酵素糖化を促進させるためのバイオマスの有機溶剤前処理
バイオマスは、アルカリ条件下で、アンモニアおよび任意により追加の求核剤の存在下で、有機溶剤溶液を用いて前処理されて、ヘミセルロースが損失されることなくリグニンが断片化および抽出される。前処理済バイオマスは、糖化酵素共同体でさらに加水分解される。糖化によって遊離された発酵可能な糖質は、発酵による目標化学薬品の生成に利用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１３９１７９号明細書の利益を主張し、その開示は、全体が参照により援用される。
【０００２】
容易に糖化可能な炭水化物富化リグノセルロースバイオマスを生成する方法が提供されていると共に開示されている。具体的には、前処理済バイオマスは、低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤が存在する、高温、アルカリ条件下での、有機溶剤溶液におけるリグニンの同時断片化および選択的抽出を介して調製される。次いで、前処理済バイオマス中に残留している炭水化物富化固形分が、酵素糖化に供されて発酵可能な糖質が得られ得、これが目標生成物の生成のためのさらなる加工に供され得る。
【背景技術】
【０００３】
農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙由来のスラッジ、ならびに、都市および産業固体廃棄物などのセルロース系およびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、化学薬品、プラスチック、燃料および飼料の製造のための潜在的に大きな再生可能原材料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびリグニンから構成されるセルロースおよびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、一般に、多様な化学的、機械的および酵素的手段により処理されて第１級ヘキソースおよびペントース糖質が遊離され、次いで、これが、有用な生成物に発酵されることが可能である。
【０００４】
度々、リグノセルロースバイオマスの多糖類を、セルロース分解酵素に対してより容易にアクセス可能とするために、前処理方法が用いられる。セルロース分解酵素消化に対する主な障害の一つは、酵素の基質に対するアクセスを制限するバリアおよび酵素が非生産的に結合する表面である、リグニンの存在である。酵素糖化に関連する相当のコストのために、酵素吸着に対するリグニンの非働化、または、その完全な抽出により、酵素の使用量を最低限とすることが望ましい。
【０００５】
他の課題は、ヘミセルロースおよびリグニンによる保護または結晶化度による保護による、酵素加水分解に対するセルロースの難アクセス性である。これらの課題の解決を試みる前処理方法としては：水蒸気爆発、熱水、希酸、アンモニア繊維爆発、アルカリ加水分解（アンモニア再利用パーコレーションを含む）、酸化脱リグニン化およびオルガノソルブが挙げられる。
【０００６】
リグノセルロースバイオマスの処理に既に実施されている、パルプの製造用またはバイオ燃料用途のためのオルガノソルブ法は、一般にリグニンの除去は良好である一方、特にキシロースといった糖質の回収率が低い。例えば、わずかに酸性のエタノール−水混合物（例えば、ＥｔＯＨ ４２重量％）を用いた高温でのリグノセルロースバイオマスからのリグニンの除去（非特許文献１）では、炭水化物の相当量の損失が生じてしまう。９５℃での希酸加水分解、これに続く、有機溶剤抽出および酵素糖化（非特許文献２）は、加水分解の最中にヘミセルロースの相当量の損失が生じ、有機溶剤抽出では追加で炭水化物の損失が生じてしまい、残渣の酵素糖化での収率は低い（総炭水化物の約５０％）。
【０００７】
気体状の水およびメチルアミンでのバイオマスの処理、これに続く、有機溶剤での抽出、および、次いで、水での抽出は、３つのステップを必要とし、炭水化物の相当量の損失が生じる（非特許文献３）。高温での水−脂肪族アルコール混合物と触媒との中でのポリアミンまたはエチルアミンでの処理では、高い液体／固形分比および低濃度のアルコールが必要とされ、特にキシランといった糖質の回収率が低くなってしまう（特許文献１）。水性アルカリ溶液中のチオグリコレートを用いた高温でのリグノセルロースバイオマスの処理、これに続く、熱水での洗浄では、アルカリ−金属水酸化物またはアルカリ土類水酸化物の使用が必要とされる。この方法では、無機イオンのコストのかかる廃棄、高重量％のチオグリコレート、および、大量の水の使用が必要とされる（特許文献２）。硫化物／ビ硫化物の存在下での高温での有機溶剤−水混合物での処理では高い溶剤／固形分比および高い硫黄含有量が必要とされ、炭水化物が相当量で損失される（特許文献３）。
【０００８】
リグノセルロースバイオマスを処理するための高濃度のアンモニアを含有する水性有機溶剤の高温の使用（非特許文献４）は、前処理における高い液体対固形分比を必要とし、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化をもたらす。
【０００９】
既に適用されている方法の追加の欠点としては、個別のヘキソースおよびペントース流（例えば希酸）、特にリグニン含有量が高い供給原料（例えば、サトウキビバガス、軟材）における不十分なリグニン抽出または抽出されたリグニンの多糖からの分離不足、廃棄生成物（例えば、酸または塩基の中和で形成される塩）の廃棄、ならびに、洗浄ステップにおける分解または損失による炭水化物の低い回収率が挙げられる。他の問題としては、エネルギーの高いコスト、設備投資、および、前処理触媒回収率、および、糖化酵素との非適合性が挙げられる。
【００１０】
バイオマス前処理の主な課題の一つは、低コストで効率的なプロセスを通じて、炭水化物の損失（セルロース＋ヘミセルロース）を最小限としつつ、リグニンの抽出または化学的中和（セルロース分解酵素の非生産的な結合に関して）を最大化することである。選択性が高いほど、前処理および酵素糖化の組み合わせに続く単糖の全収率が高い。
【００１１】
従って、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化を伴わずに、実質的により低い液体：固体比を前処理において用いると共に再使用可能な塩基を用いる単一ステッププロセスの開発に対する必要性が存在している。本開示がこの要求に対処する。本開示においては、１種以上の求核試薬の存在下において低濃度から中程度の濃度のアンモニアが、高温、アルカリ条件下でのリグニンの有機溶剤溶液−媒介断片化および選択的抽出に用いられる。この費用効率の高いプロセスは、リグニンを選択的に除去しながらバイオマスのヘミセルロース含有量を維持して、高度に酵素糖化されやすい炭水化物富化バイオマスを生成する。本明細書に記載のプロセスによって生成された前処理済バイオマスは、糖化の後に発酵可能な糖質（グルコース、ならびに、キシロース）をきわめて高い収率でもたらし、次いで、発酵の後に目標生成物（例えば、付加価値化学薬品および燃料）を高い収率でもたらす。驚くべきことに、低濃度から中程度の濃度のアンモニアの使用および１種以上の求核剤の存在が、特にヘミセルロースに関して、顕著に向上したリグニン断片化および抽出、ならびに、高い炭水化物保存をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，５９７，８３０Ａ号明細書
【特許文献２】米国特許第３，４９０，９９３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，３２９，２００Ａ号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎｅｒｔ，Ｔ．Ｎ．，Ｔａｐｐｉ，５７：９９〜１０２ページ，１９７４年
【非特許文献２】Ｌｅｅ，Ｙ−Ｈ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２９：５７２〜５８１ページ，１９８７年
【非特許文献３】Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｐ．およびＧｏｅｔｚ，Ｒ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２１３〜２１７ページ，１９９２年
【非特許文献４】Ｐａｒｋ Ｊ．−Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，６５：１８７〜２０５ページ，１９８８年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成する方法、および、特にヘミセルロースといった炭水化物を略量的に保存しつつ、リグニンをリグノセルロースバイオマスから選択的に抽出する方法を提供する。本方法は、リグノセルロースバイオマスを、低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤を含む有機溶剤溶液で、高温、アルカリ条件下で処理するステップを含む。前処理の後、バイオマスは、糖化酵素共同体でさらに処理されて、発酵可能な糖質を生成し得る。これらの糖質は、目標生成物を生成するためのさらなる加工ステップに供されてもよい。
【００１５】
従って、本発明は：
（ａ）リグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含むリグノセルロースバイオマスを提供するステップ；
（ｂ）水、乾燥バイオマスの重量を基準として約２％〜約２０％の量のアンモニア、および、１種以上の求核剤を含む有機溶剤溶液中に（ａ）のバイオマスを懸濁させて、アルカリ条件下にバイオマス−溶剤懸濁液を形成するステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約５分間〜約５時間、約１００〜２２０℃の温度に加熱して、リグニンを断片化させて、懸濁液中に溶解させるステップ；ならびに
（ｄ）（ｃ）における懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過して、溶解リグニンを除去し、ヘミセルロースが高度に保存された炭水化物富化バイオマスを生成するステップ
を含む、ヘミセルロースが高度に保存された炭水化物富化バイオマスを生成する方法を提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は：
（ａ）
１）リグニンおよび炭水化物を含む一定量のリグノセルロースバイオマス；
２）約４０％〜約７０％エタノールを水中に含む多成分溶剤溶液；
３）２％〜約２０％の量のアンモニア
４）および、１種以上の求核剤
を提供するステップ；
（ｂ）前記バイオマスに（ａ）の多成分溶剤溶液を接触させて溶剤−バイオマス混合物を形成するステップ；
（ｃ）密閉圧力容器中に溶剤−バイオマス混合物を入れ、（ｂ）の混合物を約１００℃〜約２２０℃の温度で約５分間〜約５時間加熱して、リグニンを断片化させて、溶剤中に溶解させるステップ
（ｄ）（ｃ）の溶解リグニンをろ過により除去するステップ；ならびに
（ｅ）残留物を有機溶剤で洗浄することにより、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生成するステップ
を含む、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生成するためのリグノセルロースバイオマスからリグニンを同時に断片化および選択的抽出する方法を提供する。
【００１７】
得られるバイオマスは高度に保存された炭水化物含有量を有し、例えば、炭水化物含有量は、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスと比してバイオマス炭水化物の８５％以上であり得る。より具体的には、本明細書に記載されているとおり、得られるバイオマスは、前処理前のバイオマス中に存在する炭水化物の量と比して、炭水化物の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、１００％が前処理後に保存されているよう、炭水化物富化される。さらに、結果的なヘミセルロース含有量は、本明細書に記載されているとおり、前処理前のバイオマス中に存在するヘミセルロースの量と比して、ヘミセルロースの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、１００％が前処理後に保存されているよう保存される。
【００１８】
特に好適な本発明の方法に用いられる供給原料としては、これらに限定されないが、スイッチグラス、古紙、製紙由来のスラッジ、トウモロコシ繊維、コーン穂軸、コーン包葉、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、干草、オオムギ、オオムギわら、稲わら、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の加工から得られる構成要素、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、動物堆肥、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
出願人らは、本開示において引用されているすべての文献の全内容を特定的に援用する。そうではないとの記載がない限り、すべての割合、部、比率等は重量当たりである。商標は大文字で表記されている。さらに、量、濃度、または他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または、好ましい上限値および好ましい下限値の列挙として記載されている場合、これは、範囲が別に開示されていない限りにおいて、任意の範囲上限または好ましい値と任意の範囲下限または好ましい値との任意の対から形成されるすべての範囲を特定的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が言及されている場合、他に明記されていない限りにおいて、この範囲は、範囲内の両端点、ならびに、すべての整数および少数を含むことが意図されている。本発明の範囲が、範囲の定義の際に言及されている特定の値に限定されることは意図されていない。
【００２０】
本発明は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成してその後の酵素糖化ステップを促進させるために、バイオマスを処理するためのプロセスを提供する。高温、アルカリ条件下で、アンモニアの存在下で有機溶剤を用いてリグニンが同時に断片化および抽出される前処理ステップを含むプロセスが採用される。追加の求核試薬がさらなる有益性のために採用され得る。次いで、処理されたバイオマスは、ろ過および洗浄されて、可溶化されたリグニン、酢酸、アセトアミド、アルキルアミドおよび過剰量の試薬が除去され、次いで、糖化酵素共同体で消化されて、発酵可能な糖質が生成される。この糖質は、次いで、１種以上の目標生成物にさらに加工されてもよい。除去されたリグニンもまた、効率を高めるために、他の目的（エネルギーのための燃焼など）のためにさらに加工および利用され得る。
【００２１】
定義
以下の定義が本開示において用いられている。
温度に関して用いられる場合、「室温」および「周囲」とは、約１５℃〜約２５℃の任意の温度を指す。
【００２２】
「発酵可能な糖質」とは、目標生成物を生成するための発酵プロセスにおいて微生物によって炭素源として用いられることが可能である単糖およびいくらかの二糖を主に含む糖質含有物（いくらかの多糖類が存在していてもよい）を指す。「容易に発酵可能な糖質」とは、追加の高価な加工が不要であること、および／または、抑制因子または発酵に悪影響を及ぼし得る他の構成成分による障害が最低限で、発酵微生物が得られた糖質に接触することが可能であることを意味する。
【００２３】
「リグノセルロース」とは、リグニンおよびセルロースの両方を含む材料を指す。リグノセルロース材料はヘミセルロースをも含んでいてもよい。本明細書に記載のプロセスにおいて、リグニンは溶解されて、リグノセルロースバイオマスから実質的に除去されて炭水化物富化バイオマスが生成される。
【００２４】
「ヘミセルロース」とは、ほとんどすべての植物細胞壁中にセルロースと共に存在するヘテロポリマー分岐鎖炭水化物を指す。これは、ペントース糖質、キシロースから主に構成されているが、アラビノースによっても構成されており、頻繁にこれを通してリグニンにエステル化される。これはまた、６個の炭素を有するウロン酸およびいくつかのヘキソース糖質、グルコース、ガラクトース、マンノースおよびラムノースをも含有していることが可能である。ヘミセルロースは、強度がほとんどないランダムのアモルファス構造を有すると共に、希酸または塩基およびヘミセルラーゼ酵素によって容易に加水分解される。
【００２５】
本明細書において用いられるところ、「ヘミセルロースの高度の保存」とは、出発材料中に存在するヘミセルロースの≧８５％の保存を指す。
【００２６】
本明細書において参照される「溶解リグニン」は、有機溶剤溶液中に溶解されたリグニンを意味する。
【００２７】
「ＡＩリグニン」とは、酸不溶性リグニンを指す。
【００２８】
「自己加水分解」とは、外来性の酸もしくは塩基または加水分解酵素の添加などのさらなる添加を伴わない、溶剤（水、または、有機溶剤＋水）＋熱の存在下でのバイオマスの加水分解を指す。
【００２９】
「セルロース系」とは、セルロースを含む組成物を指す。
【００３０】
「目標生成物」とは、発酵によって生成される薬品、燃料または化学構築ブロックを指す。生成物は、広範に用いられると共に、例えば、ペプチド、酵素および抗体を含むタンパク質などの分子を含む。目標生成物の定義には、エタノールおよびブタノールが含まれることも意図されている。
【００３１】
「バイオマスの乾燥重量」とは、すべての水または実質的にすべての水が除去されたバイオマスの重量を指す。乾燥重量は、典型的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）規格Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｓｏｌｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ）またはＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．（ＴＡＰＰＩ）規格Ｔ−４１２ ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｉｎ Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に準拠して計測される。
【００３２】
「選択的抽出」とは、炭水化物が実質的に保存されるリグニンの除去を意味する。
【００３３】
本明細書において用いられるところ、「溶剤溶液」および「有機溶剤溶液」は、固体、液体または気体の溶質を溶解して溶液をもたらす任意の有機液体を含む水中の有機溶剤混合物である。本発明のために最も好適な溶剤溶液は、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、ならびに、炭素数が同一であるジオールなどの有機溶剤である。これらはまた、非プロトン性溶剤をも含んでいることが可能である。溶剤溶液は、溶液との混合物で追加の成分を含んでいることが可能であり、例えば、溶剤溶液は１種以上の求核剤を含んでいてもよい。
【００３４】
本明細書において用いられるところ、「バイオマス」および「リグノセルロースバイオマス」とは、例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、庭園廃棄物、木材、林業廃棄物およびこれらの組み合わせ、ならびに、以下にさらに記載されているものといった、セルロース系およびヘミセルロース系材料を含む任意のリグノセルロース材料を指す。バイオマスは、多糖類およびオリゴ糖を含む炭水化物含有物を有すると共に、タンパク質および／または脂質などの追加の成分をも含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書において用いられるところ、「高度に保存された」とは、本明細書に記載の加工ステップ後のリグノセルロース材料の炭水化物含有量を指す。発明の一実施形態において、高度に保存された炭水化物含有量は、本明細書に記載のプロセスによる糖質収率の損失を最低限として理論収率と実質的に同様である糖化後の糖質収率を提供する。発明の一実施形態において、炭水化物含有量に関して高度に保存されたとは、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスと比してバイオマス炭水化物の８５％以上の保存を指す。
【００３６】
本明細書において用いられるところ、「プレ加工」とは、前処理に先立つリグノセルロースバイオマスの加工を指す。プレ加工は、機械的粉砕および／または適切な水分接触への乾燥などの前処理用のバイオマスを調製するバイオマスの任意の処理である。
【００３７】
「バイオマス−溶剤懸濁液」とは、バイオマスと溶剤との混合物を指す。バイオマス−溶剤溶液は、１種以上のアルキルアミン、チオグリコレート、アンモニア、硫化物等などの追加の成分を含んでいてもよい。
【００３８】
「糖化」とは、加水分解酵素の作用による主に多糖類からの発酵可能な糖質の生成を指す。前処理済バイオマスからの発酵可能な糖質の生成は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素の作用による酵素糖化によって生じる。
【００３９】
本明細書において用いられるところ、「バイオマスを前処理する」または「バイオマス前処理」とは、自然のまたは前加工されたバイオマスを化学的もしくは物理的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供して、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与えることを指す。例えば、本明細書において特許請求されている方法は、バイオマスを糖化のために加水分解酵素に対してよりアクセス可能とするための前処理プロセスとして称され得る。
【００４０】
「前処理濾液」とは、前処理後にバイオマスに接触していると共にろ過によって分離される自由液体を意味する。
【００４１】
本明細書において用いられるところ、「前処理済バイオマス」とは、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与える、化学的あるいは物理的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供された自然のまたは前加工されたバイオマスを指す。
【００４２】
「ろ過されたバイオマスを空気乾燥するステップ」は、バイオマスを周囲雰囲気の空気との平衡を介して乾燥させることにより実施されることが可能である。
【００４３】
「容易に糖化可能なバイオマス」とは、炭水化物富化されていると共に、単糖およびオリゴ糖の生成のためにセルロースまたはヘミセルロース分解酵素によってより加水分解されやすくされたバイオマス、すなわち、本明細書に記載の前処理済バイオマスを意味する。
【００４４】
本明細書において用いられるところ、「炭水化物富化された」とは、本明細書に記載のプロセス処理により生成されるバイオマスを指す。一実施形態において、本明細書に記載のプロセスにより生成された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、乾燥重量を基準として出発バイオマスリグニン含有量の７５％以上が除去されていつつも、乾燥されたバイオマスの８５重量％以上の炭水化物濃度を有する。
【００４５】
