酵素燃料電池
【課題】環境又は生体に不利な影響等を与えないメディエータを使用する燃料電池を提供する。
【解決手段】アノード極及びカソード極が電解質膜を介して対向する燃料電池であって、少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。
【解決手段】アノード極及びカソード極が電解質膜を介して対向する燃料電池であって、少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を触媒として利用する燃料電池（以下、「酵素燃料電池」と呼ぶ場合がある）の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、燃料のエネルギを直接電力に変換する装置であり、クリーンでエネルギ変換効率が高く、石油代替燃料の使用が可能であることなどから、その用途として、自動車用電源、携帯機器用電源等に用いられることが期待されている。
【０００３】
燃料電池として代表的なものに、燐酸型燃料電池（ＰＡＦＣ）、溶融炭酸塩型燃料電池（ＭＣＦＣ）、固体酸化物型燃料電池（ＳＯＦＣ）、及び固体高分子型燃料電池（ＰＥＦＣ）等がある。
【０００４】
しかしながら、このような燃料電池は、解決すべき多くの問題点を有している。例えば、高い電気エネルギを得るために激しい反応条件（例えば、高温、強酸性溶液又は強アルカリ性溶液）を必要とすることである。また、ほとんどの燃料電池において、電極に使用される触媒は白金等の金属触媒であるが、これらは高価で利用に限界がある。さらに、白金等の金属触媒は比較的低い一酸化炭素濃度でも不活性化されるにもかかわらず、純水素以外の燃料を使用した場合には、一酸化炭素が容易に反応生成物として発生することである。
【０００５】
このような問題点を解決すると期待されている燃料電池に、酵素を触媒として利用する燃料電池（酵素燃料電池）がある。酵素燃料電池は、白金等の金属触媒の代わりに酵素を触媒として使用し、アルコール、グルコース等を燃料に用いるものである。酵素を触媒として用いる酵素燃料電池は、生理的環境の室温、中性、大気圧という温和な条件下で作動（発電）できるという特徴を持っている。
【０００６】
このとき、触媒として用いられる酵素は、通常固体電極と直接電子の授受を行うことが困難であるため、酵素−電極材間の電子の受け渡しを行う電子伝達物質（メディエータ）が用いられる場合が多い。
【０００７】
従来、メディエータは、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ベンジルビオロゲン、メルドラブルー、メチレンブルー、メチルビオロゲン等の人工合成のメディエータ（例えば、特許文献１、非特許文献１）が用いられていた。
【０００８】
人工合成のメディエータは、酵素反応によって生じた電子を効率的に電極材に伝達させることができるため、酵素燃料電池のエネルギ変換効率を増加させるが、毒性を持つものが多く、使用量又は使用後の処理において注意を払わないと環境又は生体に不利な影響等を与えてしまう場合があるという問題点を有している。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−３１０６１３号公報
【非特許文献１】カズ（Ｋａｔｚ）ら、ハンドブック オブ フューエルセルズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｕｅｌ Ｃｅｌｌｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ ２００３年、２１章（Ｃｈａｐｔｅｒ２１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、環境又は生体に不利な影響等を与えないメディエータを使用する燃料電池を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アノード極及びカソード極を有する燃料電池であって、少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。
【００１２】
また、前記燃料電池において、前記電子伝達可能な生体由来のタンパク質が、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５５１、及びアズリンのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００１３】
また、前記燃料電池において、前記酵素が、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る燃料電池では、メディエータとして電子伝達可能な生体由来のタンパク質を用いることによって、環境又は生体に不利な影響等を与えないメディエータを使用する燃料電池を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施の形態について以下説明する。
【００１６】
図１は、本発明の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。図１に示すように、酵素燃料電池１は、アノード極室６と、カソード極室８と、アノード極１０と、カソード極１２と、電解質膜１４とにより構成される。アノード極室６には燃料が充填され、カソード極室８には、酸素が充填されている。
【００１７】
アノード極１０は、電極材１６と、酵素及びメディエータを含む酸化材１８とを有し、燃料が充填されたアノード極室６に設けられている。 一方、カソード極１２は、電極材１６と、還元材２２とを有し、酸素が充填されたカソード極室８に設けられている。
【００１８】
酸化材１８内のメディエータは、酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを行う電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。電子伝達可能な生体由来のタンパク質とは、生体（微生物〜人間までのあらゆる生き物）から得られる鉄、銅等を含む金属含有タンパク質であり、例えば、ヘモグロビン（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、フェレドキシン（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、シトクロム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｃ５１１、シトクロムＰ４５０、アズリン（Ａｚｕｒｉｎ）、プラストシアニン（Ｐｌａｓｔｏｃｙａｎｉｎ）、シトクロムａ，ａ１，ａ３，ｂ，ｂ２，ｂ３，ｂ５，ｂ６，ｂ５５５，ｂ５５９，ｂ５６２，ｂ５６３，ｂ５６５，ｂ５６６，ｃ，ｃ１，ｃ２，ｃ３，ｄ，ｅ，ｆ，ｏ，Ｐ−４５０、ヘモシアニン（Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）等が挙げられる。コスト、取り扱い、及び酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを効率的に行うことが可能な点において、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、アズリンであることが好ましい。特にコストの点では、食肉牛の処理過程等で、大量に取得可能なヘモグロビンが好ましい。また、特に酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを効率的に行うことが可能な点では、後述する電極材１６及び酸化材１８内の酵素の種類により多少の影響は受けるがフェレドキシンが好ましい。
【００１９】
電子伝達可能な生体由来のタンパク質の具体例として、ウシ由来のヘモグロビン（ナカライテクス社製）、クロストリジウム由来のフェレドキシン（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のシトクロムＣ５５１（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のアズリン（ＳＩＧＭＡ社製）等が挙げられる。
【００２０】
酸化材１８内の酵素は、アノード極室６に充填される燃料（アノード極１０に供給される燃料）の酸化反応に関与するものであり、下記に例示する燃料に応じて選択されることが好ましい。例えば、メタノールを燃料とする場合、メタノールからホルムアルデヒドへ酸化するアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。また、例えば、グルコースを燃料とする場合、グルコースからグルコノラクトンへ酸化するグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２１】
上記酵素は、ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼ又はＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼであることが好ましい。ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が用いられ、ＮＡＤ＋の存在下において燃料の酸化反応が進行する。一方、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼは、生体由来の酵素であり、ＮＡＤ＋の補酵素の非存在下でも燃料の酸化反応が進行する。本実施形態では、酸化材１８内のメディエータとして好ましいヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、アズリンとの構造上の相性の点から、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼが好ましい。
