酸化アポリポタンパク質ＡＩ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット
【課題】 酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の簡便で感度の高い測定法およびキットを提供する。
【解決手段】 抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩ対する抗体もしくはＨＤＬの構成成分に対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法およびキットに関する。本発明により、生体内における酸化ストレスを検出することが可能となり、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である。
【解決手段】 抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩ対する抗体もしくはＨＤＬの構成成分に対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法およびキットに関する。本発明により、生体内における酸化ストレスを検出することが可能となり、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）の免疫学的測定方法及びそれに使用するキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでの疫学的研究により、高密度リポタンパク質（High Density Lipoprotein;ＨＤＬ）は動脈硬化に対し予防的な効果を持つことが明らかにされている。この予防的効果はＨＤＬの末梢からのコレステロールの搬出機能に依存すると考えられている。すなわち、アポリポタンパク質ＡＩが肝臓、小腸などから遊離型コレステロールを受け取って生じた原始型ＨＤＬは、血流に乗って末梢へ循環する間にＬＣＡＴ酵素によってコレステロールを更に取り込んで成熟型ＨＤＬとなり、この成熟型ＨＤＬが末梢にて蓄積したコレステロールを肝臓へと運搬する。
【０００３】
さらに、ＨＤＬの高い酸化感受性が抗動脈硬化作用に寄与していることも明らかにされつつある。すなわち、ＨＤＬは他のリポタンパク質と比較し、抗酸化物質であるユビキノール１０含量が少なく、生体内においてはＬＤＬよりも優先的に酸化される。このため、ＨＤＬは動脈硬化の原因物質である酸化ＬＤＬの生成を抑制し、さらに、酸化ＬＤＬの生体内でのクリアランスにも関与していると考えられている。
【０００４】
このようなＨＤＬは、他のリポタンパク質と比較し、５０％という高いタンパク質含量を持つリポタンパク質である。ＨＤＬの蛋白成分はアポリポタンパク質ＡＩ、同ＡＩＩ、同Ｃおよび同Ｅによって構成され、それらはＨＤＬの構造維持や機能発現に寄与している。それらの中でもアポリポタンパク質ＡＩは、蛋白成分の約７０％を占め、ＨＤＬの主要な機能であるコレステロールの運搬を担っている。
【０００５】
生体内でＨＤＬが酸化される場合、脂質の酸化と並行してアポリポタンパク質ＡＩも酸化され、アポリポタンパク質ＡＩが酸化されることによりＨＤＬの凝集や分解を引き起こすことが知られている。また、酸化による構造的あるいは化学的な変性によって、ＨＤＬのコレステロールの輸送能力が減少することも知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、アポリポタンパク質ＡＩは、ＨＤＬの抗動脈硬化作用に大きく影響し、酸化に対する感受性も非常に高いことから、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）は、脂質酸化や動脈硬化の進展と強い関連性が指摘されている生体内における酸化ストレスを鋭敏に検出するためのマーカーとなり、該マーカーの測定は動脈硬化のメカニズムの解析または臨床診断に大いに役立つものと考えられる。
【０００７】
従来、酸化された脂質に対する抗体とアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体を用いて酸化されたＨＤＬを測定する方法（特開平６−２５３８８８号、特開平９−３３５２５号、特許３２５１８４８号など参照）は報告されているものの、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法は報告されていない。
【０００８】
また、上記従来法において、アポリポタンパク質ＡＩは主にＨＤＬに含まれるタンパク成分であり、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体はＨＤＬに対する特異性が期待されるものの、各リポタンパク質の脂質成分は同じであり、酸化された脂質に対する抗体は特定のリポタンパク質に対しての特異性に懸念が残る。
【０００９】
さらに、脂質を含まないアポリポタンパク質ＡＩを主成分とする原始型ＨＤＬは、分子サイズが小さいため、間質内に分散し、動脈内膜にて酸化されることが示唆されており(Biochim. Biophys. Acta, 1483, 217-35.(2000))、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定することは、ＨＤＬに特異的であり、かつ脂質を含まない原始型ＨＤＬと脂質を含む成熟型ＨＤＬの両方の酸化型を測定しうると予想される。
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２５３８８８号公報
【特許文献２】特開平９−３３５２５号公報
【特許文献３】特許３２５１８４８号公報
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、簡便で感度の高い酸化アポリポタンパク質ＡＩの測定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応するに対する抗体とアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を特異的かつ高感度で測定できることを見いだした。
【００１２】
この測定系を用いて酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）と臨床症状との関連に関して検討した結果、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）において酸化アポリポタンパク質ＡＩが有意に増加し、酸化アポリポタンパク質ＡＩが生体内の酸化ストレスの度合いを測定するためのマーカーのみならず、糖尿病合併症の診断又は予知のマーカーとしても利用可能であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１３】
日本において、中高年の４人に１人が糖尿病の発症の可能性を潜在的に有していると考えられており、糖尿病は、続発する合併症により、患者のＱＯＬ並びに医療経済にも多大な影響を及ぼす疾患である。糖尿病の発症や合併症の併発のメカニズムについては不明な点も多く、その発症に酸化ストレスが関与しているも指摘されているが(Diabetes Metab Res Rev.17:189-212.(2001)、Diabetes Res. Clin. Pract. 45:147-51(1999)、 Am. J. Med. 30:17S-26S (1999))、酸化ストレスを指標にした糖尿病合併症の予防、予知に関する研究に関する報告は、現時点で見あたらない。このような状況下、酸化アポリポタンパク質ＡＩが糖尿病合併症の診断又は予知のマーカーとしても利用可能であることは、まったく予想外のことである。
【００１４】
したがって、本発明は、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定する方法及びキットに関するものである。
【００１５】