「バイオマス懸濁液を加熱するステップ」とは、溶剤中に懸濁されたバイオマスを周囲温度または室温を超える温度に供するステップを意味する。本前処理に関連する温度は、約１００〜約２２０℃、または、約１４０〜約１８０℃、または、これらの範囲内の任意の温度またはおよそこれらの範囲の任意の温度である。
【００４６】
「自由液体を加圧下にろ過するステップ」とは、フィルタの両面にいくらかの圧力差をかけたろ過をとおした自由液体の除去を意味する。
【００４７】
「アルカリ」または「アルカリ条件下」とは、７．０を超えるｐＨを意味する。本発明においては、「アルカリ条件下」とはまた、実質的に脱プロトン化されると共に、プロトン化状態にあるよりも高度に反応性であるよう、存在する求核試薬のｐＫａ以上のバイオマス−溶剤懸濁液のｐＨを意味する。これらの求核試薬は、アルキルアミン、および、アンモニア、チオール、多硫化物および水硫化物（存在する場合）を含むであろう。
【００４８】
「二価アルカン」とは、２の満たされていない原子価を有する直鎖、分岐または環式アルカンを意味する。
【００４９】
「炭水化物含有量」とは、グルカン、キシランおよびアラビナンに起因するリグノセルロースバイオマスサンプルの乾燥物質の割合を意味し、セルロースおよびヘミセルロース由来の炭水化物を含む。
【００５０】
「炭水化物含有量を実質的に保存する」とは、リグノセルロースバイオマスに適用される前処理プロセスにおける、最大量（例えば、元の含有量の≧８５％）のグルカン、キシランおよびアラビナンの各々の保存を意味する。
【００５１】
「空気乾燥されたサンプル」とは、その含水量が、典型的には≧８５％乾燥物質といった、周囲空気の含水量と平衡となるような程度の周囲温度および圧力で空気乾燥された前処理されたサンプルを意味する。
【００５２】
「実質的にリグニンを含まないバイオマス」とは、リグニンの約≧７５％が除去された前処理されたサンプルを意味する。
【００５３】
「乾燥バイオマス」とは、≧８５％の乾燥物質含有量を有するバイオマスを意味する。バイオマスの乾燥方法は、周囲温度での減圧への露出もしくは周囲温度での大気圧下での空気流への露出、および／または、オーブンもしくは真空オーブン中での加熱を含む。
【００５４】
「多成分溶剤」とは、有機溶剤、水、および、リグニンを化学的に攻撃可能な試薬を含有する溶剤を意味する。
【００５５】
「圧力容器」は、バイオマス／溶剤懸濁液を攪拌するための機構を備えていてもいなくてもよい、リグノセルロースバイオマスの加熱時に正圧がかけられる密閉容器である。
【００５６】
「求核剤」は、結合電子の両方を与えることによりその反応相手と共有結合を形成することが可能である化学薬品である。
【００５７】
「加水分解物」とは、バイオマスに作用する（酵素的にまたは非酵素的に）加水分解反応の生成物を含有するリグノセルロースバイオマスに接触している液体を指し、この場合単糖およびオリゴ糖を指す。
【００５８】
「オルガノソルブ」とは、典型的にはバイオマスに接触していると共に、リグニンまたはその断片が可溶性である有機溶剤と水との混合物を意味する。
【００５９】
「酵素共同体」または「糖化酵素共同体」は、通常微生物によって分泌される一群の酵素であって、これは、本事例においては、典型的には、１種以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼを含有するであろう。
【００６０】
「単糖」または「単純な糖質」は、単一のペントースまたはヘキソースユニット、例えば、グルコース、キシロースおよびアラビノースから構成される。
【００６１】
「脱リグニン化」は、リグノセルロースバイオマスからリグニンを除去する操作である。本出願の文脈において、脱リグニン化は、高温、アルカリ条件下で、アンモニアおよび任意により種々の求核試薬の存在下に有機溶剤を用いる、特にヘミセルロースに関して、炭水化物が高度に保存されているリグノセルロースバイオマスからのリグニンの断片化および抽出を意味する。
【００６２】
「断片化」は、リグノセルロースバイオマスをアルカリ条件下に有機溶剤で処理して、リグニンをより小さなサブユニットに分解するプロセスである。
【００６３】
「選択的抽出」は、断片化されたリグニンをアルカリ条件下での有機溶剤での処理により溶解させて、多糖を残留させるプロセスである。
【００６４】
本明細書において用いられるところ、「同時断片化および選択的抽出」とは、リグニン断片がバルクバイオマスから遊離されると直ぐに溶液に溶解するよう、有機溶剤において実施される断片化反応を指す。
【００６５】
ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するリグノセルロースバイオマスの前処理方法が提供されている。これらの方法は、リグノセルロースバイオマスの成分を、酵素糖化に対してよりアクセス可能に、または、受容可能にするための経済的なプロセスを提供する。前処理は、化学的もしくは物理的、または、前述のものの任意の組み合わせであることが可能である。本開示において、前処理は、ＮＨ３および、任意により、追加の塩基の存在下に実施される。有機溶剤の存在およびアルカリ条件が、リグニン断片化および除去、ならびに、炭水化物回収を補助する。
【００６６】
加えて、本開示に記載の方法は、前処理プロセスの最中の炭水化物の損失を最小限とすると共に、糖化における可溶化された（単糖＋オリゴ糖）の収率を最大限とする。
【００６７】
上記に開示されているとおり、本明細書に記載の方法は、以下に記載のとおり、リグノセルロース材料を低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤を含む溶剤溶液で前処理して、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップを含む。
【００６８】
溶剤
本明細書に記載の方法は、バイオマスの前処理であって、具体的には、リグニンの断片化および抽出のための有機溶剤溶液の使用を含む。本方法において有用な溶剤は、技術分野においてオルガノソルブとして頻繁に言及されている（例えば、Ｅ．Ｍｕｕｒｉｎｅｎ（２０００年）Ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖ Ｐｕｌｐｉｎｇ，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ ｐｕｌｐｉｎｇ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｕｌｕ，３１４ページ；Ｓ．Ａｚｉｚ，Ｋ．Ｓａｒｋａｎｅｎ，Ｔａｐｐｉ Ｊ．，７２／７３：１６９〜１７５ページ，１９８９年；Ａ．Ｋ．ＶａｒｓｈｅｎｙおよびＤ．Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄ．Ｒｅｓ．，４７：３１５〜３１９ページ，１９８８年；Ａ．Ａ．ＳｈａｔａｌｏｖおよびＨ．Ｐｅｒｅｉｒａ，ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ １：４５〜６１ページ，２００６年；Ｔ．Ｎ．Ｋｌｅｉｎｅｒｔ，Ｔａｐｐｉ Ｊ．，５７：９９〜１０２ページ，１９７９年；ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを用いるパイロットスケールにまで進行したＫｌｅｉｎｅｒｔによるバイオ燃料用のオルガノソルブテクノロジーの実施が記載されている（国際公開第２００７１０５１２６９号パンフレット）、およびＸ．Ｐａｎ，Ｎ．Ｇｉｌｋｅｓ，Ｊ．Ｋａｄｌａ，Ｋ．Ｐｙｅ，Ｓ．Ｓａｋａ，Ｄ．Ｇｒｅｇｇ，Ｋ．Ｅｈａｒａ，Ｄ．Ｘｉｅ，Ｄ．ＬａｍおよびＪ．Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４：８５１〜８６１ページ，２００６年。実験規模ではあるが、アセトン／Ｈ２Ｏの使用が米国特許第４，４７０，８５１号明細書に記載されている。前処理技術に関するさらなる詳細は溶剤の使用に関すると共に、他の前処理は、Ｗｙｍａｎら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：１９５９，２００５年）；Ｗｙｍａｎら、（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：２０２６，２００５年）；Ｈｓｕ，（「Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ」，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ編，１７９〜２１２ページ，１９９６年）；ならびに、Ｍｏｓｉｅｒら，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：６７３，２００５年）に見出されることが可能である。本明細書においては溶剤がリグニンを除去するバイオマスの前処理のために用いられる。脱リグニン化は、典型的には、１６５〜２２５℃の温度、４：１〜２０：１の液体対バイオマス比、５０％有機溶剤（ｖ／ｖ）の液体組成物、および、０．５〜１２時間の反応時間で実施される。多数のモノ−およびポリヒドロキシ−アルコールが溶剤としてテストされた。エタノール、ブタノールおよびフェノールがこれらの反応に用いられている（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，６５：１８７〜２０５ページ，１９８８年）。
【００６９】
本方法におけるオルガノソルブまたは有機溶剤溶液前処理は、水および有機溶剤の混合物を温度、時間、圧力、溶剤対水比および固形分対液体比を含む選択された条件パラメータで含んでいてもよい。この溶剤は、特に限定されないが、アルコールおよび非プロトン性溶剤（ヒドロキシル基のように酸素に結合している水素原子、または、アミン基のように窒素に結合している水素原子、例えば、ケトン）を含んでいることが可能である。これらのアルコールは、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ヘキサンジオールなどの、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、ならびに、同数の炭素原子を有するその異性体およびジオールを含み得る。
【００７０】
本発明における溶液（すなわち水）中の溶剤の濃度は、約２〜約９０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約８５％または約２０％〜約８０％または約３０％〜約８０％またはより好ましくは約４０％〜約７０％（ｖ／ｖ）である。特に、本明細書における方法の一実施形態の目的に関して、約０％〜８０％（ｖ／ｖ）エタノール濃度のＨ２Ｏ混合物中のＥｔＯＨを試験し、および、４０〜７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する溶液が最も効果的であることが見出された。
【００７１】
アンモニア
アンモニアは低価格の試薬であり、それ故、バイオマス前処理に対する経済的な手段を提供する。アンモニアはまた、前処理の最中または前処理の後に前処理反応器に再利用されることが可能であり、それ故、追加の経済的な有益性を可能とする。アンモニアは液体相と気相とに分割されると共に、気体のアンモニアは、液体塩基よりも容易にバイオマス中に拡散することが可能であり、より低い濃度でより有効な前処理をもたらす。例えば、前処理の後、温度が糖化に好適な温度に下がるに伴って、アンモニアガスが任意により減圧下に遊離され得ると共に、再利用され得る。連続プロセスにおいて、アンモニアは連続的に再利用され得る。
【００７２】
一実施形態において、低濃度から中程度の濃度でのアンモニア前処理は、バイオマスにおける炭水化物回収率を高める。ＮＨ３は多糖鎖の還元末端とイミンを形成するため、この反応は、アルカリｐＨでの「ピーリング」を介した糖質の損失に関与するβ−脱離反応を阻害する可能性が高い。ＮＨ３はまた、ＥｔＯＨ濃度の上昇に伴って増加する可能性が高いリグニンのアンモノリシスを、ＮＨ４＋／ＮＨ３のｐＫａを下げる（ＮＨ３／ＮＨ４＋比を高める）ことにより後押しすることが可能である。この反応はまた、キノンメチドの形成を低減させ得る。低濃度から中程度の濃度のＮＨ３の添加の結果は、従って、Ｈ２Ｏ中のより高レベルのＥｔＯＨ前処理条件下でのグルカンおよびキシランの保存のさらなる増加である。
【００７３】
他の実施形態において、アンモニア（ＮＨ３）は、単独で、または、ＮａＯＨに追加して、溶剤溶液の追加の成分として用いられ得る。本方法において用いられるアンモニアの濃度は、最低でも、バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨをアルカリ性に維持するために十分な濃度であって、最大で、バイオマスの乾燥重量に対して、約１６重量％以下、または、約０％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％である。アンモニアのこの低い濃度は、本方法による前処理に十分である。ポプラの脱リグニン化のための高濃度のアンモニアとオルガノソルブ前処理との組み合わせの使用が報告されている（Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６５，１８７〜２０５ページ，１９８８年）。これらの実験は、前処理において高い液体対固形分比を適用する必要があると共に、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化をもたらす。
【００７４】
本明細書において実施例３に示されているとおり、アンモニアは、低濃度のＮａＯＨで補足された場合、特許請求の方法においてより効果的である。特に、本出願において開示されている低濃度から中程度の濃度でのアンモニアのアルカリの供給源としての使用は、すべての未反応アンモニアは容易に再利用可能であるため、ＮａＯＨの単独での使用に固有の廃棄問題を形成しない。
【００７５】
加えて、本開示に記載の方法は、前処理プロセスの最中の炭水化物の損失を最小限とするとし、糖化における可溶化された（単糖＋オリゴ糖）の収率を最大とする。
【００７６】
上記に開示されているとおり、本明細書に記載の方法は、リグノセルロース材料を以下に記載の成分を含む溶剤溶液で前処理して、ヘミセルロースを高度に保存している容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップを含む。
【００７７】
溶剤溶液の追加の成分
一実施形態において、ＮａＯＨは溶剤溶液の追加の成分として採用され得る。ＮａＯＨは、特に、Ｈ２Ｏ溶剤溶液中のＥｔＯＨにおいて用いられ得、および、ＮａＯＨの使用は、さらなるリグニン断片化のためのアントラキノンなどの触媒の溶剤溶液への添加を含み得る。
【００７８】
ＮａＯＨは、少なくとも約０．５〜約２０％（ｗ／ｗバイオマス）である量など、種々の濃度で用いられることが可能である。より好適な濃度は、約１〜約１０％（ｗ／ｗバイオマス）を含む。最も好適な濃度は約２〜８％（ｗ／ｗバイオマス）である。水（ｖ／ｖ）中に２０〜８０％エタノールおよびリグニン断片化用の触媒として約０．５％アントラキノン（ＡＱ）（ｗ／ｖ）を含有する溶剤への約８％（ｗ／ｗバイオマス）ＮａＯＨの添加は、自己加水分解（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏのみの中で実施）と比して前処理におけるキシランの高い保存をもたらした。
【００７９】
本方法の実施形態は、２％〜２０％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）および０．５％〜８％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）と共に、２０〜８０％ｖ／ｖエタノールをＨ２Ｏ中に含む溶剤溶液を含む。最適な回収率は、サトウキビバガスについて、Ｈ２Ｏ中の４０〜７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）および６％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）および２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）で観察された。Ｈ２Ｏ中のＥｔＯＨの増加に伴う高いリグニン抽出が観察され、これは、溶剤極性の低下によるＨ２Ｏ中のＥｔＯＨの増加に伴うリグニン断片の高い溶解度および高いＮＨ３／ＮＨ４＋を反映している可能性が高い。ＮＨ３単独とは対照的なＮＨ３＋ＮａＯＨでのより高い酵素的糖質収率およびリグニン抽出は、前者における高いｐＨの結果である可能性が高く、これは、非プロトン化ＮＨ３のより高い濃度をもたらして、リグニンおよびヘミセルロースエステルリンケージのより顕著なアンモノリシス、前処理におけるＮａＯＨの存在下におけるＯＨ−のより高い濃度による増加した加水分解、および、ヘミセルロースアセチル基の加水分解によるｐＨ低下の低減をもたらす。
【００８０】
本方法によれば、アンモニアを含む有機溶剤溶液は、任意により、水酸化ナトリウム（上述のとおり）、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムなどの少なくとも１種の追加の（無機）塩基を含み得る。少なくとも１種の追加の塩基は、アンモニアと組み合わされて、バイオマス乾燥重量に対して約２０重量％未満である一定量の総塩基を形成する量で添加され得る。好ましくは、全１種の追加の塩基＋アンモニアは、バイオマスの乾燥重量に対して。約２０％未満、または、約０％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８あるいは２０％である量である。
【００８１】
無機塩基は、少なくとも０．５％〜約１６％（乾燥バイオマスの重量％）の種々の濃度で用いられることが可能である。１％〜１０％の濃度がより好適である。２％〜８％の濃度が最も好適である。
【００８２】
リグノセルロースバイオマス
本明細書において前処理されるリグノセルロースバイオマスとしては、特に限定されないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙由来のスラッジ、庭園廃棄物、木材および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、これらに限定されないが、コーン穂軸、コーン包葉などの作物残渣、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、干草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の粉砕から得られる構成要素、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、ならびに、動物堆肥が挙げられる。
【００８３】
一実施形態においては、リグノセルロースバイオマスとしては、コーン葉茎、コムギわら、オオムギわら、カラスムギわら、稲わら、アブラナわらおよびダイズ葉茎などの農業残渣；スイッチグラス、茅、コードグラスおよびクサヨシなどの草；トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプミル微細繊維およびパルプミル廃棄物ならびにサトウキビバガスなどの繊維加工残渣；サトウキビわらおよびモロコシ；ユリノキ、ハコヤナギ材、他の硬材、軟材およびおがくずなどの林業廃棄物；ならびに、消費後の紙製品；ならびに、他の作物または十分に豊富に存在するリグノセルロース材料が挙げられる。
【００８４】
他の実施形態において、本発明に有用であるバイオマスは、比較的高い炭水化物含有量を有し、比較的高密度であり、および／または、収集、輸送、保管および／または取扱が比較的容易であるバイオマスを含む。
【００８５】
本発明の他の実施形態において、有用であるバイオマスとしては、コーン穂軸、コーン葉茎、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキおよびスイッチグラスが挙げられる。
【００８６】
リグノセルロースバイオマスは、単一の供給源に由来し得、または、２つ以上の供給源に由来する混合物を含んでいることが可能であり；例えば、バイオマスは、コーン穂軸およびコーン葉茎の混合物、または、幹もしくは茎および葉の混合物を含んでいることが可能である。
【００８７】
本方法において、バイオマス乾燥重量は、前処理の最中、バイオマス−溶剤懸濁液の重量の少なくとも約９％〜約８０％以下の初期濃度である。より好適には、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−溶剤懸濁液の重量の約１５％〜約７０％、１５％〜約６０％、または、約１５％〜約５０％の濃度である。バイオマス−溶剤懸濁液中のバイオマスの割合は、前処理材料の総体積を低減して、必要とされる溶剤および試薬の量を少なくすると共にプロセスをより経済的とするために高く維持される。
【００８８】
バイオマスは、供給源から入手されたまま直接的に用いられてもよく、または、何らかの前加工に供されてもよく、例えば、エネルギーがバイオマスに適用されて、サイズが低減され、露出表面積が高められ、および／または、本方法の第２のステップおよび第３のステップにおけるオルガノソルブ前処理および用いられる糖化酵素のそれぞれに対するバイオマス中に存在するリグニンのアクセス性ならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性が高められる。サイズを減少させるために、露出表面積を高めるために、および／または、オルガノソルブ前処理および糖化酵素に対するバイオマス中に存在するリグニンならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性を高めるために有用なエネルギー手段としては、これらに限定されないが、ミリング、破砕、研削、寸断、細断、ディスク精砕、超音波、およびマイクロ波が挙げられる。エネルギーの適用は、前処理の前もしくは最中、糖化の前もしくは最中、または、いずれかのこれらの組み合わせで行われ得る。
【００８９】
前処理に先立つ乾燥ステップは、周囲温度での減圧もしくは大気圧での空気流への露出、および／または、大気圧のオーブンまたは真空オーブン中での加熱などの従来の手段によっても行われ得る。
【００９０】
前処理条件
アンモニアと、１種以上の求核剤とを含む有機溶剤溶液でのバイオマスの前処理は、アルカリ条件下で、任意の好適な容器中で実施される。典型的には、容器は、圧力に耐えることが可能であり、加熱のためのメカニズムを有し、および、内容物を混合するためのメカニズムを有するものである。市販されている容器としては、例えば、Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ（登録商標）反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡ）、Ｊａｙｇｏ反応器（Ｊａｙｇｏ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）、ならびに、スチームガン反応器（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡに記載されている）が挙げられる。同様の機能を有するより大規模の反応器が用いられ得る。あるいは、バイオマスおよびオルガノソルブ溶液を１つの容器中に組み合わせ、次いで、他の反応器に移してもよい。また、バイオマスは、１つの容器中で前処理され得、次いで、さらに、スチームガン反応器（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡに記載されている）などの他の反応器中でプロセスされ得る。
【００９１】
