部位特異的アミノ酸導入法のための新規な直交化ｔＲＮＡ
【課題】部位特異的アミノ酸導入法のための翻訳効率が高く、なおかつ直交性の高いｔＲＮＡを提供すること。
【解決手段】ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、特定の2種類の塩基配列からなるＲＮＡまたは当該ＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡを提供する。
【効果】該ＲＮＡを用いることにより、従来法に比べて非天然アミノ酸の部位特異的なタンパク質への導入効率が向上し、高効率な人工タンパク質合成やそれを利用したアッセを行うことができる。
【解決手段】ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、特定の2種類の塩基配列からなるＲＮＡまたは当該ＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡを提供する。
【効果】該ＲＮＡを用いることにより、従来法に比べて非天然アミノ酸の部位特異的なタンパク質への導入効率が向上し、高効率な人工タンパク質合成やそれを利用したアッセを行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、人工的に構造を改変したタンパク質を合成する方法に関し、より詳細には、任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質を合成する方法に関する。また、任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質、および該タンパク質の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質は、２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列はＤＮＡの塩基配列によって規定されている。そのタンパク質をＤＮＡの塩基配列を改変することで、遺伝子工学的手法により目的のタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変するという方法は比較的古くから用いられてきた。しかしながらこの方法では、可能なのはあくまで２０種類のアミノ酸からなる配列の組換えであり、２０種類のアミノ酸のいずれの構造中にも含まれない任意の機能基をタンパク質分子に導入することは事実上不可能であるため、タンパク質に人工機能を導入する手法としては限界があった。また一方で、タンパク質に任意の機能基を導入する手法としては、タンパク質分子の化学修飾という方法が用いられてきた。しかしこの方法では、タンパク質の特定の位置だけに機能基を導入することは非常に困難であり、そのため予測できない位置への化学修飾によってタンパク質本来の機能が著しく減じてしまう場合があるという問題があった。それに加え、化学修飾による方法ではタンパク質分子内部への機能基の導入を行うことができないといった欠点もあった。
【０００３】
種々の機能側鎖を持つ非天然アミノ酸を合成し、それらを天然のアミノ酸と同様に位置特異的に導入する非天然アミノ酸導入法は、これらの点を改善し、さらにタンパク質の機能をほとんど損なわずにさまざまな機能基を導入できるという点で優れている。天然のアミノ酸のみを用いた組換えタンパク質と比較して、導入した非天然アミノ酸に応じた種々の人工機能を発現することが期待でき、タンパク質の広範囲な機能拡張が可能となる。またさらに化学修飾法と比較しても、機能基を導入する位置を任意に決定することが可能であるため、タンパク質の本来の機能を損なう危険性を大幅に減じることができる。
【０００４】
天然のタンパク質は、前述のように２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列は、そのタンパク質をコードしている遺伝子によって規定されている。遺伝子はＤＮＡ上の連続した３つの塩基の組み合わせからなる遺伝暗号（コドン）によりアミノ酸を指定している。塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の４種類があり、それらの組み合わせからなる３塩基コドンの総数は４ｘ４ｘ４＝６４種類であるが、その大半である６１種類のコドンは天然の２０種類のアミノ酸に割り当てられている。残りの３種類、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡの３種のコドンは終止コドンとよばれ、２０種類のどのアミノ酸にも対応せず、タンパク質のアミノ酸配列の終止を規定している。
【０００５】
非天然アミノ酸をタンパク質へ位置特異的に導入するには、それらを指定する専用のコドンが必要となる。しかしながら前述の様に３つの塩基で構成可能な６４種類のコドンは、すべて指定する情報が規定されている。
【０００６】
Ｓｃｈｕｌｔｚら（Ｎｏｒｅｎ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８、非特許文献１）やＣｈａｍｂａｌｉｎら（Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１１，８０１３−１４、非特許文献２）は、終止コドンの一つであるＴＡＧを非天然アミノ酸に割り当てた。タンパク質上の任意の位置のコドンをＴＡＧに置き換え、天然には存在しない、終止コドンＴＡＧに対応するアンチコドンＣＵＡを持つｔＲＮＡを合成し、非天然アミノ酸を担持させて非天然アミノ酸を位置特異的に導入するという手法であった。しかしながらこの方法では、非天然アミノ酸の取り込みはタンパク質合成の終了と競合することになり、収率が低下してしまうという欠点があった。さらに、同一のタンパク質の複数箇所に別々の非天然アミノ酸を導入することも、非天然アミノ酸の指定に転用可能な終止コドンの種類数から考えて事実上不可能であった。
【０００７】
非天然アミノ酸の位置を決めるもう一つの手法として、通常の３塩基コドンを拡張した４塩基コドンを用いるという方法がある（Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７９−７９、非特許文献３）。この方法では、たとえばＣＧＧＧからなる４塩基コドンが、４塩基のアンチコドンをもつ人工的に合成したｔＲＮＡによって翻訳されると、非天然アミノ酸が導入された完全長のタンパクが合成される。一方、ＣＧＧの３塩基のみに対する３塩基アンチコドンをもつ天然のｔＲＮＡによって翻訳されると、その後のコドンの読み枠がシフトし、終止コドンに出会うことによってタンパク質の合成は途中で終止してしまうことになる。このように、４塩基コドンを用いる方法は、６４種類存在する通常の３塩基コドンとは事実上独立に非天然アミノ酸を規定できる点が特徴であり、前述の終止コドンを用いる方法とくらべて多種類の非天然アミノ酸を同一のタンパク質分子にそれぞれ位置特異的に導入し、機能発現させることも可能である。実際に、一例としてストレプトアビジンの５４位に電子受容基を持つ非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを、８４位に蛍光基を持つ非天然アミノ酸アンスラニルアミドアラニンを導入した変異タンパク質を合成した報告がある（Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−９５、非特許文献４）。その合成された非天然二重変異タンパク質は予測通り蛍光消光を示した。また更に最近、５塩基コドンも非天然アミノ酸を指定できることが明らかになっている（Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ． ａｎｄ Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４４，９９−１００、非特許文献５）。
【０００８】
一方、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法において使用されるｔＲＮＡとしては、任意の翻訳系においてｔＲＮＡとして機能するいずれの配列を持つｔＲＮＡも使用することができ、天然由来のｔＲＮＡのアンチコドン部位の配列のみを任意に変えたものなどを用いることができる。しかしながら、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法において使用されるｔＲＮＡには、以下の２つの性質が必要とされる：
１）任意の翻訳系において高い翻訳効率（部位特異的に非天然アミノ酸を導入した蛋白質を効率よく合成するために必要である）；