また、本発明は、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分に対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法及びキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により簡便で実用的な酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の測定法及びキットを初めて提供することが可能となった。また、本発明の方法及びキットは、サンプル中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を定量するために十分な感度を有し、生体内における酸化ストレスを検出することが可能となり、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用する試料は、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含有するものであれば特に限定されず、具体的には血液自体または血清、血漿などの血液画分を試料として使用することができる。このような試料中には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の形態で存在する可能性があり、本発明の方法によれば、いずれの形態であっても測定することが可能である。
【００１８】
本発明で使用する抗体は、測定対象の抗原によって異なり、たとえば、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の場合には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体とアポリポタンパク質ＡＩ抗体との２種類の抗体を使用する。また、測定対象の抗原が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）単独の場合には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分（脂質またはタンパク質）に対する抗体との２種類の抗体を使用する。このような抗体は、抗体自体あるいはそれらの活性フラグメント〔Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’など〕であってもかまわない。
【００１９】
ここで、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体とは、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを構成するアミノ酸の酸化部位や酸化によるアポリポタンパク質ＡＩの構造的変化を認識し、これと結合する抗体を意味する。特に、本発明においては、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体としてモノクローナル抗体が好ましく、このような特異性を有するモノクローナル抗体を固相に結合させた固相化抗体の形態で使用することにより、より高感度に酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを測定することが可能である。
【００２０】
このような酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体は、常法により作製することができる。たとえば、酸素ラジカル発生剤などを用いて調製した酸化アポリポタンパク質ＡＩを抗原とし、常法によりモノクローナル抗体を調製し、得られた抗体の中から酸化していないアポリポタンパク質ＡＩとは結合せず、酸化型のアポリポタンパク質ＡＩとに結合する抗体を選出すればよい。
【００２１】
また、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体とは、アポリポタンパク質ＡＩが酸化変性を受けた場合でもその結合能が変化しない抗体であり、このような抗体はＨＤＬ中のアポリポタンパク質ＡＩと遊離したアポリポタンパク質ＡＩの両方を認識する。さらに、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分（脂質またはタンパク質）に対する抗体とは、ＨＤＬが酸化変性を受けた場合でもその結合能が変化しない抗体であり、このような抗体はＨＤＬ中のタンパク質及び／又は脂質を認識する。
このような抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもかまわない。
【００２２】
上記アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体およびＨＤＬの構成成分に対する抗体は、対応する抗原（アポリポタンパク質ＡＩ、ＨＤＬまたはその構成成分）を用いて常法により抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）を調製することができる。さらに、このような抗体は既に市販されており、この市販品を利用することも可能である。
【００２３】
本発明は、上述のような抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定しようとするものである。
【００２４】
サンドイッチ法自体は、従来行われている方法、手順など何等変わるものではない。しかし、上述したように、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応するモノクローナル抗体を固相に結合させた固相化抗体を固相試薬として使用することにより、より高感度に酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定することが可能である。
【００２５】
固相試薬を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。
【００２６】
担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。
【００２７】
担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
【００２８】
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、ＢＳＡなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００２９】
また、検出に使用する標識剤としては、放射性同位体（たとえば32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートなど）、ウンベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体〔たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど〕などを例示することができる。
【００３０】
抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
【００３１】
このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順は、通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、固相試薬と被検サンプルを反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに抗体試薬を反応させる（ツーステップ法）か、固相試薬、被検サンプル及び抗体試薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、以後のそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを検出または定量することができる。