前処理反応は、バッチ式反応器または連続式反応器などの任意の好適な容器で実施され得る。当業者は、より高い温度（１００℃超）、圧力容器が要求されることを認識するであろう。好適な容器は、バイオマス−オルガノソルブ混合物を攪拌するためのインペラなどの手段を備えていてもよい。反応器設計は、Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｈ．およびＶａｎ Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．およびＣｈｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．（編），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第５版（１９７３年）チャプター４，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ）において考察されている。この前処理反応は、バッチまたは連続プロセスのいずれかとして実施され得る。
【００９２】
バイオマスに溶剤を接触させる前に、バイオマスを含有する容器を減圧してもよい。バイオマスの細孔から排気することにより、バイオマスへの溶剤のより良好な浸透が達成され得る。減圧を適用する時間およびバイオマスに適用される負圧の程度はバイオマスのタイプに依存することとなり、バイオマスの最適な前処理（糖化後の発酵可能な糖質の生成により測られる）が達成されるよう経験的に判定可能である。
【００９３】
溶剤とのバイオマスの加熱は、約１００℃〜約２２０℃、約１５０℃〜２００℃または約１６５℃〜約１９５℃の温度で実施される。加熱された溶液は室温に急速に冷却され得る。さらに他の実施形態において、バイオマスの加熱は、約１８０℃の温度で実施される。バイオマス−溶剤懸濁液の加熱は、約５分間〜約５時間、または、約３０分間〜約３時間、または、より好ましくは約１〜２時間行われ得る。
【００９４】
有機溶剤溶液およびアンモニアでのバイオマスの前処理は、存在する求核試薬のｐＫａ以上であるｐＨでのアルカリ条件下で行われる。これらの高ｐＨ条件下では、求核試薬の少なくとも５０％が脱プロトン化された状態にある。脱プロトン化は、典型的には、求核試薬の反応性を高める。アンモニアに追加して、存在する求核試薬は、アルキルアミン、多硫化物（ヒドロ多硫化物）および硫化物（水硫化物）、ならびに、チオールを含むことが可能である。
【００９５】
本明細書に記載の前処理方法について、温度、ｐＨ、前処理時間、ならびに、有機溶剤およびアンモニアおよび追加の求核剤などの反応体の濃度、バイオマス濃度、バイオマスタイプ、ならびに、バイオマス粒径が関連しており；それ故、これらの可変要素は、バイオマスのタイプの各々について必要に応じて調整されて、本明細書に記載の前処理プロセスを最適化してもよい。
【００９６】
高温での前処理の後、バイオマスは加圧下でろ過される。冷却はろ過の前に行われても行われなくてもよい。ろ過に続いて、バイオマスは、水和有機溶剤で、高温または周囲温度で１回以上洗浄され得る。これは、次いで、水で洗浄されるか、または、乾燥されて有機溶剤が除去され得、次いで、糖化される。バイオマスを乾燥させる方法は上に記載された。
【００９７】
前処理（すなわち、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスの生成およびその後の糖化）の性能を個別にまたは一緒に評価するために、出発バイオマスから誘導可能な糖質の理論収率が判定されると共に、実測した収率と比較されることが可能である。前処理性能が、酵素の仕込み量がどのように全体的な系性能における目標生成物の収率に影響するかを関連付けることによりさらに評価され得る。
【００９８】
さらなるプロセス
糖化
前処理の後、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、有機溶剤の混合物、アンモニア、求核剤、断片化および抽出されたリグニン、ならびに、多糖類を含む。さらなる加工ステップに先立って、アンモニア、求核剤およびリグニン断片は、サンプルのろ過およびＨ２Ｏ中のＥｔＯＨ（０％〜１００％ＥｔＯＨ ｖ／ｖ）での洗浄により、前処理済バイオマスから除去され得る。バイオマスは、水で洗浄されてＥｔＯＨが除去されるか、または、乾燥されて炭水化物富化された、容易に糖化可能なバイオマスがもたらされてもよく、また、前記バイオマスのグルカン、キシランおよび酸不溶性リグニン含有物の濃度が技術分野において周知である分析手段を用いて測定されてもよい。これは、前処理済バイオマスは水で洗浄されるか、または、糖化のために乾燥されることが可能であるという、本発明の現実的な有益性である。ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、次いで、糖化酵素共同体の存在下でさらに加水分解されて加水分解物中のオリゴ糖および／または単糖が遊離され得る。
【００９９】
ツイン２０もしくはツイン８０、または、ＰＥＧ２０００、４０００あるいは８０００などのポリオキシエチレンなどの界面活性剤が添加されて、糖化プロセスが向上され得る（米国特許第７，３５４，７４３ Ｂ２号明細書、参照により本明細書において援用される）。酵素糖化への界面活性剤（例えば、ツイン２０）の添加は、度々、単糖遊離の速度および収率を促進させる。界面活性剤がいずれかの残存するリグニンを覆って、酵素のリグニンに対する非生産的な結合を低減させている可能性が高い。代わりのアプローチは、前処理におけるリグニンの抽出を促進させるか、または、リグニン吸着に対する酵素の損失が抑えられるようリグニンを化学的に変性させることである。
【０１００】
糖化酵素およびバイオマス処理方法が、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ら，（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）において概説されている。糖化酵素共同体は、１種以上のグリコシダーゼを含み得；グリコシダーゼは、セルロース加水分解グリコシダーゼ、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼおよびデンプン加水分解グリコシダーゼからなる群から選択され得る。糖化酵素共同体中の他の酵素は、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼを含み得る。
【０１０１】
糖化酵素共同体は、排他的ではないが、二糖、オリゴ糖および多糖類のエーテル結合を加水分解する群「グリコシダーゼ」から主に選択される１種以上の酵素を含み、これらは、一般的な群「加水分解酵素」（ＥＣ３）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，追補１（１９９３年）、追補２（１９９４年）、追補３（１９９５年、追補４（１９９７年）および追補５［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１〜５ページ，１９９４年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１〜６ページ，１９９５年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１〜５ページ，１９９６年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１〜６ページ，１９９７年；ならびに、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０〜６５０ページ，１９９９年］）に見出される。本方法において有用なグリコシダーゼは、これらによって加水分解されるバイオマス成分によって分類されることが可能である。本方法に有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、および、デンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。加えて、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素共同体の他の活性を追加して、バイオマスの他の成分からの多糖類の遊離を補助することが有用であり得る。多糖加水分解酵素を産生する微生物は、度々、セルロース分解などの活性を示し、これは、異なる基質特異性を有する数々の酵素または酵素の群によって触媒されることが技術分野において周知である。それ故、微生物由来の「セルラーゼ」は、そのすべてがセルロース−分解活性に寄与し得る酵素の群を含み得る。商業的なまたは非商業的なセルラーゼなどの酵素調製は、酵素の入手に利用される精製スキームに応じて数多くの酵素を含み得る。それ故、本方法の糖化酵素共同体は、「セルラーゼ」などの酵素活性を含み得るが、しかしながら、この活性は、２種以上の酵素によって触媒されていてもよいことが認識されている。
【０１０２】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）などの単離された形態で商業的に入手され得る。加えて、糖化酵素は、組み換え型微生物の使用を含む、バイオ燃料植物で宿主生物中に発現され得る。
【０１０３】
当業者は、どのように、共同体において用いられる酵素の有効量を決定し、最適な酵素活性のための条件を調整するかを知っているであろう。当業者はまた、どのように、共同体内で必要とされる酵素活性のクラスを最適化して、選択された条件下で所与の前処理生成物の最適な糖化を達成するかを知っているであろう。
【０１０４】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素に最適な温度およびｐＨで、またはその付近で実施される。本方法において糖化酵素共同体と共に用いられる至適温度は、約１５℃〜約１００℃の範囲である。他の実施形態において、至適温度は、約２０℃〜約８０℃および最も典型的には４５〜５０℃の範囲である。至適ｐＨは約２〜約１１の範囲であることが可能である。他の実施形態において、本方法において糖化酵素共同体と共に用いられる至適ｐＨは約４〜約５．５の範囲である。
【０１０５】
糖化は、約数分間〜約１２０時間、および、好ましくは約数分間〜約４８時間の時間で実施されることが可能である。反応時間は、酵素濃度および特定の活性、ならびに、用いられた基質、その濃度（すなわち、固形分仕込み量）、ならびに、温度およびｐＨなどの環境条件に応じることとなる。当業者は、特定の基質および糖化酵素共同体と共に用いられるべき温度、ｐＨおよび時間の最適な条件を容易に決定することが可能である。
【０１０６】
糖化は、バッチ式でまたは連続プロセスとして実施されることが可能である。糖化はまた、一つのステップで、または、多数のステップで実施されることが可能である。例えば、糖化に必要とされる異なる酵素は、異なる至適ｐＨまたは至適温度を示し得る。第１の処理は、一つの温度およびｐＨで酵素と共に実施され、続いて、第２または第３（または、それ以上）の処理が、異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素と共に実施されることが可能である。加えて、逐次的ステップにおける異なる酵素での処理は、より高いｐＨおよび温度で安定であると共により活性であるセルラーゼの使用、これに続く、より低いｐＨおよび温度で活性であるヘミセルラーゼの使用など、同一のｐＨおよび／または温度であり得、または、異なるｐＨおよび温度であり得る。
【０１０７】
糖化後のバイオマスからの糖質の可溶化度は、単糖およびオリゴ糖の遊離を計測することにより監視されることが可能である。単糖およびオリゴ糖の計測方法は技術分野において周知である。例えば、還元糖の濃度は、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２６〜４２８ページ，１９５９年）を用いて測定することが可能である。あるいは、糖質は、以下に記載のとおり適切なカラムを用いるＨＰＬＣにより計測することが可能である。
【０１０８】
目標生成物への発酵
本方法によって生成される、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、上記のとおり、酵素によって加水分解されて発酵可能な糖質を生成し得、次いで、これが、目標生成物に発酵されることが可能である。「発酵」とは、任意の発酵プロセスまたは発酵ステップを含む任意のプロセスを指す。目標生成物としては、特に限定されないが、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸、およびキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン、およびスレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および一酸化炭素（ＣＯ））が挙げられる。
【０１０９】
発酵プロセスはまた、飲用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳製品産業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業、およびタバコ産業において用いられるプロセスを含む。
【０１１０】
上記に加えて、本明細書に記載の前処理済バイオマスの糖化により生成された糖質は、普通、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、および、動物飼料などの有機製品、化学薬品、燃料、汎用および特殊化学薬品の製造に用いられ得る（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｂｉｏｃｏｍ．Ｅｎｇ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１５：７７７〜７９３ページ，１９９９年；およびＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９〜２１２ページ，１９９６年；ならびに、Ｒｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．およびＭａｎｄｅｌｓ，Ｍ．，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２：９１〜１０２ページ，１９８０年）。
【０１１１】
発酵可能な炭水化物由来の複数の有機生成物などの生成物の潜在的な同時生産もまたもたらされ得る。前処理および発酵の後に残留する富リグニン残渣はリグニン−由来の化学薬品、化学構築ブロックに転化されるか、または、発電に用いられることが可能である。
【０１１２】
発酵および／または糖化の従来の方法は技術分野において公知であり、特にこれらに限定されないが、糖化、発酵、個別の加水分解および発酵（ＳＨＦ）、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）、ハイブリッド加水分解および発酵（ＨＨＦ）、および直接微生物性転換（ＤＭＣ）を含む。
【０１１３】
ＳＨＦは、先ず、セルロースをグルコースおよびキシロースなどの糖質に酵素加水分解し、次いで、糖質をエタノールに発酵する個別のプロセスステップを用いる。ＳＳＦにおいて、セルロースの酵素的加水分解およびグルコースのエタノールへの発酵は一つのステップに組み合わされている（前述のＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．）。ＳＳＣＦは、複数種の糖質の共発酵を含む（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｊ．およびＨｉｍｍｅｌ，Ｍ．，Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：８１７〜８２７ページ，１９９９年）。ＨＨＦは、異なる温度、すなわち、高温酵素糖化とこれに続く発酵菌株が許容することが可能であるより低い温度でのＳＳＦで実施される同一の反応器内での２つの異なるステップを含む。ＤＭＣは、すべての３つのプロセス（セルラーゼ生成、セルロース加水分解および発酵）を一つのステップに組み合わせる（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｅｉｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ Ｚｙｌ，Ｗ．Ｈ．およびＰｒｅｔｏｒｉｕｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）。
【０１１４】
これらのプロセスは、本明細書に記載の前処理方法により生成された、ヘミセルロースが高度に保存された、炭水化物富化バイオマスから目標生成物を生成するために用いられ得る。
【０１１５】
本方法の利点
低濃度から中程度の濃度のアンモニアと組み合わされる、高温、アルカリ条件下でのリグニンの断片化および選択的抽出を用いるリグノセルロースバイオマスの前処理のための本発明に記載の方法は、顕著に向上したリグニン断片化、および、特にヘミセルロースといった炭水化物の高度の保存をもたらし、それ故、酵素糖化のための炭水化物富化バイオマスを得る経済的なプロセスを提供する。次いで、このようなバイオマスは、付加価値化学薬品および燃料への生物変換のための、発酵可能な糖質（グルコース、ならびに、キシロース）のきわめて高い収率をもたらす。
【０１１６】
現在のオルガノソルブプロセスの重要な欠点のうち、文献に記載されているものは以下のとおりである：前処理後の特にキシロースといった炭水化物の低い回収率、個別のヘキソース流およびペントース流の必要性、糖質分解生成物の生成、大量の溶剤の使用、ならびに、高い資本経費。例えば、一定の既存のプロセスは、ヘミセルロースおよびセルロースの加水分解物をもたらす酸性オルガノソルブ条件の使用を含む。酸性条件下でのヘミセルロースの大きい易変性は、単糖キシロースの分解生成物（例えばフルフラール）の形成をもたらし、キシロースの回収率を大きく低下させる（前述のＰａｎら）。このプロセスの一態様（Ａｒａｔｏ，Ｃ．，Ｐｙｅ，Ｅ．Ｋ．およびＧｊｅｎｎｅｓｔａｄ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２１−１２４：８７１〜８８２ページ，２００５年）においては、ヘミセルロースが酸性条件下で加水分解されると共に、セルロースが、中和の後、酵素加水分解される。糖化の前に酸を中和させる必要性、キシロースの部分的損失、ならびに、個別のペントース流およびヘキソース流の加工はすべて、プロセスコストを増加させる。しかも、酸性条件の使用は反応器および配管における合金の使用が必要となり、これは、実質的に、設備の資本経費を増加させる。
【０１１７】
本開示は、リグニンが安価な試薬を用いて選択的に断片化および抽出されると共に、ヘミセルロースおよびセルロースがその後に酵素糖化されるべくバイオマス中に一緒に残留する高度に選択的な方法の開発を説明している。この方法は、特に、バイオマスのヘミセルロースの高い濃度を維持させる。有機溶剤溶液に抽出されるリグニンの量は≧７５％であると共に、残留バイオマスにおけるキシランおよびグルカン回収率は定量に近似しており、それ故、上記のとおりオルガノソルブバイオマス前処理の文献に記載の手法の欠点が克服される。本出願に記載の方法による多糖の高い回収率は、ヘミセルロース加水分解および糖質分解を低減するアルカリ条件の使用、アルカリ条件下での多糖ピーリングを防止する低濃度から中程度の濃度のアンモニアの使用、ならびに、ヘミセルロースの加水分解を低減させると共にキシロースオリゴ糖を不溶性とする有機溶剤溶液の高いエタノール含有量による。加えて、用いられるアルカリ条件は、設備における特殊な合金の使用が不要であり、これにより、資本経費が抑えられる。反応体または生成物（例えば、ＮａＯＨ、ＮａＣＯ３、ＣａＳＯ４）中に無機塩をほとんどまたは全く含まない本方法の実施は、最終的な無機廃棄物材料の廃棄に関連するコストをほとんどまたは全く伴わない。未反応試薬（例えば、ＥｔＯＨ、ＮＨ３）は再利用可能であり、さらなるコスト削減の有益性がもたらされる。文献中に記載の方法の多くは高い溶剤対バイオマス比を用いる。本事例において、アルカリ条件の使用および添加された求核試薬によるリグニンの相当の断片化は、溶剤流が、高濃度のリグニンを集積させて、大容量の溶剤の必要性を低減させ、ならびに、同時に、微量の可溶化された炭水化物の損失を低減させることが可能であることを意味する。最後に、残留炭水化物は、おそらくは、前処理におけるリグニン断片の高レベルの抽出、ヘミセルロースとリグニンとの間のエステルリンケージの効果的な切断、および、多糖の重合度のいくらかの低下のために酵素を用いて良好に糖化される。有機溶剤の使用は、バイオマスの湿潤性、および、酵素の基質の細孔中へ浸透する能力を向上させる。
【実施例】
【０１１８】
容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを得るためのバイオマスの前処理
以下に記載の実験研究の目標は、前処理におけるリグニン抽出および糖質保存が最大化されたリグノセルロースのための経済的な前処理プロセスを開発すること、および、ヘミセルロースが高度に保存されており、さらにプロセスされて酵素糖化の後に最大の単糖収率が達成され得る容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成することであった。採用したアプローチは、固形分残渣中の糖質を保存しつつリグニンを好適な溶剤に選択的に断片化および抽出することである。以下の実験は、リグニンの選択的抽出のためのＮＨ３のような求核試薬の存在が組み合わされる有機溶剤溶液の開発を示す。有機溶剤および低濃度から中程度の濃度のＮＨ３および、任意により、追加の塩基の組み合わされた存在は、バイオマスのリグニン成分を選択的に断片化および可溶化して、特にヘミセルロースといった炭水化物を高レベルで含有する前処理済バイオマスを生成させる。
【０１１９】
サトウキビバガスを、前処理の前に、１ｍｍスクリーンを通してウィリーナイフミル中でミルにかけた。
【０１２０】
以下の略語が実施例において用いられている：「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーであり、「Ｃ」は摂氏温度または摂氏であり；「％」はパーセントであり；「ｗｔ」は重量であり；「ｗ／ｗ」は重量に対する重量であり；「ｍＬ」はミリリットルであり；「ＯＤ」は外径であり；「ＩＤ」は内径であり；「ｈ」は時間であり；「ｒｐｍ」は１分間当たりの回転数であり；「ＥｔＯＨ」はエタノールであり；「ｍｇ／ｇ」はミリグラム／グラムであり；「ｇ／１００ｍＬ」はグラム／１００ミリリットルであり；「Ｎ」はノルマルであり；「ｇ」はグラムであり；「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり；「ｗ／ｖ」は体積当たりの重量であり；「ｖ／ｖ」は体積に対する体積であり；「ＮＨ３」はアンモニアであり；「ｍｍ」はミリメートルであり；「ｍＬ／ｍｉｎ」はミリリットル／分であり；「ｍｉｎ」は分であり；「ｍＭ」はミリモルである。
【０１２１】
材料
硫酸、水酸化アンモニウム、酢酸、アセトアミド、イースト菌抽出物、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸カリウム、グルコース、キシロース、トリプトン、塩化ナトリウム、クエン酸、モノメチルおよびジメチルアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ１２ＬはＧｅｎｅｃｏｒ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）製であると共に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８はＮｏｖｏｚｙｍｅ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製であった。
