酸化物層上に不動態化表面を形成するための中間体および方法およびこれにより製造される製品
酸化物層上に不動態化表面を形成するための中間体および方法、およびこれにより製造される製品が記載される。酸化物表面上のヒドロキシルあるいはヒドロキシド基を式ＹＹ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍの金属試薬（式中、Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、かつ「Ｐｏｌ」はポリエチレングリコール、炭化水素、あるいはフッ化炭化水素などの不動態化剤を表す）と反応させる。生成した修飾表面は、リン酸官能基を有する不動態化剤、あるいは不動態化部分およびＹと反応性であるか、あるいは錯体形成する多数の官能基を含む多価試薬とさらに反応させることができる。不動態化剤はビオチンなどの官能基を含んで表面に所望の官能基を提供することもできる。不動態化された表面は生体分子と最小の結合を示し、かつ単分子検出スキームに用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、全般的に表面修飾技術に関し、また具体的には酸化物層上に不動態化表面を形成するための中間体および方法およびこれにより製造される製品に関する。
【０００２】
本明細書は、２００６年１１月２１日に提出された米国暫定特許出願第６０／８６０，２１５号、および２００６年１１月２２日に提出された米国暫定特許出願第６０／８６０，４８０の利点を主張する。上記の明細書はそれぞれその全文が参照文献として本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本明細書で用いられる節の標題は整理のみを目的としており、決して本明細書に記載の主題への制限として解釈されてはならない。
【背景技術】
【０００４】
リアルタイムでのＤＮＡ配列決定は、好ましくは表面上での、ポリメラーゼによる個々の組み込み事象のインテロゲーションを必要とする。一般的に、これらの組み込み事象は、個々の分子として組み込まれたヌクレオチド上の標識を検討することよって同定される（例：単分子検出）。最も一般的な標識は蛍光色素である。表面上におけるまれな標識ヌクレオチドの非特異的吸着であっても、偽陽性シグナルを生成する。したがって、基質の表面への結合は最小化されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薄い不動態化層の形成を考慮し、かつ最小の生体分子吸収を示す表面をもたらすような不動態化技術の改善へのニーズが未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の実施形態によると：
表面がヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陽イオン基を含む、表面を金属試薬と接触させること；および
金属試薬を表面上のヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基と反応させて修飾表面を形成することを含む支持体の表面を修飾する方法が提供され；
このとき金属試薬は以下の式：
Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり；
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ、ｍが整数である）で表される構造を有する。
本実施形態による方法は、不動態化部分およびＹと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する多数の官能基を含む多価試薬と修飾された表面を接触させることをさらに含むことができ、このとき不動態化部分は置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される。
【０００７】
第２の実施形態によれば、以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、このときＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓであり、かつこのときＲ２はアルキル基である）で表される化合物が提供される。
【００１０】
第３の実施形態によれば、不動態化剤とコンジュゲートした金属錯体化剤を含む化合物が提供され、このとき
金属錯体化剤はカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつこのとき
不動態化剤はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される。
【００１１】
第４の実施形態によれば、以下の式：
Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）で表される化合物が提供される。
【００１２】
第５の実施形態によれば：
式：Ｙ（ＯＲ６）ｍ
の第１の化合物をそれぞれ式：Ｐｏｌ−ＬＨ
である１つあるいはそれ以上の第２の化合物と反応させて式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｒ６はＣ１〜Ｃ５炭化水素であり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の金属エステル化合物を形成することを含む方法が提供される。
【００１３】
第６の実施形態によれば：
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；および
部分が以下の式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり；
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであるか、あるいはＬは金属錯体化剤であり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
このとき酸素原子はこれとあるいは酸化物層内の異なるケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウムあるいはスズ原子と結合する）において説明されるような構造を有する、酸化物層の表面部分を含む固形支持体が提供される。
金属錯体化剤の非限定的な例はカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンを含む。
【００１６】
第７の実施形態によれば：
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；
酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；
置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含む不動態化剤を含み；
不動態化試薬は多数の部位で１つあるいはそれ以上の金属原子と共有結合あるいは錯体形成する固形支持体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
当業者は、以下に記載する図面が、例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を限定することを全く意図していない。
【００１８】
【図１Ａ】１つの実施例にしたがって不動態化することのできる、ヒドロキシル基を含む酸化物層を描出する概略図である。
【図１Ｂ】さらなる実施例にしたがって不動態化することのできる、ヒドロキシド陰イオン基を含む表面を描出する概略図である。
【図２】酸化物表面の修飾に使用することのできる金属試薬の調製を示す。
【図３】金属試薬化合物と酸化物表面の反応により生成する修飾表面を示す。
【図４】図４Ａ、ＢおよびＣは金属試薬で処理した表面と反応させて不動態化表面を形成することのできる、リン酸基を含有する不動態化剤の化学構造を例示する。
【図５】金属試薬処理表面とリン酸基を含む不動態化試薬の相互作用の結果を示す概略図である。
【図６】多数のヒドロキシル基を含む多価ＰＥＧ不動態化剤による表面上の不安定一価不動態化剤の置換を例示する。
【図７Ａ】プロットが１００×１００μｍ画像の画素におけるカウント数である、ＴａＰＥＧ５５０／ＴＥＧリン酸修飾表面を有するカバーグラスの共焦点蛍光撮影の結果を示すプロットである。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図７Ｅ】同上
【図８Ａ】ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰを用いたＴａＰＥＧ５５０（リン酸なし）修飾表面のカウント率ヒストグラムを示すプロットである。
【図８Ｂ】同上
【図８Ｃ】同上
【図９Ａ】表面の接着性色素を示す長いラグタイム（例：１０ｍ秒）のテールを示す、定法で調整した５％Ｐｅｇｓｉｌａｎｅ修飾カバーグラス上で０．１ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＧＴＰより得られた相関曲線である。
【図９Ｂ】ＴａＰＥＧ５５０表面修飾カバーグラス上で拡散するローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線を示す。
【図９Ｃ】ＴａＰＥＧ５５０表面修飾カバーグラス上で拡散するローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線を示す。
【図１０Ａ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｂ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｃ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｄ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ａ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における１ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ｂ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における１００ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ｃ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１２】ＤＮＡ伸長緩衝液でのインキュベーション前（図１２Ａ）および後（図１２Ｂ）に、ＴａＰＥＧ５５０で処理した後ＰＥＧ３５０−三リン酸により処理した石英ガラスを示す写真であり、このときスライドは１００ｎＭ ＬＩＺ−ｄＡＴＰでインキュベートした後水ですすいで未接着色素を全て取り除いた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書における「あるいは」の使用は、特に明言しない場合、あるいは「および／あるいは」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「および／あるいは」を意味する。本明細書における「ある１つの」の使用は、特に明言しない場合あるいは「１つあるいはそれ以上」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「１つあるいはそれ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は互換的であり、制限的となることを意図していない。さらに、１つあるいはそれ以上の実施形態が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いる場合、当業者は、一部の具体的な場合において、その１つのあるいは複数の実施形態が「ほとんど〜からなる」および／あるいは「〜からなる」という言い回しを用いて代替的に記述することができることを理解するであろう。また、一部の実施形態においては、本教示が実施可能であり続ける限り、工程の順序あるいはある作業を実施する順序は重要でないことも理解すべきである。さらに、一部の実施形態においては２つあるいはそれ以上の工程を同時に実施することもできる。
【００２０】
不動態化表面を作成する、あるいは不動態化剤の末端の官能基との反応を目的とした修飾表面を作成する目的を有する、酸化物（例：シリカ）表面上にアルミニウムあるいは遷移金属化合物（例：エステル）の非常に薄い層を形成するための技術が提供される。該不動態化剤は、自己構成しない、ポリエチレングリコール（すなわちＰＥＧ）とすることができる。試薬を有機溶媒中での使用に適合するものとするために、官能基はテトラブチルアンモニウム対イオンを伴うリン酸あるいは二リン酸基とすることができる。
【００２１】
Ｔａ（５＋）、Ｔｉ（４＋）およびＺｒ（４＋）の遷移金属エステルは市販されている（例：メチル、エチルおよびイソプロピルエステルなどとして）。しかし、不溶性酸化物を生成するこれらのエステルと痕跡量の水との反応性は、被覆表面に対して水性環境におけるその使用を妨げる。さらに、特に市販されているＴｉ（４＋）エステルの、その有機溶媒に対する限られた溶解度は、多くの有機溶媒中でのこれらの試薬の使用を妨げる。
【００２２】
