酵素活性向上剤
【課題】酵素活性を向上することができる酵素活性向上剤を提供する。
【解決手段】ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法。
【解決手段】ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品として広く利用されている。例えば、プロテアーゼは、衣料用洗浄剤、自動食器洗い洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、食品の改質（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤等、多分野で盛んに利用されている。
【０００３】
酵素は、配合量を増やすと、配合量に応じて効果が向上することが多いが、非常に高価であるため、実質的に配合できる量は限りがある。
そのため、安価で酵素活性が高い酵素溶液が強く望まれている。
【０００４】
ところで、ＴＷＥＥＮ２０をセルラーゼに配合することで、植物の分解量が向上するとの技術（非特許文献１）が提案されている。また、炭素数１２の脂肪族アルコールのエチレンオキサイド１０モル付加物をプロテアーゼに配合する技術（非特許文献２）では、タンパク汚れに対するプロテアーゼの吸着量が増加することが報告されている。
【０００５】
しかしながら、これらの化合物は、確かに酵素活性を向上するが、その効果はわずかである。上記技術を用いて酵素溶液を作成する場合、酵素使用量の低減ができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”、２００８年、第１４６巻、第１−３号、ｐ．２３１−２３８
【非特許文献２】「日本家政学会誌」、１９９４年、第４５巻、第５号、ｐ．３９３−４０１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、酵素活性を向上することができる酵素活性向上剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵素活性向上剤は、溶液中での酵素活性を大きく向上することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の酵素活性向上剤は、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含む。
ここでＨＬＢとは、界面活性剤の親水性／疎水性のバランスを示す尺度であり、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記数式（１）で計算される数値である（藤本武彦著、界面活性剤入門、三洋化成工業株式会社発行、２００７年６月１１日、ｐ．１４２）。
【００１１】
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝ （１）
【００１２】
本発明において、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）としては、プルロニック化合物（ａ−１）、ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）、ポリオキシアルキレンジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）、脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物（ａ−４）、アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）等が挙げられる。
【００１３】
プルロニック化合物（ａ−１）とは、オキシエチレンとオキシプロピレンがブロック共重合したものを指し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が挙げられる。酵素活性の向上性の観点から、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記する）は１，０００〜２０，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜１０，０００である。酵素活性の向上性の観点から、オキシエチレンとオキシプロピレンの比率（オキシエチレン／オキシプロピレン）は、１／９．４〜１／１．４が好ましい。
（ａ−１）として、具体的には、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７でありＭｎ６，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝１．８）、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／６でありＭｎ５，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝２．０）、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／３でありＭｎ６，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝４．３）等が挙げられる。
【００１４】
ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）において、脂肪酸は炭素数８〜１８の脂肪酸であり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪酸が好ましい。脂肪酸として、例えばオレイン酸、ステアリン酸等が挙げられる。エステルはモノエステル、ジエステル、トリエステルが挙げられる。なお、モノエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸１モルを反応させたもの、ジエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸２モルを反応させたもの、トリエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸３モルを反応させたものである。（ａ−２）として、具体的には、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝４．０）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１．８）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ＨＬＢ＝４．７）等が挙げられる。
【００１５】
ポリオキシアルキレングリコールジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）において、脂肪酸は炭素数８〜１８の脂肪酸であり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪酸が好ましい。脂肪酸として、例えばラウリン酸、オレイン酸等が挙げられる。ポリオキシアルキレングリコールとしては、エチレンオキサイド（以下ＥＯと略記）及びプロピレンオキサイド（以下ＰＯと略記）等のアルキレンオキサイドの共重合体が挙げられる。ポリオキシアルキレンのオキシアルキレン単位のモル数（重合度）は２〜２０のものが挙げられる。（ａ−３）として、具体的には、ポリオキシエチレングリコールジラウリン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝６．６）、ポリオキシエチレングリコールジオレイン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝５．６）等が挙げられる。
【００１６】
脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物（ａ−４）において、脂肪族アルコールは炭素数８〜１８の脂肪族アルコールであり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪族アルコールが好ましい。例えば、オレイルアルコール、ステアリルアルコール及びセチルアルコール等が挙げられる。アルキレンオキサイドは、炭素数２〜４のアルキレンオキサイドであり、酵素活性の向上性の観点から炭素数２〜３のアルキレンオキサイドが好ましい。例えばＥＯ及びＰＯが挙げられる。アルキレンオキサイドの付加モル数は、１〜１０のものが挙げられる。（ａ−４）として、具体的には、オレイルアルコールＥＯ付加物等が挙げられ、オレイルアルコールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝６．０）等が挙げられる。
【００１７】
アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）において、アルキルフェノールとしては、炭素数７〜１８のアルキルフェノールが含まれ、例えば、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、デシルフェノール、ドデシルフェノール等が挙げられる。酵素活性の向上性の観点からノニルフェノールが好ましい。アルキレンオキサイドとしては、炭素数２〜４のアルキレンオキサイドが含まれ、酵素活性の向上性の観点から炭素数２〜３のアルキレンオキサイドが好ましい。アルキレンオキサイドとして、具体的には、ＥＯ及びＰＯ等が挙げられる。アルキレンオキサイドの付加モル数は、１〜２０のものが含まれる。（ａ−５）として、具体的には、ノニルフェノールＥＯ付加物等が挙げられ、ノニルフェノールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝５．７）等が挙げられる。
【００１８】
本発明の酵素活性向上剤に含まれるノニオン性界面活性剤のＨＬＢは、１．５〜７であるが、酵素活性の向上性の観点から、１．５〜５が好ましく、特に好ましくは１．５〜３である。
また、ノニオン性界面活性剤のうち、酵素活性の向上性の観点から、プルロニック化合物（ａ−１）、ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）、ポリオキシアルキレンジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）及びアルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）が好ましく、さらに好ましくはプルロニック化合物（ａ−１）である。
これらのうち、酵素活性の向上性の観点で、好ましくはプルロニック化合物（ａ−１）であり、更に好ましくはプルロニック化合物の中でもＨＬＢが１．５〜５の化合物であり、さらに好ましくはプルロニック化合物の中でもＨＬＢが１．５〜３の化合物である。
上記のなかでも、酵素活性の向上性の観点から、特に好ましくはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー（Ｍｎ：５，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７、ＨＬＢ＝１．８）である。
【００１９】
本発明において、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）は、２種以上を同時に使用してもいい。２種以上を含む場合の組み合わせとしては、（ａ−１）を２種以上、（ａ−２）を２種以上、（ａ−３）を２種以上、（ａ−３）を２種以上、（ａ−４）を２種以上、（ａ−５）を２種以上及び（ａ−１）〜（ａ−５）から２種以上を使用する組み合わせ等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、酵素活性向上剤中のノニオン性界面活性剤（ａ）の含有量（重量％）は、酵素活性向上剤の重量を基準として、０．０１〜１００であり、酵素活性の向上性の観点から、０．０１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０であり、次にさらに好ましくは１〜７である。
【００２１】
本発明の酵素活性向上剤の使用量（重量％）は、酵素（ｂ）の重量に対して、酵素活性の向上性の観点から、０．０１〜１０，０００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１，０００である。
【００２２】
本発明の酵素活性向上剤の使用により、活性を向上させる酵素（ｂ）としては、プロテアーゼ（ｂ−１）、アミラーゼ（ｂ−２）、リパーゼ（ｂ−３）及びセルラーゼ（ｂ−４）が挙げられる。
【００２３】
プロテアーゼ（ｂ−１）としては、動物、植物又は微生物起源のものが含まれ、入手しやすさの観点から、微生物起源のものが好ましい。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。プロテアーゼのうち、酵素活性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、より好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ及びトリプシン様プロテアーゼである。
【００２４】
アルカリ性微生物プロテアーゼとしては、サブチリシン、特にバシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えばサブチリシン Ｎｏｖｏ、サブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン ３０９、サブチリシン １４７及びサブチリシン １６８が挙げられる。
