非凝集抗体Ｆｃドメインの製造方法
精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の有用な製造方法が開示される。該方法は、抗体Ｆｃドメインを含んでなる高分子量の凝集ペプチド鎖を、また抗体Ｆｃドメインを含んでなるより低分子量の非凝集ペプチド鎖から分離するためプロテインＡクロマトグラフィーを使用する。本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液は、５％未満の凝集物、および精製にかけられたＦｃペプチド鎖の７０％以上を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体Ｆｃドメインを含んでなる凝集および非凝集ペプチド鎖を分離するためのプロテインＡクロマトグラフィーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃペプチド鎖を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分子の治療剤としての使用は、多様な疾患の処置のための有効なアプローチとなった。下述されるミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）分子のようなＦｃペプチド鎖を含有する抗体由来分子、およびＦｃ融合分子もまた治療的可能性を有する。加えて、これらの分子は、多様な疾患の免疫病因論ならびに他の生物学的過程のより良好な理解を獲得するための有用な研究ツールである。
【０００３】
抗体、ミメティボディおよびＦｃ融合分子の大規模での製造および精製は、治療若しくは研究使用のためこれらのＦｃペプチド鎖分子を製造するのに必要である。こうした分子の製造および精製で一般に遭遇する一問題は、複数のＦｃペプチド鎖分子を含んでなる可溶性高分子量凝集物（例えば２種以上の非凝集低分子量抗体若しくはミメティボディ分子の凝集物）の形成である。こうした凝集物の存在は、若干の患者が凝集物を受領することに応答して生命を脅かす免疫反応に苦しむことができるという危険性のため治療的製剤で高度に望ましくない。加えて、Ｆｃペプチド鎖凝集物は、研究若しくは治療的用途に意図しているＦｃペプチド鎖製剤中の望ましくない不溶性沈殿の形成を引き起こし得る。
【０００４】
Ｆｃペプチド鎖分子の精製の間の一目標は、凝集分子を本質的に含まない非凝集Ｆｃペプチド鎖産物（例えば非凝集低分子量抗体若しくはミメティボディ分子）を高収率で得ることである。典型的に、７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で５％未満の凝集物を含有する精製されたＦｃペプチド鎖の製造が望ましい。
【０００５】
Ｆｃペプチド鎖分子の製造および精製の第一段階の１つは、通常プロテインＡクロマトグラフィー樹脂に基づく精製段階である。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はＦｃペプチド鎖を特異的に結合するプロテインＡペプチド鎖を含んでなる。この結合活性は、凝集若しくは非凝集のＦｃペプチド鎖の間を識別せず、双方がプロテインＡクロマトグラフィー樹脂に結合する。重要なことに、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はこの特異的結合に基づきＦｃペプチド鎖を他の分子から分離する。こうした樹脂は、分子量の差違に基づきＦｃペプチド鎖を他の分子若しくは複合体から分離しない。結果、慣習的プロテインＡクロマトグラフィー法において、凝集高分子量Ｆｃペプチド鎖および非凝集低分子量Ｆｃペプチド鎖双方が、溶出段階の間にプロテインＡクロマトグラフィー樹脂から遊離される。これは、大量の望ましくない凝集Ｆｃペプチド鎖分子および所望の非凝集Ｆｃペプチド鎖分子双方を含んでなる水性溶液を生じる。
【０００６】
凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖分子を分離する慣習的プロテインＡクロマトグラフィー法の不能の１つの結果は、５％未満の凝集物を含有する非凝集Ｆｃペプチドの調製物を得るためにサイズ排除クロマトグラフィー若しくはイオン交換クロマトグラフィー技術のような数種の付加的な精製過程が必要とされることである。この後処理は高価であり、時間を要し、そして総パーセント収率値を７０％より十分下に低下させる。
【０００７】
従って、付加的な精製過程の使用を伴わない、５％未満の凝集物を含有する精製されたＦｃペプチド鎖調製物を７０％以上の総パーセント収率値で製造する、プロテインＡクロマトグラフィーに基づく精製方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法である。
【０００９】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１０】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１１】
本発明の別の局面は、非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１２】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、引用することによりあたかも完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本明細書および請求の範囲で使用されるところの単数形「ある（ａ、ａｎｄ）」および「該（ｔｈｅ）」は、文脈が別の方法で明瞭に指示しない限り複数の言及を包含する。従
って、例えば、「１ペプチド鎖」への言及は１若しくはそれ以上のペプチド鎖への言及であり、そして当業者に既知のその同等物を包含する。
【００１４】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されると同一の意味を有する。本明細書に記述されるものに類似若しくは同等のいかなる組成物および方法も本発明の実務若しくは試験で使用し得るとは言え、例示的組成物および方法を本明細書に記述する。
【００１５】
「凝集物」という用語は、付加的なＦｃペプチド鎖が４本のＦｃペプチド鎖に共有若しくは非共有結合されているかどうかに依存して４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる分子若しくは複合体を意味している。凝集物の形態の分子若しくは複合体は非凝集形態より大きい分子量を有する。
【００１６】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント、部分若しくはバリアントを含んでなる免疫グロブリンすなわち抗体分子を意味している。抗体は構成的に発現されかつプラズマ細胞により分泌される分泌型タンパク質である。抗体は、ハイブリドーマ生成のような標準的方法により不死化したプラズマ細胞を使用して、または、骨髄腫細胞のような不死化Ｂ細胞若しくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞のような他の細胞型への抗体Ｈおよび／若しくはＬ鎖遺伝子のトランスフェクションによってもまた製造し得る。
【００１７】
「Ｆｃペプチド鎖」という用語は、プロテインＡを結合するのに十分な免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖および免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖の一部分を含んでなるペプチド鎖を意味している。こうした定常領域ペプチド鎖は、ＩｇＧ１のようないずれのアイソタイプの抗体Ｈ鎖由来であってもよく、および「Ｆｃドメイン」ともまた称されることがある（例えば図１を参照されたい）。Ｆｃペプチド鎖は、プロテインＡを結合するのに十分な免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖および免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖の双方を含んでなる個別のペプチド鎖（例えば一本鎖抗体）、または２、３、４若しくはそれ以上のこうした個別のペプチド鎖の会合（例えば抗体若しくはミメティボディ分子の会合）でありうる。Ｆｃペプチド鎖は、例えば、Ｆｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖、およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する分子の一属を表す（図１）。「Ｆｃペプチド鎖」という用語は、非凝集Ｆｃペプチド鎖、凝集Ｆｃペプチド鎖、若しくは凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方を記述するのに使用し得る。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「Ｈ鎖」という用語は、免疫グロブリンおよび抗体分子中で見出される２つの型のポリペプチド鎖の分子量に関してより重いほうを意味している。
【００１９】
「ミメティボディ」という用語は、一般式（Ｉ）：
（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
ここでＭは生物活性ペプチド鎖であり、Ｌはペプチド鎖リンカーであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈは免疫グロブリン可変ヒンジ領域ペプチド鎖の一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖であり、およびＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖であり、ならびにｔは４未満若しくはこれに等しい整数である、
を含んでなるペプチド鎖を意味している。ミメティボディのＣＨ２−ＣＨ３部分は抗体Ｆｃドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインＡにより結合され得るＦｃペプチド
鎖である。ミメティボディ分子はＦｃドメインを含んでなるペプチド鎖の一属を代表する。Ｆｃペプチド鎖のこの属は、例えばＦｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖、およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する（図１）。
【００２０】
「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合により連結されて１本の鎖を形成する最低２アミノ酸残基を含んでなる分子を意味している。５０以上のアミノ酸の大型ペプチド鎖は「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」と称されうる。５０未満のアミノ酸の小型ペプチド鎖は「ペプチド」と称されうる。
【００２１】
「パーセント凝集物」という値は、サンプル中に存在する凝集および非凝集双方の全Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関するサンプル中に存在する凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。この値は、実験データを使用して決定しうるか、若しくは実験データの代表的なデータのセットに当てはめた等式を使用して数学的にコンピュータ計算しうる。
【００２２】
「総パーセント収率」という値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。この値は、実験データを使用して決定しうるか、若しくは実験データの代表的なデータ組に当てはめた等式を使用して数学的にコンピュータ計算しうる。
【００２３】
「総パーセント収率」という値は「特異的パーセント収率」という値と異なる。「特異的パーセント収率」という値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する特定のＦｃペプチドの質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する特定のＦｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。例えば、特定のＦｃペプチド鎖が非凝集Ｆｃペプチド鎖である場合には、「特異的パーセント収率」値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する特定のＦｃペプチドの質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。
【００２４】
「総パーセント収率」値は、望ましいまたは所定の精製段階若しくは過程により生じられる結果を記述するために、「パーセント凝集物」値のような他のパラメータとともに本発明の技術領域で典型的に使用される。
【００２５】
「集団」という用語は２本のプロテインＡペプチド鎖のような最低２品目を意味している。
【００２６】
「プロテインＡ」という用語は、１本のＦｃペプチド鎖を結合することが可能である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５に対する最低８５％の同一性をもつ配列を含んでなるペプチド鎖を意味している。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのＦｃペプチド鎖結合Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインをそれぞれ表す。２ペプチド鎖間の同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用する対（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）アミノ酸配列アライメントにより決定し得る。ＡｌｉｇｎＸは対様式でアミノ酸配列アライメントを実行するのにＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用する。
【００２７】
「非凝集」という用語は上で定義されたところの凝集物を欠くことを意味している。例えば、抗体若しくはミメティボディ分子は、４本の個別のＦｃペプチド鎖をその非凝集形
態で含み得る（図１）が、しかし４本以上の個別のＦｃペプチド鎖をその凝集形態で含むことができる。
【００２８】
本発明は精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の有用な製造方法を提供する。該方法は、また抗体Ｆｃドメインを含んでなるより低分子量の非凝集ペプチド鎖から抗体Ｆｃドメインを含んでなる高分子量の凝集ペプチド鎖を分離するのにプロテインＡクロマトグラフィーを使用する。本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液は、７０％以上という総パーセント収率で５％未満の凝集物を含有する。これらの結果は、精製の間に使用される水性溶液中に洗剤若しくはポリマーを包含することなく達成し得る。
【００２９】
本発明の一局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００３０】
凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルは多様な供給源から得ることができる。例えば、こうしたサンプルは、細胞により媒体中に分泌された凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を含有する細胞培地でありうる。あるいはこうしたサンプルは細胞培養物ライセートでありうる。こうしたサンプルは、水性溶液で再構成される凍結乾燥Ｆｃペプチドのような他の供給源から得ることができる。凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を産生する細胞は、Ｆｃペプチド鎖を発現することが可能な原核生物、真核生物若しくは古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）細胞でありうる。
【００３１】
本発明の方法を使用してＦｃドメインを含んでなるＦｃペプチド鎖分子の一属を精製しうる。Ｆｃペプチド鎖分子のこの属は、例えばＦｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する（図１）。ミメティボディ分子は、Ｆｃドメインを含んでなるペプチド鎖の一属の例示的代表である。
【００３２】
水性サンプル中の非凝集Ｆｃペプチドは４本を超えない個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる。例えば、非凝集Ｆｃペプチドは２個の抗体Ｈ鎖分子および２個の抗体Ｌ鎖分子よりなる抗体分子でありうる（図１）。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。１本のＦｃペプチド鎖が第一のH鎖に存在し、そして１本が第二のＨ鎖に存在する。
【００３３】
非凝集Ｆｃペプチドはまた、１個の抗体Ｈ鎖分子および１個の抗体Ｌ鎖分子よりなる、ときに抗体半分子（ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と称される一本鎖抗体分子でもありうる。こうした分子は、それがただ１本の抗体Ｈ鎖を含有するために４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。
【００３４】
非凝集Ｆｃペプチドは、目的の第二のペプチド鎖に融合された１個のＦｃドメインを含んでなる２本の同一のペプチド鎖よりなるＦｃ融合分子でもまたありうる（図１）。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。１本のＦｃペプチド鎖が第一のＨ鎖に存在し、そして１本が第二のＨ鎖に存在する。
【００３５】
非凝集Ｆｃペプチドは一般式（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）の４本までのペプチド鎖よりなるミメティボディ分子でもまたありうる。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。
【００３６】
非凝集ミメティボディ分子は、図１におよび上の記述により示されるところの抗体分子およびＦｃ融合分子の双方の特徴を含んでなる。ミメティボディ分子の抗体様特徴は、抗体由来可変領域Ｖ２ペプチド鎖配列、抗体由来ヒンジペプチド鎖配列、抗体由来Ｈ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖配列、および抗体由来ＣＨ３定常領域ペプチド鎖配列を包含する。ミメティボディ分子のＦｃ融合分子様特徴は、生物活性Ｍペプチド鎖、抗体Ｈ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖配列および抗体ＣＨ３定常領域ペプチド鎖配列を包含する。結果、ミメティボディ分子は、抗体およびＦｃ融合クラスの分子の双方（図１）ならびにこれらの分子種を含んでなるＦｃペプチド鎖の属（図１）を代表する。
【００３７】
本発明の方法において、水性サンプル中の凝集Ｆｃペプチドは４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる。例えば、凝集Ｆｃペプチド鎖は、会合されたようになった２個以上の抗体分子、２個以上のミメティボディ分子若しくは２個以上のＦｃ融合分子を含みうる。こうした分子は、共有結合、疎水性相互作用若しくは他の非共有結合のようないずれかの機構により会合したようになることができる。
【００３８】
３抗体分子の凝集物は６本の抗体Ｈ鎖および６本の抗体Ｌ鎖を含みうる。こうした分子は各抗体Ｈ鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００３９】
３ミメティボディ分子の凝集物は６本の抗体由来Ｈ鎖ＣＨ２−ＣＨ３ペプチド鎖を含みうる。こうした分子は各Ｈ鎖ＣＨ２−ＣＨ３ペプチド鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４０】
Ｆｃ融合分子の凝集物は、目的の第二のペプチド鎖に融合された１個のＦｃドメインをそれぞれが含んでなる６本の同一ペプチド鎖を含みうる。こうした分子は各ペプチド鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４１】