【００２２】
また、ＰＱＱ型デヒドロゲナーゼの具体例として、アセトバクターパステウリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、メチロバクテリウムエクストルケヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒ ｑｕｅｎｓ）、パラコッカスデニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、コマモナステストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ＮＢＲＣ １２０４８）由来のＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトバクターカルコアセチクス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、大腸菌由来のＰＱＱ型グルコースデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。ＰＱＱ型デヒドロゲナーゼのうちコマモナステストステロニ（ＮＢＲＣ １２０４８）由来のＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼは、特にヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロム、アズリンとの構造上の相性がよく、燃料の酸化反応を促進させる。
【００２３】
また、 酸化材１８内の酵素のその他の例として、糖代謝に関与する酵素 （例えばヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、マロン酸デヒドロゲナーゼ等）等を用いることができる。
【００２４】
アノード極室６に充填する燃料（アノード極１０に供給する燃料）は、例えば、メタノール等のアルコール類、グルコース等の糖類、脂肪類、タンパク質、糖代謝の中間生成物の有機酸（グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、トリオースリン酸イソメラーゼ、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、２−オキソグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、オキサロ酢酸等）、これらの混合物等が用いられる。
【００２５】
電極材１６は、電極材１６中に酵素及びメディエータを含む酸化材１８をより多く浸漬又は固定化させることができる点において、多孔質材料であることが好ましい。例えば、カーボンフェルト、カーボンペーパ、活性炭等が挙げられる。
【００２６】
アノード極１０は、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化材１８をポリマー又は架橋剤により電極材１６に固定化させ作製される。また、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化材１８を緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材１６に浸漬させ作製される。
【００２７】
酸化材１８を電極材１６に固定化させるために用いられるポリマーとしては、ポリビニルイミダゾール、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリピロール、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンと無水マレイン酸のグラフト共重合体、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、オルソクレゾールノボラック型エポキシ樹脂などが用いられる。また、酸化材１８を電極材１６に固定化させるために用いられる架橋剤としては、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、スベリン酸ジスクシミジル、スクシミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等が用いられる。
【００２８】
緩衝溶液としては、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝溶液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が使用する酵素の至適ｐＨ及び使用目的に応じて用いられる。
【００２９】
次にカソード極１２について説明する。カソード極１２を構成する還元材２２は、電極触媒として白金等の金属触媒が担持された炭素粉末、又は酸素還元酵素及びメディエータにより構成されているものを使用することができる。
【００３０】
還元材２２が、酸素還元酵素及びメディエータにより構成されている場合、酸素還元酵素としては、ビリルビンオキシターゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。また、メディエータとしては、上記説明したものと同様のものを用いることができる。
【００３１】
還元材２２が、金属触媒が担持された炭素粉末により構成されている場合、金属触媒として、例えば、白金、鉄、ニッケル、コバルト、ルテニウム等が用いられる。また、炭素粉末として、例えば、アセチレンブラック、ファーネスブラック、チャンネルブラック、サーマルブラック等のカーボンブラック等が用いられる。
【００３２】
カソード極室８に充填させる酸素（カソード極１２に供給される酸素）は、酸素が溶存した緩衝液等の溶液を用いることができる。また、フェリシアン化カリウム等の犠牲試薬を添加した緩衝液（酸素が含まれている）等を用いることができる。また、カソード極１２を構成する還元材２２が、白金等の金属触媒を担持した炭素粉末であれば、酸素ガスを用いることができる。
【００３３】
酸素還元酵素及びメディエータを還元材２２として用いる場合、カソード極１２は、上記同様に酸素還元酵素及びメディエータをポリマー及び架橋剤により電極材１６に固定化させ作製される。また例えば、酸素還元酵素及びメディエータを緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材１６に浸漬させ作製される。ポリマー、架橋剤、緩衝溶液は、上記と同様のものを使用することができる。
【００３４】
一方、金属触媒が担持された炭素粉末を用いる場合、カソード極１２は、金属触媒が担持された炭素粉末を下記電解質膜と同様の電解質（例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の電解質）により電極材１６に固定化させ作製される。
【００３５】
電解質膜１４は、電子伝導性を持たずプロトン伝導性を有するものであれば特に制限されるものではない。例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜等が挙げられる。具体的にはナフィオン（登録商標）が用いられる。
【００３６】
以上のように構成された本実施形態に係る酵素燃料電池１の発電反応について以下説明する。図２は、本実施形態に係る酵素燃料電池の発電反応を示す模式断面図である。図２に示すようにアノード極室６に充填する燃料（アノード極１０に供給する燃料）をメタノールとし、酸化材内の酵素をＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）とする場合を例として説明する。
【００３７】
アノード極室６にメタノール及びカソード極室８に酸素を充填すると、アノード極１０及びカソード極１２での酸化還元反応は、下式（１），（２）によって表される。
【００３８】
ＡＤＨ
アノード極：ＣＨ３ＯＨ → ＨＣＨＯ＋２Ｈ＋＋２ｅ− （１）
カソード極：２Ｈ＋＋１／２Ｏ２＋２ｅ− → Ｈ２Ｏ （２）
【００３９】
図２及び上式（１）に示すように、アノード極１０では、メタノールがＡＤＨによってホルムアルデヒドと水素イオンと電子とにする反応が行われる。電子は、メディエータによって電極材に運ばれ、さらに外部回路を通じてカソード極１２に運ばれる。水素イオンは、電解質膜を介して、カソード極１２に移動する。一方、図２及び上式（２）に示すように、カソード極１２では、水素イオン、電子、酸素が反応して水を生成する反応が行われる。上記これらの反応によって、外部回路にエネルギを放出する。
【００４０】
次に、本発明の他の実施形態について説明する。
【００４１】
図３は、本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。図３に示すように、酵素燃料電池２は、アノード極１０と、カソード極１２と、電解質膜１４と、セパレータ２４とにより構成される。なお、図１に示した酵素燃料電池１と共通するものについては同一の符号を付している。