トリプシン様プロテアーゼとしては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼが挙げられる。
【００２５】
市販のプロテアーゼとしては、ノボザイムス社のＡｌｃａｌａｓｅTM、ＳａｖｉｎａｓｅTM、ＰｒｉｍａｓｅTM、ＤｕｒａｚｙｍTM及びＥｓｐｅｒａｓｅTM並びにジェネンコア社のＰｕｒａｆｅｃｔTM及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰTM等が挙げられる。
【００２６】
アミラーゼ（ｂ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の ＤｕｒａｍｙｌTM、ＴｅｒｍａｍｙｌTM、ＦｕｎｇａｍｙｌTM及びＢＡＮTM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅTM及びＭａｘａｍｙｌ ＰTMが挙げられる。
【００２７】
リパーゼ（ｂ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８ ０６８号明細書及び欧州特許第３０５ ２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（欧州特許第２１４ ７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ 他（１９９３）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ１１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）並びにＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。
【００２８】
市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の Ｍ１ ＬｉｐａｓｅTM、Ｌｕｍａ ｆａｓｔTM及び ＬｉｐｏｍａｘTM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅTM及びＬｉｐｏｌａｓｅ ＵｌｔｒａTM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ Ｐ“Ａｍａｎｏ”TMが挙げられる。
【００２９】
セルラーゼ（ｂ−４）としては、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有するものであれば、特に限定するものではない。
【００３０】
市販のセルラーゼとしては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤があり、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、セリックＣテック（ノボザイム社製）、セルザイム（ノボザイム社製）、ＫＡＣ−５００Ｂ（花王社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）及びＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
【００３１】
上記の酵素（ｂ）のうち、酵素活性の向上性の観点で、プロテアーゼ（ｂ−１）及びセルラーゼ（ｂ−４）が好ましい。
【００３２】
本発明において、酵素（ｂ）は、２種以上を同時に含んでいても良い。２種以上を含む場合の組み合わせとしては、プロテアーゼ２種以上、セルラーゼ２種類以上、プロテアーゼとセルラーゼ、プロテアーゼとセルラーゼとリパーゼ、プロテアーゼとセルラーゼとリパーゼとアミラーゼを含む組み合わせ等が挙げられる。
【００３３】
本発明の酵素活性向上剤は、上記のノニオン性界面活性剤（ａ）以外に、下記一般式（１）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有することができる。化合物（Ａ）を含有すると、酵素活性が長期間持続できる点で好ましい。
なお、本発明において、「酵素活性が長期間持続する」とは、酵素に酵素活性向上剤を添加し、一定期間保管した後に測定した酵素活性と、保管する直前に測定した酵素活性との差が小さく、一定の酵素活性を示すことを意味する。
【００３４】
【化１】
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
一般式（１）で表される化合物として、具体的にはグアニジン、尿素及びチオ尿素が挙げられる。
【００３５】
一般式（１）で表される化合物の塩としては、グアニジンの塩が挙げられる。
塩としては塩酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩及びリン酸塩等が挙げられる。
【００３６】
化合物（Ａ）としては、酵素活性の持続性の観点で、グアニジンの塩及び尿素が好ましく、さらに好ましくはグアニジンの塩、次にさらに好ましくはグアニジン塩酸塩である。
【００３７】
本発明において、化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０．０１〜９０が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜５０、次にさらに好ましくは０．０３〜１０、特に好ましくは０．０５〜３である。
【００３８】
本発明の酵素活性向上剤は、さらに下記一般式（２）で表される化合物（Ｂ）を含有することができる。酵素活性の持続性の観点から、（Ｂ）を含有することが好ましい。
【００３９】
【化２】
【００４０】
一般式（２）中、Ｑはアミノ基又はアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。
【００４１】
Ｑのアルキル基としては炭素数１〜２２のアルキル基が挙げられ、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、セチル基、ステアリル基及びベヘニル基等が挙げられる。これらのアルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の置換基に置換されてもよい。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。置換基の数は１〜３が好ましく、さらに好ましくは２〜３である。例えばＱがブチル基の場合、ブチル基末端の水素原子２つが１つのアミノ基及び１つのカルボキシル基で置換された場合は（Ｂ）はアルギニンを表す。
【００４２】
化合物（Ｂ）としては、アルギニン又はその塩（Ｂ−１）、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）及びグアニジン誘導体又はその塩（Ｂ−３）が挙げられる。
【００４３】
アルギニン又はその塩（Ｂ−１）として、アルギニン、アルギニンの無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及びアルギニンの有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００４４】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）において、アルギニン誘導体は下記一般式（３）で表されるアルギニンのα−アミノ基若しくはα−カルボキシル基又はこれらの両方の基が置換された誘導体である。
α−アミノ基の置換は、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）への置換であり、α−カルボキシル基の置換は下記一般式（６）で表されるエステル基又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）への置換である。
【００４５】
言い換えると、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）では、α−アミノ基又はα−カルボキシル基の少なくともいずれか一方が置換されている。すなわち、Ｙがアミノ基の場合、Ｚは下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるアミド基（Ｚ−２）であり、Ｚがカルボキシル基の場合は、Ｙは下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）である。
【００４６】
【化３】
【００４７】
一般式（３）中、Ｙはアミノ基、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）を表す。Ｚは、カルボキシル基、下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）を表す。
【００４８】
【化４】
【００４９】
一般式（４）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３６の１価の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００５０】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）におけるＲ1の炭化水素基としては、炭素数１〜３６の１価の炭化水素基であり、直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基が含まれる。
直鎖の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基及びベヘニル基等が挙げられる。
分岐の脂肪族炭化水素基としては、イソプロピル基及びｔ−ブチル基等が挙げられる。
脂環式炭化水素基としては、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基及びシクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、メチルフェニル基、ベンジル基、フェニルエチル基及びメチルベンジル基等が挙げられる。
これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００５１】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）として具体的には、ホルムアミド基、アセチルアミド基、プロピオン酸アミド基、ブチル酸アミド基、ヘキシル酸アミド基、シクロヘキサンカルボキシアミド基、オクチル酸アミド基及びベンゾイルアミド基等が挙げられる。
【００５２】
【化５】
【００５３】
一般式（５）中、Ｒ2とＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００５４】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）において、Ｒ2とＲ3は、Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００５５】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）としては、メチルイミノ基等が挙げられる。
【００５６】
【化６】
【００５７】
一般式（６）中、Ｒ4は、炭素数１〜３６の炭化水素基を表す、又は多価アルコール若しくは糖から１つのヒドロキシル基を除いた残基を表す。
この炭化水素基はその水素原子一部が他の官能基、例えば、ヒドロキシル基、メトキシル基、エトキシル基、ニトロ基及びヒドロキシフェニル基からなる群より選ばれる官能基で置換されていてもよい。
【００５８】
一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）において、Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基は、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれる。
Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはエチル基である。
【００５９】
多価アルコールとしては、２価〜３価のアルコールが含まれ、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
糖としては、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等が挙げられる。
【００６０】
【化７】
【００６１】
一般式（７）中、Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００６２】
一般式（７）で表されるアミド基（Ｚ−２）において、Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基としては、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００６３】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）がアルギニン誘導体の塩の場合、無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及び有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００６４】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）の化合物として具体的に、Ｎ−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩が挙げられる。
