長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクター
【課 題】 本発明は、８ｋｂ以上の長鎖ＤＮＡ断片を導入するベクターを提供することを目的とする。
【解決手段】２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター。
【解決手段】２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉緑体ゲノムへ８ｋｂｐ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入できる転換用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの基礎研究において、数ｋｂｐの外来ＤＮＡをタバコ葉緑体ゲノムへ導入する葉緑体形質転換技術が確立されている（例えば、特許文献１参照。）。この場合、葉緑体へ目的の遺伝子を運ぶ葉緑体形質転換用ベクターは、ｐＵＣベクター等を基本として作製されている。しかし、従来は、ｐＵＣベクター等のクローン化できる外来ＤＮＡのサイズは、約８ｋｂｐ程度までである。このため例えば脂肪酸合成酵素等のような８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を葉緑体形質転換用ベクターに挿入することは不可能であった。
また、最近のゲノム研究の進展により、機能発現のための遺伝子がクラスター構造をとっているケースが知られている。このような構造をとる遺伝子群は、８ｋｂｐ以上のＤＮＡの大きさを示すケースが多い。このため現在使用されているｐＵＣベクター等を基本骨格とする葉緑体形質転換用ベクターを用いると、クラスター構造をとる遺伝子群のクローニングが困難である。また、クラスター構造をとっている遺伝子は、遺伝子群としての機能を発揮する場合が多い。このため、クラスター構造をとっている遺伝子においては、その遺伝子群を含む長鎖ＤＮＡ断片を導入する事が望ましい。
植物への長鎖ＤＮＡ断片導入について、約８０ｋｂｐのＤＮＡの核ゲノムへの導入成功例が報告されている（非特許文献１参照。）。しかし、植物核への遺伝子導入の場合、花粉の飛散による自然界への遺伝子伝播が問題視されている。一方、花粉の飛散による自然界への遺伝子伝播の可能性が低い、葉緑体形質転換におけるＤＮＡ導入の報告は、最長、約６ｋｂｐまでのＤＮＡ導入例しか報告されていない（非特許文献２参照。）。
【特許文献１】特開２０００−２５３７６８号公報
【非特許文献１】リュー（Ｌｉｕ）等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９９年、第９６巻、ｐ．６５３５−６５４０
【非特許文献２】ロスル（Ｌｏｓｓｌ）等、プラント・セル・レポート（Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．）、２００３年、第２１巻、ｐ．８９１−８９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、葉緑体ゲノムへ８ｋｂ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入できるベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）系の細菌人工合成ベクターに、２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを挿入し、該葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に８ｋｂｐ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入したベクターを作製し、該ベクターを植物の葉細胞の葉緑体ゲノムに導入でき、該植物を形質転換できることを見出した。本発明者らは、これらの知見を基礎として更に研究を重ね、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
［１］ ２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター、
［２］ ２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡが、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐの位置で２分割されて得られる塩基配列を有し、非コード領域で分割された位置から２種類の構造遺伝子側に、それぞれ少なくとも約７００ｂｐの長さを有し、かつ分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも５０ｂｐ有するＤＮＡであることを特徴とする前記［１］に記載のベクター、
［３］ ２種類の構造遺伝子が、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ及び３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶとの組み合わせから選択される２種類の遺伝子であることを特徴とする前記［２］に記載のベクター、
［４］ ８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のベクター、
［５］ ８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、ラン藻ゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡ断片であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のベクター、
［６］ 前記［５］に記載のベクターで作製したラン藻ゲノムライブラリー、
［７］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする植物、
［８］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターを、植物の葉細胞に導入することを特徴とする植物葉緑体の形質転換方法、及び
［９］ ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする前記［８］に記載の形質転換方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明で構築した長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いる事により、従来の葉緑体形質転換用ベクターでは導入が不可能であった、外来長鎖ＤＮＡ断片を導入した葉緑体形質転換植物の創製が可能になった。
さらに、作製した葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノム機能解析用長鎖ゲノムライブラリーの構築にも使用できる。また、長鎖ゲノムライブラリーを構築するベクターを用いると、長鎖ゲノムを直接葉緑体ゲノムへ導入できる、
本発明で構築した長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いることにより、代謝経路に関連する一連の遺伝子群や、多重化有用遺伝子群を葉緑体ゲノムに一括導入することも可能となり、新たな代謝経路や新たな機能を付与した新規植物の創製が可能となる。
また、本発明の形質転換植物は、被導入有用長鎖遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子が花粉によって拡散する恐れがない。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与える等の環境汚染の心配がない。また、系統間で発現が安定している。
本発明の形質転換方法によれば、有益な機能を有するタンパク質をコードする長鎖（又は多重）遺伝子を導入することにより、導入した遺伝子が形質転換された植物中で発現し、有益な機能を有するタンパク質が産生し得る。
【０００７】
さらに、作製した葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノム機能解析用長鎖ゲノムライブラリーの構築にも使用でき、ライブラリーから有用機能を持ったクローンを選び出し、直接葉緑体ゲノムへ形質転換できる。
葉緑体はラン藻などの原核生物と似ている細胞小器官もしくは同様の細胞小器官であると考えられている。また葉緑体ゲノムの遺伝子は原核生物同様ポリシストロニックな発現をする事が知られている。このような事から長鎖ＤＮＡ導入用形質転換ベクターを用いて原核生物であるラン藻ゲノムライブラリーを大腸菌で作製することにより、ラン藻ゲノムの配列の決定や、遺伝子にアノテーション（注釈）をつけることにより有用遺伝子（群）を含んだクローンを選びだせば、選び出したクローンが有するＤＮＡを直接葉緑体ゲノムへ導入する事ができる。また、作製したラン藻ゲノムライブラリーから特定の機能スクリーニングを行う事により機能を有するクローンを選び出すことができ、選び出したクローンが有するＤＮＡを直接葉緑体ゲノムへ導入する事ができる。例えば、ライブラリーから窒素固定を行うクローンを探しだせれば、そのクローンが有するＤＮＡを葉緑体ゲノムへ導入する事がでる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする。以下に、本発明の葉緑体形質転換用ベクターについて詳説する。
【０００９】
本発明において、「葉緑体」とは、緑色植物の、葉その他の緑色組織にある細胞小器官をいう。緑色植物とは、緑色の植物の総称をいい、葉緑素をもち、光合成を行うことができる植物であればその種類は問わない。緑色植物は、緑藻、車軸藻、コケ、シダ、種子植物の各門が属する。好ましい植物としては、タバコ、モロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、コムギ、ワタ、オオムギ、ヒマワリ、キュウリ、レタス、アルファルファ、ダイズ、モロコシ、ポプラ、イネ又はシロイヌナズナ等が挙げられ、特にタバコが好ましい。また、本発明において「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１０】
葉緑体ゲノムＤＮＡとしては、すでにジーンバンク等に登録され明らかになっている各種植物の葉緑体ゲノムＤＮＡ、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ０００４４ Ｓ５４３０４）等が挙げられる。
【００１１】
「２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできる塩基配列を有するＤＮＡであればよく、葉緑体ゲノムＤＮＡに存在する構造遺伝子及び構造遺伝子以外の非コード領域の塩基配列を有するＤＮＡをいうが、葉緑体ゲノムＤＮＡのうち、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の任意の位置（非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐ、好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、より好ましくは約２００〜５００ｂｐの位置）で２分割されて得られる２種類の塩基配列（以下、それぞれを該非コード領域に繋がる構造遺伝子についての構造遺伝子領域という。）をそれぞれ有する２種類のＤＮＡが好ましい。構造遺伝子領域の塩基配列は、分割されて得られる全ての塩基配列を有する必要はない。該塩基配列は、非コード領域で分割された位置から構造遺伝子側に、少なくとも約７００ｂｐ、好ましくは約７００〜２０００ｂｐを有し、かつ該分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも約５０ｂｐ（好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、さらに好ましくは約２００〜８００ｂｐ）有すればよい
【００１２】
上記「構造遺伝子」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡのうち、タンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードしている領域をいう。構造遺伝子としては、例えば光合成にかかわる酵素であるＲｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするｒｂｃＬ遺伝子及び植物において脂肪酸合成に関与している酵素のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードするａｃｃＤ遺伝子が好ましく挙げられる。また、ｒｂｃＬ遺伝子やａｃｃＤ遺伝子以外の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来の好ましい構造遺伝子としては、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））、ｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））又は３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子等が挙げられる。
「非コード領域」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡ上でのタンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードする構造遺伝子以外の領域をいう。非コード領域には、遺伝子発現調節領域（例えばプロモーター、ターミネーター等）などを含む。
【００１３】
非コード領域を挟んで繋がる領域における２種類の構造遺伝子としては、例えば、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ、又は３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶと等を好ましく挙げることができる。とりわけ好ましくは、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子である。
【００１４】
葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の任意の位置で２分割されて得られる２種類の構造遺伝子領域としては、ｔｒｎＧ領域とｔｒｎｆＭ領域；ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域；ｔｒｎＩ領域とｔｒｎＡ領域；３’ｒｐｓ１２遺伝子領域とｔｒｎＶ領域が挙げられる。好ましくは、ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域である。
【００１５】
また、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとしては、上記した葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと実質的に同一の配列、又は葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡと実質的に同一の配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと相同性を示す配列を有し、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできる配列を有するＤＮＡが挙げられる。
