遺伝子発現制御のための一本鎖ＲＮＡ分子
【課題】 遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子を提供する。
【解決手段】 標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たす分子とする。
条件（１）：前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）：前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【解決手段】 標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たす分子とする。
条件（１）：前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）：前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する一本鎖ＲＮＡ核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、より優れたＲＮＡ分子の提供が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の第１の一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【０００７】
本発明の第２の一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１１】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
【００１２】
本発明の一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ分子）は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＲＮＡ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＲＮＡ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導用ｓｓＲＮＡ分子」または「ＲＮＡ干渉剤もしくはＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。
【００１３】
１．第１のｓｓＲＮＡ分子
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含むｓｓＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【００１４】
前記第１のｓｓＲＮＡは、例えば、前記条件（１）および前記条件（２）のいずれか一方のみを満たしてもよいし、両方の条件を満たしてもよい。
【００１５】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜４塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記ハイブリダイズする塩基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００１６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。具体例として、例えば、前記アデニン塩基を有するヌクレオチド残基および前記ウラシル塩基を有するヌクレオチド残基の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、より好ましくは、前記アデニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域が、前記デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００１７】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜３塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００１８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、さらに前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域に、デオキシリボヌクレオチド残基を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域における前記デオキシリボヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１塩基または２塩基である。
【００１９】
前記第１の一本鎖核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、非ヌクレオチド残基を有してもよく、具体的には、例えば、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。
【００２０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子が前記非ヌクレオチド残基を有する場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、以下、「ｓｓＰＮ分子」ともいう。
【００２１】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００２２】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡ分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。
【００２３】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２４】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００２５】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。前記非ヌクレオチド構造を有する場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、生体内におけるインターフェロン誘導等の副作用を抑制でき、ヌクレアーゼ耐性に優れる。
【００２７】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００２８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００２９】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００３０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
【００３１】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【００３２】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００３３】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００３４】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【００３５】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【００３６】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【００３７】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【００３８】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述するシリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【００３９】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００４０】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００４１】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００４２】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【００４３】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００４４】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｘｃ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００４５】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００４６】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
【００４７】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【化３】
【００４８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【００４９】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００５０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００５１】
後者の場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、前記第１のｓｓＲＮＡ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、中でも、前記領域（Ｘ）に前記発現抑制配列を有することが好ましい。
【００５２】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＲＮＡ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００５３】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５４】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【００５５】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００５６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
【００５７】
前記領域（Ｘ）および／または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００５８】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００５９】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００６０】
前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【００６１】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１ 塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００６２】
２．第２のｓｓＲＮＡ分子
本発明の第２のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【００６３】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子について、特に示さない限り、前記第１のｓｓＲＮＡの記載を援用できる。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、以下、「ｓｓＮｃ分子」ともいう。
【００６４】
前記第２のｓｓＲＮＡは、例えば、前記条件（１）および前記条件（２）のいずれか一方のみを満たしてもよいし、両方の条件を満たしてもよい。
【００６５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜４塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記ハイブリダイズする塩基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００６６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。具体例として、例えば、前記アデニン塩基を有するヌクレオチド残基およびウラシル塩基を有するヌクレオチド残基の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、より好ましくは、前記アデニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００６７】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜３塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００６８】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、さらに前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域に、デオキシリボヌクレオチド残基を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域における前記デオキシリボヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１塩基または２塩基である。
【００６９】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記第２のｓｓＲＮＡ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００７０】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７１】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７２】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００７３】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、中でも、前記内部領域（Ｚ）に前記発現抑制配列を有することが好ましい。
【００７４】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【００７５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【００７６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）のいずれか一方を有してもよいし、両方を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、それぞれ、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、それぞれ、前記式（Ｉ）で表わすことができる。前記第２のｓｓＲＮＡ分子における前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記第１のｓｓＲＮＡ分子における説明を全て援用でき、例えば、前記式（Ｉ）の説明についても全て援用できる。
【００７７】
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
【００７８】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００７９】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子について、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＲＮＡ分子の一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＲＮＡ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図２は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【００８０】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８１】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８２】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８３】