当業者は、上で例示されたもの（例えば４個若しくはそれ以上の抗体分子の凝集物）以外のより高次の凝集物分子を認識するであろう。加えて、当業者は、抗体、ミメティボディ若しくはＦｃ融合半分子の２個の全分子との会合は、こうした分子が５本の個別のＦｃペプチド鎖を含むことができるために、凝集Ｆｃペプチドを生じることができることを認識するであろう。こうした分子は、それが４本以上の個別のペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４２】
本発明の方法での使用に適する不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団（プロテインＡ複合物質）は多くの異なる形式で提供されうる。１つのこうした形式は例えばプロテインＡクロマトグラフィー樹脂のようなビーズである。典型的には、こうしたビーズ様樹脂をクロマトグラフィーのためのカラムに負荷する。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バーミンガムシャー州リトル・シャルフォント）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はこうした形式の一例である。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、４０ないし１３０μＭの直径（平均直径は８５μＭである）をもつ不溶性の高度に架橋したアガロース素材にエポキシカップリング化学を介し複合された組換え発現されたプロテインＡペプチド鎖の集団を含んでなる。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は媒体
１ｍｌあたりおよそ３０ｍｇのヒトＩｇＧ抗体の動的結合能力を有する。動的結合能力は、２０ｃｍの床高をもつカラム中で５００ｃｍ／ｈの移動相速度での前端分析により１０％破過で測定される。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バーミンガムシャー州リトル・シャルフォント）はこうした形式の別の例である。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はＭａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）に本質的に同一であるが、しかし塩基性ｐＨを耐えるプロテインＡペプチド鎖分子に複合されている。他の形式は、プレート若しくはキャピラリーとして供給される不溶性物質にプロテインＡ分子の集団が直接若しくは間接的に結合されているプレートおよびキャピラリーの形式である。当業者は、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団を提供するのに適する他の形式およびガラス、金属若しくは有機ポリマーのような不溶性物質を認識するであろう。
【００４３】
本発明の方法において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖は、Ｆｃペプチド鎖を結合することが可能である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５に対する最低８５％の同一性をもつ配列を含んでなる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５は、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＦｃペプチド鎖結合Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインのアミノ酸配列を表す。これらの配列のそれぞれは個別にプロテインＡペプチド鎖の例である。配列番号６のアミノ酸残基１ないし４４１はプロテインＡペプチド鎖の別の例である。配列番号６のアミノ酸配列は、Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインにわたる黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡの成熟形態のＦｃペプチド鎖結合細胞外ドメインの一部分に対応する。こうしたプロテインＡペプチド鎖の他の例は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株により産生されるか若しくは塩基性ｐＨ値に対する抵抗性のような特定の特性を有するように改変されているプロテインＡペプチド鎖を包含する。当業者は、こうしたプロテインＡペプチド鎖の付加的な例を認識するであろう。
【００４４】
本発明の方法において典型的に、不溶性プロテインＡ複合物質は、凝集および非凝集Ｆｃペプチドを含んでなる水性サンプルとの接触前に適切な緩衝溶液で平衡化する。ｐＨ７．４で５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液が１種のこうした平衡緩衝液の一例である。ｐＨ７．４で５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ポリソルベート−８０を含有する溶液が１種のこうした平衡緩衝液の別の例である。９．０のｐＨで０．０５Ｍホウ酸、４．０Ｍ ＮａＣｌを含有する溶液がこうした平衡緩衝液の別の例である。プロテインＡ複合物質は、平衡化が起こるのに十分な時間該物質を特定の緩衝溶液と接触させることにより該溶液で平衡化し得る。平衡化後に、プロテインＡ複合物質を平衡緩衝液若しくは同等な溶液で洗浄して微粒子若しくは汚染分子のような残余の不純物を除去しうる。本発明の方法での使用のためのプロテインＡ複合物質を製造するのに適する付加的な平衡緩衝液組成物および技術は当業者に公知である。
【００４５】
水性サンプル中の凝集および非凝集Ｆｃペプチドはある範囲の条件下でプロテインＡ複合物質に結合することができる。プロテインＡ複合物質と接触させた水性サンプル中の凝集および非凝集Ｆｃペプチドは、典型的に、該サンプルのｐＨ値が約６．０ないし８．０である場合にこうした物質に結合することができる。最適の結合に必要な接触の時間は経験的に容易に決定され、そして典型的には約数分である。
【００４６】
標準的緩衝真核生物細胞培地組成物を含んでなる水性サンプル中の凝集および非凝集ＦｃペプチドはプロテインＡ複合物質に結合することができる。約５．６ないし７．４のｐＨ値をもつ血清を含まないＡＩＭ−Ｖ（Ｒ）細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）およびＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ−１６４０）細胞培地は、こうした標準的緩衝真核生物細胞培地組成物の２例である。７．４のｐＨ値のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）のような他の水性組成物中に存在する凝集および非凝集Ｆｃペプチドもまた、プロテインＡ複合物質に結合することができる。
【００４７】
いくつかの例において、プロテインＡ複合物質へのＦｃペプチドの結合を助長するために塩、洗剤若しくは他の分子を水性サンプル若しくは溶液に添加することが必要でありうる。当業者は、プロテインＡ複合物質と接触しかつサンプル中に存在するＦｃペプチド鎖の結合を確保するのに適する付加的な水性サンプルおよび溶液組成物を認識するであろう。
【００４８】
本発明の方法において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は、サンプル中に存在する非凝集性Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能でなければならない。標準的方法を使用してこうしたプロテインＡ複合物質の結合能力を測定し得る。例えば、標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および標準的タンパク質アッセイ法を使用して、プロテインＡ複合物質と接触前の水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド含量を測定し得る。ある容量の水性サンプルをその後、結合が起こるのに十分な時間プロテインＡ複合物質と接触させ得る。水性サンプルをその後プロテインＡ複合物質との接触から除去し、そして生じる水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖含量を測定する。プロテインＡ複合物質は、該生じるサンプルが、水性サンプル中に当初存在した非凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の３０％未満を含有する場合に、サンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能である。当業者は、プロテインＡ複合物質の結合能力を測定するための動的結合能力測定技術のような他の技術を認識するであろう。加えて、当業者は、プロテインＡ複合物との接触の時間およびＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルの塩濃度若しくはｐＨのような他のパラメータを、所定のプロテインＡ複合物質の結合能力および本発明の方法での使用のための該物質の適合性を最適化するように調節し得ることを認識するであろう。
【００４９】
本発明の方法において、集団不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖を、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液と接触させる。これはプロテインＡ複合物質への凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方の結合をもたらす。１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液との接触が、プロテインＡペプチド鎖に結合された非凝集Ｆｃペプチド鎖を、結合されたＦｃペプチド鎖凝集物より速い速度で水性溶液に進入させると考えられる。該結果は、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液が７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得られることである。
【００５０】
本発明の方法において、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液を、段階的勾配、非段階的勾配若しくは混成勾配の使用によりプロテインＡ複合物質と接触させ得る。段階的勾配の各「段階」は、特定の組成の水性溶液とプロテインＡ分子の集団を特定時間接触させることを必要とする。段階的勾配は、プロテインＡ複合物質と接触される１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をもたらす単一若しくは複数段階を含みうる。非段階的勾配での勾配は直線的若しくは非直線的（例えば指数関数的）であることができ、また、プロテインＡ複合物質と接触される水性溶液の組成は、ある時間にわたり直線的若しくは非直線的様式で連続的に変動する。非段階的勾配は、該非段階的勾配の適用の間の特定の時間点でプロテインＡ複合物質と接触される１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をもたらす。段階的勾配および非段階的勾配を組合せて混成勾配を生成してもまたよい。当業者は、１０ｍＭないし１２９ｍＭ
の塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とのプロテインＡペプチド鎖の集団の他の接触方法を認識するであろう。
【００５１】
本発明の方法において、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液を、凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を結合したプロテインＡ複合物質との接触から除去する。これは、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液を７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率値で生じる。これらの総パーセント収率およびパーセント凝集物値は、部分的に、プロテインＡ複合物質と接触された１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液の容量全体を収集することにより達成される。これは、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をカラムに充填されたプロテインＡ複合樹脂物質と接触させること、ならびに該カラムからその後溶離される水性溶液の容量全体を収集することにより、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上で達成し得る。こうして、該カラムから溶離される非凝集Ｆｃペプチド鎖の集団全体を収集し、それは７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率を確保する。重要なことに、溶離される水性溶液の容量全体が５％未満の凝集物を含有するような、プロテインＡ複合物質に結合されてカラム上に留まる凝集Ｆｃペプチド鎖の塊。あるいは、当業者は、精製されたＦｃペプチド鎖の生じる溶液中のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上となることを確実にするために、プロテインＡペプチド鎖の集団と接触される水性溶液のタンパク質濃度、伝導度、ｐＨおよび非凝集Ｆｃペプチド鎖含量のような他のパラメータをモニターしうることを認識するであろう。
【００５２】
本発明の方法において、水性サンプル若しくは精製された溶液中の凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖の含量は、標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）およびタンパク質アッセイ法を使用して測定し得る。測定された値をその後使用して、本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の凝集Ｆｃペプチド含量を決定し得る。当業者は、精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中の凝集Ｆｃペプチド鎖のパーセンテージを確かめるのに使用し得る凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖（例えば非変性ゲル電気泳動）ならびにタンパク質含量を検出するための他の技術を認識するであろう。
【００５３】
本発明の方法において、水性サンプル若しくは精製されたＦｃペプチド鎖溶液中の非凝集Ｆｃペプチド鎖含量を、上述されたところの標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）およびタンパク質アッセイ法を使用して測定し得る。測定された値をその後使用して、本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の非凝集Ｆｃペプチド鎖含量、および本発明の方法にかけられる水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド鎖含量を決定し得る。これらの値をその後使用して、本発明の方法により製造される精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率を確かめることができる。これらの値を使用して、本発明の方法により製造される精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中の非凝集Ｆｃペプチド鎖の特異的パーセント収率もまた確かめることができる。
【００５４】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値はプロテインＡ複合物質のようなクロマトグラフィー物質の分離効率の尺度である。プロテインＡ複合物質のようなクロマトグラフィー物質のＨＥＴＰ値の決定方法は当該技術分野で公知である。こうした方法は、ＭａｒｔｉｎとＳｙｎｇｅ、３５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３５８（１９４１）にもまた記述されている。
【００５５】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００５６】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。本発明の本態様を使用して精製しうるミメティボディの一例は、配列番号７により記述されるアミノ酸配列をもつミメティボディである。当業者は他のミメティボディ分子を認識するであろう。
【００５７】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００５８】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００５９】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００６０】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。
【００６１】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００６２】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００６３】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００６４】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。
【００６５】
本発明の別の局面は、非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製され
た非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００６６】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００６７】
本発明は今や以下の特定の制限しない実施例を参照して記述されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】代表的Ｆｃペプチド鎖分子の図。選択されたペプチド鎖の特徴を示す。
【図２】当てはめたＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ（ｘ，ｙ）等式のプロット。総パーセント収率値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。
【図３】当てはめたＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ（ｘ，ｙ）等式のプロット。パーセント凝集物値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。
【図４】当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２（ｘ，ｙ）等式のプロット。目的関数値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。０以上の目的関数値は、７０％以上の総パーセント収率値で質量で５％未満の凝集物を含んでなる、プロテインＡクロマトグラフィーカラムのＦｃペプチド鎖溶離液サンプルに対応する。
【実施例１】
【００６９】
凝集および非凝集抗体ＦｃドメインのプロテインＡクロマトグラフィー分離
プロテインＡクロマトグラフィーは、特定の溶離条件を使用する場合に抗体Ｆｃドメイン（Ｆｃペプチド鎖）を含んでなる凝集および非凝集ペプチド鎖を分離するのに使用し得る（表１）。
【００７０】
【表１】