【０１２２】
実施例１
有効なエタノール濃度
この実施例の目的は、ｐＨ制御の不在下での、炭水化物の回収およびリグニンの可溶化／抽出に対する水中の溶剤（例えば、エタノール）の濃度の影響を試験することであった。バガス（０．２ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、種々の濃度（０〜８０％）のＥｔＯＨを含有する１．５６ｍＬのＥｔＯＨ／水溶液中に懸濁させた。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼管（１／４インチＩＤ、３／８インチＯＤ、４インチ長）に仕込み、Ｓｗａｇｅｌｏｃｋ取付け部品（Ｐｅｎｎ Ｆｌｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）でキャップをした。これらを流動砂浴（Ｔｅｃｈｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＳＢＳ−４，Ｔｅｃｈｎｅ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）に入れ、１８０℃で２時間加熱し、および、室温の水浴へのプランジングにより急速に冷却した。サンプルをチューブから取り出し、Ｓｐｉｎ−Ｘフィルタ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）を用いて、室温で、卓上遠心機（Ｓｐｅｃｔｒｉｆｕｇｅ １６Ｍ，Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中で１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによりろ過して溶解リグニンを除去した。各サンプルの濃縮水を、１８０℃処理（０〜８０％Ｈ２Ｏ中のＥｔＯＨ）で用いたものと同一のＥｔＯＨ濃度を用いて、０．５ｍＬのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで洗浄した（４×）。次いで、サンプルを室温で空気乾燥させる（約９２％乾燥物質以下）と共に、残渣のグルカン、キシランおよび酸不溶性リグニン内容物をＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）手法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｌｉｇｎｉｎ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ−２００６年度版，Ａｍｉｅ Ｓｌｕｉｔｅｒら、ＮＲＥＬウェブサイトから入手可能）を用いて測定した。
【０１２３】
その後の酵素糖化
上記で調製した空気乾燥されたサンプルを、５０ｍｍクエン酸緩衝剤に、ｐＨ４．６、約１４％固形分仕込み量で懸濁させた。糖化酵素、例えばＳｐｅｚｙｍｅ ＣＰ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ１２ＬおよびＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８を、それぞれ６：３：６ｍｇ／ｇセルロースの濃度で添加した。また、１％（ｗ／ｖ）ツイン２０および０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を添加し、ここで、後者は微生物性の増殖を防止するためである。サンプル（約０．４ｍＬ）を２個の５ｍｍガラスビーズを含むスクリューキャップバイアル中に入れると共に、２５０ｒｐｍで操作した回転振盪機で４６℃でインキュベートした。分析のために開始から４時間で、および、２４時間間隔毎にアリコートを採ると共に、０．０１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４で４１．２５倍に希釈した。次いで、サンプルをＳｐｉｎ−Ｘフィルタを通してろ過し、濾液をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｅｒｉｅｓ １１００／１２００，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）により分析した。ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ Ａｍｉｎｅｘカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ ９４５４７を用いて、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を移動相として用い、０．６ｍＬ／ｍｉｎの流量で遊離化された糖質を分割した。カラムは６０℃に維持した。示差屈折計を用いて溶出した糖質を検出し、これを５５℃に維持した。グルコース、キシロースおよびアラビノースの滞留時間は、それぞれ、９．０５、９．７２および１０．６３分であった。表１Ａは、０％〜８０％のＥｔＯＨ濃度での前処理後の、グルカンおよびキシラン回収割合、ならびに、酸不溶性（ＡＩ）リグニン含有量の割合変化を概説している。バガスの濃度は（０．２ｇ／１．５６ｍＭ）であり、様々な濃度のＥｔＯＨを１８０℃で２時間用いた。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
表１Ａに示されている結果は、ＥｔＯＨ含有量の増加と共にリグニン抽出が増加したことを示し、これは、おそらく、ＥｔＯＨ濃度の増加に伴うリグニンの溶解度の増加による。しかしながら、抽出されたリグニンの量は高いエタノール濃度であっても適度に維持された。
【０１２６】
ヘミセルロース加水分解およびキシロースオリゴ糖の溶解度はＥｔＯＨの増加と共に低減し、残渣中のキシランおよびキシロースオリゴ糖の回収率を高める。前処理によって遊離されたアセテートの量もまたＥｔＯＨ含有量の増加に伴って低減し、高いＥｔＯＨ濃度でのバイオマスの自己加水分解の低減と一致した。
【０１２７】
表１Ｂは、異なるＥｔＯＨ濃度での前処理後の酵素糖化９６時間後のグルコースおよびキシロース収率を示す。セルロースの糖化は、前処理におけるＥｔＯＨの濃度が０から２０％に増加した際に増加したが、次いで、ＥｔＯＨのより高い前処理濃度では低下した。リグニンおよびセルロースの部分的加水分解のあり得る低減（セルロースの重合度の増加であり、これがその後の糖化でのグルコース収率を低減させた−表１Ｂ）が２０％ＥｔＯＨ超の濃度で観察された。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
特にキシロースの全単糖回収率（表１Ｂ）は低いＥｔＯＨ濃度ではかなり劣っていた。前処理における低いＥｔＯＨ濃度では、高温でヘミセルロースのアセチル基の加水分解によりもたらされた酸性条件がヘミセルロースを加水分解する。可溶化されたキシロースおよびいくらかのグルコースが前処理の後に続くろ過および洗浄において損失される。より高いＥｔＯＨ濃度では、糖化収率を低下させる、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの部分的な加水分解は少ない。低および高エタノール濃度での挙動は、一緒になって、単糖グルコースおよびキシロースの低い全収率をもたらす。
【０１３０】
実施例２
リグニン抽出に対するアルカリ有機溶剤溶液前処理の効果
この実施例の目的は、炭水化物保存およびリグニン抽出、ならびに、その後の酵素糖化の最中の単糖に関して、異なるＨ２Ｏ中のＥｔＯＨ比での有機溶剤溶液前処理に対するｐＨを上げた影響を試験することであった。自己加水分解がｐＨを低下させ、キシランを加水分解し、および、キシロースの損失を促進させる場合、前処理のｐＨをＮａＯＨの添加によって高めた。より高いｐＨのキシロース回収率に対する影響が以下に実証されている。サトウキビバガス（０．２５ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、ＥｔＯＨ（水中に２０〜８０％）および８％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）＋１ｍｇアントラキノン（ＡＱ、リグニン断片化用の触媒）を含有する１．７５ｍＬの溶剤に懸濁させた。この溶液の初期のｐＨは約１３．７であった。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼管に仕込み、キャップをし、１６８℃で１４０分間処理し、および、室温の水中で冷却した。サンプルを圧力容器から取り出し、ろ過し、洗浄し、空気乾燥し、および、実施例１に上述されているとおりすべてを分析した。グルカン、キシラン、アラビナン含有量および前処理後のリグニン含有量の変化が表２Ａに示されている。
【０１３１】
その後の酵素糖化は、Ｓｐｅｚｙｍｅ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ１８８比が、１％ツイン２０（ｗ／ｖ）の存在下で１２：６：１．２ｍｇ／ｇ乾燥固形分であったこと以外は実施例１に記載のとおり実施した。表２Ｂは、予め異なるＥｔＯＨ濃度で前処理したバイオマスの９６時間の酵素糖化後の単糖収率を示す。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
【表４】
【０１３４】
表２Ａおよび２Ｂに見ることが可能であるとおり、この実験のアルカリ条件は、実施例１の自己加水分解実験と比して、前処理におけるキシランの保存を実質的に高めた。この効果は、低ＥｔＯＨ濃度で最も明白であった。ＮａＯＨは、溶液の酸性化を防止し（最終ｐＨ約１０．７）、従って、ヘミセルロースを酸触媒加水分解から保護した。加えて、顕著により多量のリグニンが抽出されたが、これは、おそらくは、リグニンの塩基触媒分別による。糖化後の単糖全収率は、実施例１において観察されたものよりも実質的に高かった。前処理におけるより高い糖質回収率およびより高いリグニン抽出がその後の酵素糖化の収率を高めた。キシロースおよびグルコース糖化収率は、すなわち、糖質収率を高める傾向にあるより高レベルのＥｔＯＨでのリグニンの抽出の増加、および、ＥｔＯＨ濃度のさらなる上昇に伴うヘミセルロースおよびリグニンの部分加水分解の低下といった２つの反対のプロセスの結果として、約４５％ＥｔＯＨで最高であった。糖質再重合させるかまたは糖質と反応することが可能であるキノンメチドの形成と、「ピーリング」と、多糖のアルカリ切断反応とが、すべて、一緒になって糖質全収率の制限の要因となる可能性が高い。
【０１３５】
実施例３
アンモニアの存在下での前処理後の糖化収率のさらなる増加
本実施例の目的は、前処理後の炭水化物収率およびリグニン含有量、ならびに、糖化後の単糖収率に対する有機溶剤溶液中におけるアンモニアの存在の影響を研究することである。ｐＨの上昇によりキシラン回収率が実質的に向上したが、実施例２に概説されているアルカリ前処理プロセスにおいては依然相当な糖質の損失が生じていた。これらの損失は、「ピーリング」、すなわち、多糖鎖の還元末端からの糖質のストリッピングによる可能性が高い。アルカリ条件下では自己加水分解と比してより効果的に加水分解されるが、リグニンは、再重合および還元糖との反応が可能であるキノンメチドを形成することも可能である。従って、ＮＨ３の有機溶剤溶液への添加の影響は、これらの現象の両方を防ぐ意図をもって試験した。
【０１３６】
サトウキビバガス（０．３７５ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、種々の割合のＥｔＯＨ（水中に０％〜７０％）を含有する１．１２５ｍＬの溶剤中に懸濁させた。加えて、この溶剤は、６％ＮＨ３および２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）を含有していた。この溶液の初期のｐＨは１３．２であったが、ＥｔＯＨ濃度の上昇に伴ってｐＨ１４．０に上がった。これらの条件を、８％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）を単独で含有するＨ２Ｏ中の７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）中に懸濁させた、初期のｐＨが１２．２であった同様のバガスサンプルと比較した。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼圧力容器（３／１６インチＩＤ、１／４インチＯＤ、４インチ長）に仕込み、キャップをすると共に、固形分仕込み量を高くし、サンプルを１６８℃で１４０分加熱したこと以外は実施例１に記載のとおり処理した。
【０１３７】
その後の酵素糖化は、Ｓｐｅｚｙｍｅ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ１８８比が、１％ツイン２０（ｗ／ｖ）の存在下で６．６８：３．３４：１．６７ｍｇ／ｇ乾燥固形分であったこと以外は実施例１に記載のとおり実施した。固形分仕込み量は１４重量％であった。
【０１３８】
表３Ａは、種々のＥｔＯＨ濃度での前処理の結果をまとめている。表３Ｂは、６％ＮＨ３＋２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）の存在下における異なるＥｔＯＨ濃度での前処理後の糖化９６時間後をまとめている。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
表３Ａおよび３Ｂに概要が示されている結果から、残渣における炭水化物回収率が、ＮａＯＨ単独の場合と比してアルカリアンモニア前処理においては実質的に増加していることが明らかである（実施例２）。加えて、低濃度ＮＨ３の添加は、Ｈ２Ｏ中のより高い濃度のＥｔＯＨ前処理条件で前処理されたサンプルの酵素糖化で、単糖グルコースおよびキシロース収率の両方の相当の増加をもたらす。これらの結果は、「ピーリング」反応の防止、もしくは、キノンメチドの濃度の低下、または両方に対するＮＨ３の役割と一致する。ＮＨ３の存在下での低濃度のＮａＯＨの存在下では、おそらくは、ＮａＯＨの存在下でのより高いｐＨではより多くのＮＨ３が脱プロトン化形態にあるために、前処理の効力が顕著に高められる。
【０１４２】
実施例４
アンモニアを含有する有機溶剤溶液前処理に対するメチルアミンおよび元素硫黄の添加の影響
アンモニアでの前処理を、添加した求核試薬と、メチルアミンと、前処理のアルカリ条件下では不均衡化を起こして多硫化物および硫化物を形成する元素硫黄との存在下で試験した。前処理を、バガスが１％元素硫黄（ｗ／ｗバイオマス）を含有し、１４％ＭＡ（メチルアミン）、７％ＮＨ３＋７％ＭＡ、１０％ＮＨ３＋４％ＭＡ、または、１４％ＮＨ３（すべてｗ／ｗバイオマス）のいずれかを＋Ｈ２Ｏ中の７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）の中に懸濁させたこと以外は実施例３のとおり実施した。サンプルを、１８７℃で１時間、圧力容器中で加熱し、次いで、水浴中にて室温に急速に冷却した。既述のとおり、残渣をろ過し、洗浄し、および、乾燥させた。酵素糖化を、実施例５のとおりであるが、０．５％ＰＥＧ２０００（ｗ／ｗバイオマス）の存在下および不在下で実施した。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
表９に示されているとおり、アンモニアのメチルアミンでの置換は前処理でのグルカンおよびキシラン回収率に影響を有さない。単糖グルコースおよびキシロースの両方に対する糖化収率は、しかしながら、アンモニアのメチルアミンでの置換が大量になるほど累進的に増加する（表４）。ＰＥＧ２０００を伴って行われる糖化と伴わずに行われる糖化との間の差異は、大部分において数パーセントのみである。前処理におけるアンモニアのメチルアミンでの置換、または、糖化におけるＰＥＧ２０００の添加での糖質生成のより高い収率が、ＭＡまたはＰＥＧの追加コストを相殺するかどうかを判定するためのプロセス全体の経済的分析が必要とされている。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１３９１７９号明細書の利益を主張し、その開示は、全体が参照により援用される。
【０００２】
容易に糖化可能な炭水化物富化リグノセルロースバイオマスを生成する方法が提供されていると共に開示されている。具体的には、前処理済バイオマスは、低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤が存在する、高温、アルカリ条件下での、有機溶剤溶液におけるリグニンの同時断片化および選択的抽出を介して調製される。次いで、前処理済バイオマス中に残留している炭水化物富化固形分が、酵素糖化に供されて発酵可能な糖質が得られ得、これが目標生成物の生成のためのさらなる加工に供され得る。
【背景技術】
【０００３】
農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙由来のスラッジ、ならびに、都市および産業固体廃棄物などのセルロース系およびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、化学薬品、プラスチック、燃料および飼料の製造のための潜在的に大きな再生可能原材料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびリグニンから構成されるセルロースおよびリグノセルロース系供給原料および廃棄物は、一般に、多様な化学的、機械的および酵素的手段により処理されて第１級ヘキソースおよびペントース糖質が遊離され、次いで、これが、有用な生成物に発酵されることが可能である。
【０００４】
度々、リグノセルロースバイオマスの多糖類を、セルロース分解酵素に対してより容易にアクセス可能とするために、前処理方法が用いられる。セルロース分解酵素消化に対する主な障害の一つは、酵素の基質に対するアクセスを制限するバリアおよび酵素が非生産的に結合する表面である、リグニンの存在である。酵素糖化に関連する相当のコストのために、酵素吸着に対するリグニンの非働化、または、その完全な抽出により、酵素の使用量を最低限とすることが望ましい。
【０００５】
他の課題は、ヘミセルロースおよびリグニンによる保護または結晶化度による保護による、酵素加水分解に対するセルロースの難アクセス性である。これらの課題の解決を試みる前処理方法としては：水蒸気爆発、熱水、希酸、アンモニア繊維爆発、アルカリ加水分解（アンモニア再利用パーコレーションを含む）、酸化脱リグニン化およびオルガノソルブが挙げられる。
【０００６】
リグノセルロースバイオマスの処理に既に実施されている、パルプの製造用またはバイオ燃料用途のためのオルガノソルブ法は、一般にリグニンの除去は良好である一方、特にキシロースといった糖質の回収率が低い。例えば、わずかに酸性のエタノール−水混合物（例えば、ＥｔＯＨ ４２重量％）を用いた高温でのリグノセルロースバイオマスからのリグニンの除去（非特許文献１）では、炭水化物の相当量の損失が生じてしまう。９５℃での希酸加水分解、これに続く、有機溶剤抽出および酵素糖化（非特許文献２）は、加水分解の最中にヘミセルロースの相当量の損失が生じ、有機溶剤抽出では追加で炭水化物の損失が生じてしまい、残渣の酵素糖化での収率は低い（総炭水化物の約５０％）。
【０００７】
気体状の水およびメチルアミンでのバイオマスの処理、これに続く、有機溶剤での抽出、および、次いで、水での抽出は、３つのステップを必要とし、炭水化物の相当量の損失が生じる（非特許文献３）。高温での水−脂肪族アルコール混合物と触媒との中でのポリアミンまたはエチルアミンでの処理では、高い液体／固形分比および低濃度のアルコールが必要とされ、特にキシランといった糖質の回収率が低くなってしまう（特許文献１）。水性アルカリ溶液中のチオグリコレートを用いた高温でのリグノセルロースバイオマスの処理、これに続く、熱水での洗浄では、アルカリ−金属水酸化物またはアルカリ土類水酸化物の使用が必要とされる。この方法では、無機イオンのコストのかかる廃棄、高重量％のチオグリコレート、および、大量の水の使用が必要とされる（特許文献２）。硫化物／ビ硫化物の存在下での高温での有機溶剤−水混合物での処理では高い溶剤／固形分比および高い硫黄含有量が必要とされ、炭水化物が相当量で損失される（特許文献３）。
【０００８】
リグノセルロースバイオマスを処理するための高濃度のアンモニアを含有する水性有機溶剤の高温の使用（非特許文献４）は、前処理における高い液体対固形分比を必要とし、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化をもたらす。
【０００９】
既に適用されている方法の追加の欠点としては、個別のヘキソースおよびペントース流（例えば希酸）、特にリグニン含有量が高い供給原料（例えば、サトウキビバガス、軟材）における不十分なリグニン抽出または抽出されたリグニンの多糖からの分離不足、廃棄生成物（例えば、酸または塩基の中和で形成される塩）の廃棄、ならびに、洗浄ステップにおける分解または損失による炭水化物の低い回収率が挙げられる。他の問題としては、エネルギーの高いコスト、設備投資、および、前処理触媒回収率、および、糖化酵素との非適合性が挙げられる。
【００１０】
バイオマス前処理の主な課題の一つは、低コストで効率的なプロセスを通じて、炭水化物の損失（セルロース＋ヘミセルロース）を最小限としつつ、リグニンの抽出または化学的中和（セルロース分解酵素の非生産的な結合に関して）を最大化することである。選択性が高いほど、前処理および酵素糖化の組み合わせに続く単糖の全収率が高い。
【００１１】
従って、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化を伴わずに、実質的により低い液体：固体比を前処理において用いると共に再使用可能な塩基を用いる単一ステッププロセスの開発に対する必要性が存在している。本開示がこの要求に対処する。本開示においては、１種以上の求核試薬の存在下において低濃度から中程度の濃度のアンモニアが、高温、アルカリ条件下でのリグニンの有機溶剤溶液−媒介断片化および選択的抽出に用いられる。この費用効率の高いプロセスは、リグニンを選択的に除去しながらバイオマスのヘミセルロース含有量を維持して、高度に酵素糖化されやすい炭水化物富化バイオマスを生成する。本明細書に記載のプロセスによって生成された前処理済バイオマスは、糖化の後に発酵可能な糖質（グルコース、ならびに、キシロース）をきわめて高い収率でもたらし、次いで、発酵の後に目標生成物（例えば、付加価値化学薬品および燃料）を高い収率でもたらす。驚くべきことに、低濃度から中程度の濃度のアンモニアの使用および１種以上の求核剤の存在が、特にヘミセルロースに関して、顕著に向上したリグニン断片化および抽出、ならびに、高い炭水化物保存をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，５９７，８３０Ａ号明細書
【特許文献２】米国特許第３，４９０，９９３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，３２９，２００Ａ号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎｅｒｔ，Ｔ．Ｎ．，Ｔａｐｐｉ，５７：９９〜１０２ページ，１９７４年
【非特許文献２】Ｌｅｅ，Ｙ−Ｈ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２９：５７２〜５８１ページ，１９８７年