前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８４】
また、前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ ・・・（２）
【００８６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ ・・・（２１）
【００８７】
第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（１０）
【００８８】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１８）
【００８９】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２のｓｓＲＮＡ分子について、それぞれの構造の一例を、図３の模式図に示す。図３は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＲＮＡ分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＲＮＡ分子の例である。図３において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図３のｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図３は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【００９０】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、および、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図３において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００９１】
他方、前記(ｄ)のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００９２】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００９３】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、例えば、この条件が好ましい。
【００９４】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００９５】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９６】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９７】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１塩基、２塩基、３塩基または４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９８】
前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９９】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１００】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１０１】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【０１０２】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１０３】
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子および第２のｓｓＲＮＡ分子において、構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１０４】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基と前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０６】
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子および第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＲＮＡ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１または２個である。
【０１０７】
本発明のｓｓＲＮＡ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１０８】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１０９】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓ等があげられる。
【０１１０】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、例えば、前記非ヌクレオチド構造に前記標識物質を導入することが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記非ヌクレオチド残基に前記標識物質を導入することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基への標識物質の導入は、例えば、簡便かつ安価に行うことができる。
【０１１１】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現を抑制ができる。このため、本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む前記ｓｓＲＮＡ分子であれば、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１１２】
本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与すればよい。
【０１１３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１４】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定でき、前記遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０１１５】
本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を援用できる。
【０１１６】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１１７】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１１８】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１１９】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【０１２０】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１２１】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１２２】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１２３】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１２４】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１２５】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【０１２６】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１２７】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１２８】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１２９】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１３０】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１３１】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１３２】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
【０１３３】
３．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１３４】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１３５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい
【０１３６】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
【０１３７】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１３８】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１３９】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１４０】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１４１】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１４２】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１４３】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１４４】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子の検出等に利用できる。
【０１４５】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１４６】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１４７】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１４８】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸化は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１４９】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１５０】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１５１】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１５２】
４．本発明のｓｓＲＮＡ分子の合成方法
本発明のｓｓＲＮＡ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。これに限定されない。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のｓｓＲＮＡ分子については、例えば、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
【０１５３】
５．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１５４】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１５５】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１５６】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１５７】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患等があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１５８】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＲＮＡ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１５９】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与すればよい。
【０１６０】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１６１】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記投与がｉｎ ｖｉｖｏの場合、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、注射、皮下投与、局所投与等があげられる。
【０１６２】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１６３】
本発明の組成物において、前記ｓｓＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子を効率よくデリバリーできる。前記ｓｓＲＮＡ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。
【０１６４】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１６５】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤等があげられる。
【０１６６】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０１６７】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド擬似体等があげられる。
【０１６８】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０１６９】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０１７０】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子等があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０１７１】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニット等があげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０１７２】
６．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１７３】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉による発現抑制等があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１７４】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＲＮＡ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１７５】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＲＮＡ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類の種類に応じて適宜選択できる。
【０１７６】
７．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法を援用できる。
【０１７７】
８．ｓｓＲＮＡ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用である。
【０１７８】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子であり、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【０１７９】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）