【００７１】
プロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷した凝集Ｆｃペプチド鎖の９０％が、カラム溶離緩衝液が３．６のｐＨの５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含んだ場合に非凝集Ｆｃペプチド鎖から分離された（表１）。
【００７２】
プロテインＡは、抗体Ｆｃドメインがペプチド鎖中に存在しかつ到達可能である場合に
こうしたドメインを特異的に結合する。標準的条件下のプロテインＡクロマトグラフィーは、双方の分類の分子がＦｃドメインを含んでなるために、凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方の精製された混合物を生じる。結果、本発明において、プロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷された混合物中に双方の分類のペプチド鎖が存在する場合に凝集Ｆｃペプチド鎖から非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得るプロテインＡクロマトグラフィーカラム溶離条件の選択（表１）は、当該技術分野で教示若しくは示唆されなかった。
【００７３】
非凝集および凝集双方のＦｃペプチド鎖ならびに他のＦｃ以外のペプチド鎖を含有する細胞培養物上清サンプルを、真核生物Ｃ１３７４Ｃ細胞を培養することにより製造した。Ｃ１３７４Ｃ細胞は組換えミメティボディペプチド鎖および他のペプチド鎖をこれらの細胞周囲の細胞培養培地中に分泌する。Ｃ１３７４Ｃ細胞により発現される非凝集ミメティボディペプチド鎖は、一般式（Ｉ）
（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
ここで、Ｍはエリスロポエチン受容体結合分子であり、ｔは４未満若しくはそれに等しい整数であり、そして他の構成要素は上で定義されたとおりである
を有する。Ｃ１３７４Ｃ細胞により発現されるミメティボディのＣＨ２−ＣＨ３部分は抗体Ｆｃドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインＡにより結合され得る。標準的なサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析は、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養物上清が、Ｆｃドメインを欠く他のペプチド鎖に加えて高分子量Ｆｃドメインを含んでなるミメティボディ凝集物（例えばｔ＞４を伴うミメティボディ分子）およびｔ≦４を伴う非凝集Ｆｃドメインを含んでなるミメティボディ分子双方を含有する（表１）ことを示す。所望の非凝集ミメティボディ産物分子は一般式（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）の４本のペプチド鎖よりなる。
【００７４】
Ｃ１３７４Ｃ細胞は標準的細胞培養条件下に血清を含まない既知組成の培地中３７℃で培養した。１ｍｇ／ｍｌと２ｍｇ／ｍｌの間の総タンパク質を含有するＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清をその後、その後のクロマトグラフィー分析のため収集した。
【００７５】
凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離するためのプロテインＡクロマトグラフィーは後に続くとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃との間の温度で実施した。最初に、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バッキンガムシャー州リトル・シャルフォント）プロテインＡクロマトグラフィーカラム中の樹脂を、ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で平衡化し、そして基礎Ａ２８０ｎｍ値を測定した。Ａ２８０ｎｍ値はカラム溶出物のような溶液中のペプチド鎖濃度の尺度である。第二に、１ｍｌの上清あたり１．８ｍｇの総タンパク質を含有するＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清１１２．８ｍｌをプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に負荷した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、負荷された上清サンプルが２０．５０ｍｇの凝集Ｆｃペプチド鎖を含有したことを示した。第三に、測定したＡ２８０ｎｍ値が基礎値に戻るまで、カラム中の樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で初回洗浄した。第四に、カラムをｐＨ５．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で第二回洗浄し、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。第五に、プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合されたペプチド鎖を、ｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で溶離し、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。最後に、プロテインＡクロマトグラフィーカラムに結合されたまま留まるペプチド鎖を、ｐＨ３．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液でカラム樹脂からストリップし（ｓｔｒｉｐ ｏｆｆ）、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。上清およびカラム溶出物サンプル双方中のタンパク質濃度をその後、標準的方法を使用して測定した。これらのサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖含量もまた標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ
法を使用して測定した。
【００７６】
プロテインＡ樹脂クロマトグラフィーカラムからＦｃペプチド鎖を溶離するためにｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液を使用することは、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養物上清中に当初存在した凝集Ｆｃペプチド鎖の９０％を非凝集Ｆｃペプチド鎖から分離した（表１）。具体的には、２０．５０ｍｇのＦｃペプチド鎖凝集物が、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に負荷したＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清サンプル中に存在したが、しかし２．０６ｍｇのみのＦｃペプチド鎖凝集物がｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で樹脂から溶離された。Ｆｃペプチド鎖凝集物のこの２．０６ｍｇの質量は、溶離後に収集したサンプル中に存在する総ペプチド鎖質量の１．３２％のみを構成した。溶離後に収集したサンプル中の残存するペプチド鎖質量は非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を構成した。この残存するペプチド鎖質量は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷された非凝集および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の７６．９質量％の総パーセント収率を表した。ｐＨ３．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液でプロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂をストリップすることは、Ｆｃペプチド鎖凝集物の１７．４２ｍｇの回収をもたらした。この１７．４２ｍｇの質量はカラム上に負荷されたＦｃ凝集物質量の８５．０％の特異的パーセント収率値を表した。一緒に、このデータは、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して特定の塩濃度値およびｐＨ値を溶離段階で使用する場合に凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得ることを示す。
【実施例２】
【００７７】
プロテインＡクロマトグラフィー後のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨの関数である
プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後に回収されるＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率は、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である（表２および図２）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
実験データからの総パーセント収率値は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷した上清サンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチドの質量での総量に関する溶離後に回収された精製されたサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペ
プチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。総パーセント収率値はプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後の非凝集Ｆｃペプチドおよび凝集Ｆｃペプチド鎖分子双方の効率的回収の尺度である。これらの実験について、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養、上清収集、プロテインＡクロマトグラフィーカラム調製、カラム平衡化および上清負荷は上で実施例１に記述されたとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃の間の温度で実施した。カラム中の樹脂は、測定されたＡ２８０ｎｍ値が基礎値に戻るまでｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で初回洗浄した。カラムをその後、ｐＨ５．０の１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３・ＣＨ３ＣＯＯＨ；（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）の溶液で第二回洗浄した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合されたペプチド鎖は、各個別のプロテインＡクロマトグラフィー実験で、表２に示される濃度およびｐＨ値のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３・ＣＨ３ＣＯＯＨ；（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）の溶液で溶離した。溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値は双方とも各個別の実験で変動した。サンプル中のタンパク質濃度および凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上で実施例１に記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【００８０】
これらの実験から得た総パーセント収率値（ｚ軸値）をその後、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ値（ｙ軸値）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後、最小二乗法を使用して実施して、プロットした実験データに当てはめた最適化多項式を得た。
【００８１】
得られた多項式を”ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ”等式と呼称した。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得られる総パーセント収率値（ｚ軸）を、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述し得ることを示す。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数は
ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ（ｘ，ｙ）＝−０．６７６ｘ＋０．２０９ｘｙ−６２．４ｙ＋２９５．７４７
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。
【００８２】
ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数のグラフプロットを図２に示す。これらの分析は、プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後のＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数であることを示す（表２および図２）。
【００８３】
生物製剤の製造のためにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを最適に使用するためには、ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値が７０％以上でなければならない。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数により記述される関数の関係を使用して、こうした最適ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値（例えば＞７０％）を生じるプロテインＡクロマトグラフィー条件を同定し得る。
【実施例３】
【００８４】
プロテインＡクロマトグラフィー溶離液中の凝集Ｆｃペプチド鎖パーセントは溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨの関数である
プロテインＡクロマトグラフィーカラム精製後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージは、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である（表２および図３）。該実験データからのパーセント凝集物値はサンプル中に存在する凝集および非凝集双方の全Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関する溶離後に回収された精製されたサンプル中に存在する凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。パーセント凝集物値は、プロテインＡクロマトグラフィー後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖汚染レベルの尺度である。差別的に述べられれば、パーセント凝集物は回収された溶離されたサンプルの純度の尺度である。
【００８５】
溶離されたサンプルは上で実施例２に記述されたプロテインＡクロマトグラフィー実験により製造したものであった。溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨ値は双方とも各個別の実験で変動された（表２）。これらのサンプル中のタンパク質濃度および凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上で実施例１に記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【００８６】
これらの実験から得たパーセント凝集物値（ｚ軸値）をその後、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ値（ｙ軸値）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後、最小二乗法を使用して実施して、プロットした実験データに当てはめた最適化多項式を得た。
【００８７】
得られた多項式を”ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ”等式と呼称した。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得たパーセント凝集物値（ｚ軸）を、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述し得ることを示す。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数は
ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ（ｘ，ｙ）＝０．００２４２ｘ２−０．０２１３ｘ−０．０８１９ｘｙ−１．５７６ｙ２＋０．５５１ｙ＋２９．６８０
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。
【００８８】
ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数のグラフプロットを図３に示す。これらの分析は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム精製後に回収される溶離されたサンプル中の質量でのパーセント凝集物が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数であることを示す（表２および図３）。
【００８９】
生物製剤の製造のためプロテインＡカラムクロマトグラフィーを最適に使用するために、ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は５％未満でなければならない。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数により記述される関数の関係を使用して、こうした最適なＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値（例えば＜５％）を生じるプロテインＡクロマトグラフィー条件を同定し得る。
【実施例４】
【００９０】
最適の総パーセント収率およびパーセント凝集物値のためのプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩およびｐＨ値の選択
最適のＦｃペプチド鎖総パーセント収率およびパーセント凝集物値をもつ溶離液サンプルを得るためのプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩およびｐＨ値を、数学的
最適化問題解決技術を使用して同定した。
【００９１】
第一に、Ｆｃペプチド鎖を含んでなる生物製剤の製造のための最適のＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値を選択した。選択される最適のＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値は７０％以上でなければならない（上の実施例２を参照されたい）。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値のこの最適の組は、以下のファジー組：