【００６５】
グアニジン誘導体又はその塩（Ｂ−３）としては、Ｑを特に限定するものではないが、具体的にアミノグアニジン（−ＮＨ2）、ジシアンジアミド（−ＣＮ）、グアニルチオウレア（−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ2）、ドデシルグアニジン（−Ｃ12Ｈ25）、エチルグアニジン（−Ｃ2Ｈ5）、オクチルグアニジン（−Ｃ8Ｈ17）及びビグアニド（−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）が挙げられる。ここで、（）内はＱを表す。
【００６６】
これらのうち、酵素活性の持続性の観点で、好ましくは（Ｂ−１）及び（Ｂ−２）であり、さらに好ましくは、（Ｂ−２）であり、特に好ましいのはＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩である。
【００６７】
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる化合物（Ｂ）の含有量（重量％）は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．０３〜１０、次にさらに好ましくは０．０５〜５である。
【００６８】
本発明の酵素活性向上剤は、酵素活性の持続性の観点から、化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）を含有することが好ましい。
【００６９】
（Ａ）及び（Ｂ）を含有する場合、（Ａ）と（Ｂ）との重量比（（Ａ）の重量／（Ｂ）の重量）は０．１〜９が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８であり、特に好ましくは０．５〜５である。
【００７０】
本発明の酵素活性向上剤は、必要に応じ、適宜水で希釈して使用してよい。ハンドリング性の観点から水で希釈するほうが好ましい。水は、特に限定するものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。
【００７１】
本発明の酵素活性向上剤は必要に応じ、水を含んでいてもいい。ハンドリング性の観点から水を含んでいるほうが好ましい。
酵素活性向上剤に含まれる水の含有量は、酵素活性の持続性の観点から、酵素活性向上剤の重量に対し、１０〜９９．９９重量％が好ましく、さらに好ましくは３０〜９９．９８重量％、次にさらに好ましくは４０〜９９．９７重量％、その次にさらに好ましくは６０〜９９．９４重量％、特に好ましくは７０〜９９．９重量％、次に特に好ましくは７５〜９９．８重量％、最も好ましくは８５〜９８重量％である。
【００７２】
本発明において、酵素活性向上剤を使用する酵素が、酵素水溶液等の水を含んでいる場合は、酵素活性向上剤は水を含んでいなくてもよく、酵素が粉末及び固体等の水を含んでいない場合は、酵素活性向上剤は水を含んでいることが好ましい。
【００７３】
本発明の酵素活性向上剤には、酵素活性を向上させるために、上記のノニオン性界面活性剤（ａ）、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び水以外に、上記（ａ）以外の界面活性剤（ｃ）、水混和性有機溶剤（ｄ）、無機塩（ｅ）、糖（ｆ）、アルギニン以外のアミノ酸（ｇ）及びｐＨ調整剤（ｈ）を含有することができる。
【００７４】
上記（ａ）以外の界面活性剤（ｃ）として、（ａ）以外のノニオン性界面活性剤（ｃ−１）、アニオン性界面活性剤（ｃ−２）、カチオン性界面活性剤（ｃ−３）及び両性界面活性剤（ｃ−４）が挙げられる。
【００７５】
ノニオン性界面活性剤（ｃ−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［オレイルアルコールエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物等］、脂肪族アミン（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［ヘキサデシルアミンエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物、ラウリルアミンエチレンオキサイド付加物、ステアリルアミンエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物等］、（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）グリコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝２０）及びジステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝３０）等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸エチレングリコール及びモノラウリン酸ソルビタン等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル（ポリ）アルキレンオキサイド付加物（アルキレン基の炭素数２〜８，重合度＝１〜１００）［ソルビタンモノラウレートエチレンオキサイド（重合度＝１０）付加物及びメチルグルコースジオレエートエチレンオキサイド（重合度＝５０）付加物等］、脂肪酸Ｎ−ヒドロキシアルキルアミド［１：１型ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド及び１：１型ラウリン酸ジエタノールアミド等］、アルキル（炭素数１〜２２）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）フェニルエーテル、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）−アミノアルキル（炭素数８〜２４）−エーテル及びアルキル（炭素数８〜２４）ジアルキル（炭素数１〜６）アミンオキシド［ラウリルジメチルアミンオキシド等］等のうち、ＨＬＢが７．１以上のものが挙げられる。
【００７６】
アニオン性界面活性剤（ｃ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］が挙げられる。
【００７７】
カチオン性界面活性剤（ｃ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。
【００７８】
両性界面活性剤（ｃ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］、アミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。
【００７９】
界面活性剤（ｃ）としては、１種又は２種以上が使用出来る。２種以上を使用する場合、その組み合わせとしては、例えばノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤、及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。
【００８０】
水混和性有機溶剤（ｄ）としては、水１００ｇに対する溶解度が１０ｇ以上の溶剤であれば特に限定するものではないが、エタノール、イソプロピルアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール及びソルビトール等が挙げられる。
【００８１】
無機塩（ｅ）として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００８２】
糖（ｆ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００８３】
アルギニン以外のアミノ酸（ｇ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００８４】
ｐＨ調整剤（ｈ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。
【００８５】
本発明の酵素活性向上剤に含まれる界面活性剤（ｃ）の含有量は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し、０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜４０重量％、特に好ましくは０〜３０重量％である。
本発明の酵素活性向上剤に含まれる水混和性有機溶剤（ｄ）の含有量は、酵素活性の観点から、酵素活性向上剤の重量に対し、０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜１０重量％である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる無機塩（ｅ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜４０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる糖（ｆ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜８、次にさらに好ましくは０〜５である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれるアミノ酸（ｇ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜８、次にさらに好ましくは０〜５である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれるｐＨ調整剤（ｈ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜５が好ましく、さらに好ましくは０〜３、次にさらに好ましくは０〜１である。
【００８６】
本発明の酵素活性向上剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）化合物（Ａ）を含有する場合は、水に、化合物（Ａ）及び必要により化合物（Ｂ）を加え、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）ノニオン性界面活性剤（ａ）及びその他の成分を所定量添加し均一に溶解させる。
【００８７】
本発明において、酵素活性向上とは、酵素活性向上剤を加える前の酵素活性を基準として、酵素活性向上剤を加えた後の酵素活性が１２０％以上になることをいう。
【００８８】
本発明の酵素活性向上剤は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品用に使用する酵素の活性を向上させる酵素活性向上剤として使用できる。
【００８９】
本発明の酵素活性向上剤は、溶液中での酵素活性を大きく向上することができる。したがって、本発明の酵素活性向上剤を含む酵素溶液は、従来と同量の酵素を含む酵素溶液において、従来と同量の酵素溶液を使用すると活性が向上し、もしくは従来よりも少ない量の酵素溶液の使用で従来と同じ活性を得ることができる。また、従来よりも少ない量の酵素を含む酵素溶液において、従来と同量の酵素溶液の使用で従来と同じ活性を得ることができる。
【００９０】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤の使用方法は、酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法である。酵素活性向上剤の使用量は、酵素活性の向上性の観点から（ｂ）の重量に対して０．１〜１，０００重量％が好ましい。
本発明の酵素活性向上剤の使用方法は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品用に使用する酵素の活性を向上させるための酵素活性向上剤の使用方法である。。
【００９１】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤を使用した酵素溶液の必須構成成分は、酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒である。
【００９２】
本発明の酵素溶液において、酵素活性向上剤の含有量（重量％）は、酵素活性の向上性の観点から、酵素溶液の重量を基準として０．０１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０である。
本発明の酵素溶液において、酵素の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、酵素溶液の重量を基準として０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜１０である。
本発明の酵素溶液において、溶媒の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、酵素溶液の重量を基準として２０〜９９が好ましく、さらに好ましくは８０〜９９である。
【００９３】
本発明の酵素溶液において、溶媒は水、ジメチルスルホキシド、イソプロピルアルコール及びプロピレングリコール等が挙げられ、酵素活性の向上性の観点から水が好ましい。溶媒は、１種又は２種以上を使用しても良い。
【００９４】