【００４２】
酵素燃料電池２は、カソード極１２に酸素ガスを供給・排出（アノード極１０に上記燃料を供給・排出）することができるものである。酸素の拡散は、溶液中よりも気相中の方が大きいため、酸素の反応効率を高くするためには、酸素ガスであることが好ましい。但し、酸素ガスに限られるものではなく、酸素が溶存した溶液であってもよい。
【００４３】
アノード極１０は、電極材１６と、酸化材１８とを有するものである。酸化材１８は、上記説明した酵素及びメディエータを含むものである。一方、カソード極１２は、電極材１６と、上記説明した酸素還元酵素及びメディエータ、又は金属触媒が担持された炭素粉末を含む還元材２２とを有するものである。
【００４４】
セパレータ２４は、櫛型状の金属板又は焼成カーボン等のカーボン系材料等を使用することができる。櫛型状のセパレータ２４の空洞部は、アノード極１０及びカソード極１２に上記述べた燃料及び酸素ガスを供給・排出するための燃料供給排出路２８及び酸素供給排出路３０となっている。
【００４５】
以上のように構成された本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池２を燃料電池セルとして複数層積層し、燃料電池積層体としても使用可能である。
【００４６】
上記これらの実施形態に係る酵素燃料電池は、例えば、携帯電話、ノートパソコン等のモバイル機器用小型電源、自動車用電源、家庭用電源、ペースメーカ等の生体埋め込み式チップ用マイクロ電源等として用いることができる。
【００４７】
メディエータに電子伝達可能な生体由来のタンパク質を用いることにより、生体に及ぼす不利な影響等を与えないメディエータを使用する酵素燃料電池を提供することが可能であるため、特に、ペースメーカ等の生体埋め込み式チップ用マイクロ電源として好適である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び比較例を挙げ、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
＜ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼの調製＞
コマモナステストステロニ（ＮＢＲＣ １２０４８）株を下記組成の培地１０ｍｌに植菌し、振とう培養機ＴＸＹ−１６Ｒ−３Ｆ（高崎科学器械社製）を用いて培養（培養条件：３０℃、１２０ｒｐｍ、２４〜７２時間）した。培養後の培養液１．５ｍｌを下記組成の培地１００ｍｌに加え、さらに振とう培養機ＴＸＹ−１６Ｒ−３Ｆ（高崎科学器械社製）を用いて培養（培養条件：３０℃、１１０ｒｐｍ、７２時間）することによって、１Ｌの培養液を得た。
【００５０】
（培地組成）
Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １５．４ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ４．５２ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ
ＣａＣｌ・２Ｈ２Ｏ １７．１ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １５ｍｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １００ｍｇ／１Ｌ
また、上記培養直前に、１−Ｂｕｔａｎｏｌ（ナカライテスク社製）を０．３％及びＰＱＱ（Ｍｅｔｈｏｘａｔｉｎ、ＳＩＧＭＡ社製）を１μＭとなるように添加した。
【００５１】
次に、上記培養液を遠心処理（遠心処理条件：４℃以下、５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体（湿菌体重量３ｇ）を回収した。得られた菌体は、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、再度、遠心処理（遠心処理条件：４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、洗浄した。
【００５２】
続いて、菌体の湿重量を測定し、菌体の湿重量０．１ｇに対して、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び１ｇのガラスビーズ（０．１ｍｍφ、安井器械社製）を添加し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて、菌体の破砕（破砕条件：０℃、２５００ｒｐｍ、２分間、３サイクル）を行った。
【００５３】
破砕後、菌体を遠心処理（遠心処理条件：４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清液を４０ｍｌの容器へ移し、上清液をさらに遠心処理（遠心処理条件：４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）し、厚さ０．４５μｍのフィルタによりろ過し、無細胞抽出液（アルコールデヒドロゲナーゼ含有）のろ液を得た。
【００５４】
得られた無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ試薬（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用い、試薬に添付のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を標準タンパク質として、以下のように測定した。得られた無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、５．７ｍｇ／ｍｌであった。
【００５５】
＜無細胞抽出液中の蛋白質濃度測定＞
０．１３１，０．２６２，０．３９３，０．５２４，０．６５５，０．７８６，０．９８３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製したＢＳＡ溶液２０μｌを、純水で５倍希釈した染色試薬１ｍｌに添加し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、分光光度計ＤＵ７４００（ベックマン社製）で、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。測定後、添加したＢＳＡ濃度と波長５９５ｎｍの吸光度の相関を求め、これを検量線とした。次に、ＭＯＰＳ緩衝液で１０倍希釈した無細胞抽出液２０μＬを上記同様に、純水で５倍希釈した染色試薬１ｍｌに添加し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、分光光度計ＤＵ７４００（ベックマン社製）で、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度と先に求めた検量線から、無細胞抽出液の蛋白質濃度を定量した。
【００５６】
次に、ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてアルコールデヒドロゲナーゼの精製を以下の手順で行った（ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラムによるアルコールデヒドロゲナーゼの精製の詳細については、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５，６９０−６９８（１９９６）を参照）。まず、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラム５ｍｌに、上記調製した無細胞抽出液を２７ｍｌ添加し、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄後、０．１Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配によってアルコールデヒドロゲナーゼを溶出させた。得られたアルコールデヒドロゲナーゼは、濃度４μＭのＰＰＱ及び５ｍＭのＣａＣｌ２を添加した１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、２５℃〜３０℃で３０分以上静置させた。これをＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（コマモナステストステロニ由来）とした。ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼは、０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度のものが３．５ｍｌ得られた。
【００５７】
＜酵素燃料電池の作製＞
（実施例１）
図４は、実施例において使用した試験用酵素燃料電池の構成を示す模式斜視図である。図４に示すように、電解質膜１４としてＮａｆｉｏｎ１１７（登録商標、Ａｌｄｒｉｃｈ社製、寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ０．２ｍｍ）の両側にアノード極１０及びカソード極１２を設けたシリコンラバー３８、さらにその両側に白金線３６を付けた集電用ステンレス板３２（寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）及び絶縁材としてのアクリル板３４（寸法：１辺５０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を挟み、試験用酵素燃料電池３を作製した。集電用ステンレス板３２は、外部回路とアノード極１０又はカソード極１２とを電気的に接続させるためのものである。