本発明者らは、市販のＴａ（５＋）およびＴｉ（４＋）エステルを、４等量あるいはそれ以上の中分子量（すなわち２つあるいはそれ以上のＥＯ単位）ＰＥＧモノメチルエーテルと反応させて、大半の有機溶媒における優れた可溶性を有し、かつシリカ表面などの酸化物表面上に、非常に予測可能に、それらの金属の非常に薄い層を形成する能力を有する試薬を作成することができることを見いだしている。ある場合には、沈着によって単一分子検出スキームにおける使用に適した不動態化表面を作成する。他の場合には、修飾表面はさらにＰＥＧのリン酸あるいは二リン酸誘導体あるいは他の不動態化剤と反応させて所望の表面を作成することができる。
【００２３】
全体的なスキームは図１〜５に要約されている。
【００２４】
図１Ａは、反応性ヒドロキシル基を含有する酸化物材料（例：ケイ酸塩ガラスあるいは石英）の模式的描出である。表面上のヒドロキシル基は、塩基で処理することによりヒドロキシド陰イオンに変換することができる。図１Ｂは、反応性ヒドロキシド陰イオン基を含有する酸化物材料（例：ケイ酸塩ガラスあるいは石英）の模式的描出である。１つの実施形態によると、表面上のヒドロキシル基は水酸化テトラブチルアンモニウムで処理することによりヒドロキシド陰イオンに変換することができる。これにより有機媒体中で容易に溶媒和物とすることができる四級アンモニウム塩が形成される。
【００２５】
酸化物表面は、不動態化に先立ち、酸素プラズマによって、あるいは水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カリウムメタノール溶液、過酸化水素硫酸溶液（すなわち「ピラニア」溶液）、硝酸硫酸溶液（すなわち「王水」）、過酸化水素アンモニア溶液（すなわち「ＲＣＡ」溶液）、硫酸、フッ化水素酸、ＥＤＴＡによって、あるいはこれらの処理の連続的組合せによって処理することができる。
【００２６】
図２は酸化物表面の修飾に使用することのできる金属試薬の調製を例示する。試薬を合成するために、必要な等量数（すなわちｍ）よりも多くのＰｏｌ−ＬＨ化合物を加えて、金属上の低分子量アルコールの完全な置換を得ることができる。ＰＥＧは金属エステルに添加する前に乾燥しなければならない。数時間後、溶液を排気して置換された低分子量アルコールを除去し、反応を進めて完遂することを助ける。
【００２７】
図３は金属試薬と酸化物表面の反応の結果を示す。原則として、残余の「Ｐｏｌ」（例：ＰＥＧなど）基は金属エステルの未反応部位に残し、これらは後で不溶性金属−パートナー対の変換のために用いられる。これらの「Ｐｏｌ」基の存在により、異なる極性および還流温度のいずれが沈着速度の最適化に必要な場合、これらを利用するための多様な溶媒（例としてたとえば酢酸エチル、トルエン、塩化メチレンなど）の使用が可能となる。金属試薬による表面の修飾によって、多様な条件の下で非常に薄い層（ＸＰＳによる表面元素分析で示されるように）が生成することが確認されている。
【００２８】
ある場合には、金属試薬による酸化物表面の処理によって不動態化表面が得られる。他の場合には、金属試薬による処理によって形成された修飾表面が、追加的な不動態化工程による不動態化表面の形成への中間体となる。図４Ａは、金属試薬修飾酸化物表面を処理して不動態化表面を形成するために用いることのできる、リン酸あるいはホスホン酸などの錯体化剤を有する高分子不動態化剤の化学構造を示す。図４Ａにおいては、置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。
【００２９】
図４Ｂおよび４Ｃに示すように、リン酸エステルはその塩（例：テトラブチルアンモニウム塩）に変換して多様な有機溶媒中への溶解度を改善することができる。図４Ｂおよび４Ｃに示すように、置換基Ｒ４はＮ（Ｒ２）４あるいはＭとすることができ、このときＲ２はアルキル基でありかつＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓであり、また置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素である。
【００３０】
さらに、高分子不動態化剤は全てのあるいは一部の表面に所望の官能基を提供するための置換を含有することができる。例えば、図４Ａ〜４Ｃに示すリン酸エステルのＲ３置換基はビオチン部分を含むことができる。さらに、金属試薬処理表面は、異なる高分子要素を有する不動態化剤の混合物を含む組成物と接触させて、具体的な最終使用用途に最適化した表面を提供することができる。例えば、該不動態化製剤は、所望の表面特性を得るために、ＰＥＧのリン酸あるいは二リン酸エステルとフッ化炭化水素のリン酸あるいは二リン酸エステルの混合物を含有することができる。所望の表面特性は、実験を通じて経験的に決定することができる。図４Ａ〜４Ｃにおいては、ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基とすることができ、また置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。図４Ｂおよび４Ｃにおいても、各Ｒ４置換基はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭとすることができ、このときＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である。
【００３１】
図５は、リン酸基を含む不動態化剤で酸化物表面を処理することにより形成され、該酸化物表面があらかじめ金属試薬で処理される表面を示す。図５よりわかるように、この技術により酸化物表面上に不動態化剤の薄層が生成する。図５においては、Ｒ３置換基はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。図５においても、Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムとすることができ、かつＺはＯ、Ｎあるいはメチレン基とすることができる。
【００３２】
本明細書に記述された金属試薬の使用により、多様な酸化物表面上における金属前駆体の非常に薄い層の制御された作成が可能となる。さらに、表面は非常に穏やかな条件の下で形成することができる。また金属試薬は製造が容易でもあり、かつ使用前の精製を必要としない。
【００３３】
層形成前の金属試薬およびリン酸官能基不動態化剤の使用により、所望の表面の沈着を目的とした入手が容易なリン酸官能基の使用が可能となる。リン酸エステルはオキシ塩化リンおよびアルコール型不動態化剤より容易に合成することができる。合成されたリン酸エステルは、多様な溶媒に容易に可溶であり、かつその金属試薬修飾表面との反応性を未だに保持している誘導体（例：四級アンモニウム誘導体など）に変換することができる。リン酸エステルの表面との反応は、広範な加熱あるいは表面上でのテールしたリン酸の自己構成を必要としない。
【００３４】
金属試薬およびリン酸官能基不動態化試薬を使用すると、リン酸エステルに多様な高分子基を配合することにより、多様な表面型および特性の作成も可能となる。例えば、炭化水素、フッ化炭化水素、およびＰＥＧアルコールのリン酸エステルは、金属試薬処理酸化物表面と接触させる前に混ぜ合わせ、特定の用途にとって望ましい特性を有する修飾表面を得ることも可能である。さらに、特定の官能基（例：ビオチンなど）を含有するリン酸エステルを用いて、他の分子（例：ストレプトアビジンなど）と結合するような表面を得ることも可能である。
【００３５】
（１種類の多価不動態化剤による金属試薬修飾表面の処理）
一部の実施形態によると、上記のように金属試薬で処理した支持体の表面は、続いて不動態化部分、および表面上で共有結合を形成あるいは金属原子との錯体を形成することが可能な多数の官能基を含む多価不動態化剤で処理することができる。たとえば、多価不動態化剤は、酸化物表面と不動態化剤の間で遷移金属層を維持しながら、遷移金属酸化物表面上の一価の不動態化剤を置換することができる。多価不動態化剤による一価の不動態化剤の置換の模式図は、図６に例示される。この方法で、多価不動態化剤は不動態化表面に相当の加水分解安定性を付与することができる。
【００３６】
多価不動態化剤の不動態化部分は：置換ポリエチレングリコール；非置換ポリエチレングリコール；炭化水素；置換炭化水素；フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される部分とすることができる。
【００３７】
表面上の金属原子と反応性である、あるいは表面上の金属原子と錯体を形成する多数の官能基は、ヒドロキシル基、アミン基、リン酸基、ホスホン酸基、チオール基、アルキルリン酸基、カルボキシル基あるいはその組合せとすることができる。
【００３８】
多価不動態化剤の一般式を以下に示す。
【００３９】
【化３】
【００４０】
（式中：ＲはＨ、アルキル、アリールあるいは官能基であり；Ｌはリンカー基あるいは共有結合であり；ＷおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＮＨ、Ｓあるいはホスホン酸であり；各ＸおよびＺは独立にＨ、リン酸、アルキルカルボキシあるいはアルキルリン酸であり；ｎは３から１００であり；ｏは１〜８であり；ｐは０〜８であり；かつｑは１〜３である。）上記の式に示すように、多価不動態化剤は非置換ポリエチレングリコールを不動態化部分として含む。非置換ポリエチレングリコール不動態化部分が描出されているものの、上記のような他の不動態化部分も使用することができる。
【００４１】
ポリエチレングリコール不動態化部分および多数のヒドロキシル官能基を含む多価不動態化剤を合成する方法を以下に示す。
【００４２】
【化４】
【００４３】
上記の反応スキームに示すように、ポリエチレングリコール部分を含むアミノ官能基化合物を、３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンと８０℃で反応させて多価不動態化剤を形成することができる。この多価不動態化剤については、上記の一般式中の変数は次のように定義される：Ｒはメチルであり；ｎは１１であり、ｓは１であり、ｑは１であり、ＭはＣ＝Ｏであり、Ｎは−ＮＨ−Ｃ−Ｃ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であり、ｏは４であり、ＷおよびＹはＯであり、ＸおよびＺはＨであり、かつｐは１である。
【００４４】
上記に説明されるように、上記の式のリンカーＬをリンカー基とすることができる。典型的なリンカー基は式：−（Ｃ）ｓ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−Ｒ’−Ｑ−（Ｃ＝Ｏ）−（式中、各Ｑは独立に−Ｏ−あるいは−ＮＨ−であり、Ｒ’は脂肪族あるいは芳香族基であり、かつｓは０から１０までの整数である）で表される基を含むが、これに限定されない。
【００４５】
上記の一般式に対応する典型的な多価試薬は以下の式で表される：
【００４６】
【化５】
【００４７】
一部の実施形態によると、多価試薬は以下の式で表すことができる：
【００４８】
【化６】
【００４９】
（式中、ｎは正の整数である。）たとえば、ｎは３から１００とすることができる。
【００５０】
上記に説明されるような多価不動態化剤で処理した表面を有する固形支持体も提供される。一部の実施形態によれば：ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；および置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含み；該不動態化試薬が多数の部位で１つあるいはそれ以上の原子と共有結合、あるいは錯体形成する不動態化試薬を含む固形支持体が提供される。
【００５１】
上記に説明されるように、金属エステルによって表面を修飾すると、非常に穏やかな条件の下で、多様な酸化物層への、非常に制御された、金属前駆体の非常に薄い層の沈着が可能となる。金属エステルは製造が容易であり、かつ使用前の精製を必要としない。金属エステル沈着後の多価不動態化剤の沈着の組合せの使用により、多様な表面型および特性を作成することができる。たとえば、最終表面修飾時に、異なる官能基を有する多価不動態化試薬で表面を処理することができる。
【００５２】
（リン酸部分を含む多価不動態化剤の合成）
多価不動態化剤は、既知の化学合成技術を用いて容易に合成することができる。典型的な合成技術は、不動態化部分としてポリエチレングリコール、および支持体表面上の金属原子と結合することのできる多数のヒドロキシル官能基を含む多価不動態化剤について上記に記載されている。ポリエチレングリコール不動態化部分および多数のリン酸部分を含む多価不動態化剤を合成する方法を以下に示す。リン酸部分は支持体上の金属原子と錯体を形成することができる。
【００５３】
（メチルＰＥＧ２０００−酢酸の合成および精製）
該方法の第一段階は、メチルＰＥＧ２０００−酢酸中間体の合成を含む。この中間体は以下に説明する手順によって合成することができる。
【００５４】
【化７】
【００５５】
この手順は以下に記述される。
１）メチル−ＰＥＧ２０００アルコール（１００グラム、平均０．０５モル）を、窒素下で無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）１００ｍＬに溶解し、ＮａＯＨ（６ｇ、０．１５モル）を加え、氷上で冷却した。
２）ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル（３０ｇ、０．１５モル）を攪拌しながら少量ずつ加えた。最終混合物を室温で２４時間振盪した（ＮａＢｒ固形物の形成により攪拌は困難になった）。