実施例のＲＮＡとして、各配列からなるｓｓＲＮＡ分子を、ＲＮＡアミダイト（商品名ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ、三千里製薬）を用いてホスホロアミダイト法に基づき合成した。下記配列において、下線部が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関与する領域であり、小文字がデオキシリボヌクレオチドであり、かっこで囲んだ塩基が、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域との間で、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする箇所を示す。また、四角で囲んだ領域が、自己アニーリングしていない領域であり、太字は、フリー塩基を示す。
【０１８１】
【表１】
【０１８２】
NK-0111（配列番号３）およびNK-0112（配列番号４）において、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」は、それぞれ、プロリンを含む下記式のリンカーである。前記ｓｓＲＮＡ分子の合成の際、前記「Ｌｘ」および「Ｌｙ」の部位には、後述するＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（スキーム３の化合物１０）を使用した。
【化４】
【０１８３】
前記ｓｓＲＮＡを、所望の濃度となるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用し、培地は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０１８４】
まず、ＨＣＴ１１６細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、前記ＲＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、１ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した
【０１８７】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様。）。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’ （配列番号８）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’ （配列番号９）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’ （配列番号１０）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’ （配列番号１１）
【０１８８】
なお、コントロール１として、前記（Ｂ）１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
【０１８９】
補正後のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量について、コントロール（−）の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０１９０】
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図４に示すように、実施例のｓｓＲＮＡ分子は、いずれも強い遺伝子発現抑制活性を示し、その活性は投与量依存的であった。他方、ネガティブコントロールのＰＫ−０００３は、抑制効果が観察されなかった。
【０１９１】
（Ｌ−プロリンジアミドアミダイトの合成）
下記スキーム３により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイト（化合物１０）を合成した。
【０１９２】
【化５】
【０１９３】
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）
前記スキーム３の化合物２（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３ （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１９４】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、展開溶媒 ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物６（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）； ｍ／ｚ ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０１９５】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物８（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０１９６】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１０）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１０（１０.２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ， Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： Ｍｓδ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０１９７】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能である。本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する一本鎖ＲＮＡ核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、より優れたＲＮＡ分子の提供が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の第１の一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【０００７】
本発明の第２の一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１１】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
【００１２】
本発明の一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ分子）は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＲＮＡ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＲＮＡ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導用ｓｓＲＮＡ分子」または「ＲＮＡ干渉剤もしくはＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。
【００１３】
１．第１のｓｓＲＮＡ分子
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含むｓｓＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【００１４】
前記第１のｓｓＲＮＡは、例えば、前記条件（１）および前記条件（２）のいずれか一方のみを満たしてもよいし、両方の条件を満たしてもよい。
【００１５】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜４塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記ハイブリダイズする塩基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００１６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。具体例として、例えば、前記アデニン塩基を有するヌクレオチド残基および前記ウラシル塩基を有するヌクレオチド残基の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、より好ましくは、前記アデニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域が、前記デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００１７】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜３塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００１８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、さらに前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域に、デオキシリボヌクレオチド残基を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域における前記デオキシリボヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１塩基または２塩基である。
【００１９】
前記第１の一本鎖核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、非ヌクレオチド残基を有してもよく、具体的には、例えば、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。
【００２０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子が前記非ヌクレオチド残基を有する場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、以下、「ｓｓＰＮ分子」ともいう。
【００２１】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００２２】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡ分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。
【００２３】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２４】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００２５】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。前記非ヌクレオチド構造を有する場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、生体内におけるインターフェロン誘導等の副作用を抑制でき、ヌクレアーゼ耐性に優れる。
【００２７】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００２８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００２９】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００３０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
【００３１】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【００３２】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００３３】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００３４】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【００３５】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【００３６】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【００３７】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【００３８】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述するシリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【００３９】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００４０】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００４１】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００４２】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【００４３】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００４４】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｘｃ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００４５】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００４６】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
【００４７】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【化３】
【００４８】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【００４９】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００５０】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００５１】
後者の場合、前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。前記第１のｓｓＲＮＡ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、前記第１のｓｓＲＮＡ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子は、中でも、前記領域（Ｘ）に前記発現抑制配列を有することが好ましい。
【００５２】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＲＮＡ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００５３】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５４】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【００５５】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００５６】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
【００５７】
前記領域（Ｘ）および／または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００５８】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００５９】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００６０】
前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【００６１】
前記第１のｓｓＲＮＡ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１ 塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００６２】
２．第２のｓｓＲＮＡ分子
本発明の第２のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【００６３】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子について、特に示さない限り、前記第１のｓｓＲＮＡの記載を援用できる。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、以下、「ｓｓＮｃ分子」ともいう。
【００６４】
前記第２のｓｓＲＮＡは、例えば、前記条件（１）および前記条件（２）のいずれか一方のみを満たしてもよいし、両方の条件を満たしてもよい。