【００５８】
図５は、実施例において使用したアノード極１０（又はカソード極１２）を設けたシリコンラバー３８を示す模式斜視図である。図５に示すように、アノード極１０（又はカソード極１２）をシリコンラバー３８（寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）の空孔部４０（寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に設けた。アノード極１０は、電極材としてのグラファイトフェルト（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製、寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に上記精製したアルコールデヒドロゲナーゼ（５０μｇ／ｍｌ）及びメディエータとしてウシ由来のヘモグロビン（１００μｇ／ｍｌ）（ナカライテクス社製）を浸漬させたものを使用した。一方、カソード極１２は、グラファイトフェルト（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製、寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に５０ｍＭのフェリシアン化カリウムを浸漬させたものを使用した。図４，５に示すように作製した試験用酵素燃料電池を実施例１とした。
【００５９】
（実施例２〜４）
メディエータとしてクロストリジウム由来のフェレドキシ（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のシトクロムＣ５５１（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のアズリン（ＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ用い、実施例１と同様に作製した試験用酵素燃料電池をそれぞれ実施例２，３，４とした。
【００６０】
（比較例１〜３）
グラファイトフェルトのみ（上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ及びメディエータを浸漬していない）の燃料極、グラファイトフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼを浸漬した燃料極、グラファイトフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ及びメディエータの代わりに生体由来であるが電子伝達性のないＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を浸漬した燃料極を用い、実施例１と同様に作製した試験用酵素燃料電池をそれぞれ比較例１，２，３とした。
【００６１】
下記表１に実施例１〜４及び比較例１〜３の上記アルコールデヒドロゲナーゼとメディエータの組成を示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
＜エタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３の電流値測定＞
図４に示す実施例１のアノード極１０に１００ｍＭのエタノールを２０μｌ供給した後、アノード極１０とカソード極１２とを２００オームの外部負荷を介して連結し、１０分後、Ａｇｉｌｅｎｔ ３４９７０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて実施例１の電流値を測定した。実施例２〜４及び比較例１〜３の電流値も同様に測定した。また比較例１は、エタノールを供給しない場合の電流値も同様に測定した。図６にエタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３（比較例１はエタノールを供給しない場合も含む）の電流値の結果を示す。
【００６４】
＜ブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の測定＞
ブタノールを燃料としてアノード極に供給する以外は、上記エタノールを燃料として供給した場合と同様に、実施例１〜４の電流値を測定した。図７にブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の結果を示す。
【００６５】
実施例１〜４、及び比較例２，３で使用した上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（コマモナステストステロニ由来）は、ＰＱＱを補因子とし、Ｃ末端にシトクロムＣドメインを有すると報告されている（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１，１８５−１９８（１９９８）参照）。図６に示すように、比較例２は、カーボンフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼのみを浸漬させたアノード極を使用したものであるが、電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用しなくても、シトクロムＣドメインを経由して電極材に電子伝達させたことによると考えられる電流発生を観測した。しかし、上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼと電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用した実施例１〜４は、電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用していない比較例１〜３より高い電流値を示した。実施例１〜４の電流値の向上は、メディエータとして使用したヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、及びアズリンが、金属含有タンパク質であるため（比較例３のメディエータ（ＢＳＡ）は、金属含有タンパク質ではない）、上記アルコールデヒドロゲナーゼから電極材への電子伝達が良好となることによるものである。さらに、実施例１〜４の生体由来の電子伝達メディエータのうち、フェレドキシンを用いた実施例２が、最も高い電流値を示した。
【００６６】
図７に示すように、ブタノールを燃料として供給することにより、エタノールを燃料として供給する場合より（図６）、実施例１〜４それぞれの電流値を向上させた。これは、コマモナステストステロニ由来のアルコールデヒドロゲナーゼの基質（燃料）特異性によるものである。
【００６７】
このように、電子伝達可能な生体由来のメディエータを用いることによって、生体に不利な影響を与えることなく、電流値を向上させる酵素燃料電池の提供が可能となった。また、コマモナステストステロニ由来のアルコールデヒドロゲナーゼを酵素として用いた場合、電子伝達可能な生体由来の電子伝達メディエータの中では、フェレドキシを用い、燃料としてブタノールを供給することにより、電流値を向上させることができた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。
【図２】本実施形態に係る酵素燃料電池の発電反応を示す模式断面図である。
【図３】本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。
【図４】実施例において使用した試験用酵素燃料電池の構成を示す模式斜視図である。
【図５】実施例において使用したアノード極１０（又はカソード極１２）を設けたシリコンラバー３８を示す模式斜視図である。
【図６】エタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３（比較例１はエタノールを供給しない場合も含む）の電流値の結果を示す図である。
【図７】ブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６９】
１，２ 酵素燃料電池、３ 試験用酵素燃料電池、６ アノード極室、８ カソード極室、１０ アノード極、１２ カソード極、１４ 電解質膜、１６ 電極材、１８ 酸化材、２２ 還元材、２４ セパレータ、２８ 燃料供給排出路、３０ 酸素供給排出路、３２ 集電用ステンレス板、３４ アクリル板、３６ 白金線、３８ シリコンラバー、４０ 空孔部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を触媒として利用する燃料電池（以下、「酵素燃料電池」と呼ぶ場合がある）の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料電池は、燃料のエネルギを直接電力に変換する装置であり、クリーンでエネルギ変換効率が高く、石油代替燃料の使用が可能であることなどから、その用途として、自動車用電源、携帯機器用電源等に用いられることが期待されている。
【０００３】
燃料電池として代表的なものに、燐酸型燃料電池（ＰＡＦＣ）、溶融炭酸塩型燃料電池（ＭＣＦＣ）、固体酸化物型燃料電池（ＳＯＦＣ）、及び固体高分子型燃料電池（ＰＥＦＣ）等がある。