３）遠心分離あるいはデカントによりＮａＢｒ沈殿を除去した。ロータバップで大半のＤＣＭを除去。ヘキサンを加えて未反応のブロモ酢酸ｔ−ブチルエステルを抽出。ヘキサンをデカントした後の半固形物を氷上で（濃）ＨＣｌによりｐＨ１．０に調節し、室温で一晩攪拌した。
４）生成物をＤＣＭで３回抽出し（合計５００ｍＬ）、塩水で洗い、無水ＮａＳＯ４で乾燥した。ロータバップで大半のＤＣＭを除去。攪拌しながら冷ヘキサンを１滴ずつ加え、生成物を沈殿。
５）白色の固形生成物（８５グラム）を捕集し、ヘキサンで洗い、真空下で乾燥し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）による質量分析（ＭＳ）によりポジティブおよびネガティブモードで特性決定した。収率は８３％であった。
【００５６】
（ｍＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−アルコールの合成およびカラム精製）
次に、メチルＰＥＧ２Ｋ−酢酸中間反応生成物を、以下に説明するように、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールと反応させて、多数のヒドロキシル基を含む第２の中間体（すなわちｍＰＥＧ２Ｋアセトアミドートリスーアルコール）を形成することができる。
【００５７】
【化８】
【００５８】
この手順は以下に記述される。
１）メチルＰＥＧ２０００−酢酸（１２グラム、平均０．００６モル）を、無水トルエン（ＤＣＭ）およびアセトニトリルと３回ずつ共蒸発させ（各３０ｍＬ）、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．７５ｍＬ、０．００６モル）を乾燥窒素下で加えた。ジサクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）（３グラム、０．０１２モル）を窒素下で攪拌しながら少量ずつ加えた。反応物を室温で４時間放置し、ロータバップで溶媒を除去した。無水ジオキサン（１０ｍＬ）を加えて残渣を溶解し、溶液を飽和トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス塩基）水溶液に激しく攪拌しながら１滴ずつ加えた。反応物を室温で２時間放置した後、ＤＣＭで３回抽出した（合計１００ｍＬ）。ＤＣＭ相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒の除去後に粗油状物を得た。
２）５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭを充填したシリカゲル（１００ｍＬ）カラムで残渣を精製し、５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭで溶離した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＨＮＭＲ）で画分１２〜２０を所望の生成物（９．５グラム）として同定した。収率は７６％であった。
３）シリカＴＬＣプレート上での１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭにおける生成物のＲｆ値は約０．５であった。
【００５９】
（メチルＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−三リン酸の合成および精製）
次に、ｍＰＥＧ２０００ アセトアミド−トリス−アルコール中間体を、以下に説明するようにビス（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトと反応させて多価不動態化剤を形成することができる。
【００６０】
【化９】
【００６１】
この手順は以下に記述される。
１）ｍＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−アルコール（２．２グラム、１モル）を、無水トルエン（ＤＣＭ）およびアセトニトリルとそれぞれ３回共蒸発させた（各３０ｍＬ）。ビス（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＦＷ＝２７１．６、１．２２ｇ、４．５ｍモル）およびテトラゾール−アセトニトリル溶液（１５ｍＬ、０．４５Ｍ、６．７５ｍモル）を窒素下で加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（７０％水溶液、６ｍＬ、４５ｍモル）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ロータバップで溶媒を除去した。残渣をＤＣＭで３回抽出し、炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥した。１０％メタノールＤＣＭ溶液の溶離液により、残渣をシリカゲルカラムで精製した。ＭＳおよびＨＮＭＲにより、画分１５〜２０を所望の生成物と同定した。
２）シリカＴＬＣプレート上での１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭにおける生成物のＲｆ値は０．５５であった。
３）精製したホスホン酸エステルをＮＨ３．Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）に入れ、室温で一晩インキュベートした。真空下でアンモニアを除去し、水に再溶解し、セファデックスＤＥＡＢ Ａ−２５カラム（２Ｍ重炭酸カリウムで平衡化し、水でよく洗った）で精製した。リン酸を２Ｍ酢酸トリエチルアミン緩衝液で溶離させた。繰り返し真空下で水と共蒸発させることにより緩衝液を除去し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、プロトンＮＭＲおよびホスホロＮＭＲで生成物（１．７グラム）を特性決定した。収率は７０％であった。
【００６２】
（メチルＰＥＧ−３５０アセトアミド−トリス−三リン酸の合成と精製）
メチルＰＥＧ−２Ｋアセトアミド−トリス−三リン酸合成の同じ手順に従い、出発原料メチルＰＥＧ３５０アルコール（平均分子量３５０）を用いて、メチルＰＥＧ−３５０アセトアミド−トリス−三リン酸を合成した。
【００６３】
（実験）
本教示の態様は、以下の実施例に鑑みてさらに理解することができるが、これらは決して本教示の範囲を制限すると理解してはならない。
【００６４】
（金属試薬およびＴＥＧリン酸により処理された表面）
表面上で以下の操作を実施した後の、タンタルＰＥＧ−エステル修飾二酸化ケイ素表面についてのＸＰＳデータを下記の表に示す：
酢酸エチル中で、エチルアルコキシドをＰＥＧ５５０で交換することによってそのＰＥＧ５５０（モノメチルエーテル）エステルに変換した１５ｍＭタンタル（５）溶液により、石英カバーグラスを温度７７℃で１６時間処理；
続いて、２０ｍＭ（モノメチル）一リン酸（ＴＥＧリン酸）テトラエチレングリコール・テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム塩トルエン溶液により、１１０℃で４日間処理。
【００６５】
【表１】
【００６６】
表面上で以下の操作を実施した後のチタンＰＥＧ−エステル修飾二酸化ケイ素表面についてのＸＰＳデータを下記の表に示す：
ジクロロメタン溶媒中で、エチルアルコキシドをＰＥＧ５５０で交換することによってそのＰＥＧ５５０（モノメチルエーテル）エステルに変換した０．０００２ｍＭチタン（４）溶液により、石英カバーグラスをジクロロメタン還流で１８時間処理；
続いて、０．００５ｍＭ（モノメチル）一リン酸テトラエチレングリコール・テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム塩のジクロロメタン溶媒溶液により、ジクロロメタン還流で２４時間間処理。
【００６７】
【表２】
【００６８】
蛍光標識生体分子でインキュベートした後に、表面からの蛍光を測定することにより、これらの修飾表面への生体分子の吸収を試験した。
【００６９】
図７Ａ〜７ＥはＴａＰＥＧ５５０／ＴＥＧリン酸修飾表面を有するカバーグラスの共焦点蛍光撮影の結果を示すプロットである。プロットは１００×１００μｍ画像の画素におけるカウント率のヒストグラムである。図７Ａは、何らかの色素を添加する前の、２．５ｋＨｚ付近でのバックグラウンド蛍光シグナルピークを示す。図７Ｂおよび７Ｃは、１ｎＭ Ａ４８８溶液を添加するときカウント率ヒストグラムピークが７０ｋＨｚにシフトし、かつ色素を除去したときバックグランドに近いシグナルレベルに再度低下することを示す。図７Ｄに示すように、これは同じ１００×１００μｍ領域において１ｎＭ Ｒ１１０溶液でも繰り返される。この場合も、Ｒ１１０をカバーグラスより取り除くとき、蛍光シグナルはバックグラウンドレベルに戻ることが結果より示される（図７Ｅ）。これらの結果より、ローダミン色素Ａ４８８およびＲ１１０は修飾表面と非特異的に結合しないことが立証される。
【００７０】
図８Ａ〜８Ｃは、修飾表面がｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰのカバーグラスとの非特異的結合を防止することを立証する、ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣを用いたＴＰＴａＰＥＧ５５０（リン酸なし）修飾表面の同様のカウント率ヒストグラムを示すプロットである。これは、高濃度のｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰ溶液を表面に添加（図８Ｂ）および除去（図８Ｃ）したときにも認められる。ここでも、これらの結果よりｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰが修飾表面と非特異的に結合しないことが立証される。
【００７１】
図９Ａ〜９Ｃは、ＴａＰＥＧ５５０およびｓｉｌａｎｅＰＥＧ表面修飾カバーグラスと接触させた、上記のローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線の比較を例示する。相関曲線の減衰率は、溶液中の遊離色素の拡散速度に関する情報を提供する。したがって、色素が表面に接着する場合、相関曲線はより緩やかに減衰する。図９Ａは、比較のための、表面の接着性色素を示す長いラグタイム（例：１０ｍ秒など）でのテールを示す相関曲線の例である。図９Ａのためのデータは、還流トルエンよりＰＥＧｓｉｌａｎｅを沈着した、従来法で調製した５％ＰＥＧｓｉｌａｎｅ修飾カバーグラス上の０．１ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＧＴＰより得られた。
【００７２】
図９Ｂは、修飾表面上で拡散するＡ４８８およびＲ１１０希釈溶液から得られた相関曲線を示すプロットである。このプロットは、比較のために、既知の非接着性表面上で自由拡散するＡ４８８についての相関曲線も示す。ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液を用いたＦＣＳ実験も実施し、その結果を図９Ｃに示した。このプロットは、修飾カバーグラス上の異なる位置における３つの異なるＦＣＳ測定値より生成した。同時に、これらのＦＣＳの結果および上記の蛍光撮影の結果より、石英ガラス基板上のＴａＰＥＧ５５０修飾表面は、Ａ４８８、Ｒ１１０、およびｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰと非特異的に結合しないことが立証された。
【００７３】
（複数の多価不動態化剤による金属試薬修飾表面の処理）
石英の表面をＴａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５エタノール溶液で処理して修飾表面を形成した。次に、修飾表面を以下の構造を有する多価不動態化剤のエタノール溶液で処理した：
【００７４】
【化１０】
【００７５】
（ペンタ（ヒドロキシル）−モノメチルＰＥＧ５５０と命名された。）結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。
【００７６】
図１０Ａは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｂは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した、トリス緩衝液中で４時間インキュベートした後の、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｃは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した表面上における、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｄは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、トリス緩衝液中で表面を４時間インキュベートした後の、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ａ〜１０Ｄより見て取れるように、緩衝液の存在下に４時間あった後でも、多価不動態化剤による処理によって、Ｌｉｚ蛍光色素の１００ｎＭ水溶液の非特異的吸着を防止する表面が得られる。