２）翻訳系内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）とは反応しない性質、すなわち高い「直交性」（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）（直交性が低いｔＲＮＡを用いて部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質の合成を行った場合、非天然アミノ酸を担持させた直交性が低いｔＲＮＡは、翻訳系中でその担持させた非天然アミノ酸が消費された後、ＡＲＳに認識されることにより、再び別の天然アミノ酸を担持し、非天然アミノ酸を導入すべき位置に天然アミノ酸を導入したタンパク質を誤って合成してしまう恐れがある。）
【０００９】
これまで、酵母由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡや、大腸菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２、非特許文献６）、古細菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８、非特許文献７）などが好適に用いられてきた。
【００１０】
しかしながら、前述のような天然ｔＲＮＡや人工改変ｔＲＮＡは、いずれも翻訳効率が低いか直交性が低いかの問題があった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｏｒｅｎ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８
【非特許文献２】Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１１，８０１３−１４
【非特許文献３】Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７９−７９
【非特許文献４】Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−９５
【非特許文献５】Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ． ａｎｄ Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４４，９９−１００
【非特許文献６】Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上に述べたような理由から、翻訳効率が高く、なおかつ内在性のアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素と反応しない、即ち直交性の高いｔＲＮＡが求められていた。即ち、本願発明の目的は、翻訳効率が高く、なおかつ直交性の高いｔＲＮＡを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目標を達成するために、本願発明者らは鋭意研究を重ね、ウシミトコンドリア由来のｔＲＮＡおよびＭｅｔｈａｎｏｓｉｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のｔＲＮＡの配列を改変した人工ｔＲＮＡが、高い翻訳効率と高い直交性を持つことを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本願発明は以下のような構成から成る。
［１］ ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、以下の（１）、（２）および（３）からなる群より選択されるＲＮＡ：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号１における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号２における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；および
（３）（１）または（２）のいずれかのＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡ。
［２］ アンチコドンが、４塩基アンチコドンであることを特徴とする［１］に記載のＲＮＡ。
［３］ （１）のＲＮＡが配列番号３に記載の塩基配列からなる［１］に記載のＲＮＡ。
［４］ （２）のＲＮＡが配列番号４に記載の塩基配列からなる［１］に記載のＲＮＡ。
［５］ ［１］〜［４］に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法。
［６］ ［１］〜［４］に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単独のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法。
［７］ ［５］または［６］に記載の方法により、部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明により提供されるＲＮＡを用いることにより、従来法に比べて非天然アミノ酸の部位特異的なタンパク質への導入効率が向上し、高効率な人工タンパク質合成やそれを利用したアッセイを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の遺伝情報のタンパク質のアミノ酸配列への翻訳において、その分子中のアンチコドンのｍＲＮＡ中のコドンとの塩基対形成によって、その末端にエステル結合したアミノ酸を運搬する機能を有するＲＮＡをいう。末端にアミノ酸が結合したｔＲＮＡをアミノアシル化ｔＲＮＡという。天然においてはアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）の作用によってｔＲＮＡに特異的アミノ酸が結合されてアミノアシル化ｔＲＮＡが合成される。公知のアミノアシル化反応によって本願発明のｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させて人工的にアミノアシル化ｔＲＮＡを合成することもできる。
【００１７】
まず本願発明のｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡは、以下の（１）または（２）から選択されるＲＮＡである。即ち（１）配列番号１または２に記載のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ、または（２）（１）のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡの一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡである。本明細書に記載の配列番号１または２に記載のＲＮＡ分子は、図１または図２に示すような２次構造を自発的に形成する。より具体的には、５’端より（Ａ）塩基１〜７：アクセプターステム、（Ｂ）塩基８：ループ、（Ｃ）塩基９〜１２：Ｄステム、（Ｄ）塩基１３〜１７：ループ、（Ｅ）塩基１８〜２１：（Ｃ）Ｄステムの相補鎖、（Ｆ）塩基２２：ループ、（Ｇ）塩基２３〜２８：アンチコドンステム、（Ｈ）塩基２９〜３０：ループ、（Ｉ）塩基３１〜３４：アンチコドン配列（４塩基の場合）、（Ｊ）塩基３５〜３６：ループ、（Ｋ）塩基３７〜４２：（Ｇ）アンチコドンステムの相補鎖、（Ｌ）塩基４３〜４５：ループ、（Ｍ）塩基４６〜５０：Ｔステム、（Ｎ）塩基５１〜５７：ループ、（Ｏ）塩基５８〜６２：（Ｍ）Ｔステムの相補鎖、（Ｐ）塩基６３〜６９：（Ａ）アクセプターステムの相補鎖、（Ｑ）塩基７０〜７３：３’末端領域、からなる２次構造である。アンチコドンステムの長さは通常のｔＲＮＡでは５塩基対であり、本配列は異常な２次構造を形成することによって、内在性のＡＲＳからの認識を回避していると考えられる。
【００１８】
本明細書において用いる「アンチコドン」なる用語は、ｍＲＮＡ中のコドンと塩基対を形成するｔＲＮＡ中の連続した塩基をいう。天然に存在するアンチコドンは３塩基からなる（３塩基アンチコドン）。一方、上記配列における（Ｉ）塩基３１〜３４：アンチコドン配列は、任意の鎖長を持つ任意の配列のアンチコドン配列を示し、その鎖長は特に限定されないが、好ましくは塩基数２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは４である。またその配列は特に限定されず、いかなる配列を用いても非天然アミノ酸の部位特異的な導入を行うことができるが、最も好ましくはＣＣＣＧである。アンチコドンとしてＣＣＣＧの配列を有する本願発明のｔＲＮＡの例として、配列番号３および４に記載の塩基配列からなるｔＲＮＡが挙げられる。
【００１９】