前記実質的に同一とは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＮＰ）のことをいう。
「相補的な塩基配列」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡにおいて、その葉緑体ゲノムＤＮＡの塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
「相同性を示す配列」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡにおける、例えば構造遺伝子領域の塩基配列との一致の度合いが少なくとも約５０％、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、とりわけ好ましくは約９５％以上である塩基配列、又は完全な相補性はないが、安定な構造をとるのに十分な塩基対が形成される塩基配列をいう。
【００１６】
また、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとしては、上記した葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできるＤＮＡを単離することによっても、本発明に用いられるＤＮＡが得られる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、配列番号１に示すＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、少なくとも配列番号１で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性はＢＬＡＳＴにより計算された場合である。
【００１７】
上記、長鎖ＤＮＡ断片が葉緑体ゲノム中に導入される位置は、本発明のベクターに使用される２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡによって異なる。２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡがｔｒｎＧ領域由来ＤＮＡとｔｒｎｆＭ領域由来ＤＮＡ、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡ、ｔｒｎＩ領域由来ＤＮＡとｔｒｎＡ領域由来ＤＮＡ又は３’ｒｐｓ１２遺伝子領域由来ＤＮＡとｔｒｎＶ領域由来ＤＮＡである場合、長鎖ＤＮＡ断片は、それぞれ葉緑体ゲノムのｔｒｎＧ領域とｔｒｎｆＭ領域の間、ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域の間、ｔｒｎＩ領域とｔｒｎＡ領域の間又は３’ｒｐｓ１２遺伝子領域とｔｒｎＶ領域の間等であり、それぞれの構造遺伝子から充分な距離を置いた非コード領域が望ましい。前記充分な距離とは、構造遺伝子から少なくとも約５０塩基以上、好ましくは約１００〜１０００塩基程度、より好ましくは約２００〜５００塩基程度である。
以下に葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとして、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡを使用した本発明の葉緑体形質転換用ベクターにつき、より詳細に説明する。ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列としては、例えばタバコ葉緑体ＤＮＡとしてジーンバンクに登録されているａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ０００４４ Ｓ５４３０４における５７５９５．．６１３３１の領域の塩基配列が挙げられる。
【００１８】
ｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているＲｕｂｉｓｃｏ大サブユニットの遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において、初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、前記回路における代謝回転の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。
【００１９】
ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとしては、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列［配列表の配列番号１に示される塩基配列（１７２９ｂｐ）］を有するＤＮＡを用いることができる。また、前記ｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列と相補的な塩基配列、又はｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列中の１個又は複数個の塩基、例えば、１〜数個（約５〜１０）個の塩基が欠失されるか、又は別の塩基に置換されるか、又は１〜数個（約５〜１０）個の別の塩基が付加されるかして改変されたＤＮＡが、タバコ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子領域と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００２０】
また、前記ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子と相同組換えできるＤＮＡであれば、本発明に用いられる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」及び「ストリンジェントな条件」は、上記と同様である。
【００２１】
ａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。
【００２２】
ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとしては、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列［配列表の配列番号２に示される塩基配列（１１８３ｂｐ）］、を有するＤＮＡを用いることができる。また、前記ａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列と相補的な塩基配列、又はａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列中の１個又は複数個の塩基、例えば、１〜数個（約５〜１０）個の塩基が欠失されるか、又は別の塩基に置換されるか、又は１〜数個（約５〜１０）個の別の塩基が付加されるかして改変されたＤＮＡが、タバコ葉緑体ａｃｃＤ遺伝子領域と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００２３】
また、前記ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ葉緑体ａｃｃＤ遺伝子と相同組換えできるＤＮＡであれば、本発明に用いられる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」及び「ストリンジェントな条件」は、上記と同様である。
【００２４】
なお、形質転換される植物の葉緑体全ゲノム塩基配列が未知の場合は、植物の葉緑体ゲノムを公知の方法、例えば新生化学実験講座第２巻 核酸１分離精製（日本生化学会編）東京化学同人、ｐｐ．２９−３２（１９９１）に記載の方法やＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法等に従って抽出し、遺伝子のその配列相同性に基づいて、周知技術に従って単離され得る。この場合、公知のコード配列（例えばタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ又はａｃｃＤ遺伝子の塩基配列）のすべてまたは部分が、形質転換される植物由来のゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー中に存在する配列に対して選択的にハイブリダイズするプローブとして使用されるか、あるいはＰＣＲプライマーを設計するために使用される。
【００２５】
本発明のベクターは、上記２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ配列の間には、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片（以下、単に長鎖ＤＮＡ断片という。）を含むＤＮＡを挿入できる。なお、前記「約８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを挿入できる」とは、約８ｋｂｐ未満のＤＮＡ断片を含むＤＮＡの挿入は当然に可能であり、従来不可能であった約８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡも挿入できるという意味である。
【００２６】
長鎖ＤＮＡ断片としては、約８ｋｂｐ以上、好ましくは約８〜３００ｋｂｐ、より好ましくは約８〜２００ｋｂｐ、さらに好ましくは約８〜１２０ｋｂｐ、とりわけ好ましくは約８〜８０ｋｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ断片で、かつ該ＤＮＡが発現することにより、有用な機能を発揮するＤＮＡであればその種類は特に限定されない。有用な機能を発揮するＤＮＡとしては、例えば植物の物質生産性を向上させる遺伝子を含むＤＮＡ断片、耐環境性を向上させる遺伝子を含むＤＮＡ断片、又は植物を省エネルギー型若しくは低環境負荷型の工業原料生産プロセスとして活用するために必要な複数の遺伝子（調節遺伝子を含む）含むＤＮＡ断片等が挙げられる。長鎖ＤＮＡ断片は、植物固有の遺伝子でも、また外来遺伝子（例えば、他種植物、動物、細菌、酵母等の遺伝子）でもよい。また、長鎖ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子が約８ｋｂｐ以上の塩基配列を有するＤＮＡ断片でもよく、複数の遺伝子を連結して約８ｋｂｐ以上の塩基配列をなすＤＮＡ断片でもよい。このような長鎖ＤＮＡ断片としては、例えば（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子（例えば、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｆａｂＦ遺伝子又はそれらの遺伝子群）を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子（例えば、窒素固定ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ又はそれらの遺伝子群、窒素固定酵素ニトロゲナーゼの制御遺伝子のｎｉｆＡ等）を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子（例えば．カロテノイド生合成酵素群等）を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲス毒素等）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質（例えば、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子（調節遺伝子を含む；例えば、カタラーゼ等）を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子（例えば、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＣ、ｂｃｓＤ等）群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子（例えば、ａｖｅＡ１、ａｖｅＡ２、ａｖｅＡ３等）群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；又は前記（ａ）から（ｎ）で示されるＤＮＡ断片を２以上組み合わせたＤＮＡ断片等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に、リボゾーム結合部位を挿入してもよい。該導入遺伝子を含むＤＮＡの上流にリボソーム結合部位を置くことにより、長鎖ＤＮＡ断片に基づくタンパク質を高発現させることができる。該リボゾーム結合部位は長鎖ＤＮＡ断片の翻訳開始点に連続して上流にあってもよいが、翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることが好ましく、約９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅの略称であり、約４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５’−ＡＧＧＡＧＧＵ−３’の一部又は全部である。
【００２８】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡのＮ末端側上流に植物細胞由来のプロモーターを挿入してもよい。該プロモーターとしては、例えば、エロンゲーションファクター１α遺伝子のプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、３５Ｓプロモーター、ｐｓｂＡプロモーター、ＰＰＤＫプロモーター、ＰｓＰＡＬ１プロモーター、ＰＡＬプロモーター、ＵＢＩＺＭ１ユビキチンプロモーター、ｒｒｎプロモーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のプロモーターが好ましい。なお、上記リボゾーム結合部位を、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に挿入する場合には、該リボゾーム結合部位のさらに上流に前記プロモーターを挿入するのがよい。この場合、該プロモーターは、リボゾーム結合部位の上流であれば、リボゾーム結合部位に連続してもよく、約１〜３０塩基程度上流にあってもよい。
【００２９】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡのＣ末端側下流に植物由来のターミネーターを挿入してもよい。該ターミネーターは、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの下流であれば、該ＤＮＡに連続してもよく、約１〜３０塩基程度下流にあってもよい。該ターミネーターとしては、例えば３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ＯＲＦ２５ｐｏｌｙＡ転写ターミネーター、ＰｓｂＡターミネーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のターミネーターが好ましい。
【００３０】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種の薬剤耐性遺伝子（ａａｄＡ）、又は宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。また、該遺伝子の上流及び下流には、それぞれ該遺伝子を認識するためのプロモーター（以下、ａａｄＡプロモーターと略記する。）及び該遺伝子のターミネーター（以下、ａａｄＡターミネーターと略記する。）を配することが好ましい。該ａａｄＡプロモーター及びａａｄＡターミネーターとして、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。ａａｄＡプロモーター／ａａｄＡ／ａａｄＡターミネーターをａａｄＡカセットということもある。