【００７７】
対照的に、図１１Ａ〜１１Ｃに示すように、多価不動態化剤で処理していないＴａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５処理石英スライド上では、１ｎＭの蛍光Ｌｉｚ色素（図１１Ａ）および１００ｎＭの蛍光Ｌｉｚ色素（図１１Ｂ）の若干の接着が認められた。４時間緩衝液の存在下にあった後では、広範な接着が認められた（図１１Ｃ）。
【００７８】
多価不動態化剤（すなわちポリ（ヒドロキシル）−モノメチル−ＰＥＧ）による処理後のＴａ表面の完全性は、以下に示す、ポリ（ヒドロキシル）−モノメチル−ＰＥＧ修飾の前後の修飾石英表面のＸＰＳによって立証される。
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＤＮＡ伸長緩衝液中でのインキュベーションの前（図１２Ａ）および後（図１２Ｂ）に、ＴａＰＥＧ５５０で処理した後ＰＥＧ３５０で処理した石英ガラス表面を示す。ＰＥＧ３５０三リン酸は以下に説明されるような化学構造を有する：
【００８２】
【化１１】
【００８３】
（式中ｎはポリエチレングリコール部分が平均分子量約３５０を有するような値である）。処理表面を１００ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＡＴＰでインキュベートした後、水ですすいで表面に接着していない色素を全て除去した。図１２Ｂより見て取れるように、１００ｎＭ ＬＩＺ−ｄＡＴＰは、処理スライドをＤＮＡ伸長緩衝液でインキュベートした後でも、修飾表面に対して最小限の吸着を示した。
【００８４】
前述の明細書は、例示を目的として提供された実施例により本発明の原理を教示するが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における多様な変更を行うことができることが、当業者によって理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、全般的に表面修飾技術に関し、また具体的には酸化物層上に不動態化表面を形成するための中間体および方法およびこれにより製造される製品に関する。
【０００２】
本明細書は、２００６年１１月２１日に提出された米国暫定特許出願第６０／８６０，２１５号、および２００６年１１月２２日に提出された米国暫定特許出願第６０／８６０，４８０の利点を主張する。上記の明細書はそれぞれその全文が参照文献として本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本明細書で用いられる節の標題は整理のみを目的としており、決して本明細書に記載の主題への制限として解釈されてはならない。
【背景技術】
【０００４】
リアルタイムでのＤＮＡ配列決定は、好ましくは表面上での、ポリメラーゼによる個々の組み込み事象のインテロゲーションを必要とする。一般的に、これらの組み込み事象は、個々の分子として組み込まれたヌクレオチド上の標識を検討することよって同定される（例：単分子検出）。最も一般的な標識は蛍光色素である。表面上におけるまれな標識ヌクレオチドの非特異的吸着であっても、偽陽性シグナルを生成する。したがって、基質の表面への結合は最小化されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薄い不動態化層の形成を考慮し、かつ最小の生体分子吸収を示す表面をもたらすような不動態化技術の改善へのニーズが未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の実施形態によると：
表面がヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陽イオン基を含む、表面を金属試薬と接触させること；および
金属試薬を表面上のヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基と反応させて修飾表面を形成することを含む支持体の表面を修飾する方法が提供され；
このとき金属試薬は以下の式：
Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり；
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ、ｍが整数である）で表される構造を有する。
本実施形態による方法は、不動態化部分およびＹと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する多数の官能基を含む多価試薬と修飾された表面を接触させることをさらに含むことができ、このとき不動態化部分は置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される。
【０００７】
第２の実施形態によれば、以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、このときＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓであり、かつこのときＲ２はアルキル基である）で表される化合物が提供される。
【００１０】
第３の実施形態によれば、不動態化剤とコンジュゲートした金属錯体化剤を含む化合物が提供され、このとき
金属錯体化剤はカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつこのとき
不動態化剤はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される。
【００１１】
第４の実施形態によれば、以下の式：
Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）で表される化合物が提供される。
【００１２】
第５の実施形態によれば：
式：Ｙ（ＯＲ６）ｍ
の第１の化合物をそれぞれ式：Ｐｏｌ−ＬＨ
である１つあるいはそれ以上の第２の化合物と反応させて式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｒ６はＣ１〜Ｃ５炭化水素であり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の金属エステル化合物を形成することを含む方法が提供される。
【００１３】
第６の実施形態によれば：
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；および
部分が以下の式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり；
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであるか、あるいはＬは金属錯体化剤であり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
このとき酸素原子はこれとあるいは酸化物層内の異なるケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウムあるいはスズ原子と結合する）において説明されるような構造を有する、酸化物層の表面部分を含む固形支持体が提供される。
金属錯体化剤の非限定的な例はカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンを含む。
【００１６】
第７の実施形態によれば：
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；
酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；
置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含む不動態化剤を含み；
不動態化試薬は多数の部位で１つあるいはそれ以上の金属原子と共有結合あるいは錯体形成する固形支持体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
当業者は、以下に記載する図面が、例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を限定することを全く意図していない。
【００１８】
【図１Ａ】１つの実施例にしたがって不動態化することのできる、ヒドロキシル基を含む酸化物層を描出する概略図である。
【図１Ｂ】さらなる実施例にしたがって不動態化することのできる、ヒドロキシド陰イオン基を含む表面を描出する概略図である。
【図２】酸化物表面の修飾に使用することのできる金属試薬の調製を示す。
【図３】金属試薬化合物と酸化物表面の反応により生成する修飾表面を示す。
【図４】図４Ａ、ＢおよびＣは金属試薬で処理した表面と反応させて不動態化表面を形成することのできる、リン酸基を含有する不動態化剤の化学構造を例示する。
【図５】金属試薬処理表面とリン酸基を含む不動態化試薬の相互作用の結果を示す概略図である。
【図６】多数のヒドロキシル基を含む多価ＰＥＧ不動態化剤による表面上の不安定一価不動態化剤の置換を例示する。
【図７Ａ】プロットが１００×１００μｍ画像の画素におけるカウント数である、ＴａＰＥＧ５５０／ＴＥＧリン酸修飾表面を有するカバーグラスの共焦点蛍光撮影の結果を示すプロットである。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図７Ｅ】同上
【図８Ａ】ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰを用いたＴａＰＥＧ５５０（リン酸なし）修飾表面のカウント率ヒストグラムを示すプロットである。
【図８Ｂ】同上
【図８Ｃ】同上
【図９Ａ】表面の接着性色素を示す長いラグタイム（例：１０ｍ秒）のテールを示す、定法で調整した５％Ｐｅｇｓｉｌａｎｅ修飾カバーグラス上で０．１ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＧＴＰより得られた相関曲線である。
【図９Ｂ】ＴａＰＥＧ５５０表面修飾カバーグラス上で拡散するローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線を示す。
【図９Ｃ】ＴａＰＥＧ５５０表面修飾カバーグラス上で拡散するローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線を示す。
【図１０Ａ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｂ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｃ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１０Ｄ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ａ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における１ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ｂ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における１００ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１１Ｃ】Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した石英表面上における、緩衝液存在下に４時間あった後での、１ｎＭ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。
【図１２】ＤＮＡ伸長緩衝液でのインキュベーション前（図１２Ａ）および後（図１２Ｂ）に、ＴａＰＥＧ５５０で処理した後ＰＥＧ３５０−三リン酸により処理した石英ガラスを示す写真であり、このときスライドは１００ｎＭ ＬＩＺ−ｄＡＴＰでインキュベートした後水ですすいで未接着色素を全て取り除いた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書における「あるいは」の使用は、特に明言しない場合、あるいは「および／あるいは」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「および／あるいは」を意味する。本明細書における「ある１つの」の使用は、特に明言しない場合あるいは「１つあるいはそれ以上」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「１つあるいはそれ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は互換的であり、制限的となることを意図していない。さらに、１つあるいはそれ以上の実施形態が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いる場合、当業者は、一部の具体的な場合において、その１つのあるいは複数の実施形態が「ほとんど〜からなる」および／あるいは「〜からなる」という言い回しを用いて代替的に記述することができることを理解するであろう。また、一部の実施形態においては、本教示が実施可能であり続ける限り、工程の順序あるいはある作業を実施する順序は重要でないことも理解すべきである。さらに、一部の実施形態においては２つあるいはそれ以上の工程を同時に実施することもできる。