【００９２】
【数１】
【００９３】
を使用して数学的に表し得る。上の実施例３に示されるとおり、ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値は、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である。
【００９４】
ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は２方法のいずれを使用しても計算し得る。第一の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）値は、個別のクロマトグラフィー実験から実験的に決定した総パーセント収率値（表２）を使用して計算する。第二の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値のｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）値は、実験的に決定した総パーセント収率値データ組に最小二乗法により当てはめた多項ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数を使用して計算し得る（表２）。
【００９５】
ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が所定の塩濃度およびｐＨ値で７０％未満である場合に０であることができる。ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が７０％以上かつ１００％未満である場合に（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ−７０）／（１００−７０）に等しい。例えば、総パーセント収率が８０％である場合には、ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）は（８０−７０）／（１００−７０）すなわち０．３に等しい。あるいは、ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が所定の塩濃度およびｐＨ値で１００％以上若しくはそれに等しい場合に１であることができる。
【００９６】
第二に、Ｆｃペプチド鎖を含んでなる生物製剤の製造のための最適のＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値をその後選択した。選択される最適のＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は５％未満でなければならない（上の実施例２を参照されたい）。これは以下のファジー組：
【００９７】
【数２】
【００９８】
を使用して数学的に表し得る。
【００９９】
上の実施例３に示されるとおり、ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である。
【０１００】
該ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は２方法のいずれを使用しても計算し得る。第一の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）値は、個別のクロマトグラフィー実験からの実験的に決定したパーセント凝集物値（表２）を使用して計算する。第二の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）値は、実験的に決定されるパーセント凝集物値のデータ組に最小二乗法により当てはめた多項ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数を使用して計算し得る（表２）。
【０１０１】
ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が所定の塩濃度およびｐＨ値で０％未満若しくはそれに等しい場合に１であることができる。ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が０％以上かつ５％未満である場合に（５−ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）／（５−０）に等しい。例えば、パーセント凝集物が２％である場合には、ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）は（５−２）／（５−０）すなわち０．６に等しい。あるいは、ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が所定の塩濃度およびｐＨ値で５％以上若しくはそれに等しい場合に０であることができる。
【０１０２】
第三に、所定の溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨについて生成されるｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）およびｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）ファジー組値を使用して、以下の”ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１”等式：
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１＝［ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）×ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）］１／２
を使用して目的関数値を計算した。計算された目的関数値（ｚ軸）をその後、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸およびｐＨ（ｙ軸）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後最小二乗法を使用して実施して、プロットしたデータに当てはめた最適化多項式を得た。得られた多項式を”ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２”等式と呼称した。
【０１０３】
プロットしたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値を計算するのに使用しかつ当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用するｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）およびｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）ファジー組値を、２供給源のいずれかからのデータを使用して計算した。例えば、プロットしたＯ
ｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値のいくつかは、実験的に決定した総パーセント収率およびパーセント凝集物値を使用して計算した（表２）。プロットした他のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値（表３）は、上述された表２のデータ組を当てはめた等式を使用して生成したＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄおよびＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値を使用して計算した。表２および表３双方の目的関数値をその後プロットし、そして当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用した。これは、当てはめた多項式を歪ませ得る当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用したデータ組に「ギャップ」が存在しなかったことを確実にするために行った。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
【表５】
【０１０７】
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得られるＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値（ｚ軸）が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述され得ることを示す。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２関数は
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２（ｘ，ｙ）＝（３．５８×１０−５）ｅｘｐ［−０．５（０．００１７１ｘ２−０．１９２７ｘｙ＋５０．５１５ｙ２＋０．４５４０ｘ−３４８．５２ｙ＋５８９．４８７）］
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式は、６９．０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５８のｐＨで０．４６６の極大を有する。
【０１０８】
数学的最適化の問題において、「目的関数」は、解決される場合に、目的関数から最大若しくは最適値を得ることを可能にする変数の値を示す等式である。ここで、上述されたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を使用して、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得ることを可能にする特定の溶離緩衝液の塩濃度（ｘ変数）およびｐＨ（ｙ変数）値を同定した。
【０１０９】
例えば、０という目的関数値を生じるプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値（図４を参照されたい）は、所望の最適の特徴をもつ精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを製造するのに使用し得ない。対照的に、１．０という最大の可能な目的関数値までの０．０以上の目的関数値を生じるプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値（上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１を参照されたい）は、所望の最適の特徴をもつ精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを製造するのに使用し得る可能な値の範囲を表す。最良の可能な溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値は、可能な限り１．０に近い目的関数値を生じるものである。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式について、最良の可能な溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値は、０．４６６という極大値に可能な限り近い目的関数値を生じるものである。
【０１１０】
上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式およびそのグラフ表示（図４）を使用して、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得るのに最適である特定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値若しくはこうした値の範囲を同定し得る。
【実施例５】
【０１１１】
最適のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液組成の選択における使用のためのＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式の検証
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式若しくはそのグラフ表示のいずれかを使用して同定される特定のプロテインＡクロマトグラフィー緩衝液の塩濃度およびｐＨ値は、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖溶離液サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で生じることが実験的に確認された（表５）。具体的には、得られた溶離されたサンプルは、８４．７％以上のＦｃペプチドの質量での総パーセント収率（すなわち総パーセント収率値は８４．７％以上であった）で質量で２．９３％の凝集Ｆｃペプチド鎖（すなわちパーセント凝集物値は２．９３％であった）を含有した。
【０１１２】
この確認プロテインＡクロマトグラフィー実験は後に続くとおり実施した。第一に、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式のグラフ表示（プロット）を使用して０．４以上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２値を同定した（ｚ軸）（図４）。対応するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸）およびｐＨ（ｙ軸）値をその後同定した。同定されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度値は６５ｍＭであった。同定されたｐＨ値は３．５５であった。
【０１１３】
３．５５というｐＨで６５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩を含有する水性プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液をその後調製した。この確認実験のためのＣ１３７４Ｃ細胞培養、上清収集、プロテインＡクロマトグラフィーカラム調製、カラム平衡化、上清負荷およびカラム洗浄は上の実施例１に記述されたとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃の間の温度で実施した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合したペプチド鎖は、３．５５のｐＨの６５ｍＭトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン酢酸塩を含有する溶離緩衝液でプロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂から溶離した。プロテインＡクロマトグラフィーカラムをその後、３．０のｐＨの０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩の溶液でストリップした。サンプル中のタンパク質濃度、凝集Ｆｃペプチド鎖含量および非凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上の実施例１で記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【０１１４】
溶離液サンプルの分析は、該サンプルが、８４．７％以上のＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率（すなわち総パーセント収率は８４．７％以上であった）で質量で２．９３％の凝集Ｆｃペプチド鎖を含有した（すなわちパーセント凝集物値は２．９３％であった）ことを確認した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷された細胞培養物上清は９．８９％の凝集物を含有した。ストリップ後のカラムからの全体的非凝集Ｆｃペプチド鎖特異的パーセント収率は９１．３質量％であった。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅおよびＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ等式を使用して、３．５５のｐＨ（ｙ値）の６５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ｘ値）を含んでなる溶離緩衝液を使用するプロテインＡクロマトグラフィーから生じる溶離液サンプル中のそれぞれパーセント凝集物値および総パーセント収率値を予測した。予測されたパーセント凝集物値は１．７％であり、そして予測された総パーセント収率値は７８．５％であった。双方の値は、本検証実験の溶離液サンプルで実際に得られた総パーセント収率およびパーセント凝集物値に合理的に近い。
【０１１５】
これらの結果は、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式若しくはそのグラフ表示を使用して、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖溶離液サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で製造し得ることを示す（表５）。これらの結果は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して非凝集Ｆｃペプチド鎖から凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得ることもまたさらに確認する。ここで論考される結果は、２種の異なるミメティボディ産生細胞株を使用する４回の独立に実施した検証実験を代表する。
【０１１６】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれに対して多くの変更および改変をなし得ることが当業者に明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体Ｆｃドメインを含んでなる凝集および非凝集ペプチド鎖を分離するためのプロテインＡクロマトグラフィーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃペプチド鎖を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分子の治療剤としての使用は、多様な疾患の処置のための有効なアプローチとなった。下述されるミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）分子のようなＦｃペプチド鎖を含有する抗体由来分子、およびＦｃ融合分子もまた治療的可能性を有する。加えて、これらの分子は、多様な疾患の免疫病因論ならびに他の生物学的過程のより良好な理解を獲得するための有用な研究ツールである。
【０００３】
抗体、ミメティボディおよびＦｃ融合分子の大規模での製造および精製は、治療若しくは研究使用のためこれらのＦｃペプチド鎖分子を製造するのに必要である。こうした分子の製造および精製で一般に遭遇する一問題は、複数のＦｃペプチド鎖分子を含んでなる可溶性高分子量凝集物（例えば２種以上の非凝集低分子量抗体若しくはミメティボディ分子の凝集物）の形成である。こうした凝集物の存在は、若干の患者が凝集物を受領することに応答して生命を脅かす免疫反応に苦しむことができるという危険性のため治療的製剤で高度に望ましくない。加えて、Ｆｃペプチド鎖凝集物は、研究若しくは治療的用途に意図しているＦｃペプチド鎖製剤中の望ましくない不溶性沈殿の形成を引き起こし得る。
【０００４】
Ｆｃペプチド鎖分子の精製の間の一目標は、凝集分子を本質的に含まない非凝集Ｆｃペプチド鎖産物（例えば非凝集低分子量抗体若しくはミメティボディ分子）を高収率で得ることである。典型的に、７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で５％未満の凝集物を含有する精製されたＦｃペプチド鎖の製造が望ましい。
【０００５】