【００３１】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを有するので、長鎖ＤＮＡ断片が、相同組換えにより植物の葉緑体ゲノムに組み込まれやすくなるという利点がある。
【００３２】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターに使用される、基本ベクターとしては、長鎖ＤＮＡがクローニング可能なベクターである市販のベクターや人工染色体を用いる事ができる。具体的には酵母人工染色体（ＹＡＣ）のベクター（Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９７年，第４７巻，ｐ．１５８−１６３）、細菌人工合成ベクター（ＢＡＣ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター又はフォスミド等が挙げられる。ＹＡＣベクターとしてはｐＹＡＣ２、ｐＹＡＣ３、ｐＹＡＣ４、ｐＹＡＣＮｅｏ等が挙げられる。ＢＡＣベクターとしては、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＢＡＣ、ｐｌｎｄｉｇｏＢＡＣ、ｐＢｅｌｏＢＡＣ等が挙げられる。フォスミドとしては、ｐＣＣＦＯＳ等が挙げられる。好ましくは、ＢＡＣベクターである。
【００３３】
本発明のベクターの作製は例えば図１の手順にしたがって実施できる。まず、タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとの間の領域にマルチクローニングサイトを挿入したｐＵＣ１９を、例えば特開２００２−２７２４７６号公報に記載の方法に従って作製し、増幅する。該マルチクローニングサイトは、複数（約２〜１０）の制限酵素部位（以下、制限酵素サイトともいう。）を有することが好ましい。制限酵素サイトとしては、例えばＮｏｔＩサイト、ＮｈｅＩサイト、ＡｓｃＩサイト、ＰｍｌＩサイト、ＣｌａＩサイト、ＭｌｕＩサイト又はＳａｌＩサイト等が挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｌＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ又はＳａｌＩで切断され得る。
【００３４】
次いで、増幅したｐＵＣ１９から制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとの間の領域にマルチクローニングサイトを含む領域を切り出す。切り出した前記領域をＢＡＣ系ベクター、例えばｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）に公知の方法で挿入し、ｐＴＡ０５を作製する。次いで、ｐＴＡ０５に挿入された前記領域のマルチクローニングサイトの任意の制限酵素サイトを特定の制限酵素を用いて切断し、その切断部位にａａｄＡカセットを挿入することによって、本発明の葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００が作製できる。また、マルチクローニングサイトの他の制限酵素サイトには、例えば長鎖ＤＮＡ断片等を同様に導入することができる。
【００３５】
このようにして作製された本発明のベクターｐＴＡ５００を、本発明の実施態様の１つとして図２に模式図として例示した。図中、ｒｂｃＬはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域を表す。太線の大部分はｐＣＣ１ＢＡＣ由来の塩基配列を表す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｒｎプロモーターを表す。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。塩基配列を記載した部位はマルチクローニングサイトである。マルチクローニングサイトの制限酵素部位、好ましくはＡｓｃＩサイト、ＰｍｌＩサイト、ＣｌａＩサイト、ＭｌｕＩサイト、ＳａｌＩサイトの少なくとも１箇所に長鎖ＤＮＡが挿入されることを表す。
【００３６】
このようにして作製された葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、植物細胞が好ましく、植物の葉緑体がさらに好ましい。本発明の葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞、特にその葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。例えば、パーティクルガン法は、ベクターを金又はタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該ベクターの付着した粒子を火薬又は高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００３７】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００３８】
ベクターが導入された植物の葉細胞は、培地で培養し、再分化して植物体とすることができる。カルス誘導培地又は再分化誘導培地の基礎培地としては、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）等が挙げられる。培地には、培地を固めるための支持体等を添加するのがよい。支持体としては、例えば寒天、ゲランガム又はペーパーブリッジ等が挙げられる。
支持体の濃度は、培地のｐＨ等により異なるが、例えばゲランガムの場合は約０．１〜０．５質量％、より好ましくは約０．１５〜０．２５質量％程度が好ましい。
【００３９】
前記基礎培地には、所望により植物ホルモンを添加することができる。植物ホルモンとしては、オーキシン（例．ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等）又はサイトカイニン（例．カイネチン、ゼアチン、ベンジルアデニン、イソペンテニルアデニン、４−ピリジルフェニル尿素等）などが挙げられる。オーキシン及びサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシン及びサイトカイニンにより異なるが、約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２μＭとなるよう基礎培地に添加され得る。
【００４０】
また、上記基礎培地には、アミノ酸（例．グリシン等）、アデニン及び／又はココナツウォーター等を添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウム等でｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００４１】
本発明により形質転換される植物はいずれの種類であってもよく、例えばタバコ、モロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、コムギ、ワタ、オオムギ、ヒマワリ、キュウリ、レタス、アルファルファ、ダイズ、モロコシ、ポプラ、イネ又はシロイヌナズナ等が挙げられる。好ましくはタバコである。
【００４２】
本発明により形質転換された植物は、導入された長鎖ＤＮＡ断片に含まれる遺伝子が発現し、植物に種々の機能を付与することが可能となる。例えば二酸化炭素固定に重要な役目を果たす光合成に関与する酵素群をコードする遺伝子等が植物に導入されることにより、光合成に関与する酵素の産生が、通常の植物より高まり、植物の一次代謝である光合成の機能が改善される。その結果、該植物が早生し、植物の収穫量が増大する。また、前記遺伝子群が導入され、光合成に関与する酵素の産生が高められた植物は、大気中の二酸化炭素の取り込み率を高めるもとができるので、該植物の栽培によって大気中の二酸化炭素濃度を低減できる。よって、該植物を栽培することにより、地球温暖化の抑制にも貢献できる。；窒素固定化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、形質転換された該遺伝子を発現する植物は、窒素固定化酵素が通常の植物より高まり、低窒素条件下でも生育が可能となるので、化学窒素肥料等の低減が図れ、環境に優しい植物の生産が可能となる。また、人為的に肥料を与えることが困難な山野等での窒素源の枯渇に耐え得る植物の生産が可能となる。；脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を導入することにより、形質転換された該遺伝子を発現する植物は、脂肪酸合成酵素が通常の植物より高まり、該植物において脂肪酸合成が促進され植物油の生産量を増やすことができる。；また、植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例えば、カロテノイド生合成酵素群等）を発現できるので、カロテノイド等の有用成分含有の高い植物を生産できる。；バチルス・チューリンゲス毒素等の病虫害耐性タンパク質や５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等の除草剤耐性タンパク質、或いは環境ストレス耐性に係わるカタラーゼ等のタンパク質が植物中で生産されることにより、病虫害に対し耐性を有する植物、除草剤に対し耐性を有する植物、環境に適応性の高い植物等の生産が可能となる。；さらに、ゴム、炭化水素、アミノ酸、生分解性プラスチック原料、セルロース、ポリケチド化合物又は／及びセルロース分解酵素等を、植物を用いて合成し得る。
【００４３】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノムＤＮＡライブライリーの作製に使用できる。該ライブラリーとしては、例えばラン藻ゲノムＤＮＡライブラリー等が挙げられる。
ラン藻等のゲノムＤＮＡライブラリーの作製は、以下の方法により実施できる。
（１）まず、ラン藻ゲノムＤＮＡを抽出する。ラン藻ゲノムＤＮＡは、例えば新生化学実験講座第２巻 核酸１分離精製（日本生化学会編）東京化学同人、ｐｐ．２９−３２（１９９１）に記載の方法に従って抽出できる。
（２）次いで、長鎖ＤＮＡ断片導入前の２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に挿入された上記葉緑体形質転換用ベクターのマルチクローニングサイトの制限酵素サイトを制限酵素で切断する。制限酵素は、マルチクローニングサイトの制限酵素サイトを切断できる制限酵素の１種類又は２種類を用いて実施できる。例えばＭｌｕＩサイトを制限酵素ＭｌｕＩで切断する等が挙げられる。制限酵素の切断末端は、脱リン酸処理することが好ましい。脱リン酸化処理は、例えば市販のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ、ＣＩＡＰ、ＳＡＰ：タカラバイオ株式会社）等を用いて行い得る。
（３）上記（１）で抽出したラン藻ゲノムＤＮＡは、上記（２）においてマルチクローニングサイトを切断した制限酵素と同じ制限酵素、例えばＭｌｕＩで消化する。
（４）制限酵素で消化されたラン藻ゲノムＤＮＡは、葉緑体形質転換用ベクターのマルチクローニングサイトの切断部位にライゲーションにより挿入する。ライゲーションは、例えばＦａｓｔ−Ｌｉｎｋ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）等を用いて行い得る。
（５）制限酵素で消化されたラン藻ゲノムＤＮＡが挿入されたベクターを、例えば大腸菌などの宿主に導入することによりラン藻ゲノムＤＮＡライブラリーが作製できる。宿主への導入は、自体公知の例えば、エレクトロポレーション法等により行う事ができる。
【００４４】
以下に、本発明の長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの作製と、これを用いた、ラン藻ゲノムＤＮＡ断片をタバコ葉緑体に導入した例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの構築
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの塩基配列を配列表の配列番号３に示した。まずタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡ（配列表の配列番号１）とａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡ（配列表の配列番号２）との間の領域にマルチクローニングサイト（配列表の配列番号４）を挿入したｐＵＣ１９を特開２００２−２７２４７６号公報に記載の方法に従って作製した。該マルチクローニングサイトは、制限酵素サイトとして、ＮｈｅＩサイト、ＡｓｃＩサイト、ＭｌｕＩサイト、ＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＰｍｌＩサイト及びＣｌａＩサイトを有する。
増幅したｐＵＣ１９から、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡ／マルチクローニングサイト／ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡを含む領域を切り出した。次いで、切り出した領域を、ｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）のＥｃｏＲＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＴＡ０５を作製した。
別途、ａａｄＡカセットは、ｐＬＤ６（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＢＤ１７４９３１）を鋳型にフォワードプライマー（配列表の配列番号５；５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣ−３’）及びリバースプライマー（配列表の配列番号６；５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＴＡ０５のマルチクローニングサイトのＮｈｅＩ及びＡｓｃＩサイトに導入した。なお、フォワードプライマーの５’側末端は、ＮｈｅＩ制限酵素認識部位を、リバースプライマーの５’側末端は、ＡｓｃＩ制限酵素認識部位を有する。このようにして、基本となる本発明の長鎖ＤＮＡ断片導入用葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００（図２；配列表の配列番号３）を作製した。なお、配列表の配列番号３の塩基配列において、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡは、第３３３番目から第２０６１番目、ａａｄＡカセットは第２０７９第から３４１８番目、ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡは第３４５３番目から第４６３５番目に相当する。
【実施例２】
【００４６】
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いたラン藻ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
（１）ラン藻ゲノムＤＮＡ断片の調製