また、本願発明のＲＮＡは、翻訳系内在性のアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）とは反応しない性質、すなわち高い「直交性」（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）を持つ。直交性を有するｔＲＮＡを直交化ｔＲＮＡという。この直交性は、以下の方法により測定することができる。即ち、脱アミノアシル化したｔＲＮＡを翻訳系に添加し、該ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的なコドンを持つｍＲＮＡからの翻訳反応を行い、該コドンを導入した部位に翻訳系に存在するアミノ酸を取り込んだタンパク質が合成される効率（抑圧効率、ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を算出する。より具体的には、４塩基アンチコドンをもつｔＲＮＡを翻訳系に添加し、該ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的な４塩基コドンを持つ任意のタンパク質をコードするｍＲＮＡからの翻訳反応を行い、該４塩基コドンを導入した部位にアミノ酸が導入された場合には全長タンパク質が合成され、該４塩基コドンを導入した部位にアミノ酸が導入されなかった場合には、翻訳系に内在する３塩基のアンチコドンを持つアミノアシル化ｔＲＮＡが反応することにより、その部位以降のコドンの読み枠がシフトし、全長の異なるタンパク質が合成されることから、同量の該タンパク質の４塩基コドンを含まないｍＲＮＡ、即ち野生型タンパク質のｍＲＮＡからの翻訳効率と、４塩基コドンを導入したｍＲＮＡからの全長タンパク質の翻訳効率とを比較することにより、定量的に算出することができる。例えば、実施例５に記載する方法で測定した場合、本願発明のＲＮＡは、少なくとも４０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上の抑圧効率を示す。
【００２０】
また、本願発明のＲＮＡは、高い翻訳効率を持つ。即ち、その担持したアミノ酸のタンパク質への導入効率が高い。この翻訳効率は、前述のｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙを算出することにより容易に測定できる。即ち、同量の野生型タンパク質のｍＲＮＡからの翻訳効率と、４塩基コドンを導入したｍＲＮＡからの全長タンパク質の翻訳効率とを比較することにより、定量的に算出することができる。あるいは、導入する非天然アミノ酸が、ある種のラベル、より具体的には、蛍光、放射性同位元素、官能基等でラベル化されているアミノ酸を用いる場合には、翻訳反応により合成されたタンパク質の総量から、ラベル化されたタンパク質が含まれる割合を測定することによっても容易に算出することができる。
【００２１】
上記のような方法により直交性、翻訳効率を測定することによって、配列番号１、２、３または４に記載の塩基配列において一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡから、ｔＲＮＡとしての機能を有する本願発明のＲＮＡを選択することができる。
【００２２】
また、本願発明は、［１］〜［４］に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法である。またさらに本願発明は、[１］〜［４］に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単一のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法である。ここで言うタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法とは、その形態は特に限定されないが、より具体的には、それぞれ同一の、あるいは異なるコドン−アンチコドン対を用いて、２箇所以上に、それぞれ部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法であり、それぞれの非天然アミノ酸は、同種であってもよく、異なる種類であっても良い。異なる種類のアミノ酸を異なる部位に特異的に導入する場合には、好ましくは、それぞれ異なるコドン−アンチコドン対を用いることができ、さらに好ましくは、コドン−アンチコドン対は４塩基コドン−４塩基アンチコドン対を用いることができる。
【００２３】
また、本願発明は、上記の方法を用いて合成した部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質である。
【００２４】
本願発明により提供されるＲＮＡを用いることにより、部位特異的に非天然アミノ酸が導入されたタンパク質を効率よく合成することができ、なおかつ、非天然アミノ酸が本来導入されるべき部位に天然アミノ酸が誤って導入されたタンパク質が合成される割合が全く無いかもしくはきわめて少量である純度の高い非天然アミノ酸導入タンパク質を合成することが可能となる。
【００２５】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ｔＲＮＡの合成
配列番号３及び４のｔＲＮＡから３’末端のＣＡを除いたものは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応により合成した。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、２４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＧＭＰ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、１．８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ピロホスファターゼ（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＩＧＭＡ）、７５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭ ＤＮＡ鋳型を含む反応液において、３７℃で４時間の転写反応を行った。転写合成したｔＲＮＡは１０％変性ポリアクリルアミドゲルにより精製した。
【００２７】
実施例２
ｔＲＮＡのアミノアシル化反応
Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニル−ｔＲＮＡ（Ｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ、ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ）は、転写合成したｔＲＮＡ（３’−ＣＡを含まないもの）と化学合成したｐｄＣｐＡ−ｎｔｒＰｈｅとをＴ４ ＲＮＡリガーゼにより連結することにより調製した。
【００２８】
実施例３
脱アミノアシル化したｔＲＮＡを用いたタンパク質合成
無細胞タンパク質合成とウェスタンブロッティングは以下のように行った。タンパク質合成反応は、２μＬ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ ｆｏｒ Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ)、５５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ(ｐＨ７．５）、２１０ｍＭ グルタミン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、６．９ｍＭ 酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１．７ｍＭ ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２８ｍＭ ＧＴＰ、２６ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）、１ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１．９％ ポリエチレングリコール−８０００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−８０００）、３５μｇ／ｍＬ ホリニン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、１２ ｍＭ 酢酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、０．１ ｍＭ各アミノ酸、８μｇ ｍＲＮＡ、０．１ｎｍｏｌアミノアシルｔＲＮＡを含む１０μＬの反応液で行った。ｍＲＮＡはＮ末にＴ７タグが付加したストレプトアビジンの野生型（ｗｔ）または変異体をコードしている。野生型および変異体ｍＲＮＡに含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。配列番号５の塩基２８３〜２８５のｔａｔは野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列の８３位のアミノ酸に対するコドンであり、配列番号６に示す配列においてはこの箇所にＣＧＧＧコドンを含み、この部位が非天然アミノ酸に対応する。この反応液を３７℃で１時間インキュベートした。反応溶液はＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲルに流し泳動を行った。ウェスタンブロッティングは、抗Ｔ７−ｔａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＰｒｏｔｏＢｌｏｔ ＩＩ ＡＰ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で行った。