【０００４】
しかしながら、このような燃料電池は、解決すべき多くの問題点を有している。例えば、高い電気エネルギを得るために激しい反応条件（例えば、高温、強酸性溶液又は強アルカリ性溶液）を必要とすることである。また、ほとんどの燃料電池において、電極に使用される触媒は白金等の金属触媒であるが、これらは高価で利用に限界がある。さらに、白金等の金属触媒は比較的低い一酸化炭素濃度でも不活性化されるにもかかわらず、純水素以外の燃料を使用した場合には、一酸化炭素が容易に反応生成物として発生することである。
【０００５】
このような問題点を解決すると期待されている燃料電池に、酵素を触媒として利用する燃料電池（酵素燃料電池）がある。酵素燃料電池は、白金等の金属触媒の代わりに酵素を触媒として使用し、アルコール、グルコース等を燃料に用いるものである。酵素を触媒として用いる酵素燃料電池は、生理的環境の室温、中性、大気圧という温和な条件下で作動（発電）できるという特徴を持っている。
【０００６】
このとき、触媒として用いられる酵素は、通常固体電極と直接電子の授受を行うことが困難であるため、酵素−電極材間の電子の受け渡しを行う電子伝達物質（メディエータ）が用いられる場合が多い。
【０００７】
従来、メディエータは、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ベンジルビオロゲン、メルドラブルー、メチレンブルー、メチルビオロゲン等の人工合成のメディエータ（例えば、特許文献１、非特許文献１）が用いられていた。
【０００８】
人工合成のメディエータは、酵素反応によって生じた電子を効率的に電極材に伝達させることができるため、酵素燃料電池のエネルギ変換効率を増加させるが、毒性を持つものが多く、使用量又は使用後の処理において注意を払わないと環境又は生体に不利な影響等を与えてしまう場合があるという問題点を有している。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−３１０６１３号公報
【非特許文献１】カズ（Ｋａｔｚ）ら、ハンドブック オブ フューエルセルズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｕｅｌ Ｃｅｌｌｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ ２００３年、２１章（Ｃｈａｐｔｅｒ２１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、環境又は生体に不利な影響等を与えないメディエータを使用する燃料電池を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アノード極及びカソード極を有する燃料電池であって、少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。
【００１２】
また、前記燃料電池において、前記電子伝達可能な生体由来のタンパク質が、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５５１、及びアズリンのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００１３】
また、前記燃料電池において、前記酵素が、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る燃料電池では、メディエータとして電子伝達可能な生体由来のタンパク質を用いることによって、環境又は生体に不利な影響等を与えないメディエータを使用する燃料電池を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施の形態について以下説明する。
【００１６】
図１は、本発明の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。図１に示すように、酵素燃料電池１は、アノード極室６と、カソード極室８と、アノード極１０と、カソード極１２と、電解質膜１４とにより構成される。アノード極室６には燃料が充填され、カソード極室８には、酸素が充填されている。
【００１７】
アノード極１０は、電極材１６と、酵素及びメディエータを含む酸化材１８とを有し、燃料が充填されたアノード極室６に設けられている。 一方、カソード極１２は、電極材１６と、還元材２２とを有し、酸素が充填されたカソード極室８に設けられている。
【００１８】
酸化材１８内のメディエータは、酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを行う電子伝達可能な生体由来のタンパク質である。電子伝達可能な生体由来のタンパク質とは、生体（微生物〜人間までのあらゆる生き物）から得られる鉄、銅等を含む金属含有タンパク質であり、例えば、ヘモグロビン（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、フェレドキシン（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、シトクロム（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｃ５１１、シトクロムＰ４５０、アズリン（Ａｚｕｒｉｎ）、プラストシアニン（Ｐｌａｓｔｏｃｙａｎｉｎ）、シトクロムａ，ａ１，ａ３，ｂ，ｂ２，ｂ３，ｂ５，ｂ６，ｂ５５５，ｂ５５９，ｂ５６２，ｂ５６３，ｂ５６５，ｂ５６６，ｃ，ｃ１，ｃ２，ｃ３，ｄ，ｅ，ｆ，ｏ，Ｐ−４５０、ヘモシアニン（Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）等が挙げられる。コスト、取り扱い、及び酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを効率的に行うことが可能な点において、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、アズリンであることが好ましい。特にコストの点では、食肉牛の処理過程等で、大量に取得可能なヘモグロビンが好ましい。また、特に酸化材１８内の酵素−電極材１６間の電子の受け渡しを効率的に行うことが可能な点では、後述する電極材１６及び酸化材１８内の酵素の種類により多少の影響は受けるがフェレドキシンが好ましい。
【００１９】
電子伝達可能な生体由来のタンパク質の具体例として、ウシ由来のヘモグロビン（ナカライテクス社製）、クロストリジウム由来のフェレドキシン（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のシトクロムＣ５５１（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のアズリン（ＳＩＧＭＡ社製）等が挙げられる。
【００２０】
酸化材１８内の酵素は、アノード極室６に充填される燃料（アノード極１０に供給される燃料）の酸化反応に関与するものであり、下記に例示する燃料に応じて選択されることが好ましい。例えば、メタノールを燃料とする場合、メタノールからホルムアルデヒドへ酸化するアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。また、例えば、グルコースを燃料とする場合、グルコースからグルコノラクトンへ酸化するグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２１】
上記酵素は、ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼ又はＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼであることが好ましい。ＮＡＤ＋依存型デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が用いられ、ＮＡＤ＋の存在下において燃料の酸化反応が進行する。一方、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼは、生体由来の酵素であり、ＮＡＤ＋の補酵素の非存在下でも燃料の酸化反応が進行する。本実施形態では、酸化材１８内のメディエータとして好ましいヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、アズリンとの構造上の相性の点から、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼが好ましい。
【００２２】
また、ＰＱＱ型デヒドロゲナーゼの具体例として、アセトバクターパステウリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、メチロバクテリウムエクストルケヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒ ｑｕｅｎｓ）、パラコッカスデニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、コマモナステストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ＮＢＲＣ １２０４８）由来のＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトバクターカルコアセチクス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、大腸菌由来のＰＱＱ型グルコースデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。ＰＱＱ型デヒドロゲナーゼのうちコマモナステストステロニ（ＮＢＲＣ １２０４８）由来のＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼは、特にヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロム、アズリンとの構造上の相性がよく、燃料の酸化反応を促進させる。