【００２０】
不動態化表面を作成する、あるいは不動態化剤の末端の官能基との反応を目的とした修飾表面を作成する目的を有する、酸化物（例：シリカ）表面上にアルミニウムあるいは遷移金属化合物（例：エステル）の非常に薄い層を形成するための技術が提供される。該不動態化剤は、自己構成しない、ポリエチレングリコール（すなわちＰＥＧ）とすることができる。試薬を有機溶媒中での使用に適合するものとするために、官能基はテトラブチルアンモニウム対イオンを伴うリン酸あるいは二リン酸基とすることができる。
【００２１】
Ｔａ（５＋）、Ｔｉ（４＋）およびＺｒ（４＋）の遷移金属エステルは市販されている（例：メチル、エチルおよびイソプロピルエステルなどとして）。しかし、不溶性酸化物を生成するこれらのエステルと痕跡量の水との反応性は、被覆表面に対して水性環境におけるその使用を妨げる。さらに、特に市販されているＴｉ（４＋）エステルの、その有機溶媒に対する限られた溶解度は、多くの有機溶媒中でのこれらの試薬の使用を妨げる。
【００２２】
本発明者らは、市販のＴａ（５＋）およびＴｉ（４＋）エステルを、４等量あるいはそれ以上の中分子量（すなわち２つあるいはそれ以上のＥＯ単位）ＰＥＧモノメチルエーテルと反応させて、大半の有機溶媒における優れた可溶性を有し、かつシリカ表面などの酸化物表面上に、非常に予測可能に、それらの金属の非常に薄い層を形成する能力を有する試薬を作成することができることを見いだしている。ある場合には、沈着によって単一分子検出スキームにおける使用に適した不動態化表面を作成する。他の場合には、修飾表面はさらにＰＥＧのリン酸あるいは二リン酸誘導体あるいは他の不動態化剤と反応させて所望の表面を作成することができる。
【００２３】
全体的なスキームは図１〜５に要約されている。
【００２４】
図１Ａは、反応性ヒドロキシル基を含有する酸化物材料（例：ケイ酸塩ガラスあるいは石英）の模式的描出である。表面上のヒドロキシル基は、塩基で処理することによりヒドロキシド陰イオンに変換することができる。図１Ｂは、反応性ヒドロキシド陰イオン基を含有する酸化物材料（例：ケイ酸塩ガラスあるいは石英）の模式的描出である。１つの実施形態によると、表面上のヒドロキシル基は水酸化テトラブチルアンモニウムで処理することによりヒドロキシド陰イオンに変換することができる。これにより有機媒体中で容易に溶媒和物とすることができる四級アンモニウム塩が形成される。
【００２５】
酸化物表面は、不動態化に先立ち、酸素プラズマによって、あるいは水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カリウムメタノール溶液、過酸化水素硫酸溶液（すなわち「ピラニア」溶液）、硝酸硫酸溶液（すなわち「王水」）、過酸化水素アンモニア溶液（すなわち「ＲＣＡ」溶液）、硫酸、フッ化水素酸、ＥＤＴＡによって、あるいはこれらの処理の連続的組合せによって処理することができる。
【００２６】
図２は酸化物表面の修飾に使用することのできる金属試薬の調製を例示する。試薬を合成するために、必要な等量数（すなわちｍ）よりも多くのＰｏｌ−ＬＨ化合物を加えて、金属上の低分子量アルコールの完全な置換を得ることができる。ＰＥＧは金属エステルに添加する前に乾燥しなければならない。数時間後、溶液を排気して置換された低分子量アルコールを除去し、反応を進めて完遂することを助ける。
【００２７】
図３は金属試薬と酸化物表面の反応の結果を示す。原則として、残余の「Ｐｏｌ」（例：ＰＥＧなど）基は金属エステルの未反応部位に残し、これらは後で不溶性金属−パートナー対の変換のために用いられる。これらの「Ｐｏｌ」基の存在により、異なる極性および還流温度のいずれが沈着速度の最適化に必要な場合、これらを利用するための多様な溶媒（例としてたとえば酢酸エチル、トルエン、塩化メチレンなど）の使用が可能となる。金属試薬による表面の修飾によって、多様な条件の下で非常に薄い層（ＸＰＳによる表面元素分析で示されるように）が生成することが確認されている。
【００２８】
ある場合には、金属試薬による酸化物表面の処理によって不動態化表面が得られる。他の場合には、金属試薬による処理によって形成された修飾表面が、追加的な不動態化工程による不動態化表面の形成への中間体となる。図４Ａは、金属試薬修飾酸化物表面を処理して不動態化表面を形成するために用いることのできる、リン酸あるいはホスホン酸などの錯体化剤を有する高分子不動態化剤の化学構造を示す。図４Ａにおいては、置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。
【００２９】
図４Ｂおよび４Ｃに示すように、リン酸エステルはその塩（例：テトラブチルアンモニウム塩）に変換して多様な有機溶媒中への溶解度を改善することができる。図４Ｂおよび４Ｃに示すように、置換基Ｒ４はＮ（Ｒ２）４あるいはＭとすることができ、このときＲ２はアルキル基でありかつＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓであり、また置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素である。
【００３０】
さらに、高分子不動態化剤は全てのあるいは一部の表面に所望の官能基を提供するための置換を含有することができる。例えば、図４Ａ〜４Ｃに示すリン酸エステルのＲ３置換基はビオチン部分を含むことができる。さらに、金属試薬処理表面は、異なる高分子要素を有する不動態化剤の混合物を含む組成物と接触させて、具体的な最終使用用途に最適化した表面を提供することができる。例えば、該不動態化製剤は、所望の表面特性を得るために、ＰＥＧのリン酸あるいは二リン酸エステルとフッ化炭化水素のリン酸あるいは二リン酸エステルの混合物を含有することができる。所望の表面特性は、実験を通じて経験的に決定することができる。図４Ａ〜４Ｃにおいては、ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基とすることができ、また置換基Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。図４Ｂおよび４Ｃにおいても、各Ｒ４置換基はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭとすることができ、このときＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である。
【００３１】
図５は、リン酸基を含む不動態化剤で酸化物表面を処理することにより形成され、該酸化物表面があらかじめ金属試薬で処理される表面を示す。図５よりわかるように、この技術により酸化物表面上に不動態化剤の薄層が生成する。図５においては、Ｒ３置換基はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素とすることができる。図５においても、Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムとすることができ、かつＺはＯ、Ｎあるいはメチレン基とすることができる。
【００３２】
本明細書に記述された金属試薬の使用により、多様な酸化物表面上における金属前駆体の非常に薄い層の制御された作成が可能となる。さらに、表面は非常に穏やかな条件の下で形成することができる。また金属試薬は製造が容易でもあり、かつ使用前の精製を必要としない。
【００３３】
層形成前の金属試薬およびリン酸官能基不動態化剤の使用により、所望の表面の沈着を目的とした入手が容易なリン酸官能基の使用が可能となる。リン酸エステルはオキシ塩化リンおよびアルコール型不動態化剤より容易に合成することができる。合成されたリン酸エステルは、多様な溶媒に容易に可溶であり、かつその金属試薬修飾表面との反応性を未だに保持している誘導体（例：四級アンモニウム誘導体など）に変換することができる。リン酸エステルの表面との反応は、広範な加熱あるいは表面上でのテールしたリン酸の自己構成を必要としない。
【００３４】
金属試薬およびリン酸官能基不動態化試薬を使用すると、リン酸エステルに多様な高分子基を配合することにより、多様な表面型および特性の作成も可能となる。例えば、炭化水素、フッ化炭化水素、およびＰＥＧアルコールのリン酸エステルは、金属試薬処理酸化物表面と接触させる前に混ぜ合わせ、特定の用途にとって望ましい特性を有する修飾表面を得ることも可能である。さらに、特定の官能基（例：ビオチンなど）を含有するリン酸エステルを用いて、他の分子（例：ストレプトアビジンなど）と結合するような表面を得ることも可能である。
【００３５】
（１種類の多価不動態化剤による金属試薬修飾表面の処理）
一部の実施形態によると、上記のように金属試薬で処理した支持体の表面は、続いて不動態化部分、および表面上で共有結合を形成あるいは金属原子との錯体を形成することが可能な多数の官能基を含む多価不動態化剤で処理することができる。たとえば、多価不動態化剤は、酸化物表面と不動態化剤の間で遷移金属層を維持しながら、遷移金属酸化物表面上の一価の不動態化剤を置換することができる。多価不動態化剤による一価の不動態化剤の置換の模式図は、図６に例示される。この方法で、多価不動態化剤は不動態化表面に相当の加水分解安定性を付与することができる。
【００３６】
多価不動態化剤の不動態化部分は：置換ポリエチレングリコール；非置換ポリエチレングリコール；炭化水素；置換炭化水素；フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される部分とすることができる。
【００３７】
表面上の金属原子と反応性である、あるいは表面上の金属原子と錯体を形成する多数の官能基は、ヒドロキシル基、アミン基、リン酸基、ホスホン酸基、チオール基、アルキルリン酸基、カルボキシル基あるいはその組合せとすることができる。
【００３８】
多価不動態化剤の一般式を以下に示す。
【００３９】
【化３】
【００４０】
（式中：ＲはＨ、アルキル、アリールあるいは官能基であり；Ｌはリンカー基あるいは共有結合であり；ＷおよびＹはそれぞれ独立にＯ、ＮＨ、Ｓあるいはホスホン酸であり；各ＸおよびＺは独立にＨ、リン酸、アルキルカルボキシあるいはアルキルリン酸であり；ｎは３から１００であり；ｏは１〜８であり；ｐは０〜８であり；かつｑは１〜３である。）上記の式に示すように、多価不動態化剤は非置換ポリエチレングリコールを不動態化部分として含む。非置換ポリエチレングリコール不動態化部分が描出されているものの、上記のような他の不動態化部分も使用することができる。
【００４１】
ポリエチレングリコール不動態化部分および多数のヒドロキシル官能基を含む多価不動態化剤を合成する方法を以下に示す。
【００４２】
【化４】
【００４３】
上記の反応スキームに示すように、ポリエチレングリコール部分を含むアミノ官能基化合物を、３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンと８０℃で反応させて多価不動態化剤を形成することができる。この多価不動態化剤については、上記の一般式中の変数は次のように定義される：Ｒはメチルであり；ｎは１１であり、ｓは１であり、ｑは１であり、ＭはＣ＝Ｏであり、Ｎは−ＮＨ−Ｃ−Ｃ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であり、ｏは４であり、ＷおよびＹはＯであり、ＸおよびＺはＨであり、かつｐは１である。
【００４４】
上記に説明されるように、上記の式のリンカーＬをリンカー基とすることができる。典型的なリンカー基は式：−（Ｃ）ｓ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−Ｒ’−Ｑ−（Ｃ＝Ｏ）−（式中、各Ｑは独立に−Ｏ−あるいは−ＮＨ−であり、Ｒ’は脂肪族あるいは芳香族基であり、かつｓは０から１０までの整数である）で表される基を含むが、これに限定されない。
【００４５】
上記の一般式に対応する典型的な多価試薬は以下の式で表される：
【００４６】
【化５】
【００４７】
一部の実施形態によると、多価試薬は以下の式で表すことができる：
【００４８】
【化６】
【００４９】
（式中、ｎは正の整数である。）たとえば、ｎは３から１００とすることができる。
【００５０】
上記に説明されるような多価不動態化剤で処理した表面を有する固形支持体も提供される。一部の実施形態によれば：ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；および置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含み；該不動態化試薬が多数の部位で１つあるいはそれ以上の原子と共有結合、あるいは錯体形成する不動態化試薬を含む固形支持体が提供される。
【００５１】
上記に説明されるように、金属エステルによって表面を修飾すると、非常に穏やかな条件の下で、多様な酸化物層への、非常に制御された、金属前駆体の非常に薄い層の沈着が可能となる。金属エステルは製造が容易であり、かつ使用前の精製を必要としない。金属エステル沈着後の多価不動態化剤の沈着の組合せの使用により、多様な表面型および特性を作成することができる。たとえば、最終表面修飾時に、異なる官能基を有する多価不動態化試薬で表面を処理することができる。
【００５２】
（リン酸部分を含む多価不動態化剤の合成）