【００６５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜４塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記ハイブリダイズする塩基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００６６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。具体例として、例えば、前記アデニン塩基を有するヌクレオチド残基およびウラシル塩基を有するヌクレオチド残基の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、より好ましくは、前記アデニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００６７】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数は、特に制限されない。具体例として、前記塩基数は、それぞれ、１塩基〜３塩基であり、好ましくは１塩基または２塩基であり、好ましくは２塩基である。前記塩基数が、２塩基以上の場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基は、連続する配列であることが好ましく、より好ましくは、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端から連続する配列、および、前記３’側領域（Ｘ）の５’末端から連続する配列であることが好ましい。
【００６８】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、さらに前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域に、デオキシリボヌクレオチド残基を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の５’側末端領域における前記デオキシリボヌクレオチド残基の数は、特に制限されず、例えば、１塩基または２塩基である。
【００６９】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記第２のｓｓＲＮＡ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００７０】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７１】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００７２】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００７３】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、中でも、前記内部領域（Ｚ）に前記発現抑制配列を有することが好ましい。
【００７４】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【００７５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【００７６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）のいずれか一方を有してもよいし、両方を有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、それぞれ、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、それぞれ、前記式（Ｉ）で表わすことができる。前記第２のｓｓＲＮＡ分子における前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記第１のｓｓＲＮＡ分子における説明を全て援用でき、例えば、前記式（Ｉ）の説明についても全て援用できる。
【００７７】
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
【００７８】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００７９】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子について、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＲＮＡ分子の一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＲＮＡ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図２は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【００８０】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８１】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８２】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８３】
前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８４】
また、前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００８５】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ ・・・（２）
【００８６】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ ・・・（２１）
【００８７】
第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（１０）
【００８８】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１８）
【００８９】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２のｓｓＲＮＡ分子について、それぞれの構造の一例を、図３の模式図に示す。図３は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＲＮＡ分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＲＮＡ分子の例である。図３において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図３のｓｓＲＮＡ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図３は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【００９０】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、および、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図３において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＲＮＡ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００９１】
他方、前記(ｄ)のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＲＮＡ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００９２】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００９３】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、例えば、この条件が好ましい。
【００９４】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００９５】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９６】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９７】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１塩基、２塩基、３塩基または４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００９８】
前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００９９】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１００】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１０１】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【０１０２】
前記第２のｓｓＲＮＡ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＲＮＡ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１０３】
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子および第２のｓｓＲＮＡ分子において、構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１０４】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基と前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１０６】
本発明の第１のｓｓＲＮＡ分子および第２のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＲＮＡ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１または２個である。
【０１０７】
本発明のｓｓＲＮＡ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１０８】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１０９】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓ等があげられる。
【０１１０】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、例えば、前記非ヌクレオチド構造に前記標識物質を導入することが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記非ヌクレオチド残基に前記標識物質を導入することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基への標識物質の導入は、例えば、簡便かつ安価に行うことができる。
【０１１１】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現を抑制ができる。このため、本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む前記ｓｓＲＮＡ分子であれば、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１１２】
本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与すればよい。
【０１１３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１４】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定でき、前記遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０１１５】
本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を援用できる。
【０１１６】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１１７】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１１８】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１１９】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【０１２０】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１２１】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１２２】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１２３】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１２４】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１２５】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【０１２６】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１２７】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１２８】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１２９】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１３０】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１３１】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１３２】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
【０１３３】
３．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１３４】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１３５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい
【０１３６】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
【０１３７】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１３８】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１３９】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１４０】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１４１】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１４２】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１４３】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１４４】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子の検出等に利用できる。
【０１４５】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１４６】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１４７】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１４８】
本発明のｓｓＲＮＡ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸化は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１４９】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１５０】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１５１】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１５２】
４．本発明のｓｓＲＮＡ分子の合成方法