本発明の酵素溶液は、酵素活性向上剤によって活性が向上するため、従来の酵素溶液より酵素活性が高い。したがって、従来と同量の酵素溶液を使用すると活性が向上し、もしくは従来よりも少ない量で従来と同じ活性を得ることができる。
【００９５】
本発明の酵素溶液は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品として使用できる。
【００９６】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法は、酵素（ｂ）と酵素活性向上剤を水等の溶媒と混合して製造する方法であり、酵素及び／又は酵素活性向上剤をあらかじめ溶液にした後に、混合して製造しても良い。また、溶媒としては、ジメチルスルホキシド、イソプロピルアルコール及びプロピレングリコール等が挙げられ、酵素活性の向上性の観点から水が好ましい。酵素溶液の製造方法の１例を下記に示す。
（１）水に酵素（ｂ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）酵素活性向上剤を所定量添加し均一に溶解させる。
【００９７】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法は、酵素（ｂ）を使用する前に、あらかじめ酵素活性剤を添加しておくことによって酵素活性を向上させる方法である。本発明の酵素（ｂ）の酵素活性向上方法は、下記工程（１）及び（２）を含む。
（１）酵素（ｂ）に酵素活性向上剤を添加する工程
（２）１５〜６０℃で１０分〜２００時間攪拌する工程
【実施例】
【００９８】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９９】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン｛アルギニンアセトアミド、株式会社エムピーバイオジャパン｝１２．６部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱攪拌し、エバポレーターで濃縮後、塩酸（濃度：３５重量％）５．２部（０．０５モル部）を加え中和した。その後、水から再結晶し、減圧乾燥｛６０℃、２０Ｐａ｝して、化合物（Ｂ１）であるＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩を得た。
【０１００】
＜実施例１〜２１＞
表１の割合で２５℃で配合し、本発明の酵素活性向上剤を作製した。
【０１０１】
＜比較例１〜１５＞
表２の割合で２５℃で配合し、比較用の酵素活性向上剤を作製した。
【０１０２】
＜性能試験＞
実施例１〜２１及び比較例１〜１５の酵素活性向上剤を用いたときの、表１及び２に記載の酵素（ｂ）に対する酵素活性の向上性を評価した。
酵素活性向上剤により酵素活性がどの程度向上したかを、各酵素の分解性能の向上の度合いで評価した。
具体的には、プロテアーゼ（ｂ−１）はカゼインの分解性能、アミラーゼ（ｂ−２）はデンプンの分解性能、セルラーゼ（ｂ−４）はセルロースの分解性能、リパーゼ（ｂ−３）はエステルの分解性能で評価した。
【０１０３】
＜セルラーゼ（ｂ−４）の分解性能＞
０．５重量％のセルロース懸濁液（和光純薬工業製セルロース０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例１〜４、８〜１４、１８〜２１又は比較例１〜４、８〜１２の酵素活性向上剤１０μＬ及び、０．１重量％セルラーゼ水溶液１０μＬを加え、５０℃で２０分間振とうした。
振とう後、ワットマン社製ろ紙（グレードＮｏ．１、９ｃｍ）でろ過し、ろ液を得た。９６穴のマイクロプレートにろ液１００μＬと、グルコース定量試薬（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬを加え、２５℃で１０分間静置した。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
セルラーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
セルラーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０４】
＜プロテアーゼ（ｂ−１）の分解活性＞
０．５重量％のミルクカゼイン溶液（和光純薬工業製カゼイン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例５、１５又は比較例５、１３の酵素活性向上剤１０μＬ、０．１重量％プロテアーゼ（和光純薬工業製）水溶液１０μＬを加え、２５℃で２０分間振とうした。
振とう後、１５％のトリクロロ酢酸を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み１ｍＬに０．０５モル／Ｌの炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬとイオン交換水で３倍希釈したフォーリン試薬（和光純薬工業製）１ｍＬを加え、２５度で１０分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
プロテアーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
プロテアーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０５】
＜リパーゼ（ｂ−３）の分解性能＞
０．５重量％のｐ−ニトロフェニルアセテート水溶液（和光純薬工業製、０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例６、１６又は比較例６、１４の酵素活性向上剤１０μＬ、および０．１％リパーゼ水溶液（和光純薬工業製）１０μＬを加え、４０℃で２０分間振とうした。
その後、４００ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
リパーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
リパーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０６】
＜アミラーゼ（ｂ−２）の分解性能＞
０．５重量％のデンプン懸濁液（和光純薬工業製デンプン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例７、１７又は比較例７、１５の酵素活性向上剤１０μＬ、０．１％アミラーゼ水溶液１０μＬを加え、６０℃で２０分間振とうした。
振とう後、ワットマン社製ろ紙（グレードＮｏ．１、９ｃｍ）でろ過し、ろ液を得た。９６穴のマイクロプレートにろ液１００μＬと、グルコース定量試薬（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬを加え、２５℃で１０分間静置した。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
セルラーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
セルラーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０７】
＜保管後の性能試験＞
実施例１〜２１及び比較例１〜１５の酵素活性向上剤１０μＬと、０．１重量％酵素液１０μＬを混合し、２５℃で３ヶ月保管した後、上記と同様に分解性能試験を行い、３ヶ月保管後の酵素活性向上剤を使用した分解率を算出した。結果を表１、表２に示す。
＜酵素活性の持続性＞
酵素活性の持続性は下記の式で算出した。
酵素活性の持続性（％）＝（３ヶ月保管後の酵素活性）／（作製直後の酵素活性）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
表１及び２中のノニオン性界面活性剤（ａ）、比較の活性剤、化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）、比較の活性剤は下記のものを使用した。
（Ａ１）グアニジン塩酸塩：和光純薬工業製
（Ａ２）尿素：和光純薬工業製
（Ｂ１）Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩：製造例１で得たもの
（Ｂ２）アルギニン塩酸塩：和光純薬工業製
（ａ−１−１）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ５，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７、ＨＬＢ＝１．８
（ａ−１−２）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／３、ＨＬＢ＝４．３
（ａ−１−３）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／２、ＨＬＢ＝６．７
（ａ−２−１）ソルビタンオレイン酸エステル：ＨＬＢ＝４．３
（ａ−５−１）ノニルフェノールＥＯ２モル付加物：ＨＬＢ＝５．７
（ａ−３−１）ポリオキシエチレングリコールジラウリン酸エステル：オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝６．６
（ｃ−１−１）ＴＷＥＥＮ２０：和光純薬工業製、ＨＬＢ＝１６．７
（ｃ−１−２）ラウリルアルコールＥＯ１０モル付加物：ＨＬＢ＝１４．０
（ｃ−１−３）オレイルアルコールＥＯ４モル付加物：ＨＬＢ＝８．０
（ｃ−１−４）ポリオキシエチレングリコールモノオレイン酸エステル：オキシエチレンの重合度＝１０、ＨＬＢ＝１１．７
（ｃ−１−５）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝５／７、ＨＬＢ＝１０．２
（ｃ−１−６）ソルビタンオレイン酸エステルＥＯ２０モル付加物：ＨＬＢ＝１５．０
（ｃ−１−７）ノニルフェノールＥＯ１０モル付加物：ＨＬＢ＝１３．４
（ｃ−１−８）ポリオキシエチレンジラウリン酸エステル：ＨＬＢ＝１０．４
【０１１１】
表２より、比較例１〜１１のＨＬＢの高い界面活性剤を含む酵素活性向上剤は、作製直後の酵素活性が１００〜１１５％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が最大でも１５％程度しか向上していない。また、２５℃で３ヶ月保管後に１００％未満となるものがある。このことから、比較例１〜１１は酵素活性向上剤としての性能が低いことがわかる。また、酵素活性の持続性が低く、３ヶ月保管することによって酵素の活性が著しく低下することがわかる。
また、比較例１２〜１５の界面活性剤を含まない酵素活性向上剤は、酵素活性の持続性は高いものの、酵素活性が全て１００％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が全く向上していないことがわかる。
一方、表１の本発明の酵素活性向上剤である実施例１〜１７は、作製直後の酵素活性が１３０〜１６０％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が３０〜６０％向上しており、効果的に酵素活性を向上できていることがわかる。また、２５℃で３ヶ月保管後も酵素活性が１００％以上に維持されており、酵素活性の持続性も高いことがわかる。
さらに、酵素活性向上剤中に化合物（Ａ）や化合物（Ｂ）を含んでいる実施例８〜１７、２０及び２１は、（Ａ）及び（Ｂ）を含んでいない実施例１〜７、１８及び１９と比較して、酵素活性の持続性がより高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の酵素活性向上剤は、酵素活性の向上性が高い。また、酵素と混合した場合の酵素の保存安定性が非常に高い。そのため、酵素溶液の酵素活性向上剤として幅広く使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品として広く利用されている。例えば、プロテアーゼは、衣料用洗浄剤、自動食器洗い洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、食品の改質（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤等、多分野で盛んに利用されている。
【０００３】
酵素は、配合量を増やすと、配合量に応じて効果が向上することが多いが、非常に高価であるため、実質的に配合できる量は限りがある。
そのため、安価で酵素活性が高い酵素溶液が強く望まれている。
【０００４】
ところで、ＴＷＥＥＮ２０をセルラーゼに配合することで、植物の分解量が向上するとの技術（非特許文献１）が提案されている。また、炭素数１２の脂肪族アルコールのエチレンオキサイド１０モル付加物をプロテアーゼに配合する技術（非特許文献２）では、タンパク汚れに対するプロテアーゼの吸着量が増加することが報告されている。
【０００５】
しかしながら、これらの化合物は、確かに酵素活性を向上するが、その効果はわずかである。上記技術を用いて酵素溶液を作成する場合、酵素使用量の低減ができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”、２００８年、第１４６巻、第１−３号、ｐ．２３１−２３８