【００２３】
また、 酸化材１８内の酵素のその他の例として、糖代謝に関与する酵素 （例えばヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、マロン酸デヒドロゲナーゼ等）等を用いることができる。
【００２４】
アノード極室６に充填する燃料（アノード極１０に供給する燃料）は、例えば、メタノール等のアルコール類、グルコース等の糖類、脂肪類、タンパク質、糖代謝の中間生成物の有機酸（グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、トリオースリン酸イソメラーゼ、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、２−オキソグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、オキサロ酢酸等）、これらの混合物等が用いられる。
【００２５】
電極材１６は、電極材１６中に酵素及びメディエータを含む酸化材１８をより多く浸漬又は固定化させることができる点において、多孔質材料であることが好ましい。例えば、カーボンフェルト、カーボンペーパ、活性炭等が挙げられる。
【００２６】
アノード極１０は、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化材１８をポリマー又は架橋剤により電極材１６に固定化させ作製される。また、例えば、酵素及びメディエータを含む酸化材１８を緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材１６に浸漬させ作製される。
【００２７】
酸化材１８を電極材１６に固定化させるために用いられるポリマーとしては、ポリビニルイミダゾール、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリピロール、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンと無水マレイン酸のグラフト共重合体、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、オルソクレゾールノボラック型エポキシ樹脂などが用いられる。また、酸化材１８を電極材１６に固定化させるために用いられる架橋剤としては、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、スベリン酸ジスクシミジル、スクシミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等が用いられる。
【００２８】
緩衝溶液としては、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝溶液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が使用する酵素の至適ｐＨ及び使用目的に応じて用いられる。
【００２９】
次にカソード極１２について説明する。カソード極１２を構成する還元材２２は、電極触媒として白金等の金属触媒が担持された炭素粉末、又は酸素還元酵素及びメディエータにより構成されているものを使用することができる。
【００３０】
還元材２２が、酸素還元酵素及びメディエータにより構成されている場合、酸素還元酵素としては、ビリルビンオキシターゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。また、メディエータとしては、上記説明したものと同様のものを用いることができる。
【００３１】
還元材２２が、金属触媒が担持された炭素粉末により構成されている場合、金属触媒として、例えば、白金、鉄、ニッケル、コバルト、ルテニウム等が用いられる。また、炭素粉末として、例えば、アセチレンブラック、ファーネスブラック、チャンネルブラック、サーマルブラック等のカーボンブラック等が用いられる。
【００３２】
カソード極室８に充填させる酸素（カソード極１２に供給される酸素）は、酸素が溶存した緩衝液等の溶液を用いることができる。また、フェリシアン化カリウム等の犠牲試薬を添加した緩衝液（酸素が含まれている）等を用いることができる。また、カソード極１２を構成する還元材２２が、白金等の金属触媒を担持した炭素粉末であれば、酸素ガスを用いることができる。
【００３３】
酸素還元酵素及びメディエータを還元材２２として用いる場合、カソード極１２は、上記同様に酸素還元酵素及びメディエータをポリマー及び架橋剤により電極材１６に固定化させ作製される。また例えば、酸素還元酵素及びメディエータを緩衝溶液に溶解させ、その溶解液を電極材１６に浸漬させ作製される。ポリマー、架橋剤、緩衝溶液は、上記と同様のものを使用することができる。
【００３４】
一方、金属触媒が担持された炭素粉末を用いる場合、カソード極１２は、金属触媒が担持された炭素粉末を下記電解質膜と同様の電解質（例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の電解質）により電極材１６に固定化させ作製される。
【００３５】
電解質膜１４は、電子伝導性を持たずプロトン伝導性を有するものであれば特に制限されるものではない。例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜等が挙げられる。具体的にはナフィオン（登録商標）が用いられる。
【００３６】
以上のように構成された本実施形態に係る酵素燃料電池１の発電反応について以下説明する。図２は、本実施形態に係る酵素燃料電池の発電反応を示す模式断面図である。図２に示すようにアノード極室６に充填する燃料（アノード極１０に供給する燃料）をメタノールとし、酸化材内の酵素をＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）とする場合を例として説明する。
【００３７】
アノード極室６にメタノール及びカソード極室８に酸素を充填すると、アノード極１０及びカソード極１２での酸化還元反応は、下式（１），（２）によって表される。
【００３８】
ＡＤＨ
アノード極：ＣＨ３ＯＨ → ＨＣＨＯ＋２Ｈ＋＋２ｅ− （１）
カソード極：２Ｈ＋＋１／２Ｏ２＋２ｅ− → Ｈ２Ｏ （２）
【００３９】
図２及び上式（１）に示すように、アノード極１０では、メタノールがＡＤＨによってホルムアルデヒドと水素イオンと電子とにする反応が行われる。電子は、メディエータによって電極材に運ばれ、さらに外部回路を通じてカソード極１２に運ばれる。水素イオンは、電解質膜を介して、カソード極１２に移動する。一方、図２及び上式（２）に示すように、カソード極１２では、水素イオン、電子、酸素が反応して水を生成する反応が行われる。上記これらの反応によって、外部回路にエネルギを放出する。
【００４０】
次に、本発明の他の実施形態について説明する。
【００４１】
図３は、本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。図３に示すように、酵素燃料電池２は、アノード極１０と、カソード極１２と、電解質膜１４と、セパレータ２４とにより構成される。なお、図１に示した酵素燃料電池１と共通するものについては同一の符号を付している。
【００４２】
酵素燃料電池２は、カソード極１２に酸素ガスを供給・排出（アノード極１０に上記燃料を供給・排出）することができるものである。酸素の拡散は、溶液中よりも気相中の方が大きいため、酸素の反応効率を高くするためには、酸素ガスであることが好ましい。但し、酸素ガスに限られるものではなく、酸素が溶存した溶液であってもよい。
【００４３】
アノード極１０は、電極材１６と、酸化材１８とを有するものである。酸化材１８は、上記説明した酵素及びメディエータを含むものである。一方、カソード極１２は、電極材１６と、上記説明した酸素還元酵素及びメディエータ、又は金属触媒が担持された炭素粉末を含む還元材２２とを有するものである。
【００４４】
セパレータ２４は、櫛型状の金属板又は焼成カーボン等のカーボン系材料等を使用することができる。櫛型状のセパレータ２４の空洞部は、アノード極１０及びカソード極１２に上記述べた燃料及び酸素ガスを供給・排出するための燃料供給排出路２８及び酸素供給排出路３０となっている。
【００４５】
以上のように構成された本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池２を燃料電池セルとして複数層積層し、燃料電池積層体としても使用可能である。
【００４６】
上記これらの実施形態に係る酵素燃料電池は、例えば、携帯電話、ノートパソコン等のモバイル機器用小型電源、自動車用電源、家庭用電源、ペースメーカ等の生体埋め込み式チップ用マイクロ電源等として用いることができる。