本発明のｓｓＲＮＡ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。これに限定されない。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のｓｓＲＮＡ分子については、例えば、前記式（Ｉ）で表わされるリンカー領域の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
【０１５３】
５．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１５４】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１５５】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１５６】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１５７】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患等があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１５８】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＲＮＡ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１５９】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与すればよい。
【０１６０】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１６１】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記投与がｉｎ ｖｉｖｏの場合、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、注射、皮下投与、局所投与等があげられる。
【０１６２】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＲＮＡ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１６３】
本発明の組成物において、前記ｓｓＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子を効率よくデリバリーできる。前記ｓｓＲＮＡ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。
【０１６４】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１６５】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤等があげられる。
【０１６６】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０１６７】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド擬似体等があげられる。
【０１６８】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０１６９】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０１７０】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子等があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０１７１】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニット等があげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０１７２】
６．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１７３】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉による発現抑制等があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１７４】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＲＮＡ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＲＮＡ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１７５】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＲＮＡ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＲＮＡ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類の種類に応じて適宜選択できる。
【０１７６】
７．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法を援用できる。
【０１７７】
８．ｓｓＲＮＡ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子の使用である。
【０１７８】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＲＮＡ分子であり、前記ｓｓＲＮＡ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【０１７９】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）
実施例のＲＮＡとして、各配列からなるｓｓＲＮＡ分子を、ＲＮＡアミダイト（商品名ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ、三千里製薬）を用いてホスホロアミダイト法に基づき合成した。下記配列において、下線部が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制に関与する領域であり、小文字がデオキシリボヌクレオチドであり、かっこで囲んだ塩基が、前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域との間で、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする箇所を示す。また、四角で囲んだ領域が、自己アニーリングしていない領域であり、太字は、フリー塩基を示す。
【０１８１】
【表１】
【０１８２】
NK-0111（配列番号３）およびNK-0112（配列番号４）において、「Ｌｘ」および「Ｌｙ」は、それぞれ、プロリンを含む下記式のリンカーである。前記ｓｓＲＮＡ分子の合成の際、前記「Ｌｘ」および「Ｌｙ」の部位には、後述するＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（スキーム３の化合物１０）を使用した。
【化４】
【０１８３】
前記ｓｓＲＮＡを、所望の濃度となるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用し、培地は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０１８４】
まず、ＨＣＴ１１６細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、前記ＲＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、１ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した
【０１８７】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様。）。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’ （配列番号８）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’ （配列番号９）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’ （配列番号１０）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’ （配列番号１１）
【０１８８】
なお、コントロール１として、前記（Ｂ）１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
【０１８９】
補正後のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量について、コントロール（−）の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。
【０１９０】
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図４に示すように、実施例のｓｓＲＮＡ分子は、いずれも強い遺伝子発現抑制活性を示し、その活性は投与量依存的であった。他方、ネガティブコントロールのＰＫ−０００３は、抑制効果が観察されなかった。
【０１９１】
（Ｌ−プロリンジアミドアミダイトの合成）
下記スキーム３により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイト（化合物１０）を合成した。
【０１９２】
【化５】
【０１９３】
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）
前記スキーム３の化合物２（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３ （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１９４】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、展開溶媒 ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物６（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）； ｍ／ｚ ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０１９５】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物８（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０１９６】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１０）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１０（１０.２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ， Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： Ｍｓδ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）： ｍ／ｚ ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０１９７】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能である。本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする一本鎖ＲＮＡ分子。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【請求項２】
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数が、それぞれ、１塩基または２塩基である、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記３’側領域（Ｘ）に、前記発現抑制配列を含む、請求項１または２記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、非ヌクレオチド残基を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項５】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする一本鎖ＲＮＡ分子。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【請求項６】
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数が、それぞれ、１塩基または２塩基である、請求項５記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記３’側領域（Ｘ）に、前記発現抑制配列を含む、請求項５または６記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結している、請求項５から７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項５から８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド残基を有する、請求項８または９記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）および３’側領域（Ｘ）を、前記順序で含み、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記３’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする一本鎖ＲＮＡ分子。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【請求項２】
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数が、それぞれ、１塩基または２塩基である、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記３’側領域（Ｘ）に、前記発現抑制配列を含む、請求項１または２記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、非ヌクレオチド残基を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項５】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含み、
さらに、下記（１）または（２）の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする一本鎖ＲＮＡ分子。
条件（１）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域と前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域とが、アデニン塩基とウラシル塩基との水素結合によりハイブリダイズする。
条件（２）
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の少なくとも一方が、デオキシリボヌクレオチド残基を有する。
【請求項６】
前記５’側領域（Ｘｃ）の３’末端領域の塩基数および前記３’側領域（Ｘ）の５’末端領域の塩基数が、それぞれ、１塩基または２塩基である、請求項５記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記３’側領域（Ｘ）に、前記発現抑制配列を含む、請求項５または６記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結している、請求項５から７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項５から８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド残基を有する、請求項８または９記載の一本鎖ＲＮＡ分子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−５５９１３（Ｐ２０１３−５５９１３Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９６７４２（Ｐ２０１１−１９６７４２）
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（３１００１５０８６）株式会社ボナック (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（３１００１５０８６）株式会社ボナック (3)
【Ｆターム（参考）】
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