【非特許文献２】「日本家政学会誌」、１９９４年、第４５巻、第５号、ｐ．３９３−４０１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、酵素活性を向上することができる酵素活性向上剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液；酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法；酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵素活性向上剤は、溶液中での酵素活性を大きく向上することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の酵素活性向上剤は、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含む。
ここでＨＬＢとは、界面活性剤の親水性／疎水性のバランスを示す尺度であり、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記数式（１）で計算される数値である（藤本武彦著、界面活性剤入門、三洋化成工業株式会社発行、２００７年６月１１日、ｐ．１４２）。
【００１１】
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝ （１）
【００１２】
本発明において、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）としては、プルロニック化合物（ａ−１）、ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）、ポリオキシアルキレンジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）、脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物（ａ−４）、アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）等が挙げられる。
【００１３】
プルロニック化合物（ａ−１）とは、オキシエチレンとオキシプロピレンがブロック共重合したものを指し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体が挙げられる。酵素活性の向上性の観点から、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記する）は１，０００〜２０，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜１０，０００である。酵素活性の向上性の観点から、オキシエチレンとオキシプロピレンの比率（オキシエチレン／オキシプロピレン）は、１／９．４〜１／１．４が好ましい。
（ａ−１）として、具体的には、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７でありＭｎ６，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝１．８）、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／６でありＭｎ５，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝２．０）、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／３でありＭｎ６，０００の界面活性剤（ＨＬＢ＝４．３）等が挙げられる。
【００１４】
ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）において、脂肪酸は炭素数８〜１８の脂肪酸であり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪酸が好ましい。脂肪酸として、例えばオレイン酸、ステアリン酸等が挙げられる。エステルはモノエステル、ジエステル、トリエステルが挙げられる。なお、モノエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸１モルを反応させたもの、ジエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸２モルを反応させたもの、トリエステルはソルビタン１モルに対して脂肪酸３モルを反応させたものである。（ａ−２）として、具体的には、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝４．０）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ＨＬＢ＝１．８）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ＨＬＢ＝４．７）等が挙げられる。
【００１５】
ポリオキシアルキレングリコールジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）において、脂肪酸は炭素数８〜１８の脂肪酸であり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪酸が好ましい。脂肪酸として、例えばラウリン酸、オレイン酸等が挙げられる。ポリオキシアルキレングリコールとしては、エチレンオキサイド（以下ＥＯと略記）及びプロピレンオキサイド（以下ＰＯと略記）等のアルキレンオキサイドの共重合体が挙げられる。ポリオキシアルキレンのオキシアルキレン単位のモル数（重合度）は２〜２０のものが挙げられる。（ａ−３）として、具体的には、ポリオキシエチレングリコールジラウリン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝６．６）、ポリオキシエチレングリコールジオレイン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝５．６）等が挙げられる。
【００１６】
脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物（ａ−４）において、脂肪族アルコールは炭素数８〜１８の脂肪族アルコールであり、酵素活性の向上性の観点から、炭素数１２〜１８の脂肪族アルコールが好ましい。例えば、オレイルアルコール、ステアリルアルコール及びセチルアルコール等が挙げられる。アルキレンオキサイドは、炭素数２〜４のアルキレンオキサイドであり、酵素活性の向上性の観点から炭素数２〜３のアルキレンオキサイドが好ましい。例えばＥＯ及びＰＯが挙げられる。アルキレンオキサイドの付加モル数は、１〜１０のものが挙げられる。（ａ−４）として、具体的には、オレイルアルコールＥＯ付加物等が挙げられ、オレイルアルコールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝６．０）等が挙げられる。
【００１７】
アルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）において、アルキルフェノールとしては、炭素数７〜１８のアルキルフェノールが含まれ、例えば、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、デシルフェノール、ドデシルフェノール等が挙げられる。酵素活性の向上性の観点からノニルフェノールが好ましい。アルキレンオキサイドとしては、炭素数２〜４のアルキレンオキサイドが含まれ、酵素活性の向上性の観点から炭素数２〜３のアルキレンオキサイドが好ましい。アルキレンオキサイドとして、具体的には、ＥＯ及びＰＯ等が挙げられる。アルキレンオキサイドの付加モル数は、１〜２０のものが含まれる。（ａ−５）として、具体的には、ノニルフェノールＥＯ付加物等が挙げられ、ノニルフェノールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝５．７）等が挙げられる。
【００１８】
本発明の酵素活性向上剤に含まれるノニオン性界面活性剤のＨＬＢは、１．５〜７であるが、酵素活性の向上性の観点から、１．５〜５が好ましく、特に好ましくは１．５〜３である。
また、ノニオン性界面活性剤のうち、酵素活性の向上性の観点から、プルロニック化合物（ａ−１）、ソルビタン脂肪酸エステル化合物（ａ−２）、ポリオキシアルキレンジ脂肪酸エステル化合物（ａ−３）及びアルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物（ａ−５）が好ましく、さらに好ましくはプルロニック化合物（ａ−１）である。
これらのうち、酵素活性の向上性の観点で、好ましくはプルロニック化合物（ａ−１）であり、更に好ましくはプルロニック化合物の中でもＨＬＢが１．５〜５の化合物であり、さらに好ましくはプルロニック化合物の中でもＨＬＢが１．５〜３の化合物である。
上記のなかでも、酵素活性の向上性の観点から、特に好ましくはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー（Ｍｎ：５，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７、ＨＬＢ＝１．８）である。
【００１９】
本発明において、ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）は、２種以上を同時に使用してもいい。２種以上を含む場合の組み合わせとしては、（ａ−１）を２種以上、（ａ−２）を２種以上、（ａ−３）を２種以上、（ａ−３）を２種以上、（ａ−４）を２種以上、（ａ−５）を２種以上及び（ａ−１）〜（ａ−５）から２種以上を使用する組み合わせ等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、酵素活性向上剤中のノニオン性界面活性剤（ａ）の含有量（重量％）は、酵素活性向上剤の重量を基準として、０．０１〜１００であり、酵素活性の向上性の観点から、０．０１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０であり、次にさらに好ましくは１〜７である。
【００２１】
本発明の酵素活性向上剤の使用量（重量％）は、酵素（ｂ）の重量に対して、酵素活性の向上性の観点から、０．０１〜１０，０００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１，０００である。
【００２２】
本発明の酵素活性向上剤の使用により、活性を向上させる酵素（ｂ）としては、プロテアーゼ（ｂ−１）、アミラーゼ（ｂ−２）、リパーゼ（ｂ−３）及びセルラーゼ（ｂ−４）が挙げられる。
【００２３】
プロテアーゼ（ｂ−１）としては、動物、植物又は微生物起源のものが含まれ、入手しやすさの観点から、微生物起源のものが好ましい。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。プロテアーゼのうち、酵素活性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、より好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ及びトリプシン様プロテアーゼである。
【００２４】
アルカリ性微生物プロテアーゼとしては、サブチリシン、特にバシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えばサブチリシン Ｎｏｖｏ、サブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン ３０９、サブチリシン １４７及びサブチリシン １６８が挙げられる。
トリプシン様プロテアーゼとしては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼが挙げられる。
【００２５】
市販のプロテアーゼとしては、ノボザイムス社のＡｌｃａｌａｓｅTM、ＳａｖｉｎａｓｅTM、ＰｒｉｍａｓｅTM、ＤｕｒａｚｙｍTM及びＥｓｐｅｒａｓｅTM並びにジェネンコア社のＰｕｒａｆｅｃｔTM及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰTM等が挙げられる。
【００２６】
アミラーゼ（ｂ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の ＤｕｒａｍｙｌTM、ＴｅｒｍａｍｙｌTM、ＦｕｎｇａｍｙｌTM及びＢＡＮTM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅTM及びＭａｘａｍｙｌ ＰTMが挙げられる。
【００２７】
リパーゼ（ｂ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８ ０６８号明細書及び欧州特許第３０５ ２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（欧州特許第２１４ ７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ 他（１９９３）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ１１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）並びにＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。
【００２８】
市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の Ｍ１ ＬｉｐａｓｅTM、Ｌｕｍａ ｆａｓｔTM及び ＬｉｐｏｍａｘTM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅTM及びＬｉｐｏｌａｓｅ ＵｌｔｒａTM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ Ｐ“Ａｍａｎｏ”TMが挙げられる。