【００４７】
メディエータに電子伝達可能な生体由来のタンパク質を用いることにより、生体に及ぼす不利な影響等を与えないメディエータを使用する酵素燃料電池を提供することが可能であるため、特に、ペースメーカ等の生体埋め込み式チップ用マイクロ電源として好適である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び比較例を挙げ、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
＜ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼの調製＞
コマモナステストステロニ（ＮＢＲＣ １２０４８）株を下記組成の培地１０ｍｌに植菌し、振とう培養機ＴＸＹ−１６Ｒ−３Ｆ（高崎科学器械社製）を用いて培養（培養条件：３０℃、１２０ｒｐｍ、２４〜７２時間）した。培養後の培養液１．５ｍｌを下記組成の培地１００ｍｌに加え、さらに振とう培養機ＴＸＹ−１６Ｒ−３Ｆ（高崎科学器械社製）を用いて培養（培養条件：３０℃、１１０ｒｐｍ、７２時間）することによって、１Ｌの培養液を得た。
【００５０】
（培地組成）
Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １５．４ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ４．５２ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ
ＣａＣｌ・２Ｈ２Ｏ １７．１ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １５ｍｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １００ｍｇ／１Ｌ
また、上記培養直前に、１−Ｂｕｔａｎｏｌ（ナカライテスク社製）を０．３％及びＰＱＱ（Ｍｅｔｈｏｘａｔｉｎ、ＳＩＧＭＡ社製）を１μＭとなるように添加した。
【００５１】
次に、上記培養液を遠心処理（遠心処理条件：４℃以下、５０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体（湿菌体重量３ｇ）を回収した。得られた菌体は、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、再度、遠心処理（遠心処理条件：４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、洗浄した。
【００５２】
続いて、菌体の湿重量を測定し、菌体の湿重量０．１ｇに対して、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び１ｇのガラスビーズ（０．１ｍｍφ、安井器械社製）を添加し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて、菌体の破砕（破砕条件：０℃、２５００ｒｐｍ、２分間、３サイクル）を行った。
【００５３】
破砕後、菌体を遠心処理（遠心処理条件：４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清液を４０ｍｌの容器へ移し、上清液をさらに遠心処理（遠心処理条件：４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）し、厚さ０．４５μｍのフィルタによりろ過し、無細胞抽出液（アルコールデヒドロゲナーゼ含有）のろ液を得た。
【００５４】
得られた無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ試薬（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用い、試薬に添付のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を標準タンパク質として、以下のように測定した。得られた無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、５．７ｍｇ／ｍｌであった。
【００５５】
＜無細胞抽出液中の蛋白質濃度測定＞
０．１３１，０．２６２，０．３９３，０．５２４，０．６５５，０．７８６，０．９８３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製したＢＳＡ溶液２０μｌを、純水で５倍希釈した染色試薬１ｍｌに添加し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、分光光度計ＤＵ７４００（ベックマン社製）で、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。測定後、添加したＢＳＡ濃度と波長５９５ｎｍの吸光度の相関を求め、これを検量線とした。次に、ＭＯＰＳ緩衝液で１０倍希釈した無細胞抽出液２０μＬを上記同様に、純水で５倍希釈した染色試薬１ｍｌに添加し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、分光光度計ＤＵ７４００（ベックマン社製）で、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度と先に求めた検量線から、無細胞抽出液の蛋白質濃度を定量した。
【００５６】
次に、ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてアルコールデヒドロゲナーゼの精製を以下の手順で行った（ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラムによるアルコールデヒドロゲナーゼの精製の詳細については、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５，６９０−６９８（１９９６）を参照）。まず、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラム５ｍｌに、上記調製した無細胞抽出液を２７ｍｌ添加し、１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄後、０．１Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配によってアルコールデヒドロゲナーゼを溶出させた。得られたアルコールデヒドロゲナーゼは、濃度４μＭのＰＰＱ及び５ｍＭのＣａＣｌ２を添加した１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、２５℃〜３０℃で３０分以上静置させた。これをＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（コマモナステストステロニ由来）とした。ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼは、０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度のものが３．５ｍｌ得られた。
【００５７】
＜酵素燃料電池の作製＞
（実施例１）
図４は、実施例において使用した試験用酵素燃料電池の構成を示す模式斜視図である。図４に示すように、電解質膜１４としてＮａｆｉｏｎ１１７（登録商標、Ａｌｄｒｉｃｈ社製、寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ０．２ｍｍ）の両側にアノード極１０及びカソード極１２を設けたシリコンラバー３８、さらにその両側に白金線３６を付けた集電用ステンレス板３２（寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）及び絶縁材としてのアクリル板３４（寸法：１辺５０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を挟み、試験用酵素燃料電池３を作製した。集電用ステンレス板３２は、外部回路とアノード極１０又はカソード極１２とを電気的に接続させるためのものである。
【００５８】
図５は、実施例において使用したアノード極１０（又はカソード極１２）を設けたシリコンラバー３８を示す模式斜視図である。図５に示すように、アノード極１０（又はカソード極１２）をシリコンラバー３８（寸法：１辺２０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）の空孔部４０（寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に設けた。アノード極１０は、電極材としてのグラファイトフェルト（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製、寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に上記精製したアルコールデヒドロゲナーゼ（５０μｇ／ｍｌ）及びメディエータとしてウシ由来のヘモグロビン（１００μｇ／ｍｌ）（ナカライテクス社製）を浸漬させたものを使用した。一方、カソード極１２は、グラファイトフェルト（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製、寸法：１辺１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）に５０ｍＭのフェリシアン化カリウムを浸漬させたものを使用した。図４，５に示すように作製した試験用酵素燃料電池を実施例１とした。