【非特許文献３】Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｐ．およびＧｏｅｔｚ，Ｒ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２１３〜２１７ページ，１９９２年
【非特許文献４】Ｐａｒｋ Ｊ．−Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，６５：１８７〜２０５ページ，１９８８年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成する方法、および、特にヘミセルロースといった炭水化物を略量的に保存しつつ、リグニンをリグノセルロースバイオマスから選択的に抽出する方法を提供する。本方法は、リグノセルロースバイオマスを、低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤を含む有機溶剤溶液で、高温、アルカリ条件下で処理するステップを含む。前処理の後、バイオマスは、糖化酵素共同体でさらに処理されて、発酵可能な糖質を生成し得る。これらの糖質は、目標生成物を生成するためのさらなる加工ステップに供されてもよい。
【００１５】
従って、本発明は：
（ａ）リグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含むリグノセルロースバイオマスを提供するステップ；
（ｂ）水、乾燥バイオマスの重量を基準として約２％〜約２０％の量のアンモニア、および、１種以上の求核剤を含む有機溶剤溶液中に（ａ）のバイオマスを懸濁させて、アルカリ条件下にバイオマス−溶剤懸濁液を形成するステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約５分間〜約５時間、約１００〜２２０℃の温度に加熱して、リグニンを断片化させて、懸濁液中に溶解させるステップ；ならびに
（ｄ）（ｃ）における懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過して、溶解リグニンを除去し、ヘミセルロースが高度に保存された炭水化物富化バイオマスを生成するステップ
を含む、ヘミセルロースが高度に保存された炭水化物富化バイオマスを生成する方法を提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は：
（ａ）
１）リグニンおよび炭水化物を含む一定量のリグノセルロースバイオマス；
２）約４０％〜約７０％エタノールを水中に含む多成分溶剤溶液；
３）２％〜約２０％の量のアンモニア
４）および、１種以上の求核剤
を提供するステップ；
（ｂ）前記バイオマスに（ａ）の多成分溶剤溶液を接触させて溶剤−バイオマス混合物を形成するステップ；
（ｃ）密閉圧力容器中に溶剤−バイオマス混合物を入れ、（ｂ）の混合物を約１００℃〜約２２０℃の温度で約５分間〜約５時間加熱して、リグニンを断片化させて、溶剤中に溶解させるステップ
（ｄ）（ｃ）の溶解リグニンをろ過により除去するステップ；ならびに
（ｅ）残留物を有機溶剤で洗浄することにより、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生成するステップ
を含む、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生成するためのリグノセルロースバイオマスからリグニンを同時に断片化および選択的抽出する方法を提供する。
【００１７】
得られるバイオマスは高度に保存された炭水化物含有量を有し、例えば、炭水化物含有量は、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスと比してバイオマス炭水化物の８５％以上であり得る。より具体的には、本明細書に記載されているとおり、得られるバイオマスは、前処理前のバイオマス中に存在する炭水化物の量と比して、炭水化物の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、１００％が前処理後に保存されているよう、炭水化物富化される。さらに、結果的なヘミセルロース含有量は、本明細書に記載されているとおり、前処理前のバイオマス中に存在するヘミセルロースの量と比して、ヘミセルロースの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、１００％が前処理後に保存されているよう保存される。
【００１８】
特に好適な本発明の方法に用いられる供給原料としては、これらに限定されないが、スイッチグラス、古紙、製紙由来のスラッジ、トウモロコシ繊維、コーン穂軸、コーン包葉、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、干草、オオムギ、オオムギわら、稲わら、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の加工から得られる構成要素、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、動物堆肥、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
出願人らは、本開示において引用されているすべての文献の全内容を特定的に援用する。そうではないとの記載がない限り、すべての割合、部、比率等は重量当たりである。商標は大文字で表記されている。さらに、量、濃度、または他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または、好ましい上限値および好ましい下限値の列挙として記載されている場合、これは、範囲が別に開示されていない限りにおいて、任意の範囲上限または好ましい値と任意の範囲下限または好ましい値との任意の対から形成されるすべての範囲を特定的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が言及されている場合、他に明記されていない限りにおいて、この範囲は、範囲内の両端点、ならびに、すべての整数および少数を含むことが意図されている。本発明の範囲が、範囲の定義の際に言及されている特定の値に限定されることは意図されていない。
【００２０】
本発明は、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成してその後の酵素糖化ステップを促進させるために、バイオマスを処理するためのプロセスを提供する。高温、アルカリ条件下で、アンモニアの存在下で有機溶剤を用いてリグニンが同時に断片化および抽出される前処理ステップを含むプロセスが採用される。追加の求核試薬がさらなる有益性のために採用され得る。次いで、処理されたバイオマスは、ろ過および洗浄されて、可溶化されたリグニン、酢酸、アセトアミド、アルキルアミドおよび過剰量の試薬が除去され、次いで、糖化酵素共同体で消化されて、発酵可能な糖質が生成される。この糖質は、次いで、１種以上の目標生成物にさらに加工されてもよい。除去されたリグニンもまた、効率を高めるために、他の目的（エネルギーのための燃焼など）のためにさらに加工および利用され得る。
【００２１】
定義
以下の定義が本開示において用いられている。
温度に関して用いられる場合、「室温」および「周囲」とは、約１５℃〜約２５℃の任意の温度を指す。
【００２２】
「発酵可能な糖質」とは、目標生成物を生成するための発酵プロセスにおいて微生物によって炭素源として用いられることが可能である単糖およびいくらかの二糖を主に含む糖質含有物（いくらかの多糖類が存在していてもよい）を指す。「容易に発酵可能な糖質」とは、追加の高価な加工が不要であること、および／または、抑制因子または発酵に悪影響を及ぼし得る他の構成成分による障害が最低限で、発酵微生物が得られた糖質に接触することが可能であることを意味する。
【００２３】
「リグノセルロース」とは、リグニンおよびセルロースの両方を含む材料を指す。リグノセルロース材料はヘミセルロースをも含んでいてもよい。本明細書に記載のプロセスにおいて、リグニンは溶解されて、リグノセルロースバイオマスから実質的に除去されて炭水化物富化バイオマスが生成される。
【００２４】
「ヘミセルロース」とは、ほとんどすべての植物細胞壁中にセルロースと共に存在するヘテロポリマー分岐鎖炭水化物を指す。これは、ペントース糖質、キシロースから主に構成されているが、アラビノースによっても構成されており、頻繁にこれを通してリグニンにエステル化される。これはまた、６個の炭素を有するウロン酸およびいくつかのヘキソース糖質、グルコース、ガラクトース、マンノースおよびラムノースをも含有していることが可能である。ヘミセルロースは、強度がほとんどないランダムのアモルファス構造を有すると共に、希酸または塩基およびヘミセルラーゼ酵素によって容易に加水分解される。
【００２５】
本明細書において用いられるところ、「ヘミセルロースの高度の保存」とは、出発材料中に存在するヘミセルロースの≧８５％の保存を指す。
【００２６】
本明細書において参照される「溶解リグニン」は、有機溶剤溶液中に溶解されたリグニンを意味する。
【００２７】
「ＡＩリグニン」とは、酸不溶性リグニンを指す。
【００２８】
「自己加水分解」とは、外来性の酸もしくは塩基または加水分解酵素の添加などのさらなる添加を伴わない、溶剤（水、または、有機溶剤＋水）＋熱の存在下でのバイオマスの加水分解を指す。
【００２９】
「セルロース系」とは、セルロースを含む組成物を指す。
【００３０】
「目標生成物」とは、発酵によって生成される薬品、燃料または化学構築ブロックを指す。生成物は、広範に用いられると共に、例えば、ペプチド、酵素および抗体を含むタンパク質などの分子を含む。目標生成物の定義には、エタノールおよびブタノールが含まれることも意図されている。
【００３１】
「バイオマスの乾燥重量」とは、すべての水または実質的にすべての水が除去されたバイオマスの重量を指す。乾燥重量は、典型的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）規格Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｓｏｌｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ）またはＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．（ＴＡＰＰＩ）規格Ｔ−４１２ ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｉｎ Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に準拠して計測される。
【００３２】
「選択的抽出」とは、炭水化物が実質的に保存されるリグニンの除去を意味する。
【００３３】
本明細書において用いられるところ、「溶剤溶液」および「有機溶剤溶液」は、固体、液体または気体の溶質を溶解して溶液をもたらす任意の有機液体を含む水中の有機溶剤混合物である。本発明のために最も好適な溶剤溶液は、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、ならびに、炭素数が同一であるジオールなどの有機溶剤である。これらはまた、非プロトン性溶剤をも含んでいることが可能である。溶剤溶液は、溶液との混合物で追加の成分を含んでいることが可能であり、例えば、溶剤溶液は１種以上の求核剤を含んでいてもよい。
【００３４】
本明細書において用いられるところ、「バイオマス」および「リグノセルロースバイオマス」とは、例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、庭園廃棄物、木材、林業廃棄物およびこれらの組み合わせ、ならびに、以下にさらに記載されているものといった、セルロース系およびヘミセルロース系材料を含む任意のリグノセルロース材料を指す。バイオマスは、多糖類およびオリゴ糖を含む炭水化物含有物を有すると共に、タンパク質および／または脂質などの追加の成分をも含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書において用いられるところ、「高度に保存された」とは、本明細書に記載の加工ステップ後のリグノセルロース材料の炭水化物含有量を指す。発明の一実施形態において、高度に保存された炭水化物含有量は、本明細書に記載のプロセスによる糖質収率の損失を最低限として理論収率と実質的に同様である糖化後の糖質収率を提供する。発明の一実施形態において、炭水化物含有量に関して高度に保存されたとは、本明細書に記載の前処理に先立つバイオマスと比してバイオマス炭水化物の８５％以上の保存を指す。
【００３６】
本明細書において用いられるところ、「プレ加工」とは、前処理に先立つリグノセルロースバイオマスの加工を指す。プレ加工は、機械的粉砕および／または適切な水分接触への乾燥などの前処理用のバイオマスを調製するバイオマスの任意の処理である。
【００３７】
「バイオマス−溶剤懸濁液」とは、バイオマスと溶剤との混合物を指す。バイオマス−溶剤溶液は、１種以上のアルキルアミン、チオグリコレート、アンモニア、硫化物等などの追加の成分を含んでいてもよい。
【００３８】
「糖化」とは、加水分解酵素の作用による主に多糖類からの発酵可能な糖質の生成を指す。前処理済バイオマスからの発酵可能な糖質の生成は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素の作用による酵素糖化によって生じる。
【００３９】
本明細書において用いられるところ、「バイオマスを前処理する」または「バイオマス前処理」とは、自然のまたは前加工されたバイオマスを化学的もしくは物理的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供して、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与えることを指す。例えば、本明細書において特許請求されている方法は、バイオマスを糖化のために加水分解酵素に対してよりアクセス可能とするための前処理プロセスとして称され得る。
【００４０】
「前処理濾液」とは、前処理後にバイオマスに接触していると共にろ過によって分離される自由液体を意味する。
【００４１】
本明細書において用いられるところ、「前処理済バイオマス」とは、酵素糖化に対する、または、糖化に先立つ他の加水分解手段に対するより高い感度をバイオマスに与える、化学的あるいは物理的作用、または、いずれかのこれらの組み合わせに供された自然のまたは前加工されたバイオマスを指す。
【００４２】
「ろ過されたバイオマスを空気乾燥するステップ」は、バイオマスを周囲雰囲気の空気との平衡を介して乾燥させることにより実施されることが可能である。
【００４３】
「容易に糖化可能なバイオマス」とは、炭水化物富化されていると共に、単糖およびオリゴ糖の生成のためにセルロースまたはヘミセルロース分解酵素によってより加水分解されやすくされたバイオマス、すなわち、本明細書に記載の前処理済バイオマスを意味する。
【００４４】
本明細書において用いられるところ、「炭水化物富化された」とは、本明細書に記載のプロセス処理により生成されるバイオマスを指す。一実施形態において、本明細書に記載のプロセスにより生成された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、乾燥重量を基準として出発バイオマスリグニン含有量の７５％以上が除去されていつつも、乾燥されたバイオマスの８５重量％以上の炭水化物濃度を有する。
【００４５】
「バイオマス懸濁液を加熱するステップ」とは、溶剤中に懸濁されたバイオマスを周囲温度または室温を超える温度に供するステップを意味する。本前処理に関連する温度は、約１００〜約２２０℃、または、約１４０〜約１８０℃、または、これらの範囲内の任意の温度またはおよそこれらの範囲の任意の温度である。
【００４６】
「自由液体を加圧下にろ過するステップ」とは、フィルタの両面にいくらかの圧力差をかけたろ過をとおした自由液体の除去を意味する。
【００４７】
「アルカリ」または「アルカリ条件下」とは、７．０を超えるｐＨを意味する。本発明においては、「アルカリ条件下」とはまた、実質的に脱プロトン化されると共に、プロトン化状態にあるよりも高度に反応性であるよう、存在する求核試薬のｐＫａ以上のバイオマス−溶剤懸濁液のｐＨを意味する。これらの求核試薬は、アルキルアミン、および、アンモニア、チオール、多硫化物および水硫化物（存在する場合）を含むであろう。
【００４８】
「二価アルカン」とは、２の満たされていない原子価を有する直鎖、分岐または環式アルカンを意味する。
【００４９】
「炭水化物含有量」とは、グルカン、キシランおよびアラビナンに起因するリグノセルロースバイオマスサンプルの乾燥物質の割合を意味し、セルロースおよびヘミセルロース由来の炭水化物を含む。
【００５０】
「炭水化物含有量を実質的に保存する」とは、リグノセルロースバイオマスに適用される前処理プロセスにおける、最大量（例えば、元の含有量の≧８５％）のグルカン、キシランおよびアラビナンの各々の保存を意味する。
【００５１】
「空気乾燥されたサンプル」とは、その含水量が、典型的には≧８５％乾燥物質といった、周囲空気の含水量と平衡となるような程度の周囲温度および圧力で空気乾燥された前処理されたサンプルを意味する。
【００５２】
「実質的にリグニンを含まないバイオマス」とは、リグニンの約≧７５％が除去された前処理されたサンプルを意味する。
【００５３】
「乾燥バイオマス」とは、≧８５％の乾燥物質含有量を有するバイオマスを意味する。バイオマスの乾燥方法は、周囲温度での減圧への露出もしくは周囲温度での大気圧下での空気流への露出、および／または、オーブンもしくは真空オーブン中での加熱を含む。
【００５４】
「多成分溶剤」とは、有機溶剤、水、および、リグニンを化学的に攻撃可能な試薬を含有する溶剤を意味する。
【００５５】
「圧力容器」は、バイオマス／溶剤懸濁液を攪拌するための機構を備えていてもいなくてもよい、リグノセルロースバイオマスの加熱時に正圧がかけられる密閉容器である。
【００５６】
「求核剤」は、結合電子の両方を与えることによりその反応相手と共有結合を形成することが可能である化学薬品である。
【００５７】
「加水分解物」とは、バイオマスに作用する（酵素的にまたは非酵素的に）加水分解反応の生成物を含有するリグノセルロースバイオマスに接触している液体を指し、この場合単糖およびオリゴ糖を指す。
【００５８】
「オルガノソルブ」とは、典型的にはバイオマスに接触していると共に、リグニンまたはその断片が可溶性である有機溶剤と水との混合物を意味する。
【００５９】
「酵素共同体」または「糖化酵素共同体」は、通常微生物によって分泌される一群の酵素であって、これは、本事例においては、典型的には、１種以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼを含有するであろう。
【００６０】
「単糖」または「単純な糖質」は、単一のペントースまたはヘキソースユニット、例えば、グルコース、キシロースおよびアラビノースから構成される。
【００６１】
「脱リグニン化」は、リグノセルロースバイオマスからリグニンを除去する操作である。本出願の文脈において、脱リグニン化は、高温、アルカリ条件下で、アンモニアおよび任意により種々の求核試薬の存在下に有機溶剤を用いる、特にヘミセルロースに関して、炭水化物が高度に保存されているリグノセルロースバイオマスからのリグニンの断片化および抽出を意味する。
【００６２】
「断片化」は、リグノセルロースバイオマスをアルカリ条件下に有機溶剤で処理して、リグニンをより小さなサブユニットに分解するプロセスである。
【００６３】
「選択的抽出」は、断片化されたリグニンをアルカリ条件下での有機溶剤での処理により溶解させて、多糖を残留させるプロセスである。
【００６４】
本明細書において用いられるところ、「同時断片化および選択的抽出」とは、リグニン断片がバルクバイオマスから遊離されると直ぐに溶液に溶解するよう、有機溶剤において実施される断片化反応を指す。
【００６５】
ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するリグノセルロースバイオマスの前処理方法が提供されている。これらの方法は、リグノセルロースバイオマスの成分を、酵素糖化に対してよりアクセス可能に、または、受容可能にするための経済的なプロセスを提供する。前処理は、化学的もしくは物理的、または、前述のものの任意の組み合わせであることが可能である。本開示において、前処理は、ＮＨ３および、任意により、追加の塩基の存在下に実施される。有機溶剤の存在およびアルカリ条件が、リグニン断片化および除去、ならびに、炭水化物回収を補助する。
【００６６】
加えて、本開示に記載の方法は、前処理プロセスの最中の炭水化物の損失を最小限とすると共に、糖化における可溶化された（単糖＋オリゴ糖）の収率を最大限とする。
【００６７】
上記に開示されているとおり、本明細書に記載の方法は、以下に記載のとおり、リグノセルロース材料を低濃度から中程度の濃度のアンモニアおよび１種以上の求核剤を含む溶剤溶液で前処理して、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップを含む。
【００６８】
溶剤
本明細書に記載の方法は、バイオマスの前処理であって、具体的には、リグニンの断片化および抽出のための有機溶剤溶液の使用を含む。本方法において有用な溶剤は、技術分野においてオルガノソルブとして頻繁に言及されている（例えば、Ｅ．Ｍｕｕｒｉｎｅｎ（２０００年）Ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖ Ｐｕｌｐｉｎｇ，Ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ ｐｕｌｐｉｎｇ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｕｌｕ，３１４ページ；Ｓ．Ａｚｉｚ，Ｋ．Ｓａｒｋａｎｅｎ，Ｔａｐｐｉ Ｊ．，７２／７３：１６９〜１７５ページ，１９８９年；Ａ．Ｋ．ＶａｒｓｈｅｎｙおよびＤ．Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄ．Ｒｅｓ．，４７：３１５〜３１９ページ，１９８８年；Ａ．Ａ．ＳｈａｔａｌｏｖおよびＨ．Ｐｅｒｅｉｒａ，ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ １：４５〜６１ページ，２００６年；Ｔ．Ｎ．Ｋｌｅｉｎｅｒｔ，Ｔａｐｐｉ Ｊ．，５７：９９〜１０２ページ，１９７９年；ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを用いるパイロットスケールにまで進行したＫｌｅｉｎｅｒｔによるバイオ燃料用のオルガノソルブテクノロジーの実施が記載されている（国際公開第２００７１０５１２６９号パンフレット）、およびＸ．Ｐａｎ，Ｎ．Ｇｉｌｋｅｓ，Ｊ．Ｋａｄｌａ，Ｋ．Ｐｙｅ，Ｓ．Ｓａｋａ，Ｄ．Ｇｒｅｇｇ，Ｋ．Ｅｈａｒａ，Ｄ．Ｘｉｅ，Ｄ．ＬａｍおよびＪ．Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４：８５１〜８６１ページ，２００６年。実験規模ではあるが、アセトン／Ｈ２Ｏの使用が米国特許第４，４７０，８５１号明細書に記載されている。前処理技術に関するさらなる詳細は溶剤の使用に関すると共に、他の前処理は、Ｗｙｍａｎら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：１９５９，２００５年）；Ｗｙｍａｎら、（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：２０２６，２００５年）；Ｈｓｕ，（「Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ」，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ編，１７９〜２１２ページ，１９９６年）；ならびに、Ｍｏｓｉｅｒら，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．，９６：６７３，２００５年）に見出されることが可能である。本明細書においては溶剤がリグニンを除去するバイオマスの前処理のために用いられる。脱リグニン化は、典型的には、１６５〜２２５℃の温度、４：１〜２０：１の液体対バイオマス比、５０％有機溶剤（ｖ／ｖ）の液体組成物、および、０．５〜１２時間の反応時間で実施される。多数のモノ−およびポリヒドロキシ−アルコールが溶剤としてテストされた。エタノール、ブタノールおよびフェノールがこれらの反応に用いられている（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，６５：１８７〜２０５ページ，１９８８年）。