Ｆｃペプチド鎖分子の製造および精製の第一段階の１つは、通常プロテインＡクロマトグラフィー樹脂に基づく精製段階である。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はＦｃペプチド鎖を特異的に結合するプロテインＡペプチド鎖を含んでなる。この結合活性は、凝集若しくは非凝集のＦｃペプチド鎖の間を識別せず、双方がプロテインＡクロマトグラフィー樹脂に結合する。重要なことに、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はこの特異的結合に基づきＦｃペプチド鎖を他の分子から分離する。こうした樹脂は、分子量の差違に基づきＦｃペプチド鎖を他の分子若しくは複合体から分離しない。結果、慣習的プロテインＡクロマトグラフィー法において、凝集高分子量Ｆｃペプチド鎖および非凝集低分子量Ｆｃペプチド鎖双方が、溶出段階の間にプロテインＡクロマトグラフィー樹脂から遊離される。これは、大量の望ましくない凝集Ｆｃペプチド鎖分子および所望の非凝集Ｆｃペプチド鎖分子双方を含んでなる水性溶液を生じる。
【０００６】
凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖分子を分離する慣習的プロテインＡクロマトグラフィー法の不能の１つの結果は、５％未満の凝集物を含有する非凝集Ｆｃペプチドの調製物を得るためにサイズ排除クロマトグラフィー若しくはイオン交換クロマトグラフィー技術のような数種の付加的な精製過程が必要とされることである。この後処理は高価であり、時間を要し、そして総パーセント収率値を７０％より十分下に低下させる。
【０００７】
従って、付加的な精製過程の使用を伴わない、５％未満の凝集物を含有する精製されたＦｃペプチド鎖調製物を７０％以上の総パーセント収率値で製造する、プロテインＡクロマトグラフィーに基づく精製方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法である。
【０００９】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１０】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１１】
本発明の別の局面は、非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００１２】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、引用することによりあたかも完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本明細書および請求の範囲で使用されるところの単数形「ある（ａ、ａｎｄ）」および「該（ｔｈｅ）」は、文脈が別の方法で明瞭に指示しない限り複数の言及を包含する。従
って、例えば、「１ペプチド鎖」への言及は１若しくはそれ以上のペプチド鎖への言及であり、そして当業者に既知のその同等物を包含する。
【００１４】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されると同一の意味を有する。本明細書に記述されるものに類似若しくは同等のいかなる組成物および方法も本発明の実務若しくは試験で使用し得るとは言え、例示的組成物および方法を本明細書に記述する。
【００１５】
「凝集物」という用語は、付加的なＦｃペプチド鎖が４本のＦｃペプチド鎖に共有若しくは非共有結合されているかどうかに依存して４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる分子若しくは複合体を意味している。凝集物の形態の分子若しくは複合体は非凝集形態より大きい分子量を有する。
【００１６】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント、部分若しくはバリアントを含んでなる免疫グロブリンすなわち抗体分子を意味している。抗体は構成的に発現されかつプラズマ細胞により分泌される分泌型タンパク質である。抗体は、ハイブリドーマ生成のような標準的方法により不死化したプラズマ細胞を使用して、または、骨髄腫細胞のような不死化Ｂ細胞若しくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞のような他の細胞型への抗体Ｈおよび／若しくはＬ鎖遺伝子のトランスフェクションによってもまた製造し得る。
【００１７】
「Ｆｃペプチド鎖」という用語は、プロテインＡを結合するのに十分な免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖および免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖の一部分を含んでなるペプチド鎖を意味している。こうした定常領域ペプチド鎖は、ＩｇＧ１のようないずれのアイソタイプの抗体Ｈ鎖由来であってもよく、および「Ｆｃドメイン」ともまた称されることがある（例えば図１を参照されたい）。Ｆｃペプチド鎖は、プロテインＡを結合するのに十分な免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖および免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖の双方を含んでなる個別のペプチド鎖（例えば一本鎖抗体）、または２、３、４若しくはそれ以上のこうした個別のペプチド鎖の会合（例えば抗体若しくはミメティボディ分子の会合）でありうる。Ｆｃペプチド鎖は、例えば、Ｆｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖、およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する分子の一属を表す（図１）。「Ｆｃペプチド鎖」という用語は、非凝集Ｆｃペプチド鎖、凝集Ｆｃペプチド鎖、若しくは凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方を記述するのに使用し得る。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「Ｈ鎖」という用語は、免疫グロブリンおよび抗体分子中で見出される２つの型のポリペプチド鎖の分子量に関してより重いほうを意味している。
【００１９】
「ミメティボディ」という用語は、一般式（Ｉ）：
（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
ここでＭは生物活性ペプチド鎖であり、Ｌはペプチド鎖リンカーであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈは免疫グロブリン可変ヒンジ領域ペプチド鎖の一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖であり、およびＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域ペプチド鎖であり、ならびにｔは４未満若しくはこれに等しい整数である、
を含んでなるペプチド鎖を意味している。ミメティボディのＣＨ２−ＣＨ３部分は抗体Ｆｃドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインＡにより結合され得るＦｃペプチド
鎖である。ミメティボディ分子はＦｃドメインを含んでなるペプチド鎖の一属を代表する。Ｆｃペプチド鎖のこの属は、例えばＦｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖、およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する（図１）。
【００２０】
「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合により連結されて１本の鎖を形成する最低２アミノ酸残基を含んでなる分子を意味している。５０以上のアミノ酸の大型ペプチド鎖は「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」と称されうる。５０未満のアミノ酸の小型ペプチド鎖は「ペプチド」と称されうる。
【００２１】
「パーセント凝集物」という値は、サンプル中に存在する凝集および非凝集双方の全Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関するサンプル中に存在する凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。この値は、実験データを使用して決定しうるか、若しくは実験データの代表的なデータのセットに当てはめた等式を使用して数学的にコンピュータ計算しうる。
【００２２】
「総パーセント収率」という値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。この値は、実験データを使用して決定しうるか、若しくは実験データの代表的なデータ組に当てはめた等式を使用して数学的にコンピュータ計算しうる。
【００２３】
「総パーセント収率」という値は「特異的パーセント収率」という値と異なる。「特異的パーセント収率」という値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する特定のＦｃペプチドの質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する特定のＦｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。例えば、特定のＦｃペプチド鎖が非凝集Ｆｃペプチド鎖である場合には、「特異的パーセント収率」値は、精製段階にかけられるサンプル中に当初存在する特定のＦｃペプチドの質量での総量に関する精製段階により生じられるサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージである。
【００２４】
「総パーセント収率」値は、望ましいまたは所定の精製段階若しくは過程により生じられる結果を記述するために、「パーセント凝集物」値のような他のパラメータとともに本発明の技術領域で典型的に使用される。
【００２５】
「集団」という用語は２本のプロテインＡペプチド鎖のような最低２品目を意味している。
【００２６】
「プロテインＡ」という用語は、１本のＦｃペプチド鎖を結合することが可能である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５に対する最低８５％の同一性をもつ配列を含んでなるペプチド鎖を意味している。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのＦｃペプチド鎖結合Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインをそれぞれ表す。２ペプチド鎖間の同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用する対（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）アミノ酸配列アライメントにより決定し得る。ＡｌｉｇｎＸは対様式でアミノ酸配列アライメントを実行するのにＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用する。
【００２７】
「非凝集」という用語は上で定義されたところの凝集物を欠くことを意味している。例えば、抗体若しくはミメティボディ分子は、４本の個別のＦｃペプチド鎖をその非凝集形
態で含み得る（図１）が、しかし４本以上の個別のＦｃペプチド鎖をその凝集形態で含むことができる。
【００２８】
本発明は精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の有用な製造方法を提供する。該方法は、また抗体Ｆｃドメインを含んでなるより低分子量の非凝集ペプチド鎖から抗体Ｆｃドメインを含んでなる高分子量の凝集ペプチド鎖を分離するのにプロテインＡクロマトグラフィーを使用する。本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液は、７０％以上という総パーセント収率で５％未満の凝集物を含有する。これらの結果は、精製の間に使用される水性溶液中に洗剤若しくはポリマーを包含することなく達成し得る。
【００２９】
本発明の一局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに、プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００３０】
凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルは多様な供給源から得ることができる。例えば、こうしたサンプルは、細胞により媒体中に分泌された凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を含有する細胞培地でありうる。あるいはこうしたサンプルは細胞培養物ライセートでありうる。こうしたサンプルは、水性溶液で再構成される凍結乾燥Ｆｃペプチドのような他の供給源から得ることができる。凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を産生する細胞は、Ｆｃペプチド鎖を発現することが可能な原核生物、真核生物若しくは古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）細胞でありうる。
【００３１】
本発明の方法を使用してＦｃドメインを含んでなるＦｃペプチド鎖分子の一属を精製しうる。Ｆｃペプチド鎖分子のこの属は、例えばＦｃドメインを含んでなる抗体分子、Ｆｃドメインを含んでなるＦｃ融合ペプチド鎖およびＦｃドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する（図１）。ミメティボディ分子は、Ｆｃドメインを含んでなるペプチド鎖の一属の例示的代表である。
【００３２】
水性サンプル中の非凝集Ｆｃペプチドは４本を超えない個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる。例えば、非凝集Ｆｃペプチドは２個の抗体Ｈ鎖分子および２個の抗体Ｌ鎖分子よりなる抗体分子でありうる（図１）。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。１本のＦｃペプチド鎖が第一のH鎖に存在し、そして１本が第二のＨ鎖に存在する。
【００３３】
非凝集Ｆｃペプチドはまた、１個の抗体Ｈ鎖分子および１個の抗体Ｌ鎖分子よりなる、ときに抗体半分子（ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と称される一本鎖抗体分子でもありうる。こうした分子は、それがただ１本の抗体Ｈ鎖を含有するために４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。
【００３４】
非凝集Ｆｃペプチドは、目的の第二のペプチド鎖に融合された１個のＦｃドメインを含んでなる２本の同一のペプチド鎖よりなるＦｃ融合分子でもまたありうる（図１）。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。１本のＦｃペプチド鎖が第一のＨ鎖に存在し、そして１本が第二のＨ鎖に存在する。
【００３５】
非凝集Ｆｃペプチドは一般式（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）の４本までのペプチド鎖よりなるミメティボディ分子でもまたありうる。こうした分子は４本を超えないＦｃペプチド鎖を含有する。
【００３６】
非凝集ミメティボディ分子は、図１におよび上の記述により示されるところの抗体分子およびＦｃ融合分子の双方の特徴を含んでなる。ミメティボディ分子の抗体様特徴は、抗体由来可変領域Ｖ２ペプチド鎖配列、抗体由来ヒンジペプチド鎖配列、抗体由来Ｈ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖配列、および抗体由来ＣＨ３定常領域ペプチド鎖配列を包含する。ミメティボディ分子のＦｃ融合分子様特徴は、生物活性Ｍペプチド鎖、抗体Ｈ鎖ＣＨ２定常領域ペプチド鎖配列および抗体ＣＨ３定常領域ペプチド鎖配列を包含する。結果、ミメティボディ分子は、抗体およびＦｃ融合クラスの分子の双方（図１）ならびにこれらの分子種を含んでなるＦｃペプチド鎖の属（図１）を代表する。
【００３７】
本発明の方法において、水性サンプル中の凝集Ｆｃペプチドは４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含んでなる。例えば、凝集Ｆｃペプチド鎖は、会合されたようになった２個以上の抗体分子、２個以上のミメティボディ分子若しくは２個以上のＦｃ融合分子を含みうる。こうした分子は、共有結合、疎水性相互作用若しくは他の非共有結合のようないずれかの機構により会合したようになることができる。
【００３８】
３抗体分子の凝集物は６本の抗体Ｈ鎖および６本の抗体Ｌ鎖を含みうる。こうした分子は各抗体Ｈ鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００３９】
３ミメティボディ分子の凝集物は６本の抗体由来Ｈ鎖ＣＨ２−ＣＨ３ペプチド鎖を含みうる。こうした分子は各Ｈ鎖ＣＨ２−ＣＨ３ペプチド鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４０】
Ｆｃ融合分子の凝集物は、目的の第二のペプチド鎖に融合された１個のＦｃドメインをそれぞれが含んでなる６本の同一ペプチド鎖を含みうる。こうした分子は各ペプチド鎖について１本の６本のＦｃペプチド鎖を含んでなり、そしてそれが４本以上の個別のＦｃペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４１】
当業者は、上で例示されたもの（例えば４個若しくはそれ以上の抗体分子の凝集物）以外のより高次の凝集物分子を認識するであろう。加えて、当業者は、抗体、ミメティボディ若しくはＦｃ融合半分子の２個の全分子との会合は、こうした分子が５本の個別のＦｃペプチド鎖を含むことができるために、凝集Ｆｃペプチドを生じることができることを認識するであろう。こうした分子は、それが４本以上の個別のペプチド鎖を含有するために凝集Ｆｃペプチド鎖である。
【００４２】
本発明の方法での使用に適する不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団（プロテインＡ複合物質）は多くの異なる形式で提供されうる。１つのこうした形式は例えばプロテインＡクロマトグラフィー樹脂のようなビーズである。典型的には、こうしたビーズ様樹脂をクロマトグラフィーのためのカラムに負荷する。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バーミンガムシャー州リトル・シャルフォント）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はこうした形式の一例である。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、４０ないし１３０μＭの直径（平均直径は８５μＭである）をもつ不溶性の高度に架橋したアガロース素材にエポキシカップリング化学を介し複合された組換え発現されたプロテインＡペプチド鎖の集団を含んでなる。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は媒体
１ｍｌあたりおよそ３０ｍｇのヒトＩｇＧ抗体の動的結合能力を有する。動的結合能力は、２０ｃｍの床高をもつカラム中で５００ｃｍ／ｈの移動相速度での前端分析により１０％破過で測定される。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バーミンガムシャー州リトル・シャルフォント）はこうした形式の別の例である。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｒ）プロテインＡクロマトグラフィー樹脂はＭａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）に本質的に同一であるが、しかし塩基性ｐＨを耐えるプロテインＡペプチド鎖分子に複合されている。他の形式は、プレート若しくはキャピラリーとして供給される不溶性物質にプロテインＡ分子の集団が直接若しくは間接的に結合されているプレートおよびキャピラリーの形式である。当業者は、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団を提供するのに適する他の形式およびガラス、金属若しくは有機ポリマーのような不溶性物質を認識するであろう。