【００２９】
セルラーゼ（ｂ−４）としては、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有するものであれば、特に限定するものではない。
【００３０】
市販のセルラーゼとしては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤があり、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、セリックＣテック（ノボザイム社製）、セルザイム（ノボザイム社製）、ＫＡＣ−５００Ｂ（花王社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）及びＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
【００３１】
上記の酵素（ｂ）のうち、酵素活性の向上性の観点で、プロテアーゼ（ｂ−１）及びセルラーゼ（ｂ−４）が好ましい。
【００３２】
本発明において、酵素（ｂ）は、２種以上を同時に含んでいても良い。２種以上を含む場合の組み合わせとしては、プロテアーゼ２種以上、セルラーゼ２種類以上、プロテアーゼとセルラーゼ、プロテアーゼとセルラーゼとリパーゼ、プロテアーゼとセルラーゼとリパーゼとアミラーゼを含む組み合わせ等が挙げられる。
【００３３】
本発明の酵素活性向上剤は、上記のノニオン性界面活性剤（ａ）以外に、下記一般式（１）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有することができる。化合物（Ａ）を含有すると、酵素活性が長期間持続できる点で好ましい。
なお、本発明において、「酵素活性が長期間持続する」とは、酵素に酵素活性向上剤を添加し、一定期間保管した後に測定した酵素活性と、保管する直前に測定した酵素活性との差が小さく、一定の酵素活性を示すことを意味する。
【００３４】
【化１】
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
一般式（１）で表される化合物として、具体的にはグアニジン、尿素及びチオ尿素が挙げられる。
【００３５】
一般式（１）で表される化合物の塩としては、グアニジンの塩が挙げられる。
塩としては塩酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩及びリン酸塩等が挙げられる。
【００３６】
化合物（Ａ）としては、酵素活性の持続性の観点で、グアニジンの塩及び尿素が好ましく、さらに好ましくはグアニジンの塩、次にさらに好ましくはグアニジン塩酸塩である。
【００３７】
本発明において、化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０．０１〜９０が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜５０、次にさらに好ましくは０．０３〜１０、特に好ましくは０．０５〜３である。
【００３８】
本発明の酵素活性向上剤は、さらに下記一般式（２）で表される化合物（Ｂ）を含有することができる。酵素活性の持続性の観点から、（Ｂ）を含有することが好ましい。
【００３９】
【化２】
【００４０】
一般式（２）中、Ｑはアミノ基又はアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。
【００４１】
Ｑのアルキル基としては炭素数１〜２２のアルキル基が挙げられ、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、セチル基、ステアリル基及びベヘニル基等が挙げられる。これらのアルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の置換基に置換されてもよい。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。置換基の数は１〜３が好ましく、さらに好ましくは２〜３である。例えばＱがブチル基の場合、ブチル基末端の水素原子２つが１つのアミノ基及び１つのカルボキシル基で置換された場合は（Ｂ）はアルギニンを表す。
【００４２】
化合物（Ｂ）としては、アルギニン又はその塩（Ｂ−１）、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）及びグアニジン誘導体又はその塩（Ｂ−３）が挙げられる。
【００４３】
アルギニン又はその塩（Ｂ−１）として、アルギニン、アルギニンの無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及びアルギニンの有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００４４】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）において、アルギニン誘導体は下記一般式（３）で表されるアルギニンのα−アミノ基若しくはα−カルボキシル基又はこれらの両方の基が置換された誘導体である。
α−アミノ基の置換は、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）への置換であり、α−カルボキシル基の置換は下記一般式（６）で表されるエステル基又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）への置換である。
【００４５】
言い換えると、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）では、α−アミノ基又はα−カルボキシル基の少なくともいずれか一方が置換されている。すなわち、Ｙがアミノ基の場合、Ｚは下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるアミド基（Ｚ−２）であり、Ｚがカルボキシル基の場合は、Ｙは下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）である。
【００４６】
【化３】
【００４７】
一般式（３）中、Ｙはアミノ基、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）を表す。Ｚは、カルボキシル基、下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）を表す。
【００４８】
【化４】
【００４９】
一般式（４）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３６の１価の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００５０】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）におけるＲ1の炭化水素基としては、炭素数１〜３６の１価の炭化水素基であり、直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基が含まれる。
直鎖の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基及びベヘニル基等が挙げられる。
分岐の脂肪族炭化水素基としては、イソプロピル基及びｔ−ブチル基等が挙げられる。
脂環式炭化水素基としては、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基及びシクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、メチルフェニル基、ベンジル基、フェニルエチル基及びメチルベンジル基等が挙げられる。
これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
【００５１】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）として具体的には、ホルムアミド基、アセチルアミド基、プロピオン酸アミド基、ブチル酸アミド基、ヘキシル酸アミド基、シクロヘキサンカルボキシアミド基、オクチル酸アミド基及びベンゾイルアミド基等が挙げられる。
【００５２】
【化５】
【００５３】
一般式（５）中、Ｒ2とＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００５４】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）において、Ｒ2とＲ3は、Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００５５】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）としては、メチルイミノ基等が挙げられる。
【００５６】
【化６】
【００５７】
一般式（６）中、Ｒ4は、炭素数１〜３６の炭化水素基を表す、又は多価アルコール若しくは糖から１つのヒドロキシル基を除いた残基を表す。
この炭化水素基はその水素原子一部が他の官能基、例えば、ヒドロキシル基、メトキシル基、エトキシル基、ニトロ基及びヒドロキシフェニル基からなる群より選ばれる官能基で置換されていてもよい。
【００５８】
一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）において、Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基は、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれる。
Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはエチル基である。
【００５９】
多価アルコールとしては、２価〜３価のアルコールが含まれ、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
糖としては、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等が挙げられる。
【００６０】
【化７】
【００６１】
一般式（７）中、Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００６２】
一般式（７）で表されるアミド基（Ｚ−２）において、Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基としては、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、酵素活性の持続性の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００６３】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）がアルギニン誘導体の塩の場合、無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及び有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００６４】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）の化合物として具体的に、Ｎ−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩が挙げられる。
【００６５】
グアニジン誘導体又はその塩（Ｂ−３）としては、Ｑを特に限定するものではないが、具体的にアミノグアニジン（−ＮＨ2）、ジシアンジアミド（−ＣＮ）、グアニルチオウレア（−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ2）、ドデシルグアニジン（−Ｃ12Ｈ25）、エチルグアニジン（−Ｃ2Ｈ5）、オクチルグアニジン（−Ｃ8Ｈ17）及びビグアニド（−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）が挙げられる。ここで、（）内はＱを表す。
【００６６】
これらのうち、酵素活性の持続性の観点で、好ましくは（Ｂ−１）及び（Ｂ−２）であり、さらに好ましくは、（Ｂ−２）であり、特に好ましいのはＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩である。
【００６７】
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる化合物（Ｂ）の含有量（重量％）は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．０３〜１０、次にさらに好ましくは０．０５〜５である。
【００６８】
本発明の酵素活性向上剤は、酵素活性の持続性の観点から、化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）を含有することが好ましい。
【００６９】
（Ａ）及び（Ｂ）を含有する場合、（Ａ）と（Ｂ）との重量比（（Ａ）の重量／（Ｂ）の重量）は０．１〜９が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８であり、特に好ましくは０．５〜５である。
【００７０】