ラン藻（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＴＵ１２６）は、窒素源無しのＡ−Ｎ培地（Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８年，第３２３巻，ｐ．７２０−７２２）を用いて２７℃、で約１ヶ月間培養を行った。ゲノムの抽出は以下の手順により行った。湿重量約６００ｍｇの菌体を洗浄液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に懸濁し、洗浄した。菌体に１．５ｍＬの飽和ヨウ化ナトリウム水溶液を加え、ミキサーを使って懸濁後、保温（３７℃、２０分間）した。菌体を滅菌水で洗浄後、５４０μＬのＴＥＮ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ］に懸濁した。５０ｍｇ／ｍＬ リゾチームを、６０μＬを加え、混合後、保温（３７℃、２０分間）した。さらに、２０ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫ溶液（和光純薬株式会社）を加えた後、１０％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を３０μＬ加え、保温（５５℃、一晩）した。等量のＴＥ飽和フェノール（株式会社ニッポンジーン）を加え、緩やかに混合（室温、２０分間）した（以下、フェノール処理という。）。遠心分離し、水層を回収し、再度フェノール処理を行った。遠心分離後、回収した水層に等量のクロロホルム−イソアミルアルコール［２４：１（Ｖ／Ｖ）］を加え、緩やかに混合した。遠心分離し、水層を回収した。クロロホルム−イソアミルアルコール［２４：１（Ｖ／Ｖ）］抽出は中間層が消失するまで行った。回収した水層に等量のジエチルエーテルを加え、遠心分離し、水層を回収した。ジエチルエーテル処理を再度行った。水層に２．５倍容のエタノールを加え、緩やかに混合後、遠心分離した。上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄した後、１００μＬのＴＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。このように抽出したラン藻ゲノムに、２μｇのゲノムに対し１０ｕｎｉｔのＭｌｕＩを加え３７℃で、一晩反応させ、ラン藻ゲノムＤＮＡ断片を調製した。
【００４７】
（２）ラン藻ゲノムライブラリーの作製
実施例１で作製した長鎖ＤＮＡ断片導入用葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００のマルチクローニングサイトのＭｌｕＩ部位を制限酵素で切断し、末端を脱リン酸化処理した。脱リン酸化は、アルカリフォスファターゼ［Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）；タカラバイオ株式会社］を用いて添付されているプロトコールに従って行った。リン酸化処理した長鎖ＤＮＡ導入葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００と上記（１）で調製したラン藻ゲノムＤＮＡ断片のライゲーションは、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）を用いて付属のプロトコールに従い行った。ラン藻ゲノムＤＮＡ断片がライゲーションされた上記ベクターをエレクトロポレーションによって大腸菌の中に導入することにより、ゲノムライブラリーを作製した。
作製したライブラリーからランダムにコロニーを選びだし、スペクチノマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にて３７℃、約１６時間培養した。培養した大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドをＭｌｕＩ（約１μｇのプラスミドに対しＭｌｕＩ、１ ｕｎｉｔ）処理（３７℃、２時間）し、パルスフィールド電気泳動（泳動時間１３時間４５分、フォワード９Ｖ／ｃｍ 、リバース６Ｖ／ｃｍ、０．０５−０．９２ｓｅｃ）にて長鎖ＤＮＡ葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００に導入されているラン藻ゲノムのサイズを調べた。ベクターに導入されたゲノムのサイズが約２３、３４、３５ｋｂｐの３種類についてタバコ葉緑体ゲノムへ導入を試みた。
同時にこれら３種類のクローンについてのシーケンスを行った。シーケンス反応は、ＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ社）を用いて行い、シーケンスは、ＣＥＱ８０００システム（ＢＥＣＫＭＡＮ社）で行った。方法はそれぞれ、添付のプロトコールに従った。シーケンス用のプライマーは、上流側は５’−ＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣ−３’（フォワードプライマー；配列表の配列番号２１；配列表の配列番号３の第３２６３−３２８２番目に相当）、下流側は５’−ＣＡＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＣ−３’（リバースプライマー；配列表の配列番号１２；配列表の配列番号３の第３５４９−３５６８に相当）を用いた。
【実施例３】
【００４８】
実施例２で取得したラン藻ゲノムＤＮＡ断片が挿入された長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００を、タバコ葉細胞の葉緑体にパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて導入し、葉緑体形質転換植物を作製した。パーティクルガン導入方法及びベクターを導入したタバコ葉細胞から植物への分化誘導は、既知の方法［Ｚｏｒａ Ｓｖａｂ，Ｐｅｔｅｒ Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，ａｎｄ Ｐａｌ Ｍａｌｉｇａ、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７，８５２６−８５３０（１９９０年）］によった。すなわち、直径０．６ミクロンの金粒子２．３ｍｇ、実施例２で作製した葉緑体形質転換用ベクター２５μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム２５０μＬ及び０．１Ｍスペルミジン５０μＬとを混ぜ、１分毎に懸濁を１０回（懸濁と懸濁の間は氷中に静置）行い、金粒子にベクターを付着させた。金粒子をエタノールで２回洗浄後、６０μＬのエタノールに懸濁した。これは１０回分の打ち込み実験に使用できる量に相当する。パーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてタバコの葉細胞に金粒子を打ち込んだ。１回の実験当たり１０回の打ち込みを行った。打ち込み圧力は９００ｐｓｉであった。打ち込みをして２日後、ベクターを打ち込んだ生葉を３ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地に置床した。
タバコ葉細胞の葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片が導入されたタバコ葉細胞から植物に分化し、成長した植物体を図４に示した。
【実施例４】
【００４９】
ＰＣＲによるタバコ葉緑体形質転換体の解析
実施例３で得られたタバコ植物体の葉組織、約５０ｍｇを採取し、液体窒素下で破砕した。破砕したサンプルにＤＮＡ抽出バッファー［０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍとリス塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５Ｍ尿素、５質量％フェノール］を加えて、混合した。次いで、前記混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール［２５／２４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で抽出し、エタノ−ルでＤＮＡを沈澱させた後、抽出したＤＮＡを風乾した。乾燥した抽出ＤＮＡに１００μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。ラン藻ゲノムＤＮＡ断片の導入の有無を確認するＰＣＲではタバコ植物体から抽出したＤＮＡ溶液を鋳型に表１に示すように、１クローンにつき３種類のｆｏｒｗａｒｄプライマー（表１のＬＴ、ＭＴ、ＳＴ）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー（表１のＬＢ、ＭＢ、ＳＢ）セットを用いてＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
【表１】
【００５１】
前記ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を図５に示した。実施例３の２３ｋｂｐＤＮＡ断片が挿入されたタバコの葉のＤＮＡ抽出物（図５−２；Ａ）及び実施例３に使用したベクター（図５−２；Ｃ）には、２３ｋｂｐのバンドが見られた。２３ｋｂｐＤＮＡ断片の塩基配列は配列表の配列番号２２に示した。このことは、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは２３ｋｂｐ（約８ｋｂｐ以上）のＤＮＡ断片を挿入できることを示す。
表２のプライマーを用いて同様にして、ＰＣＲを行い、３４ｋｂｐＤＮＡ断片（配列表の配列番号２３）及び３５ｋｂｐＤＮＡ断片（配列表の配列番号２４）を確認した。
【００５２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のベクターを用いると、植物の葉緑体ゲノムに長鎖ＤＮＡ断片が導入できるので、新たな代謝経路、機能が付与された新規植物の創製に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクターの構築過程の一実施態様を示す図である。
【図２】図２は長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００の模式図である。ｒｂｃＬはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域を表す。太線の大部分はｐＣＣ１ＢＡＣ由来の塩基配列を表す。ＰｍｌＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＳａｌＩは制限酵素部位を表す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｒｎプロモーターを表す。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。ＰｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡプロモーターを表す。塩基配列を記載した部位はマルチクローニングサイトである。
【図３】図３は、長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクター用いて作ったラン藻ＭｌｕＩ完全消化ゲノムライブラリーを制限酵素ＭｌｕＩで切断した断片のパルスフィールド電気泳動の結果を表す。
【図４】図４は、タバコ葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片を導入した植物体の写真である。
【図５】図５は、タバコ葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片導入の検討を行ったＰＣＲプライマーの位置を模式図（図５−１）とアガロース電気泳動（図５−２）を示す。図中ＬＴ、ＬＢ、ＭＴ、ＭＢ、ＳＴ、ＳＢは使用した、プライマーの名称である。ＬＴ／ＬＢ、ＭＴ／ＭＢ、ＳＴ／ＳＢのプライマーセットでＰＣＲを行った。１．８、２３、０．５ｋｂｐは増幅サイズを表している。Ａ、Ｂ、Ｃは、ＰＣＲの鋳型を示す。Ａ：タバコ形質転換体ＤＮＡ抽出物、Ｂ：タバコ野生型ＤＮＡ抽出物、Ｃ：導入プラスミド、Ｍはマーカーを示す。Ｍ１：λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ２：１ｋｂｐ ｌａｄｄｅｒ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉緑体ゲノムへ８ｋｂｐ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入できる転換用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの基礎研究において、数ｋｂｐの外来ＤＮＡをタバコ葉緑体ゲノムへ導入する葉緑体形質転換技術が確立されている（例えば、特許文献１参照。）。この場合、葉緑体へ目的の遺伝子を運ぶ葉緑体形質転換用ベクターは、ｐＵＣベクター等を基本として作製されている。しかし、従来は、ｐＵＣベクター等のクローン化できる外来ＤＮＡのサイズは、約８ｋｂｐ程度までである。このため例えば脂肪酸合成酵素等のような８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を葉緑体形質転換用ベクターに挿入することは不可能であった。
また、最近のゲノム研究の進展により、機能発現のための遺伝子がクラスター構造をとっているケースが知られている。このような構造をとる遺伝子群は、８ｋｂｐ以上のＤＮＡの大きさを示すケースが多い。このため現在使用されているｐＵＣベクター等を基本骨格とする葉緑体形質転換用ベクターを用いると、クラスター構造をとる遺伝子群のクローニングが困難である。また、クラスター構造をとっている遺伝子は、遺伝子群としての機能を発揮する場合が多い。このため、クラスター構造をとっている遺伝子においては、その遺伝子群を含む長鎖ＤＮＡ断片を導入する事が望ましい。
植物への長鎖ＤＮＡ断片導入について、約８０ｋｂｐのＤＮＡの核ゲノムへの導入成功例が報告されている（非特許文献１参照。）。しかし、植物核への遺伝子導入の場合、花粉の飛散による自然界への遺伝子伝播が問題視されている。一方、花粉の飛散による自然界への遺伝子伝播の可能性が低い、葉緑体形質転換におけるＤＮＡ導入の報告は、最長、約６ｋｂｐまでのＤＮＡ導入例しか報告されていない（非特許文献２参照。）。
【特許文献１】特開２０００−２５３７６８号公報
【非特許文献１】リュー（Ｌｉｕ）等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９９年、第９６巻、ｐ．６５３５−６５４０
【非特許文献２】ロスル（Ｌｏｓｓｌ）等、プラント・セル・レポート（Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．）、２００３年、第２１巻、ｐ．８９１−８９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、葉緑体ゲノムへ８ｋｂ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入できるベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）系の細菌人工合成ベクターに、２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを挿入し、該葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に８ｋｂｐ以上の有用な長鎖ＤＮＡ断片を導入したベクターを作製し、該ベクターを植物の葉細胞の葉緑体ゲノムに導入でき、該植物を形質転換できることを見出した。本発明者らは、これらの知見を基礎として更に研究を重ね、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