多価不動態化剤は、既知の化学合成技術を用いて容易に合成することができる。典型的な合成技術は、不動態化部分としてポリエチレングリコール、および支持体表面上の金属原子と結合することのできる多数のヒドロキシル官能基を含む多価不動態化剤について上記に記載されている。ポリエチレングリコール不動態化部分および多数のリン酸部分を含む多価不動態化剤を合成する方法を以下に示す。リン酸部分は支持体上の金属原子と錯体を形成することができる。
【００５３】
（メチルＰＥＧ２０００−酢酸の合成および精製）
該方法の第一段階は、メチルＰＥＧ２０００−酢酸中間体の合成を含む。この中間体は以下に説明する手順によって合成することができる。
【００５４】
【化７】
【００５５】
この手順は以下に記述される。
１）メチル−ＰＥＧ２０００アルコール（１００グラム、平均０．０５モル）を、窒素下で無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）１００ｍＬに溶解し、ＮａＯＨ（６ｇ、０．１５モル）を加え、氷上で冷却した。
２）ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル（３０ｇ、０．１５モル）を攪拌しながら少量ずつ加えた。最終混合物を室温で２４時間振盪した（ＮａＢｒ固形物の形成により攪拌は困難になった）。
３）遠心分離あるいはデカントによりＮａＢｒ沈殿を除去した。ロータバップで大半のＤＣＭを除去。ヘキサンを加えて未反応のブロモ酢酸ｔ−ブチルエステルを抽出。ヘキサンをデカントした後の半固形物を氷上で（濃）ＨＣｌによりｐＨ１．０に調節し、室温で一晩攪拌した。
４）生成物をＤＣＭで３回抽出し（合計５００ｍＬ）、塩水で洗い、無水ＮａＳＯ４で乾燥した。ロータバップで大半のＤＣＭを除去。攪拌しながら冷ヘキサンを１滴ずつ加え、生成物を沈殿。
５）白色の固形生成物（８５グラム）を捕集し、ヘキサンで洗い、真空下で乾燥し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）による質量分析（ＭＳ）によりポジティブおよびネガティブモードで特性決定した。収率は８３％であった。
【００５６】
（ｍＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−アルコールの合成およびカラム精製）
次に、メチルＰＥＧ２Ｋ−酢酸中間反応生成物を、以下に説明するように、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールと反応させて、多数のヒドロキシル基を含む第２の中間体（すなわちｍＰＥＧ２Ｋアセトアミドートリスーアルコール）を形成することができる。
【００５７】
【化８】
【００５８】
この手順は以下に記述される。
１）メチルＰＥＧ２０００−酢酸（１２グラム、平均０．００６モル）を、無水トルエン（ＤＣＭ）およびアセトニトリルと３回ずつ共蒸発させ（各３０ｍＬ）、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．７５ｍＬ、０．００６モル）を乾燥窒素下で加えた。ジサクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）（３グラム、０．０１２モル）を窒素下で攪拌しながら少量ずつ加えた。反応物を室温で４時間放置し、ロータバップで溶媒を除去した。無水ジオキサン（１０ｍＬ）を加えて残渣を溶解し、溶液を飽和トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス塩基）水溶液に激しく攪拌しながら１滴ずつ加えた。反応物を室温で２時間放置した後、ＤＣＭで３回抽出した（合計１００ｍＬ）。ＤＣＭ相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒の除去後に粗油状物を得た。
２）５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭを充填したシリカゲル（１００ｍＬ）カラムで残渣を精製し、５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭで溶離した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＨＮＭＲ）で画分１２〜２０を所望の生成物（９．５グラム）として同定した。収率は７６％であった。
３）シリカＴＬＣプレート上での１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭにおける生成物のＲｆ値は約０．５であった。
【００５９】
（メチルＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−三リン酸の合成および精製）
次に、ｍＰＥＧ２０００ アセトアミド−トリス−アルコール中間体を、以下に説明するようにビス（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトと反応させて多価不動態化剤を形成することができる。
【００６０】
【化９】
【００６１】
この手順は以下に記述される。
１）ｍＰＥＧ２Ｋ アセトアミド−トリス−アルコール（２．２グラム、１モル）を、無水トルエン（ＤＣＭ）およびアセトニトリルとそれぞれ３回共蒸発させた（各３０ｍＬ）。ビス（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＦＷ＝２７１．６、１．２２ｇ、４．５ｍモル）およびテトラゾール−アセトニトリル溶液（１５ｍＬ、０．４５Ｍ、６．７５ｍモル）を窒素下で加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（７０％水溶液、６ｍＬ、４５ｍモル）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ロータバップで溶媒を除去した。残渣をＤＣＭで３回抽出し、炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥した。１０％メタノールＤＣＭ溶液の溶離液により、残渣をシリカゲルカラムで精製した。ＭＳおよびＨＮＭＲにより、画分１５〜２０を所望の生成物と同定した。
２）シリカＴＬＣプレート上での１０％ＭｅＯＨ−ＤＣＭにおける生成物のＲｆ値は０．５５であった。
３）精製したホスホン酸エステルをＮＨ３．Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）に入れ、室温で一晩インキュベートした。真空下でアンモニアを除去し、水に再溶解し、セファデックスＤＥＡＢ Ａ−２５カラム（２Ｍ重炭酸カリウムで平衡化し、水でよく洗った）で精製した。リン酸を２Ｍ酢酸トリエチルアミン緩衝液で溶離させた。繰り返し真空下で水と共蒸発させることにより緩衝液を除去し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、プロトンＮＭＲおよびホスホロＮＭＲで生成物（１．７グラム）を特性決定した。収率は７０％であった。
【００６２】
（メチルＰＥＧ−３５０アセトアミド−トリス−三リン酸の合成と精製）
メチルＰＥＧ−２Ｋアセトアミド−トリス−三リン酸合成の同じ手順に従い、出発原料メチルＰＥＧ３５０アルコール（平均分子量３５０）を用いて、メチルＰＥＧ−３５０アセトアミド−トリス−三リン酸を合成した。
【００６３】
（実験）
本教示の態様は、以下の実施例に鑑みてさらに理解することができるが、これらは決して本教示の範囲を制限すると理解してはならない。
【００６４】
（金属試薬およびＴＥＧリン酸により処理された表面）
表面上で以下の操作を実施した後の、タンタルＰＥＧ−エステル修飾二酸化ケイ素表面についてのＸＰＳデータを下記の表に示す：
酢酸エチル中で、エチルアルコキシドをＰＥＧ５５０で交換することによってそのＰＥＧ５５０（モノメチルエーテル）エステルに変換した１５ｍＭタンタル（５）溶液により、石英カバーグラスを温度７７℃で１６時間処理；
続いて、２０ｍＭ（モノメチル）一リン酸（ＴＥＧリン酸）テトラエチレングリコール・テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム塩トルエン溶液により、１１０℃で４日間処理。
【００６５】
【表１】
【００６６】
表面上で以下の操作を実施した後のチタンＰＥＧ−エステル修飾二酸化ケイ素表面についてのＸＰＳデータを下記の表に示す：
ジクロロメタン溶媒中で、エチルアルコキシドをＰＥＧ５５０で交換することによってそのＰＥＧ５５０（モノメチルエーテル）エステルに変換した０．０００２ｍＭチタン（４）溶液により、石英カバーグラスをジクロロメタン還流で１８時間処理；
続いて、０．００５ｍＭ（モノメチル）一リン酸テトラエチレングリコール・テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム塩のジクロロメタン溶媒溶液により、ジクロロメタン還流で２４時間間処理。
【００６７】
【表２】
【００６８】
蛍光標識生体分子でインキュベートした後に、表面からの蛍光を測定することにより、これらの修飾表面への生体分子の吸収を試験した。
【００６９】
図７Ａ〜７ＥはＴａＰＥＧ５５０／ＴＥＧリン酸修飾表面を有するカバーグラスの共焦点蛍光撮影の結果を示すプロットである。プロットは１００×１００μｍ画像の画素におけるカウント率のヒストグラムである。図７Ａは、何らかの色素を添加する前の、２．５ｋＨｚ付近でのバックグラウンド蛍光シグナルピークを示す。図７Ｂおよび７Ｃは、１ｎＭ Ａ４８８溶液を添加するときカウント率ヒストグラムピークが７０ｋＨｚにシフトし、かつ色素を除去したときバックグランドに近いシグナルレベルに再度低下することを示す。図７Ｄに示すように、これは同じ１００×１００μｍ領域において１ｎＭ Ｒ１１０溶液でも繰り返される。この場合も、Ｒ１１０をカバーグラスより取り除くとき、蛍光シグナルはバックグラウンドレベルに戻ることが結果より示される（図７Ｅ）。これらの結果より、ローダミン色素Ａ４８８およびＲ１１０は修飾表面と非特異的に結合しないことが立証される。
【００７０】
図８Ａ〜８Ｃは、修飾表面がｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰのカバーグラスとの非特異的結合を防止することを立証する、ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣを用いたＴＰＴａＰＥＧ５５０（リン酸なし）修飾表面の同様のカウント率ヒストグラムを示すプロットである。これは、高濃度のｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰ溶液を表面に添加（図８Ｂ）および除去（図８Ｃ）したときにも認められる。ここでも、これらの結果よりｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰが修飾表面と非特異的に結合しないことが立証される。
【００７１】
図９Ａ〜９Ｃは、ＴａＰＥＧ５５０およびｓｉｌａｎｅＰＥＧ表面修飾カバーグラスと接触させた、上記のローダミン色素およびｓｕｌｆｏＬｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液の蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）より得られた相関曲線の比較を例示する。相関曲線の減衰率は、溶液中の遊離色素の拡散速度に関する情報を提供する。したがって、色素が表面に接着する場合、相関曲線はより緩やかに減衰する。図９Ａは、比較のための、表面の接着性色素を示す長いラグタイム（例：１０ｍ秒など）でのテールを示す相関曲線の例である。図９Ａのためのデータは、還流トルエンよりＰＥＧｓｉｌａｎｅを沈着した、従来法で調製した５％ＰＥＧｓｉｌａｎｅ修飾カバーグラス上の０．１ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＧＴＰより得られた。
【００７２】
図９Ｂは、修飾表面上で拡散するＡ４８８およびＲ１１０希釈溶液から得られた相関曲線を示すプロットである。このプロットは、比較のために、既知の非接着性表面上で自由拡散するＡ４８８についての相関曲線も示す。ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰの希釈溶液を用いたＦＣＳ実験も実施し、その結果を図９Ｃに示した。このプロットは、修飾カバーグラス上の異なる位置における３つの異なるＦＣＳ測定値より生成した。同時に、これらのＦＣＳの結果および上記の蛍光撮影の結果より、石英ガラス基板上のＴａＰＥＧ５５０修飾表面は、Ａ４８８、Ｒ１１０、およびｓｕｌｆｏ−Ｌｉｚ ｄＣＴＰと非特異的に結合しないことが立証された。
【００７３】
（複数の多価不動態化剤による金属試薬修飾表面の処理）
石英の表面をＴａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５エタノール溶液で処理して修飾表面を形成した。次に、修飾表面を以下の構造を有する多価不動態化剤のエタノール溶液で処理した：
【００７４】
【化１０】
【００７５】
（ペンタ（ヒドロキシル）−モノメチルＰＥＧ５５０と命名された。）結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。
【００７６】