【００３２】
なお、サンドイッチ法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
(1)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(3)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(4)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
(5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A)）
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)）
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D:
Selected Immunoassay)）
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E:
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行］
【００３３】
本発明のキットは、上述の測定法を実施するためのものであり、たとえば、下記の試薬から構成され、抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体としてはモノクローナル抗体が好ましい。
(1)固相化抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体
(2)標識化された抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体又はＨＤＬの構成成分に対する抗体
【００３４】
また、標識化抗体の代わりに標識化抗イムノグロブリン抗体を使用してもよく、その場合には次の試薬から構成される。
(1)固相化抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体
(2)抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体又はＨＤＬの構成成分に対する抗体
(3)標識化抗イムノグロブリン抗体
上記各試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付すればよい。
【００３５】
本発明の方法及びキットは、ヒトを含む動物の生体内における酸化ストレスの度合い及び該酸化ストレス関連疾患の検出に利用可能である。より具体的には、後述実施例に示すように、例えば、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの陽性群においては、酸化アポリポタンパク質ＡＩの有意な増加が認められることから、血中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定し、その測定値を健常人の数値あるいは当該疾患の基準値と比較することで、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの発症や進展を検出することが可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
実施例１
＜方法＞
（１）酸化アポリポタンパク質の調製
ヒトアポリポタンパク質ＡＩ，ＡＩＩ，Ｂ，ＣＩＩ，Ｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｓ．）５００μｇを、酸素ラジカル発生剤である2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride（４ｍＭ）（ＡＡＰＨ；和光純薬）に添加し、３７℃、３時間反応させて酸化アポリポタンパク質を得た。
【００３７】
（２）抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体の作製
常法に従い、酸化アポリポタンパク質ＡＩを免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４を細胞融合して得られたハイブリドーマから酸化されたアポリポタンパク質ＡＩに強く結合する抗体を産生するクローンを複数選出し、モノクロナール抗体を得た。このような抗体のうち、今回はモノクロナール抗体３Ｃ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５９：平成１４年３月１２日 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託）を用いた。
【００３８】
（３）酸化リポタンパク質の調製
リポタンパク質はヒトＥＤＴＡ血漿より密度勾配比重遠心法により精製した。得られたリポタンパク質はゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Biochem.J.,139, 89-95.(1974)）でさらに分画し、目的のリポタンパク質以外のリポタンパク質の混入がみられないフラクションのみを実験に用いた。得られたリポタンパク質の蛋白量をＬｏｗｒｙらの方法により定量し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整後、これらに１μＭとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。
【００３９】
（４）抗体の特異性試験
酸化アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体３Ｃ１１並びにアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体（ヤマサ社製）の抗原特異性を固相化した各抗原に対する免疫活性により検討を行った。すなわち、各抗原（１μｇ／ｍｌ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ）に１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させた。抗体液を吸引除去後、プレートをＰＢＳで洗浄し、３００μｌの０．５％スキムミルクを含むＰＢＳにより各ウェルをブロッキングした（一昼夜、４℃）。ブロッキング液を吸引除去後、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて希釈した４０ｎｇ／ｍｌの抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１と１ｎｇ／ｍｌの抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体（ヤマサ社製）を１時間反応させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を１００μｌ加え室温で１時間反応させた。
反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＳＡＴ−ＢＬＵＥ、同仁化学）を１００μｌ毎分注し発色させた。１Ｎ硫酸にて反応を停止後、４５０ｎｍによって吸光度を測定した。
【００４０】
（５）ＥＬＩＳＡ法