【００４３】
本発明の方法において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖は、Ｆｃペプチド鎖を結合することが可能である配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５に対する最低８５％の同一性をもつ配列を含んでなる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５は、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＦｃペプチド鎖結合Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインのアミノ酸配列を表す。これらの配列のそれぞれは個別にプロテインＡペプチド鎖の例である。配列番号６のアミノ酸残基１ないし４４１はプロテインＡペプチド鎖の別の例である。配列番号６のアミノ酸配列は、Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインにわたる黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡの成熟形態のＦｃペプチド鎖結合細胞外ドメインの一部分に対応する。こうしたプロテインＡペプチド鎖の他の例は、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株により産生されるか若しくは塩基性ｐＨ値に対する抵抗性のような特定の特性を有するように改変されているプロテインＡペプチド鎖を包含する。当業者は、こうしたプロテインＡペプチド鎖の付加的な例を認識するであろう。
【００４４】
本発明の方法において典型的に、不溶性プロテインＡ複合物質は、凝集および非凝集Ｆｃペプチドを含んでなる水性サンプルとの接触前に適切な緩衝溶液で平衡化する。ｐＨ７．４で５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液が１種のこうした平衡緩衝液の一例である。ｐＨ７．４で５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ポリソルベート−８０を含有する溶液が１種のこうした平衡緩衝液の別の例である。９．０のｐＨで０．０５Ｍホウ酸、４．０Ｍ ＮａＣｌを含有する溶液がこうした平衡緩衝液の別の例である。プロテインＡ複合物質は、平衡化が起こるのに十分な時間該物質を特定の緩衝溶液と接触させることにより該溶液で平衡化し得る。平衡化後に、プロテインＡ複合物質を平衡緩衝液若しくは同等な溶液で洗浄して微粒子若しくは汚染分子のような残余の不純物を除去しうる。本発明の方法での使用のためのプロテインＡ複合物質を製造するのに適する付加的な平衡緩衝液組成物および技術は当業者に公知である。
【００４５】
水性サンプル中の凝集および非凝集Ｆｃペプチドはある範囲の条件下でプロテインＡ複合物質に結合することができる。プロテインＡ複合物質と接触させた水性サンプル中の凝集および非凝集Ｆｃペプチドは、典型的に、該サンプルのｐＨ値が約６．０ないし８．０である場合にこうした物質に結合することができる。最適の結合に必要な接触の時間は経験的に容易に決定され、そして典型的には約数分である。
【００４６】
標準的緩衝真核生物細胞培地組成物を含んでなる水性サンプル中の凝集および非凝集ＦｃペプチドはプロテインＡ複合物質に結合することができる。約５．６ないし７．４のｐＨ値をもつ血清を含まないＡＩＭ−Ｖ（Ｒ）細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）およびＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ−１６４０）細胞培地は、こうした標準的緩衝真核生物細胞培地組成物の２例である。７．４のｐＨ値のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）のような他の水性組成物中に存在する凝集および非凝集Ｆｃペプチドもまた、プロテインＡ複合物質に結合することができる。
【００４７】
いくつかの例において、プロテインＡ複合物質へのＦｃペプチドの結合を助長するために塩、洗剤若しくは他の分子を水性サンプル若しくは溶液に添加することが必要でありうる。当業者は、プロテインＡ複合物質と接触しかつサンプル中に存在するＦｃペプチド鎖の結合を確保するのに適する付加的な水性サンプルおよび溶液組成物を認識するであろう。
【００４８】
本発明の方法において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は、サンプル中に存在する非凝集性Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能でなければならない。標準的方法を使用してこうしたプロテインＡ複合物質の結合能力を測定し得る。例えば、標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および標準的タンパク質アッセイ法を使用して、プロテインＡ複合物質と接触前の水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド含量を測定し得る。ある容量の水性サンプルをその後、結合が起こるのに十分な時間プロテインＡ複合物質と接触させ得る。水性サンプルをその後プロテインＡ複合物質との接触から除去し、そして生じる水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖含量を測定する。プロテインＡ複合物質は、該生じるサンプルが、水性サンプル中に当初存在した非凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の３０％未満を含有する場合に、サンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能である。当業者は、プロテインＡ複合物質の結合能力を測定するための動的結合能力測定技術のような他の技術を認識するであろう。加えて、当業者は、プロテインＡ複合物との接触の時間およびＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルの塩濃度若しくはｐＨのような他のパラメータを、所定のプロテインＡ複合物質の結合能力および本発明の方法での使用のための該物質の適合性を最適化するように調節し得ることを認識するであろう。
【００４９】
本発明の方法において、集団不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖を、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液と接触させる。これはプロテインＡ複合物質への凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方の結合をもたらす。１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液との接触が、プロテインＡペプチド鎖に結合された非凝集Ｆｃペプチド鎖を、結合されたＦｃペプチド鎖凝集物より速い速度で水性溶液に進入させると考えられる。該結果は、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液が７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得られることである。
【００５０】
本発明の方法において、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液を、段階的勾配、非段階的勾配若しくは混成勾配の使用によりプロテインＡ複合物質と接触させ得る。段階的勾配の各「段階」は、特定の組成の水性溶液とプロテインＡ分子の集団を特定時間接触させることを必要とする。段階的勾配は、プロテインＡ複合物質と接触される１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をもたらす単一若しくは複数段階を含みうる。非段階的勾配での勾配は直線的若しくは非直線的（例えば指数関数的）であることができ、また、プロテインＡ複合物質と接触される水性溶液の組成は、ある時間にわたり直線的若しくは非直線的様式で連続的に変動する。非段階的勾配は、該非段階的勾配の適用の間の特定の時間点でプロテインＡ複合物質と接触される１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をもたらす。段階的勾配および非段階的勾配を組合せて混成勾配を生成してもまたよい。当業者は、１０ｍＭないし１２９ｍＭ
の塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とのプロテインＡペプチド鎖の集団の他の接触方法を認識するであろう。
【００５１】
本発明の方法において、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液を、凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を結合したプロテインＡ複合物質との接触から除去する。これは、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液を７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率値で生じる。これらの総パーセント収率およびパーセント凝集物値は、部分的に、プロテインＡ複合物質と接触された１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液の容量全体を収集することにより達成される。これは、１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液をカラムに充填されたプロテインＡ複合樹脂物質と接触させること、ならびに該カラムからその後溶離される水性溶液の容量全体を収集することにより、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上で達成し得る。こうして、該カラムから溶離される非凝集Ｆｃペプチド鎖の集団全体を収集し、それは７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率を確保する。重要なことに、溶離される水性溶液の容量全体が５％未満の凝集物を含有するような、プロテインＡ複合物質に結合されてカラム上に留まる凝集Ｆｃペプチド鎖の塊。あるいは、当業者は、精製されたＦｃペプチド鎖の生じる溶液中のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上となることを確実にするために、プロテインＡペプチド鎖の集団と接触される水性溶液のタンパク質濃度、伝導度、ｐＨおよび非凝集Ｆｃペプチド鎖含量のような他のパラメータをモニターしうることを認識するであろう。
【００５２】
本発明の方法において、水性サンプル若しくは精製された溶液中の凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖の含量は、標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）およびタンパク質アッセイ法を使用して測定し得る。測定された値をその後使用して、本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の凝集Ｆｃペプチド含量を決定し得る。当業者は、精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中の凝集Ｆｃペプチド鎖のパーセンテージを確かめるのに使用し得る凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖（例えば非変性ゲル電気泳動）ならびにタンパク質含量を検出するための他の技術を認識するであろう。
【００５３】
本発明の方法において、水性サンプル若しくは精製されたＦｃペプチド鎖溶液中の非凝集Ｆｃペプチド鎖含量を、上述されたところの標準的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）およびタンパク質アッセイ法を使用して測定し得る。測定された値をその後使用して、本発明の方法により得られる精製されたＦｃペプチド鎖の溶液の非凝集Ｆｃペプチド鎖含量、および本発明の方法にかけられる水性サンプルの非凝集Ｆｃペプチド鎖含量を決定し得る。これらの値をその後使用して、本発明の方法により製造される精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率を確かめることができる。これらの値を使用して、本発明の方法により製造される精製されたＦｃペプチド鎖の溶液中の非凝集Ｆｃペプチド鎖の特異的パーセント収率もまた確かめることができる。
【００５４】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値はプロテインＡ複合物質のようなクロマトグラフィー物質の分離効率の尺度である。プロテインＡ複合物質のようなクロマトグラフィー物質のＨＥＴＰ値の決定方法は当該技術分野で公知である。こうした方法は、ＭａｒｔｉｎとＳｙｎｇｅ、３５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３５８（１９４１）にもまた記述されている。
【００５５】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００５６】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。本発明の本態様を使用して精製しうるミメティボディの一例は、配列番号７により記述されるアミノ酸配列をもつミメティボディである。当業者は他のミメティボディ分子を認識するであろう。
【００５７】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００５８】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００５９】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００６０】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。
【００６１】
本発明の別の局面は、非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００６２】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００６３】
本発明の方法の別の態様において、塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である。
【００６４】
本発明の方法の別の態様において、非凝集Ｆｃペプチド鎖はミメティボディである。
【００６５】
本発明の別の局面は、非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびにプロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階を含んでなる、精製され
た非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法であり；ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は７０％以上である。
【００６６】
本発明の方法の一態様において、不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団は０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する。
【００６７】
本発明は今や以下の特定の制限しない実施例を参照して記述されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】代表的Ｆｃペプチド鎖分子の図。選択されたペプチド鎖の特徴を示す。
【図２】当てはめたＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ（ｘ，ｙ）等式のプロット。総パーセント収率値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。
【図３】当てはめたＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ（ｘ，ｙ）等式のプロット。パーセント凝集物値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。
【図４】当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２（ｘ，ｙ）等式のプロット。目的関数値はｍＭでの緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数として示される。０以上の目的関数値は、７０％以上の総パーセント収率値で質量で５％未満の凝集物を含んでなる、プロテインＡクロマトグラフィーカラムのＦｃペプチド鎖溶離液サンプルに対応する。
【実施例１】
【００６９】
凝集および非凝集抗体ＦｃドメインのプロテインＡクロマトグラフィー分離
プロテインＡクロマトグラフィーは、特定の溶離条件を使用する場合に抗体Ｆｃドメイン（Ｆｃペプチド鎖）を含んでなる凝集および非凝集ペプチド鎖を分離するのに使用し得る（表１）。
【００７０】
【表１】
【００７１】
プロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷した凝集Ｆｃペプチド鎖の９０％が、カラム溶離緩衝液が３．６のｐＨの５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含んだ場合に非凝集Ｆｃペプチド鎖から分離された（表１）。
【００７２】
プロテインＡは、抗体Ｆｃドメインがペプチド鎖中に存在しかつ到達可能である場合に
こうしたドメインを特異的に結合する。標準的条件下のプロテインＡクロマトグラフィーは、双方の分類の分子がＦｃドメインを含んでなるために、凝集Ｆｃペプチド鎖および非凝集Ｆｃペプチド鎖双方の精製された混合物を生じる。結果、本発明において、プロテインＡクロマトグラフィーカラムに負荷された混合物中に双方の分類のペプチド鎖が存在する場合に凝集Ｆｃペプチド鎖から非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得るプロテインＡクロマトグラフィーカラム溶離条件の選択（表１）は、当該技術分野で教示若しくは示唆されなかった。
【００７３】
非凝集および凝集双方のＦｃペプチド鎖ならびに他のＦｃ以外のペプチド鎖を含有する細胞培養物上清サンプルを、真核生物Ｃ１３７４Ｃ細胞を培養することにより製造した。Ｃ１３７４Ｃ細胞は組換えミメティボディペプチド鎖および他のペプチド鎖をこれらの細胞周囲の細胞培養培地中に分泌する。Ｃ１３７４Ｃ細胞により発現される非凝集ミメティボディペプチド鎖は、一般式（Ｉ）
（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
ここで、Ｍはエリスロポエチン受容体結合分子であり、ｔは４未満若しくはそれに等しい整数であり、そして他の構成要素は上で定義されたとおりである