【００２９】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０無細胞タンパク質合成系を用いて、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成した結果を図３に示す。図３は、配列番号３に示すＲＮＡ（Ａ）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｂ）およびその他数種のＲＮＡ（１〜１０）を添加した場合の結果である。配列番号３に示すＲＮＡおよび配列番号４に示すＲＮＡを添加した場合、完全長タンパク質の合成は認められず、これらのＲＮＡは内在性のＡＲＳによるアミノアシル化を受けていないことが示された。
【００３０】
実施例４
非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いたタンパク質合成
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０無細胞タンパク質合成系を用いて、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡに非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを担持させたものを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成した。タンパク質合成とウェスタンブロッティングは実施例３と同様に行った。その結果を図４に示す。配列番号３に示すＲＮＡ（Ａ）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｂ）を用いた場合、他のＲＮＡ（１〜１０）の場合と比べ、完全長タンパク質の合成量が特に多く、これらのＲＮＡは高い翻訳能を持つことが示された。
【００３１】
実施例５
非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いたタンパク質合成効率の測定
実施例４と同様に、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡに非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを担持させたものを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成しウェスタンブロッティングを行った。４塩基コドンの翻訳効率は全長タンパク質のバンド強度を、同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で調製した野生型ストレプトアビジンと比較することにより見積もった。バンド強度は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｇｒａｍ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）により測定した。これまでに報告されている、大腸菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡＡｓｎ由来変異体、Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２、配列番号７）、古細菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｈ．ｓｐ．ＮＲＣ−１ ｔＲＮＡＬｅｕ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８、配列番号８）と、配列番号３に示すＲＮＡ（ウシミトコンドリア ｔＲＮＡＳｅｒＵＧＡ変異体）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｉｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ ｔＲＮＡＰｙｌ）との翻訳効率（抑圧効率、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の比較結果を図６に示す。この結果より、これまでに報告されているｔＲＮＡよりも非天然アミノ酸を非常に効率よく導入できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本願発明のｔＲＮＡを用いて、種々の機能性非天然アミノ酸を部位特異的に導入したタンパク質を効率よく合成することができ、研究分野、医療分野等の産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】配列番号１のｔＲＮＡが自発的に取りうる２次構造を示す図。
【図２】配列番号２のｔＲＮＡが自発的に取りうる２次構造を示す図。
【図３】脱アミノアシル化したｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った図。
【図４】非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った図。
【図５】非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果から、それぞれの翻訳効率（抑圧効率、Suppression efficiency）を算出した図。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
SEQ ID NO:1: tRNA; "nnnn" from nucleotide 31 to nucleotide 34 represents an anticodon consisting of "p" arbitrary ribonucleotides, wherein the number "p" is 3 or more
SEQ ID NO:2: tRNA; "nnnn" from nucleotide 31 to nucleotide 34 represents an anticodon consisting of "p" arbitrary ribonucleotides, wherein the number "p" is 3 or more
SEQ ID NO:3: tRNA
SEQ ID NO:4: tRNA
SEQ ID NO:5: ORF of mRNA
SEQ ID NO:6: ORF of mRNA
SEQ ID NO:7: tRNA
SEQ ID NO:8: tRNA
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、人工的に構造を改変したタンパク質を合成する方法に関し、より詳細には、任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質を合成する方法に関する。また、任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質、および該タンパク質の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質は、２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列はＤＮＡの塩基配列によって規定されている。そのタンパク質をＤＮＡの塩基配列を改変することで、遺伝子工学的手法により目的のタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変するという方法は比較的古くから用いられてきた。しかしながらこの方法では、可能なのはあくまで２０種類のアミノ酸からなる配列の組換えであり、２０種類のアミノ酸のいずれの構造中にも含まれない任意の機能基をタンパク質分子に導入することは事実上不可能であるため、タンパク質に人工機能を導入する手法としては限界があった。また一方で、タンパク質に任意の機能基を導入する手法としては、タンパク質分子の化学修飾という方法が用いられてきた。しかしこの方法では、タンパク質の特定の位置だけに機能基を導入することは非常に困難であり、そのため予測できない位置への化学修飾によってタンパク質本来の機能が著しく減じてしまう場合があるという問題があった。それに加え、化学修飾による方法ではタンパク質分子内部への機能基の導入を行うことができないといった欠点もあった。