モノクロナール抗酸化リアポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１溶液を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ）に１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させた。抗体液を吸引除去後、ＰＢＳで洗浄し、３００μｌの０．５％スキムミルクを含むＰＢＳにてブロッキング（４℃、一晩）を行った。反応後ブロッキング液を吸引除去し、プレートを乾燥した。この９６穴マイクロプレートの各ウエルに検体あるいは標準濃度溶液を１００μｌ毎加え、３７℃、３．５時間反応した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、標識二次抗体として抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を１００μｌ加え３７℃、１．５時間反応した。
反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＳＡＴ−ＢＬＵＥ、同仁化学）を１００μｌ毎分注し発色した。１Ｎ硫酸にて発色を停止後、４５０ｎｍによって吸光度を測定した。なお、血清検体は１％ウシ血清アルブミン並びに０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）によって２０倍に希釈したものを使用した。また、標準液としては４０ｍＭＡＡＰＨにより酸化したアポリポタンパク質ＡＩを用いた。
【００４１】
＜結果＞
（１）抗原特異性試験
固相に結合させた抗原を用いて抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１の反応性特異性を試験したところ、本抗体が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩと酸化されたＨＤＬに特異性を示すことが明らかとなった（図１，２）。このことから、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体はＨＤＬ中の酸化されたアポリポタンパク質ＡＩにも反応する抗体であることが明らかとなった。より具体的には、酸化ＨＤＬを固相したときの吸光度は１．３０９であり、未酸化のＨＤＬのそれより６倍高く、また、酸化アポリポタンパク質ＡＩを固相したときの吸光度は１．００９であり、未酸化のアポリポタンパク質ＡＩのそれより４倍高かった。なお、他のアポリポタンパク質並びにＨＤＬ以外のリポタンパク質においては、その吸光度は最大で０．１１であり、交差反応性は認められなかった。
一方、抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体は、ＨＤＬ及びアポリポタンパク質ＡＩの酸化によってその吸光度に有意な変化はなく、この抗体が酸化に関与する部分以外を認識していることが明らかとなった。
【００４２】
（２）標準曲線
酸化アポリポタンパク質ＡＩの標準液を使用して作成した上記ＥＬＩＳＡ法の標準曲線を図３に示す。標準曲線は２ｎｇ／ｍｌから４０ｎｇ／ｍｌまで直線性を示し、なおかつゼロ点に収束する良好な反応性が認められた。
【００４３】
（３）本ＥＬＩＳＡ法の特異性の解析
本ＥＬＩＳＡ法にてアポリポタンパク質ＡＩ並びにその酸化物を測定した。測定された結果より、これら１ｍｇあたりの酸化アポリポタンパク質ＡＩ濃度（ｎｇ／ｍｇ（タンパク質））を算出し、その反応性を比較した（図４）。その結果、４ｍＭＡＡＰＨにて酸化したアポリポタンパク質ＡＩは未酸化のそれと比較し、１２倍の特異性を有し、この測定系が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に認識していることが明らかとなった。また、４０ｍＭＡＡＰＨにて酸化したアポリポタンパク質ＡＩは未酸化のそれと比較し、７３０倍であり、より特異性が向上した。
【００４４】
また、本ＥＬＩＳＡ法にてＨＤＬ並びにその酸化物を測定したところ、酸化されたＨＤＬは未酸化のそれに対し、８５００倍の特異性を有していた（図４）。
なお、４ｍＭＡＡＰＨ酸化アポリポタンパク質ＡＩを対照とした場合の他のアポリポタンパク質ＡＩＩ、ＣＩＩ、Ｅならびにその酸化物に対する交差反応性は３％以下、銅酸化ＨＤＬを対照とした場合の他リポタンパク質（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）並びにその酸化物の交差反応性は０．０５％以下であった（図示せず）。
【００４５】
（４）本ＥＬＩＳＡ測定法の基礎的検討
４−１：血清サンプルの希釈試験
酸化アポリポタンパク質ＡＩの高値を示した健常人血清を用いて、酸化アポリポタンパク質ＡＩ測定系における希釈直線性試験を行った。その結果、試験した３試料すべてが１０倍以上の希釈倍率で原点に収束する良好な希釈直線性を示した（図５）。そこで以後の血清試料の測定は２０倍希釈にて測定した。
【００４６】
４−２：添加回収試験
１０倍に希釈した血清サンプルに酸化アポリポタンパク質ＡＩを添加して回収率を観察した。その結果を表１に示す。試験した３濃度すべてにおいて回収率は８０％以上を示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
４−３：血清中酸化アポリポタンパク質ＡＩ
健常者４０名より得られた血清試料中の酸化アポリポタンパク質ＡＩを本ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果、健常者の血中酸化アポリポタンパク質ＡＩは２９０.２２５±１６５.３ｎｇ/ｍｌ（ｍｅａｎ±ＳＤ）であった。
【００４９】
実施例２
＜材料と方法＞
II型糖尿病患者から血液を採取し、得られた血清をサンプルとして使用した。なお、II型糖尿病の診断は、ＷＨＯの基準 (Diabet Med. 15:539-53.(1998)) に従った。
血清サンプル中の酸化アポリポタンパク質ＡＩは、３Ｃ１１モノクローナル抗体を用いた上記ＥＬＩＳＡ法により測定した。統計解析はｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ ｔｅｓｔの片側検定を用い、Ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００５０】
＜結果＞
サンプルを採取した患者の臨床特徴を表２にまとめた。このようなサンプルを用い、血清中の酸化アポリポタンパク質ＡＩの濃度を測定したところ、図６に示すように、糖尿病性の腎症と神経障害の疾患陽性群において有意な酸化アポリポタンパク質ＡＩの濃度増加が認められた。
このことから、これら疾患の有病患者において酸化ストレスが亢進している可能性が示唆され、酸化アポリポタンパク質ＡＩが生体内の酸化ストレスマーカーならびに糖尿病合併症のマーカーとして利用可能であることを示唆した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
＜受託証＞
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、固相された酸化及び未酸化のアポリポタンパク質に対する２種類の抗体反応性を示したものである。
【図２】図２は、固相された酸化及び未酸化のリポタンパク質に対する２種類の抗体反応性を示したものである。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ法における標準曲線を示したものである。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡ法における交差性を示したものである。
【図５】図５は、血清サンプルの希釈性を示したものである。
【図６】図６は、糖尿病関連疾患から得られた血清サンプル中の酸化アポリポタンパク質Ａ１量を測定した結果を示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）の免疫学的測定方法及びそれに使用するキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでの疫学的研究により、高密度リポタンパク質（High Density Lipoprotein;ＨＤＬ）は動脈硬化に対し予防的な効果を持つことが明らかにされている。この予防的効果はＨＤＬの末梢からのコレステロールの搬出機能に依存すると考えられている。すなわち、アポリポタンパク質ＡＩが肝臓、小腸などから遊離型コレステロールを受け取って生じた原始型ＨＤＬは、血流に乗って末梢へ循環する間にＬＣＡＴ酵素によってコレステロールを更に取り込んで成熟型ＨＤＬとなり、この成熟型ＨＤＬが末梢にて蓄積したコレステロールを肝臓へと運搬する。