［１］ ２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター、
［２］ ２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡが、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐの位置で２分割されて得られる塩基配列を有し、非コード領域で分割された位置から２種類の構造遺伝子側に、それぞれ少なくとも約７００ｂｐの長さを有し、かつ分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも５０ｂｐ有するＤＮＡであることを特徴とする前記［１］に記載のベクター、
［３］ ２種類の構造遺伝子が、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ及び３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶとの組み合わせから選択される２種類の遺伝子であることを特徴とする前記［２］に記載のベクター、
［４］ ８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のベクター、
［５］ ８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、ラン藻ゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡ断片であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のベクター、
［６］ 前記［５］に記載のベクターで作製したラン藻ゲノムライブラリー、
［７］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする植物、
［８］ 前記［１］〜［５］のいずれかに記載のベクターを、植物の葉細胞に導入することを特徴とする植物葉緑体の形質転換方法、及び
［９］ ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする前記［８］に記載の形質転換方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明で構築した長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いる事により、従来の葉緑体形質転換用ベクターでは導入が不可能であった、外来長鎖ＤＮＡ断片を導入した葉緑体形質転換植物の創製が可能になった。
さらに、作製した葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノム機能解析用長鎖ゲノムライブラリーの構築にも使用できる。また、長鎖ゲノムライブラリーを構築するベクターを用いると、長鎖ゲノムを直接葉緑体ゲノムへ導入できる、
本発明で構築した長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いることにより、代謝経路に関連する一連の遺伝子群や、多重化有用遺伝子群を葉緑体ゲノムに一括導入することも可能となり、新たな代謝経路や新たな機能を付与した新規植物の創製が可能となる。
また、本発明の形質転換植物は、被導入有用長鎖遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子が花粉によって拡散する恐れがない。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与える等の環境汚染の心配がない。また、系統間で発現が安定している。
本発明の形質転換方法によれば、有益な機能を有するタンパク質をコードする長鎖（又は多重）遺伝子を導入することにより、導入した遺伝子が形質転換された植物中で発現し、有益な機能を有するタンパク質が産生し得る。
【０００７】
さらに、作製した葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノム機能解析用長鎖ゲノムライブラリーの構築にも使用でき、ライブラリーから有用機能を持ったクローンを選び出し、直接葉緑体ゲノムへ形質転換できる。
葉緑体はラン藻などの原核生物と似ている細胞小器官もしくは同様の細胞小器官であると考えられている。また葉緑体ゲノムの遺伝子は原核生物同様ポリシストロニックな発現をする事が知られている。このような事から長鎖ＤＮＡ導入用形質転換ベクターを用いて原核生物であるラン藻ゲノムライブラリーを大腸菌で作製することにより、ラン藻ゲノムの配列の決定や、遺伝子にアノテーション（注釈）をつけることにより有用遺伝子（群）を含んだクローンを選びだせば、選び出したクローンが有するＤＮＡを直接葉緑体ゲノムへ導入する事ができる。また、作製したラン藻ゲノムライブラリーから特定の機能スクリーニングを行う事により機能を有するクローンを選び出すことができ、選び出したクローンが有するＤＮＡを直接葉緑体ゲノムへ導入する事ができる。例えば、ライブラリーから窒素固定を行うクローンを探しだせれば、そのクローンが有するＤＮＡを葉緑体ゲノムへ導入する事がでる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする。以下に、本発明の葉緑体形質転換用ベクターについて詳説する。
【０００９】
本発明において、「葉緑体」とは、緑色植物の、葉その他の緑色組織にある細胞小器官をいう。緑色植物とは、緑色の植物の総称をいい、葉緑素をもち、光合成を行うことができる植物であればその種類は問わない。緑色植物は、緑藻、車軸藻、コケ、シダ、種子植物の各門が属する。好ましい植物としては、タバコ、モロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、コムギ、ワタ、オオムギ、ヒマワリ、キュウリ、レタス、アルファルファ、ダイズ、モロコシ、ポプラ、イネ又はシロイヌナズナ等が挙げられ、特にタバコが好ましい。また、本発明において「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１０】
葉緑体ゲノムＤＮＡとしては、すでにジーンバンク等に登録され明らかになっている各種植物の葉緑体ゲノムＤＮＡ、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ０００４４ Ｓ５４３０４）等が挙げられる。
【００１１】
「２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできる塩基配列を有するＤＮＡであればよく、葉緑体ゲノムＤＮＡに存在する構造遺伝子及び構造遺伝子以外の非コード領域の塩基配列を有するＤＮＡをいうが、葉緑体ゲノムＤＮＡのうち、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の任意の位置（非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐ、好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、より好ましくは約２００〜５００ｂｐの位置）で２分割されて得られる２種類の塩基配列（以下、それぞれを該非コード領域に繋がる構造遺伝子についての構造遺伝子領域という。）をそれぞれ有する２種類のＤＮＡが好ましい。構造遺伝子領域の塩基配列は、分割されて得られる全ての塩基配列を有する必要はない。該塩基配列は、非コード領域で分割された位置から構造遺伝子側に、少なくとも約７００ｂｐ、好ましくは約７００〜２０００ｂｐを有し、かつ該分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも約５０ｂｐ（好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、さらに好ましくは約２００〜８００ｂｐ）有すればよい
【００１２】
上記「構造遺伝子」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡのうち、タンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードしている領域をいう。構造遺伝子としては、例えば光合成にかかわる酵素であるＲｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするｒｂｃＬ遺伝子及び植物において脂肪酸合成に関与している酵素のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットをコードするａｃｃＤ遺伝子が好ましく挙げられる。また、ｒｂｃＬ遺伝子やａｃｃＤ遺伝子以外の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来の好ましい構造遺伝子としては、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））、ｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））又は３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子等が挙げられる。
「非コード領域」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡ上でのタンパク質、リボソームＲＮＡ又は転移ＲＮＡをコードする構造遺伝子以外の領域をいう。非コード領域には、遺伝子発現調節領域（例えばプロモーター、ターミネーター等）などを含む。
【００１３】
非コード領域を挟んで繋がる領域における２種類の構造遺伝子としては、例えば、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ、又は３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶと等を好ましく挙げることができる。とりわけ好ましくは、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子である。
【００１４】
葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の任意の位置で２分割されて得られる２種類の構造遺伝子領域としては、ｔｒｎＧ領域とｔｒｎｆＭ領域；ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域；ｔｒｎＩ領域とｔｒｎＡ領域；３’ｒｐｓ１２遺伝子領域とｔｒｎＶ領域が挙げられる。好ましくは、ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域である。
【００１５】
また、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとしては、上記した葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと実質的に同一の配列、又は葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡと実質的に同一の配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと相同性を示す配列を有し、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできる配列を有するＤＮＡが挙げられる。
前記実質的に同一とは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＮＰ）のことをいう。
「相補的な塩基配列」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡにおいて、その葉緑体ゲノムＤＮＡの塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
「相同性を示す配列」とは、葉緑体ゲノムＤＮＡにおける、例えば構造遺伝子領域の塩基配列との一致の度合いが少なくとも約５０％、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、とりわけ好ましくは約９５％以上である塩基配列、又は完全な相補性はないが、安定な構造をとるのに十分な塩基対が形成される塩基配列をいう。
【００１６】
また、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとしては、上記した葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、葉緑体ゲノムＤＮＡと相同組換えできるＤＮＡを単離することによっても、本発明に用いられるＤＮＡが得られる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、配列番号１に示すＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、少なくとも配列番号１で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性はＢＬＡＳＴにより計算された場合である。
【００１７】
上記、長鎖ＤＮＡ断片が葉緑体ゲノム中に導入される位置は、本発明のベクターに使用される２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡによって異なる。２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡがｔｒｎＧ領域由来ＤＮＡとｔｒｎｆＭ領域由来ＤＮＡ、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡ、ｔｒｎＩ領域由来ＤＮＡとｔｒｎＡ領域由来ＤＮＡ又は３’ｒｐｓ１２遺伝子領域由来ＤＮＡとｔｒｎＶ領域由来ＤＮＡである場合、長鎖ＤＮＡ断片は、それぞれ葉緑体ゲノムのｔｒｎＧ領域とｔｒｎｆＭ領域の間、ｒｂｃＬ遺伝子領域とａｃｃＤ遺伝子領域の間、ｔｒｎＩ領域とｔｒｎＡ領域の間又は３’ｒｐｓ１２遺伝子領域とｔｒｎＶ領域の間等であり、それぞれの構造遺伝子から充分な距離を置いた非コード領域が望ましい。前記充分な距離とは、構造遺伝子から少なくとも約５０塩基以上、好ましくは約１００〜１０００塩基程度、より好ましくは約２００〜５００塩基程度である。
以下に葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡとして、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡを使用した本発明の葉緑体形質転換用ベクターにつき、より詳細に説明する。ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列としては、例えばタバコ葉緑体ＤＮＡとしてジーンバンクに登録されているａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ０００４４ Ｓ５４３０４における５７５９５．．６１３３１の領域の塩基配列が挙げられる。
【００１８】
ｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているＲｕｂｉｓｃｏ大サブユニットの遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において、初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、前記回路における代謝回転の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。
【００１９】
ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとしては、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列［配列表の配列番号１に示される塩基配列（１７２９ｂｐ）］を有するＤＮＡを用いることができる。また、前記ｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列と相補的な塩基配列、又はｒｂｃＬ遺伝子領域の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列中の１個又は複数個の塩基、例えば、１〜数個（約５〜１０）個の塩基が欠失されるか、又は別の塩基に置換されるか、又は１〜数個（約５〜１０）個の別の塩基が付加されるかして改変されたＤＮＡが、タバコ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子領域と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００２０】
また、前記ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子と相同組換えできるＤＮＡであれば、本発明に用いられる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」及び「ストリンジェントな条件」は、上記と同様である。
【００２１】
ａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼベータサブユニットの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。
【００２２】
ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとしては、例えばタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列［配列表の配列番号２に示される塩基配列（１１８３ｂｐ）］、を有するＤＮＡを用いることができる。また、前記ａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列と相補的な塩基配列、又はａｃｃＤ遺伝子領域の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列中の１個又は複数個の塩基、例えば、１〜数個（約５〜１０）個の塩基が欠失されるか、又は別の塩基に置換されるか、又は１〜数個（約５〜１０）個の別の塩基が付加されるかして改変されたＤＮＡが、タバコ葉緑体ａｃｃＤ遺伝子領域と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００２３】
また、前記ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ葉緑体ａｃｃＤ遺伝子と相同組換えできるＤＮＡであれば、本発明に用いられる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」及び「ストリンジェントな条件」は、上記と同様である。
【００２４】
なお、形質転換される植物の葉緑体全ゲノム塩基配列が未知の場合は、植物の葉緑体ゲノムを公知の方法、例えば新生化学実験講座第２巻 核酸１分離精製（日本生化学会編）東京化学同人、ｐｐ．２９−３２（１９９１）に記載の方法やＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法等に従って抽出し、遺伝子のその配列相同性に基づいて、周知技術に従って単離され得る。この場合、公知のコード配列（例えばタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ又はａｃｃＤ遺伝子の塩基配列）のすべてまたは部分が、形質転換される植物由来のゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー中に存在する配列に対して選択的にハイブリダイズするプローブとして使用されるか、あるいはＰＣＲプライマーを設計するために使用される。
【００２５】
本発明のベクターは、上記２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ配列の間には、約８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片（以下、単に長鎖ＤＮＡ断片という。）を含むＤＮＡを挿入できる。なお、前記「約８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを挿入できる」とは、約８ｋｂｐ未満のＤＮＡ断片を含むＤＮＡの挿入は当然に可能であり、従来不可能であった約８ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡも挿入できるという意味である。
【００２６】
長鎖ＤＮＡ断片としては、約８ｋｂｐ以上、好ましくは約８〜３００ｋｂｐ、より好ましくは約８〜２００ｋｂｐ、さらに好ましくは約８〜１２０ｋｂｐ、とりわけ好ましくは約８〜８０ｋｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ断片で、かつ該ＤＮＡが発現することにより、有用な機能を発揮するＤＮＡであればその種類は特に限定されない。有用な機能を発揮するＤＮＡとしては、例えば植物の物質生産性を向上させる遺伝子を含むＤＮＡ断片、耐環境性を向上させる遺伝子を含むＤＮＡ断片、又は植物を省エネルギー型若しくは低環境負荷型の工業原料生産プロセスとして活用するために必要な複数の遺伝子（調節遺伝子を含む）含むＤＮＡ断片等が挙げられる。長鎖ＤＮＡ断片は、植物固有の遺伝子でも、また外来遺伝子（例えば、他種植物、動物、細菌、酵母等の遺伝子）でもよい。また、長鎖ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子が約８ｋｂｐ以上の塩基配列を有するＤＮＡ断片でもよく、複数の遺伝子を連結して約８ｋｂｐ以上の塩基配列をなすＤＮＡ断片でもよい。このような長鎖ＤＮＡ断片としては、例えば（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子（例えば、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｆａｂＦ遺伝子又はそれらの遺伝子群）を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子（例えば、窒素固定ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ又はそれらの遺伝子群、窒素固定酵素ニトロゲナーゼの制御遺伝子のｎｉｆＡ等）を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子（例えば．カロテノイド生合成酵素群等）を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲス毒素等）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質（例えば、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子（調節遺伝子を含む；例えば、カタラーゼ等）を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子（例えば、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＣ、ｂｃｓＤ等）群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子（例えば、ａｖｅＡ１、ａｖｅＡ２、ａｖｅＡ３等）群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；又は前記（ａ）から（ｎ）で示されるＤＮＡ断片を２以上組み合わせたＤＮＡ断片等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に、リボゾーム結合部位を挿入してもよい。該導入遺伝子を含むＤＮＡの上流にリボソーム結合部位を置くことにより、長鎖ＤＮＡ断片に基づくタンパク質を高発現させることができる。該リボゾーム結合部位は長鎖ＤＮＡ断片の翻訳開始点に連続して上流にあってもよいが、翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることが好ましく、約９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅの略称であり、約４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５’−ＡＧＧＡＧＧＵ−３’の一部又は全部である。
【００２８】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡのＮ末端側上流に植物細胞由来のプロモーターを挿入してもよい。該プロモーターとしては、例えば、エロンゲーションファクター１α遺伝子のプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、３５Ｓプロモーター、ｐｓｂＡプロモーター、ＰＰＤＫプロモーター、ＰｓＰＡＬ１プロモーター、ＰＡＬプロモーター、ＵＢＩＺＭ１ユビキチンプロモーター、ｒｒｎプロモーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のプロモーターが好ましい。なお、上記リボゾーム結合部位を、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの翻訳開始点の上流に挿入する場合には、該リボゾーム結合部位のさらに上流に前記プロモーターを挿入するのがよい。この場合、該プロモーターは、リボゾーム結合部位の上流であれば、リボゾーム結合部位に連続してもよく、約１〜３０塩基程度上流にあってもよい。
【００２９】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡのＣ末端側下流に植物由来のターミネーターを挿入してもよい。該ターミネーターは、長鎖ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの下流であれば、該ＤＮＡに連続してもよく、約１〜３０塩基程度下流にあってもよい。該ターミネーターとしては、例えば３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ＯＲＦ２５ｐｏｌｙＡ転写ターミネーター、ＰｓｂＡターミネーター等が挙げられる。中でも、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のターミネーターが好ましい。
【００３０】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種の薬剤耐性遺伝子（ａａｄＡ）、又は宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。また、該遺伝子の上流及び下流には、それぞれ該遺伝子を認識するためのプロモーター（以下、ａａｄＡプロモーターと略記する。）及び該遺伝子のターミネーター（以下、ａａｄＡターミネーターと略記する。）を配することが好ましい。該ａａｄＡプロモーター及びａａｄＡターミネーターとして、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。ａａｄＡプロモーター／ａａｄＡ／ａａｄＡターミネーターをａａｄＡカセットということもある。
【００３１】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡを有するので、長鎖ＤＮＡ断片が、相同組換えにより植物の葉緑体ゲノムに組み込まれやすくなるという利点がある。
【００３２】
本発明の葉緑体形質転換用ベクターに使用される、基本ベクターとしては、長鎖ＤＮＡがクローニング可能なベクターである市販のベクターや人工染色体を用いる事ができる。具体的には酵母人工染色体（ＹＡＣ）のベクター（Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９７年，第４７巻，ｐ．１５８−１６３）、細菌人工合成ベクター（ＢＡＣ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター又はフォスミド等が挙げられる。ＹＡＣベクターとしてはｐＹＡＣ２、ｐＹＡＣ３、ｐＹＡＣ４、ｐＹＡＣＮｅｏ等が挙げられる。ＢＡＣベクターとしては、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＢＡＣ、ｐｌｎｄｉｇｏＢＡＣ、ｐＢｅｌｏＢＡＣ等が挙げられる。フォスミドとしては、ｐＣＣＦＯＳ等が挙げられる。好ましくは、ＢＡＣベクターである。
【００３３】
本発明のベクターの作製は例えば図１の手順にしたがって実施できる。まず、タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡのｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとの間の領域にマルチクローニングサイトを挿入したｐＵＣ１９を、例えば特開２００２−２７２４７６号公報に記載の方法に従って作製し、増幅する。該マルチクローニングサイトは、複数（約２〜１０）の制限酵素部位（以下、制限酵素サイトともいう。）を有することが好ましい。制限酵素サイトとしては、例えばＮｏｔＩサイト、ＮｈｅＩサイト、ＡｓｃＩサイト、ＰｍｌＩサイト、ＣｌａＩサイト、ＭｌｕＩサイト又はＳａｌＩサイト等が挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｌＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ又はＳａｌＩで切断され得る。
【００３４】
次いで、増幅したｐＵＣ１９から制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡとａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡとの間の領域にマルチクローニングサイトを含む領域を切り出す。切り出した前記領域をＢＡＣ系ベクター、例えばｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）に公知の方法で挿入し、ｐＴＡ０５を作製する。次いで、ｐＴＡ０５に挿入された前記領域のマルチクローニングサイトの任意の制限酵素サイトを特定の制限酵素を用いて切断し、その切断部位にａａｄＡカセットを挿入することによって、本発明の葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００が作製できる。また、マルチクローニングサイトの他の制限酵素サイトには、例えば長鎖ＤＮＡ断片等を同様に導入することができる。
【００３５】
