡを溶解したハイブリ液１００μＬを９５℃で１０分間加熱、この溶液をオリゴＤＮＡ固定化ビーズ２ｍｇに加え、６５℃３時間転倒混和。固定されなかったターゲットＤＮＡを洗浄により除去した。
さらに、ビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせたビーズと、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと反応させた。具体的には、０．１μｇ/ｍＬに調製したＨＲＰ標識ス
トレプトアビジンのＰＢＳ溶液１ｍＬを添加し、３７℃１５分転倒混和。反応しなかったＨＲＰ標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で４倍に希釈して吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。
【００４４】
＜実施例３＞
本発明の遺伝子固定化ビーズにハイブリした遺伝子が、脱ハイブリが可能かどうかを検証した。具体的には、実施例２でハイブリさせたビーズを９５℃で１０分加熱、ＰＢＳで３回洗浄した。こうして得られたビーズを、実施例２と同様、０．１μｇ/ｍＬに調製した
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンのＰＢＳ溶液１ｍＬを添加し、３７℃１５分転倒混和。反応しなかったＨＲＰ標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で４倍に希釈して吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。
【００４５】
＜比較例１＞
表面処理をしていないシリカビーズ（平均粒径５μｍ、宇部日東化成株式会社製、ハイプレシカＴＳ）に対しても実施例１と同様のＣｙ３標識オリゴＤＮＡ固定化の処理を行った。
図１によると、表面処理ビーズに対しオリゴＤＮＡ固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
一方、未処理ビーズに対し同様にオリゴＤＮＡ固定化を行った場合は、蛍光がほとんど観察されなかった。 このことから、重合体固定ビーズには末端にアミノ基を有するオリゴ
ＤＮＡを固定化できることが分かった。
また、オリゴＤＮＡの処方量の増加とともに、固定化量が増加した。
【００４６】
＜比較例２＞
実施例２において、オリゴＤＮＡを添加しないビーズを作製、このビーズに対しても実施例２と同様、ビオチン標識されたターゲットＤＮＡをハイブリさせたのち、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応させ、ぺルオキシダーゼ発色キットで発色した。
【００４７】
図２より、ターゲットＤＮＡをハイブリさせたビーズはターゲット量に応じてシグナル上昇 。９５℃で加熱した後のビーズはシグナルが減少した。このことよりビーズに固定し
たＤＮＡにターゲットＤＮＡをハイブリ可能であり、 また、実施例３に記載した加熱に
よる脱ハイブリも可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の医療用粒子を用いることで、オリゴＤＮＡを選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。
【請求項２】
前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である請求項１または２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である請求項１ないし３いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項５】
前記遺伝子物資が、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する請求項１ないし４いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記活性エステル基は、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である請求項１ないし５いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである請求項１ないし６いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項８】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである請求項７に記載の医療用粒子。
【化１】
【請求項９】
前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている請求項１ないし８のいずれか記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記無機材料が、無機酸化物である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項１０に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１３】
前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である請求項１２記載の医療用粒子。
【請求項１４】
前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている請求項１ないし１３いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１５】
遺伝子物質が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれる請求項1ないし１４いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１６】
請求項１ないし１５いずれか１項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
【請求項１】
遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第２繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。
【請求項２】
前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である請求項１または２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である請求項１ないし３いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項５】
前記遺伝子物資が、前記第２繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する請求項１ないし４いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記活性エステル基は、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である請求項１ないし５いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである請求項１ないし６いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項８】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである請求項７に記載の医療用粒子。
【化１】
【請求項９】
前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている請求項１ないし８のいずれか記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記無機材料が、無機酸化物である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項１０に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１３】
前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である請求項１２記載の医療用粒子。
【請求項１４】
前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている請求項１ないし１３いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１５】
遺伝子物質が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの少なくとも一種から選ばれる請求項1ないし１４いずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１６】
請求項１ないし１５いずれか１項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−１９７１３（Ｐ２０１３−１９７１３Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５１５２１（Ｐ２０１１−１５１５２１）
【出願日】平成２３年７月８日（２０１１．７．８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月８日（２０１１．７．８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
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