【０００３】
さらに、ＨＤＬの高い酸化感受性が抗動脈硬化作用に寄与していることも明らかにされつつある。すなわち、ＨＤＬは他のリポタンパク質と比較し、抗酸化物質であるユビキノール１０含量が少なく、生体内においてはＬＤＬよりも優先的に酸化される。このため、ＨＤＬは動脈硬化の原因物質である酸化ＬＤＬの生成を抑制し、さらに、酸化ＬＤＬの生体内でのクリアランスにも関与していると考えられている。
【０００４】
このようなＨＤＬは、他のリポタンパク質と比較し、５０％という高いタンパク質含量を持つリポタンパク質である。ＨＤＬの蛋白成分はアポリポタンパク質ＡＩ、同ＡＩＩ、同Ｃおよび同Ｅによって構成され、それらはＨＤＬの構造維持や機能発現に寄与している。それらの中でもアポリポタンパク質ＡＩは、蛋白成分の約７０％を占め、ＨＤＬの主要な機能であるコレステロールの運搬を担っている。
【０００５】
生体内でＨＤＬが酸化される場合、脂質の酸化と並行してアポリポタンパク質ＡＩも酸化され、アポリポタンパク質ＡＩが酸化されることによりＨＤＬの凝集や分解を引き起こすことが知られている。また、酸化による構造的あるいは化学的な変性によって、ＨＤＬのコレステロールの輸送能力が減少することも知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、アポリポタンパク質ＡＩは、ＨＤＬの抗動脈硬化作用に大きく影響し、酸化に対する感受性も非常に高いことから、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）は、脂質酸化や動脈硬化の進展と強い関連性が指摘されている生体内における酸化ストレスを鋭敏に検出するためのマーカーとなり、該マーカーの測定は動脈硬化のメカニズムの解析または臨床診断に大いに役立つものと考えられる。
【０００７】
従来、酸化された脂質に対する抗体とアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体を用いて酸化されたＨＤＬを測定する方法（特開平６−２５３８８８号、特開平９−３３５２５号、特許３２５１８４８号など参照）は報告されているものの、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法は報告されていない。
【０００８】
また、上記従来法において、アポリポタンパク質ＡＩは主にＨＤＬに含まれるタンパク成分であり、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体はＨＤＬに対する特異性が期待されるものの、各リポタンパク質の脂質成分は同じであり、酸化された脂質に対する抗体は特定のリポタンパク質に対しての特異性に懸念が残る。
【０００９】
さらに、脂質を含まないアポリポタンパク質ＡＩを主成分とする原始型ＨＤＬは、分子サイズが小さいため、間質内に分散し、動脈内膜にて酸化されることが示唆されており(Biochim. Biophys. Acta, 1483, 217-35.(2000))、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定することは、ＨＤＬに特異的であり、かつ脂質を含まない原始型ＨＤＬと脂質を含む成熟型ＨＤＬの両方の酸化型を測定しうると予想される。
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２５３８８８号公報
【特許文献２】特開平９−３３５２５号公報
【特許文献３】特許３２５１８４８号公報
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、簡便で感度の高い酸化アポリポタンパク質ＡＩの測定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応するに対する抗体とアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を特異的かつ高感度で測定できることを見いだした。
【００１２】
この測定系を用いて酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）と臨床症状との関連に関して検討した結果、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）において酸化アポリポタンパク質ＡＩが有意に増加し、酸化アポリポタンパク質ＡＩが生体内の酸化ストレスの度合いを測定するためのマーカーのみならず、糖尿病合併症の診断又は予知のマーカーとしても利用可能であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１３】
日本において、中高年の４人に１人が糖尿病の発症の可能性を潜在的に有していると考えられており、糖尿病は、続発する合併症により、患者のＱＯＬ並びに医療経済にも多大な影響を及ぼす疾患である。糖尿病の発症や合併症の併発のメカニズムについては不明な点も多く、その発症に酸化ストレスが関与しているも指摘されているが(Diabetes Metab Res Rev.17:189-212.(2001)、Diabetes Res. Clin. Pract. 45:147-51(1999)、 Am. J. Med. 30:17S-26S (1999))、酸化ストレスを指標にした糖尿病合併症の予防、予知に関する研究に関する報告は、現時点で見あたらない。このような状況下、酸化アポリポタンパク質ＡＩが糖尿病合併症の診断又は予知のマーカーとしても利用可能であることは、まったく予想外のことである。
【００１４】
したがって、本発明は、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定する方法及びキットに関するものである。
【００１５】
また、本発明は、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分に対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を特異的に測定する方法及びキットに関するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により簡便で実用的な酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の測定法及びキットを初めて提供することが可能となった。また、本発明の方法及びキットは、サンプル中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を定量するために十分な感度を有し、生体内における酸化ストレスを検出することが可能となり、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用する試料は、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含有するものであれば特に限定されず、具体的には血液自体または血清、血漿などの血液画分を試料として使用することができる。このような試料中には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の形態で存在する可能性があり、本発明の方法によれば、いずれの形態であっても測定することが可能である。
【００１８】