を有する。Ｃ１３７４Ｃ細胞により発現されるミメティボディのＣＨ２−ＣＨ３部分は抗体Ｆｃドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインＡにより結合され得る。標準的なサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析は、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養物上清が、Ｆｃドメインを欠く他のペプチド鎖に加えて高分子量Ｆｃドメインを含んでなるミメティボディ凝集物（例えばｔ＞４を伴うミメティボディ分子）およびｔ≦４を伴う非凝集Ｆｃドメインを含んでなるミメティボディ分子双方を含有する（表１）ことを示す。所望の非凝集ミメティボディ産物分子は一般式（Ｍ−Ｌ−Ｖ２−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）の４本のペプチド鎖よりなる。
【００７４】
Ｃ１３７４Ｃ細胞は標準的細胞培養条件下に血清を含まない既知組成の培地中３７℃で培養した。１ｍｇ／ｍｌと２ｍｇ／ｍｌの間の総タンパク質を含有するＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清をその後、その後のクロマトグラフィー分析のため収集した。
【００７５】
凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離するためのプロテインＡクロマトグラフィーは後に続くとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃との間の温度で実施した。最初に、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国バッキンガムシャー州リトル・シャルフォント）プロテインＡクロマトグラフィーカラム中の樹脂を、ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で平衡化し、そして基礎Ａ２８０ｎｍ値を測定した。Ａ２８０ｎｍ値はカラム溶出物のような溶液中のペプチド鎖濃度の尺度である。第二に、１ｍｌの上清あたり１．８ｍｇの総タンパク質を含有するＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清１１２．８ｍｌをプロテインＡクロマトグラフィーカラム上に負荷した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、負荷された上清サンプルが２０．５０ｍｇの凝集Ｆｃペプチド鎖を含有したことを示した。第三に、測定したＡ２８０ｎｍ値が基礎値に戻るまで、カラム中の樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で初回洗浄した。第四に、カラムをｐＨ５．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で第二回洗浄し、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。第五に、プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合されたペプチド鎖を、ｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で溶離し、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。最後に、プロテインＡクロマトグラフィーカラムに結合されたまま留まるペプチド鎖を、ｐＨ３．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液でカラム樹脂からストリップし（ｓｔｒｉｐ ｏｆｆ）、そしてカラム溶出物サンプルを収集した。上清およびカラム溶出物サンプル双方中のタンパク質濃度をその後、標準的方法を使用して測定した。これらのサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖含量もまた標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ
法を使用して測定した。
【００７６】
プロテインＡ樹脂クロマトグラフィーカラムからＦｃペプチド鎖を溶離するためにｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液を使用することは、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養物上清中に当初存在した凝集Ｆｃペプチド鎖の９０％を非凝集Ｆｃペプチド鎖から分離した（表１）。具体的には、２０．５０ｍｇのＦｃペプチド鎖凝集物が、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に負荷したＣ１３７４Ｃ細胞培養物上清サンプル中に存在したが、しかし２．０６ｍｇのみのＦｃペプチド鎖凝集物がｐＨ３．６の５０ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液で樹脂から溶離された。Ｆｃペプチド鎖凝集物のこの２．０６ｍｇの質量は、溶離後に収集したサンプル中に存在する総ペプチド鎖質量の１．３２％のみを構成した。溶離後に収集したサンプル中の残存するペプチド鎖質量は非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を構成した。この残存するペプチド鎖質量は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷された非凝集および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の７６．９質量％の総パーセント収率を表した。ｐＨ３．０の１００ｍＭ ＮａＣＨ３ＣＯＯの溶液でプロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂をストリップすることは、Ｆｃペプチド鎖凝集物の１７．４２ｍｇの回収をもたらした。この１７．４２ｍｇの質量はカラム上に負荷されたＦｃ凝集物質量の８５．０％の特異的パーセント収率値を表した。一緒に、このデータは、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して特定の塩濃度値およびｐＨ値を溶離段階で使用する場合に凝集および非凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得ることを示す。
【実施例２】
【００７７】
プロテインＡクロマトグラフィー後のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率は溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨの関数である
プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後に回収されるＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率は、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である（表２および図２）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
実験データからの総パーセント収率値は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷した上清サンプル中に存在する非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチドの質量での総量に関する溶離後に回収された精製されたサンプル中に存在する非凝集Ｆｃペ
プチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。総パーセント収率値はプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後の非凝集Ｆｃペプチドおよび凝集Ｆｃペプチド鎖分子双方の効率的回収の尺度である。これらの実験について、Ｃ１３７４Ｃ細胞培養、上清収集、プロテインＡクロマトグラフィーカラム調製、カラム平衡化および上清負荷は上で実施例１に記述されたとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃の間の温度で実施した。カラム中の樹脂は、測定されたＡ２８０ｎｍ値が基礎値に戻るまでｐＨ７．４の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液で初回洗浄した。カラムをその後、ｐＨ５．０の１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３・ＣＨ３ＣＯＯＨ；（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）の溶液で第二回洗浄した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合されたペプチド鎖は、各個別のプロテインＡクロマトグラフィー実験で、表２に示される濃度およびｐＨ値のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３・ＣＨ３ＣＯＯＨ；（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）の溶液で溶離した。溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値は双方とも各個別の実験で変動した。サンプル中のタンパク質濃度および凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上で実施例１に記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【００８０】
これらの実験から得た総パーセント収率値（ｚ軸値）をその後、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ値（ｙ軸値）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後、最小二乗法を使用して実施して、プロットした実験データに当てはめた最適化多項式を得た。
【００８１】
得られた多項式を”ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ”等式と呼称した。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得られる総パーセント収率値（ｚ軸）を、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述し得ることを示す。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数は
ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ（ｘ，ｙ）＝−０．６７６ｘ＋０．２０９ｘｙ−６２．４ｙ＋２９５．７４７
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。
【００８２】
ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数のグラフプロットを図２に示す。これらの分析は、プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶離後のＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数であることを示す（表２および図２）。
【００８３】
生物製剤の製造のためにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを最適に使用するためには、ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値が７０％以上でなければならない。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数により記述される関数の関係を使用して、こうした最適ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値（例えば＞７０％）を生じるプロテインＡクロマトグラフィー条件を同定し得る。
【実施例３】
【００８４】
プロテインＡクロマトグラフィー溶離液中の凝集Ｆｃペプチド鎖パーセントは溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨの関数である
プロテインＡクロマトグラフィーカラム精製後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージは、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である（表２および図３）。該実験データからのパーセント凝集物値はサンプル中に存在する凝集および非凝集双方の全Ｆｃペプチド鎖の質量での総量に関する溶離後に回収された精製されたサンプル中に存在する凝集Ｆｃペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。パーセント凝集物値は、プロテインＡクロマトグラフィー後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Ｆｃペプチド鎖汚染レベルの尺度である。差別的に述べられれば、パーセント凝集物は回収された溶離されたサンプルの純度の尺度である。
【００８５】
溶離されたサンプルは上で実施例２に記述されたプロテインＡクロマトグラフィー実験により製造したものであった。溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨ値は双方とも各個別の実験で変動された（表２）。これらのサンプル中のタンパク質濃度および凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上で実施例１に記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【００８６】
これらの実験から得たパーセント凝集物値（ｚ軸値）をその後、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ値（ｙ軸値）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後、最小二乗法を使用して実施して、プロットした実験データに当てはめた最適化多項式を得た。
【００８７】
得られた多項式を”ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ”等式と呼称した。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得たパーセント凝集物値（ｚ軸）を、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述し得ることを示す。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数は
ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ（ｘ，ｙ）＝０．００２４２ｘ２−０．０２１３ｘ−０．０８１９ｘｙ−１．５７６ｙ２＋０．５５１ｙ＋２９．６８０
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。
【００８８】
ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数のグラフプロットを図３に示す。これらの分析は、プロテインＡクロマトグラフィーカラム精製後に回収される溶離されたサンプル中の質量でのパーセント凝集物が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数であることを示す（表２および図３）。
【００８９】
生物製剤の製造のためプロテインＡカラムクロマトグラフィーを最適に使用するために、ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は５％未満でなければならない。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数により記述される関数の関係を使用して、こうした最適なＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値（例えば＜５％）を生じるプロテインＡクロマトグラフィー条件を同定し得る。
【実施例４】
【００９０】
最適の総パーセント収率およびパーセント凝集物値のためのプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩およびｐＨ値の選択
最適のＦｃペプチド鎖総パーセント収率およびパーセント凝集物値をもつ溶離液サンプルを得るためのプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩およびｐＨ値を、数学的
最適化問題解決技術を使用して同定した。
【００９１】
第一に、Ｆｃペプチド鎖を含んでなる生物製剤の製造のための最適のＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値を選択した。選択される最適のＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値は７０％以上でなければならない（上の実施例２を参照されたい）。ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値のこの最適の組は、以下のファジー組：
【００９２】
【数１】
【００９３】
を使用して数学的に表し得る。上の実施例３に示されるとおり、ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ値は、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である。
【００９４】
ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は２方法のいずれを使用しても計算し得る。第一の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）値は、個別のクロマトグラフィー実験から実験的に決定した総パーセント収率値（表２）を使用して計算する。第二の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値のｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）値は、実験的に決定した総パーセント収率値データ組に最小二乗法により当てはめた多項ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ関数を使用して計算し得る（表２）。
【００９５】
ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が所定の塩濃度およびｐＨ値で７０％未満である場合に０であることができる。ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が７０％以上かつ１００％未満である場合に（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ−７０）／（１００−７０）に等しい。例えば、総パーセント収率が８０％である場合には、ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）は（８０−７０）／（１００−７０）すなわち０．３に等しい。あるいは、ファジー組ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）の値は、総パーセント収率が所定の塩濃度およびｐＨ値で１００％以上若しくはそれに等しい場合に１であることができる。
【００９６】
第二に、Ｆｃペプチド鎖を含んでなる生物製剤の製造のための最適のＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値をその後選択した。選択される最適のＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は５％未満でなければならない（上の実施例２を参照されたい）。これは以下のファジー組：
【００９７】
【数２】
【００９８】