図１０Ａは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｂは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した、トリス緩衝液中で４時間インキュベートした後の、１ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｃは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した表面上における、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ｄは、Ｔａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５で処理した後ペンタ（ヒドロキシル）モノメチル−ＰＥＧ５５０エタノール溶液で処理した石英表面上における、トリス緩衝液中で表面を４時間インキュベートした後の、１００ｎｍ蛍光ＬＩＺ色素溶液の非特異的結合のデータを示す。図１０Ａ〜１０Ｄより見て取れるように、緩衝液の存在下に４時間あった後でも、多価不動態化剤による処理によって、Ｌｉｚ蛍光色素の１００ｎＭ水溶液の非特異的吸着を防止する表面が得られる。
【００７７】
対照的に、図１１Ａ〜１１Ｃに示すように、多価不動態化剤で処理していないＴａ（モノメチル−ＰＥＧ５５０）５処理石英スライド上では、１ｎＭの蛍光Ｌｉｚ色素（図１１Ａ）および１００ｎＭの蛍光Ｌｉｚ色素（図１１Ｂ）の若干の接着が認められた。４時間緩衝液の存在下にあった後では、広範な接着が認められた（図１１Ｃ）。
【００７８】
多価不動態化剤（すなわちポリ（ヒドロキシル）−モノメチル−ＰＥＧ）による処理後のＴａ表面の完全性は、以下に示す、ポリ（ヒドロキシル）−モノメチル−ＰＥＧ修飾の前後の修飾石英表面のＸＰＳによって立証される。
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＤＮＡ伸長緩衝液中でのインキュベーションの前（図１２Ａ）および後（図１２Ｂ）に、ＴａＰＥＧ５５０で処理した後ＰＥＧ３５０で処理した石英ガラス表面を示す。ＰＥＧ３５０三リン酸は以下に説明されるような化学構造を有する：
【００８２】
【化１１】
【００８３】
（式中ｎはポリエチレングリコール部分が平均分子量約３５０を有するような値である）。処理表面を１００ｎＭ Ｌｉｚ−ｄＡＴＰでインキュベートした後、水ですすいで表面に接着していない色素を全て除去した。図１２Ｂより見て取れるように、１００ｎＭ ＬＩＺ−ｄＡＴＰは、処理スライドをＤＮＡ伸長緩衝液でインキュベートした後でも、修飾表面に対して最小限の吸着を示した。
【００８４】
前述の明細書は、例示を目的として提供された実施例により本発明の原理を教示するが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における多様な変更を行うことができることが、当業者によって理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の表面を修飾する方法であって、前記方法が：
前記表面がヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基を含む、前記表面と金属試薬を接触させること；および
前記表面上で前記金属試薬とヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基を反応させて修飾表面を形成することを含み；
前記金属試薬が以下の式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）で表される構造を有する方法。
【請求項２】
以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）の化合物：
【化１】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、ＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である）を含む不動態化組成物と前記修飾表面を接触させることを含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記不動態化組成物が前記式（ＩＩ）の化合物あるいは前記式（ＩＩＩ）の化合物を含む、請求項２に記載の前記方法。
【請求項４】
Ｒ２がアルキル基でありＲ４がＮ（Ｒ２）４である、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
前処理することが前記支持体の前記表面を酸素プラズマで処理するかあるいは前記支持体の前記表面を水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カリウムメタノール溶液、過酸化水素硫酸溶液、硝酸硫酸溶液、過酸化水素アンモニア溶液、硫酸、フッ化水素酸、ＥＤＴＡ、あるいはその組合せと接触させることを含む、前記支持体の前記表面を前記金属試薬と接触させる前に前記支持体の前記表面を前処理することをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項６】
前記支持体の前記表面が塩基と接触しかつ前記塩基が水酸化テトラブチルアンモニウムである、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記支持体が金属酸化物を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項８】
前記支持体がケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項９】
少なくとも１つの「Ｐｏｌ」基がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの「Ｐｏｌ」基がビオチン部分を含むポリエチレングリコールである、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記不動態化組成物が第１のＲ３基を有する前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第１のリン酸化合物および第２のＲ３基を有する前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第２のリン酸化合物を含みかつ前記第１のＲ３基が前記第２のＲ３基と異なる、請求項２に記載の前記方法。
【請求項１２】
Ｒ３がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項２に記載の前記方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項１４】
請求項２に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項１５】
以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化２】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、ＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である）の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が前記式（ＩＩ）の化合物あるいは前記式（ＩＩＩ）の化合物である、請求項１５に記載の前記化合物。
【請求項１７】
Ｒ４がＮ（Ｒ２）４である、請求項１６に記載の前記化合物。
【請求項１８】
Ｒ２がブチル基である、請求項１７に記載の前記化合物。
【請求項１９】
Ｒ３がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項１５に記載の前記化合物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の前記化合物を含む組成物。
【請求項２１】
前記組成物が前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第１のリン酸化合物および前記第１のリン酸化合物と異なる前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第２のリン酸化合物を含む、請求項２０に記載の前記組成物。
【請求項２２】
式： Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の化合物。
【請求項２３】
ＹがＴａ、Ｔｉ、Ｎｂ、ＺｒおよびＡｌからなる群から選択される、請求項２２に記載の前記化合物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の前記化合物を含む組成物。
【請求項２５】
式：Ｙ（ＯＲ６）ｍの第１の化合物を１つあるいはそれ以上の式：Ｐｏｌ−ＬＨの第２の化合物と反応させて式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｒ６はＣ１〜Ｃ５炭化水素であり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の金属エステル化合物を形成することを含む方法。
【請求項２６】
前記の１つあるいはそれ以上の第２の化合物を前記第１の化合物と少なくともｍ：１のモル比で反応させる、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；および
部分が以下の式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）：
【化３】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであるかあるいはＬは金属錯体化剤であり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
ｍは整数である）で説明されるような構造を有する、前記酸化物層の表面上の前記部分を含み；かつ、前記酸素原子が前記酸化物層中の同じあるいは異なるケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズ原子と結合する固形支持体。
【請求項２８】
ＹがＴａ、Ｔｉ、Ｎｂ、ＺｒおよびＡｌからなる群から選択される、請求項２７に記載の支持体。
【請求項２９】
金属錯体化剤がカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつ
不動態化剤がポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される、前記不動態化剤とコンジュゲートした前記金属錯体化剤を含む化合物。
【請求項３０】
金属錯体化剤がカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつ
不動態化剤がポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される、前記不動態化剤とコンジュゲートした前記金属錯体化剤を含む不動態化組成物と前記修飾表面を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３１】
Ｌがカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択される金属錯体化剤である、請求項２７に記載の前記固形支持体。
【請求項３２】
不動態化部分が置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択され、前記不動態化部分およびＹと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する多数の官能基を含む多価試薬と前記修飾表面を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３３】
Ｙと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する前記多数の官能基が：ヒドロキシル基、アミン基、リン酸基、ホスホン酸基、チオール基、アルキルリン酸基、カルボキシル基およびその組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記多価試薬が以下の式：
【化４】
（式中：
ＲはＨ、アルキル、アリールあるいは官能基であり；
Ｌはリンカー基あるいは共有結合であり；
ＷおよびＹがそれぞれ独立にＯ、ＮＨ、Ｓあるいはリン酸であり；
ＸおよびＺがそれぞれ独立にＨ、リン酸、アルキルカルボキシあるいはアルキルリン酸であり；
ｎが３から１００であり；
ｏが１〜８であり；
ｐが０〜８であり；かつ
ｑが１〜３である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記リンカーＬが式：−（Ｃ）ｓ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−Ｒ’−Ｑ−（Ｃ＝Ｏ）−（式中、各Ｑは独立に−Ｏ−あるいは−ＮＨ−であり、Ｒ’は脂肪族あるいは芳香族基であり、かつｓは０から１０までの整数である）で表される、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記多価試薬が以下の式：
【化５】
（式中、ｎは正の整数である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記多価試薬が以下の式：
【化６】