本発明で使用する抗体は、測定対象の抗原によって異なり、たとえば、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の場合には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体とアポリポタンパク質ＡＩ抗体との２種類の抗体を使用する。また、測定対象の抗原が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）単独の場合には、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分（脂質またはタンパク質）に対する抗体との２種類の抗体を使用する。このような抗体は、抗体自体あるいはそれらの活性フラグメント〔Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’など〕であってもかまわない。
【００１９】
ここで、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体とは、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを構成するアミノ酸の酸化部位や酸化によるアポリポタンパク質ＡＩの構造的変化を認識し、これと結合する抗体を意味する。特に、本発明においては、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体としてモノクローナル抗体が好ましく、このような特異性を有するモノクローナル抗体を固相に結合させた固相化抗体の形態で使用することにより、より高感度に酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを測定することが可能である。
【００２０】
このような酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体は、常法により作製することができる。たとえば、酸素ラジカル発生剤などを用いて調製した酸化アポリポタンパク質ＡＩを抗原とし、常法によりモノクローナル抗体を調製し、得られた抗体の中から酸化していないアポリポタンパク質ＡＩとは結合せず、酸化型のアポリポタンパク質ＡＩとに結合する抗体を選出すればよい。
【００２１】
また、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体とは、アポリポタンパク質ＡＩが酸化変性を受けた場合でもその結合能が変化しない抗体であり、このような抗体はＨＤＬ中のアポリポタンパク質ＡＩと遊離したアポリポタンパク質ＡＩの両方を認識する。さらに、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の構成成分（脂質またはタンパク質）に対する抗体とは、ＨＤＬが酸化変性を受けた場合でもその結合能が変化しない抗体であり、このような抗体はＨＤＬ中のタンパク質及び／又は脂質を認識する。
このような抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもかまわない。
【００２２】
上記アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体およびＨＤＬの構成成分に対する抗体は、対応する抗原（アポリポタンパク質ＡＩ、ＨＤＬまたはその構成成分）を用いて常法により抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）を調製することができる。さらに、このような抗体は既に市販されており、この市販品を利用することも可能である。
【００２３】
本発明は、上述のような抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定しようとするものである。
【００２４】
サンドイッチ法自体は、従来行われている方法、手順など何等変わるものではない。しかし、上述したように、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応するモノクローナル抗体を固相に結合させた固相化抗体を固相試薬として使用することにより、より高感度に酸化されたアポリポタンパク質ＡＩ及び／又は同抗原を含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定することが可能である。
【００２５】
固相試薬を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。
【００２６】
担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。
【００２７】
担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
【００２８】
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、ＢＳＡなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００２９】
また、検出に使用する標識剤としては、放射性同位体（たとえば32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートなど）、ウンベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体〔たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど〕などを例示することができる。
【００３０】
抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
【００３１】
このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順は、通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、固相試薬と被検サンプルを反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに抗体試薬を反応させる（ツーステップ法）か、固相試薬、被検サンプル及び抗体試薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、以後のそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを検出または定量することができる。
【００３２】
なお、サンドイッチ法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
(1)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(3)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(4)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
(5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A)）
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)）
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D:
Selected Immunoassay)）
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E:
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行］
【００３３】
本発明のキットは、上述の測定法を実施するためのものであり、たとえば、下記の試薬から構成され、抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体としてはモノクローナル抗体が好ましい。
(1)固相化抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体