【００６９】
本方法におけるオルガノソルブまたは有機溶剤溶液前処理は、水および有機溶剤の混合物を温度、時間、圧力、溶剤対水比および固形分対液体比を含む選択された条件パラメータで含んでいてもよい。この溶剤は、特に限定されないが、アルコールおよび非プロトン性溶剤（ヒドロキシル基のように酸素に結合している水素原子、または、アミン基のように窒素に結合している水素原子、例えば、ケトン）を含んでいることが可能である。これらのアルコールは、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ヘキサンジオールなどの、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、ならびに、同数の炭素原子を有するその異性体およびジオールを含み得る。
【００７０】
本発明における溶液（すなわち水）中の溶剤の濃度は、約２〜約９０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約８５％または約２０％〜約８０％または約３０％〜約８０％またはより好ましくは約４０％〜約７０％（ｖ／ｖ）である。特に、本明細書における方法の一実施形態の目的に関して、約０％〜８０％（ｖ／ｖ）エタノール濃度のＨ２Ｏ混合物中のＥｔＯＨを試験し、および、４０〜７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する溶液が最も効果的であることが見出された。
【００７１】
アンモニア
アンモニアは低価格の試薬であり、それ故、バイオマス前処理に対する経済的な手段を提供する。アンモニアはまた、前処理の最中または前処理の後に前処理反応器に再利用されることが可能であり、それ故、追加の経済的な有益性を可能とする。アンモニアは液体相と気相とに分割されると共に、気体のアンモニアは、液体塩基よりも容易にバイオマス中に拡散することが可能であり、より低い濃度でより有効な前処理をもたらす。例えば、前処理の後、温度が糖化に好適な温度に下がるに伴って、アンモニアガスが任意により減圧下に遊離され得ると共に、再利用され得る。連続プロセスにおいて、アンモニアは連続的に再利用され得る。
【００７２】
一実施形態において、低濃度から中程度の濃度でのアンモニア前処理は、バイオマスにおける炭水化物回収率を高める。ＮＨ３は多糖鎖の還元末端とイミンを形成するため、この反応は、アルカリｐＨでの「ピーリング」を介した糖質の損失に関与するβ−脱離反応を阻害する可能性が高い。ＮＨ３はまた、ＥｔＯＨ濃度の上昇に伴って増加する可能性が高いリグニンのアンモノリシスを、ＮＨ４＋／ＮＨ３のｐＫａを下げる（ＮＨ３／ＮＨ４＋比を高める）ことにより後押しすることが可能である。この反応はまた、キノンメチドの形成を低減させ得る。低濃度から中程度の濃度のＮＨ３の添加の結果は、従って、Ｈ２Ｏ中のより高レベルのＥｔＯＨ前処理条件下でのグルカンおよびキシランの保存のさらなる増加である。
【００７３】
他の実施形態において、アンモニア（ＮＨ３）は、単独で、または、ＮａＯＨに追加して、溶剤溶液の追加の成分として用いられ得る。本方法において用いられるアンモニアの濃度は、最低でも、バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨをアルカリ性に維持するために十分な濃度であって、最大で、バイオマスの乾燥重量に対して、約１６重量％以下、または、約０％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％である。アンモニアのこの低い濃度は、本方法による前処理に十分である。ポプラの脱リグニン化のための高濃度のアンモニアとオルガノソルブ前処理との組み合わせの使用が報告されている（Ｐａｒｋ，Ｊ．−Ｋ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６５，１８７〜２０５ページ，１９８８年）。これらの実験は、前処理において高い液体対固形分比を適用する必要があると共に、ヘミセルロースの相当な損失およびセルロースの劣った酵素糖化をもたらす。
【００７４】
本明細書において実施例３に示されているとおり、アンモニアは、低濃度のＮａＯＨで補足された場合、特許請求の方法においてより効果的である。特に、本出願において開示されている低濃度から中程度の濃度でのアンモニアのアルカリの供給源としての使用は、すべての未反応アンモニアは容易に再利用可能であるため、ＮａＯＨの単独での使用に固有の廃棄問題を形成しない。
【００７５】
加えて、本開示に記載の方法は、前処理プロセスの最中の炭水化物の損失を最小限とするとし、糖化における可溶化された（単糖＋オリゴ糖）の収率を最大とする。
【００７６】
上記に開示されているとおり、本明細書に記載の方法は、リグノセルロース材料を以下に記載の成分を含む溶剤溶液で前処理して、ヘミセルロースを高度に保存している容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成するステップを含む。
【００７７】
溶剤溶液の追加の成分
一実施形態において、ＮａＯＨは溶剤溶液の追加の成分として採用され得る。ＮａＯＨは、特に、Ｈ２Ｏ溶剤溶液中のＥｔＯＨにおいて用いられ得、および、ＮａＯＨの使用は、さらなるリグニン断片化のためのアントラキノンなどの触媒の溶剤溶液への添加を含み得る。
【００７８】
ＮａＯＨは、少なくとも約０．５〜約２０％（ｗ／ｗバイオマス）である量など、種々の濃度で用いられることが可能である。より好適な濃度は、約１〜約１０％（ｗ／ｗバイオマス）を含む。最も好適な濃度は約２〜８％（ｗ／ｗバイオマス）である。水（ｖ／ｖ）中に２０〜８０％エタノールおよびリグニン断片化用の触媒として約０．５％アントラキノン（ＡＱ）（ｗ／ｖ）を含有する溶剤への約８％（ｗ／ｗバイオマス）ＮａＯＨの添加は、自己加水分解（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏのみの中で実施）と比して前処理におけるキシランの高い保存をもたらした。
【００７９】
本方法の実施形態は、２％〜２０％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）および０．５％〜８％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）と共に、２０〜８０％ｖ／ｖエタノールをＨ２Ｏ中に含む溶剤溶液を含む。最適な回収率は、サトウキビバガスについて、Ｈ２Ｏ中の４０〜７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）および６％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）および２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）で観察された。Ｈ２Ｏ中のＥｔＯＨの増加に伴う高いリグニン抽出が観察され、これは、溶剤極性の低下によるＨ２Ｏ中のＥｔＯＨの増加に伴うリグニン断片の高い溶解度および高いＮＨ３／ＮＨ４＋を反映している可能性が高い。ＮＨ３単独とは対照的なＮＨ３＋ＮａＯＨでのより高い酵素的糖質収率およびリグニン抽出は、前者における高いｐＨの結果である可能性が高く、これは、非プロトン化ＮＨ３のより高い濃度をもたらして、リグニンおよびヘミセルロースエステルリンケージのより顕著なアンモノリシス、前処理におけるＮａＯＨの存在下におけるＯＨ−のより高い濃度による増加した加水分解、および、ヘミセルロースアセチル基の加水分解によるｐＨ低下の低減をもたらす。
【００８０】
本方法によれば、アンモニアを含む有機溶剤溶液は、任意により、水酸化ナトリウム（上述のとおり）、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムなどの少なくとも１種の追加の（無機）塩基を含み得る。少なくとも１種の追加の塩基は、アンモニアと組み合わされて、バイオマス乾燥重量に対して約２０重量％未満である一定量の総塩基を形成する量で添加され得る。好ましくは、全１種の追加の塩基＋アンモニアは、バイオマスの乾燥重量に対して。約２０％未満、または、約０％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８あるいは２０％である量である。
【００８１】
無機塩基は、少なくとも０．５％〜約１６％（乾燥バイオマスの重量％）の種々の濃度で用いられることが可能である。１％〜１０％の濃度がより好適である。２％〜８％の濃度が最も好適である。
【００８２】
リグノセルロースバイオマス
本明細書において前処理されるリグノセルロースバイオマスとしては、特に限定されないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙由来のスラッジ、庭園廃棄物、木材および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、これらに限定されないが、コーン穂軸、コーン包葉などの作物残渣、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、干草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の粉砕から得られる構成要素、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、ならびに、動物堆肥が挙げられる。
【００８３】
一実施形態においては、リグノセルロースバイオマスとしては、コーン葉茎、コムギわら、オオムギわら、カラスムギわら、稲わら、アブラナわらおよびダイズ葉茎などの農業残渣；スイッチグラス、茅、コードグラスおよびクサヨシなどの草；トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプミル微細繊維およびパルプミル廃棄物ならびにサトウキビバガスなどの繊維加工残渣；サトウキビわらおよびモロコシ；ユリノキ、ハコヤナギ材、他の硬材、軟材およびおがくずなどの林業廃棄物；ならびに、消費後の紙製品；ならびに、他の作物または十分に豊富に存在するリグノセルロース材料が挙げられる。
【００８４】
他の実施形態において、本発明に有用であるバイオマスは、比較的高い炭水化物含有量を有し、比較的高密度であり、および／または、収集、輸送、保管および／または取扱が比較的容易であるバイオマスを含む。
【００８５】
本発明の他の実施形態において、有用であるバイオマスとしては、コーン穂軸、コーン葉茎、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキおよびスイッチグラスが挙げられる。
【００８６】
リグノセルロースバイオマスは、単一の供給源に由来し得、または、２つ以上の供給源に由来する混合物を含んでいることが可能であり；例えば、バイオマスは、コーン穂軸およびコーン葉茎の混合物、または、幹もしくは茎および葉の混合物を含んでいることが可能である。
【００８７】
本方法において、バイオマス乾燥重量は、前処理の最中、バイオマス−溶剤懸濁液の重量の少なくとも約９％〜約８０％以下の初期濃度である。より好適には、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−溶剤懸濁液の重量の約１５％〜約７０％、１５％〜約６０％、または、約１５％〜約５０％の濃度である。バイオマス−溶剤懸濁液中のバイオマスの割合は、前処理材料の総体積を低減して、必要とされる溶剤および試薬の量を少なくすると共にプロセスをより経済的とするために高く維持される。
【００８８】
バイオマスは、供給源から入手されたまま直接的に用いられてもよく、または、何らかの前加工に供されてもよく、例えば、エネルギーがバイオマスに適用されて、サイズが低減され、露出表面積が高められ、および／または、本方法の第２のステップおよび第３のステップにおけるオルガノソルブ前処理および用いられる糖化酵素のそれぞれに対するバイオマス中に存在するリグニンのアクセス性ならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性が高められる。サイズを減少させるために、露出表面積を高めるために、および／または、オルガノソルブ前処理および糖化酵素に対するバイオマス中に存在するリグニンならびにセルロース、ヘミセルロースおよび／またはオリゴ糖のアクセス性を高めるために有用なエネルギー手段としては、これらに限定されないが、ミリング、破砕、研削、寸断、細断、ディスク精砕、超音波、およびマイクロ波が挙げられる。エネルギーの適用は、前処理の前もしくは最中、糖化の前もしくは最中、または、いずれかのこれらの組み合わせで行われ得る。
【００８９】
前処理に先立つ乾燥ステップは、周囲温度での減圧もしくは大気圧での空気流への露出、および／または、大気圧のオーブンまたは真空オーブン中での加熱などの従来の手段によっても行われ得る。
【００９０】
前処理条件
アンモニアと、１種以上の求核剤とを含む有機溶剤溶液でのバイオマスの前処理は、アルカリ条件下で、任意の好適な容器中で実施される。典型的には、容器は、圧力に耐えることが可能であり、加熱のためのメカニズムを有し、および、内容物を混合するためのメカニズムを有するものである。市販されている容器としては、例えば、Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ（登録商標）反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡ）、Ｊａｙｇｏ反応器（Ｊａｙｇｏ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）、ならびに、スチームガン反応器（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡに記載されている）が挙げられる。同様の機能を有するより大規模の反応器が用いられ得る。あるいは、バイオマスおよびオルガノソルブ溶液を１つの容器中に組み合わせ、次いで、他の反応器に移してもよい。また、バイオマスは、１つの容器中で前処理され得、次いで、さらに、スチームガン反応器（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｅｒｉｅ，ＰＡに記載されている）などの他の反応器中でプロセスされ得る。
【００９１】
前処理反応は、バッチ式反応器または連続式反応器などの任意の好適な容器で実施され得る。当業者は、より高い温度（１００℃超）、圧力容器が要求されることを認識するであろう。好適な容器は、バイオマス−オルガノソルブ混合物を攪拌するためのインペラなどの手段を備えていてもよい。反応器設計は、Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｈ．およびＶａｎ Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．およびＣｈｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．（編），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第５版（１９７３年）チャプター４，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ）において考察されている。この前処理反応は、バッチまたは連続プロセスのいずれかとして実施され得る。
【００９２】
バイオマスに溶剤を接触させる前に、バイオマスを含有する容器を減圧してもよい。バイオマスの細孔から排気することにより、バイオマスへの溶剤のより良好な浸透が達成され得る。減圧を適用する時間およびバイオマスに適用される負圧の程度はバイオマスのタイプに依存することとなり、バイオマスの最適な前処理（糖化後の発酵可能な糖質の生成により測られる）が達成されるよう経験的に判定可能である。
【００９３】
溶剤とのバイオマスの加熱は、約１００℃〜約２２０℃、約１５０℃〜２００℃または約１６５℃〜約１９５℃の温度で実施される。加熱された溶液は室温に急速に冷却され得る。さらに他の実施形態において、バイオマスの加熱は、約１８０℃の温度で実施される。バイオマス−溶剤懸濁液の加熱は、約５分間〜約５時間、または、約３０分間〜約３時間、または、より好ましくは約１〜２時間行われ得る。
【００９４】
有機溶剤溶液およびアンモニアでのバイオマスの前処理は、存在する求核試薬のｐＫａ以上であるｐＨでのアルカリ条件下で行われる。これらの高ｐＨ条件下では、求核試薬の少なくとも５０％が脱プロトン化された状態にある。脱プロトン化は、典型的には、求核試薬の反応性を高める。アンモニアに追加して、存在する求核試薬は、アルキルアミン、多硫化物（ヒドロ多硫化物）および硫化物（水硫化物）、ならびに、チオールを含むことが可能である。
【００９５】
本明細書に記載の前処理方法について、温度、ｐＨ、前処理時間、ならびに、有機溶剤およびアンモニアおよび追加の求核剤などの反応体の濃度、バイオマス濃度、バイオマスタイプ、ならびに、バイオマス粒径が関連しており；それ故、これらの可変要素は、バイオマスのタイプの各々について必要に応じて調整されて、本明細書に記載の前処理プロセスを最適化してもよい。
【００９６】
高温での前処理の後、バイオマスは加圧下でろ過される。冷却はろ過の前に行われても行われなくてもよい。ろ過に続いて、バイオマスは、水和有機溶剤で、高温または周囲温度で１回以上洗浄され得る。これは、次いで、水で洗浄されるか、または、乾燥されて有機溶剤が除去され得、次いで、糖化される。バイオマスを乾燥させる方法は上に記載された。
【００９７】
前処理（すなわち、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスの生成およびその後の糖化）の性能を個別にまたは一緒に評価するために、出発バイオマスから誘導可能な糖質の理論収率が判定されると共に、実測した収率と比較されることが可能である。前処理性能が、酵素の仕込み量がどのように全体的な系性能における目標生成物の収率に影響するかを関連付けることによりさらに評価され得る。
【００９８】
さらなるプロセス
糖化
前処理の後、容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、有機溶剤の混合物、アンモニア、求核剤、断片化および抽出されたリグニン、ならびに、多糖類を含む。さらなる加工ステップに先立って、アンモニア、求核剤およびリグニン断片は、サンプルのろ過およびＨ２Ｏ中のＥｔＯＨ（０％〜１００％ＥｔＯＨ ｖ／ｖ）での洗浄により、前処理済バイオマスから除去され得る。バイオマスは、水で洗浄されてＥｔＯＨが除去されるか、または、乾燥されて炭水化物富化された、容易に糖化可能なバイオマスがもたらされてもよく、また、前記バイオマスのグルカン、キシランおよび酸不溶性リグニン含有物の濃度が技術分野において周知である分析手段を用いて測定されてもよい。これは、前処理済バイオマスは水で洗浄されるか、または、糖化のために乾燥されることが可能であるという、本発明の現実的な有益性である。ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、次いで、糖化酵素共同体の存在下でさらに加水分解されて加水分解物中のオリゴ糖および／または単糖が遊離され得る。
【００９９】
ツイン２０もしくはツイン８０、または、ＰＥＧ２０００、４０００あるいは８０００などのポリオキシエチレンなどの界面活性剤が添加されて、糖化プロセスが向上され得る（米国特許第７，３５４，７４３ Ｂ２号明細書、参照により本明細書において援用される）。酵素糖化への界面活性剤（例えば、ツイン２０）の添加は、度々、単糖遊離の速度および収率を促進させる。界面活性剤がいずれかの残存するリグニンを覆って、酵素のリグニンに対する非生産的な結合を低減させている可能性が高い。代わりのアプローチは、前処理におけるリグニンの抽出を促進させるか、または、リグニン吸着に対する酵素の損失が抑えられるようリグニンを化学的に変性させることである。
【０１００】
糖化酵素およびバイオマス処理方法が、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ら，（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）において概説されている。糖化酵素共同体は、１種以上のグリコシダーゼを含み得；グリコシダーゼは、セルロース加水分解グリコシダーゼ、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼおよびデンプン加水分解グリコシダーゼからなる群から選択され得る。糖化酵素共同体中の他の酵素は、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼを含み得る。
【０１０１】
糖化酵素共同体は、排他的ではないが、二糖、オリゴ糖および多糖類のエーテル結合を加水分解する群「グリコシダーゼ」から主に選択される１種以上の酵素を含み、これらは、一般的な群「加水分解酵素」（ＥＣ３）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，追補１（１９９３年）、追補２（１９９４年）、追補３（１９９５年、追補４（１９９７年）および追補５［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１〜５ページ，１９９４年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１〜６ページ，１９９５年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１〜５ページ，１９９６年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１〜６ページ，１９９７年；ならびに、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０〜６５０ページ，１９９９年］）に見出される。本方法において有用なグリコシダーゼは、これらによって加水分解されるバイオマス成分によって分類されることが可能である。本方法に有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、および、デンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。加えて、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素共同体の他の活性を追加して、バイオマスの他の成分からの多糖類の遊離を補助することが有用であり得る。多糖加水分解酵素を産生する微生物は、度々、セルロース分解などの活性を示し、これは、異なる基質特異性を有する数々の酵素または酵素の群によって触媒されることが技術分野において周知である。それ故、微生物由来の「セルラーゼ」は、そのすべてがセルロース−分解活性に寄与し得る酵素の群を含み得る。商業的なまたは非商業的なセルラーゼなどの酵素調製は、酵素の入手に利用される精製スキームに応じて数多くの酵素を含み得る。それ故、本方法の糖化酵素共同体は、「セルラーゼ」などの酵素活性を含み得るが、しかしながら、この活性は、２種以上の酵素によって触媒されていてもよいことが認識されている。