本発明の酵素活性向上剤は、必要に応じ、適宜水で希釈して使用してよい。ハンドリング性の観点から水で希釈するほうが好ましい。水は、特に限定するものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。
【００７１】
本発明の酵素活性向上剤は必要に応じ、水を含んでいてもいい。ハンドリング性の観点から水を含んでいるほうが好ましい。
酵素活性向上剤に含まれる水の含有量は、酵素活性の持続性の観点から、酵素活性向上剤の重量に対し、１０〜９９．９９重量％が好ましく、さらに好ましくは３０〜９９．９８重量％、次にさらに好ましくは４０〜９９．９７重量％、その次にさらに好ましくは６０〜９９．９４重量％、特に好ましくは７０〜９９．９重量％、次に特に好ましくは７５〜９９．８重量％、最も好ましくは８５〜９８重量％である。
【００７２】
本発明において、酵素活性向上剤を使用する酵素が、酵素水溶液等の水を含んでいる場合は、酵素活性向上剤は水を含んでいなくてもよく、酵素が粉末及び固体等の水を含んでいない場合は、酵素活性向上剤は水を含んでいることが好ましい。
【００７３】
本発明の酵素活性向上剤には、酵素活性を向上させるために、上記のノニオン性界面活性剤（ａ）、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び水以外に、上記（ａ）以外の界面活性剤（ｃ）、水混和性有機溶剤（ｄ）、無機塩（ｅ）、糖（ｆ）、アルギニン以外のアミノ酸（ｇ）及びｐＨ調整剤（ｈ）を含有することができる。
【００７４】
上記（ａ）以外の界面活性剤（ｃ）として、（ａ）以外のノニオン性界面活性剤（ｃ−１）、アニオン性界面活性剤（ｃ−２）、カチオン性界面活性剤（ｃ−３）及び両性界面活性剤（ｃ−４）が挙げられる。
【００７５】
ノニオン性界面活性剤（ｃ−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［オレイルアルコールエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物等］、脂肪族アミン（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［ヘキサデシルアミンエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物、ラウリルアミンエチレンオキサイド付加物、ステアリルアミンエチレンオキサイドプロピレンオキサイド付加物等］、（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）グリコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝２０）及びジステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝３０）等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸エチレングリコール及びモノラウリン酸ソルビタン等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル（ポリ）アルキレンオキサイド付加物（アルキレン基の炭素数２〜８，重合度＝１〜１００）［ソルビタンモノラウレートエチレンオキサイド（重合度＝１０）付加物及びメチルグルコースジオレエートエチレンオキサイド（重合度＝５０）付加物等］、脂肪酸Ｎ−ヒドロキシアルキルアミド［１：１型ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド及び１：１型ラウリン酸ジエタノールアミド等］、アルキル（炭素数１〜２２）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）フェニルエーテル、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）−アミノアルキル（炭素数８〜２４）−エーテル及びアルキル（炭素数８〜２４）ジアルキル（炭素数１〜６）アミンオキシド［ラウリルジメチルアミンオキシド等］等のうち、ＨＬＢが７．１以上のものが挙げられる。
【００７６】
アニオン性界面活性剤（ｃ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］が挙げられる。
【００７７】
カチオン性界面活性剤（ｃ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。
【００７８】
両性界面活性剤（ｃ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］、アミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。
【００７９】
界面活性剤（ｃ）としては、１種又は２種以上が使用出来る。２種以上を使用する場合、その組み合わせとしては、例えばノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤、及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。
【００８０】
水混和性有機溶剤（ｄ）としては、水１００ｇに対する溶解度が１０ｇ以上の溶剤であれば特に限定するものではないが、エタノール、イソプロピルアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール及びソルビトール等が挙げられる。
【００８１】
無機塩（ｅ）として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００８２】
糖（ｆ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００８３】
アルギニン以外のアミノ酸（ｇ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００８４】
ｐＨ調整剤（ｈ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。
【００８５】
本発明の酵素活性向上剤に含まれる界面活性剤（ｃ）の含有量は、酵素活性の持続性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し、０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜４０重量％、特に好ましくは０〜３０重量％である。
本発明の酵素活性向上剤に含まれる水混和性有機溶剤（ｄ）の含有量は、酵素活性の観点から、酵素活性向上剤の重量に対し、０〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０重量％、特に好ましくは０〜１０重量％である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる無機塩（ｅ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜４０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれる糖（ｆ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜８、次にさらに好ましくは０〜５である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれるアミノ酸（ｇ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜８、次にさらに好ましくは０〜５である。
本発明の酵素活性向上剤中に含まれるｐＨ調整剤（ｈ）の含有量（重量％）は、酵素活性の観点から酵素活性向上剤の重量に対し０〜５が好ましく、さらに好ましくは０〜３、次にさらに好ましくは０〜１である。
【００８６】
本発明の酵素活性向上剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）化合物（Ａ）を含有する場合は、水に、化合物（Ａ）及び必要により化合物（Ｂ）を加え、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）ノニオン性界面活性剤（ａ）及びその他の成分を所定量添加し均一に溶解させる。
【００８７】
本発明において、酵素活性向上とは、酵素活性向上剤を加える前の酵素活性を基準として、酵素活性向上剤を加えた後の酵素活性が１２０％以上になることをいう。
【００８８】
本発明の酵素活性向上剤は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品用に使用する酵素の活性を向上させる酵素活性向上剤として使用できる。
【００８９】
本発明の酵素活性向上剤は、溶液中での酵素活性を大きく向上することができる。したがって、本発明の酵素活性向上剤を含む酵素溶液は、従来と同量の酵素を含む酵素溶液において、従来と同量の酵素溶液を使用すると活性が向上し、もしくは従来よりも少ない量の酵素溶液の使用で従来と同じ活性を得ることができる。また、従来よりも少ない量の酵素を含む酵素溶液において、従来と同量の酵素溶液の使用で従来と同じ活性を得ることができる。
【００９０】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤の使用方法は、酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法である。酵素活性向上剤の使用量は、酵素活性の向上性の観点から（ｂ）の重量に対して０．１〜１，０００重量％が好ましい。
本発明の酵素活性向上剤の使用方法は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品用に使用する酵素の活性を向上させるための酵素活性向上剤の使用方法である。。
【００９１】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤を使用した酵素溶液の必須構成成分は、酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒である。
【００９２】
本発明の酵素溶液において、酵素活性向上剤の含有量（重量％）は、酵素活性の向上性の観点から、酵素溶液の重量を基準として０．０１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０である。
本発明の酵素溶液において、酵素の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、酵素溶液の重量を基準として０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜１０である。
本発明の酵素溶液において、溶媒の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、酵素溶液の重量を基準として２０〜９９が好ましく、さらに好ましくは８０〜９９である。
【００９３】
本発明の酵素溶液において、溶媒は水、ジメチルスルホキシド、イソプロピルアルコール及びプロピレングリコール等が挙げられ、酵素活性の向上性の観点から水が好ましい。溶媒は、１種又は２種以上を使用しても良い。
【００９４】
本発明の酵素溶液は、酵素活性向上剤によって活性が向上するため、従来の酵素溶液より酵素活性が高い。したがって、従来と同量の酵素溶液を使用すると活性が向上し、もしくは従来よりも少ない量で従来と同じ活性を得ることができる。
【００９５】
本発明の酵素溶液は、洗剤、診断・検査薬及び医薬品として使用できる。
【００９６】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法は、酵素（ｂ）と酵素活性向上剤を水等の溶媒と混合して製造する方法であり、酵素及び／又は酵素活性向上剤をあらかじめ溶液にした後に、混合して製造しても良い。また、溶媒としては、ジメチルスルホキシド、イソプロピルアルコール及びプロピレングリコール等が挙げられ、酵素活性の向上性の観点から水が好ましい。酵素溶液の製造方法の１例を下記に示す。
（１）水に酵素（ｂ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）酵素活性向上剤を所定量添加し均一に溶解させる。
【００９７】
本発明の別の実施形態である酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法は、酵素（ｂ）を使用する前に、あらかじめ酵素活性剤を添加しておくことによって酵素活性を向上させる方法である。本発明の酵素（ｂ）の酵素活性向上方法は、下記工程（１）及び（２）を含む。
（１）酵素（ｂ）に酵素活性向上剤を添加する工程
（２）１５〜６０℃で１０分〜２００時間攪拌する工程
【実施例】
【００９８】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９９】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン｛アルギニンアセトアミド、株式会社エムピーバイオジャパン｝１２．６部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱攪拌し、エバポレーターで濃縮後、塩酸（濃度：３５重量％）５．２部（０．０５モル部）を加え中和した。その後、水から再結晶し、減圧乾燥｛６０℃、２０Ｐａ｝して、化合物（Ｂ１）であるＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩を得た。