(2)標識化された抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体又はＨＤＬの構成成分に対する抗体
【００３４】
また、標識化抗体の代わりに標識化抗イムノグロブリン抗体を使用してもよく、その場合には次の試薬から構成される。
(1)固相化抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体
(2)抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体又はＨＤＬの構成成分に対する抗体
(3)標識化抗イムノグロブリン抗体
上記各試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付すればよい。
【００３５】
本発明の方法及びキットは、ヒトを含む動物の生体内における酸化ストレスの度合い及び該酸化ストレス関連疾患の検出に利用可能である。より具体的には、後述実施例に示すように、例えば、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの陽性群においては、酸化アポリポタンパク質ＡＩの有意な増加が認められることから、血中の酸化アポリポタンパク質ＡＩ及び／又は酸化アポリポタンパク質ＡＩを含むＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）を測定し、その測定値を健常人の数値あるいは当該疾患の基準値と比較することで、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの発症や進展を検出することが可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
実施例１
＜方法＞
（１）酸化アポリポタンパク質の調製
ヒトアポリポタンパク質ＡＩ，ＡＩＩ，Ｂ，ＣＩＩ，Ｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｓ．）５００μｇを、酸素ラジカル発生剤である2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride（４ｍＭ）（ＡＡＰＨ；和光純薬）に添加し、３７℃、３時間反応させて酸化アポリポタンパク質を得た。
【００３７】
（２）抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体の作製
常法に従い、酸化アポリポタンパク質ＡＩを免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４を細胞融合して得られたハイブリドーマから酸化されたアポリポタンパク質ＡＩに強く結合する抗体を産生するクローンを複数選出し、モノクロナール抗体を得た。このような抗体のうち、今回はモノクロナール抗体３Ｃ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７５９：平成１４年３月１２日 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託）を用いた。
【００３８】
（３）酸化リポタンパク質の調製
リポタンパク質はヒトＥＤＴＡ血漿より密度勾配比重遠心法により精製した。得られたリポタンパク質はゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Biochem.J.,139, 89-95.(1974)）でさらに分画し、目的のリポタンパク質以外のリポタンパク質の混入がみられないフラクションのみを実験に用いた。得られたリポタンパク質の蛋白量をＬｏｗｒｙらの方法により定量し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整後、これらに１μＭとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。
【００３９】
（４）抗体の特異性試験
酸化アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体３Ｃ１１並びにアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体（ヤマサ社製）の抗原特異性を固相化した各抗原に対する免疫活性により検討を行った。すなわち、各抗原（１μｇ／ｍｌ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ）に１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させた。抗体液を吸引除去後、プレートをＰＢＳで洗浄し、３００μｌの０．５％スキムミルクを含むＰＢＳにより各ウェルをブロッキングした（一昼夜、４℃）。ブロッキング液を吸引除去後、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて希釈した４０ｎｇ／ｍｌの抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１と１ｎｇ／ｍｌの抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体（ヤマサ社製）を１時間反応させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を１００μｌ加え室温で１時間反応させた。
反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＳＡＴ−ＢＬＵＥ、同仁化学）を１００μｌ毎分注し発色させた。１Ｎ硫酸にて反応を停止後、４５０ｎｍによって吸光度を測定した。
【００４０】
（５）ＥＬＩＳＡ法
モノクロナール抗酸化リアポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１溶液を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ）に１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させた。抗体液を吸引除去後、ＰＢＳで洗浄し、３００μｌの０．５％スキムミルクを含むＰＢＳにてブロッキング（４℃、一晩）を行った。反応後ブロッキング液を吸引除去し、プレートを乾燥した。この９６穴マイクロプレートの各ウエルに検体あるいは標準濃度溶液を１００μｌ毎加え、３７℃、３．５時間反応した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、標識二次抗体として抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を１００μｌ加え３７℃、１．５時間反応した。
反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、発色液（ＳＡＴ−ＢＬＵＥ、同仁化学）を１００μｌ毎分注し発色した。１Ｎ硫酸にて発色を停止後、４５０ｎｍによって吸光度を測定した。なお、血清検体は１％ウシ血清アルブミン並びに０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）によって２０倍に希釈したものを使用した。また、標準液としては４０ｍＭＡＡＰＨにより酸化したアポリポタンパク質ＡＩを用いた。
【００４１】
＜結果＞
（１）抗原特異性試験