【０００３】
種々の機能側鎖を持つ非天然アミノ酸を合成し、それらを天然のアミノ酸と同様に位置特異的に導入する非天然アミノ酸導入法は、これらの点を改善し、さらにタンパク質の機能をほとんど損なわずにさまざまな機能基を導入できるという点で優れている。天然のアミノ酸のみを用いた組換えタンパク質と比較して、導入した非天然アミノ酸に応じた種々の人工機能を発現することが期待でき、タンパク質の広範囲な機能拡張が可能となる。またさらに化学修飾法と比較しても、機能基を導入する位置を任意に決定することが可能であるため、タンパク質の本来の機能を損なう危険性を大幅に減じることができる。
【０００４】
天然のタンパク質は、前述のように２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列は、そのタンパク質をコードしている遺伝子によって規定されている。遺伝子はＤＮＡ上の連続した３つの塩基の組み合わせからなる遺伝暗号（コドン）によりアミノ酸を指定している。塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の４種類があり、それらの組み合わせからなる３塩基コドンの総数は４ｘ４ｘ４＝６４種類であるが、その大半である６１種類のコドンは天然の２０種類のアミノ酸に割り当てられている。残りの３種類、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡの３種のコドンは終止コドンとよばれ、２０種類のどのアミノ酸にも対応せず、タンパク質のアミノ酸配列の終止を規定している。
【０００５】
非天然アミノ酸をタンパク質へ位置特異的に導入するには、それらを指定する専用のコドンが必要となる。しかしながら前述の様に３つの塩基で構成可能な６４種類のコドンは、すべて指定する情報が規定されている。
【０００６】
Ｓｃｈｕｌｔｚら（Ｎｏｒｅｎ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８、非特許文献１）やＣｈａｍｂａｌｉｎら（Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１１，８０１３−１４、非特許文献２）は、終止コドンの一つであるＴＡＧを非天然アミノ酸に割り当てた。タンパク質上の任意の位置のコドンをＴＡＧに置き換え、天然には存在しない、終止コドンＴＡＧに対応するアンチコドンＣＵＡを持つｔＲＮＡを合成し、非天然アミノ酸を担持させて非天然アミノ酸を位置特異的に導入するという手法であった。しかしながらこの方法では、非天然アミノ酸の取り込みはタンパク質合成の終了と競合することになり、収率が低下してしまうという欠点があった。さらに、同一のタンパク質の複数箇所に別々の非天然アミノ酸を導入することも、非天然アミノ酸の指定に転用可能な終止コドンの種類数から考えて事実上不可能であった。
【０００７】
非天然アミノ酸の位置を決めるもう一つの手法として、通常の３塩基コドンを拡張した４塩基コドンを用いるという方法がある（Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７９−７９、非特許文献３）。この方法では、たとえばＣＧＧＧからなる４塩基コドンが、４塩基のアンチコドンをもつ人工的に合成したｔＲＮＡによって翻訳されると、非天然アミノ酸が導入された完全長のタンパクが合成される。一方、ＣＧＧの３塩基のみに対する３塩基アンチコドンをもつ天然のｔＲＮＡによって翻訳されると、その後のコドンの読み枠がシフトし、終止コドンに出会うことによってタンパク質の合成は途中で終止してしまうことになる。このように、４塩基コドンを用いる方法は、６４種類存在する通常の３塩基コドンとは事実上独立に非天然アミノ酸を規定できる点が特徴であり、前述の終止コドンを用いる方法とくらべて多種類の非天然アミノ酸を同一のタンパク質分子にそれぞれ位置特異的に導入し、機能発現させることも可能である。実際に、一例としてストレプトアビジンの５４位に電子受容基を持つ非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを、８４位に蛍光基を持つ非天然アミノ酸アンスラニルアミドアラニンを導入した変異タンパク質を合成した報告がある（Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−９５、非特許文献４）。その合成された非天然二重変異タンパク質は予測通り蛍光消光を示した。また更に最近、５塩基コドンも非天然アミノ酸を指定できることが明らかになっている（Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ． ａｎｄ Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４４，９９−１００、非特許文献５）。
【０００８】
一方、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法において使用されるｔＲＮＡとしては、任意の翻訳系においてｔＲＮＡとして機能するいずれの配列を持つｔＲＮＡも使用することができ、天然由来のｔＲＮＡのアンチコドン部位の配列のみを任意に変えたものなどを用いることができる。しかしながら、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法において使用されるｔＲＮＡには、以下の２つの性質が必要とされる：
１）任意の翻訳系において高い翻訳効率（部位特異的に非天然アミノ酸を導入した蛋白質を効率よく合成するために必要である）；
２）翻訳系内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）とは反応しない性質、すなわち高い「直交性」（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）（直交性が低いｔＲＮＡを用いて部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質の合成を行った場合、非天然アミノ酸を担持させた直交性が低いｔＲＮＡは、翻訳系中でその担持させた非天然アミノ酸が消費された後、ＡＲＳに認識されることにより、再び別の天然アミノ酸を担持し、非天然アミノ酸を導入すべき位置に天然アミノ酸を導入したタンパク質を誤って合成してしまう恐れがある。）
【０００９】
これまで、酵母由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡや、大腸菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２、非特許文献６）、古細菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８、非特許文献７）などが好適に用いられてきた。
【００１０】
しかしながら、前述のような天然ｔＲＮＡや人工改変ｔＲＮＡは、いずれも翻訳効率が低いか直交性が低いかの問題があった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｏｒｅｎ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８
【非特許文献２】Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１１，８０１３−１４
【非特許文献３】Ｈｏｈｓａｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，９７７９−７９
【非特許文献４】Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１２１９４−９５
【非特許文献５】Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ． ａｎｄ Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４４，９９−１００
【非特許文献６】Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上に述べたような理由から、翻訳効率が高く、なおかつ内在性のアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素と反応しない、即ち直交性の高いｔＲＮＡが求められていた。即ち、本願発明の目的は、翻訳効率が高く、なおかつ直交性の高いｔＲＮＡを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目標を達成するために、本願発明者らは鋭意研究を重ね、ウシミトコンドリア由来のｔＲＮＡおよびＭｅｔｈａｎｏｓｉｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のｔＲＮＡの配列を改変した人工ｔＲＮＡが、高い翻訳効率と高い直交性を持つことを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本願発明は以下のような構成から成る。