このようにして作製された本発明のベクターｐＴＡ５００を、本発明の実施態様の１つとして図２に模式図として例示した。図中、ｒｂｃＬはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域を表す。太線の大部分はｐＣＣ１ＢＡＣ由来の塩基配列を表す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｒｎプロモーターを表す。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。塩基配列を記載した部位はマルチクローニングサイトである。マルチクローニングサイトの制限酵素部位、好ましくはＡｓｃＩサイト、ＰｍｌＩサイト、ＣｌａＩサイト、ＭｌｕＩサイト、ＳａｌＩサイトの少なくとも１箇所に長鎖ＤＮＡが挿入されることを表す。
【００３６】
このようにして作製された葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、植物細胞が好ましく、植物の葉緑体がさらに好ましい。本発明の葉緑体形質転換用ベクターを宿主細胞、特にその葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。例えば、パーティクルガン法は、ベクターを金又はタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該ベクターの付着した粒子を火薬又は高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００３７】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００３８】
ベクターが導入された植物の葉細胞は、培地で培養し、再分化して植物体とすることができる。カルス誘導培地又は再分化誘導培地の基礎培地としては、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）等が挙げられる。培地には、培地を固めるための支持体等を添加するのがよい。支持体としては、例えば寒天、ゲランガム又はペーパーブリッジ等が挙げられる。
支持体の濃度は、培地のｐＨ等により異なるが、例えばゲランガムの場合は約０．１〜０．５質量％、より好ましくは約０．１５〜０．２５質量％程度が好ましい。
【００３９】
前記基礎培地には、所望により植物ホルモンを添加することができる。植物ホルモンとしては、オーキシン（例．ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等）又はサイトカイニン（例．カイネチン、ゼアチン、ベンジルアデニン、イソペンテニルアデニン、４−ピリジルフェニル尿素等）などが挙げられる。オーキシン及びサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシン及びサイトカイニンにより異なるが、約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２μＭとなるよう基礎培地に添加され得る。
【００４０】
また、上記基礎培地には、アミノ酸（例．グリシン等）、アデニン及び／又はココナツウォーター等を添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウム等でｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００４１】
本発明により形質転換される植物はいずれの種類であってもよく、例えばタバコ、モロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、コムギ、ワタ、オオムギ、ヒマワリ、キュウリ、レタス、アルファルファ、ダイズ、モロコシ、ポプラ、イネ又はシロイヌナズナ等が挙げられる。好ましくはタバコである。
【００４２】
本発明により形質転換された植物は、導入された長鎖ＤＮＡ断片に含まれる遺伝子が発現し、植物に種々の機能を付与することが可能となる。例えば二酸化炭素固定に重要な役目を果たす光合成に関与する酵素群をコードする遺伝子等が植物に導入されることにより、光合成に関与する酵素の産生が、通常の植物より高まり、植物の一次代謝である光合成の機能が改善される。その結果、該植物が早生し、植物の収穫量が増大する。また、前記遺伝子群が導入され、光合成に関与する酵素の産生が高められた植物は、大気中の二酸化炭素の取り込み率を高めるもとができるので、該植物の栽培によって大気中の二酸化炭素濃度を低減できる。よって、該植物を栽培することにより、地球温暖化の抑制にも貢献できる。；窒素固定化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、形質転換された該遺伝子を発現する植物は、窒素固定化酵素が通常の植物より高まり、低窒素条件下でも生育が可能となるので、化学窒素肥料等の低減が図れ、環境に優しい植物の生産が可能となる。また、人為的に肥料を与えることが困難な山野等での窒素源の枯渇に耐え得る植物の生産が可能となる。；脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を導入することにより、形質転換された該遺伝子を発現する植物は、脂肪酸合成酵素が通常の植物より高まり、該植物において脂肪酸合成が促進され植物油の生産量を増やすことができる。；また、植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例えば、カロテノイド生合成酵素群等）を発現できるので、カロテノイド等の有用成分含有の高い植物を生産できる。；バチルス・チューリンゲス毒素等の病虫害耐性タンパク質や５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素等の除草剤耐性タンパク質、或いは環境ストレス耐性に係わるカタラーゼ等のタンパク質が植物中で生産されることにより、病虫害に対し耐性を有する植物、除草剤に対し耐性を有する植物、環境に適応性の高い植物等の生産が可能となる。；さらに、ゴム、炭化水素、アミノ酸、生分解性プラスチック原料、セルロース、ポリケチド化合物又は／及びセルロース分解酵素等を、植物を用いて合成し得る。
【００４３】
また、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは、ゲノムＤＮＡライブライリーの作製に使用できる。該ライブラリーとしては、例えばラン藻ゲノムＤＮＡライブラリー等が挙げられる。
ラン藻等のゲノムＤＮＡライブラリーの作製は、以下の方法により実施できる。
（１）まず、ラン藻ゲノムＤＮＡを抽出する。ラン藻ゲノムＤＮＡは、例えば新生化学実験講座第２巻 核酸１分離精製（日本生化学会編）東京化学同人、ｐｐ．２９−３２（１９９１）に記載の方法に従って抽出できる。
（２）次いで、長鎖ＤＮＡ断片導入前の２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に挿入された上記葉緑体形質転換用ベクターのマルチクローニングサイトの制限酵素サイトを制限酵素で切断する。制限酵素は、マルチクローニングサイトの制限酵素サイトを切断できる制限酵素の１種類又は２種類を用いて実施できる。例えばＭｌｕＩサイトを制限酵素ＭｌｕＩで切断する等が挙げられる。制限酵素の切断末端は、脱リン酸処理することが好ましい。脱リン酸化処理は、例えば市販のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ、ＣＩＡＰ、ＳＡＰ：タカラバイオ株式会社）等を用いて行い得る。
（３）上記（１）で抽出したラン藻ゲノムＤＮＡは、上記（２）においてマルチクローニングサイトを切断した制限酵素と同じ制限酵素、例えばＭｌｕＩで消化する。
（４）制限酵素で消化されたラン藻ゲノムＤＮＡは、葉緑体形質転換用ベクターのマルチクローニングサイトの切断部位にライゲーションにより挿入する。ライゲーションは、例えばＦａｓｔ−Ｌｉｎｋ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）等を用いて行い得る。
（５）制限酵素で消化されたラン藻ゲノムＤＮＡが挿入されたベクターを、例えば大腸菌などの宿主に導入することによりラン藻ゲノムＤＮＡライブラリーが作製できる。宿主への導入は、自体公知の例えば、エレクトロポレーション法等により行う事ができる。
【００４４】
以下に、本発明の長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの作製と、これを用いた、ラン藻ゲノムＤＮＡ断片をタバコ葉緑体に導入した例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの構築
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターの塩基配列を配列表の配列番号３に示した。まずタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡ（配列表の配列番号１）とａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡ（配列表の配列番号２）との間の領域にマルチクローニングサイト（配列表の配列番号４）を挿入したｐＵＣ１９を特開２００２−２７２４７６号公報に記載の方法に従って作製した。該マルチクローニングサイトは、制限酵素サイトとして、ＮｈｅＩサイト、ＡｓｃＩサイト、ＭｌｕＩサイト、ＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＰｍｌＩサイト及びＣｌａＩサイトを有する。
増幅したｐＵＣ１９から、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡ／マルチクローニングサイト／ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡを含む領域を切り出した。次いで、切り出した領域を、ｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）のＥｃｏＲＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＴＡ０５を作製した。
別途、ａａｄＡカセットは、ｐＬＤ６（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＢＤ１７４９３１）を鋳型にフォワードプライマー（配列表の配列番号５；５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣ−３’）及びリバースプライマー（配列表の配列番号６；５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＴＡ０５のマルチクローニングサイトのＮｈｅＩ及びＡｓｃＩサイトに導入した。なお、フォワードプライマーの５’側末端は、ＮｈｅＩ制限酵素認識部位を、リバースプライマーの５’側末端は、ＡｓｃＩ制限酵素認識部位を有する。このようにして、基本となる本発明の長鎖ＤＮＡ断片導入用葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００（図２；配列表の配列番号３）を作製した。なお、配列表の配列番号３の塩基配列において、ｒｂｃＬ遺伝子領域由来ＤＮＡは、第３３３番目から第２０６１番目、ａａｄＡカセットは第２０７９第から３４１８番目、ａｃｃＤ遺伝子領域由来ＤＮＡは第３４５３番目から第４６３５番目に相当する。
【実施例２】
【００４６】
長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターを用いたラン藻ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
（１）ラン藻ゲノムＤＮＡ断片の調製
ラン藻（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＴＵ１２６）は、窒素源無しのＡ−Ｎ培地（Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８年，第３２３巻，ｐ．７２０−７２２）を用いて２７℃、で約１ヶ月間培養を行った。ゲノムの抽出は以下の手順により行った。湿重量約６００ｍｇの菌体を洗浄液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に懸濁し、洗浄した。菌体に１．５ｍＬの飽和ヨウ化ナトリウム水溶液を加え、ミキサーを使って懸濁後、保温（３７℃、２０分間）した。菌体を滅菌水で洗浄後、５４０μＬのＴＥＮ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ］に懸濁した。５０ｍｇ／ｍＬ リゾチームを、６０μＬを加え、混合後、保温（３７℃、２０分間）した。さらに、２０ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫ溶液（和光純薬株式会社）を加えた後、１０％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を３０μＬ加え、保温（５５℃、一晩）した。等量のＴＥ飽和フェノール（株式会社ニッポンジーン）を加え、緩やかに混合（室温、２０分間）した（以下、フェノール処理という。）。遠心分離し、水層を回収し、再度フェノール処理を行った。遠心分離後、回収した水層に等量のクロロホルム−イソアミルアルコール［２４：１（Ｖ／Ｖ）］を加え、緩やかに混合した。遠心分離し、水層を回収した。クロロホルム−イソアミルアルコール［２４：１（Ｖ／Ｖ）］抽出は中間層が消失するまで行った。回収した水層に等量のジエチルエーテルを加え、遠心分離し、水層を回収した。ジエチルエーテル処理を再度行った。水層に２．５倍容のエタノールを加え、緩やかに混合後、遠心分離した。上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄した後、１００μＬのＴＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。このように抽出したラン藻ゲノムに、２μｇのゲノムに対し１０ｕｎｉｔのＭｌｕＩを加え３７℃で、一晩反応させ、ラン藻ゲノムＤＮＡ断片を調製した。
【００４７】
（２）ラン藻ゲノムライブラリーの作製
実施例１で作製した長鎖ＤＮＡ断片導入用葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００のマルチクローニングサイトのＭｌｕＩ部位を制限酵素で切断し、末端を脱リン酸化処理した。脱リン酸化は、アルカリフォスファターゼ［Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）；タカラバイオ株式会社］を用いて添付されているプロトコールに従って行った。リン酸化処理した長鎖ＤＮＡ導入葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００と上記（１）で調製したラン藻ゲノムＤＮＡ断片のライゲーションは、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社）を用いて付属のプロトコールに従い行った。ラン藻ゲノムＤＮＡ断片がライゲーションされた上記ベクターをエレクトロポレーションによって大腸菌の中に導入することにより、ゲノムライブラリーを作製した。