（式中、ｎは正の整数である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項３９】
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；
酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；
置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含む不動態化剤を含み；
前記不動態化試薬が多数の部位で１つあるいはそれ以上の金属原子と共有結合あるいは錯体形成する固形支持体。
【請求項１】
支持体の表面を修飾する方法であって、前記方法が：
前記表面がヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基を含む、前記表面と金属試薬を接触させること；および
前記表面上で前記金属試薬とヒドロキシルおよび／あるいはオキシド陰イオン基を反応させて修飾表面を形成することを含み；
前記金属試薬が以下の式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）で表される構造を有する方法。
【請求項２】
以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）の化合物：
【化１】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、ＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である）を含む不動態化組成物と前記修飾表面を接触させることを含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記不動態化組成物が前記式（ＩＩ）の化合物あるいは前記式（ＩＩＩ）の化合物を含む、請求項２に記載の前記方法。
【請求項４】
Ｒ２がアルキル基でありＲ４がＮ（Ｒ２）４である、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
前処理することが前記支持体の前記表面を酸素プラズマで処理するかあるいは前記支持体の前記表面を水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カリウムメタノール溶液、過酸化水素硫酸溶液、硝酸硫酸溶液、過酸化水素アンモニア溶液、硫酸、フッ化水素酸、ＥＤＴＡ、あるいはその組合せと接触させることを含む、前記支持体の前記表面を前記金属試薬と接触させる前に前記支持体の前記表面を前処理することをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項６】
前記支持体の前記表面が塩基と接触しかつ前記塩基が水酸化テトラブチルアンモニウムである、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記支持体が金属酸化物を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項８】
前記支持体がケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項９】
少なくとも１つの「Ｐｏｌ」基がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の前記方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの「Ｐｏｌ」基がビオチン部分を含むポリエチレングリコールである、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記不動態化組成物が第１のＲ３基を有する前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第１のリン酸化合物および第２のＲ３基を有する前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第２のリン酸化合物を含みかつ前記第１のＲ３基が前記第２のＲ３基と異なる、請求項２に記載の前記方法。
【請求項１２】
Ｒ３がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項２に記載の前記方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項１４】
請求項２に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項１５】
以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化２】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素であり；かつ
Ｒ４はＮ（Ｒ２）４、あるいはＭであり、ＭはＬｉ、Ｎａ、ＫあるいはＣｓでありかつＲ２はアルキル基である）の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が前記式（ＩＩ）の化合物あるいは前記式（ＩＩＩ）の化合物である、請求項１５に記載の前記化合物。
【請求項１７】
Ｒ４がＮ（Ｒ２）４である、請求項１６に記載の前記化合物。
【請求項１８】
Ｒ２がブチル基である、請求項１７に記載の前記化合物。
【請求項１９】
Ｒ３がポリエチレングリコールあるいは置換ポリエチレングリコールである、請求項１５に記載の前記化合物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の前記化合物を含む組成物。
【請求項２１】
前記組成物が前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第１のリン酸化合物および前記第１のリン酸化合物と異なる前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、あるいは（ＩＩＩ）の第２のリン酸化合物を含む、請求項２０に記載の前記組成物。
【請求項２２】
式： Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の化合物。
【請求項２３】
ＹがＴａ、Ｔｉ、Ｎｂ、ＺｒおよびＡｌからなる群から選択される、請求項２２に記載の前記化合物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の前記化合物を含む組成物。
【請求項２５】
式：Ｙ（ＯＲ６）ｍの第１の化合物を１つあるいはそれ以上の式：Ｐｏｌ−ＬＨの第２の化合物と反応させて式：Ｙ（Ｌ−Ｐｏｌ）ｍ
（式中：
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｒ６はＣ１〜Ｃ５炭化水素であり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであり、
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、かつ、ｍは整数である）の金属エステル化合物を形成することを含む方法。
【請求項２６】
前記の１つあるいはそれ以上の第２の化合物を前記第１の化合物と少なくともｍ：１のモル比で反応させる、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；および
部分が以下の式（Ｉ）あるいは式（ＩＩ）：
【化３】
（式中：
ＸはＯ、Ｎあるいはメチレン基であり；
Ｙは遷移金属、マグネシウムあるいはアルミニウムであり、
Ｌは酸素、イオウ、セレニウムあるいはアミンであるかあるいはＬは金属錯体化剤であり；
各「Ｐｏｌ」基は独立してポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し、
Ｒ３はポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素を表し；かつ
ｍは整数である）で説明されるような構造を有する、前記酸化物層の表面上の前記部分を含み；かつ、前記酸素原子が前記酸化物層中の同じあるいは異なるケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズ原子と結合する固形支持体。
【請求項２８】
ＹがＴａ、Ｔｉ、Ｎｂ、ＺｒおよびＡｌからなる群から選択される、請求項２７に記載の支持体。
【請求項２９】
金属錯体化剤がカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつ
不動態化剤がポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される、前記不動態化剤とコンジュゲートした前記金属錯体化剤を含む化合物。
【請求項３０】
金属錯体化剤がカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択され；かつ
不動態化剤がポリエチレングリコール、置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素あるいは置換フッ化炭化水素からなる群から選択される、前記不動態化剤とコンジュゲートした前記金属錯体化剤を含む不動態化組成物と前記修飾表面を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３１】
Ｌがカルボン酸エステル、ドーパミンおよびアナセリンからなる群から選択される金属錯体化剤である、請求項２７に記載の前記固形支持体。
【請求項３２】
不動態化部分が置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素、および置換フッ化炭化水素からなる群から選択され、前記不動態化部分およびＹと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する多数の官能基を含む多価試薬と前記修飾表面を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３３】
Ｙと反応性であるかあるいはＹと錯体形成する前記多数の官能基が：ヒドロキシル基、アミン基、リン酸基、ホスホン酸基、チオール基、アルキルリン酸基、カルボキシル基およびその組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記多価試薬が以下の式：
【化４】
（式中：
ＲはＨ、アルキル、アリールあるいは官能基であり；
Ｌはリンカー基あるいは共有結合であり；
ＷおよびＹがそれぞれ独立にＯ、ＮＨ、Ｓあるいはリン酸であり；
ＸおよびＺがそれぞれ独立にＨ、リン酸、アルキルカルボキシあるいはアルキルリン酸であり；
ｎが３から１００であり；
ｏが１〜８であり；
ｐが０〜８であり；かつ
ｑが１〜３である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記リンカーＬが式：−（Ｃ）ｓ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｑ−Ｒ’−Ｑ−（Ｃ＝Ｏ）−（式中、各Ｑは独立に−Ｏ−あるいは−ＮＨ−であり、Ｒ’は脂肪族あるいは芳香族基であり、かつｓは０から１０までの整数である）で表される、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記多価試薬が以下の式：
【化５】
（式中、ｎは正の整数である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記多価試薬が以下の式：
【化６】
（式中、ｎは正の整数である）で表される、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載の前記方法で製造される支持体。
【請求項３９】
ケイ素、アルミニウム、ゲルマニウム、ガリウム、インジウム、マグネシウムあるいはスズの酸化物を含む酸化物層；
酸化物層と結合した遷移金属、マグネシウムおよびアルミニウムからなる群から選択される金属原子；
置換ポリエチレングリコール、非置換ポリエチレングリコール、炭化水素、置換炭化水素、フッ化炭化水素および置換フッ化炭化水素からなる群から選択される不動態化部分を含む不動態化剤を含み；
前記不動態化試薬が多数の部位で１つあるいはそれ以上の金属原子と共有結合あるいは錯体形成する固形支持体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５１０２４７（Ｐ２０１０−５１０２４７Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７４１８（Ｐ２００９−５３７４１８）
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８５３４７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６４２９１
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８５３４７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６４２９１
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
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