［１］ ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、以下の（１）、（２）および（３）からなる群より選択されるＲＮＡ：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号１における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号２における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；および
（３）（１）または（２）のいずれかのＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡ。
［２］ アンチコドンが、４塩基アンチコドンであることを特徴とする［１］に記載のＲＮＡ。
［３］ （１）のＲＮＡが配列番号３に記載の塩基配列からなる［１］に記載のＲＮＡ。
［４］ （２）のＲＮＡが配列番号４に記載の塩基配列からなる［１］に記載のＲＮＡ。
［５］ ［１］〜［４］に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法。
［６］ ［１］〜［４］に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単独のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法。
［７］ ［５］または［６］に記載の方法により、部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明により提供されるＲＮＡを用いることにより、従来法に比べて非天然アミノ酸の部位特異的なタンパク質への導入効率が向上し、高効率な人工タンパク質合成やそれを利用したアッセイを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の遺伝情報のタンパク質のアミノ酸配列への翻訳において、その分子中のアンチコドンのｍＲＮＡ中のコドンとの塩基対形成によって、その末端にエステル結合したアミノ酸を運搬する機能を有するＲＮＡをいう。末端にアミノ酸が結合したｔＲＮＡをアミノアシル化ｔＲＮＡという。天然においてはアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）の作用によってｔＲＮＡに特異的アミノ酸が結合されてアミノアシル化ｔＲＮＡが合成される。公知のアミノアシル化反応によって本願発明のｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させて人工的にアミノアシル化ｔＲＮＡを合成することもできる。
【００１７】
まず本願発明のｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡは、以下の（１）または（２）から選択されるＲＮＡである。即ち（１）配列番号１または２に記載のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡ、または（２）（１）のいずれかの塩基配列からなるＲＮＡの一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡである。本明細書に記載の配列番号１または２に記載のＲＮＡ分子は、図１または図２に示すような２次構造を自発的に形成する。より具体的には、５’端より（Ａ）塩基１〜７：アクセプターステム、（Ｂ）塩基８：ループ、（Ｃ）塩基９〜１２：Ｄステム、（Ｄ）塩基１３〜１７：ループ、（Ｅ）塩基１８〜２１：（Ｃ）Ｄステムの相補鎖、（Ｆ）塩基２２：ループ、（Ｇ）塩基２３〜２８：アンチコドンステム、（Ｈ）塩基２９〜３０：ループ、（Ｉ）塩基３１〜３４：アンチコドン配列（４塩基の場合）、（Ｊ）塩基３５〜３６：ループ、（Ｋ）塩基３７〜４２：（Ｇ）アンチコドンステムの相補鎖、（Ｌ）塩基４３〜４５：ループ、（Ｍ）塩基４６〜５０：Ｔステム、（Ｎ）塩基５１〜５７：ループ、（Ｏ）塩基５８〜６２：（Ｍ）Ｔステムの相補鎖、（Ｐ）塩基６３〜６９：（Ａ）アクセプターステムの相補鎖、（Ｑ）塩基７０〜７３：３’末端領域、からなる２次構造である。アンチコドンステムの長さは通常のｔＲＮＡでは５塩基対であり、本配列は異常な２次構造を形成することによって、内在性のＡＲＳからの認識を回避していると考えられる。
【００１８】
本明細書において用いる「アンチコドン」なる用語は、ｍＲＮＡ中のコドンと塩基対を形成するｔＲＮＡ中の連続した塩基をいう。天然に存在するアンチコドンは３塩基からなる（３塩基アンチコドン）。一方、上記配列における（Ｉ）塩基３１〜３４：アンチコドン配列は、任意の鎖長を持つ任意の配列のアンチコドン配列を示し、その鎖長は特に限定されないが、好ましくは塩基数２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは４である。またその配列は特に限定されず、いかなる配列を用いても非天然アミノ酸の部位特異的な導入を行うことができるが、最も好ましくはＣＣＣＧである。アンチコドンとしてＣＣＣＧの配列を有する本願発明のｔＲＮＡの例として、配列番号３および４に記載の塩基配列からなるｔＲＮＡが挙げられる。
【００１９】
また、本願発明のＲＮＡは、翻訳系内在性のアミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）とは反応しない性質、すなわち高い「直交性」（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）を持つ。直交性を有するｔＲＮＡを直交化ｔＲＮＡという。この直交性は、以下の方法により測定することができる。即ち、脱アミノアシル化したｔＲＮＡを翻訳系に添加し、該ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的なコドンを持つｍＲＮＡからの翻訳反応を行い、該コドンを導入した部位に翻訳系に存在するアミノ酸を取り込んだタンパク質が合成される効率（抑圧効率、ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を算出する。より具体的には、４塩基アンチコドンをもつｔＲＮＡを翻訳系に添加し、該ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的な４塩基コドンを持つ任意のタンパク質をコードするｍＲＮＡからの翻訳反応を行い、該４塩基コドンを導入した部位にアミノ酸が導入された場合には全長タンパク質が合成され、該４塩基コドンを導入した部位にアミノ酸が導入されなかった場合には、翻訳系に内在する３塩基のアンチコドンを持つアミノアシル化ｔＲＮＡが反応することにより、その部位以降のコドンの読み枠がシフトし、全長の異なるタンパク質が合成されることから、同量の該タンパク質の４塩基コドンを含まないｍＲＮＡ、即ち野生型タンパク質のｍＲＮＡからの翻訳効率と、４塩基コドンを導入したｍＲＮＡからの全長タンパク質の翻訳効率とを比較することにより、定量的に算出することができる。例えば、実施例５に記載する方法で測定した場合、本願発明のＲＮＡは、少なくとも４０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上の抑圧効率を示す。
【００２０】
また、本願発明のＲＮＡは、高い翻訳効率を持つ。即ち、その担持したアミノ酸のタンパク質への導入効率が高い。この翻訳効率は、前述のｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙを算出することにより容易に測定できる。即ち、同量の野生型タンパク質のｍＲＮＡからの翻訳効率と、４塩基コドンを導入したｍＲＮＡからの全長タンパク質の翻訳効率とを比較することにより、定量的に算出することができる。あるいは、導入する非天然アミノ酸が、ある種のラベル、より具体的には、蛍光、放射性同位元素、官能基等でラベル化されているアミノ酸を用いる場合には、翻訳反応により合成されたタンパク質の総量から、ラベル化されたタンパク質が含まれる割合を測定することによっても容易に算出することができる。
【００２１】
上記のような方法により直交性、翻訳効率を測定することによって、配列番号１、２、３または４に記載の塩基配列において一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡから、ｔＲＮＡとしての機能を有する本願発明のＲＮＡを選択することができる。
【００２２】