【０１０２】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）などの単離された形態で商業的に入手され得る。加えて、糖化酵素は、組み換え型微生物の使用を含む、バイオ燃料植物で宿主生物中に発現され得る。
【０１０３】
当業者は、どのように、共同体において用いられる酵素の有効量を決定し、最適な酵素活性のための条件を調整するかを知っているであろう。当業者はまた、どのように、共同体内で必要とされる酵素活性のクラスを最適化して、選択された条件下で所与の前処理生成物の最適な糖化を達成するかを知っているであろう。
【０１０４】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素に最適な温度およびｐＨで、またはその付近で実施される。本方法において糖化酵素共同体と共に用いられる至適温度は、約１５℃〜約１００℃の範囲である。他の実施形態において、至適温度は、約２０℃〜約８０℃および最も典型的には４５〜５０℃の範囲である。至適ｐＨは約２〜約１１の範囲であることが可能である。他の実施形態において、本方法において糖化酵素共同体と共に用いられる至適ｐＨは約４〜約５．５の範囲である。
【０１０５】
糖化は、約数分間〜約１２０時間、および、好ましくは約数分間〜約４８時間の時間で実施されることが可能である。反応時間は、酵素濃度および特定の活性、ならびに、用いられた基質、その濃度（すなわち、固形分仕込み量）、ならびに、温度およびｐＨなどの環境条件に応じることとなる。当業者は、特定の基質および糖化酵素共同体と共に用いられるべき温度、ｐＨおよび時間の最適な条件を容易に決定することが可能である。
【０１０６】
糖化は、バッチ式でまたは連続プロセスとして実施されることが可能である。糖化はまた、一つのステップで、または、多数のステップで実施されることが可能である。例えば、糖化に必要とされる異なる酵素は、異なる至適ｐＨまたは至適温度を示し得る。第１の処理は、一つの温度およびｐＨで酵素と共に実施され、続いて、第２または第３（または、それ以上）の処理が、異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素と共に実施されることが可能である。加えて、逐次的ステップにおける異なる酵素での処理は、より高いｐＨおよび温度で安定であると共により活性であるセルラーゼの使用、これに続く、より低いｐＨおよび温度で活性であるヘミセルラーゼの使用など、同一のｐＨおよび／または温度であり得、または、異なるｐＨおよび温度であり得る。
【０１０７】
糖化後のバイオマスからの糖質の可溶化度は、単糖およびオリゴ糖の遊離を計測することにより監視されることが可能である。単糖およびオリゴ糖の計測方法は技術分野において周知である。例えば、還元糖の濃度は、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２６〜４２８ページ，１９５９年）を用いて測定することが可能である。あるいは、糖質は、以下に記載のとおり適切なカラムを用いるＨＰＬＣにより計測することが可能である。
【０１０８】
目標生成物への発酵
本方法によって生成される、ヘミセルロースが高度に保存された容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスは、上記のとおり、酵素によって加水分解されて発酵可能な糖質を生成し得、次いで、これが、目標生成物に発酵されることが可能である。「発酵」とは、任意の発酵プロセスまたは発酵ステップを含む任意のプロセスを指す。目標生成物としては、特に限定されないが、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸、およびキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン、およびスレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および一酸化炭素（ＣＯ））が挙げられる。
【０１０９】
発酵プロセスはまた、飲用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳製品産業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業、およびタバコ産業において用いられるプロセスを含む。
【０１１０】
上記に加えて、本明細書に記載の前処理済バイオマスの糖化により生成された糖質は、普通、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、および、動物飼料などの有機製品、化学薬品、燃料、汎用および特殊化学薬品の製造に用いられ得る（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｂｉｏｃｏｍ．Ｅｎｇ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１５：７７７〜７９３ページ，１９９９年；およびＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９〜２１２ページ，１９９６年；ならびに、Ｒｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．およびＭａｎｄｅｌｓ，Ｍ．，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２：９１〜１０２ページ，１９８０年）。
【０１１１】
発酵可能な炭水化物由来の複数の有機生成物などの生成物の潜在的な同時生産もまたもたらされ得る。前処理および発酵の後に残留する富リグニン残渣はリグニン−由来の化学薬品、化学構築ブロックに転化されるか、または、発電に用いられることが可能である。
【０１１２】
発酵および／または糖化の従来の方法は技術分野において公知であり、特にこれらに限定されないが、糖化、発酵、個別の加水分解および発酵（ＳＨＦ）、同時糖化および発酵（ＳＳＦ）、同時糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）、ハイブリッド加水分解および発酵（ＨＨＦ）、および直接微生物性転換（ＤＭＣ）を含む。
【０１１３】
ＳＨＦは、先ず、セルロースをグルコースおよびキシロースなどの糖質に酵素加水分解し、次いで、糖質をエタノールに発酵する個別のプロセスステップを用いる。ＳＳＦにおいて、セルロースの酵素的加水分解およびグルコースのエタノールへの発酵は一つのステップに組み合わされている（前述のＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．）。ＳＳＣＦは、複数種の糖質の共発酵を含む（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｊ．およびＨｉｍｍｅｌ，Ｍ．，Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：８１７〜８２７ページ，１９９９年）。ＨＨＦは、異なる温度、すなわち、高温酵素糖化とこれに続く発酵菌株が許容することが可能であるより低い温度でのＳＳＦで実施される同一の反応器内での２つの異なるステップを含む。ＤＭＣは、すべての３つのプロセス（セルラーゼ生成、セルロース加水分解および発酵）を一つのステップに組み合わせる（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｅｉｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ Ｚｙｌ，Ｗ．Ｈ．およびＰｒｅｔｏｒｉｕｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７ページ，２００２年）。
【０１１４】
これらのプロセスは、本明細書に記載の前処理方法により生成された、ヘミセルロースが高度に保存された、炭水化物富化バイオマスから目標生成物を生成するために用いられ得る。
【０１１５】
本方法の利点
低濃度から中程度の濃度のアンモニアと組み合わされる、高温、アルカリ条件下でのリグニンの断片化および選択的抽出を用いるリグノセルロースバイオマスの前処理のための本発明に記載の方法は、顕著に向上したリグニン断片化、および、特にヘミセルロースといった炭水化物の高度の保存をもたらし、それ故、酵素糖化のための炭水化物富化バイオマスを得る経済的なプロセスを提供する。次いで、このようなバイオマスは、付加価値化学薬品および燃料への生物変換のための、発酵可能な糖質（グルコース、ならびに、キシロース）のきわめて高い収率をもたらす。
【０１１６】
現在のオルガノソルブプロセスの重要な欠点のうち、文献に記載されているものは以下のとおりである：前処理後の特にキシロースといった炭水化物の低い回収率、個別のヘキソース流およびペントース流の必要性、糖質分解生成物の生成、大量の溶剤の使用、ならびに、高い資本経費。例えば、一定の既存のプロセスは、ヘミセルロースおよびセルロースの加水分解物をもたらす酸性オルガノソルブ条件の使用を含む。酸性条件下でのヘミセルロースの大きい易変性は、単糖キシロースの分解生成物（例えばフルフラール）の形成をもたらし、キシロースの回収率を大きく低下させる（前述のＰａｎら）。このプロセスの一態様（Ａｒａｔｏ，Ｃ．，Ｐｙｅ，Ｅ．Ｋ．およびＧｊｅｎｎｅｓｔａｄ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２１−１２４：８７１〜８８２ページ，２００５年）においては、ヘミセルロースが酸性条件下で加水分解されると共に、セルロースが、中和の後、酵素加水分解される。糖化の前に酸を中和させる必要性、キシロースの部分的損失、ならびに、個別のペントース流およびヘキソース流の加工はすべて、プロセスコストを増加させる。しかも、酸性条件の使用は反応器および配管における合金の使用が必要となり、これは、実質的に、設備の資本経費を増加させる。
【０１１７】
本開示は、リグニンが安価な試薬を用いて選択的に断片化および抽出されると共に、ヘミセルロースおよびセルロースがその後に酵素糖化されるべくバイオマス中に一緒に残留する高度に選択的な方法の開発を説明している。この方法は、特に、バイオマスのヘミセルロースの高い濃度を維持させる。有機溶剤溶液に抽出されるリグニンの量は≧７５％であると共に、残留バイオマスにおけるキシランおよびグルカン回収率は定量に近似しており、それ故、上記のとおりオルガノソルブバイオマス前処理の文献に記載の手法の欠点が克服される。本出願に記載の方法による多糖の高い回収率は、ヘミセルロース加水分解および糖質分解を低減するアルカリ条件の使用、アルカリ条件下での多糖ピーリングを防止する低濃度から中程度の濃度のアンモニアの使用、ならびに、ヘミセルロースの加水分解を低減させると共にキシロースオリゴ糖を不溶性とする有機溶剤溶液の高いエタノール含有量による。加えて、用いられるアルカリ条件は、設備における特殊な合金の使用が不要であり、これにより、資本経費が抑えられる。反応体または生成物（例えば、ＮａＯＨ、ＮａＣＯ３、ＣａＳＯ４）中に無機塩をほとんどまたは全く含まない本方法の実施は、最終的な無機廃棄物材料の廃棄に関連するコストをほとんどまたは全く伴わない。未反応試薬（例えば、ＥｔＯＨ、ＮＨ３）は再利用可能であり、さらなるコスト削減の有益性がもたらされる。文献中に記載の方法の多くは高い溶剤対バイオマス比を用いる。本事例において、アルカリ条件の使用および添加された求核試薬によるリグニンの相当の断片化は、溶剤流が、高濃度のリグニンを集積させて、大容量の溶剤の必要性を低減させ、ならびに、同時に、微量の可溶化された炭水化物の損失を低減させることが可能であることを意味する。最後に、残留炭水化物は、おそらくは、前処理におけるリグニン断片の高レベルの抽出、ヘミセルロースとリグニンとの間のエステルリンケージの効果的な切断、および、多糖の重合度のいくらかの低下のために酵素を用いて良好に糖化される。有機溶剤の使用は、バイオマスの湿潤性、および、酵素の基質の細孔中へ浸透する能力を向上させる。
【実施例】
【０１１８】
容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを得るためのバイオマスの前処理
以下に記載の実験研究の目標は、前処理におけるリグニン抽出および糖質保存が最大化されたリグノセルロースのための経済的な前処理プロセスを開発すること、および、ヘミセルロースが高度に保存されており、さらにプロセスされて酵素糖化の後に最大の単糖収率が達成され得る容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生成することであった。採用したアプローチは、固形分残渣中の糖質を保存しつつリグニンを好適な溶剤に選択的に断片化および抽出することである。以下の実験は、リグニンの選択的抽出のためのＮＨ３のような求核試薬の存在が組み合わされる有機溶剤溶液の開発を示す。有機溶剤および低濃度から中程度の濃度のＮＨ３および、任意により、追加の塩基の組み合わされた存在は、バイオマスのリグニン成分を選択的に断片化および可溶化して、特にヘミセルロースといった炭水化物を高レベルで含有する前処理済バイオマスを生成させる。
【０１１９】
サトウキビバガスを、前処理の前に、１ｍｍスクリーンを通してウィリーナイフミル中でミルにかけた。
【０１２０】
以下の略語が実施例において用いられている：「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーであり、「Ｃ」は摂氏温度または摂氏であり；「％」はパーセントであり；「ｗｔ」は重量であり；「ｗ／ｗ」は重量に対する重量であり；「ｍＬ」はミリリットルであり；「ＯＤ」は外径であり；「ＩＤ」は内径であり；「ｈ」は時間であり；「ｒｐｍ」は１分間当たりの回転数であり；「ＥｔＯＨ」はエタノールであり；「ｍｇ／ｇ」はミリグラム／グラムであり；「ｇ／１００ｍＬ」はグラム／１００ミリリットルであり；「Ｎ」はノルマルであり；「ｇ」はグラムであり；「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり；「ｗ／ｖ」は体積当たりの重量であり；「ｖ／ｖ」は体積に対する体積であり；「ＮＨ３」はアンモニアであり；「ｍｍ」はミリメートルであり；「ｍＬ／ｍｉｎ」はミリリットル／分であり；「ｍｉｎ」は分であり；「ｍＭ」はミリモルである。
【０１２１】
材料
硫酸、水酸化アンモニウム、酢酸、アセトアミド、イースト菌抽出物、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸カリウム、グルコース、キシロース、トリプトン、塩化ナトリウム、クエン酸、モノメチルおよびジメチルアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ１２ＬはＧｅｎｅｃｏｒ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）製であると共に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８はＮｏｖｏｚｙｍｅ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製であった。
【０１２２】
実施例１
有効なエタノール濃度
この実施例の目的は、ｐＨ制御の不在下での、炭水化物の回収およびリグニンの可溶化／抽出に対する水中の溶剤（例えば、エタノール）の濃度の影響を試験することであった。バガス（０．２ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、種々の濃度（０〜８０％）のＥｔＯＨを含有する１．５６ｍＬのＥｔＯＨ／水溶液中に懸濁させた。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼管（１／４インチＩＤ、３／８インチＯＤ、４インチ長）に仕込み、Ｓｗａｇｅｌｏｃｋ取付け部品（Ｐｅｎｎ Ｆｌｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）でキャップをした。これらを流動砂浴（Ｔｅｃｈｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＳＢＳ−４，Ｔｅｃｈｎｅ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）に入れ、１８０℃で２時間加熱し、および、室温の水浴へのプランジングにより急速に冷却した。サンプルをチューブから取り出し、Ｓｐｉｎ−Ｘフィルタ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）を用いて、室温で、卓上遠心機（Ｓｐｅｃｔｒｉｆｕｇｅ １６Ｍ，Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中で１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによりろ過して溶解リグニンを除去した。各サンプルの濃縮水を、１８０℃処理（０〜８０％Ｈ２Ｏ中のＥｔＯＨ）で用いたものと同一のＥｔＯＨ濃度を用いて、０．５ｍＬのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで洗浄した（４×）。次いで、サンプルを室温で空気乾燥させる（約９２％乾燥物質以下）と共に、残渣のグルカン、キシランおよび酸不溶性リグニン内容物をＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）手法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｌｉｇｎｉｎ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ−２００６年度版，Ａｍｉｅ Ｓｌｕｉｔｅｒら、ＮＲＥＬウェブサイトから入手可能）を用いて測定した。
【０１２３】
その後の酵素糖化
上記で調製した空気乾燥されたサンプルを、５０ｍｍクエン酸緩衝剤に、ｐＨ４．６、約１４％固形分仕込み量で懸濁させた。糖化酵素、例えばＳｐｅｚｙｍｅ ＣＰ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ１２ＬおよびＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８を、それぞれ６：３：６ｍｇ／ｇセルロースの濃度で添加した。また、１％（ｗ／ｖ）ツイン２０および０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を添加し、ここで、後者は微生物性の増殖を防止するためである。サンプル（約０．４ｍＬ）を２個の５ｍｍガラスビーズを含むスクリューキャップバイアル中に入れると共に、２５０ｒｐｍで操作した回転振盪機で４６℃でインキュベートした。分析のために開始から４時間で、および、２４時間間隔毎にアリコートを採ると共に、０．０１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４で４１．２５倍に希釈した。次いで、サンプルをＳｐｉｎ−Ｘフィルタを通してろ過し、濾液をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｅｒｉｅｓ １１００／１２００，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）により分析した。ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ Ａｍｉｎｅｘカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ ９４５４７を用いて、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を移動相として用い、０．６ｍＬ／ｍｉｎの流量で遊離化された糖質を分割した。カラムは６０℃に維持した。示差屈折計を用いて溶出した糖質を検出し、これを５５℃に維持した。グルコース、キシロースおよびアラビノースの滞留時間は、それぞれ、９．０５、９．７２および１０．６３分であった。表１Ａは、０％〜８０％のＥｔＯＨ濃度での前処理後の、グルカンおよびキシラン回収割合、ならびに、酸不溶性（ＡＩ）リグニン含有量の割合変化を概説している。バガスの濃度は（０．２ｇ／１．５６ｍＭ）であり、様々な濃度のＥｔＯＨを１８０℃で２時間用いた。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
表１Ａに示されている結果は、ＥｔＯＨ含有量の増加と共にリグニン抽出が増加したことを示し、これは、おそらく、ＥｔＯＨ濃度の増加に伴うリグニンの溶解度の増加による。しかしながら、抽出されたリグニンの量は高いエタノール濃度であっても適度に維持された。
【０１２６】
ヘミセルロース加水分解およびキシロースオリゴ糖の溶解度はＥｔＯＨの増加と共に低減し、残渣中のキシランおよびキシロースオリゴ糖の回収率を高める。前処理によって遊離されたアセテートの量もまたＥｔＯＨ含有量の増加に伴って低減し、高いＥｔＯＨ濃度でのバイオマスの自己加水分解の低減と一致した。
【０１２７】
表１Ｂは、異なるＥｔＯＨ濃度での前処理後の酵素糖化９６時間後のグルコースおよびキシロース収率を示す。セルロースの糖化は、前処理におけるＥｔＯＨの濃度が０から２０％に増加した際に増加したが、次いで、ＥｔＯＨのより高い前処理濃度では低下した。リグニンおよびセルロースの部分的加水分解のあり得る低減（セルロースの重合度の増加であり、これがその後の糖化でのグルコース収率を低減させた−表１Ｂ）が２０％ＥｔＯＨ超の濃度で観察された。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
特にキシロースの全単糖回収率（表１Ｂ）は低いＥｔＯＨ濃度ではかなり劣っていた。前処理における低いＥｔＯＨ濃度では、高温でヘミセルロースのアセチル基の加水分解によりもたらされた酸性条件がヘミセルロースを加水分解する。可溶化されたキシロースおよびいくらかのグルコースが前処理の後に続くろ過および洗浄において損失される。より高いＥｔＯＨ濃度では、糖化収率を低下させる、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの部分的な加水分解は少ない。低および高エタノール濃度での挙動は、一緒になって、単糖グルコースおよびキシロースの低い全収率をもたらす。
【０１３０】
実施例２
リグニン抽出に対するアルカリ有機溶剤溶液前処理の効果