【０１００】
＜実施例１〜２１＞
表１の割合で２５℃で配合し、本発明の酵素活性向上剤を作製した。
【０１０１】
＜比較例１〜１５＞
表２の割合で２５℃で配合し、比較用の酵素活性向上剤を作製した。
【０１０２】
＜性能試験＞
実施例１〜２１及び比較例１〜１５の酵素活性向上剤を用いたときの、表１及び２に記載の酵素（ｂ）に対する酵素活性の向上性を評価した。
酵素活性向上剤により酵素活性がどの程度向上したかを、各酵素の分解性能の向上の度合いで評価した。
具体的には、プロテアーゼ（ｂ−１）はカゼインの分解性能、アミラーゼ（ｂ−２）はデンプンの分解性能、セルラーゼ（ｂ−４）はセルロースの分解性能、リパーゼ（ｂ−３）はエステルの分解性能で評価した。
【０１０３】
＜セルラーゼ（ｂ−４）の分解性能＞
０．５重量％のセルロース懸濁液（和光純薬工業製セルロース０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例１〜４、８〜１４、１８〜２１又は比較例１〜４、８〜１２の酵素活性向上剤１０μＬ及び、０．１重量％セルラーゼ水溶液１０μＬを加え、５０℃で２０分間振とうした。
振とう後、ワットマン社製ろ紙（グレードＮｏ．１、９ｃｍ）でろ過し、ろ液を得た。９６穴のマイクロプレートにろ液１００μＬと、グルコース定量試薬（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬを加え、２５℃で１０分間静置した。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
セルラーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
セルラーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０４】
＜プロテアーゼ（ｂ−１）の分解活性＞
０．５重量％のミルクカゼイン溶液（和光純薬工業製カゼイン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例５、１５又は比較例５、１３の酵素活性向上剤１０μＬ、０．１重量％プロテアーゼ（和光純薬工業製）水溶液１０μＬを加え、２５℃で２０分間振とうした。
振とう後、１５％のトリクロロ酢酸を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み１ｍＬに０．０５モル／Ｌの炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬとイオン交換水で３倍希釈したフォーリン試薬（和光純薬工業製）１ｍＬを加え、２５度で１０分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
プロテアーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
プロテアーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０５】
＜リパーゼ（ｂ−３）の分解性能＞
０．５重量％のｐ−ニトロフェニルアセテート水溶液（和光純薬工業製、０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例６、１６又は比較例６、１４の酵素活性向上剤１０μＬ、および０．１％リパーゼ水溶液（和光純薬工業製）１０μＬを加え、４０℃で２０分間振とうした。
その後、４００ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
リパーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
リパーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０６】
＜アミラーゼ（ｂ−２）の分解性能＞
０．５重量％のデンプン懸濁液（和光純薬工業製デンプン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解する）５ｍＬに、実施例７、１７又は比較例７、１５の酵素活性向上剤１０μＬ、０．１％アミラーゼ水溶液１０μＬを加え、６０℃で２０分間振とうした。
振とう後、ワットマン社製ろ紙（グレードＮｏ．１、９ｃｍ）でろ過し、ろ液を得た。９６穴のマイクロプレートにろ液１００μＬと、グルコース定量試薬（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬを加え、２５℃で１０分間静置した。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ２０）を測定した。
また、ブランクとして酵素活性向上剤を加えていないものについても上記と同様におこない、吸光度（Ａ２０ｂ）を測定した。
セルラーゼの酵素活性は以下の式で算出した。
セルラーゼの酵素活性（％）＝（Ａ２０）／（Ａ２０ｂ）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０７】
＜保管後の性能試験＞
実施例１〜２１及び比較例１〜１５の酵素活性向上剤１０μＬと、０．１重量％酵素液１０μＬを混合し、２５℃で３ヶ月保管した後、上記と同様に分解性能試験を行い、３ヶ月保管後の酵素活性向上剤を使用した分解率を算出した。結果を表１、表２に示す。
＜酵素活性の持続性＞
酵素活性の持続性は下記の式で算出した。
酵素活性の持続性（％）＝（３ヶ月保管後の酵素活性）／（作製直後の酵素活性）×１００
結果を表１、２に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
表１及び２中のノニオン性界面活性剤（ａ）、比較の活性剤、化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）、比較の活性剤は下記のものを使用した。
（Ａ１）グアニジン塩酸塩：和光純薬工業製
（Ａ２）尿素：和光純薬工業製
（Ｂ１）Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩：製造例１で得たもの
（Ｂ２）アルギニン塩酸塩：和光純薬工業製
（ａ−１−１）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ５，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／７．７、ＨＬＢ＝１．８
（ａ−１−２）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／３、ＨＬＢ＝４．３
（ａ−１−３）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝１／２、ＨＬＢ＝６．７
（ａ−２−１）ソルビタンオレイン酸エステル：ＨＬＢ＝４．３
（ａ−５−１）ノニルフェノールＥＯ２モル付加物：ＨＬＢ＝５．７
（ａ−３−１）ポリオキシエチレングリコールジラウリン酸エステル：オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝６．６
（ｃ−１−１）ＴＷＥＥＮ２０：和光純薬工業製、ＨＬＢ＝１６．７
（ｃ−１−２）ラウリルアルコールＥＯ１０モル付加物：ＨＬＢ＝１４．０
（ｃ−１−３）オレイルアルコールＥＯ４モル付加物：ＨＬＢ＝８．０
（ｃ−１−４）ポリオキシエチレングリコールモノオレイン酸エステル：オキシエチレンの重合度＝１０、ＨＬＢ＝１１．７
（ｃ−１−５）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー：Ｍｎ６，０００、オキシエチレン／オキシプロピレン比率＝５／７、ＨＬＢ＝１０．２
（ｃ−１−６）ソルビタンオレイン酸エステルＥＯ２０モル付加物：ＨＬＢ＝１５．０
（ｃ−１−７）ノニルフェノールＥＯ１０モル付加物：ＨＬＢ＝１３．４
（ｃ−１−８）ポリオキシエチレンジラウリン酸エステル：ＨＬＢ＝１０．４
【０１１１】
表２より、比較例１〜１１のＨＬＢの高い界面活性剤を含む酵素活性向上剤は、作製直後の酵素活性が１００〜１１５％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が最大でも１５％程度しか向上していない。また、２５℃で３ヶ月保管後に１００％未満となるものがある。このことから、比較例１〜１１は酵素活性向上剤としての性能が低いことがわかる。また、酵素活性の持続性が低く、３ヶ月保管することによって酵素の活性が著しく低下することがわかる。
また、比較例１２〜１５の界面活性剤を含まない酵素活性向上剤は、酵素活性の持続性は高いものの、酵素活性が全て１００％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が全く向上していないことがわかる。
一方、表１の本発明の酵素活性向上剤である実施例１〜１７は、作製直後の酵素活性が１３０〜１６０％であり、酵素活性向上剤を添加していない酵素と比較して、酵素活性が３０〜６０％向上しており、効果的に酵素活性を向上できていることがわかる。また、２５℃で３ヶ月保管後も酵素活性が１００％以上に維持されており、酵素活性の持続性も高いことがわかる。
さらに、酵素活性向上剤中に化合物（Ａ）や化合物（Ｂ）を含んでいる実施例８〜１７、２０及び２１は、（Ａ）及び（Ｂ）を含んでいない実施例１〜７、１８及び１９と比較して、酵素活性の持続性がより高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の酵素活性向上剤は、酵素活性の向上性が高い。また、酵素と混合した場合の酵素の保存安定性が非常に高い。そのため、酵素溶液の酵素活性向上剤として幅広く使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤。
【請求項２】
活性を向上させる酵素（ｂ）が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の酵素活性向上剤。
【請求項３】
さらに、下記一般式（１）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有する請求項１又は２に記載の酵素活性向上剤。
【化１】
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項４】
化合物（Ａ）がグアニジン塩酸塩である請求項３に記載の酵素活性向上剤。
【請求項５】
さらに、下記一般式（２）で表される化合物（Ｂ）を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の酵素活性向上剤。
【化２】
［式中、Ｑは、アミノ基又はアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。］
【請求項６】
化合物（Ａ）の含有量が酵素活性向上剤の重量を基準として０．０１〜９０重量％である請求項３〜５のいずれかに記載の酵素活性向上剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法。
【請求項１】
ＨＬＢが１．５〜７のノニオン性界面活性剤（ａ）を含んでなる酵素活性向上剤。
【請求項２】
活性を向上させる酵素（ｂ）が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の酵素活性向上剤。
【請求項３】
さらに、下記一般式（１）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有する請求項１又は２に記載の酵素活性向上剤。
【化１】
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項４】
化合物（Ａ）がグアニジン塩酸塩である請求項３に記載の酵素活性向上剤。
【請求項５】
さらに、下記一般式（２）で表される化合物（Ｂ）を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の酵素活性向上剤。
【化２】
［式中、Ｑは、アミノ基又はアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。］
【請求項６】
化合物（Ａ）の含有量が酵素活性向上剤の重量を基準として０．０１〜９０重量％である請求項３〜５のいずれかに記載の酵素活性向上剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を同時に存在させ、酵素活性向上剤の使用量が、（ｂ）の重量に対して、０．０１〜１０，０００重量％である酵素活性向上剤の使用方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を含んでなる酵素溶液。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤、酵素（ｂ）及び溶媒を混合する酵素溶液の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素活性向上剤及び酵素（ｂ）を１５〜６０℃で１０分〜２００時間同時に存在させる酵素（ｂ）の酵素活性向上方法。
【公開番号】特開２０１２−１０６９７（Ｐ２０１２−１０６９７Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２３０５３（Ｐ２０１１−１２３０５３）
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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