また、本願発明は、［１］〜［４］に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法である。またさらに本願発明は、[１］〜［４］に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単一のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法である。ここで言うタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法とは、その形態は特に限定されないが、より具体的には、それぞれ同一の、あるいは異なるコドン−アンチコドン対を用いて、２箇所以上に、それぞれ部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法であり、それぞれの非天然アミノ酸は、同種であってもよく、異なる種類であっても良い。異なる種類のアミノ酸を異なる部位に特異的に導入する場合には、好ましくは、それぞれ異なるコドン−アンチコドン対を用いることができ、さらに好ましくは、コドン−アンチコドン対は４塩基コドン−４塩基アンチコドン対を用いることができる。
【００２３】
また、本願発明は、上記の方法を用いて合成した部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質である。
【００２４】
本願発明により提供されるＲＮＡを用いることにより、部位特異的に非天然アミノ酸が導入されたタンパク質を効率よく合成することができ、なおかつ、非天然アミノ酸が本来導入されるべき部位に天然アミノ酸が誤って導入されたタンパク質が合成される割合が全く無いかもしくはきわめて少量である純度の高い非天然アミノ酸導入タンパク質を合成することが可能となる。
【００２５】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ｔＲＮＡの合成
配列番号３及び４のｔＲＮＡから３’末端のＣＡを除いたものは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応により合成した。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、２４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＧＭＰ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、１．８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ピロホスファターゼ（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＩＧＭＡ）、７５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭ ＤＮＡ鋳型を含む反応液において、３７℃で４時間の転写反応を行った。転写合成したｔＲＮＡは１０％変性ポリアクリルアミドゲルにより精製した。
【００２７】
実施例２
ｔＲＮＡのアミノアシル化反応
Ｌ−ｐ−ニトロフェニルアラニル−ｔＲＮＡ（Ｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ、ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ）は、転写合成したｔＲＮＡ（３’−ＣＡを含まないもの）と化学合成したｐｄＣｐＡ−ｎｔｒＰｈｅとをＴ４ ＲＮＡリガーゼにより連結することにより調製した。
【００２８】
実施例３
脱アミノアシル化したｔＲＮＡを用いたタンパク質合成
無細胞タンパク質合成とウェスタンブロッティングは以下のように行った。タンパク質合成反応は、２μＬ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ ｆｏｒ Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ)、５５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ(ｐＨ７．５）、２１０ｍＭ グルタミン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、６．９ｍＭ 酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１．７ｍＭ ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２８ｍＭ ＧＴＰ、２６ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）、１ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１．９％ ポリエチレングリコール−８０００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−８０００）、３５μｇ／ｍＬ ホリニン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、１２ ｍＭ 酢酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、０．１ ｍＭ各アミノ酸、８μｇ ｍＲＮＡ、０．１ｎｍｏｌアミノアシルｔＲＮＡを含む１０μＬの反応液で行った。ｍＲＮＡはＮ末にＴ７タグが付加したストレプトアビジンの野生型（ｗｔ）または変異体をコードしている。野生型および変異体ｍＲＮＡに含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。配列番号５の塩基２８３〜２８５のｔａｔは野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列の８３位のアミノ酸に対するコドンであり、配列番号６に示す配列においてはこの箇所にＣＧＧＧコドンを含み、この部位が非天然アミノ酸に対応する。この反応液を３７℃で１時間インキュベートした。反応溶液はＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲルに流し泳動を行った。ウェスタンブロッティングは、抗Ｔ７−ｔａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）とＰｒｏｔｏＢｌｏｔ ＩＩ ＡＰ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で行った。
【００２９】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０無細胞タンパク質合成系を用いて、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成した結果を図３に示す。図３は、配列番号３に示すＲＮＡ（Ａ）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｂ）およびその他数種のＲＮＡ（１〜１０）を添加した場合の結果である。配列番号３に示すＲＮＡおよび配列番号４に示すＲＮＡを添加した場合、完全長タンパク質の合成は認められず、これらのＲＮＡは内在性のＡＲＳによるアミノアシル化を受けていないことが示された。
【００３０】
実施例４
非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いたタンパク質合成
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０無細胞タンパク質合成系を用いて、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡに非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを担持させたものを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成した。タンパク質合成とウェスタンブロッティングは実施例３と同様に行った。その結果を図４に示す。配列番号３に示すＲＮＡ（Ａ）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｂ）を用いた場合、他のＲＮＡ（１〜１０）の場合と比べ、完全長タンパク質の合成量が特に多く、これらのＲＮＡは高い翻訳能を持つことが示された。
【００３１】
実施例５
非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いたタンパク質合成効率の測定