【００５９】
（実施例２〜４）
メディエータとしてクロストリジウム由来のフェレドキシ（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のシトクロムＣ５５１（ＳＩＧＭＡ社製）、シュードモナス由来のアズリン（ＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ用い、実施例１と同様に作製した試験用酵素燃料電池をそれぞれ実施例２，３，４とした。
【００６０】
（比較例１〜３）
グラファイトフェルトのみ（上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ及びメディエータを浸漬していない）の燃料極、グラファイトフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼを浸漬した燃料極、グラファイトフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ及びメディエータの代わりに生体由来であるが電子伝達性のないＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を浸漬した燃料極を用い、実施例１と同様に作製した試験用酵素燃料電池をそれぞれ比較例１，２，３とした。
【００６１】
下記表１に実施例１〜４及び比較例１〜３の上記アルコールデヒドロゲナーゼとメディエータの組成を示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
＜エタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３の電流値測定＞
図４に示す実施例１のアノード極１０に１００ｍＭのエタノールを２０μｌ供給した後、アノード極１０とカソード極１２とを２００オームの外部負荷を介して連結し、１０分後、Ａｇｉｌｅｎｔ ３４９７０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて実施例１の電流値を測定した。実施例２〜４及び比較例１〜３の電流値も同様に測定した。また比較例１は、エタノールを供給しない場合の電流値も同様に測定した。図６にエタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３（比較例１はエタノールを供給しない場合も含む）の電流値の結果を示す。
【００６４】
＜ブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の測定＞
ブタノールを燃料としてアノード極に供給する以外は、上記エタノールを燃料として供給した場合と同様に、実施例１〜４の電流値を測定した。図７にブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の結果を示す。
【００６５】
実施例１〜４、及び比較例２，３で使用した上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼ（コマモナステストステロニ由来）は、ＰＱＱを補因子とし、Ｃ末端にシトクロムＣドメインを有すると報告されている（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１，１８５−１９８（１９９８）参照）。図６に示すように、比較例２は、カーボンフェルトに上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼのみを浸漬させたアノード極を使用したものであるが、電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用しなくても、シトクロムＣドメインを経由して電極材に電子伝達させたことによると考えられる電流発生を観測した。しかし、上記ＰＱＱ型アルコールデヒドロゲナーゼと電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用した実施例１〜４は、電子伝達可能な生体由来のメディエータを使用していない比較例１〜３より高い電流値を示した。実施例１〜４の電流値の向上は、メディエータとして使用したヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５１１、及びアズリンが、金属含有タンパク質であるため（比較例３のメディエータ（ＢＳＡ）は、金属含有タンパク質ではない）、上記アルコールデヒドロゲナーゼから電極材への電子伝達が良好となることによるものである。さらに、実施例１〜４の生体由来の電子伝達メディエータのうち、フェレドキシンを用いた実施例２が、最も高い電流値を示した。
【００６６】
図７に示すように、ブタノールを燃料として供給することにより、エタノールを燃料として供給する場合より（図６）、実施例１〜４それぞれの電流値を向上させた。これは、コマモナステストステロニ由来のアルコールデヒドロゲナーゼの基質（燃料）特異性によるものである。
【００６７】
このように、電子伝達可能な生体由来のメディエータを用いることによって、生体に不利な影響を与えることなく、電流値を向上させる酵素燃料電池の提供が可能となった。また、コマモナステストステロニ由来のアルコールデヒドロゲナーゼを酵素として用いた場合、電子伝達可能な生体由来の電子伝達メディエータの中では、フェレドキシを用い、燃料としてブタノールを供給することにより、電流値を向上させることができた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。
【図２】本実施形態に係る酵素燃料電池の発電反応を示す模式断面図である。
【図３】本発明の他の実施形態に係る酵素燃料電池の構成の一例を示す模式断面図である。
【図４】実施例において使用した試験用酵素燃料電池の構成を示す模式斜視図である。
【図５】実施例において使用したアノード極１０（又はカソード極１２）を設けたシリコンラバー３８を示す模式斜視図である。
【図６】エタノールを燃料とした場合の実施例１〜４及び比較例１〜３（比較例１はエタノールを供給しない場合も含む）の電流値の結果を示す図である。
【図７】ブタノールを燃料とした場合の実施例１〜４の電流値の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６９】
１，２ 酵素燃料電池、３ 試験用酵素燃料電池、６ アノード極室、８ カソード極室、１０ アノード極、１２ カソード極、１４ 電解質膜、１６ 電極材、１８ 酸化材、２２ 還元材、２４ セパレータ、２８ 燃料供給排出路、３０ 酸素供給排出路、３２ 集電用ステンレス板、３４ アクリル板、３６ 白金線、３８ シリコンラバー、４０ 空孔部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アノード極及びカソード極を有する燃料電池であって、
少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、
前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質であることを特徴とする燃料電池。
【請求項２】
請求項１記載の燃料電池であって、前記電子伝達可能な生体由来のタンパク質が、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５５１、及びアズリンのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする燃料電池。
【請求項３】
請求項２記載の燃料電池であって、前記酵素が、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする燃料電池。
【請求項１】
アノード極及びカソード極を有する燃料電池であって、
少なくとも前記アノード極に酵素及びメディエータを有し、
前記メディエータが、電子伝達可能な生体由来のタンパク質であることを特徴とする燃料電池。
【請求項２】
請求項１記載の燃料電池であって、前記電子伝達可能な生体由来のタンパク質が、ヘモグロビン、フェレドキシン、シトクロムＣ５５１、及びアズリンのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする燃料電池。
【請求項３】
請求項２記載の燃料電池であって、前記酵素が、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）型デヒドロゲナーゼを含むことを特徴とする燃料電池。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−７１７２２（Ｐ２００８−７１７２２Ａ）
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５１７８１（Ｐ２００６−２５１７８１）
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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