を使用して数学的に表し得る。
【００９９】
上の実施例３に示されるとおり、ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値は、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度およびｐＨの関数である。
【０１００】
該ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は２方法のいずれを使用しても計算し得る。第一の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）値は、個別のクロマトグラフィー実験からの実験的に決定したパーセント凝集物値（表２）を使用して計算する。第二の方法において、所定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値でのｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）値は、実験的に決定されるパーセント凝集物値のデータ組に最小二乗法により当てはめた多項ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ関数を使用して計算し得る（表２）。
【０１０１】
ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が所定の塩濃度およびｐＨ値で０％未満若しくはそれに等しい場合に１であることができる。ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が０％以上かつ５％未満である場合に（５−ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）／（５−０）に等しい。例えば、パーセント凝集物が２％である場合には、ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）は（５−２）／（５−０）すなわち０．６に等しい。あるいは、ファジー組ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）の値は、パーセント凝集物が所定の塩濃度およびｐＨ値で５％以上若しくはそれに等しい場合に０であることができる。
【０１０２】
第三に、所定の溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨについて生成されるｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）およびｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）ファジー組値を使用して、以下の”ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１”等式：
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１＝［ｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）×ｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）］１／２
を使用して目的関数値を計算した。計算された目的関数値（ｚ軸）をその後、プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸およびｐＨ（ｙ軸）の関数としてプロットした（データは示されない）。標準的多項式曲線当てはめをその後最小二乗法を使用して実施して、プロットしたデータに当てはめた最適化多項式を得た。得られた多項式を”ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２”等式と呼称した。
【０１０３】
プロットしたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値を計算するのに使用しかつ当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用するｍ（ＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ）およびｍ（ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ）ファジー組値を、２供給源のいずれかからのデータを使用して計算した。例えば、プロットしたＯ
ｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値のいくつかは、実験的に決定した総パーセント収率およびパーセント凝集物値を使用して計算した（表２）。プロットした他のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値（表３）は、上述された表２のデータ組を当てはめた等式を使用して生成したＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄおよびＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅ値を使用して計算した。表２および表３双方の目的関数値をその後プロットし、そして当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用した。これは、当てはめた多項式を歪ませ得る当てはめたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を生成するのに使用したデータ組に「ギャップ」が存在しなかったことを確実にするために行った。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
【表５】
【０１０７】
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式は、プロテインＡクロマトグラフィーにより得られるＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１値（ｚ軸）が、溶離緩衝液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸値）およびｐＨ（ｙ軸値）双方の関数として数学的に記述され得ることを示す。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２関数は
ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２（ｘ，ｙ）＝（３．５８×１０−５）ｅｘｐ［−０．５（０．００１７１ｘ２−０．１９２７ｘｙ＋５０．５１５ｙ２＋０．４５４０ｘ−３４８．５２ｙ＋５８９．４８７）］
式中
ｘ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度；ｍＭ
および
ｙ＝ｐＨ
である。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式は、６９．０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５８のｐＨで０．４６６の極大を有する。
【０１０８】
数学的最適化の問題において、「目的関数」は、解決される場合に、目的関数から最大若しくは最適値を得ることを可能にする変数の値を示す等式である。ここで、上述されたＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式を使用して、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得ることを可能にする特定の溶離緩衝液の塩濃度（ｘ変数）およびｐＨ（ｙ変数）値を同定した。
【０１０９】
例えば、０という目的関数値を生じるプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値（図４を参照されたい）は、所望の最適の特徴をもつ精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを製造するのに使用し得ない。対照的に、１．０という最大の可能な目的関数値までの０．０以上の目的関数値を生じるプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値（上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ１を参照されたい）は、所望の最適の特徴をもつ精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを製造するのに使用し得る可能な値の範囲を表す。最良の可能な溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値は、可能な限り１．０に近い目的関数値を生じるものである。ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式について、最良の可能な溶離緩衝液塩濃度およびｐＨ値は、０．４６６という極大値に可能な限り近い目的関数値を生じるものである。
【０１１０】
上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式およびそのグラフ表示（図４）を使用して、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で得るのに最適である特定のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩濃度およびｐＨ値若しくはこうした値の範囲を同定し得る。
【実施例５】
【０１１１】
最適のプロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液組成の選択における使用のためのＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２等式の検証
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式若しくはそのグラフ表示のいずれかを使用して同定される特定のプロテインＡクロマトグラフィー緩衝液の塩濃度およびｐＨ値は、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖溶離液サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で生じることが実験的に確認された（表５）。具体的には、得られた溶離されたサンプルは、８４．７％以上のＦｃペプチドの質量での総パーセント収率（すなわち総パーセント収率値は８４．７％以上であった）で質量で２．９３％の凝集Ｆｃペプチド鎖（すなわちパーセント凝集物値は２．９３％であった）を含有した。
【０１１２】
この確認プロテインＡクロマトグラフィー実験は後に続くとおり実施した。第一に、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式のグラフ表示（プロット）を使用して０．４以上のＯｂｊｅｃｔｉｖｅＦｕｎｃｔｉｏｎ２値を同定した（ｚ軸）（図４）。対応するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度（ｘ軸）およびｐＨ（ｙ軸）値をその後同定した。同定されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度値は６５ｍＭであった。同定されたｐＨ値は３．５５であった。
【０１１３】
３．５５というｐＨで６５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩を含有する水性プロテインＡクロマトグラフィー溶離緩衝液をその後調製した。この確認実験のためのＣ１３７４Ｃ細胞培養、上清収集、プロテインＡクロマトグラフィーカラム調製、カラム平衡化、上清負荷およびカラム洗浄は上の実施例１に記述されたとおり実施した。クロマトグラフィーは１９℃と２５℃の間の温度で実施した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂に結合したペプチド鎖は、３．５５のｐＨの６５ｍＭトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン酢酸塩を含有する溶離緩衝液でプロテインＡクロマトグラフィーカラム樹脂から溶離した。プロテインＡクロマトグラフィーカラムをその後、３．０のｐＨの０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩の溶液でストリップした。サンプル中のタンパク質濃度、凝集Ｆｃペプチド鎖含量および非凝集Ｆｃペプチド鎖含量は、上の実施例１で記述されたところの標準的ＳＥ−ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
【０１１４】
溶離液サンプルの分析は、該サンプルが、８４．７％以上のＦｃペプチド鎖の質量での総パーセント収率（すなわち総パーセント収率は８４．７％以上であった）で質量で２．９３％の凝集Ｆｃペプチド鎖を含有した（すなわちパーセント凝集物値は２．９３％であった）ことを確認した。プロテインＡクロマトグラフィーカラム上に当初負荷された細胞培養物上清は９．８９％の凝集物を含有した。ストリップ後のカラムからの全体的非凝集Ｆｃペプチド鎖特異的パーセント収率は９１．３質量％であった。ＰｅｒｃｅｎｔＡｇｇｒｅｇａｔｅおよびＴｏｔａｌＰｅｒｃｅｎｔＹｉｅｌｄ等式を使用して、３．５５のｐＨ（ｙ値）の６５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩（ｘ値）を含んでなる溶離緩衝液を使用するプロテインＡクロマトグラフィーから生じる溶離液サンプル中のそれぞれパーセント凝集物値および総パーセント収率値を予測した。予測されたパーセント凝集物値は１．７％であり、そして予測された総パーセント収率値は７８．５％であった。双方の値は、本検証実験の溶離液サンプルで実際に得られた総パーセント収率およびパーセント凝集物値に合理的に近い。
【０１１５】
これらの結果は、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２等式若しくはそのグラフ表示を使用して、質量で５％未満の凝集物を含んでなる精製されたＦｃペプチド鎖溶離液サンプルを７０％以上のＦｃペプチド鎖の総パーセント収率で製造し得ることを示す（表５）。これらの結果は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して非凝集Ｆｃペプチド鎖から凝集Ｆｃペプチド鎖を分離し得ることもまたさらに確認する。ここで論考される結果は、２種の異なるミメティボディ産生細胞株を使用する４回の独立に実施した検証実験を代表する。
【０１１６】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれに対して多くの変更および改変をなし得ることが当業者に明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項２】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項６】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集
Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項１０】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項１４】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）１０ｍＭないし１２９ｍＭの塩濃度および３．２４ないし３．９３のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項２】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）４１ｍＭないし９７ｍＭの塩濃度および３．４２ないし３．７４のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項６】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ａ）非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Ｆｃペプチド鎖および凝集Ｆｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）５５ｍＭないし８５ｍＭの塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集
Ｆｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
Ｆｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集Ｆｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項１０】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
塩がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
非凝集Ｆｃペプチド鎖がミメティボディである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる水性サンプルを提供する段階；
ｂ）不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖および凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の総質量の７０％以上を結合することが可能なプロテインＡペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階；
ｃ）５５ｍＭないし８５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン酢酸塩濃度および３．５０ないし３．６６のｐＨを有する水性溶液とプロテインＡペプチド鎖の該集団を接触させる段階；ならびに
ｄ）プロテインＡペプチド鎖の集団との接触から該水性溶液を除去して、５％未満の凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖を含んでなる精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液を生じる段階
を含んでなり、
ミメティボディＦｃペプチド鎖の総パーセント収率が７０％以上である、
精製された非凝集ミメティボディＦｃペプチド鎖の溶液の製造方法。
【請求項１４】
不溶性物質に結合されたプロテインＡペプチド鎖の集団が０．００５ｃｍないし０．０５ｃｍの理論段値に同等な高さを有する、請求項１３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０７５８３（Ｐ２０１０−５０７５８３Ａ）
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３５６４（Ｐ２００９−５３３５６４）
【出願日】平成１９年１０月１９日（２００７．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８１９２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４９１０６
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１９日（２００７．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８１９２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４９１０６
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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