実施例４と同様に、４塩基アンチコドンＣＣＣＧを持つ各種ｔＲＮＡに非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを担持させたものを添加してストレプトアビジンタンパク質を合成しウェスタンブロッティングを行った。４塩基コドンの翻訳効率は全長タンパク質のバンド強度を、同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で調製した野生型ストレプトアビジンと比較することにより見積もった。バンド強度は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｇｒａｍ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）により測定した。これまでに報告されている、大腸菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡＡｓｎ由来変異体、Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５５−６２、配列番号７）、古細菌由来の配列を改変した人工ｔＲＮＡ（Ｈ．ｓｐ．ＮＲＣ−１ ｔＲＮＡＬｅｕ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，９５９８−６０８、配列番号８）と、配列番号３に示すＲＮＡ（ウシミトコンドリア ｔＲＮＡＳｅｒＵＧＡ変異体）および配列番号４に示すＲＮＡ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｉｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ ｔＲＮＡＰｙｌ）との翻訳効率（抑圧効率、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の比較結果を図６に示す。この結果より、これまでに報告されているｔＲＮＡよりも非天然アミノ酸を非常に効率よく導入できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本願発明のｔＲＮＡを用いて、種々の機能性非天然アミノ酸を部位特異的に導入したタンパク質を効率よく合成することができ、研究分野、医療分野等の産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】配列番号１のｔＲＮＡが自発的に取りうる２次構造を示す図。
【図２】配列番号２のｔＲＮＡが自発的に取りうる２次構造を示す図。
【図３】脱アミノアシル化したｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った図。
【図４】非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った図。
【図５】非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを用いて合成を行ったタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果から、それぞれの翻訳効率（抑圧効率、Suppression efficiency）を算出した図。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
SEQ ID NO:1: tRNA; "nnnn" from nucleotide 31 to nucleotide 34 represents an anticodon consisting of "p" arbitrary ribonucleotides, wherein the number "p" is 3 or more
SEQ ID NO:2: tRNA; "nnnn" from nucleotide 31 to nucleotide 34 represents an anticodon consisting of "p" arbitrary ribonucleotides, wherein the number "p" is 3 or more
SEQ ID NO:3: tRNA
SEQ ID NO:4: tRNA
SEQ ID NO:5: ORF of mRNA
SEQ ID NO:6: ORF of mRNA
SEQ ID NO:7: tRNA
SEQ ID NO:8: tRNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、以下の（１）、（２）および（３）からなる群より選択されるＲＮＡ：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号１における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号２における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；および
（３）（１）または（２）のいずれかのＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡ。
【請求項２】
アンチコドンが、４塩基アンチコドンであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
（１）のＲＮＡが配列番号３に記載の塩基配列からなる請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
（２）のＲＮＡが配列番号４に記載の塩基配列からなる請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法。
【請求項６】
請求項１〜４に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単一のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の方法により、部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質。
【請求項１】
ｔＲＮＡとしての機能を有するＲＮＡであって、以下の（１）、（２）および（３）からなる群より選択されるＲＮＡ：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号１における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；
（２）配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、ここで配列番号２における塩基３１〜３４の「ｎｎｎｎ」はｐ個の任意の塩基からなるアンチコドンであるｐ塩基アンチコドンを表し、ｐは３以上の整数である；および
（３）（１）または（２）のいずれかのＲＮＡにおいて一つまたは複数の塩基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなるＲＮＡ。
【請求項２】
アンチコドンが、４塩基アンチコドンであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
（１）のＲＮＡが配列番号３に記載の塩基配列からなる請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
（２）のＲＮＡが配列番号４に記載の塩基配列からなる請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のＲＮＡを用いて、部位特異的に非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法。
【請求項６】
請求項１〜４に記載のＲＮＡから選択される２種以上のＲＮＡを用いて、単一のタンパク質の２箇所以上に部位特異的に非天然アミノ酸を導入する方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の方法により、部位特異的に非天然アミノ酸を導入したタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２８０２５０（Ｐ２００６−２８０２５０Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１０２８６８（Ｐ２００５−１０２８６８）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２５日 第２７回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２７回 日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２５日 第２７回日本分子生物学会年会組織委員会発行の「第２７回 日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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