作製したライブラリーからランダムにコロニーを選びだし、スペクチノマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にて３７℃、約１６時間培養した。培養した大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドをＭｌｕＩ（約１μｇのプラスミドに対しＭｌｕＩ、１ ｕｎｉｔ）処理（３７℃、２時間）し、パルスフィールド電気泳動（泳動時間１３時間４５分、フォワード９Ｖ／ｃｍ 、リバース６Ｖ／ｃｍ、０．０５−０．９２ｓｅｃ）にて長鎖ＤＮＡ葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００に導入されているラン藻ゲノムのサイズを調べた。ベクターに導入されたゲノムのサイズが約２３、３４、３５ｋｂｐの３種類についてタバコ葉緑体ゲノムへ導入を試みた。
同時にこれら３種類のクローンについてのシーケンスを行った。シーケンス反応は、ＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ社）を用いて行い、シーケンスは、ＣＥＱ８０００システム（ＢＥＣＫＭＡＮ社）で行った。方法はそれぞれ、添付のプロトコールに従った。シーケンス用のプライマーは、上流側は５’−ＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣ−３’（フォワードプライマー；配列表の配列番号２１；配列表の配列番号３の第３２６３−３２８２番目に相当）、下流側は５’−ＣＡＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＣ−３’（リバースプライマー；配列表の配列番号１２；配列表の配列番号３の第３５４９−３５６８に相当）を用いた。
【実施例３】
【００４８】
実施例２で取得したラン藻ゲノムＤＮＡ断片が挿入された長鎖ＤＮＡ断片導入葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００を、タバコ葉細胞の葉緑体にパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて導入し、葉緑体形質転換植物を作製した。パーティクルガン導入方法及びベクターを導入したタバコ葉細胞から植物への分化誘導は、既知の方法［Ｚｏｒａ Ｓｖａｂ，Ｐｅｔｅｒ Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，ａｎｄ Ｐａｌ Ｍａｌｉｇａ、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７，８５２６−８５３０（１９９０年）］によった。すなわち、直径０．６ミクロンの金粒子２．３ｍｇ、実施例２で作製した葉緑体形質転換用ベクター２５μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム２５０μＬ及び０．１Ｍスペルミジン５０μＬとを混ぜ、１分毎に懸濁を１０回（懸濁と懸濁の間は氷中に静置）行い、金粒子にベクターを付着させた。金粒子をエタノールで２回洗浄後、６０μＬのエタノールに懸濁した。これは１０回分の打ち込み実験に使用できる量に相当する。パーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてタバコの葉細胞に金粒子を打ち込んだ。１回の実験当たり１０回の打ち込みを行った。打ち込み圧力は９００ｐｓｉであった。打ち込みをして２日後、ベクターを打ち込んだ生葉を３ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地に置床した。
タバコ葉細胞の葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片が導入されたタバコ葉細胞から植物に分化し、成長した植物体を図４に示した。
【実施例４】
【００４９】
ＰＣＲによるタバコ葉緑体形質転換体の解析
実施例３で得られたタバコ植物体の葉組織、約５０ｍｇを採取し、液体窒素下で破砕した。破砕したサンプルにＤＮＡ抽出バッファー［０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍとリス塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５Ｍ尿素、５質量％フェノール］を加えて、混合した。次いで、前記混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール［２５／２４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で抽出し、エタノ−ルでＤＮＡを沈澱させた後、抽出したＤＮＡを風乾した。乾燥した抽出ＤＮＡに１００μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。ラン藻ゲノムＤＮＡ断片の導入の有無を確認するＰＣＲではタバコ植物体から抽出したＤＮＡ溶液を鋳型に表１に示すように、１クローンにつき３種類のｆｏｒｗａｒｄプライマー（表１のＬＴ、ＭＴ、ＳＴ）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー（表１のＬＢ、ＭＢ、ＳＢ）セットを用いてＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
【表１】
【００５１】
前記ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を図５に示した。実施例３の２３ｋｂｐＤＮＡ断片が挿入されたタバコの葉のＤＮＡ抽出物（図５−２；Ａ）及び実施例３に使用したベクター（図５−２；Ｃ）には、２３ｋｂｐのバンドが見られた。２３ｋｂｐＤＮＡ断片の塩基配列は配列表の配列番号２２に示した。このことは、本発明の葉緑体形質転換用ベクターは２３ｋｂｐ（約８ｋｂｐ以上）のＤＮＡ断片を挿入できることを示す。
表２のプライマーを用いて同様にして、ＰＣＲを行い、３４ｋｂｐＤＮＡ断片（配列表の配列番号２３）及び３５ｋｂｐＤＮＡ断片（配列表の配列番号２４）を確認した。
【００５２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のベクターを用いると、植物の葉緑体ゲノムに長鎖ＤＮＡ断片が導入できるので、新たな代謝経路、機能が付与された新規植物の創製に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクターの構築過程の一実施態様を示す図である。
【図２】図２は長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクターｐＴＡ５００の模式図である。ｒｂｃＬはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｂｃＬ遺伝子領域を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のａｃｃＤ遺伝子領域を表す。太線の大部分はｐＣＣ１ＢＡＣ由来の塩基配列を表す。ＰｍｌＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＳａｌＩは制限酵素部位を表す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｒｒｎプロモーターを表す。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。ＰｐｓｂＡはタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のｐｓｂＡプロモーターを表す。塩基配列を記載した部位はマルチクローニングサイトである。
【図３】図３は、長鎖ＤＮＡ断片葉緑体形質転換用ベクター用いて作ったラン藻ＭｌｕＩ完全消化ゲノムライブラリーを制限酵素ＭｌｕＩで切断した断片のパルスフィールド電気泳動の結果を表す。
【図４】図４は、タバコ葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片を導入した植物体の写真である。
【図５】図５は、タバコ葉緑体ゲノムへ約２３ｋｂｐのラン藻ゲノム断片導入の検討を行ったＰＣＲプライマーの位置を模式図（図５−１）とアガロース電気泳動（図５−２）を示す。図中ＬＴ、ＬＢ、ＭＴ、ＭＢ、ＳＴ、ＳＢは使用した、プライマーの名称である。ＬＴ／ＬＢ、ＭＴ／ＭＢ、ＳＴ／ＳＢのプライマーセットでＰＣＲを行った。１．８、２３、０．５ｋｂｐは増幅サイズを表している。Ａ、Ｂ、Ｃは、ＰＣＲの鋳型を示す。Ａ：タバコ形質転換体ＤＮＡ抽出物、Ｂ：タバコ野生型ＤＮＡ抽出物、Ｃ：導入プラスミド、Ｍはマーカーを示す。Ｍ１：λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ２：１ｋｂｐ ｌａｄｄｅｒ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項２】
２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡが、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐの位置で２分割されて得られる塩基配列を有し、非コード領域で分割された位置から２種類の構造遺伝子側に、それぞれ少なくとも約７００ｂｐの長さを有し、かつ分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも５０ｂｐ有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
２種類の構造遺伝子が、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ及び３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶとの組み合わせから選択される２種類の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、ラン藻ゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡ断片であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで作製したラン藻ゲノムライブラリー。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする植物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターを、植物の葉細胞に導入することを特徴とする植物葉緑体の形質転換方法。
【請求項９】
ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする請求項８に記載の形質転換方法。
【請求項１】
２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡの間に、８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片を有することを特徴とする葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項２】
２種類の葉緑体ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡが、葉緑体ゲノム上で２種類の構造遺伝子がその非コード領域を挟んで繋がる領域の塩基配列において、該非コード領域の５’側末端から３’側に又は３’側末端から５’側に少なくとも約５０ｂｐの位置で２分割されて得られる塩基配列を有し、非コード領域で分割された位置から２種類の構造遺伝子側に、それぞれ少なくとも約７００ｂｐの長さを有し、かつ分割された非コード領域に繋がる構造遺伝子の塩基配列を少なくとも５０ｂｐ有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
２種類の構造遺伝子が、ｔｒｎＧとｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩとｔｒｎＡ及び３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶとの組み合わせから選択される２種類の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、（ａ）脂肪酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｂ）窒素固定酵素ニトロゲナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｃ）光合成に関与するカルビンサイクルの律速酵素群を構成する酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ断片；（ｄ）植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｅ）病虫害耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｆ）除草剤耐性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｇ）環境ストレス耐性遺伝子又は生産効率に関わる遺伝子を含むＤＮＡ断片；（ｈ）ゴムを生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｉ）炭化水素を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｊ）アミノ酸を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｋ）生分解性プラスチック原料等を生合成する遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｌ）セルロース合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｍ）ポリケチド化合物合成酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片；（ｎ）セルロース分解酵素遺伝子群を含むＤＮＡ断片から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
８ｋｂｐ以上の被導入有用長鎖ＤＮＡ断片が、ラン藻ゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡ断片であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで作製したラン藻ゲノムライブラリー。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする植物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のベクターを、植物の葉細胞に導入することを特徴とする植物葉緑体の形質転換方法。
【請求項９】
ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする請求項８に記載の形質転換方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３１４３０１（Ｐ２００６−３１４３０１Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４３２７５（Ｐ２００５−１４３２７５）
【出願日】平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
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