この実施例の目的は、炭水化物保存およびリグニン抽出、ならびに、その後の酵素糖化の最中の単糖に関して、異なるＨ２Ｏ中のＥｔＯＨ比での有機溶剤溶液前処理に対するｐＨを上げた影響を試験することであった。自己加水分解がｐＨを低下させ、キシランを加水分解し、および、キシロースの損失を促進させる場合、前処理のｐＨをＮａＯＨの添加によって高めた。より高いｐＨのキシロース回収率に対する影響が以下に実証されている。サトウキビバガス（０．２５ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、ＥｔＯＨ（水中に２０〜８０％）および８％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）＋１ｍｇアントラキノン（ＡＱ、リグニン断片化用の触媒）を含有する１．７５ｍＬの溶剤に懸濁させた。この溶液の初期のｐＨは約１３．７であった。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼管に仕込み、キャップをし、１６８℃で１４０分間処理し、および、室温の水中で冷却した。サンプルを圧力容器から取り出し、ろ過し、洗浄し、空気乾燥し、および、実施例１に上述されているとおりすべてを分析した。グルカン、キシラン、アラビナン含有量および前処理後のリグニン含有量の変化が表２Ａに示されている。
【０１３１】
その後の酵素糖化は、Ｓｐｅｚｙｍｅ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ１８８比が、１％ツイン２０（ｗ／ｖ）の存在下で１２：６：１．２ｍｇ／ｇ乾燥固形分であったこと以外は実施例１に記載のとおり実施した。表２Ｂは、予め異なるＥｔＯＨ濃度で前処理したバイオマスの９６時間の酵素糖化後の単糖収率を示す。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
【表４】
【０１３４】
表２Ａおよび２Ｂに見ることが可能であるとおり、この実験のアルカリ条件は、実施例１の自己加水分解実験と比して、前処理におけるキシランの保存を実質的に高めた。この効果は、低ＥｔＯＨ濃度で最も明白であった。ＮａＯＨは、溶液の酸性化を防止し（最終ｐＨ約１０．７）、従って、ヘミセルロースを酸触媒加水分解から保護した。加えて、顕著により多量のリグニンが抽出されたが、これは、おそらくは、リグニンの塩基触媒分別による。糖化後の単糖全収率は、実施例１において観察されたものよりも実質的に高かった。前処理におけるより高い糖質回収率およびより高いリグニン抽出がその後の酵素糖化の収率を高めた。キシロースおよびグルコース糖化収率は、すなわち、糖質収率を高める傾向にあるより高レベルのＥｔＯＨでのリグニンの抽出の増加、および、ＥｔＯＨ濃度のさらなる上昇に伴うヘミセルロースおよびリグニンの部分加水分解の低下といった２つの反対のプロセスの結果として、約４５％ＥｔＯＨで最高であった。糖質再重合させるかまたは糖質と反応することが可能であるキノンメチドの形成と、「ピーリング」と、多糖のアルカリ切断反応とが、すべて、一緒になって糖質全収率の制限の要因となる可能性が高い。
【０１３５】
実施例３
アンモニアの存在下での前処理後の糖化収率のさらなる増加
本実施例の目的は、前処理後の炭水化物収率およびリグニン含有量、ならびに、糖化後の単糖収率に対する有機溶剤溶液中におけるアンモニアの存在の影響を研究することである。ｐＨの上昇によりキシラン回収率が実質的に向上したが、実施例２に概説されているアルカリ前処理プロセスにおいては依然相当な糖質の損失が生じていた。これらの損失は、「ピーリング」、すなわち、多糖鎖の還元末端からの糖質のストリッピングによる可能性が高い。アルカリ条件下では自己加水分解と比してより効果的に加水分解されるが、リグニンは、再重合および還元糖との反応が可能であるキノンメチドを形成することも可能である。従って、ＮＨ３の有機溶剤溶液への添加の影響は、これらの現象の両方を防ぐ意図をもって試験した。
【０１３６】
サトウキビバガス（０．３７５ｇ、９５．７８％乾燥物質）を、種々の割合のＥｔＯＨ（水中に０％〜７０％）を含有する１．１２５ｍＬの溶剤中に懸濁させた。加えて、この溶剤は、６％ＮＨ３および２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）を含有していた。この溶液の初期のｐＨは１３．２であったが、ＥｔＯＨ濃度の上昇に伴ってｐＨ１４．０に上がった。これらの条件を、８％ＮＨ３（ｗ／ｗバイオマス）を単独で含有するＨ２Ｏ中の７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）中に懸濁させた、初期のｐＨが１２．２であった同様のバガスサンプルと比較した。この懸濁液をタイプ３１６ステンレス鋼圧力容器（３／１６インチＩＤ、１／４インチＯＤ、４インチ長）に仕込み、キャップをすると共に、固形分仕込み量を高くし、サンプルを１６８℃で１４０分加熱したこと以外は実施例１に記載のとおり処理した。
【０１３７】
その後の酵素糖化は、Ｓｐｅｚｙｍｅ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ１８８比が、１％ツイン２０（ｗ／ｖ）の存在下で６．６８：３．３４：１．６７ｍｇ／ｇ乾燥固形分であったこと以外は実施例１に記載のとおり実施した。固形分仕込み量は１４重量％であった。
【０１３８】
表３Ａは、種々のＥｔＯＨ濃度での前処理の結果をまとめている。表３Ｂは、６％ＮＨ３＋２％ＮａＯＨ（ｗ／ｗバイオマス）の存在下における異なるＥｔＯＨ濃度での前処理後の糖化９６時間後をまとめている。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
表３Ａおよび３Ｂに概要が示されている結果から、残渣における炭水化物回収率が、ＮａＯＨ単独の場合と比してアルカリアンモニア前処理においては実質的に増加していることが明らかである（実施例２）。加えて、低濃度ＮＨ３の添加は、Ｈ２Ｏ中のより高い濃度のＥｔＯＨ前処理条件で前処理されたサンプルの酵素糖化で、単糖グルコースおよびキシロース収率の両方の相当の増加をもたらす。これらの結果は、「ピーリング」反応の防止、もしくは、キノンメチドの濃度の低下、または両方に対するＮＨ３の役割と一致する。ＮＨ３の存在下での低濃度のＮａＯＨの存在下では、おそらくは、ＮａＯＨの存在下でのより高いｐＨではより多くのＮＨ３が脱プロトン化形態にあるために、前処理の効力が顕著に高められる。
【０１４２】
実施例４
アンモニアを含有する有機溶剤溶液前処理に対するメチルアミンおよび元素硫黄の添加の影響
アンモニアでの前処理を、添加した求核試薬と、メチルアミンと、前処理のアルカリ条件下では不均衡化を起こして多硫化物および硫化物を形成する元素硫黄との存在下で試験した。前処理を、バガスが１％元素硫黄（ｗ／ｗバイオマス）を含有し、１４％ＭＡ（メチルアミン）、７％ＮＨ３＋７％ＭＡ、１０％ＮＨ３＋４％ＭＡ、または、１４％ＮＨ３（すべてｗ／ｗバイオマス）のいずれかを＋Ｈ２Ｏ中の７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）の中に懸濁させたこと以外は実施例３のとおり実施した。サンプルを、１８７℃で１時間、圧力容器中で加熱し、次いで、水浴中にて室温に急速に冷却した。既述のとおり、残渣をろ過し、洗浄し、および、乾燥させた。酵素糖化を、実施例５のとおりであるが、０．５％ＰＥＧ２０００（ｗ／ｗバイオマス）の存在下および不在下で実施した。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
表９に示されているとおり、アンモニアのメチルアミンでの置換は前処理でのグルカンおよびキシラン回収率に影響を有さない。単糖グルコースおよびキシロースの両方に対する糖化収率は、しかしながら、アンモニアのメチルアミンでの置換が大量になるほど累進的に増加する（表４）。ＰＥＧ２０００を伴って行われる糖化と伴わずに行われる糖化との間の差異は、大部分において数パーセントのみである。前処理におけるアンモニアのメチルアミンでの置換、または、糖化におけるＰＥＧ２０００の添加での糖質生成のより高い収率が、ＭＡまたはＰＥＧの追加コストを相殺するかどうかを判定するためのプロセス全体の経済的分析が必要とされている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含むリグノセルロースバイオマスを備えるステップ；
（ｂ）（ａ）のバイオマスを水、乾燥バイオマスの質量に対して約２％〜約２０％の量のアンモニア、および１つまたはそれ以上の求核剤を含む有機溶剤溶液に懸濁させ、それによりアルカリ条件下にバイオマス−溶剤懸濁液を形成させるステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約１００〜２２０℃の温度に約５分間〜約５時間、加熱し、それによりリグニンを断片化させて、懸濁液に溶解させるステップ；ならびに
（ｄ）（ｃ）における懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過し、それにより溶解リグニンを除去し、高保持率のヘミセルロースを有する炭水化物富化バイオマスを生成させるステップ
を含む、高保持率のヘミセルロースを有する炭水化物富化バイオマスを生産する方法。
【請求項２】
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産されたバイオマスを溶剤溶液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）ステップ（ｅ）後に生産されたバイオマスを水で洗浄し、それにより容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）で生産されたバイオマスを乾燥させ、それにより容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれ以上反復するステップをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の求核剤が、ＮａＯＨ、１つまたはそれ以上のアルキルアミン、硫化物、水硫化物、多硫化物、ヒドロポリスルフィド、チオール試薬、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１つまたはそれ以上のアルキルアミンが、Ｒ−ＮＨ２、Ｒ２−ＮＨ、Ｒ３Ｎ、（Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２）、（Ｈ２Ｎ−Ｒ（ＮＨ２）２）、（ＨＯ−Ｒ−ＮＨ２）、（（ＨＯ）２−Ｒ−ＮＨ２）、（ＨＯ−Ｒ−（ＮＨ２）２）、（ＨＳ−Ｒ−ＮＨ２）、（（ＨＳ）２−Ｒ−ＮＨ２）、（ＨＳ−Ｒ−（ＮＨ２）２）および（Ｈ２Ｎ−Ｒ（ＯＨ）（ＳＨ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、式中、Ｒは、独立して、一価、二価または三価の１〜６個の炭素を有する、直鎖、環式または分岐アルカン、アルケンまたはアルキンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒが、独立して、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルキルアミンがメチルアミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）における溶剤溶液：バイオマスが、約１０：１〜０．５：１の質量比を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）の加熱された懸濁液がステップ（ｄ）のろ過ステップの前に室温に冷却される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）後の、ろ過されて洗浄されたバイオマスの溶剤を減圧下で蒸発させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
バイオマスを酵素集合体で糖化し、それにより発酵可能な糖類を生産させるステップをさらに含む、請求項３、４または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｆ）における水での洗浄の後にバイオマスを酵素集合体と接触させることによりバイオマスを乾燥させることなく糖化し、それにより発酵可能な糖類を生産させるステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
糖類を発酵させて標的生産物を生産するステップをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的生産物が、エタノール、ブタノールまたは１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バイオマスが、スイッチグラス、古紙、製紙由来のスラッジ、トウモロコシ繊維、コーン穂軸、コーン包葉、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、干草、オオムギ、オオムギわら、稲わら、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の加工から得られる成分、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、動物堆肥、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）
１）リグニンおよび炭水化物を含む一定の量のリグノセルロースバイオマス；
２）約４０％〜約７０％エタノールを水中に含む多成分溶剤溶液；
３）２％〜約２０％の量のアンモニア
４）および１つまたはそれ以上の求核剤
を備えるステップ；
（ｂ）バイオマスを（ａ）の多成分溶剤溶液と接触させて溶剤−バイオマス混合物を形成させるステップ；
（ｃ）溶剤−バイオマス混合物を密閉圧力容器中に入れ、それにより（ｂ）の混合物を約１００℃〜約２２０℃の温度で約５分間〜約５時間加熱し、それによりリグニンを断片化させて、溶剤に溶解させるステップ
（ｄ）（ｃ）の溶解リグニンをろ過により除去するステップ；ならびに
（ｅ）残留物を有機溶剤で洗浄し、それにより実質的にリグニンを含まないバイオマスを生産させるステップ
を含む、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生産するためにリグノセルロースバイオマスからリグニンを同時に断片化および選択的抽出する方法。
【請求項１９】
実質的にリグニンを含まないバイオマスが、バイオマスの元々の質量の約６０％〜約１００％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有機溶剤溶液が、アルカリもしくはアルカリ土類水酸化物もしくは炭酸塩、アンモニア、チオール、硫化物、水硫化物、多硫化物、ヒドロポリスルフィド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたはさらなる成分をさらに含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２１】
溶剤溶液、および任意のアンモニアまたは他の未反応成分が再生利用可能である、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２２】
有機溶剤溶液が、アルコール、ジオールおよび非プロトン性溶剤からなる群から選択される溶剤を含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２３】
有機溶剤溶液が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、その異性体およびそのジオールからなる群から選択される溶剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）リグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含むリグノセルロースバイオマスを備えるステップ；
（ｂ）（ａ）のバイオマスを水、乾燥バイオマスの質量に対して約２％〜約２０％の量のアンモニア、および１つまたはそれ以上の求核剤を含む有機溶剤溶液に懸濁させ、それによりアルカリ条件下にバイオマス−溶剤懸濁液を形成させるステップ；
（ｃ）バイオマス−溶剤懸濁液を約１００〜２２０℃の温度に約５分間〜約５時間、加熱し、それによりリグニンを断片化させて、懸濁液に溶解させるステップ；ならびに
（ｄ）（ｃ）における懸濁液を加熱した後に自由液体を加圧下にろ過し、それにより溶解リグニンを除去し、高保持率のヘミセルロースを有する炭水化物富化バイオマスを生成させるステップ
を含む、高保持率のヘミセルロースを有する炭水化物富化バイオマスを生産する方法。
【請求項２】
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産されたバイオマスを溶剤溶液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）ステップ（ｅ）後に生産されたバイオマスを水で洗浄し、それにより容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）で生産されたバイオマスを乾燥させ、それにより容易に糖化可能な炭水化物富化バイオマスを生産させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれ以上反復するステップをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の求核剤が、ＮａＯＨ、１つまたはそれ以上のアルキルアミン、硫化物、水硫化物、多硫化物、ヒドロポリスルフィド、チオール試薬、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１つまたはそれ以上のアルキルアミンが、Ｒ−ＮＨ２、Ｒ２−ＮＨ、Ｒ３Ｎ、（Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２）、（Ｈ２Ｎ−Ｒ（ＮＨ２）２）、（ＨＯ−Ｒ−ＮＨ２）、（（ＨＯ）２−Ｒ−ＮＨ２）、（ＨＯ−Ｒ−（ＮＨ２）２）、（ＨＳ−Ｒ−ＮＨ２）、（（ＨＳ）２−Ｒ−ＮＨ２）、（ＨＳ−Ｒ−（ＮＨ２）２）および（Ｈ２Ｎ−Ｒ（ＯＨ）（ＳＨ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、式中、Ｒは、独立して、一価、二価または三価の１〜６個の炭素を有する、直鎖、環式または分岐アルカン、アルケンまたはアルキンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒが、独立して、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルキルアミンがメチルアミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）における溶剤溶液：バイオマスが、約１０：１〜０．５：１の質量比を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）の加熱された懸濁液がステップ（ｄ）のろ過ステップの前に室温に冷却される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）後の、ろ過されて洗浄されたバイオマスの溶剤を減圧下で蒸発させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
バイオマスを酵素集合体で糖化し、それにより発酵可能な糖類を生産させるステップをさらに含む、請求項３、４または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｆ）における水での洗浄の後にバイオマスを酵素集合体と接触させることによりバイオマスを乾燥させることなく糖化し、それにより発酵可能な糖類を生産させるステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
糖類を発酵させて標的生産物を生産するステップをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的生産物が、エタノール、ブタノールまたは１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バイオマスが、スイッチグラス、古紙、製紙由来のスラッジ、トウモロコシ繊維、コーン穂軸、コーン包葉、コーン葉茎、草、コムギ、コムギわら、干草、オオムギ、オオムギわら、稲わら、サトウキビバガス、サトウキビわら、ユリノキ、モロコシ、大豆、穀粒の加工から得られる成分、高木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および潅木、野菜、果実、花、動物堆肥、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）
１）リグニンおよび炭水化物を含む一定の量のリグノセルロースバイオマス；
２）約４０％〜約７０％エタノールを水中に含む多成分溶剤溶液；
３）２％〜約２０％の量のアンモニア
４）および１つまたはそれ以上の求核剤
を備えるステップ；
（ｂ）バイオマスを（ａ）の多成分溶剤溶液と接触させて溶剤−バイオマス混合物を形成させるステップ；
（ｃ）溶剤−バイオマス混合物を密閉圧力容器中に入れ、それにより（ｂ）の混合物を約１００℃〜約２２０℃の温度で約５分間〜約５時間加熱し、それによりリグニンを断片化させて、溶剤に溶解させるステップ
（ｄ）（ｃ）の溶解リグニンをろ過により除去するステップ；ならびに
（ｅ）残留物を有機溶剤で洗浄し、それにより実質的にリグニンを含まないバイオマスを生産させるステップ
を含む、実質的にリグニンを含まないバイオマスを生産するためにリグノセルロースバイオマスからリグニンを同時に断片化および選択的抽出する方法。
【請求項１９】
実質的にリグニンを含まないバイオマスが、バイオマスの元々の質量の約６０％〜約１００％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有機溶剤溶液が、アルカリもしくはアルカリ土類水酸化物もしくは炭酸塩、アンモニア、チオール、硫化物、水硫化物、多硫化物、ヒドロポリスルフィド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたはさらなる成分をさらに含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２１】
溶剤溶液、および任意のアンモニアまたは他の未反応成分が再生利用可能である、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２２】
有機溶剤溶液が、アルコール、ジオールおよび非プロトン性溶剤からなる群から選択される溶剤を含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２３】
有機溶剤溶液が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノール、その異性体およびそのジオールからなる群から選択される溶剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５１２６５８（Ｐ２０１２−５１２６５８Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２４１６（Ｐ２０１１−５４２４１６）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８３７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０４６４
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８３７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０４６４
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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