固相に結合させた抗原を用いて抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体３Ｃ１１の反応性特異性を試験したところ、本抗体が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩと酸化されたＨＤＬに特異性を示すことが明らかとなった（図１，２）。このことから、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩに対する抗体はＨＤＬ中の酸化されたアポリポタンパク質ＡＩにも反応する抗体であることが明らかとなった。より具体的には、酸化ＨＤＬを固相したときの吸光度は１．３０９であり、未酸化のＨＤＬのそれより６倍高く、また、酸化アポリポタンパク質ＡＩを固相したときの吸光度は１．００９であり、未酸化のアポリポタンパク質ＡＩのそれより４倍高かった。なお、他のアポリポタンパク質並びにＨＤＬ以外のリポタンパク質においては、その吸光度は最大で０．１１であり、交差反応性は認められなかった。
一方、抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体は、ＨＤＬ及びアポリポタンパク質ＡＩの酸化によってその吸光度に有意な変化はなく、この抗体が酸化に関与する部分以外を認識していることが明らかとなった。
【００４２】
（２）標準曲線
酸化アポリポタンパク質ＡＩの標準液を使用して作成した上記ＥＬＩＳＡ法の標準曲線を図３に示す。標準曲線は２ｎｇ／ｍｌから４０ｎｇ／ｍｌまで直線性を示し、なおかつゼロ点に収束する良好な反応性が認められた。
【００４３】
（３）本ＥＬＩＳＡ法の特異性の解析
本ＥＬＩＳＡ法にてアポリポタンパク質ＡＩ並びにその酸化物を測定した。測定された結果より、これら１ｍｇあたりの酸化アポリポタンパク質ＡＩ濃度（ｎｇ／ｍｇ（タンパク質））を算出し、その反応性を比較した（図４）。その結果、４ｍＭＡＡＰＨにて酸化したアポリポタンパク質ＡＩは未酸化のそれと比較し、１２倍の特異性を有し、この測定系が酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に認識していることが明らかとなった。また、４０ｍＭＡＡＰＨにて酸化したアポリポタンパク質ＡＩは未酸化のそれと比較し、７３０倍であり、より特異性が向上した。
【００４４】
また、本ＥＬＩＳＡ法にてＨＤＬ並びにその酸化物を測定したところ、酸化されたＨＤＬは未酸化のそれに対し、８５００倍の特異性を有していた（図４）。
なお、４ｍＭＡＡＰＨ酸化アポリポタンパク質ＡＩを対照とした場合の他のアポリポタンパク質ＡＩＩ、ＣＩＩ、Ｅならびにその酸化物に対する交差反応性は３％以下、銅酸化ＨＤＬを対照とした場合の他リポタンパク質（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）並びにその酸化物の交差反応性は０．０５％以下であった（図示せず）。
【００４５】
（４）本ＥＬＩＳＡ測定法の基礎的検討
４−１：血清サンプルの希釈試験
酸化アポリポタンパク質ＡＩの高値を示した健常人血清を用いて、酸化アポリポタンパク質ＡＩ測定系における希釈直線性試験を行った。その結果、試験した３試料すべてが１０倍以上の希釈倍率で原点に収束する良好な希釈直線性を示した（図５）。そこで以後の血清試料の測定は２０倍希釈にて測定した。
【００４６】
４−２：添加回収試験
１０倍に希釈した血清サンプルに酸化アポリポタンパク質ＡＩを添加して回収率を観察した。その結果を表１に示す。試験した３濃度すべてにおいて回収率は８０％以上を示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
４−３：血清中酸化アポリポタンパク質ＡＩ
健常者４０名より得られた血清試料中の酸化アポリポタンパク質ＡＩを本ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果、健常者の血中酸化アポリポタンパク質ＡＩは２９０.２２５±１６５.３ｎｇ/ｍｌ（ｍｅａｎ±ＳＤ）であった。
【００４９】
実施例２
＜材料と方法＞
II型糖尿病患者から血液を採取し、得られた血清をサンプルとして使用した。なお、II型糖尿病の診断は、ＷＨＯの基準 (Diabet Med. 15:539-53.(1998)) に従った。
血清サンプル中の酸化アポリポタンパク質ＡＩは、３Ｃ１１モノクローナル抗体を用いた上記ＥＬＩＳＡ法により測定した。統計解析はｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ ｔｅｓｔの片側検定を用い、Ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００５０】
＜結果＞
サンプルを採取した患者の臨床特徴を表２にまとめた。このようなサンプルを用い、血清中の酸化アポリポタンパク質ＡＩの濃度を測定したところ、図６に示すように、糖尿病性の腎症と神経障害の疾患陽性群において有意な酸化アポリポタンパク質ＡＩの濃度増加が認められた。
このことから、これら疾患の有病患者において酸化ストレスが亢進している可能性が示唆され、酸化アポリポタンパク質ＡＩが生体内の酸化ストレスマーカーならびに糖尿病合併症のマーカーとして利用可能であることを示唆した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
＜受託証＞
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、固相された酸化及び未酸化のアポリポタンパク質に対する２種類の抗体反応性を示したものである。
【図２】図２は、固相された酸化及び未酸化のリポタンパク質に対する２種類の抗体反応性を示したものである。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ法における標準曲線を示したものである。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡ法における交差性を示したものである。
【図５】図５は、血清サンプルの希釈性を示したものである。
【図６】図６は、糖尿病関連疾患から得られた血清サンプル中の酸化アポリポタンパク質Ａ１量を測定した結果を示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化アポリポタンパク質ＡＩの糖尿病合併症のマーカーとしての使用。
【請求項２】
糖尿病合併症が糖尿病性腎症又は糖尿病性神経障害である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酸化アポリポタンパク質ＡＩとして、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１】
酸化アポリポタンパク質ＡＩの糖尿病合併症のマーカーとしての使用。
【請求項２】
糖尿病合併症が糖尿病性腎症又は糖尿病性神経障害である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酸化アポリポタンパク質ＡＩとして、酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを含む高密度リポタンパク質（酸化ＨＤＬ）を含む、請求項１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−２７９０６６（Ｐ２００７−２７９０６６Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８２８３９（Ｐ２００７−１８２８３９）
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【分割の表示】特願２００３−５５６５６（Ｐ２００３−５５６５６）の分割
【原出願日】平成１５年３月３日（２００３．３．３）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【分割の表示】特願２００３−５５６５６（Ｐ２００３−５５６５６）の分割
【原出願日】平成１５年３月３日（２００３．３．３）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
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